JP4424158B2 - バイオアッセイ装置とバイオアッセイ方法 - Google Patents
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Description
本発明は、バイオアッセイ装置とバイオアッセイ方法に関する。より詳しくは、物質間の相互作用の場を提供する反応領域に貯留又は保持される媒質の乾燥による濃度変化を防止するように工夫されたバイオアッセイ装置とバイオアッセイ方法に関する。
近年、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイ（以下、本願では「ＤＮＡチップ」と総称。）と呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板が、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されるようになり、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、進化の研究、法医学その他の分野において広範囲に活用され始めている。この「ＤＮＡチップ」は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されていることから、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴とされている。
前記ＤＮＡチップ以外にも、タンパク質関連の相互作用を検出するためのプロテインチップなど、様々なセンサーチップが開発されている。このセンサーチップは、概ね、生体分子などの物質間の相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）の場を提供可能な条件を有する反応領域を、基板上に予め設定しておき、この反応領域中に予め固定化されたプローブ物質とターゲット物質との間の相互作用の有無や程度を、蛍光シグナル検出、表面プラズモン共鳴原理、水晶発振子原理などの測定原理を用いて、検出するという技術である。
このセンサーチップ技術では、極微量の媒質（例えば、溶液）を扱うため、相互作用アッセイ時における該媒質の乾燥は、媒質中の物質の濃度変化や析出の原因となり、測定精度に悪影響を与える。従って、相互作用分析アッセイを行う時には、湿度や温度の好適な環境を設定したり、反応領域を閉塞して水分蒸発を防止したりするなどの対策を講じる必要がある。
例えば、特許文献１には、マイクロアレイ作成時（プローブ固定時）のサンプルスポット作業の際に、サンプル溶液が蒸発すると、マイクロアレイの品質が安定しないという問題を解決するために、マイクロアレイ装置に付設した蒸発発生装置からの水蒸気によってサンプル溶液が蒸発し難い湿度に設定するという技術が開示されている。
また、特許文献２には、多価アルコールを所定量以上ゲルに含ませておくことによって、当該ゲル中の水分の蒸発、ゲルの収縮、ゲルの脱落を抑制する技術が開示されている。
特開２００２−３６３０２号公報。
特開２００３−０７９３７７号公報。
ここで、反応領域中の水分の蒸発（速度）を低下させるためには、（１）相対湿度を上昇させる、（２）温度を下げて飽和蒸気圧を下げる、以上の２通りしか原理的にはないと考えられる。
このため、反応領域でのアッセイ工程を進行させるときの雰囲気全体を高湿度環境に維持するという手段を採用することが考えられる。しかしながら、その効果には限界があり、また、高湿度維持のための機械設備のコストアップ、さらには、メンテナンス対策などが避けられないなどの問題が生じる。
また、サンプル溶液を保持する反応領域を蓋部材などで閉塞することは必要であるとしても、基板上に多数配設される各反応領域へのプローブ物質やターゲット物質の供給（例えば、滴下）作業をすべて完了するまでには時間がかかる。従って、蓋をするまでに、反応領域内の物質濃度は、それぞれの時間経過とともに刻々変化する。
例えば、図１９に示したように、所定の反応領域Ｒに所定量供給された媒質Ｍ１は、時間経過によって乾燥し、その初期容量Ｖ１が次第に減少して、容量Ｖ２（Ｖ２＜Ｖ１）の媒質Ｍ２となる。この媒質の容量変化のため、反応領域Ｒでの物質ｍ（プローブ物質やターゲット物質など）の濃度が変化したり、反応領域Ｒに物質ｍが析出、固着したりするという問題が起こる。この結果、反応領域Ｒ間での物質濃度のばらつきが発生し、検出精度に悪影響を与える。
そこで、本発明は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域に貯留又は保持される媒質が乾燥することによって起こる含有物質の濃度変化や媒質中の物質が析出、固着を防止するために、該反応領域内の媒質から消失した水分を補給可能なバイオアッセイ装置、並びにバイオアッセイ方法を提供することを主な目的とする。
本発明では、以下の「バイオアッセイ装置」と「バイオアッセイ方法」を提供する。
まず、本発明に係る「バイオアッセイ装置」は、ハイブリダイゼーションなどの物質間の相互作用の場を提供する反応領域に対して、前記相互作用に係わる物質を含む媒質を供給するための媒質供給手段と、前記反応領域に対して、必要な水分を自動補給する水分補給手段と、を少なくとも備える。
