JP4587112B2 - 誘電泳動装置及び物質の分離方法 - Google Patents
誘電泳動装置及び物質の分離方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4587112B2 JP4587112B2 JP2000112337A JP2000112337A JP4587112B2 JP 4587112 B2 JP4587112 B2 JP 4587112B2 JP 2000112337 A JP2000112337 A JP 2000112337A JP 2000112337 A JP2000112337 A JP 2000112337A JP 4587112 B2 JP4587112 B2 JP 4587112B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- electrode
- electrodes
- electric field
- substrate
- substance
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Electrostatic Separation (AREA)
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
この発明は、捕集能力を向上させた誘電泳動装置及び物質の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、半導体技術の進歩によりフォトリソグラフィー等の微細加工技術によってnmからμm単位での物質加工技術が確立され、現在もその微細加工技術は進歩しつづけている。
【０００３】
化学・生化学分野に於いては、この微細加工技術を利用して、生体試料からの分析対象成分の抽出（抽出工程），化学・生化学反応を用いる当該成分の分析（分析工程），並びにそれに続く分離処理（分離工程）及び検出（検出工程）といった一連の化学的・生化学的分析工程の全てを一辺数cm〜数十cmのチップ上に集積化等した極小の分析装置を用いて行う、微細総分析システム〔Micro Total Analysis System（μ-TAS）、Laboratory on a chip〕と呼ばれる新技術が発展しつつある。
【０００４】
このμ-TASの手法は、化学的・生化学的分析工程全てを通じて、分析時間の短縮化、使用するサンプル量や化学・生化学反応に必要な試薬量の低減化、分析機器や分析スペースの縮小化に大きく貢献するものと期待されている。
【０００５】
特に、μ-TASに於ける分離工程については、テフロン（登録商標）やシリカ等を材料として作製された内径１mm以下のキャピラリー（細管）を分離カラムとして使用して高電界中で物質の持つ電荷の差を利用して分離を行うキャピラリー電気泳動法や、同様のキャピラリーを用いてカラム担体と物質との相互作用の差を利用して分離を行うキャピラリーカラムクロマトグラフィー法が開発されている。
【０００６】
しかしながら、キャピラリー電気泳動法は、分離に高電圧が必要であることや、検出領域でのキャピラリー容量が制約されるため検出感度が低いという問題、更には、チップ上のキャピラリーチップでは、分離のためのキャピラリー長に制約があり、高分子の分離に充分なキャピラリー長が得られないため、低分子の物質の分離には適しているが高分子の物質の分離には適さないという問題を有している。また、キャピラリーカラムクロマトグラフィー法は、分離処理の高速化に限界があり、処理時間の短縮化が困難であるという問題を有している。
【０００７】
そこで、近年、上記した如き問題を解決する手段の一つとして、物質を不均一な交流電界内に置くと、物質内に正と負の分極が起こり、物質を取り囲む媒質の誘電率が物質よりも大きいと物質は電界の低い方向へ移動し、媒質の誘電率が物質よりも小さいと物質は電界の強い方向へと移動する力が働く現象、いわゆる誘電泳動力〔H.A.Pohl: "Dielectrophoresis", Cambridge Univ. Press(1978)、T.B.Jones: "Electromechanics ofParticles", Cambridge Univ. Press (1995)等〕を利用した分離方法が、注目されている。
【０００８】
この分離方法は、（１）誘電泳動力の大きさは、物質（粒子）の大きさ・誘電的性質に依存し、電界傾度に比例するため、微細加工電極を用いれば、電界および電界傾度をきわめて大きくとることができるので、キャピラリー電気泳動のように高電圧を必要とせず、低い印加電圧で高速な分離が期待できる、（２）電界の強い場所が微小領域に極限されるため、電界印加による温度上昇も最小限にとどめることができ、また、高電界場の形成が可能となる、（３）誘電泳動は、電界傾度に比例する力であることからわかるように、印加電圧の極性に依存しないので、交流電界下でも直流同様に力が働く。従って、高周波交流を用いれば水溶液での電極反応（電気分解反応）は抑えられるので、電極自体をチャネル（サンプル流路）中に集積化することが可能となる、（４）キャピラリー電気泳動のように検出部分のチャンバ容量に制約がないことから検出感度の向上も望める、等の点から、現在ではμ-TASに於ける最も適した分離方法と考えられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、誘電泳動のμ−ＴＡＳへの応用を考えた場合、捕集能力を向上させることは、極めて重大なことであり、この点で従来の誘電泳動装置は未だ十分満足すべきものではない。
【００１０】
即ち、物質の捕集能力が向上すれば、電極領域での分離が可能となることと、効率よく保持することによって、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比の高い分離が実現される。また例えば、特に物質に働く誘電泳動力と流体抗力との相互作用によって分離を行うField-Flow fractionationにおいては、同じ流速でも短い電極領域での分離が可能となるからである。
【００１１】
この発明のうち請求項１に記載の発明は、このような点に着目してなされたものであり、誘電泳動電極により形成された不均一電界内に分離すべき物質を含む液体を存在させ、該物質に働く誘電泳動力によって分離を行う装置において、物質の捕集能力を向上させた誘電泳動装置を提供することを目的とする。
【００１２】
また、請求項３に記載の発明は、物質の分離方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するため本発明者等は鋭意研究の結果、電極と電極の基板部分を掘削し、該電極よりも低い部位を形成することによって、不均一電界領域が増大することと流体の抗力が低減することから、捕集能力が向上することを想到し、本発明に到達した。
【００１４】
しかして、従来、誘電泳動力を利用した分離装置及び方法、特にField-Flow fractionationにおける装置及び方法についての特許及び論文は多数見られるが、「電極よりも低い部位」を形成させることによって物質の捕集能力を向上させる装置及び方法は全く知られていないし、このような発想も全く知られていない。
【００１５】
本発明のうち、請求項１記載の発明は、基板上に電極を設けた誘電泳動装置において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する前記電極間に該電極よりも低い部位を形成して、対向する前記電極間に、不均一電界領域の増加を実現する構造を形成したことを特徴とする。
【００１６】
「電極よりも低い部位」を形成することによって、電極間の上方だけでなく下方にも電解が形成されるので不均一電界領域が増加し、更には、例えばField-Flow fractionationに用いた場合には、この部分の流体の流速が落ちるので流体抗力が低減することから、物質の捕集能力が向上する。
ここで、物理的手段とは、例えば適当な刃物等を使用して掘削する方法、例えばシンクロトロン放射光を用いるＬＩＧＡ（Lithographile Galvanoformung Abformung）法等のことであり、また、化学的手段とは、例えば基板に対するエッチング液を用いて基板を掘削するエッチング等のことである。また、例えば物理的掘削と化学的掘削とを同時に行う、高周波電源によりプラズマとした反応性ガスを用いるエッチング［反応性イオンエッチング：Reactive Ion Etching（RIE）］によっても電極間の基板を掘削することができる。尚、上記した如き手段を適宜組み合わせて基板の掘削を行っても良い。
【００１７】
また、請求項３に記載の発明は、誘電泳動電極により形成された不均一電界内に、分離すべき物質を含む液体を存在させ、該物質に働く誘電泳動力の差によって分離を行う物質の分離方法において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する電極間に形成した電極よりも低い部位を形成することにより、不均一電界領域の増加を実現することによって、物質の捕集能力を向上させたことを特徴とする。
【００１８】
尚、誘電泳動（Dielectrophoresis,DEP）とは、物質の電導率及び誘電率と媒質の電導率及び誘電率と、印加する周波数との相互作用により、不均一な電界内で中性粒子が移動する現象のことであり、この際に分子に働く力を誘電泳動力と呼ぶ。また、誘電泳動力は、物質が電界の強い方へと移動する正の誘電泳動力と電界の弱い方へと移動する負の誘電泳動力の２種類に分けられる。以下に、分子に正の誘電泳動力が働く場合を例にとり説明する。
【００１９】
即ち、電界内に置かれた中性分子には、図１に示すように電界の下流側に正極性の分極電荷＋ｑが、上流側には負極性の分極電荷−ｑが夫々誘導され、＋ｑには電界Ｅにより大きさ＋ｑＥの力が働き、この部分を電界の上流側へと引く。分子が中性ならば、＋ｑと−ｑの絶対値は等しく、仮に電界が場所によらず一定であるならば、両者に働く力は釣り合って分子は動かない。しかし、電界が一様でない場合には、強い電界側へ引く力の方が大きくなり、分子は電界の強い側へと駆動されることとなる。
