JP4262559B2 - 電気泳動分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光標識されたＤＮＡなどの試料を電気泳動により分離分析する電気泳動装置に関する。

ＤＮＡの塩基配列および塩基長の決定等を目的として、石英管およびそれを覆うポリマ被覆からなるキャピラリを用いた電気泳動分析法が用いられている。石英キャピラリ中のポリアクリルアミド等の分離媒体に測定対象であるＤＮＡを含む試料を注入して、キャピラリの両端部に電圧を印加する。試料中のＤＮＡ合成物はキャピラリ内を移動し、分子量の大きさ等によって分離されキャピラリ内にＤＮＡバンドを生じる。各ＤＮＡバンドには蛍光色素が加えられており、レーザ光の照射によって発色し、これを蛍光計測手段で読み取り、ＤＮＡの配列を決定する。蛋白質の分離・分析も同様に行って、蛋白質の構成を調べることができる。

レーザ光の照射方式には、マルチフォーカス方式と呼ばれる以下のような方法がある。平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、レーザ光が隣接するキャピラリを次々と伝搬してキャピラリアレイを横断する方式である。レーザ光が照射されるキャピラリ上の個所及びその近傍においては、キャピラリの表面のポリイミドなどの被覆は除去され、キャピラリの石英表面は空気に触れている。ここで、互いに接触し合う複数のキャピラリをレーザ光が貫通しているため、レーザ光、および、キャピラリからの発光が、各キャピラリ表面で複雑に乱反射する。また、キャピラリを配列するための平面基板が存在するために、この乱反射はさらに増大する。

特開２００２−２９６２３５号公報では、配列基板による散乱光の反射を抑制することを目的として、前記配列基板のうち、光検出器からキャピラリアレイを見た場合にキャピラリの後方に位置する領域に貫通穴を形成することによって、散乱光を抑制している。

特開２００２−２９６２３５号公報

電気泳動分析において、ある特定のキャピラリにおける発光の一部が、隣接するキャピラリの発光場所と重なる問題が存在する。つまり、ある特定のキャピラリの信号が、隣接キャピラリの信号として検出されるというクロストークが生じる。本発明は、このクロストークの低減に関する。

発明者が検討した結果、クロストークには、少なくとも次の成分があることを見出した。すなわち、あるキャピラリから出る信号光が、隣接するひとつあるいは複数のキャピラリを伝搬し、キャピラリの石英外径の内面での反射によって、光検出器に至る経路である。このクロストークは、光検出器において、キャピラリ中心軸から所定距離だけ離れた箇所に強く結像する。

本発明は、光検出器上に結像されるキャピラリからの発光の像のうち、キャピラリの信号として取得する像の範囲を制御することに関する。これにより、隣接キャピラリにおける発光の取得を抑制し、クロストークを低減できる。

また、本発明は、クロストーク低減をＳ／Ｎ向上より重視した低クロストークモードと、Ｓ／Ｎ向上をクロストーク低減より重視した高感度モードを選択できる電気泳動分析に関する。これにより、さまざまな分析アプリケーションに適した電気泳動分析を実施できる。例えば、遺伝子配列の読み取りと、２つのＤＮＡバンドの強度比較を、それぞれ最適に行える。

本発明により、試料を高精度に電気泳動分析できる。

以下、上記およびその他本発明の新規な特徴と効果について、図面を参酌して説明する。ただし、図面はもっぱら解説のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。

平面基板上に並んだ複数のキャピラリからなるキャピラリアレイの一方あるいは両側の端のキャピラリにレーザ光を照射し、前記レーザ光が隣接するキャピラリに次々と伝搬してキャピラリアレイを横断し、キャピラリアレイにおいて発生する発光を光検出器によって検出する照射方式を採用する場合には、多数本のキャピラリからの分光された発光を同時検出するために、通常、２次元ＣＣＤ検出器が用いられる。２次元像の縦軸（Ｙ軸）は空間軸、すなわち、複数のキャピラリの位置を表わす。横軸（Ｘ軸）は波長分散軸であり、それぞれのキャピラリの発光スペクトルが示される。