この装置によれば、例えば、反応領域へ供給された媒質から消失した水分を、該消失水分に一致する容量だけ、適宜のタイミングで、反応領域へ補給することが可能となる。これにより、媒質中の物質濃度を所望の濃度に維持したり、多数の反応領域間で媒質中の物質濃度を均一化したりすることができ、さらには、過剰乾燥による物質の析出や固着を有効に防止することができる。
さらに、本装置では、前記反応領域に保持された媒質の体積を自動検出可能な体積検出手段を持つように工夫し、該体積検出手段から得られる体積変化情報に基づいて、乾燥によって消失した水分に相当する水分を、前記水分補給手段を介して前記反応領域へ供給するようにする。前記体積検出手段は、特に限定しないが、例えば、前記反応領域内に保持された媒質の外形をカメラ出力画像から抽出し、メニスカス形状寸法から算出するという手段を好適に採用できる。
次に、本発明に係るバイオアッセイ方法は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域に対して、前記相互作用に係わる物質を含む媒質と水分を別経路によって供給する工程を、（１）相互作用に係わる物質を含む媒質を供給する手順に続いて、水分を補給する手順、（２）水分を補給する手順に続いて、相互作用に係わる物質を含む媒質を供給する手順、これらのいずれかの手順に従って行う方法である。
本方法により、プローブ物質やターゲット物質などの物質を含む媒質を供給した後に、乾燥により失われた水分を補給したり（（１）の手順）、予め乾燥消失する水分を見込んでおいて水分を補給しておいた後に、プローブ物質やターゲット物質などの物質を含む媒質を供給したり（（２）の手順）、することができる。特に、（２）の手順では、エッジや境界部分における物質の析出や固着を防止するのに有効である。
ここで、本発明で使用する主たる技術用語の定義付けを行う。
「相互作用」は、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、例えば、核酸（ヌクレオチド鎖）間の相補結合であるハイブリダイゼーション、高分子−高分子、高分子−低分子、低分子−低分子の結合又は会合などを広く含む。「ハイブリダイゼーション」は、相補的な塩基配列構造を備える間の相補鎖（二本鎖）形成反応を意味する。
「反応領域」は、ハイブリダイゼーションその他の相互作用の反応場を提供できる領域又は空間である。一例を挙げると、液相やゲルなどを貯留できる反応領域形状を有する反応場を挙げることができる。この反応領域で行われる相互作用は、本発明の目的や効果に沿う限りにおいて、狭く限定されない。
「媒質」は、相互作用に係わる物質（プローブ物質やターゲット物質）やインターカレータなどの相互作用検出に用いる物質などの物質を含有する水分含有媒体である。
「核酸」とは、プリンまたはピリミジン塩基と糖がグリコシド結合したヌクレオシドのリン酸エステルの重合体（ヌクレオチド鎖）を意味し、プローブＤＮＡを含むオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、プリンヌクレオチドとピリミジンヌクレオチオドが重合したＤＮＡ（全長あるいはその断片）、逆転写により得られるｃＤＮＡ（ｃプローブＤＮＡ）、ＲＮＡ、ポリアミドヌクレオチド誘導体（ＰＮＡ）等を広く含む。
本発明によれば、バイオアッセイ用に用意された基板上に配設されている反応領域内において、物質濃度の調整を行うことができるため、精度の良いバイオアッセイプロセスを行うことが可能となる。また、恒湿度チャンバ内の湿度を高湿度に保つ必要がなくなるので、装置の小型化，低コスト化を実現することができる。反応領域内の溶液などの媒質の量を、自動検出する手段を用いることによって、物質濃度の調整を容易化できる。
以下、本発明の好適な実施形態について、添付図面を参照しながら説明する。なお、添付図面に示された各実施形態は、本発明に係わる物や方法の代表的な実施形態を例示したものであり、この例示によって本発明の範囲が狭く解釈されることはない。
まず、図１は、本発明に係るバイオアッセイ装置や方法を適用できる反応領域が形成された基板の部材構成を示す断面図である。
基板１は、バイオアッセイ用に用意された基板であって、下側基板１１と、これに貼り合わせる等して重ね合わされる上側基板（以下、「蓋」という。）１２と、から構成されている。下側基板１１は、下層基板１１１と、透明電極層１１２と、固定化層１１３と、例えば、反応領域状をなす反応領域Ｒが形成される反応領域形成層１１４と、が順次積層された層構成を有する。
なお、下側基板１１の透明電極層１１２は、相互作用検出のためのバイオアッセイの過程において、何らかの電気力学的な作用を用いる場合に利用される層であって、本発明との関係において、特に必須な層ではない。
下層基板１１１は、例えば、蛍光検出時などに使用するレーザ光（蛍光励起光、位置検出用サーボ光など）や反応領域Ｒで発生する蛍光を透過する性質を備えた材料（例えば、合成樹脂やガラス）から形成されている。下層基板１１１を光透過性にすることで、基板１１の裏面からの光照射手段を採用できる。
透明電極層１１２は、例えば、インジウム−スズ−オキサイド（ＩＴＯ）などの光透過性の導体材料から形成される。この透明電極層１１２は、例えば、下層基板１１上に、スパッタリング技術などを用いて、所定の膜厚（例えば、２００ｎｍ）に形成されている。
固定化層１１３は、プローブ物質、例えば、プローブＤＮＡ（例えば、オリゴヌクレオチド鎖）などの核酸分子の一端を固定化するために適する材料であって、例えば、シランにより表面修飾が可能なＳｉＯ２が、スパッタリング技術によって所定の膜圧（例えば、２００ｎｍ）に形成されている。