【００２０】
上記したように、溶液中の分子は、該分子に生じる誘電泳動力に応じて電界領域内を種々移動するが、例えばField-Flow fractionationにおける分子の運動は、該分子に生じる誘電泳動力Ｆdの他に、流体抗力（流路内の流れによる抗力）Ｆvと熱運動による力Ｆthの３つの要因により支配される。即ち、（１）Ｆd＞＞Ｆv＋Ｆthの場合には、分子は電極に捕集（トラップ）され、（２）Ｆd＜＜Ｆv＋Ｆthの場合には、電界に関わらず、分子は流路内の流れにのって流出する。また、（３）Ｆd≒Ｆv＋Ｆthの場合には、分子は電極に吸着・脱着を繰り返しながら下流へと運ばれる結果、本来の流路内の流れよりも遅れて出口に到達する。
【００２１】
本発明においては、対向する電極間を深く掘削することによって、電極間の下方にも不均一電界が形成されるから、不均一電界領域が増加することと、この部分の流体の流れが遅くなり、流体の抗力Ｆvが低減することから、上記（１）の如き条件でＦdがより大となり、Ｆvがより小となるから、捕集率が向上する。また、電極間の下方に形成された電界にトラップされた粒子は、「電極よりも低い部位」に位置することとなるから、流出され難くなる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態を説明する。
図２は、基板（ガラス基板）１上の凸状物（支柱）２で、長さ方向に間隔付けて電極３を支持した例を示す。
【００２３】
対向する電極３，３間には、図２（Ｂ）に示すように、断面半円状の「電極よりも低い部位」（連通溝）４が形成され、隣接する連通溝４，４は、図２（Ａ）に示すように、凸状物２以外の部分で連通するようになっている。図３は、本発明の実施例を示すもので、図３（Ａ）は、上記のように凸状物２以外の部分で連通するようになっているが、図３（Ｂ）は、電極３を壁体（凸状物）２′で支持し、隣接する溝４′，４′を同壁体２′で隔離して、連通しないようになっている。
【００２４】
また、図３（Ａ）、（Ｂ）に示す実施例では、凸状物２及び２′以外の部分は「電極３よりも低い部位」（４及び４′）に形成されている。
【００２５】
しかしながら、対向する電極３，３間の一部に、凹部（穴）を単独若しくは間隔付けて複数設けても差し支えないが、図３（Ａ）、（Ｂ）に示すように、対向する電極の全部若しくは大部分を電極よりも低い部位（４若しくは４′）に形成する方が、捕集能力が向上することから好ましい。
【００２６】
対向する電極３，３間の一部に、凹部（穴）を設ける場合は、対向する電極間の最小ギャップ間５に設けるのが好ましい。この部分が電界強度が強いので、この部分に設ければ、捕集能力がより向上するからである。しかしながら、この部分を含んだ全体に形成すれば、分子をトラップする部分が増大するから、更に捕集能力が向上する。
【００２７】
溝４の広さ（図３（Ａ）、（Ｂ）に示す場合は、電極３，３間の距離と同じ）は、電界強度に大きく影響するが、誘導泳動対象とする物質の大きさによって適宜決定するものであり一概には言えない。その大きさがマイクロメーターサイズの物質では、好ましくはその物質が持つ直径の１００倍以下１倍以上、更に好ましくは１０倍以下１倍以上の広さとするのが良い。また、タンパク質、遺伝子等の生体分子の場合、例えばペプチド鎖、タンパク質等では、通常１０μｍ以下１ｎｍ以上、好ましくは５μｍ以下１ｎｍ以上であり、ヌクレオチド鎖（ポリヌクレオチド、オリゴグクレオチド）等の場合、通常１００μｍ以下１ｎｍ以上、好ましくは５０μｍ以下１ｎｍ以上とするのが良い。
【００２８】
一般には、深いほど分子をトラップする部分が増大し、更には特にField-Flowfractionationの場合には、溝の部分での流速が抑えられ捕集能力（捕集率）が向上する。しかしながら、深すぎると、誘電泳動によって電極上にトラップした分子を測定する必要がある場合、トラップされていた分子が溝部分から放出され難いか、放出されない場合が生じる。従って、溝の深さは、好ましくは溝の広さの１０倍以下１／１０００倍以上、更に好ましくは１倍以下１／１０００倍以上である。
【００２９】
溝の深さは、図３（Ａ）に示すような等方性エッチングにより形成すれば、電極幅以上に掘ると電極３を保持している凸状物２が全て削り取られるので、電極３が剥離する。従って、この方法で溝を形成する場合は、溝の深さは、最大電極幅部分の１／２以下となる。
【００３０】
図３（Ｂ）に示すように、シリコンウェハーの異方性エッチングにより形成する場合は、５５度の角度で深さ方向のみにエッチングが進む。従って、この方法でエッチングする場合は、深さ方向の最大距離は、（電極間の距離÷２）×１．４２（ｔａｎ５５度）となる。図３（Ｃ）に示すように、ＲＩＥやＬＩＧＡ等により形成する場合は、ほぼ垂直にエッチングが進む。従って、これらの方法でエッチングする場合は、溝の深さは、前述した範囲、即ち、好ましくは溝の深さの１０倍以下１／１０００倍以上、更に好ましくは１倍以下１／１０００倍以上である。
【００３１】
溝の間隔（＝電極自体の幅）は、正の誘電泳動による分離に限定すれば、分離対象によって左右されない。微細加工技術の加工精度から、通常は５０μｍ以下１ｎｍ以上、好ましくは１０μｍ以下１ｎｍ以上である。
【００３２】
図３（Ａ）に示す等方性エッチングは、ガラス基板若しくはプラスチック基板をエッチングすることにより形成される。等方性エッチングは、基板上の壁体２上で電極３を支持し、隣接する溝４，４は同壁体２で隔離されるように形成される場合や、基板上の凸状物２で電極３を支持し、隣接する溝（連通溝）４，４は連通するように形成される場合等、エッチングの程度により種々の形状が形成される。
【００３３】
図３（Ｂ）に示す異方性エッチングは、シリコン基板をエッチングすることにより形成される。この場合は、基板上の壁体２′上で電極３を支持し、隣接する溝４′，４′は同壁体２′で隔離されるようになっている。図３（Ｃ）に示すＲＩＥは、シリコンやＳｉＯ２基板等をエッチングすることにより形成され、また、ＬＩＧＡは、ポリマー、セラミック、プラスチック基板等をエッチングすることにより形成される。これらの場合は、基板上の壁体２”上で電極３を支持し、隣接する溝４”，４”は同壁体２”で隔離されるようになっている。
【００３４】
図３（Ａ）に示す等方性エッチングでは、一般には、溝又は連通溝４は断面が半円若しくは半楕円形のような形状に形成される。図３（Ｂ）に示す異方性エッチングで溝を形成すると、一般には、溝４′は断面略台形を通って最終的に略Ｖ字形にエッチングされる。また、図３（Ｃ）に示すＲＩＥやＬＩＧＡ等で溝を形成すると、一般には、ほぼ断面方形にエッチングされる。従って、エッチングの仕方及び「電極より低い部位」の形成の仕方によって、種々の断面形状のものが形成されるが、本発明においては「電極より低い部位」（連通溝、溝、凹部等）の形状は特に限定されない。
【００３５】
図３（Ａ）の壁体又は凸状物２は、中央部が括れた形状に形成され、図３（Ｂ）の壁体２′は、台形に形成され、また、図３（Ｃ）の壁体２”は、方形に形成されているが、壁体又は凸状物２、壁体２′及び壁体２”は、電極３を支持し得るならどのような形状でも良く、特に限定されない。
【００３６】
本発明に使用する電極３は、例えばアルミニウム、金等の導電性の材質からなり、その構造は、誘電泳動力、即ち、水平及び垂直方向に不均一電界を生じ得るものであればよく、例えば、インターデジタル形状〔J. Phys. D:Appl. Phys. 258, 81-88,(1992)、Biochim.Biophys. Acta., 964, 221-230,(1988)等〕が挙げられる。
【００３７】
より具体的には、図４に示すように、（Ａ）直線状の帯状部６の上下に対向して三角形の外方突出部７ａを間隔付けて多数形成した形状、（Ｂ）直線状の帯状部６の上下に対向して四角形の外方突出部７ｂを間隔付けて多数形成した形状、（Ｃ）直線状の帯状部６の上下に対向して台形の外方突出部７ｃを間隔付けて多数形成した形状、（Ｄ）上下に正弦波形であり、同正弦波の凸部８と凹部９（凹部９と凸部８）とが上下に対向して直線状に多数連設された形状、（Ｄ）上下に鋸歯形であり、同鋸歯の凸部８′と凹部９′（凹部９′と凸部８′）とが上下に対向して直線状に多数連設された形状が好ましい。しかしながら、誘電泳動に使用し得る電極であれば、どのようなものでも使用することが出来、特に限定されない。
【００３６】
このような電極は、通常、例えばガラス、プラスチック、石英、シリコン等の非導電性の材質からなる基板上に、それ自体公知の微細加工技術〔Biochim. Biophys. Acta., 964, 221-230等〕を用いて、１対以上の上記した如き形状の電極を櫛歯状に設けることにより作製される。また、対向（隣接）する電極３間の距離は、強電界強度の不均一交流電界を形成し得るものであれば特に限定されず、目的の分子の種類により適宜設定すべきものである。
【００３９】
電極３の厚さは、従来と同様で良く、具体的には、通常０．５ｎｍ以上、好ましくは０．５ｎｍ〜１ｎｍ、更に好ましくは１ｎｍ〜１０００ｎｍである。
【００４０】
電極３は、厚さ以外は、従来と同様で良く、電極上への種々の物質の吸着防止のため、有機薄膜を電極にコーティングしても差し支えない。
【００４１】
上記本発明の誘電泳動装置を製造するには、誘電泳動電極及び流路のような「電極よりも低い部位」（連通溝４、溝４′、凹部等）以外は、従来と同様に形成すれば良い。
【００４２】
「電極よりも低い部位」を形成するには、例えば適当な刃物等を使用して掘削する方法や例えばシンクロトロン放射光を用いるＬＩＧＡ（Lithographile Galvanoformung Abformung）法等の物理的手段、例えば基板に対するエッチング液を用いて基板を掘削するエッチング等の化学的手段、又は、高周波電源によりプラズマとした反応性ガスを用いるエッチング［反応性イオンエッチング：ReactiveIon Etching（RIE）］等の物理的及び化学的手段、等により電極間の基板を掘削して形成すればよい。尚、上記した如き手段を適宜組み合わせて基板の掘削を行っても良い。
【００４３】