クロストーク要因の光路の特性上、隣接するキャピラリ（キャピラリＢ）でのクロストークの発生位置は、蛍光を発するキャピラリ（キャピラリＡ）に対し、キャピラリＢの中心軸のやや外側になる。キャピラリＢでのクロストークの発光とキャピラリＢ内のサンプルからの真の発光とは空間的に分離できることになる。空間的に分離するためには、次のような方法がある。Ｙ軸方向の単一画素（キャピラリのＢ中心位置の画素）上に結像される光強度をキャピラリＢの発光信号として記録する。この場合の（クロストーク強度）／（真の信号強度）比は、Ｙ軸方向の複数画素（キャピラリＢの中心位置およびその周辺画素）上に結像される光強度をキャピラリＢの発光信号として記録する場合に比べて、小さくなる。これは、キャピラリＢの中心位置から距離が大きくなるにつれて、前述した通りクロストークの信号強度が大きくなり、キャピラリＢのサンプルの信号は小さくなるためである。この為、キャピラリ方向に単一画素のみをそのキャピラリの信号として記録することにより、クロストークを小さくできる。

尚、クロストークは、外径の内面からの反射によるものであることを考慮し、クロストークの発光とそのキャピラリ内のサンプルからの真の発光との空間的な分離を大きくして、クロストークを低減する方法もある。キャピラリの石英管の内径／外径比が小さいほど、空間的分離を大きくでき、クロストークを低減できる。しかしながら、キャピラリの石英管の内径／外径比を小さくすると、隣接するキャピラリに次々と伝搬する照射レーザ光の反射ロスが増大する。つまり、相反する条件を満たす最適条件を見出す必要がある。

本実施例にかかるマルチキャピラリ電気泳動装置の全体構成を図１に示す。

本実施例にかかるマルチキャピラリ電気泳動装置は、検査試料を分離するための分離媒体を含むキャピラリからなるマルチキャピラリアレイ１と、マルチキャピラリアレイの負電極２と試料導入部１１−３とを浸す負電極側のバッファー液３を保持する第１バッファー容器１１−４と、バルブ６を有するゲルブロック４と、ゲルブロック４とアース電極７とを浸すアース電極側のバッファー液１２を保持する第２バッファー容器１１−７と、キャピラリアレイ内に泳動媒体であるゲルを注入するためのシリンジ１０と、試料に依存する情報を取得するための検出部１１−８と、コヒーレント光であるレーザ光９を光照射部８に照射する光源（図示しない）と、試料が生じる蛍光を取得する測定部（図示しない）と、キャピラリアレイの温度を調節する恒温槽１１と、分離媒体に電圧を印加する高圧電源（図示しない）から構成される。

マルチキャピラリアレイ１は、ＤＮＡ分子などのサンプルが含まれている検査試料と検査試料中のＤＮＡ分子を分離するための分離媒体であるポリマ水溶液が充填される、管状部材である石英製キャピラリを４８本有する。マルチキャピラリアレイ１の一端には、キャピラリ内に試料を導入できる試料導入部１１−３が形成され、負電圧を印加できる電極２が配置されている。他端には、ゲルブロック４と連結し、ゲルブロック４とマルチキャピラリアレイ１との間で分離媒体を移動できる接続部５を有する。試料導入部１１−３と接続部５の間に、レーザ光が照射される光照射部８を含む検出部１１−８を有する。

ゲルブロック４とシリンジ１０は、泳動媒体であるポリマ水溶液をキャピラリ内に注入する流動媒体注入機構である。キャピラリ内に、泳動媒体であるポリマ水溶液を充填する際には、バルブ６を閉じ、シリンジ１０を押し込むことによって、シリンジ１０内のポリマ水溶液をキャピラリ内に注入する。