この固定化層１１３の表層に、アミノ基、チオール基、カルボキシル基等の官能基（活性基）を有する物質やシステアミン、ストレプトアビジン等をコートしてもよい。例えば、ストレプトアビジンによって表面処理されている場合には、ビオチン化されたプローブＤＮＡなどのプローブ物質末端の固定化に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理されている場合には、チオール基が末端に修飾されたプローブ物質をジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）により固定することに適している。
反応領域形成層１１４は、下側基板１１において上方に開口する凹状の反応領域Ｒが多数配設されている層である。この反応領域形成層１１４は、例えば、感光性ポリイミドのフォトリソグラフィープロセスによって形成できる。なお、反応領域Ｒは、例えば、φ１００μｍ、深さ５μｍの形状に形成する。この場合、一つの反応領域Ｒ内の容積は、約１００ｐｌとなる。
図２は、下側基板１１に同口径の蓋（上側基板）１２が重ね合わされるときの様子を示す斜視図であり、図３は、基板１１と蓋１２が重ね合わされたときの基板１の層構成を示す断面図である。
反応領域Ｒは、図２に示すように、下側基板１１の中心から、基板全体を上方視したときに、放射状を呈するように複数配列されている。さらに、反応領域Ｒの放射状列が、半径方向に所定間隔をおいて配列された形態を有する。
本願発明者が実際に作成した下側基板１１の一実施形態例では、基板中心から半径２５ｍｍから３５ｍｍまでの間に、０．２ｍｍ間隔で計５０個の反応領域Ｒを、放射状列をなすように形成し、そして、この放射状列を半径方向に０．２ｍｍピッチで、７８５個配列した。従って、本例では、基板上に計３８２５０個（５０個×７８５列）の反応領域Ｒが形成されていることになる。
なお、特に図示はしないが、基板１には、基板の位置情報（番地情報）として機能するアドレスピット、あるいはバーコードなどが形成されている。例えば、反応領域形成層１１４において、回転方向の基準位置を示すアドレスピットを反応領域Ｒと同様のプロセスで形成することができる。このアドレスピットを所定のサーボ光を用いて追従することによって基板位置情報を得ることができる。この基板位置情報を手がかりとして、正確に目的の反応領域Ｒを特定することができる。
蓋１２は、主に、反応領域Ｒ内に貯留又は保持される媒質の乾燥を防止するための部材として機能する。例えば、図３に示すように、重ね合せられた時には、蓋１２が反応領域Ｒを閉塞し、反応領域Ｒと外気が連通しないように密着する。例えば、蓋１２は、導電性を有するｎ型Ｓｉによって形成することができる。
続いて、図４から図８に基づいて、本発明に係る「バイオアッセイ装置」の具体的構成について説明する。
図４等において符号２で示された「バイオアッセイ装置」は、大別すると、反応領域Ｒへ媒質を供給する供給用モジュール２ａと、固定化反応や相互作用を進行させる反応用モジュール２ｂと、反応領域Ｒ内の励起蛍光を測定する蛍光測定用モジュール２ｃと、によって構成されている。なお、該装置２は、コンピュータＣによって、各動作を制御するドライバ（後述）や電界印加などが制御されている。
図４は、下側基板１１が供給用モジュール２ａ位置で処理を受けている状態を示しており、図５は、基板１が反応用モジュール２ｂ位置で処理を受けている状態を示しており、図６は、基板１が蛍光測定用モジュール２ｃ位置で処理を受けている状態を、それぞれ示している。
このように、下側基板１１は、各モジュール２ａ，２ｂ，２ｃ間をスライド移動し、かつ目的の処理や反応を実行するために、各モジュール２ａ，２ｂ，２ｃの所定位置に停止するように構成されている。
上記構成の下側基板１１は、図４等に示されたチャッキング機構２０１を介して、ターンテーブル２０２に固定されている。該ターンテーブル２０２は、スピンドルモータ２０３とロータリーエンコーダ２０４に連結されている。スピンドルモータ２０３は、送りねじ２０５に締結されており、ドライバ２０６ａで制御されるスピンドル走査モータ２０６によって、供給用モジュール２ａ、反応用モジュール２ｂ、蛍光測定用モジュール２ｃの各モジュールへ、基板１を搬送することができる。
ここで、図８に示されているように、供給用モジュール２ａには、下側基板１１上の領域に、一つの放射状列の反応領域Ｒと同数の５０個のインクジェットノズルが脱着可能な機構で配置されている第１インラインヘッド２０７が設けられている。この第１インラインヘッド２０７は、反応領域Ｒに対する媒質供給手段として機能する。
また、この第１インラインヘッド２０７は、プローブ物質を含む媒質が充填された供給用のインクジェットノズル（図示せず。）とターゲット物質を含む媒質が充填された供給用のインクジェットノズル（図示せず。）を、適宜交換することによって、所望の物質を含む媒質を反応領域Ｒへ供給できる構成となっている。
供給用モジュール２ａには、プローブ物質等を含む媒質供給用の上記第１インラインヘッド２０７とは別に、下側基板１１上の反応領域Ｒへ水分を供給するために専用に設けられた第２インラインヘッド２０８が、必要数設けられている。この第２インラインヘッド２０８は、反応領域Ｒに対する水分補給手段として機能する。