エッチング液は、基板の材質に応じて公知のエッチング液を選択すれば良く、また基板の一部に電極よりも低い部分を形成する場合は、掘削したくない部分を適当にマスキングしてエッチングすれば良い。
【００４４】
本発明の誘電泳動装置を使用して、本発明の分離方法を実施するには、分離方法自体は従来と同じように行えばよい。
【００４５】
即ち、上記した如き電極（電極基板）を用いて形成させた不均一電界内に、分離すべき物質を含む液体、例えば２種以上の物質（分子若しくは粒子）が溶解若しくは懸濁している液体を存在させて、当該物質に働く誘電泳動力の差によって分離すれば良い。
【００４６】
一般には、基板上の流路内に水平及び垂直方向に不均一な電界を形成させ、入口から分離すべき物質を含む液体を流して、当該物質に働く誘電泳動力の差によって分離すれば良い。しかしながら、流れを生じさせることなく、電極の特定部分に保持される成分と保持されない成分とに分離しても勿論良い。
【００４７】
物質（分子、粒子）に働く誘電泳動力の差によって分離するには、電極の特定部分に保持される分子等と保持されない分子等とに分離したり、より強い誘電泳動力を受ける分子等は弱い誘電泳動力を受ける分子等よりも遅延して移動するため、移動時間に差が生じることを利用して分離したりすれば良い。
【００４８】
図５の矢印で示すように、本発明の装置の流路に電極の長さ方向と交差する方向から分離すべき物質を含む液体を流すと、連通溝４の中の流速は流路部分に比べて遅くなり、連通溝４の中に入った分子にかかる流体の抗力Ｆｖを減らすことが出来る。また、電極３，３間に連通溝４を形成したことによって、電界の影響範囲が広くなることと、トラップされた分子がストックされる場所が広がることから、捕集率が向上したものと思われる。
【００４９】
本発明の測定方法は、本発明の分離方法を利用する以外は、上記した如きそれ自体公知の方法に準じて実施すればよく、使用される試薬類も、それ自体公知の試薬類の中から適宜選択すればよい。
【００５０】
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】
参考例 １：誘電泳動電極基板の作製最小ギャップ7μm 、電極ピッチ20μm、電極数2016（1008対）の多段電極列を設計し、それに基づいて、電極作製用のフォトマスクを作製した。
【００５２】
即ち、アルミ蒸着したガラス基板にレジストを塗布して、電子ビーム描画装置にて上記設計通りの電極パターンを描画した後、レジストを現像し、アルミをエッチングすることによってフォトマスクを作製した。
【００５３】
電極基板の作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、（1985）に記載の方法に準じて以下の如く行った。
【００５４】
即ち、上記の如くして作製したフォトマスクと、レジストを塗布したアルミ蒸着ガラス基板を密着させたのち、水銀ランプで電極パターンを露光した。露光後の電極用ガラス基板はレジストの現像、アルミ面のエッチングに続き、アルミ面に残ったレジストを除去することによって電極基板を作製した。
【００５５】
実施例 １：エッチングにより基板に「電極よりも低い部位」を形成
図６に示すように、参考例１に記載のようにして作製した誘導泳動電極のガラス基板１をエッチングして、基板１の電極３対向部に連通溝４を形成した。
【００５６】
エッチング液として、フッ化ナトリウム硫酸（ＮａＦ３％、Ｈ２ＳＯ４ 、Ｈ２Ｏ）を使用した。フッ化ナトリウム硫酸は、ガラス、アルミの両方を溶かす性質を有するが、ガラスをエッチングする速度は、アルミをエッチングする速度に比べて非常に早いので、アルミ電極をマスクとしてアルミ電極以外のガラス部分をエッチングすることが出来る。
【００５７】
電極のアルミの厚さを４０ｎｍとすると、深さ３μｍ以上エッチングすると、エッチング液を純水で洗浄する時に、電極が水流によって折れ曲がる様子が観察されるが、２５０ｎｍの厚さで行うと電極が折れ曲がる現象は観察されなかった。
【００５８】
上記のようにエッチングして、エッチング時間（ｓｅｃ．）と電極間に形成される連通溝の深さ（μｍ）との関係を測定した。結果は、図７に示すように、エッチング時間と形成される溝の深さとは、比例関係を示した。尚、溝の深さは、電極をガラス切りで切断し、断面を顕微鏡で観察して測定した。
参考例 ２ 流路を有する電極基板の作製
不均一電界中に分子を移動させることによる分子の分離を行うため、実施例１で作製した電極基板上にシリコンゴムを用いて流路を作製した。
【００５９】
電極上に分子が溶解した溶液を送流するためのシリコンゴム流路は、深さ25μm、幅400μmで、電極基板上の電極が配置されている領域を通るように設計した。
【００６０】
作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、1985に記載の方法に準じて行った。先ず、ガラス板上に厚さ25μmのシート状ネガレジストを貼り付けた後、流路作製用に設計したフォトマスクを用いて露光した後、ネガレジストの現像を行った。このネガレジスト基板を鋳型として未硬化のシリコンゴムを流し込んだ後、硬化させることによって、電極が配置されている部分に高さ25μmの凹面を持つシリコンゴムを作製した。
【００６１】
電極基板とシリコンゴム流路を、電極基板上の電極が配置されている領域にシリコンゴム凹面があうように２液硬化型シリコンゴムで接着し、流路上流部に、溶液注入用のシリンジを差し込み、該電極基板に、電極上を分子が溶解している溶液を送流させる装置を付加した。
【００６２】
実施例 ２ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパクについての捕集率の測定
実施例１のようにして、深さ２μｍ又は４μｍの連通溝を形成した電極を作製し、参考例２に記載のように流路を形成して、本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置を作製し、下記のようにしてこの装置の捕集率を測定した。尚、比較のため、連通溝を形成しない以外は同様にして作製した誘導泳動クロマトグラフィー装置についても捕集率を測定した。
【００６３】
（試料）サンプルとして、ＦＩＴＣ標識されたＢＳＡ（分子量約６５ｋＤ）６０μｇ／ｍｌを用いた。
【００６４】
（操作）タンパク分子の電極基板や流路への吸着を防止するため、ブロックＡ（雪印乳業（株）社製）を用いて流路表面をブロッキングした後、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡを誘導泳動クロマトグラフィーに供した。
【００６５】
使用したサンプルの平均流速は５５６μｍ／ｓｅｃ．であり、電界印加は測定開始から３０〜１２０秒の間に行った。この時の印加する電界強度は、２．１４Ｍｖ／ｍ、２．５Ｍｖ／ｍ、２．８６Ｍｖ／ｍの３種類について捕集率を測定した。
【００６６】
捕集率の測定は、次式により求めた。
【００６７】
捕集率（％）＝［（Ｉ０-Ｉｍｉｎ）×１００］／（Ｉ０-Ｉｂａｃｋ）
式中、Ｉ０は、電界印加前の蛍光強度の定常値を表し、Ｉｍｉｎは、電界印加中の蛍光強度の最小値を表し、Ｉｂａｃｋは、バックグラウンドを表す。
（結果）結果を図８に示す。尚、図８中、−△―は深さ４μｍ、−□−は深さ２μｍ、−◇―は深さ０μｍの誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用した結果を表す。
【００６８】
図８の結果から明らかなように、溝の深さが深いほど捕集率（％）が向上し、２．８６Ｍｖ／ｍでは、４μｍの連通溝を持つ本発明の装置は、持たない従来の装置の捕集率２８％と比べて４０％であり、捕集率が約４３％向上すること、言い換えれば、このように本発明の装置を使用することにより目的物質の捕集能力が著しく向上することが判る。
【００６９】
実施例 ３：５００ｂｐＤＮＡについての捕集率の測定
インターカーレーター蛍光色素ＹＯＹＯ―１（モレキュラープローブ社）で標識した５００ｂｐＤＮＡを試料として使用し、実施例２と同様にして、溝の深さ０μｍ、２μｍ及び４μｍの誘導泳動クロマトグラフィー装置により捕集率（％）を測定した。
【００７０】
結果を図９に示す。尚、図９中、−△―は深さ４μｍ、−□−は深さ２μｍ、−◇―は深さ０μｍの連通溝を有する誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用した結果を表す。
【００７１】
図９の結果から明らかなように、この場合でも１．５Ｍｖ／ｍ以上の電界強度において、深さ４μｍの連通溝を形成した本発明の装置は、連通溝を有しない従来の装置より、約２０％程度捕集率（％）が向上した。
【００７２】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明によれば、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する電極間に電極よりも低い部位を設けるという従来全く行われていなかったことを行うことによって、誘導泳動による物質の分離に極めて重要な役割を有する捕集率が著しく向上するという絶大な効果を奏するものであり、それゆえ極めて画期的な発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】誘電泳動の原理を示す図である。
【図２】「電極よりも低い部位」の例を示す平面図（Ａ）と断面図（Ｂ）である。
【図３】等方性エッチング（Ａ）、異方性エッチング（Ｂ）、及びＲＩＥ若しくはＬＩＧＡ（Ｃ）により形成した本発明の「電極よりも低い部位」の例を示す断面図である。
【図４】本発明に使用する電極の例を示す平面図である。
【図５】本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置の断面図である。
【図６】本発明の方法により基板に「電極よりも低い部位」を形成する例を示す断面図である。
【図７】実施例１で測定したエッチング時間と溝の深さとの関係を示すグラフである。