キャピラリアレイ１，ゲルブロック４，バッファー液３，電極２，アース電極側のバッファー１２，アース電極７、及び高圧電源は、検査試料を電気泳動するための電圧印加機構を構成する。電気泳動をする際には、負電極２をバッファー液３に浸し、バルブ６を開放する。これにより、負電極２，バッファー液３，マルチキャピラリアレイ１（より正確には、キャピラリ内のポリマ水溶液），ゲルブロック（より正確には、ゲルブロック内のポリマ水溶液），アース電極側のバッファー１２、及びアース電極７からなる通電路が形成される。この通電路に高圧電源により電圧を印加する。通電路に電圧が印加されると、ポリマ水溶液中の検査試料が電気泳動し、その分子量等の性質に従い分離される。

電気泳動装置の光学系は、光源と、光照射部８を含む検出部１１−８と、検出部から生じる蛍光を検出する検出機構から構成される。光源は、コヒーレント光であるレーザ光９（アルゴンイオンレーザからの４８８.０ｎｍおよび５１４.５ｎｍの光）を発振する。検出部１１−８には、レーザ光９がキャピラリを透過する個所である光照射部８が並列配置されている。そして、複数本のキャピラリの光照射部８を同時に貫くように、検出部１１−８にレーザ光９が上下両方向から照射される。このレーザ光９が検査試料を励起して、検査試料から蛍光が放出される。この蛍光を、ＣＣＤ３４を含む検出機構により検出して、ＤＮＡ分子配列等の検査試料に依存した情報を取得できる。尚、キャピラリへの光照射方式は、ここに示したマルチフォーカス方式でも良いし、スキャン方式や、一括照射方式等でも構わない。スキャン方式とは、例えば、ガルバノミラーを用いてレーザ光の照射方向を変更したり、又は、レーザ光を反射するミラーを動かして、レーザ光が照射されるキャピラリを時間分割で切り換える方式である。また、一括照射方式とは、例えば、励起光として末広がりな平面ビームを用い、複数キャピラリを同時に照射する方式である。

図６に、キャピラリ番号１２と１３からの出力を示す。横軸は泳動時間である。キャピラリ番号１３には、サンプルが入っているが、１２はサンプルが入っていない。（ｂ）に示すように、キャピラリ番号１２の信号がキャピラリ番号１３の信号のクロストークである。

図２に、キャピラリアレイ中の検査試料からの蛍光の検出機構と、光照射部８を示す。検出機構は、蛍光集光レンズ３１，グレーティング３２，フォーカスレンズ３３、及び
ＣＣＤ３４から構成される。光照射部８にレーザ光９が照射されることで生じる、キャピラリ１６中の検査試料からの蛍光３５は、蛍光集光レンズ３１によって平行光３６となり、グレーティング３２によって分光され、フォーカスレンズ３３によってＣＣＤ３４上に結像される。図２の右図にその結像に関する素子（グレーティング，ＣＣＤ）の様子を示す。Ｙ軸方向に４８本のキャピラリ像が並び、Ｘ軸方向に各キャピラリからの発光が分光される。

恒温槽（オーブン）１１は、キャピラリアレイ１の温度を制御するための温度制御機構である。これにより、キャピラリアレイ１の大部分は、例えば６０℃などの一定温度に保温される。

検出部１１−８について説明する。図３に、検出部１１−８の正面図（ａ）と側面図
（ｂ，ｃ）を示す。検出部１１−８は、４８本のキャピラリ１６と、配列基板１５と、セル蓋２０と、押さえ板１７と、気泡排除ブロック２３と、屈折率１.２９ の透明充填媒体（Ｆ溶液１９）と、気泡２２より構成される。