この第２インラインヘッド２０８は、下側基板１１上の一つの放射状列をなす反応領域Ｒ群と同数である計５０個のインクジェットノズルが配列されている。なお、インラインヘッド２０７，２０８は、いずれもインクジェットドライバ２０９に連結され、制御されている。
次に、反応用モジュール２ｂは、乾燥防止などの役割を果たす導電性の蓋１２を、反応領域Ｒが配設されている下側基板１１へ重ね合わせて装着する機構を備えている。この装着機構は、主に、蓋１２の脱着を制御するアクチュエータードライバ２１０ａと、該ドライバ２１０ａで制御されるアクチュエータ２１０ｂと、蓋１２の位置を検出する位置センサ２１１などから構成されている。
また、この反応用モジュール２ｂは、高周波電源などの電源２１２を介して、導電性の蓋１２へ高周波交流電界などの電界を印加するためのコンタクト電極２１３、基板１を加熱するためのヒータ２１４などを備える。なお、符号２１５は、該ヒータ２１４に設けられている温度センサであり、符号２１６は、温度センサ２１５からの検出信号を受けてヒータ２１４の温度を制御するヒータドライバである。
ここで、下側基板１１や蓋１２、あるいはヒータ２１４は、いずれも恒湿度チャンバ２１７内に保持可能とされている。この恒湿度チャンバ２１７は、その一部に開口部２１７ａを有する。この開口部２１７ａは、ドライバ２１８によって制御されているアクチュエータ２１９を介して、シャッター２２０の上下動によって開閉される。符号２２１は、シャッター２２０の位置を検出するための位置センサである。なお、恒湿度チャンバ２１７は、基板１（あるいは下側基板１１）が搬送される際に、通過するとき以外は、閉じられている（例えば、図４参照）。
次に、蛍光測定用モジュール２ｃは、主に、測定制御系２２５により制御されている光学系Ｘから構成されている。図４から図６中の光学系Ｘを拡大して示した図７に示されているように、下側基板１１の反応領域Ｒ内に存在する蛍光物質（例えば、ターゲット物質に標識された蛍光色素や蛍光性のインターカレータ）の蛍光励起を行うための蛍光励起用光学系Ｐ１（蛍光励起レーザＬＤ１，コリメータレンズＬ１，対物レンズＬ３）を備える。
また、励起された蛍光を測定するための蛍光測定用光学系Ｐ２（対物レンズＬ３，波長選択フィルタＦ、対物レンズＬ５、蛍光測定ディテクタＰＭＴ）、さらには、対物レンズＬ５のオートフォーカスＡＦ制御信号を検出するＡＦ検出光学系Ｐ３（ＡＦ検出レーザＬＤ２、コリメータレンズＬ２、対物レンズＬ３、ビームスプリッタＭ３、非点収差レンズＬ４、ＡＦ検出ディテクタＰＤ）を備える。
なお、蛍光励起用のレーザ、ＡＦ検出用のレーザ、及び蛍光は、それぞれ波長が異なり、ダイクロイックミラーＭ１，Ｍ２を介して、合成／分離される。
供給用モジュール２ａと反応用モジュール２ｂには、上記した恒湿度チャンバ２１７が設けられており（図４等参照）、図示していない恒湿度調整器によって、基板周囲環境は、例えば、湿度５０％ＲＨの一定湿度に保たれている。これにより、供給後のプローブ物質含有媒質又はターゲット物質含有媒質からの水分の消失（蒸発）を最小限に抑えることができる。
ここで、上記構成のバイオアッセイ装置２を使用して行う、プローブ物質の固定化に係わるアッセイについて説明する。以下、プローブ物質は、プローブＤＮＡを代表例として説明するが、これに限定する趣旨ではない。
プローブＤＮＡは、後述するバイオアッセイプロセスにおいて、ターゲット物質であるターゲットＤＮＡ（一本鎖）内に含まれるかどうかを調べたい塩基配列と相補的な塩基配列を持つように合成された一本鎖ＤＮＡ（ヌクレオチド鎖）である。
下側基板１１に配設された反応領域Ｒに対するプローブＤＮＡの供給は、供給用モジュール２ａ位置で、上記第１インラインヘッド２０７に配されたインクジェットノズルを介して、該プローブＤＮＡを含有した媒質を反応領域Ｒへ所定量、供給（滴下）することによって行う。
供給用のノズルとして機能するインクジェットノズルは、プローブＤＮＡ含有媒質用、水分補給のための溶媒用のいずれについても、下側基板１１に形成された反応領域Ｒの半径方向での配列ピッチと同ピッチで、同数のノズルを備えており、各々ノズルから異なる媒質を滴下できる構造となっている。
最初に、蛍光測定用モジュール２ｃの位置で、（蓋がされていない状態の）下側基板１１をターンテーブル２０２に載置し、続いて、チャッキング機構２０１で基板１１を固定した後、スピンドル走査モータ２０６によって、スピンドル位置センサ２２２ａで検出された供給用モジュール２ａ位置まで搬送する。この搬送後の状態は、図４に示されている。
次に、下側基板１１を、ドライバ２０３ａで制御されるスピンドルモータ２０３で回転させ、下側基板１１の回転方向の基準位置を検出するディスク基準位置センサ２２３とロータリーエンコーダ２０４の出力から、反応領域Ｒの位置に対応した信号（反応領域位置信号）を発生させる。そして、この反応領域位置信号と供給用のノズルの吐出位置信号を同期させることによって、下側基板１１上の所望の反応領域Ｒへ、目的のプローブＤＮＡを含む媒質を供給する。
図８、図９には、インラインヘッド２０７，２０８の配置構成の一例が示されている。図８は、斜視図、図９は、上方視したときの平面図である。
図８、図９に示された例では、プローブＤＮＡを含有する媒質が充填されたインクジェットノズルについては、吐出量１００ｐｌ、吐出周波数５ｋＨｚである構成のものを採用している。例えば、反応領域Ｒの半径方向の配列数と同数の５０個の該インクジェットノズルが、第１インラインヘッド２０７に対して脱着可能な機構で、設けられている。