【図８】本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置と従来の誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用して、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパクについて捕集率を測定したグラフである。
【図９】本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置と従来の誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用して、５００ｂｐＤＮＡについて捕集率を測定したグラフである。
【符号の説明】
１：基板
２：凸状物（支柱）
２′：凸状物（壁体）
３：電極
４：電極よりも低い部位（連通溝）
４′：電極よりも低い部位（溝）
５：電極間の最小ギャップ
【発明が属する技術分野】
この発明は、捕集能力を向上させた誘電泳動装置及び物質の分離方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年、半導体技術の進歩によりフォトリソグラフィー等の微細加工技術によってnmからμm単位での物質加工技術が確立され、現在もその微細加工技術は進歩しつづけている。
【０００３】
化学・生化学分野に於いては、この微細加工技術を利用して、生体試料からの分析対象成分の抽出（抽出工程），化学・生化学反応を用いる当該成分の分析（分析工程），並びにそれに続く分離処理（分離工程）及び検出（検出工程）といった一連の化学的・生化学的分析工程の全てを一辺数cm〜数十cmのチップ上に集積化等した極小の分析装置を用いて行う、微細総分析システム〔Micro Total Analysis System（μ-TAS）、Laboratory on a chip〕と呼ばれる新技術が発展しつつある。
【０００４】
このμ-TASの手法は、化学的・生化学的分析工程全てを通じて、分析時間の短縮化、使用するサンプル量や化学・生化学反応に必要な試薬量の低減化、分析機器や分析スペースの縮小化に大きく貢献するものと期待されている。
【０００５】
特に、μ-TASに於ける分離工程については、テフロン（登録商標）やシリカ等を材料として作製された内径１mm以下のキャピラリー（細管）を分離カラムとして使用して高電界中で物質の持つ電荷の差を利用して分離を行うキャピラリー電気泳動法や、同様のキャピラリーを用いてカラム担体と物質との相互作用の差を利用して分離を行うキャピラリーカラムクロマトグラフィー法が開発されている。
【０００６】
しかしながら、キャピラリー電気泳動法は、分離に高電圧が必要であることや、検出領域でのキャピラリー容量が制約されるため検出感度が低いという問題、更には、チップ上のキャピラリーチップでは、分離のためのキャピラリー長に制約があり、高分子の分離に充分なキャピラリー長が得られないため、低分子の物質の分離には適しているが高分子の物質の分離には適さないという問題を有している。また、キャピラリーカラムクロマトグラフィー法は、分離処理の高速化に限界があり、処理時間の短縮化が困難であるという問題を有している。
【０００７】
そこで、近年、上記した如き問題を解決する手段の一つとして、物質を不均一な交流電界内に置くと、物質内に正と負の分極が起こり、物質を取り囲む媒質の誘電率が物質よりも大きいと物質は電界の低い方向へ移動し、媒質の誘電率が物質よりも小さいと物質は電界の強い方向へと移動する力が働く現象、いわゆる誘電泳動力〔H.A.Pohl: "Dielectrophoresis", Cambridge Univ. Press(1978)、T.B.Jones: "Electromechanics ofParticles", Cambridge Univ. Press (1995)等〕を利用した分離方法が、注目されている。
【０００８】
この分離方法は、（１）誘電泳動力の大きさは、物質（粒子）の大きさ・誘電的性質に依存し、電界傾度に比例するため、微細加工電極を用いれば、電界および電界傾度をきわめて大きくとることができるので、キャピラリー電気泳動のように高電圧を必要とせず、低い印加電圧で高速な分離が期待できる、（２）電界の強い場所が微小領域に極限されるため、電界印加による温度上昇も最小限にとどめることができ、また、高電界場の形成が可能となる、（３）誘電泳動は、電界傾度に比例する力であることからわかるように、印加電圧の極性に依存しないので、交流電界下でも直流同様に力が働く。従って、高周波交流を用いれば水溶液での電極反応（電気分解反応）は抑えられるので、電極自体をチャネル（サンプル流路）中に集積化することが可能となる、（４）キャピラリー電気泳動のように検出部分のチャンバ容量に制約がないことから検出感度の向上も望める、等の点から、現在ではμ-TASに於ける最も適した分離方法と考えられている。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、誘電泳動のμ−ＴＡＳへの応用を考えた場合、捕集能力を向上させることは、極めて重大なことであり、この点で従来の誘電泳動装置は未だ十分満足すべきものではない。
【００１０】
即ち、物質の捕集能力が向上すれば、電極領域での分離が可能となることと、効率よく保持することによって、Ｓ／Ｎ（シグナル／ノイズ）比の高い分離が実現される。また例えば、特に物質に働く誘電泳動力と流体抗力との相互作用によって分離を行うField-Flow fractionationにおいては、同じ流速でも短い電極領域での分離が可能となるからである。
【００１１】
この発明のうち請求項１に記載の発明は、このような点に着目してなされたものであり、誘電泳動電極により形成された不均一電界内に分離すべき物質を含む液体を存在させ、該物質に働く誘電泳動力によって分離を行う装置において、物質の捕集能力を向上させた誘電泳動装置を提供することを目的とする。
【００１２】
また、請求項３に記載の発明は、物質の分離方法を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
上記問題点を解決するため本発明者等は鋭意研究の結果、電極と電極の基板部分を掘削し、該電極よりも低い部位を形成することによって、不均一電界領域が増大することと流体の抗力が低減することから、捕集能力が向上することを想到し、本発明に到達した。
【００１４】
しかして、従来、誘電泳動力を利用した分離装置及び方法、特にField-Flow fractionationにおける装置及び方法についての特許及び論文は多数見られるが、「電極よりも低い部位」を形成させることによって物質の捕集能力を向上させる装置及び方法は全く知られていないし、このような発想も全く知られていない。
【００１５】
本発明のうち、請求項１記載の発明は、基板上に電極を設けた誘電泳動装置において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する前記電極間に該電極よりも低い部位を形成して、対向する前記電極間に、不均一電界領域の増加を実現する構造を形成したことを特徴とする。
【００１６】
「電極よりも低い部位」を形成することによって、電極間の上方だけでなく下方にも電解が形成されるので不均一電界領域が増加し、更には、例えばField-Flow fractionationに用いた場合には、この部分の流体の流速が落ちるので流体抗力が低減することから、物質の捕集能力が向上する。
ここで、物理的手段とは、例えば適当な刃物等を使用して掘削する方法、例えばシンクロトロン放射光を用いるＬＩＧＡ（Lithographile Galvanoformung Abformung）法等のことであり、また、化学的手段とは、例えば基板に対するエッチング液を用いて基板を掘削するエッチング等のことである。また、例えば物理的掘削と化学的掘削とを同時に行う、高周波電源によりプラズマとした反応性ガスを用いるエッチング［反応性イオンエッチング：Reactive Ion Etching（RIE）］によっても電極間の基板を掘削することができる。尚、上記した如き手段を適宜組み合わせて基板の掘削を行っても良い。
【００１７】
また、請求項３に記載の発明は、誘電泳動電極により形成された不均一電界内に、分離すべき物質を含む液体を存在させ、該物質に働く誘電泳動力の差によって分離を行う物質の分離方法において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する電極間に形成した電極よりも低い部位を形成することにより、不均一電界領域の増加を実現することによって、物質の捕集能力を向上させたことを特徴とする。
【００１８】
尚、誘電泳動（Dielectrophoresis,DEP）とは、物質の電導率及び誘電率と媒質の電導率及び誘電率と、印加する周波数との相互作用により、不均一な電界内で中性粒子が移動する現象のことであり、この際に分子に働く力を誘電泳動力と呼ぶ。また、誘電泳動力は、物質が電界の強い方へと移動する正の誘電泳動力と電界の弱い方へと移動する負の誘電泳動力の２種類に分けられる。以下に、分子に正の誘電泳動力が働く場合を例にとり説明する。
【００１９】
即ち、電界内に置かれた中性分子には、図１に示すように電界の下流側に正極性の分極電荷＋ｑが、上流側には負極性の分極電荷−ｑが夫々誘導され、＋ｑには電界Ｅにより大きさ＋ｑＥの力が働き、この部分を電界の上流側へと引く。分子が中性ならば、＋ｑと−ｑの絶対値は等しく、仮に電界が場所によらず一定であるならば、両者に働く力は釣り合って分子は動かない。しかし、電界が一様でない場合には、強い電界側へ引く力の方が大きくなり、分子は電界の強い側へと駆動されることとなる。
【００２０】
上記したように、溶液中の分子は、該分子に生じる誘電泳動力に応じて電界領域内を種々移動するが、例えばField-Flow fractionationにおける分子の運動は、該分子に生じる誘電泳動力Ｆdの他に、流体抗力（流路内の流れによる抗力）Ｆvと熱運動による力Ｆthの３つの要因により支配される。即ち、（１）Ｆd＞＞Ｆv＋Ｆthの場合には、分子は電極に捕集（トラップ）され、（２）Ｆd＜＜Ｆv＋Ｆthの場合には、電界に関わらず、分子は流路内の流れにのって流出する。また、（３）Ｆd≒Ｆv＋Ｆthの場合には、分子は電極に吸着・脱着を繰り返しながら下流へと運ばれる結果、本来の流路内の流れよりも遅れて出口に到達する。