キャピラリの配列について説明する。マルチフォーカス方式においては、複数のキャピラリにレーザ光を伝搬させるため、複数のキャピラリの相対位置ずれを小さく抑制する必要がある。そのため、隣接するキャピラリが互いに接触する状態ですべてのキャピラリを平面基板上に押さえつけて固定することによって、本方式に必要なキャピラリの位置精度を実現する。具体的には、石英製の配列基板１５は、キャピラリを配列するための基準平面４０が形成されている。４８本のキャピラリが全て基準平面４０に接触するように、かつ、隣接キャピラリが互いに接触するように配列基板１５上に配列される。キャピラリ
１６を固定するための押さえ板１７と配列基板１５との間に挟み込むことで、キャピラリ１６は配列基板１５に対して接着固定されている。これにより、キャピラリは平面状に並列配置され、各キャピラリの中心軸のズレを６μｍ以下にすることができる。従って、
４８本ものキャピラリを同時に貫くようにレーザ光９を照射した際の、屈折や反射によるレーザ光９の損失の影響を低減できる。尚、キャピラリを配列させる方法は、ここに示した方法以外でも良い。例えば、キャピラリを配列保持できる平面を２つ有する部材（中心部に穴を備える平面基板や、凹形状部材）を用い、レーザ光が照射される箇所は保持せず、その両端部分を保持し、複数のキャピラリを平面状に配列する方法でも良い。

キャピラリの構造について説明する。キャピラリ１６は、内径５０ｕｍ，外形１２６
ｕｍの石英管が、厚さ１２ｕｍのポリマ被膜で覆われた構造をとり、全外径は１５０ｕｍである。キャピラリ内部にはＤＮＡの分離媒体であるポリマ水溶液（屈折率１.４１ ）が充填されている。光照射部８においては、ポリマ被膜が除去され、石英管がむき出しの状態になっている。レーザ光９を照射すると、乱反射光の一部がキャピラリのポリマ被膜にあたり、このポリマ被膜が蛍光を発する場合がある。しかし、このポリマ被膜からの蛍光は押さえ板１７により遮られ、測定部に到達しないようになっている。このため、ＳＮ比の高い高精度検出ができる。

マルチフォーカス方式においては、キャピラリの石英外面をレーザ光が透過するとき、石英境界面における反射によりレーザ光は減衰する。本実施例では、この減衰を緩和することを目的として、キャピラリとキャピラリの間に所定の屈折率を有する光伝達媒体を充填し、レーザ光の損失を抑制している。具体的には、配列基板１５と、石英製のセル蓋
２０、およびそれらを固定する接着剤２１が密閉構造を形成し、特定の液体・固体等の光伝導媒体を保持できる密閉容器（セル）を構成する。このセル内にＦ溶液１９を充填することにより、キャピラリの間であってレーザ光が通過する空間をＦ溶液１９で満たすことができる。言い換えれば、キャピラリ１６の光照射部８はＦ溶液１９に浸されている。レーザ光が配列平面板に触れることを避けるために、配列平面４０には溝４１が形成してある。溝の底面４２は、擦りガラス状であり、キャピラリの配列面と平行である。

図４に示す通り、あるキャピラリ５１からの発光は、隣接するキャピラリ５２−５４を伝搬し、伝搬した先のキャピラリ５２，５４の外径の内壁からの反射により、検出器へと発光が導入される。ＣＣＤ検出器上の像を図５に示す。像の縦軸（Ｙ軸）は空間軸、すなわち、複数のキャピラリの位置を表わす。横軸（Ｘ軸）は波長分散軸であり、それぞれのキャピラリの発光スペクトルが示される。図５（ａ）の枠付近の拡大図を図５（ｂ）に示す。また、図５（ａ），図５（ｂ）の線上の強度分布を図５（ｃ）に示す。図５（ｃ）の破線は、各キャピラリの中心位置を示す。図５ｃからわかる通り、隣接するキャピラリ
（キャピラリＢ）でのクロストークの発生位置は、蛍光を発するキャピラリ（キャピラリＡ）に対し、キャピラリＢの中心軸のやや外側になる。これは、クロストークが、図４に示す光路によるものであることの証拠である。

ここで、キャピラリ配列方向に３画素（図５（ｃ）：キャピラリの中心位置およびその＋−１画素）分のデータをそのキャピラリの発光信号として記録する。図７に隣接するキャピラリのクロストークを示す。横軸は蛍光を発するサンプルが注入されたキャピラリ番号２４からの距離をキャピラリ単位で表したものである。縦軸がクロストークの大きさを示し、隣接キャピラリに観測されるクロストークを％単位で表示している。３画素積算の場合のクロストークを点線で示しており、その値は、０.１〜０.５％であった。クロストークの大きさは周期的であることがわかる。これは、図４において、外径の内壁からの反射により、検出器へと導入される発光の強度が、サンプルを含むキャピラリからの距離に対して周期的であることに対応している。

また、キャピラリ配列方向に１画素（図５（ｃ）：キャピラリの中心位置のみ）のみをそのキャピラリの発光の信号として記録することもできる。その場合のクロストークは
０.１−０.２％であった（図７実線）。キャピラリ方向に１画素のみをそのキャピラリの信号として記録する方がクロストークが小さいことがわかる。しかしながら、１画素分の信号を取得するのみであるため、３画素分のデータを取得する場合に比べて、信号強度が小さくなる、すなわち、Ｓ／Ｎが小さくなるというデメリットをもつ。

本実施例は、本装置を制御するパソコン上のソフトウェアの画面上において、測定モードを変更できる点にも特徴がある。図８に制御パソコンの画面を示す。低クロストーク測定モードと高感度測定モード切替ボタンがあり、これにより、データ取得画素数を切り替えることができる。低クロストークモードでは、キャピラリ配列方向に１画素（図５(ｃ)：キャピラリの中心位置のみ）分のデータをそのキャピラリの発光信号として記録する。高感度測定モードでは、キャピラリ配列方向に３画素（図５（ｃ）：キャピラリの中心位置およびその＋−１画素）をそのキャピラリの発光の信号として記録する。マウス操作により、このモードを切り替えることができる。尚、測定モードの変更は、データ取得画素数の切り替え以外にも、例えば、キャピラリ中心位置の画素のみの増幅倍率を選択的に大きくすることによって実現することもできる。

図９に高感度モードでの測定例を示す。図９は、人の遺伝子配列を読み取ったものである。遺伝子配列を読み取る場合には、クロストークは、０.５％ 程度以下であれば、全く問題にならない。なぜならば、１塩基毎に、４種類の塩基のいずれかに対応する発光が必ず観測され、クロストーク成分は、この主信号の強度に比べて充分小さく、無視しうるからである。この場合に重要なのは、１塩基の分離である。図９の７５０塩基付近で見られるように、１塩基の分離、すなわち、バンドの山と山の識別ができることである。従って、Ｓ／Ｎが大きい３画素データ取得、すなわち高感度モードでの測定が望ましい。

図１０に低クロストークモードでの測定例を示す。図１０の測定例は、ある遺伝子が発現しているか否かを判定することを目的として、発生しているＲＮＡを元にしてある二人のある組織で発現中のＤＮＡを測定したものである。この結果、ＤＮＡバンドの間隔が
５０塩基である２つのＤＮＡバンドが観測された。この２つのバンドの強度比［バンドＱの強度］／［バンドＰの強度］を調べ、ｉ）１以上、ii）０.１〜１、iii）０.１ 以下のいずれかに分類をすることにより、遺伝子の発現有無を判定できる。（ａ）については、ｉ）１以上であると判定できる。ここで、（ｂ）については、測定結果にクロストークが多く含まれている虞があるとii）であるのか、あるいは、バンドＱのように見えるのは実際にはクロストークであってiii)に相当するのか、判断ができない。しかし、本実施例の低クロストークモードで測定した場合、（ｂ）はii）であると結論することができる。

本実施例においては、３画素と１画素によるモード切り替えを示したが、画素数はこれに限るものではない。１０画素と３画素の切り替えでも良いし、１０画素と、その１０画素のうち図５（ｃ）に示したクロストークが大きい画素に対応する部分を除いた画素によるモード切り替えでも構わない。

本実施例によれば、１台の装置により、分析の目的に応じて、低クロストークモードと、高感度モードに切り替えることにより、さまざまなアプリケーションに対して試料を高精度に分析することができる。

実施例１のマルチキャピラリ電気泳動装置の全体構成図。 実施例１の蛍光結像素子およびＣＣＤ付近の概略構成図。 実施例１の検出部の正面図（ａ）と側面図（ｂ，ｃ）。 クロストークの光路図。 ＣＣＤ検出器上の像（ａ）、図５（ａ）の枠付近の拡大図（ｂ）、ａ，ｂの線上の強度分布（ｃ）。 クロストークの説明図。 クロストークの説明図。 制御パソコンの画面表示。 高感度モードでの測定例。 低クロストークモードでの測定例。

符号の説明

１…キャピラリアレイ、２…負電極、３…負電極側のバッファー液、４…ゲルブロック、５…ゲルブロックへの接続部、６…バルブ、７…アース電極、８…光照射部、９…レーザ光、１０…シリンジ、１１…オーブン、１１−３…試料導入部、１１−４…第１バッファー容器、１１−６，１１−８…検出部、１１−７…第２バッファー容器、１２…アース電極側のバッファー、１５…配列基板、１６…キャピラリ、１７…キャピラリ押さえ板、１８…石英管、１９…キャピラリ周辺を満たす屈折率１.２９ の透明充填媒体（Ｆ溶液）、２０…セル蓋、２０−２…気泡収容空間、２１…接着剤、２２…気泡、２３…気泡がレーザ光路上に侵入することを防ぐための石英製の気泡排除ブロック、３１…蛍光集光レンズ、３２…グレーティング、３３…フォーカスレンズ、３４…ＣＣＤ、３４−２…検出機構、３５…蛍光、３６…平行光、４０…基準平面、４１…配列基板１５のレーザ光避けの溝、４２…配列基板１５のレーザ光避けの溝の底面、５１…サンプルを泳動しているキャピラリ、５２−５４…サンプルを泳動しているキャピラリに隣接するキャピラリ、６３…サンプルを泳動しているキャピラリから出る蛍光、６４…サンプルを泳動しているキャピラリから出る蛍光の、配列基板による反射光、６５…隣接キャピラリからの発光。

Claims (4)

1. 以下の構成を含む電気泳動装置；
   泳動媒体を充填できる複数のキャピラリと、該複数のキャピラリの少なくとも一部を平
   面上に配置した検出部を含むキャピラリアレイ；
   複数のキャピラリの両端に電圧を印加できる電源；
   検出部にレーザ光を照射できる光源；
   検出部からの発光を検出できる光検出器と、該光検出器の測定モードを選択できる制御
   装置を含み、
   該測定モードは、
   光検出器において、所望のキャピラリの中心軸の位置と、当該中心軸の外側にあり、所望のキャピラリに隣接するキャピラリからのクロストークが発生するクロストーク発生位置とにおける発光を取得する高感度モードと、
   所望のキャピラリの中心軸の位置における発光を取得し、前記クロストーク発生位置における発光を取得しない低クロストークモードとを含む検出機構。
2. 請求項１記載の電気泳動装置であって、
   前記低クロストークモードにおいて、所望のキャピラリから取得した発光における（クロストーク強度）／（真の信号強度）比が０.５％ 以下である電気泳動装置。
3. 請求項１記載の電気泳動装置であって、
   前記光検出器が複数の光検出画素を含み、所望のキャピラリからの光を検出する光検出
   器画素を変更することにより前記測定モードを選択する電気泳動装置。
4. 請求項１記載の電気泳動装置であって、
   前記光検出器が複数の光検出画素を含み、所定の光検出画素の増幅倍率を変更すること
   により前記測定モードを選択する電気泳動装置。

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