JP4497903B2 - タンパク質チップおよびそれを用いたバイオセンサー - Google Patents

Description

本発明は、プローブとしてタンパク質のマイクロアレイを有するバイオチップおよびそれを用いたバイオセンサーに関する。より詳しくは、電気的信号検出によってタンパク質マイクロアレイへのターゲット分子の特異的結合を検出することができる高感度のバイオセンサーに関する。

近年、新薬開発プロセス、医療診断等などの分野において、バイオチップが注目され、研究開発が盛んに進められている。
バイオチップとは、固体表面上（固相化担体としては、シリコン基板、ガラス基板、高分子、金基板など）にＤＮＡ等の核酸、酵素や抗体のごときタンパク質、ペプチド等のバイオ分子アレイ、あるいは細胞等を固定化し、固定化されたバイオ分子アレイ等のプローブ物質に特定のターゲット物質が結合したときに生じる特異的な反応を検出するものである。特に、微量のサンプルを用いて大量にハイスループットな検出および解析ができるところから、大量かつ同時並行的な処理を要求されるポストゲノム時代のバイオ分子アレイの機能解析技術にはバイオチップ関連技術が必須となっている。

バイオチップの代表例として、基板上にＤＮＡを高密度に固定化し、ハイブリダイゼーションにより相補的な配列の存在を検出するＤＮＡチップ（ＤＮＡマイクロアレイ）や、タンパク質を固定化し相互作用するタンパク質を検出するタンパク質チップ（プロテインチップ）などがある。
また、微細加工技術を利用してシリコン、ガラス等の基板表面上に流路、回路を成形し、微小空間上で反応、分離、検出等を行う装置、器具（ラボ・オン・チップ、μＴＡＳ(micro-total analysis system)、バイオＭＥＭＳ(micro-electro-mechanical systems)等）が実用化され、それらをバイオチップと称することもある。

タンパク質チップの場合、基本的にはＤＮＡチップのプローブをＤＮＡからタンパク質に換えたものと考えてよいが、タンパク質の場合、ＤＮＡとは異なり、ターゲット分子と相互作用する機能を発現するためには一定の高次構造を必要とする。したがって、固相担体上にタンパク質を固定化するとき、その高次構造を破壊しないようにする必要がある。また、相互作用部位と固相担体との相対的な位置関係によっては、相互作用が立体障害を受ける可能性もある。したがって、従来のＤＮＡチップのＤＮＡをタンパク質に置換するだけでは、タンパク質チップを作製することはできない。
また、タンパク質チップにおいては、非特異的吸着（本来ある２つの物質同士が結合しやすい関係にあるとき、関係のない別の物質と結合してしまうこと）を制御するため、タンパク質の立体構造を正しく保つ必要性や大気中での安定性の問題で、固定化の技術が難しい。このため、現在、タンパク質チップはＤＮＡチップほど普及していない。

特許文献１には、抗原または抗体を平面状の基板に１次元または２次元に配列したタンパク質チップを用いて一度に大量のタンパク質を検出する方法が開示されている。この方法によれば、前記抗原または抗体に蛍光標識し、抗原抗体反応によりタンパク質を結合させ、結合しなかった抗原または抗体を除去するために洗浄し、最後に、結合したタンパク質を蛍光観察により検出している。

さらに近年、医療現場での臨床検査としてポイント・オブ・ケア検査(Point-Of-Care Testing; POCT)の重要性が高まっており、ＰＯＣＴ装置の１つとして、携帯型バイオセンサーのような小型化された自動分析システムが有力になると考えられる。

しかしながら、特許文献１に開示された方法では、上記のように、タンパク質の検出を蛍光観察により行うため、蛍光標識の前処理や蛍光装置が必要となり、
ＰＯＣＴの要求に応えるのが困難である。

特開２００１−００４６３０号

上記問題を解決するために、本発明の目的は、タンパク質の種類によらず、立体障害、失活を起こすことなく、タンパク質を固相担体に固定化する革新的な方法を開発し、配向性が制御され、アドレス化された高密度アレイを作製できる汎用的な技術を開発することにある。
また、本発明の目的は、従来の蛍光検出型タンパク質チップの有する問題を解決し、簡便性、携帯性、開発コストの面で優れている微小電極アレイ型タンパク質チップを開発することにある。そこで、本発明者らは、プローブタンパク質を電極上に固定化する方法を検討し、微小電極アレイ型タンパク質チップを作製し、一切の標識分子修飾を行うことなく、同時に複数種のターゲット分子を電気化学的に検出する新しい「次世代タンパク質チップ電極アレイシステム」の構築を行った。
そして、最終的に、本発明は、本発明によるタンパク質チップを、迅速かつ簡便な臨床検査に応用することを目的とする。

本発明において、微細加工技術によって１または複数の微小電極を平面上に配列させ、これら１または複数の微小電極の各々にプローブタンパク質を固定化したバイオ分子アレイチップを作製し、このプローブタンパク質にターゲット分子が相互作用したときの電気的信号の変化を高感度で検出する。

本発明のバイオチップにおいて、プローブとなるタンパク質は、ターゲット分子の種類に依存して、抗体その他のタンパク質のいずれを選択することもできる。例えば、ターゲット分子にタンパク質を選択した場合、プローブタンパク質としては、選択したターゲットタンパク質に対する抗体をプローブとして用いればよい。

より詳しくは、本発明は、１または複数のプローブタンパク質が配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成され、該１または複数のウェルの底部にプローブタンパク質が固定化されているバイオチップを提供する。

本発明によるバイオチップにおいて、該プローブタンパク質に第１の分子が結合され、該第１の分子と特異的結合する第２の分子が該ウェルの底部に固定化され、該第１の分子と該第２の分子との間の特異的結合によって該１または複数のウェル底部に該プローブタンパク質が固定化されている。

本発明の１の局面によるバイオチップにおいて、さらに、該ウェルの底部に脂質二重層が形成され、第３の分子が結合されたアンカー化合物が該脂質二重層にアンカーされ、該アンカー化合物に結合された第３の分子と該第２の分子との間の特異的結合によって該１または複数のウェル底部に該プローブタンパク質が固定化されている。

細胞膜は主に非共有結合した脂質とタンパク質分子からなり、リン脂質からなる脂質二重層にタンパク質分子が溶け込んだ構造を有している。本発明者らは、プローブタンパク質の高次構造に影響を与えることなく電極配線上に固定化することを目的として、タンパク質を直接電極表面上に固定化せずに、細胞膜構造を模した脂質二重層を電極表面上に形成し、その上にプローブタンパク質を配列させた。

本発明において、該第１の分子がビオチンであって、該第２の分子がストレプトアビジンであることが好ましく、さらに該第３の分子がビオチンであることが好ましい。

本発明の１の局面において、該１または複数のプローブタンパク質が抗体であることを特徴とする。

本発明によるバイオチップは、基板上に１または複数の電極配線を形成し、該１または複数の電極配線を絶縁膜で被覆し、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルを形成し、次いで、該１または複数のウェルの底部にプローブタンパク質を固定化することによって作製する。

さらに、本発明は、少なくとも、作用電極、対極および参照電極を含むバイオセンサーであって、
ここに、該作用電極は、１または複数のプローブタンパク質が配列して固定化されているバイオチップであって、基板上に１または複数の電極配線が形成され、該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に、電極表面に達する１または複数の孔を設けることによって１または複数のウェルが形成され、該１または複数のウェルの底部にプローブタンパク質が固定化されているバイオチップであり、
処理前に、該バイオチップの第１の電気的信号を測定し；
該バイオチップを試験溶液中で処理した後、該バイオチップの第２の電気的信号を測定し；次いで、
第１の電気的信号と第２の電気的信号との強度差から、試験溶液中に存在する、該１または複数のプローブタンパク質と特異的結合する非標識ターゲット分子を検出することを特徴とするバイオセンサーを提供する。

ここで、「処理」とは、プローブタンパク質と非標識ターゲット分子とを特異的結合させるために必要なプロセスをいう。したがって、処理前、バイオチップにおいては、該１または複数のプローブタンパク質には非標識ターゲット分子が結合していない。また、試験溶液中に該非標識ターゲット分子が存在していれば、この処理によって、該１または複数のプローブタンパク質に非標識ターゲット分子が特異的結合する。本発明のバイオチップに上記の処理を行う前後で、電気的信号を測定し、電気的信号に変化があれば、該試験溶液中に、非標識ターゲット分子が存在していたことを確認することができる。

本発明において、特に、電気的信号として酸化還元電流値を用いる。
すなわち、本発明によれば、非標識ターゲット分子のプローブタンパク質への特異的結合の有無をバイオチップのバイオ分子アレイ上の酸化還元状態の変化から検出する。したがって、ターゲット分子に蛍光物質等を標識することなく、酸化還元電流値を測定するだけで特異的結合を検出できるので、迅速かつ簡便な測定が可能となる。
すなわち、プローブタンパク質にターゲット分子が結合していない系で測定した電気的信号とプローブタンパク質にターゲット分子が結合した系で測定した電気的信号との間に統計学的に有意な変化があった場合、当該有意な変化をターゲット分子とプローブタンパク質との特異的結合に関連付けることができる。

本発明の１の局面において、該非標識ターゲット分子が抗原であって、該バイオチップに固定化された１または複数のプローブタンパク質が該ターゲット分子に対する抗体である。例えば、該非標識ターゲット分子がヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）であって、該バイオチップに固定化された１または複数のプローブタンパク質が抗ＨＳＡ抗体である。

本発明のバイオセンサーを用いて電気的信号を測定するとき、好ましい態様において、その表面にＡｕ粒子が付着している非標識ターゲット分子を用いる。
これにより、ターゲット分子が絶縁体であるタンパク質であっても、その表面が導電性になるため、特異的結合に起因する電気的信号の変化を検出することが容易になる。

本発明によるバイオチップを用いれば、蛍光標識を用いることなくターゲット分子の存在を認識することができるので、迅速、簡便に測定が可能で、かつ、小型化されたバイオセンサーを構築することができる。
また、本発明によれば、電極上に脂質二重層を固定化し、その上にプローブタンパク質を固定化するので、プローブタンパク質の高次構造を破壊することなく、かくして、プローブタンパク質の特異性を損なうことがない。
さらに、本発明によるバイオチップには、複数の電極上に各自異なるプローブタンパク質を固定化することができるので、複数種類のターゲット分子を同時に検出することができる。

実施例１：タンパク質チップの作製
本発明によるタンパク質チップの上面図を図１に示す。この実施例では、ガラス基板１０上に８本の電極配線１３を形成し、一度に８点測定が可能なタンパク質チップ１を形成した。
電極配線１３の一方の端部にはバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部にはバイオ分子アレイ領域で検出した電気的信号を取り出すためのパッド１３２が形成されている。
図２にバイオ分子アレイ領域１３１の拡大上面図を示す。バイオ分子アレイ領域１３１上には絶縁性レジスト膜１４が形成され、この絶縁膜に１または複数の孔を設けることによって、バイオ分子を固定化するための１または複数のウェル１３１ａが形成されている。
バイオ分子アレイ領域１３１には、ウェル１３１ａの直径が５μｍ以上の場合、図２ａに示すように単一のウェルを形成することができ、ウェル１３１ａの直径がサブミクロン以下２０ｎｍ程度までの場合、図２ｂに示すように複数のウェルを配列させることができる。

バイオ分子アレイ領域１３１の断面図を図３ａに示す。この実施例では、ガラス基板１０上に、まず、Ｔｉ薄膜１３ａを形成し、その上にＡｕ薄膜１３ｂを形成することによって、Ａｕ／Ｔｉ積層薄膜からなる電極配線１３を形成した。Ａｕ薄膜を直接ガラス基板に形成することもできるが、Ａｕ薄膜の接着強度が弱いので、Ａｕ薄膜の剥離を防止し、バイオチップの信頼性を向上させるためにＴｉ薄膜を用いた。Ｔｉ以外にＣｒを用いることもできる。

この図が示すように、絶縁性レジスト膜に形成された孔は、下部層の電極配線の表面にまで達している。すなわち、バイオ分子アレイ領域に形成されたウェルの側面は絶縁性レジスト膜１４により定められ、ウェルの底部は電極配線の表面により定められている。
この構成によって、図３ｂに示すように、ウェル１３１ａの底部の露出した電極表面上にのみプローブとなるバイオ分子を固定化する。

ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、その特性および構造がよく知られており、商業的に容易に入手可能であり、またＨＳＡに対する抗体も容易に作製することができるため、この実施例において、ターゲットタンパク質６（図示せず）としてＨＳＡを用い、プローブ２としてヤギ抗ＨＳＡ抗体を用いた。

本発明のタンパク質チップを作製するために、半導体製造技術の１つであるフォトファブリケーション技術を用いた。ここでは、「フォトファブリケーション技術」なる用語は、フォトリソグラフィー技術、蒸着技術、エッチング技術などを組み合わせた技術を意味する。
フォトファブリケーション技術はすでにＩＣやＬＳＩ製造技術の１つとして確立されているため、従来のＤＮＡチップのように小型化や製造工程の自動化が可能で、チップの大量生産や低コスト化につながる。

図４ないし図９は、本発明のＤＮＡチップを作製する工程を示す概略図である
まず、直径５μｍ以上の単一ウェル（第１の具体例）を作製する工程について説明する。基板１０上にスピンコータを用いて感光性材料であるフォトレジスト１１を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図４ａ,４ｂ）。この実施例ではガラス基板を用いたが、アルミナ基板、シリコン基板、または、シリコーン樹脂のごとき樹脂製基板等のいずれの材質の基板も用いることができる。
次いで、フォトマスクを用いて紫外線１２ａで２０秒間露光し（図４ｃ）、フォトレジスト１１を現像して電極配線１３用の配線パターンを形成する（図４ｄ）。フォトレジストには、露光によって結合が分解して現像液に溶解するもの（ポジ型）と、逆に重合して溶解しないもの（ネガ型）があるが、ここではフォトレジスト１１としてポジ型レジスト（ＡＺ１５００：クラリアントジャパン株式会社）を用いた。

その後、真空蒸着やＲＦスパッタリングなどの蒸着技術によって基板上に電極材料となる金属薄膜を形成する（図４ｅ）。
さらに、これをアセトンのごとき有機溶媒中に浸漬して、レジスト１１を剥離することによって、ガラス基板１０上に電極配線１３を形成した（図４ｆ）。電極配線１３が形成されたチップの概略上面図を図６ａに示す。図６において、一方の端部に円形のバイオ分子アレイ領域１３１が形成され、他方の端部には電気的信号を取り出すための角型パッド１３２が形成された電極配線が示されているが、これは電極配線の一例であって、この形状に限定されるものではない。当業者であれば、バイオセンサーに搭載されるバイオチップとして使用できるいずれの形状にも変形することができる。
また、電極配線の本数も、使用の形態に適合させて、適宜増減することができる。

次に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＡＺ１５００）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図５ａ）。次いで、フォトマスクを用いて紫外線１２ａで２０秒間露光し（図５ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上にウェル１３１ａを形成した（図５ｃ）。これを１５０℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させた（図５ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図を図６ｂに示す。

次に、直径がサブミクロン以下のウェルのアレイ（第２の具体例）を作製する工程を説明する。直径５μｍ以上の単一ウェルを作製したときと同様にして電極配線を形成し（図４）、その後、図５ａに示す工程と同様に、スピンコーターを用いて電極配線１３が形成された基板上に絶縁性レジスト１４（ＺＥＰ５２０：日本ゼオン株式会社）を塗布し、９０℃にて２分間ベーキングする（図７ａ）。次いで、７５ｋＶにて電子ビーム１５を照射し（図７ｂ）、レジスト１４を現像することによって電極表面を露出させて、バイオ分子アレイ領域１３１上に複数のウェル１３１ａの配列を形成した（図７ｃ）。これを２００℃にて５分間ベーキングすることによって、レジスト１４を固着させた（図７ｄ）。ウェルが形成されたチップの概略上面図を図８に示す。

従来の半導体製造技術を用いれば、基板上にウェルを形成することができるので、上記の条件に限定されることなく、適宜、当業者によく知られた他の条件でウェルを形成することができる。

次に、生物化学の分野でよく知られている方法を用いて、ウェル底部の電極表面上に脂質二重層を形成した。具体的には、まず、チップをピランハ溶液（Ｈ_２Ｏ_２：Ｈ_２ＳＯ_４＝１：３［ｖ／ｖ］に１０分間浸漬してウェル底部の電極表面上の有機不純物質を除去し、純粋で十分に洗浄し、エタノールで洗浄した後（図９ａ）、１−オクタデカンチオール（ＯＤＴ）３のエタノール溶液に浸漬してＯＤＴ３をその−ＳＨ基を介して電極表面に結合させた（図９ｂ）。
次いで、リン酸バッファー（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）中に１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）４を溶解して（１０ｍＭ）、ＰＯＰＣ４のリポソーム溶液を調製する。このリポソーム溶液をチップに滴下し、湿度１００％の環境で１時間静置して、電極表面上にＰＯＰＣ４の脂質二重層を形成した（図９ｃ）。
あるいは、９９．９モル％のＰＯＰＣ４および０．１モル％のＯＤＴ３をクロロホルム中でよく混合した後、溶媒をＰＢＳに交換して混合リポソーム溶液を調製し、このリポソーム溶液をチップに滴下して、電極表面上にＰＯＰＣ４の脂質二重層を形成する（図９ｃ）。
いずれの場合も、ウェル底部の電極表面にのみ脂質二重層が固定化されるように、前記のレジスト１４はＯＤＴの−ＳＨ基が結合しない材料であることが必要である。

原子力間顕微鏡（ＡＦＭ；セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＰＩ３８００）を用いて、脂質二重層が形成された電極表面を観察したところ、電極表面全体に均一に脂質二重層が形成されていることが確認された（図示せず）。

脂質二重層を電極表面に固定化する別法として、アミノカップリング法を用いることもできる。具体的には、ピランハ溶液で洗浄したチップを３,３’−ジチオジプロピオン酸（ＤＴＤＰ）のエタノール溶液に浸漬して、ＤＴＤＰをその−Ｓ−Ｓ−基を介して電極表面に結合させる。次いで、ジオキサンおよび水（９：１［ｖ／ｖ］）中のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）および１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−カルボジイミド塩酸（ＥＤＣ）の混合溶液にチップを浸漬して、ＤＴＤＰのカルボキシル基を活性化する。ここに、ＰＯＰＣ４のリポソーム溶液を添加し、ＰＯＰＣ４のアミン基とＤＴＤＰのカルボキシル基とを結合させることによって、ＰＯＰＣ４の脂質二重層を電極表面に固定化する。

次に、１ｍＭの（１１−フェロセニル）ウンデシルポリオキシエチレン（Ｆｅ−ＰＥＧ）５および０．１ｍＭのビオチン化した１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｂｉｏ−ＰＥ）２１のリン酸バッファー混合溶液（ｐＨ７．４）を脂質二重層が形成されたチップに滴下し、１時間放置して脂質二重層上にＦｅ−ＰＥＧ５およびＢｉｏ−ＰＥ２１をアンカーした（図９ｄ）。このとき、Ｆｅ−ＰＥＧ５およびＢｉｏ−ＰＥ２１の混合溶液中のモル濃度比を適宜調整することによって、Ｂｉｏ−ＰＥ２１が分散して適度な密度で脂質二重層上にアンカーされるようにする。
脂質二重層は絶縁性であるので、脂質二重層上での現象を電気的信号として検出することが不可能である。そこで、脂質二重層表面を導電性にする目的で、Ｆｅ−ＰＥＧ５を用いる。

さらに、このビオチン修飾脂質二重層が形成されたチップに０．２ｍｇ／ｍｌのストレプトアビジン２２の水溶液を滴下し、湿度１００％の環境で１時間静置して、Ｂｉｏ−ＰＥ２１のビオチンとの特異的結合により、ストレプトアビジン２２を結合させた（図９ｅ）。ＰＢＳで洗浄することによって、脂質二重層に固定化されていない未結合のストレプトアビジンを除去した。

ストレプトアビジンは、ビオチンと生物学的に最も強固で安定に結合（Ｋ_ｄ＝１０^−１５Ｍ）するタンパク質であり、４分子のビオチンと結合する。
ストレプトアビジン−ビオチン間の特異的結合を利用して、ストレプトアビジンを修飾した分子と、ビオチンを修飾したもう一つの分子とを結合させる手法が一般的に用いられている。したがって、様々なタンパク質にビオチンを修飾する技術がすでに確立され、そのためのキットも市販されている。また、ビオチン修飾したＤＮＡも商業的に入手可能である。

Ｂｉｏ−ＰＥ２１は脂質二重層上に分散してアンカーされ、１つのストレプトアビジン分子には、１つのビオチンしか結合していないと考えられる。

最後に、予めビオチン化したプローブ抗体２３の溶液にストレプトアビジン固定化チップを浸漬することによって、ストレプトアビジン−ビオチンの特異的結合を介してプローブ抗体２３をウェル底部に固定化した（図９ｆ）。

ストレプトアビジンが基板上に固定化されている場合、ビオチンの有効結合数は１であることがすでに知られている。固定化によりビオチンが接近可能なストレプトアビジンの結合部位が限定されているためと考えられる。特に、本発明の場合、ビオチンにはタンパク質が結合しているので、１つのビオチン化タンパク質がストレプトアビジンに結合した後、立体障害によりさらなるビオチン化タンパク質がストレプトアビジンに接近できないためと考えられる。したがって、１つの固定化ストレプトアビジン２２には１つのビオチン化プローブ抗体２３が結合していると十分に考えられる。

実施例２：タンパク質チップのＨＳＡ結合能力評価
実施例１で作製されたタンパク質チップ１を作製したときと同様の条件で、水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ；株式会社イニシアムＡＦＦＩＮＩＸ Ｑ）測定用の２７ＭＨｚ水晶振動子の表面にプローブ抗体２３を固定化して、ターゲットタンパク質６（ＨＳＡ）の結合能力を評価した。

具体的には、まず、図７ｅに示すように、ストレプトアビジン２２まで結合させた段階の試料を用いて、１ｍｇ／ｍｌのプローブ抗体２３（ビオチン化ヤギ抗ＨＳＡ抗体）の溶液５μｌをインジェクションすると（インジェクション時刻を矢印で示す）、時間とともに発振周波数が下降し、ストレプトアビジン２２にプローブ抗体２３が結合したことが確認された（図１０ａ）。さらに、プローブ抗体２３が結合した試料を用いて、１００μｇ／ｍｌのＨＳＡ溶液５μｌをインジェクションすると、発振周波数が下降し、ＨＳＡが結合したことが確認された（図１０ｂ）。

比較のため、図７ｄに示すように、ストレプトアビジン２２が結合していない段階の試料を用いて、１ｍｇ／ｍｌのプローブ抗体２３（ビオチン化ヤギ抗ＨＳＡ抗体）の溶液５μｌをインジェクションすると（インジェクション時刻を矢印で示す、時間とともに発振周波数が下降し、脂質二重層上にプローブ抗体２３が結合したことが確認された（図１１ａ）。しかしながら、この試料に、１００μｇ／ｍｌのＨＳＡ溶液をいくらインジェクションしても、インジェクションショックによる発振周波数の上昇は見られたが、発振周波数が下降することはなかった。したがって、ストレプトアビジンが存在しなければ、ＨＳＡは結合しないことが確認された（図１１ｂ）。

上記の結果から、ストレプトアビジンを介して、脂質二重層上にプローブ抗体を配列することによって、ターゲット分子である抗原と効率的に結合することが分った。
すなわち、本発明により、プローブタンパク質とターゲット分子とが効率よく結合できるようにプローブタンパク質の配向性を制御することが可能となった。

実施例３：タンパク質チップの検出性能評価
実施例１で作製された第１の具体例のタンパク質チップ１（直径２００μｍの単一ウェル）を用いて、バイオセンサーを構築し、ターゲットタンパク質６の検出実験を行った。
具体的には、５ｍＭのＫ_３［Ｆｅ（ＣＮ）_６］および１００ｍＭ ＫＣｌの混合水溶液中、タンパク質チップ１を作用電極とし、白金を対極とし、銀／塩化銀を参照電極として電気化学セルを構成して、サイクリックボルタンメトリーによって、タンパク質チップ１の酸化還元電位を測定した。また、測定は２５℃にて行い、電位の掃引速度は５０Ｖ／秒とした。

まず、本発明のバイオセンサーの機能を確認するために、タンパク質チップ１の製造工程の各段階および、プローブ抗体２３にターゲットタンパク質６を結合させたとき、電流電位曲線を得た。
具体的には、図９ｅに示すように、Ｂｉｏ−ＰＥ２１にストレプトアビジン２２を結合させた状態（図中、Ａで示す）；ストレプトアビジン２２にビオチン化プローブ抗体２３を結合させた状態（図中、Ｂで示す）；および、ビオチン化プローブ抗体２３にターゲットタンパク質６（ＨＳＡ）を結合させた状態（図中、Ｃで示す）の３つの状態において、電流電位曲線を得た（図１２）。
図１２に示す電流電位曲線において、ピーク電流値が酸化還元電流値を示している。

図１２から分るように、ストレプトアビジン２２にビオチン化プローブ抗体２３が結合したとき（状態Ａから状態Ｂへの変化）にも、プローブ抗体２３にターゲットタンパク質６が結合したとき（状態Ｂから状態Ｃへの変化）にも、酸化還元電流値の絶対値が減少した。
すなわち、この条件下で、酸化還元電流値を測定しても、値の変化をターゲットタンパク質６のプローブ抗体２３への特異的結合と関連付けることができない。

本発明者らは、この現象は、脂質二重層の表面が十分に導電性ではないうえに、ターゲットであるタンパク質も絶縁性であることに起因し、ターゲットタンパク質がプローブ抗体に結合して酸化還元状態が変化しても、その電気的信号を電極で検出することができないためと考えた。
そこで、本発明者らは、ターゲットタンパク質の表面を導電性にすることによって、この系における電気的信号の伝達性を改善することにした。

本発明では、ターゲットタンパク質であるＨＳＡを導電性にするために、その表面にＡｕ粒子を静電相互作用により付着させた。
Ａｕ粒子は水溶液中で負に荷電しているので、ＨＳＡの表面の荷電が正になれば、その表面上にＡｕ粒子を付着させることができる。ＨＳＡの等電点ｐＩは４．９であって、ｐＨが４．９を下回るとＨＳＡは正に荷電する。

そこで、１ｍｇ／ｍｌのＨＳＡ水溶液中に５ｎｍ径のＡｕ粒子（BB International）を添加してその粒子濃度を５×１０^１３粒子／ｌとした混合溶液を調製した。次に、この混合溶液のｐＨを４．６に調整し、３７℃にて１０時間反応させて、ＨＳＡの表面にＡｕ粒子を付着させた。

このＡｕ粒子が付着したターゲットタンパク質６’（Ａｕ−ＨＳＡ）を用いて、図１２に示される電流電位曲線を得たときと同様にして各段階で電流電位曲線を得た（図１３）。
この場合、ストレプトアビジン２２にビオチン化プローブ抗体２３が結合したとき（状態Ａから状態Ｂへの変化）には、上記と同様に、酸化還元電流値の絶対値が減少したが、プローブ抗体２３にＡｕ−ＨＳＡが結合したとき（状態Ｂから状態Ｃへの変化）には、酸化還元電流値の絶対値が増大した。
すなわち、Ａｕ粒子をＨＳＡの表面に付着させることにより、酸化還元電流値の変化をターゲットタンパク質６のプローブ抗体２３への特異的結合と関連付けることができた。

実施例４：ナノサイズウェルのアレイを有するタンパク質チップの作製
バイオ分子アレイ領域上に２００×２００個の配列で直径１００ｎｍのウェルを形成した第２の具体例のＤＮＡチップを作製した。

バイオ分子アレイ領域に１００ｎｍ径ウェルのアレイを形成し、実施例１に記載された方法で複数のウェル底部の電極表面上にプローブタンパク質２を固定化して（図９）、第２の具体例のＤＮＡチップを作製した。

原子力間顕微鏡（ＡＦＭ；セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＰＩ３８００）を用いてタッピングモードで、第２の具体例のバイオ分子アレイ領域１１３の表面を観察した（図１４）。共振周波数１２５ｋＨｚおよびバネ定数１４Ｎ／ｍのシリコン製カンチレバー（セイコーインスツルメンツ株式会社ＳＩ−ＤＦ−２０）を用いた。
このＡＦＭ像から、各ウェル（黒色円形に示される領域）にストレプトアビジン（ウェル内、白色で示される物質）が固定化されているのが確認された。また、観察視野全体にわたって、均一にウェル内にストレプトアビジンの存在が確認された。

かくして、プローブタンパク質がバイオ分子アレイ領域１１３に形成された複数のウェルに均一に分散して固定化されたタンパク質チップが得られた。

以上の結果から、本発明によれば、ターゲットタンパク質を蛍光物質等で標識化する必要がないこと、電解質溶液中での測定が可能なこと、マイクロファブリゲーション法を利用して複数の電極を作製することができることから、迅速かつ簡単な解析を可能にし、コストパフォーマンスに優れた次世代ＤＮＡアレイシステムを提供する技術として期待される。

本発明のタンパク質チップの上面図。 本発明のタンパク質チップのバイオ分子アレイ領域の上面図。 本発明のバイオ分子アレイ領域の断面図。 本発明の第１の具体例のタンパク質チップの製造工程を説明する概略図。 本発明の第１の具体例のタンパク質チップの製造工程を説明する概略図。 本発明の第１の具体例のタンパク質チップの製造工程を説明する概略図。 本発明の第２の具体例のタンパク質チップの製造工程を説明する概略図。 本発明の第２の具体例のタンパク質チップの製造工程を説明する概略図。 本発明のタンパク質チップの製造工程を説明する概略図。 本発明のタンパク質チップと同様の構成で測定した水晶振動子マイクロバランスを示すグラフ。 タンパク質チップと同様の構成で測定した比較例の水晶振動子マイクロバランスを示すグラフ。 本発明のタンパク質チップおよびＨＳＡを用いて測定した酸化還元電流電位曲線。 本発明のタンパク質チップおよびＡｕ粒子付着ＨＳＡを用いて測定した酸化還元電流電位曲線。 本発明の第２の具体例のＤＮＡチップのＡＦＭ像。

符号の説明

１・・・バイオチップ（タンパク質チップ）、１０・・・基板、１１・・・フォトレジスト、１２ａ・・・紫外線、１２ｂ・・・フォトマスク、１３・・・電極配線、１３１・・・バイオ分子アレイ領域、１３１ａ・・・ウェル、１３２・・・パッド、１４・・・絶縁性レジスト膜、１５・・・電子ビーム、２・・・プローブ、２１・・・ビオチン化１,２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Ｂｉｏ−ＰＥ）、２２・・・ストレプトアビジン、２３・・・ビオチン化プローブ抗体、３・・・１−オクタデカンチオール（ＯＤＴ）、４・・・１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、５・・・（１１−フェロセニル）ウンデシルポリオキシエチレン（Ｆｅ−ＰＥＧ）、６・・・ターゲットタンパク質。

Claims (6)

1. １または複数のプローブタンパク質が配列して固定化されているバイオチップであって、
   基板上に１または複数の電極配線が形成され、
   該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、
   該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に１または複数のウェルが形成され、ここに、該１または複数のウェルの各々は、側面が前記絶縁膜により定められ、底部は電極配線の表面により定められ、
   該ウェルの各々の底部に脂質二重層が形成され、
   該プローブタンパク質に第１の分子が結合され、
   該第１の分子と特異的結合する第２の分子が、該第１の分子と結合し、
   該第２の分子と特異的結合する第３の分子が結合されたアンカー化合物および（１１−フェロセニル）ウンデシルポリオキシエチレンが該脂質二重層にアンカーされ、
   該アンカー化合物に結合された第３の分子と該第２の分子との間の特異的結合によって該１または複数のウェル底部に該プローブタンパク質が固定化されている、バイオチップ。
2. 該第１の分子がビオチンであって、該第２の分子がストレプトアビジンである請求項１記載のバイオチップ。
3. 該第３の分子がビオチンである請求項１記載のバイオチップ。
4. 該１または複数のプローブタンパク質が抗体である請求項１記載のバイオチップ。
5. 少なくとも、作用電極、対極および参照電極から構成された電気化学セルを含むバイオセンサーであって、
   ここに、該作用電極は、１または複数のプローブタンパク質が配列して固定化されているバイオチップであって、
   基板上に１または複数の電極配線が形成され、
   該１または複数の電極配線は絶縁膜で被覆され、
   該１または複数の電極配線の各々の一領域上の絶縁膜に１または複数のウェルが形成され、ここに、該１または複数のウェルの各々は、側面が前記絶縁膜により定められ、底部は電極配線の表面により定められ、
   該ウェルの各々の底部に脂質二重層が形成され、
   該プローブタンパク質に第１の分子が結合され、
   該第１の分子と特異的結合する第２の分子が、該第１の分子と結合し、
   該第２の分子と特異的結合する第３の分子が結合されたアンカー化合物および（１１−フェロセニル）ウンデシルポリオキシエチレンが該脂質二重層にアンカーされ、
   該アンカー化合物に結合された第３の分子と該第２の分子との間の特異的結合によって該１または複数のウェル底部に該プローブタンパク質が固定化されている、バイオチップであることを特徴とするバイオセンサー。
6. K₃[Fe(CN)₆]およびKClの混合溶液中、該電気化学セルが構成されている、請求項５記載のバイオセンサー。

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