【００２１】
本発明においては、対向する電極間を深く掘削することによって、電極間の下方にも不均一電界が形成されるから、不均一電界領域が増加することと、この部分の流体の流れが遅くなり、流体の抗力Ｆvが低減することから、上記（１）の如き条件でＦdがより大となり、Ｆvがより小となるから、捕集率が向上する。また、電極間の下方に形成された電界にトラップされた粒子は、「電極よりも低い部位」に位置することとなるから、流出され難くなる。
【００２２】
【発明の実施の形態】
次に、本発明の実施の形態を説明する。
図２は、基板（ガラス基板）１上の凸状物（支柱）２で、長さ方向に間隔付けて電極３を支持した例を示す。
【００２３】
対向する電極３，３間には、図２（Ｂ）に示すように、断面半円状の「電極よりも低い部位」（連通溝）４が形成され、隣接する連通溝４，４は、図２（Ａ）に示すように、凸状物２以外の部分で連通するようになっている。図３は、本発明の実施例を示すもので、図３（Ａ）は、上記のように凸状物２以外の部分で連通するようになっているが、図３（Ｂ）は、電極３を壁体（凸状物）２′で支持し、隣接する溝４′，４′を同壁体２′で隔離して、連通しないようになっている。
【００２４】
また、図３（Ａ）、（Ｂ）に示す実施例では、凸状物２及び２′以外の部分は「電極３よりも低い部位」（４及び４′）に形成されている。
【００２５】
しかしながら、対向する電極３，３間の一部に、凹部（穴）を単独若しくは間隔付けて複数設けても差し支えないが、図３（Ａ）、（Ｂ）に示すように、対向する電極の全部若しくは大部分を電極よりも低い部位（４若しくは４′）に形成する方が、捕集能力が向上することから好ましい。
【００２６】
対向する電極３，３間の一部に、凹部（穴）を設ける場合は、対向する電極間の最小ギャップ間５に設けるのが好ましい。この部分が電界強度が強いので、この部分に設ければ、捕集能力がより向上するからである。しかしながら、この部分を含んだ全体に形成すれば、分子をトラップする部分が増大するから、更に捕集能力が向上する。
【００２７】
溝４の広さ（図３（Ａ）、（Ｂ）に示す場合は、電極３，３間の距離と同じ）は、電界強度に大きく影響するが、誘導泳動対象とする物質の大きさによって適宜決定するものであり一概には言えない。その大きさがマイクロメーターサイズの物質では、好ましくはその物質が持つ直径の１００倍以下１倍以上、更に好ましくは１０倍以下１倍以上の広さとするのが良い。また、タンパク質、遺伝子等の生体分子の場合、例えばペプチド鎖、タンパク質等では、通常１０μｍ以下１ｎｍ以上、好ましくは５μｍ以下１ｎｍ以上であり、ヌクレオチド鎖（ポリヌクレオチド、オリゴグクレオチド）等の場合、通常１００μｍ以下１ｎｍ以上、好ましくは５０μｍ以下１ｎｍ以上とするのが良い。
【００２８】
一般には、深いほど分子をトラップする部分が増大し、更には特にField-Flowfractionationの場合には、溝の部分での流速が抑えられ捕集能力（捕集率）が向上する。しかしながら、深すぎると、誘電泳動によって電極上にトラップした分子を測定する必要がある場合、トラップされていた分子が溝部分から放出され難いか、放出されない場合が生じる。従って、溝の深さは、好ましくは溝の広さの１０倍以下１／１０００倍以上、更に好ましくは１倍以下１／１０００倍以上である。
【００２９】
溝の深さは、図３（Ａ）に示すような等方性エッチングにより形成すれば、電極幅以上に掘ると電極３を保持している凸状物２が全て削り取られるので、電極３が剥離する。従って、この方法で溝を形成する場合は、溝の深さは、最大電極幅部分の１／２以下となる。
【００３０】
図３（Ｂ）に示すように、シリコンウェハーの異方性エッチングにより形成する場合は、５５度の角度で深さ方向のみにエッチングが進む。従って、この方法でエッチングする場合は、深さ方向の最大距離は、（電極間の距離÷２）×１．４２（ｔａｎ５５度）となる。図３（Ｃ）に示すように、ＲＩＥやＬＩＧＡ等により形成する場合は、ほぼ垂直にエッチングが進む。従って、これらの方法でエッチングする場合は、溝の深さは、前述した範囲、即ち、好ましくは溝の深さの１０倍以下１／１０００倍以上、更に好ましくは１倍以下１／１０００倍以上である。
【００３１】
溝の間隔（＝電極自体の幅）は、正の誘電泳動による分離に限定すれば、分離対象によって左右されない。微細加工技術の加工精度から、通常は５０μｍ以下１ｎｍ以上、好ましくは１０μｍ以下１ｎｍ以上である。
【００３２】
図３（Ａ）に示す等方性エッチングは、ガラス基板若しくはプラスチック基板をエッチングすることにより形成される。等方性エッチングは、基板上の壁体２上で電極３を支持し、隣接する溝４，４は同壁体２で隔離されるように形成される場合や、基板上の凸状物２で電極３を支持し、隣接する溝（連通溝）４，４は連通するように形成される場合等、エッチングの程度により種々の形状が形成される。
【００３３】
図３（Ｂ）に示す異方性エッチングは、シリコン基板をエッチングすることにより形成される。この場合は、基板上の壁体２′上で電極３を支持し、隣接する溝４′，４′は同壁体２′で隔離されるようになっている。図３（Ｃ）に示すＲＩＥは、シリコンやＳｉＯ２基板等をエッチングすることにより形成され、また、ＬＩＧＡは、ポリマー、セラミック、プラスチック基板等をエッチングすることにより形成される。これらの場合は、基板上の壁体２”上で電極３を支持し、隣接する溝４”，４”は同壁体２”で隔離されるようになっている。
【００３４】
図３（Ａ）に示す等方性エッチングでは、一般には、溝又は連通溝４は断面が半円若しくは半楕円形のような形状に形成される。図３（Ｂ）に示す異方性エッチングで溝を形成すると、一般には、溝４′は断面略台形を通って最終的に略Ｖ字形にエッチングされる。また、図３（Ｃ）に示すＲＩＥやＬＩＧＡ等で溝を形成すると、一般には、ほぼ断面方形にエッチングされる。従って、エッチングの仕方及び「電極より低い部位」の形成の仕方によって、種々の断面形状のものが形成されるが、本発明においては「電極より低い部位」（連通溝、溝、凹部等）の形状は特に限定されない。
【００３５】
図３（Ａ）の壁体又は凸状物２は、中央部が括れた形状に形成され、図３（Ｂ）の壁体２′は、台形に形成され、また、図３（Ｃ）の壁体２”は、方形に形成されているが、壁体又は凸状物２、壁体２′及び壁体２”は、電極３を支持し得るならどのような形状でも良く、特に限定されない。
【００３６】
本発明に使用する電極３は、例えばアルミニウム、金等の導電性の材質からなり、その構造は、誘電泳動力、即ち、水平及び垂直方向に不均一電界を生じ得るものであればよく、例えば、インターデジタル形状〔J. Phys. D:Appl. Phys. 258, 81-88,(1992)、Biochim.Biophys. Acta., 964, 221-230,(1988)等〕が挙げられる。
【００３７】
より具体的には、図４に示すように、（Ａ）直線状の帯状部６の上下に対向して三角形の外方突出部７ａを間隔付けて多数形成した形状、（Ｂ）直線状の帯状部６の上下に対向して四角形の外方突出部７ｂを間隔付けて多数形成した形状、（Ｃ）直線状の帯状部６の上下に対向して台形の外方突出部７ｃを間隔付けて多数形成した形状、（Ｄ）上下に正弦波形であり、同正弦波の凸部８と凹部９（凹部９と凸部８）とが上下に対向して直線状に多数連設された形状、（Ｄ）上下に鋸歯形であり、同鋸歯の凸部８′と凹部９′（凹部９′と凸部８′）とが上下に対向して直線状に多数連設された形状が好ましい。しかしながら、誘電泳動に使用し得る電極であれば、どのようなものでも使用することが出来、特に限定されない。
【００３６】
このような電極は、通常、例えばガラス、プラスチック、石英、シリコン等の非導電性の材質からなる基板上に、それ自体公知の微細加工技術〔Biochim. Biophys. Acta., 964, 221-230等〕を用いて、１対以上の上記した如き形状の電極を櫛歯状に設けることにより作製される。また、対向（隣接）する電極３間の距離は、強電界強度の不均一交流電界を形成し得るものであれば特に限定されず、目的の分子の種類により適宜設定すべきものである。
【００３９】
電極３の厚さは、従来と同様で良く、具体的には、通常０．５ｎｍ以上、好ましくは０．５ｎｍ〜１ｎｍ、更に好ましくは１ｎｍ〜１０００ｎｍである。
【００４０】
電極３は、厚さ以外は、従来と同様で良く、電極上への種々の物質の吸着防止のため、有機薄膜を電極にコーティングしても差し支えない。
【００４１】
上記本発明の誘電泳動装置を製造するには、誘電泳動電極及び流路のような「電極よりも低い部位」（連通溝４、溝４′、凹部等）以外は、従来と同様に形成すれば良い。
【００４２】
「電極よりも低い部位」を形成するには、例えば適当な刃物等を使用して掘削する方法や例えばシンクロトロン放射光を用いるＬＩＧＡ（Lithographile Galvanoformung Abformung）法等の物理的手段、例えば基板に対するエッチング液を用いて基板を掘削するエッチング等の化学的手段、又は、高周波電源によりプラズマとした反応性ガスを用いるエッチング［反応性イオンエッチング：ReactiveIon Etching（RIE）］等の物理的及び化学的手段、等により電極間の基板を掘削して形成すればよい。尚、上記した如き手段を適宜組み合わせて基板の掘削を行っても良い。
【００４３】
エッチング液は、基板の材質に応じて公知のエッチング液を選択すれば良く、また基板の一部に電極よりも低い部分を形成する場合は、掘削したくない部分を適当にマスキングしてエッチングすれば良い。
【００４４】
本発明の誘電泳動装置を使用して、本発明の分離方法を実施するには、分離方法自体は従来と同じように行えばよい。
【００４５】
即ち、上記した如き電極（電極基板）を用いて形成させた不均一電界内に、分離すべき物質を含む液体、例えば２種以上の物質（分子若しくは粒子）が溶解若しくは懸濁している液体を存在させて、当該物質に働く誘電泳動力の差によって分離すれば良い。
【００４６】
