JP4402457B2 - アデノウイルスｅ２後期プロモーターの制御のための、インビトロにおけるｙｂ−１の使用、及び、腫瘍の治療を目的とする医薬の製造のための当該使用を活用した核酸構築物の使用 - Google Patents

Description

本発明は、アデノウイルスＥ２後期プロモーターの制御のための、インビトロにおけるＹＢ−１の使用、及び、腫瘍の治療を目的とする医薬の製造のための核酸構築物の使用に関する。

現在、数多くの治療理念に従って腫瘍の治療が進められている。外科的技法を別とすれば、化学療法と放射線療法が主流である。しかしながら、これらの技法はいずれも、患者にとって負担の大きい副作用を伴う。

複製選択的腫瘍細胞溶解ウイルスを利用する、腫瘍治療のための新たな技術的基盤が創出されてきている。この場合、媒介体であるウイルスの選択的腫瘍内複製が引き起こされ、その結果、ウイルスの複製、感染腫瘍細胞の溶解、次いで周囲の腫瘍細胞へのウイルスの拡散へと進展する。ウイルスの複製能が向けられる対象を腫瘍細胞に限定すると、正常組織は感染を免れ、その結果ウイルスによる溶解も免れる。このような複製選択的腫瘍細胞溶解ウイルスとしては、遺伝子弱毒化アデノウイルスやヘルペスウイルスが挙げられる（Ｍａｒｔｕｚａ，Ｒ．ら、サイエンス２５２，８５４−８５８（１９９１）；Ｆｕｅｙｏ，Ｊ．ら、オンコジーン１９，２−１２（２０００））．

種々のアデノウイルスが産業界でよく知られている。それらはｄｓＤＮＡウイルスからなるものである（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ，Ｐら、（１９９１）；Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２７５，２８１−２９９）。アデノウイルスゲノムについてはその完全な塩基配列が知られており、文献に記載されている（Ｃｈｒｏｂｏｃｚｅｋ，Ｊ．ら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１９９２，１８６，２８０−２８５）。アデノウイルスの利用にあたり、特に重要なゲノムの部分は、いわゆる初期遺伝子群とそれらの産物であるＥ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４である。Ｅ１は２種の遺伝子産物Ｅ１ＡとＥ１Ｂ（これらは腫瘍遺伝子である）を含む。Ｅ２グループの計３種の遺伝子産物は、遺伝子産物Ｅ３及びＥ４と共に複製に関与している。

腫瘍細胞溶解アデノウイルスの例としてはｄｌ１５２０（Ｏｎｙｘ−０１５）が挙げられ、これは既に臨床第Ｉ及びＩＩ相で成功裏に用いられている（Ｋｈｕｒｉ，Ｆ．ら、ネーチャー・メディシン６，８７９−８８５（２０００））。Ｏｎｙｘ−０１５はアデノウイルスの一種で、Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ遺伝子が欠損しているものである。Ｅ１Ｂ−５５ｋＤａ遺伝子産物は、ｐ５３の阻害、ウイルスｍＲＮＡの輸送、及び宿主細胞の蛋白合成停止に関与する。この場合、ｐ５３の阻害は、ｐ５３とアデノウイルス・コード化Ｅ１Ｂ−５５ ｋＤａ蛋白が複合体を形成することによって起こる。Ｐ５３（コードされてＴＰ５３）は複雑な調節機構を働かせる（Ｚａｍｂｅｔｔｉ，Ｇ．Ｐ．ら、ＦＡＳＥＢ Ｊ，７，８５５−８６５）が、この調節機構により、アデノウイルス等のウイルスの効率的複製が細胞内で抑制される等の結果をもたらす。ヒトの全腫瘍の約５０％で遺伝子ＴＰ５３の欠損あるいは変異が見られ、その結果、化学療法や放射線療法を行なっても期待されるアポトーシスが起こらず、従って通常の場合、この腫瘍治療の成功は起こらないという結果となる。

アデノウイルス等のＤＮＡ腫瘍ウイルスは、感染した細胞を細胞周期のＳ期へと促しウイルスのＤＮＡ複製を進行させる。Ｏｎｙｘ−０１５はＥ１Ｂ−５５ｋＤａ蛋白を発現せず、正常細胞より腫瘍細胞内で選択的に複製する。加えて、更なる選択性も有し、これにより、ｐ５３欠損腫瘍はｐ５３野生型のものに比べウイルスによる腫瘍細胞溶解による壊死の程度が比較的強いという効果がもたらされる（Ｋｈｕｒｉら、上掲参照）。原理的にはウイルス誘導腫瘍細胞溶解においてＯｎｙｘ−０１５が有効であるにも拘らず、ｐ５３欠損腫瘍の場合、腫瘍治療成功率は１５％で、これは非常に低い成功率である。

Ｒｉｅｓらは、ｐ５３野生型の各種腫瘍に対してもＯｎｙｘ−０１５を使ってよい結果を得るためには如何にすべきかについて基本的な可能性を示している（Ｒｉｅｓ，Ｄ．Ｊ．ら、ネーチャー・メディシン６，１１２８-１１３２（２０００））。この場合、腫瘍抑制蛋白ｐ１４ＡＲＦは発現されない。ｐ１４ＡＲＦが存在しないことによって、ウイルス感染に直面したｐ５３系は正常な反応を起こさず、前記ｐ５３野生型腫瘍内でもＯｎｙｘ−０１５の複製を許容する。しかしながら、この知識を実際に応用できるためには、適切な遺伝子的状況が、腫瘍細胞に存在するか或いは適切な治療手段によって提供されることが前提である。前者の場合は、Ｏｎｙｘ−０１５で治療可能な腫瘍の数は更に少ないものとなり、後者の場合は、腫瘍細胞の遺伝子的背景の、時間がかかる困難な改変が必要とされるであろう。

本発明の一様相において、本発明の基本的な課題は、核酸の腫瘍特異的発現を可能にするプロモーターを提供することである。本発明の他の一様相において、本発明は、腫瘍疾患の治療のための医薬を提供するという目的に基づくものである。

本発明は、以下の発明を提供するものである。
第１に、人体から分離された腫瘍細胞の細胞核内のＹＢ−１に、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片を接触させ、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸を発現させる、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片の制御のための、インビトロにおけるＹＢ−１の使用、を提供する。

この第一の様相の使用において、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、配列番号１又は２の核酸配列を含むことを特徴とする態様が提供される。

また、この第一の様相の使用において、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、ＹＢ−１の結合部位を有することを特徴とする態様が提供される。

また、この第一の様相の使用において、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、Ｙボックス、ＴＡＴＡボックス及びＳＰＩ結合部位からなる群から選択される少なくとも一要素を有することを特徴とする態様が提供される。

また、この第一の様相の使用において、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、トランスジーン又はトランスジェニック核酸である態様が提供される。

また、この第一の様相の使用において、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ・システム用遺伝子及びプロテアーゼインヒビターの遺伝子からなる群から選択されるものであることを特徴とする態様が提供される。

また、この第一の様相の使用において、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アンチセンス分子、リボザイム、siＲＮＡｓ及びアプタマーからなる群から選択されるものである態様が提供される。

また、この第一の様相の使用において、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片は、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸を組み込んだベクターに含まれることを特徴とする態様が提供される。

本発明は、第２に、核酸構築物の、細胞核内にＹＢ−１を有する腫瘍細胞を含む腫瘍の治療を目的とする医薬の製造のための使用であって、該核酸構築物は、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片、及び、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸を含有することを特徴とする、核酸構築物の使用、を提供する。

この第二の様相の使用において、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片は、配列番号１及び２からなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、トランスジーン又はトランスジェニック核酸である態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ・システム用遺伝子及びプロテアーゼインヒビターの遺伝子からなる群から選択されるものであることを特徴とする態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アンチセンス分子、リボザイム、siＲＮＡｓ及びアプタマーからなる群から選択されるものである態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、腫瘍細胞が、ＹＢ−１をストレス因子の存在下で細胞核内に有するものであることを特徴とする態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、ストレス因子が、温熱療法、紫外線への曝露及び細胞増殖抑制剤への曝露からなる群から選択されるものであることを特徴とする態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、医薬が細胞増殖抑制剤及び／又は温熱療法と共に用いられるものであることを特徴とする態様が提供される。

また、この第二の様相の使用において、腫瘍細胞が多薬剤耐性を有するものであることを特徴とする態様が提供される。

本発明は、核内のＹＢ−１がアデノウイルスＥ２後期プロモーターと結合し、このプロモーターは、アデノウイルス・システム中で（即ち自然界に現れるアデノウイルス中で）Ｅ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸の発現に非常に適している、という驚くべき知見に基づく。更にまた驚くべき知見として、アデノウイルスＥ２後期プロモーターは他方、非常に強力なプロモーターで、黄金標準として用いられるＣＭＶプロモーターに比べ、プロモーターが不活性である場合、実際は存在しないバックグラウンド発現の存在下で、ほんの少しだけ弱いことが判明した。

本発明に係る使用、即ちアデノウイルスＥ２後期プロモーターの使用は、とりわけ該プロモーターの、ＹＢ−１による調節能によって決定される。なお、ＹＢ−１は正のエフェクターとしての効力を有する、言い換えると、このプロモーターは核内にＹＢ−１が存在する場合にのみ活性である。この点に関し、前記アデノウイルスＥ２後期プロモーターは非常に選択的に調節可能であり、そのため、ＹＢ−１が核内に存在する系において使用可能であり、ＹＢ−１がエフェクターやレギュレーターとして核内に存在しない場合、事実上アデノウイルスＥ２後期プロモーターの制御下にある核酸の如何なる発現をも妨げる。

ＹＢ−１は、ＤＮＡ配列モチーフＹボックスに結合するＹボックス蛋白ファミリーの代表的なものである。Ｙボックスモチーフは、細胞増殖の調節の一端を担う数々の遺伝子のプロモーター領域またはエンハンサー領域に存在する転写調節要素である（Ｌａｄｏｍｅｒｙ，Ｍ．ら、１９９５；Ｂｉｏａｓｓａｙｓ，１７：９−１１，Ｄｉｄｉｅｒ，Ｄ．Ｋ．ら、，１９８８，ＰＮＡＳ，８５，７３２２−７３２６）。

ここに述べる詳細は、前記アデノウイルスＥ２後期プロモーターの断片（本明細書においてはこれら断片についてもＥ２後期プロモーター、更にはＥ２プロモーターと称する場合がある）、特に配列番号１及び配列番号２としてここに開示されるプロモーター断片にもまた当てはまるものである。

配列番号１の核酸配列は次の通りである。

５’ａｔｔｔｇｔａｃｃｔｇａｇｇａｃｔａｃｃａｃｇｃｃｃａｃｇａｇａｔｔａｇｇｔｔｃｔａｃｇａａｇａｃｃａａｔｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃａａａｔｇｃｇｇａｇｃ−３’

ＹＢ−１の結合に関係すると考えられるＹボックス（ＣＡＡＴ）を、下線を引いて示した。

配列番号１の配列は、Ｅ２後期プロモーターの−２２位から−９６位までの領域である。

配列番号２の核酸配列は次の通りである。

５’ｃｃａｃｇａｇａｔｔａｇｇｔｔｃｔａｃｇａａｇａｃｃａａｔｃｃｃｇｃｃｃｇｃｃａａ−３’

配列番号２の配列は、Ｅ２後期プロモーターの−４７位から−８７位までの領域を含む。

加えて、前記プロモーターの個々の断片又は誘導体は、ＹＢ−１と結合でき、結合後もプロモーター活性を示すことができる限り、本発明の範囲に入るものとして使用できる。ＹＢ−１はＹボックスに対して結合するものと考えられ、或いはＹボックスは二次構造の形成に関与すると思われ（但しこれら推測に固執するものではない）、その結果、Ｙボックスの存在は本発明において用いられるアデノウイルスＥ２後期プロモーター及び対応する断片の形成において重要な意義を有する。

アデノウイルスのＥ２後期プロモーターについては、例えば、Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｓ．とＴｈｉｍｍａｐａｙａ，Ｂ．による次の文献に記載されている：Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９５）１９９，１７７−１９４。アデノウイルス・システムにおいては、Ｅ２後期プロモーターはＥ２初期プロモーターと共にアデノウイルスＥ２領域及び／又は遺伝子Ｅ２Ａ、Ｅ２Ｂを制御する機能を有する。この場合、Ｅ２ｍＲＮＡの合成が最初に始まるのはＥ２初期プロモーターからである。細胞の感染からおよそ５〜７時間たつと、Ｅ２後期プロモーターへの切り替えが起こる。このプロセスの機序は今の所まだ分っていない。

アデノウイルスに感染した初期の段階では、Ｅ１Ａ領域の２種のｍＲＮＡ産物がまず生成される。これら産物のサイズは１３Ｓあるいは１２Ｓである。研究の結果、Ｅ１Ａの１２Ｓ蛋白は、Ｅ２後期プロモーターを介してＥ２領域の活性化を阻害及び／又は抑制することが判明した。一方、Ｅ１Ａの１３Ｓ蛋白をコードする遺伝子はＥ２初期プロモーターを介してＥ２領域及び／又は遺伝子を活性化する（Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ，ＲＡ，Ｏｓｈｅｒｏｆｆ ＷＰ，Ｒｏｓｓｉｎｉ，ＥＭＢＯ Ｊ １９８５，４，７０７−７１３）。

更に、Ｅ２後期プロモーターの−５１位から−３３位のヌクレオチド域の欠損は、ほぼ完全にＥ２領域の合成を抑制することが知られている（Ｇｕｉｌｆｏｙｌｅ ＲＡら、上掲文献参照）。

本発明の範囲において、どのアデノウイルスＥ２後期プロモーターも使用することができる。このような様々のアデノウイルスＥ２後期プロモーターは、技術水準において知られている種々の形態のアデノウイルスによって決定され得る。技術水準において現在、約５０種のサブタイプが知られており、原則的にはこれらのいずれも本発明の範囲において、ベクターとしてあるいはＥ２後期プロモーター源として使用することができる。

Ｅ２後期プロモーターは、数々の構造上及び配列上の特徴を有し、これらは、該プロモーターの使用において（特にプロモーターの断片の使用において）重要であり得る。そのような一特徴として、ヌクレオチドの−４７位から−８１位の範囲におけるループの形成がある。なお、位置−１は、直接的に、プロモーターの制御下で転写される最初のヌクレオチドを示す。このループは、本明細書に記載するＥ２後期プロモーターの２つの断片が結合した部分（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｐａｒｔ）であって、これら２つの断片も本明細書に記載する完全Ｅ２後期プロモーターの性質を示す。Ｅ２後期プロモーターの機能的活性断片に含まれていることが好ましい第二の特徴は、いわゆるＹボックスで、これがＹＢ−１蛋白の結合に関与していると考えられる。Ｅ２後期プロモーターの好ましい実施態様及び本発明に係る断片の一部を構成し得る更なる要素は、ＴＡＴＡボックスとＳＰＩ結合部位である。これについては、ＴＡＴＡボックスは転写開始にとって重要であり、通常、転写開始部位から約２５から３２ｂｐ上流の位置に存在する。Ｅ２後期プロモーター及び／又はその機能的活性断片の更なる特徴はいわゆるＳＰＩ結合部位にあって、この特徴は単独で存在してもよくまた他の上記特徴を補完するものとして存在してもよい。ＳＰＩ結合部位は、いわゆるＧＣボックスにより形成され、これは転写因子ＳＰＩに結合する。１プロモーターにつき２以上のＧＣボックスが存在してもよい。

本明細書に開示する核酸構築物及び／又はＥ２後期プロモーター若しくはその機能的活性断片の存在形態は、ＹＢ−１が結合した形態でもＹＢ−１フリーの形態でもよい。もしＹＢ−１が結合している場合には、プロモーターは機能的に活性であり、適切な転写システムで転写が起こるであろう。一方、ＹＢ−１がない場合には、プロモーターは非活性であるので、転写システムにおいて転写を見ることはできない。適切な転写システムについては例えば次の文献に記載されている：Ｌｅｗｉｎ，Ｂ．Ｇｅｎｅ：Ｌｅｈｒｂｕｃｈ ｄｅｒ ｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｎ Ｇｅｎｅｔｉｋ ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ（ドイツ国ワインハイム６４９０）。

本発明においては、事実上如何なる核酸もアデノウイルスＥ２後期プロモーターの制御下におくことができ、その際、該プロモーターは核酸の発現を制御する。この場合、Ｅ２後期プロモーターはＹＢ−１の厳しい制御を受ける。この場合、可能な核酸として、遺伝子及び一般コード配列、又はその断片を使用することができ、さらに、非コード核酸も使用することができる。最も広いセンスをコードする核酸の発現及びＥ２後期プロモーターによるその制御の場合、プロモーターに通常要求される事項は満たされていると予想される；即ち適切な開始コドンが存在し、プロモーターは、開始コドンからの距離が翻訳が可能である位置に存在する。転写に関して要求される事項についても原則的に同様である。

原則として、本発明の範囲において如何なるコード核酸も使用できる。ＹＢ−１によるプロモーターの特異的な調節能、そしてその結果としての、このエフェクターの存否によって特徴付けられる生体系でのベクターの使用を鑑みて、コード配列とＥ２後期プロモーターの好適な組み合わせが得られる。ＹＢ−１は特に種々の腫瘍イベント（ｅｖｅｎｔｓ）に関連するので、好ましい核酸は、分子レベルで腫瘍の治療に重要であり得るものからなることができる。そのような核酸の例としては、例えばアポトーシス誘導遺伝子が挙げられる。このような遺伝子を、核内にＹＢ−１を有する腫瘍細胞（例えば卵巣癌の３０％［Ｋａｍｕｒａら、１９９９；Ｃａｎｃｅｒ，８５，２４５０−２４５４，Ｓｈｉｂａｏ Ｋ，Ｔａｋａｎｏ Ｈ，Ｎａｋａｙａｍａ Ｙ，Ｏｋａｚａｋｉ Ｋ，Ｎａｇａｔａ Ｎ，Ｉｚｕｍｉ Ｈ，Ｕｃｈｉｕｍｉ Ｔ，Ｋｕｗａｎｏ Ｍ，Ｋｏｈｎｏ Ｋ，Ｉｔｏｈ Ｈ；「ヒト大腸癌におけるＹＢ−１とＤＮＡトポイソメラーゼＩＩアルファ遺伝子の共発現の向上」Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，Ｄｅｃ１０；８３（６）：７３２−７］）に導入すると、そのままでも誘導されていても、腫瘍細胞のみが、プロモーターと結合した遺伝子を発現することができ、その結果、アポトーシス誘導遺伝子によってもたらされるアポトーシスはそれらの細胞のみにおいて起こる。この状況はこのようにして導入されるその他の遺伝子でも同様である。好ましくは、例えば、細胞の挙動（例えば細胞の腫瘍特性）の変化及び／又は腫瘍細胞の選択的殺傷（ｋｉｌｌｉｎｇ）をもたらす遺伝子が導入される。アポトーシス遺伝子に加えて、高度に直接的に細胞イベントに影響を及ぼす遺伝子、例えばプロテアーゼインヒビターの遺伝子を、導入することができる。そのようなプロテアーゼインヒビターは、一般に、腫瘍の侵襲挙動及び／又は転移を阻害する。これらにはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、プラスミノーゲン・アクチベータ系（ｕＰＡ）、カテプシンがある。更に、本発明によれば、Ｅ２後期プロモーターをウイルス蛋白の発現の制御に用いることができる。なお、ウイルス蛋白は、通常（換言すれば、自然界に現れるアデノウイルス類中で）、Ｅ２後期プロモーターの制御を受けない。特に、そのようなウイルス蛋白として、Ｅ３ＡＤＰ、Ｅ４ｏｒｆ６及びＥ１Ｂ５５ｋが挙げられる。Ｅ４ｏｒｆ６は多機能蛋白であって、最大限のウイルスＤＮＡの複製及びウイルス粒子形成に必要とされる。Ｅ４ｏｒｆ６はまた、ウイルスＲＮＡのスプライシング及び輸送に重要な役割を果たす。加えて、Ｅ４ｏｒｆ６はウイルス蛋白Ｅ１Ｂ５５ｋと相互作用しｐ５３の不活化を促進する。Ｅ１Ｂ５５Ｋもまた多機能蛋白であって、Ｅ４ｏｒｆ６蛋白と相互作用してウイルスＲＮＡの核外への輸送を促進する一方、細胞固有のＲＮＡは細胞核内に保持される。Ｅ１Ｂ５５ｋの更なる重要な機能は、Ｅ１Ｂ５５ｋ単独で及び／又はＥ４ｏｒｆ６と共に、細胞蛋白ｐ５３を不活化することである。Ｅ３ＡＤＰ（これはアデノウイルス死蛋白（ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｄｅａｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎ）とも称される）は、効率的な細胞溶解及び新たに合成されたウイルスの放出に必要とされる、必須の膜糖蛋白である。上述のウイルス蛋白は、この技術分野における専門家に知られており、文献に記載されている。

細胞の選択的殺傷は、導入された遺伝子の影響の結果として直接的に、あるいは導入された遺伝子によってもたらされる細胞の変化の結果として間接的に起こり得る。そのような変化は、例えば、さらに外部から供給された化合物がまずこの細胞に作用し、その結果、例えば、腫瘍細胞の殺傷に至り得る。このアプローチの例としては、プロドラッグ・システムに帰すべき遺伝子がある。プロドラッグ・システムは特に酵素系であって、例えば医薬として生体組織に取り込まれた代謝不活性な化学種の化合物を、体内でのみ医薬として有効な形態に転換させるものである。例えばチミジンキナーゼ系（ＴＫシステム）は、プロドラッグの一例である。これは、プロドラッグであるガンシクロビルの添加に続いて起こる単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｌｅｘ ｓｉｍｐｌｅｘ）チミジンキナーゼ遺伝子（ＨＳＶｔｋ）の発現に基づくものである。チミジンキナーゼ系は、この形態ではヒトへの毒性はない。チミジンキナーゼはガンシクロビル基質をリン酸化する。プリン・アナログが形成されるが、これは毒性である。他の例はシトシンデアミナーゼ遺伝子系（ＣＤ）である。

アデノウイルスＥ２後期プロモーターの非コード核酸への結合は、例えば、ｒＲＮＡやｔＲＮＡにも可能である。この点に関し、細胞系の機能にとって必須であるこのＲＮＡポピュレーションの高発現が可能である。一方、ＲＮＡポピュレーションは、数多くの細胞作用や機能に関連するであろう。

アデノウイルスＥ２後期プロモーターの制御を受けることができる非コード核酸の更なる形態は、アプタマー、リボザイム、アンチセンス分子及びsiＲＮＡｓである。アプタマーは核酸であって、好ましくは、選択された標的分子に特異的に結合するリボ核酸である。そのようなアプタマーの調製は、ヨーロッパ特許第０５３３８３８号公報等に記載されている。アデノウイルスＥ２後期プロモーターの制御を受けることができる核酸の他のグループはアンチセンス分子からなるものであって、その作用原理は、これら分子がｍＲＮＡと複合体を形成し、これによってｍＲＮＡの翻訳が阻止されるという事実に基づいている。一実施態様においては、アンチセンス分子はまた、細胞ＲＮａｓｅのＨ系が活性化され、そしてこのＲＮａｓｅのＨ系の酵素活性の結果、アンチセンス分子と複合体を形成したあるいはハイブリダイズしたｍＲＮＡが分解されるような形態をとることもまた知られている。

最後に、この非コード核酸もまたリボザイム（即ち触媒活性を有し、分子内若しくは分子間核酸、とりわけリボ核酸、をスプリット可能な、換言すれば加水分解可能な核酸）からなることができる。リボザイムの配列特異性の結果、細胞等の生物学的系において特定の核酸ポピュレーションを選択的に加水分解することができ、生物学的プロセスに影響を及ぼすことができる。

本明細書に開示する核酸構築物は、Ｅ２後期プロモーターとその断片の様々な用途に関し上に記載したような範囲において、設計することができる。

核酸構築物は種々の形態をとることができる。よって核酸構築物がベクターの一部であることは本発明の範囲内である。そのようなベクターは当業者に知られており、例えば、プラスミド及びウイルスを包含する。好ましくは、ベクターは真核細胞のためのベクター、特に哺乳類細胞のためのベクターである。ウイルスベクターとしては、とりわけアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）及び単純ヘルペスベクターが挙げられる。これら全ベクターについては既に言及されており及び／又は文献に記載されている（Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ＧＪ，Ｃｈａｐｌｉｎ，Ｄ．，Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，ＳＴ．，Ｃｈｉｕ，ＲＫ，ＭｃＢｒｉｄｇｅ，Ｗｈ．「インビボでの癌の遺伝子療法、腫瘍ターゲッティング」２，１０６−１１４（１９９６）；「薬学の進歩：遺伝子療法」Ｊ．Ｔｈｏｍａｓ編、８月、第４０巻、アカデミック・プレス）。

本発明の核酸構築物は、一般に医薬品の製造に用いることができる。この点に関し、これら医薬品は、ここに開示したアデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的活性断片を用いることによって作られる及び／又は有効になるという特徴を有する限りにおいて、これら医薬品の適応のタイプに関し何ら制限はない。言い換えると、本発明に係る医薬は、アデノウイルス後期Ｅ２プロモーター又はその機能的活性断片の制御を受けるという条件さえ満たせば、公知の遺伝子や一般的核酸からなるものを包含する。

本発明の医薬の使用に関する好ましい適応は腫瘍疾患である。これは、本明細書に記載した、ＹＢ−１のアデノウイルスＥ２後期プロモーターへの結合、及びこれに基づく該プロモーターの特異的調節能に基づき、その結果、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的活性断片の制御下にある各核酸が、核内にＹＢ−１を有する腫瘍細胞において特異的に発現する。正常な細胞、とりわけ正常なヒト細胞は、細胞質にのみＹＢ−１を有するので、これらの細胞はアデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的活性断片の制御を受ける核酸を一切発現しない。

アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的活性断片の制御を受ける核酸の活性化と、細胞核に存在するＹＢ−１とを組み合わせることにより、本発明の核酸構築物で次のような特定の疾患（特に腫瘍疾患）をも治療することができる。即ち、この特定の疾患とは、ＹＢ−１を核内に存在せしめる一定の条件が存在する場合にのみＹＢ−１が、主として、或いは前記特定の条件が存在しない場合と比べて増加した量で、細胞核内に存在する疾病である。腫瘍疾患の範囲において、ＹＢ−１の核内への局在化は、腫瘍細胞をストレス因子に曝すことによって達成することができる。そのようなストレス因子の例としては、温熱療法、紫外線照射、又は、腫瘍細胞や腫瘍細胞を含む生体の細胞増殖抑制剤（ｃｙｔｏｓｔａｔｉｃｓ）による処理等が挙げられる。このような細胞増殖抑制剤は、特にシス白金（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ）を含む。

本発明の核酸構築物による処置（治療）が基本的に可能である他の細胞は、いわゆる多薬剤耐性腫瘍細胞である。多薬剤耐性はＰ−糖蛋白の合成によって引き起こされる。ＹＢ−１とＭＤＲ−１遺伝子発現（ＭＤＲ−多薬剤耐性）の関係については、Ｂａｇｏｕらにより文献記載されている（Ｂａｇｏｕ，Ｒ．Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．３，１９９７，４：４４７〜４５０）。この関係により、Ｐ−糖蛋白陽性である、このような腫瘍細胞またはこれらを含む腫瘍に、本発明の核酸構築物により、処置を施すことができ、そして治療することができる。

以下、本発明を図、実施例及び配列表によって説明するが、これにより本発明の更なる特徴、実施態様及び利点が導かれるであろう。

実施例１：Ｅ２後期プロモーターはＹＢ−１に特異的である
Ｅ２後期プロモーターを、ベクターｐＧＬ３エンハンサー（プロメガ社）中、ＸｈｏＩとＨｉｎｄＩＩＩの間に挿入してクローニングした。このベクターは、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子又はＧＦＰ遺伝子を有する。ＧＦＰが発現されると直ぐ、細胞は緑色に光る。まず、ウェル当たり２００，０００個のＵ２ＯＳ細胞を６穴プレートに播種した。２４時間後、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔを用い、製造業者（キアーゲン社）記載の指示に従ってＥ２後期プロモーターの各種断片を含有する種々のベクターでトランスフェクションを行った。プラスミドは、ｐＧＬ３エンハンサーベクター（プロメガ社）から調製し、その際、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子ＧＦＰ（緑色蛍光蛋白）に換えた。

更に２４時間後、当該細胞を、Ｅ１／Ｅ３を欠失したアデノウイルス（ＡｄｌａｃＺ、図１の左列）とＡｄＹＢ−１（図１の右列）を用いて５０ｐｆｕ／細胞で、感染させた。ＡｄＹＢ−１はＥ１／Ｅ３を欠失したアデノウイルスで、転写因子ＹＢ−１をトランスジーンとして発現する。更に２４時間後、蛍光顕微鏡下で評価を行った。その結果、完全なＥ２後期プロモーターのみが図１Ｄに示されるようにＹＢ−１の発現によって活性化されていることが明白に示された。図１Ａ及び図１Ｂに示されている細胞は、陽性コントロールとしてプラスミド構築物でトランスフェクションを行ったものであり、この場合、緑色蛍光蛋白はサイトメガロウイルスプロモーター（ＣＭＶ）の制御下にあった。図１Ｃ及び図１Ｄに示す構築物や試験の場合、Ｅ２後期プロモーターを本発明により用いた。即ち、緑色蛍光蛋白の発現はこのプロモーターによって制御された。図１Ｅ及び図１Ｆに示す細胞の場合、アデノウイルスのＥ２後期プロモーターの代わりに、アデノウイルスの変異Ｅ２後期プロモーターを用いた。変異はＹＢ−１ボックス内にあり、その際、ＡＴＴＧＧの変わりに配列ＧＣＣＴＧが使用された。

実施例２：Ｅ２後期プロモーターはＹＢ−１核陽性細胞に特異的である
耐性ＹＢ−１核陽性細胞におけるＥ２後期プロモーターの特異性を調べるために、次の実験を行なった。

ウェル当たり２，０００，０００個の細胞を６穴プレートに播種した。レポーター遺伝子ＧＦＰを有するｐＧＬ３エンハンサーベクター（プロメガ社より入手可能）中の合成したＥ２後期プロモーターで、キアーゲン社のＳｕｐｅｒｆｅｃｔを用いて同社が記載する指示に従って２４時間後に、当該細胞のトランスフェクションを行った。更に４８時間経過後、蛍光顕微鏡下で評価を行った。

図２Ａは、骨肉腫細胞Ｕ２ＯＳが核内にＹＢ−１を有しないという結果を示す。図２Ｂは、多薬剤耐性の胃癌細胞２５７ＲＤＢを用いた結果を示す。この細胞の場合、ＹＢ−１は細胞核内に局在している。この結果は、レポーター遺伝子ＧＦＰが、ＹＢ−１核陽性の２５７ＲＤＢ細胞中でのみＥ２後期プロモーターによって活性化されることを明らかに示している。

本明細書、請求項及び図面に開示した、本発明を性格づける数々の特徴は、それぞれ単独でもまた如何なる任意の組み合わせでも、本発明を種々の態様において実施するにあたり基本的特徴である。

図１は、緑色蛍光蛋白をコードするベクターでトランスフェクトしたＵ２ＯＳ細胞の蛍光顕微鏡像であって、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスによる感染（図１Ａ、１Ｃ、１Ｅ）又はＹＢ−１を発現するＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルス（図１Ｂ、１Ｄ、１Ｆ）による感染後の、ＣＭＶプロモーターによる制御（図１Ａ、１Ｂ）、Ｅ２後期プロモーターによる制御（図１Ｃ、１Ｄ）、及びＹＢ−１ボックス内変異Ｅ２後期プロモーターによる制御（図１Ｅ、１Ｆ）を示す。 図２は、アデノウイルスＥ２後期プロモーターで制御される緑色蛍光蛋白をコードするプラスミドによるトランスフェクション後の、ＹＢ−１核陰性のＵ２ＯＳ細胞（図２Ａ）及びＹＢ−１核陽性細胞（図２Ｂ）の蛍光顕微鏡像を示す。

Claims (18)

1. 人体から分離された腫瘍細胞の細胞核内のＹＢ−１に、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片を接触させ、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸を発現させる、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片の制御のための、インビトロにおけるＹＢ−１の使用。
2. アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、配列番号１の核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１に記載の使用。
3. アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、配列番号２の核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の使用。
4. アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、ＹＢ−１の結合部位を有することを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
5. アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片が、Ｙボックス、ＴＡＴＡボックス及びＳＰＩ結合部位からなる群から選択される少なくとも一要素を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
6. 自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、トランスジーン又はトランスジェニック核酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
7. 自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ・システム用遺伝子及びプロテアーゼインヒビターの遺伝子からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
8. 自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アンチセンス分子、リボザイム、siＲＮＡｓ及びアプタマーからなる群から選択されるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
9. アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片は、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸を組み込んだベクターに含まれることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用。
10. 核酸構築物の、細胞核内にＹＢ−１を有する腫瘍細胞を含む腫瘍の治療を目的とする医薬の製造のための使用であって、該核酸構築物は、アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片、及び、自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸を含有することを特徴とする、核酸構築物の使用。
11. アデノウイルスＥ２後期プロモーター又はその機能的に活性な断片は、配列番号１及び２からなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
12. 自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、トランスジーン又はトランスジェニック核酸である、請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の使用。
13. 自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アポトーシス誘導遺伝子、プロドラッグ・システム用遺伝子及びプロテアーゼインヒビターの遺伝子からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の使用。
14. 自然界に現れるアデノウイルスの中でＥ２後期プロモーターによって制御される核酸とは異なる核酸は、アンチセンス分子、リボザイム、siＲＮＡｓ及びアプタマーからなる群から選択されるものである、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の使用。
15. 腫瘍細胞が、ＹＢ−１をストレス因子の存在下で細胞核内に有するものであることを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用。
16. ストレス因子が、温熱療法、紫外線への曝露及び細胞増殖抑制剤への曝露からなる群から選択されるものであることを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
17. 医薬が細胞増殖抑制剤及び／又は温熱療法と共に用いられるものであることを特徴とする、請求項１０〜１６のいずれか一項に記載の使用。
18. 腫瘍細胞が多薬剤耐性を有するものであることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用。

Images