また、一方の水分補給用のインクジェットノズルは、例えば、吐出量２ｐｌ、吐出周波数２０ｋＨｚである構成のものを採用している。例えば、反応領域Ｒの半径方向の配列数と同数の５０個の該インクジェットノズルが、第２インラインヘッド２０８に対して脱着可能な機構で設けられている。
本例では、第２インラインヘッド２０８が二つ設けられている（図８、図９参照）。その一方（２０８ａ）を媒質中の物質濃度調整用として、他方（２０８ｂ）を物質の析出防止用として、それぞれ役割分担させている。
なお、図１０に示す変形形態のように、第２インラインヘッド２０８を一つだけ設けて、該第２インラインヘッド２０８に物質濃度調整用と物質の析出防止用の両機能を集約したり、いずれか一方の役割だけを担当させたりするようにしてもよい。
次に、図１１に基づいて、媒質供給（滴下）の動作シーケンスについて説明する。
まず、下側基板１１を回転させ、プローブＤＮＡ含有媒質を該基板１１の反応領域Ｒへ滴下供給する。さらに、この基板１１を回転させ、水分補給用の第２インラインヘッド２０８の位置まで来たタイミングで、コンピュータＣが保持する「乾燥時間テーブル」を参照して、溶媒滴下数を計算し、水分補給用の溶媒を、必要滴数だけ滴下供給する。
この「乾燥時間テーブル」は、各湿度条件下で、予め行った実験から予め作成してあるものであり、対応する反応領域Ｒの位置番号に対して、水分補給用の溶媒の滴下数が記録されている。
図１２、図１３は、この実験により得られたデータをグラフ化して示す図である。図１２は、滴下された溶液が全て乾燥するまでの時間を横軸に滴下量，縦軸に乾燥時間とし、５０〜９０％ＲＨの各環境湿度に対してプロットしたグラフである。図１３は、前記図１２の環境湿度５０％ＲＨのプロットを滴下量１００pl付近し拡大し抜き出したグラフである。
この実験によれば、例えば、湿度５０％ＲＨの場合では、最初に滴下した反応領域Ｒ（例えば、反応領域列１）に保持されているプローブＤＮＡ含有媒質は、最後の反応領域Ｒ（例えば、反応領域列７８５）へ滴下する０．１６秒後に、約１１ｐｌの水分が乾燥により減少していることがわかる。
従って、図１４に示すように、反応領域列番号に対する溶媒滴下数を算出設定することで、各反応領域ＲのプローブＤＮＡの乾燥による濃度変化を、最小限に抑制することができる。
より詳しくは、基板１１に放射状列を成すように配列された反応領域Ｒに対して、放射状列ごとに、周方向順番に配列番号（符号Ｎ参照）を付しておき、この配列番号列Ｎによって特定される領域に存在する反応領域Ｒ群に、水分補給用の溶媒を必要滴数分だけ、供給する（図１４参照）。なお、図１４では、供給順番が先であるほど、供給する滴数が増えている。
次に、図１５を参照して、水分補給に係わる他の実施形態について説明する。
本実施形態では、プローブＤＮＡ含有媒質が充填されているインクジェットノズルは、吐出量１００ｐｌ、吐出周波数５ｋＨｚとする。そして、反応領域Ｒの放射状列の一列分の数と同数（例えば、５０個）のインクジェットノズルを、第１インラインヘッド２０７に対して、脱着可能な機構により装着する。
また、本実施形態では、水分補給を担う溶媒供給用のインクジェットノズルは、吐出量２ｐｌ、吐出周波数２０ｋＨｚとする。そして、このインクジェットノズルは、反応領域Ｒの放射状列の一列分の数と同数（５０個）を、第２インラインヘッド２０８に対して、脱着可能な機構により装着する。
本実施形態では、さらに、反応領域Ｒ内の媒質量を自動測定するために用いられる光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３（図４〜図６参照）が、基板１１の上方に設置されている。なお、図１５の符号Ｙで示す領域は、前記光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３の焦点範囲を示している。
ここで、反応領域Ｒ内の媒質容量は、カメラ出力画像から溶液外形を抽出し，メニスカス形状寸法から算出することが可能である。
この実施形態での動作シーケンスの例を、図１６に基づいて説明する。
下側基板１１を回転し、プローブＤＮＡ含有媒質を、基板１１の全反応領域Ｒへ供給（滴下）する。次の周回では、反応領域Ｒ内の媒質量を、前記光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３を用いて検出し、減少した溶液量の計算を行う。この計算に基づいて、水分補給用の第２インラインヘッド２０８の位置まで来たタイミングで、水分補給用溶媒を必要滴数だけ滴下する。
この構成によって、恒湿度チャンバ２１７（図４等参照）内の湿度をあらかじめ検出すること無く、各反応領域ＲのプローブＤＮＡの乾燥による濃度変化を最小限に抑えることができる。
また、他の実施形態では、プローブＤＮＡ含有媒質を供給するインクジェットノズルとして、吐出量２ｐｌ、吐出周波数２０ｋＨｚのものを採用してもよい。このインクジェットノズルを、反応領域Ｒの放射状列の一列分の数と同数（例えば、５０個）だけ、第１インラインヘッド２０７に対して、脱着可能な機構により装着する。
この場合では、水分補給用（溶媒滴下用）のインクジェットノズルとして、吐出量１００ｐｌ、吐出周波数５ｋＨｚのものを採用する。このインクジェットノズルを、反応領域Ｒの放射状列の一列分の数と同数（例えば、５０個）だけ、第１インラインヘッド２０８に対して、脱着可能な機構により装着する。
この場合の供給動作シーケンスを、図１７に基づいて説明する。
まず、基板１１を回転し、第２インラインヘッド２０８を介して、水分補給用の溶媒を、最初に滴下供給しておく。次に、基板１１を回転させて、プローブＤＮＡ含有媒質を滴下供給するノズルが配列された第１インラインヘッド２０７を介して、プローブＤＮＡ含有媒質を反応領域Ｒへ滴下供給する。なお、プローブＤＮＡ含有媒質の濃度は、反応領域Ｒ内で１００ｐｌの溶媒と混合した時に、所定の濃度となるように調整しておくようにする。
このようにすれば、溶液の滴下供給から乾燥防止用の蓋（上側基板１２）を装着する短時間の間では、完全に混合することがなくなるので、反応領域Ｒ内にプローブＤＮＡが析出、固着することを有効に防止することができる。
即ち、反応領域Ｒへ溶媒を滴下した後に，プローブＤＮＡ含有媒質を滴下することで，反応領域Ｒ内でのプローブ物質の析出や固着によるムラが減少し、精度の良いバイオアッセイプロセスを実現することができる。
さらに他の実施形態では、第１インラインヘッド２０７用のインクジェットノズルとして、吐出量２ｐｌ、吐出周波数２０ｋＨｚのものを採用する。また、（水分補給用の）第２インラインヘッド２０８用のインクジェットノズルとして、吐出量１００ｐｌ、吐出周波数５ｋＨｚのものを採用する。さらに、反応領域Ｒ内の媒質量を測定するための光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３を用いて、反応領域Ｒ内の媒質量をカメラ出力画像から溶液外形を抽出し，メニスカス形状寸法から算出する。
この場合の供給動作シーケンスを、図１８に基づいて説明する。
基板１１を回転させて、最初に、溶媒Ａを反応領域Ｒに滴下供給する。次に、該基板１１を回転させて、第１インラインヘッド２０７位置まで来たタイミングで、プローブＤＮＡ含有媒質を反応領域Ｒへ滴下供給する。以上の供給動作を、基板全周に渡って行い、次の周回では、反応領域Ｒ内に保持された媒質量を、前記光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３を用いて検出し、その減少量の計算を行う。この計算結果に基づいて、溶媒Ｂの滴下供給を担う第２インラインヘッド２０８位置まで来た時に、必要滴数だけ溶媒Ｂを滴下供給する。
この方法によれば、恒湿度チャンバ２２３（図４等参照）内の湿度をあらかじめ検出すること無く、各反応領域ＲのプローブＤＮＡの乾燥による濃度変化を最小限に抑制することができ、かつ反応領域Ｒ内のプローブＤＮＡの析出及び固着を有効に防止することができる。
以上で説明した各実施形態で示す方法によって、プローブＤＮＡ含有媒質を基板１１へ滴下供給した後、スピンドル位置センサ２２２ｂで検出される反応用モジュール２ｂ位置まで、スピンドル走査モータ２０６によって基板１１を搬送する（図５の状態）。そして、基板１１に対して、蓋脱着アクチュエータ２１０ｂと蓋位置センサ２１１を使用して、蓋（上側基板１２）を装着する（図５再参照）。
その後、恒湿度チャンバ一２１７内に一定定時間静置することにより、反応領域Ｒの表面（固定化用に処理された表面）に対するプローブＤＮＡの固定化作業を完了する。
プローブＤＮＡの固定化作業が完了した基板１１は、スピンドル位置センサ２２２ｃで検出される蛍光測定用モジュール２ｃ位置まで搬送される。そして、基板１１はターンテーブル２０２から取り外され、反応領域Ｒ内へ所定の洗浄液を送り込み、これを排出することにより、該反応領域Ｒに存在する未固定状態のプローブＤＮＡを除去するための洗浄処理が施され、そして、バイオアッセイプロセスに備え、所定の場所に保管される。
以下、固定化後のバイオアッセイプロセスについて説明する。なお、このバイオアッセイプロセスとは、ターゲット物質の滴下供給→相互作用（例えば、ハイブリダイゼーション）の進行→蛍光測定プロセスに至る工程を意味する。
まず、ターゲット物質（ここでは、ターゲットＤＮＡとする。）は、プローブＤＮＡと相補的な塩基配列が含まれるかどうかを調べたい一本鎖ＤＮＡ（ヌクレオチド鎖）であって、生体などから分離、抽出される。
プローブＤＮＡが固定された基板１を、蛍光測定用モジュール２ｃ位置で、ターンテーブル２０２に載置し、チャッキング機構２０１により固定する。その後、スピンドル走査モータ２０６によって、スピンドル位置センサ２２２ａによって検出された供給用モジュール２ａ位置まで、基板１を搬送する（図４の状態を参照）。
インクジェットノズルには、例えば、ターゲットＤＮＡとインターカレータ（後述）を含む媒質（例えば溶液）を予め充填しておく。基板１をスピンドルモータ２０３で回転させ、該基板１の回転方向の基準位置を検出するディスク基準位置センサ２２４とロータリーエンコーダ２０４の出力から反応領域位置に対応した信号を発生させ、反応領域Ｒの位置信号と滴下ノズルの吐出信号とを同期させることによって、基板１に形成された所望の反応領域Ｒへ媒質を滴下供給する。この時の供給動作は、上述した図１６と同様の手順で行うことができる。この場合、図１６に示されている「ＤＮＡ溶液」とは、ターゲットＤＮＡ含有の溶液を意味する。
ターゲットＤＮＡ供給作業の場合でも、水分を補給するための溶媒を反応領域Ｒへ滴下供給する。即ち、第２インラインヘッド２０８位置まで来たタイミングで、上記実験によって得られている乾燥時間テーブルを参照して、溶媒を必要滴数だけ滴下する。このようにすれば、各反応領域ＲにおけるターゲットＤＮＡの乾燥による濃度変化を最小限に抑えることができる。
また、ターゲットＤＮＡ供給作業の場合でも、反応領域Ｒ内の媒質量を測定するための光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３を用いて、反応領域Ｒ内の媒質量をカメラ出力画像から溶液外形を抽出し，メニスカス形状寸法から算出することができる。
この場合の動作シーケンスは、上述した図１６と同様である。即ち、基板１１を回転させ、まずターゲットＤＮＡ含有媒質（図１６のＤＮＡ溶液に対応）を、基板全周に渡って滴下供給し、次の周回では、反応領域Ｒ内の媒質量を検出して、乾燥により減少した媒質量の計算を行う。そして、選択された反応領域Ｒが第２インラインヘッド２０８位置まで来た時に、必要滴数だけ溶媒を滴下供給する。このようにすると、恒湿度チャンバ２１７内の湿度を予め検出すること無く、各反応領域Ｒ内のターゲットＤＮＡの乾燥による濃度変化を最小限に抑えることができる。
また、ターゲットＤＮＡ供給の場合でも、図１７に示されたような動作シーケンスを採用することができる。即ち、基板１１を回転させ、まず溶媒を滴下しておく。続いて、基板１１を回転させ、第１インラインヘッド２０７位置まで来たタイミングで、ターゲットＤＮＡ含有媒質を滴下供給する。なお、このとき、ターゲットＤＮＡ含有媒質の濃度は、反応領域Ｒ内で１００ｐｌの溶媒と混合した時に、所定の濃度となるように予め調整しておく。このような方法を行うことで、反応領域Ｒ内にターゲットＤＮＡが析出及び固着することを有効に防止することができる。
また、ターゲットＤＮＡ供給作業の場合でも、反応領域Ｒ内の媒質量を測定するための光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３によって得られるカメラ出力画像から溶液外形を抽出し、媒質容量をメニスカス形状寸法から算出することができる。
この場合の動作シーケンスは、上述の図１８と同様である。即ち、基板１１を回転させて、最初に、溶媒Ａを反応領域Ｒに滴下供給する。次に、該基板１１を回転させて、第１インラインヘッド２０７位置まで来たタイミングで、ターゲットＤＮＡ含有媒質を反応領域Ｒへ滴下供給する。以上の供給動作を、基板全周に渡って行い、次の周回では、反応領域Ｒ内に保持された媒質量を、前記光学顕微鏡ＣＣＤカメラ２２３を用いて検出し、その減少量の計算を行う。この計算結果に基づいて、溶媒Ｂの滴下供給を担う第２インラインヘッド２０８位置まで来た時に、必要滴数だけ溶媒Ｂを滴下供給する。
この方法によれば、恒湿度チャンバ２２３（図４等参照）内の湿度をあらかじめ検出すること無く、各反応領域ＲのプローブＤＮＡの乾燥による濃度変化を最小限に抑制することができ、かつ反応領域Ｒ内のプローブＤＮＡの析出及び固着を有効に防止することができる。
以上のように、ターゲットＤＮＡ含有媒質を滴下供給した後、スピンドル位置センサ２２２ｂで検出される反応用モジュール２ｂまで、スピンドル走査モータ２０６によって基板１１を搬送する。そして、該基板１１に、蓋脱着アクチュエータ２１０ｂと蓋位置センサ２１１を用いて、乾燥防止用の蓋（上側基板）１２を装着する（図５の状態を参照）。
ここで、反応用モジュール２ｂに、基板１１を一定時間放置する。もし、ターゲットＦＤＮＡに（固定化された）プローブＤＮＡと相補的な塩基配列が含まれるのであれば、両者はハイブリダイゼーションし、二本鎖ＤＮＡを形成する。
このハイブリダイゼーションプロセスは、蓋１２の装着と同時に基板１１をヒータ２１４へ圧接して、例えば、５５℃に加熱した状態で行う。さらに、基板１の透明電極層１１２（図１参照）と導電性の蓋（上側基板）１２を対向電極として活用し、これらを高周波電源２１２と接続して、例えば、１ＭＶ/ｍ、１ＭＨｚの高周波交流電界を反応領域Ｒへ印加してもよい。
反応領域Ｒへの電界印加は、誘電泳動などの電気力学的効果によって、核酸分子を伸張させたり、移動させたりすることを目的とする。これにより、ハイブリダイゼーションの際の立体障害を排除したり、プローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの間の会合確率を高めたりすることができる。この結果、ハイブリダイゼーションを迅速に行うことができる。
反応領域Ｒに固定されたプローブＤＮＡとターゲットＤＮＡとの間のハイブリダイゼーションが完了したら、下側基板１１は、蓋(上側基板)１２を装着したままの状態で、スピンドル位置センサ２２２ｃによって検出される蛍光測定用モジュール２ｃ位置へ搬送される（図６の状態を参照）。
ここで、反応領域Ｒ内へ供給されているインターカレータは、二本鎖ＤＮＡに結合することによって蛍光を発する構造に変成する性質を持つ蛍光物質である。従って、このインターカレータは、ターゲットＤＮＡがプローブＤＮＡと相補的な塩基配列を持つ時に形成された二本鎖ＤＮＡに結合して蛍光を発する。
これにより、インターカレータの蛍光強度を測定することで、ターゲットＤＮＡ内の特定の塩基配列の有無を特定することができる。インターカレータは、特に限定されないが、例えば、市販のSYBERGreenIなどを採用することができる。
次に、蛍光測定は、通常の光ディスクシステムと同様の動作で行うことが可能である。具体的には、スピンドルモータ２０３で基板１を回転させ、ＡＦ検出光学系Ｐ３及びアクチュエータによって、基板面に対する対物レンズＬ３の相対位置を制御する（特に、図７参照）。
そして、蛍光励起用光学系Ｐ１で、基板上の反応領域Ｒ内のインターカレータを励起し、蛍光計測光学系でその蛍光を測定する。このとき、蛍光励起レーザＬＤ１は、波長４５０ｎｍの半導体レーザを使用し、コリメータレンズＬ１で平行光とし、続くダイクロイックミラーＭ１で折り返した後、対物レンズＬ３で、反応領域Ｒの固定化層１１３に焦点を結び、該固定化層１１３上に形成された二本鎖ＤＮＡに結合しているインターカレータを励起する（図７参照）。
このインターカレータは、波長５２０ｎｍ近傍の蛍光を発する。該蛍光は、対物レンズＬ３、ダイクロイックミラーＭ１，Ｍ２を通過し、波長選択フィルタＦで迷光を除去された後、対物レンズＬ５によって蛍光計測用ディテクタＰＭＴの受光部へ集光され、これにより蛍光強度が測定される。
なお、このときの蛍光は微弱であるため、蛍光計測用ディテクタＰＭＴには、フォトマルチプライヤを採用するのが望ましい。また、ＡＦ検出光学系Ｐ３及びレンズアクチュエータＡ（図７参照）は、光ディスクで使用される構成や制御方式をそのまま用いることができる。
本実施形態では、ＡＦ検出レーザＬＤ２は、波長７８０ｎｍの半導体レーザを使用し、コリメータレンズＬ２で平行光としビームスプリッタＭ３を経てダイクロイックミラーＭ２で折り返される。その後、ダイクロイックミラーＭ１を経て、対物レンズＬ３で基板面に焦点を結んで、反射する構成を採用している（図７参照）。
反射されたレーザ光は、対物レンズＬ３、ダイクロイックミラーＭ１，Ｍ２を経て、ビームスプリッタＭ３に達する。そして、非点収差レンズＬ４とＡＦ検出ディテクタＰＤで構成された非点収差法によるフォーカスエーラー検出光学系へ折り返される。
蛍光計測制御系は、まずＡＦ検出光学系Ｐ３を使用して、基板最外周の回転方向基準位置を示す基準位置マークを検出し、ロータリーエンコーダ２０４（図４等参照）の出力から基準位置信号を記憶し、反応領域Ｒの位置を計算する。
そして、基板１を回転し、対物レンズＬ３の位置を、アクチュエータＡによってオートフォーカス制御を行い、各反応領域Ｒ位置での蛍光測定を安定して行うようにする。
測定により得られた蛍光強度を解析することによって、ターゲットＤＮＡに含まれている塩基配列、すなわち遺伝子情報を解析することが可能となる。これにより、一連のバイオアッセイを実現している。なお、以上の説明では、媒質を供給するためのノズルとしてインクジェット方式のノズルを挙げて説明したが、正確な容量の媒質を滴下又は注入できる吐出手段であれば、採用可能である。
本発明は、物質間の相互作用の場を提供する反応領域に貯留又は保持される媒質が乾燥することによって起こる含有物質の濃度変化や媒質中の物質が析出、固着を有効に防止する技術として利用できる。ＤＮＡチップやプロテインチップなどのセンサーチップを対象とするバイオアッセイ技術として利用できる。
１ 基板
２ バイオアッセイ装置
２ａ 供給用モジュール
２ｂ 反応用モジュール
２ｃ 蛍光測定用モジュール
１１ 下側基板
１２ 上側基板（蓋）
２０３ スピンドルモータ
２０７ 媒質供給手段である第１インラインヘッド
２０８ 水分補給手段である第２インラインヘッド
２１０ｂ 蓋脱着アクチュエーター
２１４ ヒータ
２１７ 恒湿度チャンバ
２２３ 光学顕微鏡ＣＣＤカメラ
Ｒ 反応領域
Ｘ 蛍光測定用モジュールの光学系
２ バイオアッセイ装置
２ａ 供給用モジュール
２ｂ 反応用モジュール
２ｃ 蛍光測定用モジュール
１１ 下側基板
１２ 上側基板（蓋）
２０３ スピンドルモータ
２０７ 媒質供給手段である第１インラインヘッド
２０８ 水分補給手段である第２インラインヘッド
２１０ｂ 蓋脱着アクチュエーター
２１４ ヒータ
２１７ 恒湿度チャンバ
２２３ 光学顕微鏡ＣＣＤカメラ
Ｒ 反応領域
Ｘ 蛍光測定用モジュールの光学系
Claims (6)
- 物質間の相互作用の場を提供する反応領域に対して、前記相互作用に係わる物質を含む媒質を供給するための媒質供給手段と、
前記反応領域に対して、必要な滴下数の水分を自動で滴下する水分補給手段と、
を少なくとも備えるバイオアッセイ装置。 - 前記反応領域に保持された媒質の体積を自動検出可能な体積検出手段を備え、
該体積検出手段から得られる体積変化情報に基づいて、乾燥によって消失した水分に相当する水分を、前記水分補給手段を介して前記反応領域へ供給することを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ装置。 - 前記相互作用は、核酸分子間のハイブリダイゼーションであることを特徴とする請求項１記載のバイオアッセイ装置。
- 前記体積検出手段は、前記反応領域内に保持された媒質の外形をカメラ出力画像から抽出し、メニスカス形状寸法から算出することを特徴とする請求項２記載のバイオアッセイ装置。
- 物質間の相互作用の場を提供する反応領域に対して、前記相互作用に係わる物質を含む媒質と水分を別経路によって供給する工程を、以下の（１）又は（２）のいずれかの手順により行うバイオアッセイ方法。
（１）相互作用に係わる物質を含む媒質を供給する手順に続いて、必要な滴下数の水分を滴下する手順。
（２）必要な滴下数の水分を滴下する手順に続いて、相互作用に係わる物質を含む媒質を供給する手順。 - 前記相互作用に係わる物質は、前記反応領域内へ固定されるプローブ物質、該プローブ物質と相互作用するターゲット物質のいずれかであることを特徴とする請求項５記載のバイオアッセイ方法。
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