一般には、基板上の流路内に水平及び垂直方向に不均一な電界を形成させ、入口から分離すべき物質を含む液体を流して、当該物質に働く誘電泳動力の差によって分離すれば良い。しかしながら、流れを生じさせることなく、電極の特定部分に保持される成分と保持されない成分とに分離しても勿論良い。
【００４７】
物質（分子、粒子）に働く誘電泳動力の差によって分離するには、電極の特定部分に保持される分子等と保持されない分子等とに分離したり、より強い誘電泳動力を受ける分子等は弱い誘電泳動力を受ける分子等よりも遅延して移動するため、移動時間に差が生じることを利用して分離したりすれば良い。
【００４８】
図５の矢印で示すように、本発明の装置の流路に電極の長さ方向と交差する方向から分離すべき物質を含む液体を流すと、連通溝４の中の流速は流路部分に比べて遅くなり、連通溝４の中に入った分子にかかる流体の抗力Ｆｖを減らすことが出来る。また、電極３，３間に連通溝４を形成したことによって、電界の影響範囲が広くなることと、トラップされた分子がストックされる場所が広がることから、捕集率が向上したものと思われる。
【００４９】
本発明の測定方法は、本発明の分離方法を利用する以外は、上記した如きそれ自体公知の方法に準じて実施すればよく、使用される試薬類も、それ自体公知の試薬類の中から適宜選択すればよい。
【００５０】
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらにより何等限定されるものではない。
【００５１】
【実施例】
参考例 １：誘電泳動電極基板の作製最小ギャップ7μm 、電極ピッチ20μm、電極数2016（1008対）の多段電極列を設計し、それに基づいて、電極作製用のフォトマスクを作製した。
【００５２】
即ち、アルミ蒸着したガラス基板にレジストを塗布して、電子ビーム描画装置にて上記設計通りの電極パターンを描画した後、レジストを現像し、アルミをエッチングすることによってフォトマスクを作製した。
【００５３】
電極基板の作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、（1985）に記載の方法に準じて以下の如く行った。
【００５４】
即ち、上記の如くして作製したフォトマスクと、レジストを塗布したアルミ蒸着ガラス基板を密着させたのち、水銀ランプで電極パターンを露光した。露光後の電極用ガラス基板はレジストの現像、アルミ面のエッチングに続き、アルミ面に残ったレジストを除去することによって電極基板を作製した。
【００５５】
実施例 １：エッチングにより基板に「電極よりも低い部位」を形成
図６に示すように、参考例１に記載のようにして作製した誘導泳動電極のガラス基板１をエッチングして、基板１の電極３対向部に連通溝４を形成した。
【００５６】
エッチング液として、フッ化ナトリウム硫酸（ＮａＦ３％、Ｈ２ＳＯ４ 、Ｈ２Ｏ）を使用した。フッ化ナトリウム硫酸は、ガラス、アルミの両方を溶かす性質を有するが、ガラスをエッチングする速度は、アルミをエッチングする速度に比べて非常に早いので、アルミ電極をマスクとしてアルミ電極以外のガラス部分をエッチングすることが出来る。
【００５７】
電極のアルミの厚さを４０ｎｍとすると、深さ３μｍ以上エッチングすると、エッチング液を純水で洗浄する時に、電極が水流によって折れ曲がる様子が観察されるが、２５０ｎｍの厚さで行うと電極が折れ曲がる現象は観察されなかった。
【００５８】
上記のようにエッチングして、エッチング時間（ｓｅｃ．）と電極間に形成される連通溝の深さ（μｍ）との関係を測定した。結果は、図７に示すように、エッチング時間と形成される溝の深さとは、比例関係を示した。尚、溝の深さは、電極をガラス切りで切断し、断面を顕微鏡で観察して測定した。
参考例 ２ 流路を有する電極基板の作製
不均一電界中に分子を移動させることによる分子の分離を行うため、実施例１で作製した電極基板上にシリコンゴムを用いて流路を作製した。
【００５９】
電極上に分子が溶解した溶液を送流するためのシリコンゴム流路は、深さ25μm、幅400μmで、電極基板上の電極が配置されている領域を通るように設計した。
【００６０】
作製は、図解フォトファブリケーション、橋本貴夫著、総合電子出版、1985に記載の方法に準じて行った。先ず、ガラス板上に厚さ25μmのシート状ネガレジストを貼り付けた後、流路作製用に設計したフォトマスクを用いて露光した後、ネガレジストの現像を行った。このネガレジスト基板を鋳型として未硬化のシリコンゴムを流し込んだ後、硬化させることによって、電極が配置されている部分に高さ25μmの凹面を持つシリコンゴムを作製した。
【００６１】
電極基板とシリコンゴム流路を、電極基板上の電極が配置されている領域にシリコンゴム凹面があうように２液硬化型シリコンゴムで接着し、流路上流部に、溶液注入用のシリンジを差し込み、該電極基板に、電極上を分子が溶解している溶液を送流させる装置を付加した。
【００６２】
実施例 ２ 牛血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパクについての捕集率の測定
実施例１のようにして、深さ２μｍ又は４μｍの連通溝を形成した電極を作製し、参考例２に記載のように流路を形成して、本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置を作製し、下記のようにしてこの装置の捕集率を測定した。尚、比較のため、連通溝を形成しない以外は同様にして作製した誘導泳動クロマトグラフィー装置についても捕集率を測定した。
【００６３】
（試料）サンプルとして、ＦＩＴＣ標識されたＢＳＡ（分子量約６５ｋＤ）６０μｇ／ｍｌを用いた。
【００６４】
（操作）タンパク分子の電極基板や流路への吸着を防止するため、ブロックＡ（雪印乳業（株）社製）を用いて流路表面をブロッキングした後、ＦＩＴＣ標識ＢＳＡを誘導泳動クロマトグラフィーに供した。
【００６５】
使用したサンプルの平均流速は５５６μｍ／ｓｅｃ．であり、電界印加は測定開始から３０〜１２０秒の間に行った。この時の印加する電界強度は、２．１４Ｍｖ／ｍ、２．５Ｍｖ／ｍ、２．８６Ｍｖ／ｍの３種類について捕集率を測定した。
【００６６】
捕集率の測定は、次式により求めた。
【００６７】
捕集率（％）＝［（Ｉ０-Ｉｍｉｎ）×１００］／（Ｉ０-Ｉｂａｃｋ）
式中、Ｉ０は、電界印加前の蛍光強度の定常値を表し、Ｉｍｉｎは、電界印加中の蛍光強度の最小値を表し、Ｉｂａｃｋは、バックグラウンドを表す。
（結果）結果を図８に示す。尚、図８中、−△―は深さ４μｍ、−□−は深さ２μｍ、−◇―は深さ０μｍの誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用した結果を表す。
【００６８】
図８の結果から明らかなように、溝の深さが深いほど捕集率（％）が向上し、２．８６Ｍｖ／ｍでは、４μｍの連通溝を持つ本発明の装置は、持たない従来の装置の捕集率２８％と比べて４０％であり、捕集率が約４３％向上すること、言い換えれば、このように本発明の装置を使用することにより目的物質の捕集能力が著しく向上することが判る。
【００６９】
実施例 ３：５００ｂｐＤＮＡについての捕集率の測定
インターカーレーター蛍光色素ＹＯＹＯ―１（モレキュラープローブ社）で標識した５００ｂｐＤＮＡを試料として使用し、実施例２と同様にして、溝の深さ０μｍ、２μｍ及び４μｍの誘導泳動クロマトグラフィー装置により捕集率（％）を測定した。
【００７０】
結果を図９に示す。尚、図９中、−△―は深さ４μｍ、−□−は深さ２μｍ、−◇―は深さ０μｍの連通溝を有する誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用した結果を表す。
【００７１】
図９の結果から明らかなように、この場合でも１．５Ｍｖ／ｍ以上の電界強度において、深さ４μｍの連通溝を形成した本発明の装置は、連通溝を有しない従来の装置より、約２０％程度捕集率（％）が向上した。
【００７２】
【発明の効果】
以上述べた如く、本発明によれば、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する電極間に電極よりも低い部位を設けるという従来全く行われていなかったことを行うことによって、誘導泳動による物質の分離に極めて重要な役割を有する捕集率が著しく向上するという絶大な効果を奏するものであり、それゆえ極めて画期的な発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】誘電泳動の原理を示す図である。
【図２】「電極よりも低い部位」の例を示す平面図（Ａ）と断面図（Ｂ）である。
【図３】等方性エッチング（Ａ）、異方性エッチング（Ｂ）、及びＲＩＥ若しくはＬＩＧＡ（Ｃ）により形成した本発明の「電極よりも低い部位」の例を示す断面図である。
【図４】本発明に使用する電極の例を示す平面図である。
【図５】本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置の断面図である。
【図６】本発明の方法により基板に「電極よりも低い部位」を形成する例を示す断面図である。
【図７】実施例１で測定したエッチング時間と溝の深さとの関係を示すグラフである。
【図８】本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置と従来の誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用して、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）タンパクについて捕集率を測定したグラフである。
【図９】本発明の誘導泳動クロマトグラフィー装置と従来の誘導泳動クロマトグラフィー装置を使用して、５００ｂｐＤＮＡについて捕集率を測定したグラフである。
【符号の説明】
１：基板
２：凸状物（支柱）
２′：凸状物（壁体）
３：電極
４：電極よりも低い部位（連通溝）
４′：電極よりも低い部位（溝）
５：電極間の最小ギャップ
Claims (4)
- 基板上に電極を設けた誘電泳動装置において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する前記電極間に該電極よりも低い部位を形成して、対向する前記電極間に、不均一電界領域の増加を実現する構造を形成したことを特徴とする誘電泳動装置。
- 前記化学的手段が、誘電泳動装置の基板に対するエッチング液を用いるエッチングである請求項１に記載の誘電泳動装置。
- 誘電泳動電極により形成された不均一電界内に、分離すべき物質を含む液体を存在させ、該物質に働く誘電泳動力の差によって分離を行う物質の分離方法において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削して、対向する電極間に形成した電極よりも低い部位を形成することにより、不均一電界領域の増加を実現することによって、物質の捕集能力を向上させたことを特徴とする物質の分離方法。
- 誘電泳動電極により形成された不均一電界内に、分離すべき物質を含む液体を流し、該物質に働く誘電泳動力と流体抗力の相互作用によって分離を行う物質の分離方法において、物理的又は／及び化学的手段により電極間の基板を掘削し、対向する電極間に形成した電極よりも低い部位を形成することにより、不均一電界領域の増加と流体抗力の低減を実現することによって、物質の捕集能力を向上させる請求項３に記載の分離方法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000112337A JP4587112B2 (ja) | 2000-04-13 | 2000-04-13 | 誘電泳動装置及び物質の分離方法 |
| AT01109169T ATE370793T1 (de) | 2000-04-13 | 2001-04-12 | Elektroden-bau für dielektrophoretische anordnung und dielektrophoretische trennung |
| DE60130052T DE60130052T2 (de) | 2000-04-13 | 2001-04-12 | Elektroden-Bau für dielektrophoretische Anordnung und dielektrophoretische Trennung |
| ES01109169T ES2288154T3 (es) | 2000-04-13 | 2001-04-12 | Construccion de electrodos para aparato dielectroforetico y separacion por dielectroforesis. |
| EP06008220A EP1716926A3 (en) | 2000-04-13 | 2001-04-12 | Electrode for dielectrophoretic apparatus, dielectrophoretic apparatus, method for manufacturing the same, and method for separating substances using the electrode or dielectrophoretic apparatus |
| CA002343873A CA2343873A1 (en) | 2000-04-12 | 2001-04-12 | Electrode for dielectrophoretic apparatus, dielectrophoretic apparatus, methdo for manufacturing the same, and method for separating substances using the elctrode or dielectrophoretic apparatus |
| EP01109169A EP1145766B1 (en) | 2000-04-13 | 2001-04-12 | Electrode construction for dielectrophoretic apparatus and separation by dielectrophoresis |
| US09/833,566 US6875329B2 (en) | 2000-04-13 | 2001-04-13 | Method for separating substances using a dielectrophoretic apparatus |
| US11/064,828 US20050139473A1 (en) | 2000-04-13 | 2005-02-25 | Electrode for dielectrophoretic apparatus, dielectrophoretic apparatus, method for manufacturing the same, and method for separating substances using the electrode or dielectrophoretic apparatus |
| US12/588,268 US20100126865A1 (en) | 2000-04-13 | 2009-10-09 | Electrode for dielectrophoretic apparatus, dielectrophoretic apparatus, method for manufacturing the same, and method for separating substances using the electrode or dielectrophoretic apparatus |
| US13/067,876 US20110259746A1 (en) | 2000-04-13 | 2011-07-01 | Electrode for dielectrophoretic apparatus, dielectrophoretic apparatus, method for manufacturing the same, and method for separating substances using the electrode or dielectrophoretic apparatus |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000112337A JP4587112B2 (ja) | 2000-04-13 | 2000-04-13 | 誘電泳動装置及び物質の分離方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001296274A JP2001296274A (ja) | 2001-10-26 |
| JP4587112B2 true JP4587112B2 (ja) | 2010-11-24 |
Family
ID=18624526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000112337A Expired - Fee Related JP4587112B2 (ja) | 2000-04-12 | 2000-04-13 | 誘電泳動装置及び物質の分離方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP4587112B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101284725B1 (ko) * | 2011-07-22 | 2013-07-17 | 한국항공대학교산학협력단 | 유전영동력을 이용한 고속 입자분리 시스템 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3695431B2 (ja) * | 2001-08-03 | 2005-09-14 | 日本電気株式会社 | 分離装置および分離装置の製造方法 |
| JP3811404B2 (ja) * | 2002-01-10 | 2006-08-23 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 誘電泳動フィルター装置及び誘電泳動による懸濁微粒子除去方法 |
| GB0303305D0 (en) * | 2003-02-12 | 2003-03-19 | Secr Defence | Apparatus for collecting particles |
| JP2004243238A (ja) * | 2003-02-14 | 2004-09-02 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | 粒子の選別法 |
| WO2005121767A1 (ja) * | 2004-05-25 | 2005-12-22 | Fluid Incorporated | マイクロ流体デバイス及びこれを用いる分析分取装置 |
| KR101395149B1 (ko) * | 2012-07-20 | 2014-05-15 | 부산대학교 산학협력단 | 교류 전압을 이용한 마이크로유체 채널 및 이를 이용한 검출 방법 |
| JP6822006B2 (ja) * | 2016-08-16 | 2021-01-27 | 東ソー株式会社 | 目的粒子の回収方法および回収装置 |
| CN107267382B (zh) * | 2017-07-26 | 2024-04-23 | 南方科技大学 | 一种基于介电电泳的微流控芯片及其制备方法和应用 |
| KR102060099B1 (ko) * | 2018-03-23 | 2019-12-30 | 한국과학기술연구원 | 수직 나노갭 유전영동 전극, 이의 제조방법 및 이를 이용한 입자 포집 및 분리 방법 |
| KR102362856B1 (ko) * | 2020-08-03 | 2022-02-15 | 한국과학기술연구원 | 입자 포집 장치 및 입자 센싱 방법 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2756677B2 (ja) * | 1988-05-10 | 1998-05-25 | 株式会社アドバンス | 微粒子取扱い装置 |
| DE4034697A1 (de) * | 1990-10-31 | 1992-05-14 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur handhabung mikroskopisch kleiner, dielektrischer teilchen und vorrichtung zur durchfuehrung des verfahrens |
| DE4127405C2 (de) * | 1991-08-19 | 1996-02-29 | Fraunhofer Ges Forschung | Verfahren zur Trennung von Gemischen mikroskopisch kleiner, in einer Flüssigkeit oder einem Gel suspendierter dielektrischer Teilchen und Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens |
| GB9615775D0 (en) * | 1996-07-26 | 1996-09-04 | British Tech Group | Apparatus and method for characterising particles using dielectrophoresis |
| WO2000000293A1 (de) * | 1998-06-26 | 2000-01-06 | Evotec Biosystems Ag | Elektrodenanordnungen zur erzeugung funktioneller feldbarrieren in mikrosystemen |
| JP3669182B2 (ja) * | 1998-10-27 | 2005-07-06 | 松下電器産業株式会社 | 微生物数測定装置及び微生物数測定方法 |
| GB9916850D0 (en) * | 1999-07-20 | 1999-09-22 | Univ Wales Bangor | Dielectrophoretic apparatus & method |
| JP4504501B2 (ja) * | 2000-03-15 | 2010-07-14 | 株式会社東海理化電機製作所 | 粒子移動／固定装置 |
-
2000
- 2000-04-13 JP JP2000112337A patent/JP4587112B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101284725B1 (ko) * | 2011-07-22 | 2013-07-17 | 한국항공대학교산학협력단 | 유전영동력을 이용한 고속 입자분리 시스템 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2001296274A (ja) | 2001-10-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP1145766B1 (en) | Electrode construction for dielectrophoretic apparatus and separation by dielectrophoresis | |
| US6790330B2 (en) | Systems and methods for cell subpopulation analysis | |
| Tegenfeldt et al. | Micro-and nanofluidics for DNA analysis | |
| US6136171A (en) | Micromachined electrical field-flow fractionation system | |
| US9995668B2 (en) | Apparatus for manipulating, modifying and characterizing particles in a micro channel | |
| Zhao et al. | Continuous separation of nanoparticles by type via localized DC-dielectrophoresis using asymmetric nano-orifice in pressure-driven flow | |
| Ramirez‐Murillo et al. | Toward low‐voltage dielectrophoresis‐based microfluidic systems: A review | |
| KR100813254B1 (ko) | 유전 영동을 통하여 분극성 분석물을 분리하기 위한 장치및 그를 이용하여 시료 중의 분극성 물질을 분리하는 방법 | |
| US20140048417A1 (en) | Ex-Vivo Multi-Dimensional System For The Separation And Isolation Of Cells, Vesicles, Nanoparticles, And Biomarkers | |
| US20060196772A1 (en) | Microfluidic device including membrane having nano- to micro-sized pores and method of separating polarizable material using the same | |
| US20060210995A1 (en) | Nanopore analysis systems and methods of using nanopore devices | |
| JP4587112B2 (ja) | 誘電泳動装置及び物質の分離方法 | |
| CN110918139B (zh) | 微流控芯片、含有该微流控芯片的装置及样本浓缩的方法 | |
| US20070267295A1 (en) | Apparatus and method for non-contact microfluidic sample manipulation | |
| Bu et al. | Continuous-flow label-free size fractionation of extracellular vesicles through electrothermal fluid rolls and dielectrophoresis synergistically integrated in a microfluidic device | |
| Li et al. | Conductivity-difference-enhanced DC dielectrophoretic particle separation in a microfluidic chip | |
| US7713395B1 (en) | Dielectrophoretic columnar focusing device | |
| Miles et al. | Dielectrophoretic manipulation of particles for use in microfluidic devices | |
| Ichiki et al. | Microchip technologies for the analysis of biological cells | |
| EP3799956A1 (en) | Electrophoretic enrichment of analytes in droplets | |
| KR100924514B1 (ko) | 단백질 시료의 미세전기탈염장치, 이를 포함하는 랩온어칩및 이들의 적용 방법 | |
| JP4671084B2 (ja) | 誘電泳動装置用電極、その製法及び誘電泳動装置並びに該電極を使用する物質の分離方法及び検出方法 | |
| JP4128084B2 (ja) | 試料の特性化方法およびその装置 | |
| WO2007046871A2 (en) | Apparatus and method for non-contact microfluidic sample manipulation | |
| Dalir et al. | Three-dimensional dielectrophoretic microparticle separator fabricated by ultraviolet-assisted direct-write assembly |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070316 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20090630 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100223 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100402 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100407 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100816 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100829 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130917 Year of fee payment: 3 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |