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JP4504559B2 - 新リポポリアミン、その調製および適用 - Google Patents

新リポポリアミン、その調製および適用 Download PDF

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Description

【０００１】
正に帯電した脂質（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ、生物複合化学第５号、３８２−３８９頁、１９９４年）は、リポソーム、ミセルの形態で、またはこのような形態としてペプチド類、ペプトイド類、タンパク質類、ＰＮＡ、抗ウィルス作用物質、しかし特にＤＮＡ、ＲＮＡ、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡまたはリボザイムのような生物学的に活性の物質を真核細胞（たとえば哺乳動物-、植物-、または昆虫細胞）内へ組入れるために使用される。リポポリアミンは比較的卓越したトランスフェクション性質を示す陽イオン脂質の特殊の種類である。トランスフェクションのもとに真核細胞内への遺伝物質の組入れが理解されている。
【０００２】
たとえば成功裡に遺伝子治療を営むことができるようにするためにＤＮＡ（たとえばプラスミド、コスミド、一本鎖または二本鎖）、ＲＮＡまたは、アンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡまたはリボザイムのような同類の物質の種類を真核細胞内に導入する必然性が多数のトランスフェクション方法の開発をもたらした。真核細胞および特に哺乳動物細胞内へ核酸を導入するために、たとえばＣａＰＯ４共沈法、ＤＥＡＥデキストラン処理法、合成ポリアミン（ポリエチレニミン、ポリリシン、ＰＡＭＡＭデンドリマー）のような多数の処理法、レセプタ仲介の細胞内取込を利用する方法、電気穿孔法、微小衝撃法、微量注入法およびＤＮＡキャリヤとしてのウィルス性キャプシドを利用する方法が知られている。もう１つ別の方法はリポフェクション（Ｐ．Ｌ．Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国７４、７４１３ １９８７年）と呼ばれる。この方法は、合成陽イオン脂質がリポソーム、ミセルの形態でまたはこのような形態として負に帯電したＤＮＡ複合体と共に形成する事実を利用する。発生する複合体が正の正味帯電を帯びるようにＤＮＡおよび陽イオン脂質の量比が調整される場合、これらの複合体は負に帯電した真核細胞の膜表面と高い親和性を有する。このようなＤＮＡ／脂質複合体が細胞に達すると、細胞内への遺伝物質の組入れが生じる。ＤＮＡが細胞内へどのように達するかについて、正確な機構はまだ十分に知られていないが、これは細胞内へのＤＮＡの同時振出時に陰イオン細胞膜と陽イオン脂質の融合を生じるか、またはＤＮＡ／脂質複合体が全体として細胞の自然の輸送機構、いわゆる細胞内取込を介して細胞内へ達し、かつその後でＤＮＡが遊離されるか、そのいずれかである。
【０００３】
リポソームは通常‘二重層構造’を有する水溶液中の脂質の球状の配列であり、かつ典型的には３種類に分類される（ニューヨークアカデミーサイエンス会議：‘リポソームとその生物学および医学への使用’１９７７年１２月）：多層小疱（ＭＬＶ、１００００ｎｍまで）、小さい単層小疱（ＳＵＶ、２０−５０ｎｍ）および大きい単層小疱（ＬＵＶ、６００−３００００ｎｍ）。一連のリポソーム製造方法が知られており、かつ‘リポソーム技術’（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、ＣＦＣプレス、ニューヨーク１９８４年）、‘リポソーム’（Ｏｓｔｒｏ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ、ニューヨーク１９８７年）またはＬｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇらの一覧表論文（生化学分析方法第３３号、３３７−４６２頁、１９８８年）、ＰａｇａｎｏおよびＷｅｉｎｓｔｅｉｎ（生物物理学、生物工学年報、第７号、４３５−６８頁、１９７８年）またはＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ（生物物理学、生物工学年報、第９号、４６７−５０８頁、１９８０年）に記述されている。公知の方法は、たとえば脂質溶液が多孔膜により加圧される‘逆相蒸発’法および押出法がある。
【０００４】
リポソームは典型的に次の方法で製造される：脂質は有機溶剤の中に取込まれる。窒素流のもとでこの溶剤の蒸発によりガラス容器壁に脂質薄膜が作られる。水または水性緩衝剤を添加してこの膜を水和する。得られた溶液は最後に超音波で処理される。
【０００５】
陽イオン脂質は遺伝子治療でますます重要性を獲得している。その際、複合体がキャリヤおよびＤＮＡから皮内、筋内、腹膜内、静脈内、皮下、鼻腔内、脳脊髄洞内または腫瘍に直接投薬され、または体細胞が抽出、導入および再び植付けられることにより、生体内で種々の方法により体細胞が導入される。これに関連する好ましい方法は、つい先頃までウィルス性キャリヤによる遺伝物質の組入れであった。しかしこの方法は病原体ウィルスへ逆突然変異の危険を有する。さらに導入されたＤＮＡは安定して遺伝物質の中に組込まれ、この結果、治療の管理または細胞の回復はその本来の状態ではもはや不可能である。特にウィルス性キャリヤは導入されるＤＮＡに対する制限を有する。修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡはウィルスにより伝染しない。さらに自己分裂する細胞のみがこの方法で感染することができる。
【０００６】
ウィルス性キャリヤ系を適用する際に考慮すべきその他の危険は、腫瘍形成遺伝子の活性化の可能性および処理された有機体の免疫反応である。
陽イオン脂質によるトランスフェクションは逆にこの制限を受けない。トランスフェクションは通常過渡的に経過する。すなわち導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、これが遺伝物質の中に組込まれ、かつヌクレアーゼにより時間と共に分解されるので、極く一定の時間でのみ発現される。この方法により遺伝子治療を処方し、かつ可逆的にすることができる。ＤＮＡの大きさに対する制限は無く、かつ修飾されたＤＮＡまたはＲＮＡ（たとえばアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡまたは修飾されたヌクレオチドの組込みにより安定化されたリボザイム）も陽イオン脂質を利用して細胞内に導入することができる。また、たとえば神経細胞のような自己分裂しない細胞も陽イオン脂質により導入することができる。さらに、これまで生体内での試験ではまったく陽イオン脂質の免疫抗原性の反応は見出されなかった。
【０００７】
微量注入および電気穿孔法の生体内適用が方法上の理由から不可能と受けとめられているのに対し、ＣａＰＯ４-およびＤＥＡＥ法はリポフェクションに比べより悪いトランスフェクション効率を有する。
【０００８】
陽イオン脂質の中には、トランスフェクションに対してポリアミン類（たとえばスペルミン、スペルミジン）とＤＮＡとの間で公知の高い親和性を利用する種類、いわゆるリポポリアミンがある。その際このポリアミンは直鎖または分枝して形成されており、かつエチレン基；プロピレン基；またはアミノ官能基間のブチレン基を含む。ポリアミンは様ざまな方法で脂肪親和性の残基と結合する。
【０００９】
たとえば生理学的ｐＨ値で正に帯電したスペルミンは、多くの場合スペーサを介して、親水性の残基と結合する。スペルミンは、水素橋結合を介してＤＮＡの溝の中に結合することにより、ＤＮＡおよび類似の化合物と共に安定した複合体を形成する。
【００１０】
第１のこのようなリポスペルミン誘導体は、Ｂｅｈｒ，Ｊ．Ｐ．ら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８６、６９８２−６９８６；１９８９；ＥＰ０３９４１１１）により合成された。その際この誘導体は２つの異なる親水性の残基を有するスペーサを介してカルボキシスペルミンと結合した。その際に得られた５-カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（ＤＯＧＳ）の構造：
【化２４】
Figure 0004504559
【００１１】
ＤＯＧＳはトランスフェクタムＴＭ（プロメガ）として市販されている。
第２のＢｅｈｒらにより開発された化合物はジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン-５-カルボキシスペルミルアミド（ＤＰＰＥＳ）である：
【化２５】
Figure 0004504559
【００１２】
もう１つ別のリポスペルミン誘導体は、Ｐ．Ｌ．ＦｅｌｇｎｅｒらによりＷＯ９１１６０２４で名称Ｌ-スペルミン-５-カルボキシル-３-（ＤＬ-１，２-ジオレオイルジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアミン）のもとに請求されている。しかしこの特許公報にはＬ-スペルミン-５-カルボキシル-３-（ＤＬ-１，２-ジパルミトイル-ジメチルアミノプロピル-β-ヒドロキシエチルアミン）が記述されている：
【化２６】
Figure 0004504559
【００１３】
Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．らは、ＷＯ９４０５６２４で化合物Ｎ-［Ｎ-（５-カルボキシスペルミル）アミノエチル］Ｎ，Ｎ-ジメチル-２，３-ビス（９-オクタデセニロキシ）１-プロパンアンモニウム テトラ（トリフルオロアセテート）を記述しており、これはリポフェクタミンＴＭ（ジブコ-ＢＲＬ：ライフテクノロジーインコーポレーテッド）として市販されている。
【化２７】
Figure 0004504559
【００１４】
Ｖｏｎ Ｄｅｒ Ｅｌｔｚらは、ＷＯ９７００２４１に化合物２-（６-カルボキシ-スペルミル）-１，３-ジオレオイロキシ-プロピルアミドを記述しており、これは名称ドスペルのもとに市場に提供された（ベーリンガー マンハイム ゲーエムベーハー）。
【化２８】
Figure 0004504559
【００１５】
上述の化合物は、全て側鎖としてカルボキシ官能基を持つ直鎖ポリアミンのアミドまたはエステル結合を介して、すなわちカルボキシスペルミンから脂肪親和性の残基に製造された。最後により後の出版物は、たとえば直鎖ポリアミンの末端アミノ官能基（直鎖構造）または内部アミノ官能基（‘Ｔ型構造’）へアミドまたはカルバミン酸結合により、直鎖ポリアミンから脂肪親和性の残基へのその他の結合方法も示す。例は刊行物ＤＥ１９６３１８９、ＷＯ９６４０７２６、ＷＯ９６４０７２５、ＷＯ９６１８３７２、ＷＯ９７４６２２３、ＷＯ９８０２１９０およびＷＯ９８０２１９１にみられる。
また分枝したポリアミンが記述された（Ｇ．Ｂｙｋら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、４１、２２４−２３５、１９９８）。
刊行物ＷＯ-Ａ-９７／０３９３９には陽イオン脂質がアミド基で開示されており、この脂質は脂質凝集物で細胞内の巨大分子の導入に適している。
【００１６】
陽イオン脂質を利用したトランスフェクションの分野での大きな進歩にもかかわらず、需要はこのような脂質のより大きな選択にとどまっている。その理由は、今日まですべての細胞タイプを満足する結果を提供する陽イオン脂質が見出されていないことにある。種々の細胞タイプは、自体その膜組成で異なるので、種々の脂質の複合物および種々の脂質タイプが異なる細胞の実効のあるトランスフェクションのために必要とされることは驚くにあたらない。
【００１７】
本来のトランスフェクション工程については今日までまだあまり知られていないので、新たな陽イオン脂質の開発は広範囲に経験的である。従ってこのような脂質の構成にとり注意すべき重要な観点はリポソームまたはミセル類の形成に対する該脂質の物理的性質、形成されたリポソームまたはミセルの性質、導入する標的細胞に対する毒性、さらに脂質の安定性、その代謝性および生体内適用における可能性としなければならない。
【００１８】
従って本発明に基づき解決されるべき課題は、高い実効と可能な限り幅の広い実効多様性とを有する新しい陽イオン脂質を良好な安定性および低毒性との組合せで見出すことであった。本発明では驚くべきことに、特殊の脂肪親和性の残基と頭基としてのポリアミンの組合せが効率および安定性に関し特に良好な性質をもたらすことが見出された。
【化２９】
Figure 0004504559
【００１９】
その際、残基Ｒは飽和または不飽和の直鎖または分枝した、好ましくは１０個〜２０個の炭素原子を含有するアルキル鎖である。
【００２０】
説明として次の仮説を利用することができる。いわゆるＤＮＡ脂質複合体の形成が証明されたことは、成功を収めたトランスフェクションにとって特別重要な定義をもつ。リポソームまたはミセル製剤として使用されるＤＮＡおよび陽イオン脂質が一致する場合、陽イオン脂質のリポソームまたはミセル状の有機体構造の破壊下でＤＮＡの自発的な凝集を生じる。ＤＮＡが前記脂質から成る“二重層構造”を有する多層複合体に植込まれたＤＮＡ脂質複合体が形成される（Ｊ．Ｏ．Ｒａｅｄｌｅｒら、科学、第２７５号、８１０頁、１９９７年）。たとえばスペルミン基がＤＮＡ親和性の頭基として最初に１回ＤＮＡに結合すると、その結果ファンデルワールス力を介して安定した“二重層構造”を形成できるようにするため、アルキル基が可能な限り平行に配向できるようにしなければならないので、残留分子部（親和性の残基）の弾性および対称性が特に重要になる。
【００２１】
これまで提案してきた化合物は通常あまり対称性がないように構成され、これがアルキル残基の平行の配向を困難にし、かつ全てがエステル、エーテル、またはアルキル残基と基本骨格もしくはスペーサとの間にアミド結合を含む。従ってこれらの化合物は指定された結合角度に基づきその弾性において、かつアミド結合の場合（たとえばＧ．Ｂｙｋら、医化学誌、第４１号、２２４−２３５頁、１９９８年、ＥＰ０３９４１１１、ＷＯ９６１８３７２、ＷＯ９７４６２２３、ＷＯ９８０２１９０およびＷＯ９８０２１９１からの化合物の場合）に存在する共振構造に基づき大幅に制限されている。
【００２２】
【化３０】
Figure 0004504559
【００２３】
アミド類の共鳴構造ではＯ原子が負にかつアミド-Ｎ-原子が正に帯電する。アミド結合に参加する原子の平面配列が生じる。カルボニル、炭素および窒素原子間のアミド結合の自由回転は不可能である。この性質は、たとえばまったく特別の方法でタンパク質の構造に影響を及ぼす（第２、第３および第４構造）。そのペプチド結合はアミド結合以外のものではない。剛性の、非弾性のアミド結合が初めてタンパク質にその生物学的に必要な構造を提供する。
【００２４】
本発明に基づく化合物（下記も参照）はアルキル残基Ｒ２およびＲ３を第３窒素原子（アミン）を介して結合する。それにより高い対称性と、自由電子対（疑似回転）の回転（Durchschwingens)の可能性により窒素原子に最大の弾性とが保証される。それにより前記化合物では（ＤＮＡに固定された頭基にもかかわらず）アルキル残基の平行配向と、それにより安定したＤＮＡ脂質複合体を形成するための最適の前提条件がある。この安定性は特にアルキル基のファンデルワールス力が大きく重なり合うことにより生じる。
【００２５】
特に良好な、請求された化合物の性質のためのもう１つ別の説明の可能性は、これらの化合物がＤＮＡ複合体形成に参加していないアルキル残基をもつ塩基性の窒素原子に基づき、生理学的ｐＨ領域内での緩衝能力を有することである。この性質はエンドサイトーシスの方法でエンドソームの浸透圧破壊を促進するため、この結果ＤＮＡがますます良好にサイトソルの中に遊離される（Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒ、遺伝子治療、第３号、１０１０−１０１７頁、１９９６年）。
特に、脂肪親和性の残基Ｒ１に結合している頭基のポリアミンが少なくとも３個の窒素原子を有する本発明に基づく化合物が特に良好な性質を有することが明らかになった。従ってこれらの化合物が特に好ましい。
【００２６】
従って本発明は生物学的な活性分子を真核細胞の中に輸送することのできる一般式Ｉの新リポポリアミンに関する。
【００２７】
式Ｉ：
【化３１】
Figure 0004504559
不斉中心が存在する時にＤ-、Ｌ-またはＤＬ-形態で存在し、その塩を含み、ここでＲ１は次の一般式の脂肪親和性の残基であり：
【化３２】
Figure 0004504559
【００２８】
式中Ｒ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシル、オクタデセニル、または全ての可能な組合せで飽和若しくは不飽和であってもよく、分枝若しくは非分枝又はフッ素化もしくは非フッ素化されていてもよい、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の炭素原子からなる他のアルキル残基であり、
かつＸは次の基の１つであり：
【００２９】
【化３３】
Figure 0004504559
【００３０】
式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
【００３１】
または
式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
【００３２】
または
式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
【００３３】
式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
【００３４】
または
式中ｍ＝１およびｎ＝２であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
【００３５】
または
式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、その際好ましくはＨ原子の最大５０％、特に好ましくはその３０％がＦ原子により置換される。
【００３６】
好ましくはｇ＞１である。好ましい化合物ではｃ＝３および／またはｄ＝３である。特に好ましい化合物ではａ＝０または３および／またはｅ＝０または３および／またはｂ＝０または１および／またはｆ＝０または１である。
【００３７】
その際特に重要なものは次の構造を有する化合物とその塩である：
【化３４】
Figure 0004504559
【００３８】
【化３５】
Figure 0004504559
【００３９】
【化３６】
Figure 0004504559
【００４０】
【化３７】
Figure 0004504559
【００４１】
【化３８】
Figure 0004504559
【００４２】
【化３９】
Figure 0004504559
【００４３】
【化４０】
Figure 0004504559
【００４４】
式中ｈ＝０、１、２、３、４、５または６、ｒ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６、ｌ＝０、１、２、３、４、５または６、およびその際ｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、Ｒ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
【００４５】
その際、批判の余地なく特に重要なものは次の化合物とその塩である：
【化４１】
Figure 0004504559
【００４６】
さらに特に重要なものは、たとえばジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロールまたはコレステリルアミンのようなコリピドを含むまたは含まない本発明に基づく化合物の少なくとも１つを含有する組成物または製剤（リポソームまたはミセル類を含有）である。この組成物または製剤（リポソームまたはミセル類を含有）は通常添加物、担体、佐剤などを含有することができる。
【００４７】
さらに特に重要なものは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド類、ペプトイド類およびタンパク質類のような生物学的に実効のある化合物を組入れるための方法であって、その際本発明に基づく化合物、組成物または製剤が組入れる（生物学的に活性の）化合物と複合体を形成し、かつ発生した複合体が真核細胞と生体内または試験管内で接触させられる。
【００４８】
さらに特に重要なものは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド類、ペプトイド類およびタンパク質類のような生物学的に実効のある化合物を真核細胞の中に生体内または試験管内で組入れるための本発明に基づく化合物、組成物または製剤（薬剤または試薬を製造するため）の使用である。
さらに特に重要なものは、本発明の化合物の作用を補強する、いわゆる‘エンハンサー’と組合せた、ＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド類、ペプトイド類およびタンパク質類のような生物学的に実効のある化合物を真核細胞の中に生体内または試験管内で組入れるための本発明に基づく化合物、組成物または製剤（薬剤または試薬を製造するため）の使用である。
【００４９】
すなわち本発明に基づく脂質は、必要がある場合にスペーサを介して特異の脂肪親和性の残基に結合されたＤＮＡ親和性の頭基としてポリアミンを含有する。本発明に基づく脂質の特別の価値は、非常に良好なトランスフェクション性質と組合せて同時に細胞にとり低毒性で溶液中で安定性があることである。
【００５０】
このように本発明に基づく化合物は、現在まで専門分野で知られている最も実効のあるリポポリアミンから成るトランスフェクション試薬であるリポフェクタミンＴＭ（ジブコＢＲＬ：ライフテクノロジーインコーポレーテッド）に比べ、前記化合物が同一の頭基をもつ場合、より良好なトランスフェクション性質を有することを示すことができた。その際このトランスフェクション効率はそれぞれ血清を含まないおよび血清を含む環境でより高くなるのみならず、トランスフェクション効率の高い水準が本質的により幅の広いＤＮＡ脂質比にわたり達成できることも示している。
【００５１】
本発明に基づく化合物は、ジアミンのアミノ基が必要のある場合塩基の存在中でアルキル化試薬と変換され、かつ他のアミノ基は必要がある場合ＢＯＣ保護されたカルボキシポリアルキルアミンと結合することにより製造できる。その際他のアミノ基は好ましくは第１反応段階で、たとえばカルボキシポリアルキルアミンと変換する前に除去されるＢＯＣ基により保護されている。アルキル化試薬としては臭化ステアリルのような臭化アルキルを使用し、かつ塩基としてたとえばトリエチルアミンまたは４-メチルモルフォリンを使用することができる。
【００５２】
以下、批判の余地なく特に重要な化合物、すなわちＮ-［２,５-ビス［（３-アミノプロピル）アミノ］-１-オキソペンチル］-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンを例にとり対応する合成方法を説明する。
その際アミノ基がＮ-ｔｅｒｔ-ブチルオキシカルボニルで保護（ＢＯＣ保護）されたアルキレンジアミンから出発する。自由アミノ基は、たとえば臭化ステアリルのような臭化アルキルにより塩基の存在中で誘導される。それに続き保護されたアミノ官能基が自体通例の方法で除去され、かつ自体通例の方法で全ての（反応性の）アミノ官能基にＢＯＣ保護されたカルボキシポリアルキルアミン（ここではＢＯＣ保護されたカルボキシスペルミン）に結合される。自体通例の方法で行われる前記頭基の除去後、自由アミンとしてまたはその塩の形態で各処理に応じて所望の化合物が得られる。
【００５３】
【化４２】
Figure 0004504559
【００５４】
もう１つ別の実施態様において必要がある場合にアミノ基に保護されたジアミンがアクリロニトリルと変換され、かつこの生成物が臭化ステアルのようなアルキル化試薬と、必要がある場合塩基の存在中で変換される。次いでこの生成物は水素化することができる。
【００５５】
このようにして、もう１つ別の好ましい化合物、すなわちＮ，Ｎ-ビス（３-アミノプロピル）-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンを製造することができる。この化合物は、Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニルエチレンジアミン（ＢＯＣ-エチレンジアミン）から出発して、アクリロニトリルによる変換と、臭化アルキルによるアルキル化と、それに続く水素化とにより得られる。それに続く段階は洗浄に利用される。
【００５６】
【化４３】
Figure 0004504559
【００５７】
同一分子に対する選択的な方法は、Ｎ-ＢＯＣ-３-ブロムプロピルアミンによるＮ，Ｎ-ジオクタデシルエチレンジアミンのアルキル化である。
【化４４】
Figure 0004504559
【００５８】
専門家に自体公知の適切な温度、時間、化学量論比などのような条件を選択することにより、ポリアミン頭基を延長し、または分枝したポリアミン頭基を作ることができる。その際この頭基を個別的に製造し、かつそれに続き脂肪親和性の残基に結合し、またはすでに分子に結合した頭基を拡大する可能性がある。たとえば次の自体公知の、その他の点で本例にも含まれている反応図式に従って処理することができる：
【００５９】
【化４５】
Figure 0004504559
【００６０】
明示的な例としてアクリロニトリルによるオルニチンの変換に利用するものとする。アクリロニトリルの量および反応温度の適正な選択により所望の生成物を主要量として得ることができる。アミン類とニトリルの水素化およびＢＯＣ保護基によるその保護は、Ｊ．Ｐ．ＢｅｈｒらＰｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、米国第８６号、６９８２−６９８６頁以降、１９８９年により、テトラ-ＢＯＣ-カルボキシスペルミンの合成と同様に実施される。
【００６１】
【化４６】
Figure 0004504559
【００６２】
ポリアミン頭基を延長および分枝するもう１つ別の可能性は、Ｎ-（ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル）-３-ブロムプロピルアミンによるアミン類のアルキル化にある。
【００６３】
【化４７】
Figure 0004504559
【００６４】
一般に、記載された全ての脂質類は前記および下記の例に記載された方法（ＢＯＣ保護基によるアミノ官能基の阻止および除去、臭化アルキルによるアミノ官能基のアルキル化、公知のペプチド化学と同様のアミド結合の結合、アクリロニトリルを経由したアミノ官能基のシアノエチル化、シアノ官能基からアミン類への水素化）により、または有機化学者に信頼されている、一般に周知の方法（アルコールのアルキル化、エステル結合の結合、水酸化アルミニウムリチウムを経由したエステルからエーテルへもしくはアミド類からアミン類への還元）により製造することができる。
【００６５】
２つの最後に挙げたスペーサを含有する化合物の製造に関しては、ＷＯ９８０２１９１の参照を指示する。ここではＢＯＣ保護基を反応させずに、エステルおよびアミドを水酸化アルミニウムリチウムによりどのようにエーテルおよびアミン類に還元できるかが記載されている。この方法により適切な前駆体からこのような化合物が生じる。
【００６６】
本発明に基づく化合物は、このような化合物として水溶液または水性緩衝溶液またはエタノール溶液に適用することができる。ただしリポソーム（またはミセル）も上記脂質単独で、またはたとえばコレステロール、コレステリルアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）またはジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）のような他の脂質と組合せて形成することができる。
【００６７】
本発明に基づく脂質のトランスフェクション効率を向上させるために、リソソーム内の酵素活性を禁止する物質、たとえばクロロキンまたはウィルスから派生したリソソームアトロプ作用のタンパク質のような、いわゆるリソソームアトロプ物質の存在中で細胞を導入する可能性がある。
【００６８】
さらに陽イオン脂質と組合せた、いわゆるエンハンサーを使用する可能性がある。エンハンサーは陽イオン脂質の作用を強化する。その際、それ自体まったく転移性質をもたないエンハンサーがあり、かつ陽イオン脂質なしでもトランスフェクションに使用できるエンハンサーがある。前者の場合は陽イオン脂質のトランスフェクション効率の簡単な強化（増幅）が生ずる。後者の場合は、組合せ適用において個別適用の場合よりも大きいトランスフェクション効率が現われる。従って組合せ効率は相乗効果により生じる。エンハンサーはその作用を通常は転移ＤＮＡの前凝縮により、またはエンハンサーは浸透する細胞膜の浸透性を高める。エンハンサーの例はポリエチレンイミン、トランスフェリン、硫酸プロタミン、ポリヒストン、紡錘遺伝子ペプチド、ウィルス皮膜、ウィルス性表面ペプチド、複製欠陥のあるウィルスなどである。
【００６９】
本発明に基づくリポポリアミンは生理学的ｐＨで正に帯電されており、かつこのため負に帯電した巨大分子、特にＤＮＡおよび同種の物質類により安定した凝集物を形成することができる。リポポリアミンにより被覆および陽性にされた巨大分子は細胞内に巨大分子を導入させる方法で負に帯電した細胞膜と相互作用をする。その際生体内にも試験管内にも適用することができる。
【００７０】
ＤＮＡ結合剤とも呼ばれる（たとえばポリリシンなどの）ポリ陽イオンが標的に向けて特定の細胞の表面レセプタに結合する、いわゆる内部化因子（たとえば特定の糖タンパク質）に結合する標的に合せてレセプタを仲介した細胞内取込（Ｗｕら、化学誌、第２６２号、４４２９−４４３２頁、１９８７年）に比べ、本発明に基づく脂質もしくはそのリポソーム製剤は細胞特異性がない。本発明に基づく脂質もしくはそのリポソーム製剤による標的に合せた供給は、脂質および輸送する生物分子の帯電が調整され、かつ生物分子と脂質間の凝集物に追加して内部化因子が取込まれることにより達成することができる。これはコリピドが頭基としてこのような内部化因子をもつ場合、コリピドによるリポソーム製剤により達成することができる。もう１つ別の可能性は生物分子、脂質および内部化因子から成る中性の帯電に調整された凝集物である。いわゆる内部化因子はトランスフェリン、ガラクトース、マンノース、マンノース-６-ホスフェート、アシアルグリコプロテイン、コンアルブミン、レクチン、トランスコバラミン、α-２-マクログロブリン、ビオチン、葉酸、マンノース化グリコプロテインである。その他の因子はＥＰ０５３５５７６、ＥＰ０５４４２９２、ＷＯ９４２１８０８で取出すものとし、この中に引用して採録されている。内部化因子と同様に細胞特異性の抗体も使用することができる。
【００７１】
本発明に基づく化合物は治療目的に使用することができる。特にこのような化合物は、たとえば嚢胞性線維症、筋ジストロフィ症、フェニルケトン尿症、カエデシロップ病、プロピオン酸血症、メチルマロン酸血症、アデノシンデアミナーゼ欠乏症、高コレステリン血症、血友病およびβ-サラセミアの遺伝子治療に使用することができる。遺伝子治療上の治療方法は、ホルモン、成長因子、細胞毒または免疫調節作用タンパク質が生体内で合成されるべき場合、さらに重要になる。上述の目的のためにＤＮＡ断片はこれらの脂質を利用し、これらのＤＮＡが所望の効果を発揮する細胞内に組入れることができる。この所望の効果は欠乏または欠失したＤＮＡ領域の補充または罹病した細胞タイプ内で疾病を誘発するＤＮＡ領域（たとえばアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ）の禁止剤とすることができる。この方法により抗腫瘍遺伝子を癌治療に使用することができ、またはコレステロール調整遺伝子の導入により心臓および血管疾患の予防に貢献することができる。さらにリボザイムに遺伝暗号を指定するＤＮＡ、またはリボザイム自体を罹病した細胞内に導入することができる。このようなＤＮＡの翻訳は特異の部位でｍ-ＲＮＡを触媒的に分裂させ、かつこの方法で転移を阻止する活性リボザイムを作る。この方法により、たとえばウィルスｍ-ＲＮＡは、他の細胞ｍ-ＲＮＡを交換疼痛させずに特異的に分裂させることができる。ウィルス（たとえばＨＩＶ、ヘルペス、肝炎）の増殖サイクルはこの方法で遮断することができる。
【００７２】
また癌治療でも癌ワクチンを製造するトランスフェクションがますます重要になる役割を演じている。従ってこの分野は本発明に基づく化合物に可能な適用範囲でもある。
もう１つ別の適用は、たとえば免疫遺伝子ペプチドに遺伝暗号を指定するＤＮＡの発現に基づき、人間および動物の体内に作用するような脂質を接種法で見出すことができる。そのために脂質／ＤＮＡ複合体が接種素として使用される。体細胞内へのＤＮＡの導入は免疫遺伝子ペプチドの発現をもたらし、かつそれにより免疫反応が引起こされる。
【００７３】
ＤＮＡを除き、たとえばＰＮＡ、ペプチド、ペプトイドまたはタンパク質のような他の巨大分子も細胞内に導入することができる。この目的のために、これらの巨大分子は本発明に基づくリポポリアミンをそのものとして被覆させることができ、または成分として本発明に基づくリポポリアミンを含有するリポソームに封入または負の正味帯電が存在する場合、表面に吸着させることができる。このような凝集物を細胞と接触させると、細胞壁を通してこれらの分子の輸送が行われる。治療用のペプチドは多数の疾病に好ましい影響を及ぼす。このようなペプチドまたはタンパク質は、たとえばリンフォカイン、インターロイキン、腫瘍壊死因子またはインターフェロン、さらに成長因子、組織プラスミノゲン活性因子、第VIII：ｃ因子、顆粒球マクロファージ刺激因子、赤血球生成促進因子、インスリン、カルシトニン、チミジンキナーゼおよびその他がある。またリシン、ジフテリアトキシンおよびその他のような毒性ペプチドは、治療上この方法で利益をもたらすように使用することができる。ペプトイドは体内での急速な酵素分解を阻止するためのペプチド類似物として成功裡に使用するとができる。
【００７４】
本発明に基づく脂質はその正帯電のため主として負に帯電した分子をその負帯電のために複合体を形成し、かつ細胞内への導入に使用される。しかしいわゆる‘自己集合系’により、初めに負に帯電したリポソームが前記の正に帯電した分子と複合体を形成する正に帯電した分子も輸送することができる。負の正味帯電が残留するようにこの関係を選択すると、この複合体は本発明に基づくリポポリアミンによりそれ自体としてまたは逆に帯電した成分が接触されるリポソームの形態で陽性にすることができる。発生する正に帯電した全複合体は細胞によって吸収される。
【００７５】
陽イオン脂質のためのその他の適用可能性は出版物ＷＯ９０１１０９２、ＷＯ９１１６０２４、ＷＯ９３０３７６８、科学、第２５８号、７４４−７４６頁、１９９２年から取出すことができ、この中に引用して収録されている。
目下治療上有望と見なされている遺伝物質の配列の例は、Ｆ．Ｗ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ、科学、第２５６号、８０８頁、１９９２年の一覧表に読取ることができ、同様にこの中に引用して収録されている。
【００７６】
例
購入先：
１．プラスミド：ｐＣＭＶ＜スポーツ＞β-ガル；ジブコＢＲＬ、ライフテクノロジー
２．β-ガラクトシダーゼ定量キット、ストラタゲーネ
３．テトラ-ＢＯＣ-カルボキシスペルミンは、Ｊ．Ｐ．Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．米国８６、６９８２−６９８６頁以降、（１９８９年）、により合成された。
４．リポフェクタミンＴＭ：ジブコ-ＢＲＬ：ライフテクノロジーインコーポレーテッド
５．Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニルエチレンジアミン、アルドリッヒ
６．Ｏ-（Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブトキシカルボニル）-フェニルグリオキシル-アシッドニトリロキシム（ＢＯＣ-ＯＮ）；アルドリッヒ
７．Ｎ’-（３-ジメチルアミノプロピル）-Ｎ-エチルカルボジイミド メトヨードイド（ＥＤＣ）、アルドリッヒ
８．１-ヒドロキシ-１Ｈ-ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）、アルドリッヒ
９．４-メチルモルフォリン、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、トリエチルアミン、アルドリッヒ。
１０．トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、アルドリッヒ
１１．ダルベッコ修飾イーグル培養液（ＤＭＥＭ）、ジブコ-ＢＲＬ：ライフテクノロジーインコーポレーテッド
１２．胎内凝乳血清（ＦＣＳ）、バイオクロム
１３．ペニシリン、ストレプトマイシン、ＳＩＧＭＡ
【００７７】
例１：トランスフェクション試薬１
Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンの合成
６４６ｍｇ（１．９４ｍｍｏｌ、ＭＧ３３３．４）臭化オクタデシル、１３５ｍｇ（０．８４ｍｍｏｌ、Ｍｇ１６０．２２）Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニルエチレンジアミン（ＢＯＣ-エチレンジアミン）および３３２μｌ（１．９４ｍｍｏｌ、ＭＧ１２９．２５、ｄ０．７５５）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）が１０ｍｌアセトニトリルに溶解され、かつ夜通し還流しながら煮沸される。１００ｍｌエーテルを添加して水で洗浄される。有機相は硫酸マグネシウムで乾燥され、かつ溶剤が引抜かれる。すでに比較的清浄な生成物はフラッシュクロマトグラフィで洗浄される。
【００７８】
Ｃ４３Ｈ８８Ｏ２Ｎ２
ＭＧ６６４．１２
Ｒｆ＝０．４４（９：１ ｖ／ｖクロロホルム／メタノール）
ＭＳ（ＦＡＢ）：６６５．７（Ｍ＋１）
１Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
０．８８（ｔｒ、６Ｈ、ＣＨ３）；１．２６（“ｓ”、６０Ｈ、ＣＨ２）；１．４０（ｍ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２ＣＨ ２）；１．４４（ｓ、９Ｈ、ＣＨ３ＢＯＣ）；２．４０（ｔｒ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；２．５０（ｔｒ、２Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；３．１５（ｍ、２Ｈ、ＯＣＯ-Ｎ-ＣＨ２）
１３Ｃ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
１３．１（ＣＨ３）；２２．７、２７．０、２５．５（ＣＨ２）；２８．５（ＣＨ３ＢＯＣ）；２９．４、２９．６、２９．７、２９．７（ＣＨ２）；５３．２（Ｎ-ＣＨ２）；５４．０（Ｎ-ＣＨ２）；７８．９（ＣｑＢＯＣ）；１５６．１（ＯＣＯ）
収率：３９０ｍｇ（６９％）
【００７９】
Ｎ-［テトラ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル-［（２，５-ビス（３-アミノプロピル）アミノ）-１-オキソペンチル］］-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンの合成
１５７ｍｇ（０．２３６ｍｍｏｌ、ＭＧ６６５．１２）Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンがトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）と塩化メチレンとから成る混合物１：３ｖ／ｖ４ｍｌに入れられる。２−３時間後に回出され、かつ０．５時間高真空で乾燥される。それに続きＤＭＦと塩化メチレンとから成る混合物１：１ｖ／ｖ６ｍｌに入れられ、かつ３００μｌ ４-メチルモルフォリンで置換される。それに続き１５２．６ｍｇ（０．２３６ｍｍｏｌ、ＭＧ６４６．８）テトラ-ＢＯＣ-カルボキシスペルミンがジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）と塩化メチレンとから成る混合物１：１ｖ／ｖ２ｍｌに溶解され、かつ添加される。さらに４５ｍｇ（０．３３０ｍｍｏｌ）１-ヒドロキシ-１Ｈ-ベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）および９８ｍｇ（０．３３０ｍｍｏｌ）Ｎ’-（３-ジメチルアミノプロピル）-Ｎ-エチルカルボジイミド メトヨードイド（ＥＤＣ）が添加され、かつ５０時間室温で攪拌される。この溶剤が回出され、かつ残渣が塩化メチレンに入れられる。その後、水で洗浄され、有機相が硫酸ナトリウムで乾燥され、かつ回出される。粗生成物がフラッシュクロマトグラフィを介して洗浄される。
【００８０】
Ｃ５１Ｈ１３６Ｎ６Ｏ９
ＭＧ９７７．６５
Ｒｆ＝０．４０（９：１ ｖ／ｖ塩化メチレン／メタノール）
１Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
０．８８（ｔｒ、６Ｈ、ＣＨ３）；１．２５（“ｓ”、６４Ｈ、ＣＨ２）；１．４４（ｍ、３６Ｈ、ＣＨ３ＢＯＣ）；１．６７（ｍ、８Ｈ、スペルミン：ＣＨ２ＣＨ ２ＣＨ２）；２．３６（ｍｒ、４Ｈ、ステアリル：Ｎ-ＣＨ２）；２．５１（ｍ、２Ｈ、エチレンジアミン：Ｎ-ＣＨ２）；３．１-３．２５（ｍ、１０Ｈ、ＯＣ-Ｎ-ＣＨ２）
収率：１３５ｍｇ（５９％）
【００８１】
Ｎ-［２，５-ビス（（３-アミノプロピル）アミノ）-１-オキソペンチル］-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレン-ジアミン（ＴＦＡ塩）の合成
７０ｍｇＮ-［テトラ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル-［（２，５-ビス（３-アミノプロピル）アミノ）-１-オキソペンチル］］-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンが塩化メチレンとトリフルオロ酢酸（３：１ｖ／ｖ）とから成る混合物２ｍｌに溶解され、かつ１．５時間室温で攪拌される。その後、回出され、水／ｔｅｒｔ．ブタノール（１：１ｖ／ｖ）から成る混合物１０ｍｌに入れられかつ凍結真空乾燥される。
Ｃ５３Ｈ１０４ＯＮ６（ｘ４ＣＦ３ＣＯＯＨ）
ＭＧ７９３．５２（＋４ｘ１１４＝１２４９．５２）
収率：１００％
【００８２】
例２：トランスフェクション試薬２
Ｎ’，Ｎ’-ビス（２-シアノエチル）-Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニルエチレンジアミンの合成
５００ｍｇ（３．１２ｍｍｏｌ、ＭＧ１６０．２２）Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニルエチレンジアミンが５ｍｌ水に溶解され、かつ０．６５ｍｌ（９．８ｍｍｏｌ、ＭＧ５３．０６）アクリロニトリルが添加される。その後７日間室温で攪拌される。その後、酢酸エステルで層状にされ、振出され、かつ有機相が分離される。硫酸ナトリウムを介して乾燥後、回出される。
Ｃ１３Ｈ２２Ｏ２Ｎ４
ＭＧ２６６．３４
Ｒｆ＝０．６９（９：１ ｖ／ｖクロロホルム／エタノール）
収率：６６０ｍｇ（８０％）
【００８３】
Ｎ’，Ｎ’-ビス（２-シアノエチル）-Ｎ，Ｎ-ジオクタデシルエチレンジアミンの合成
６６０ｍｇ（２．４８ｍｍｏｌ、ＭＧ２６６．３４）Ｎ’，Ｎ’-ビス（２-シアノエチル）-Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニルエチレンジアミンがトリフルオロ酢酸と塩化メチレンとから成る混合物１：３ｖ／ｖ１０ｍｌに入れられる。２−３時間後に回出され、かつ０．５時間高真空で乾燥される。その後、ブタノール／水（１：１ｖ／ｖ）から凍結真空乾燥される。得られたトリフルオロ酢酸は、２．４３ｇ（７．２８ｍｍｏｌ、ＭＧ３３３．４）臭化オクタデシルおよび２．２３ｍｌ（１．６８ｇ、１３．０２ｍｌ、ＭＧ１２９．２５、ｄ０．７５５）ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と共に乾燥したアセトニトリル４０ｍｌに溶解され、かつ２４時間還流しながら煮沸される。粗生成物がフラッシュクロマトグラフィを介して洗浄される。
Ｃ４４Ｈ３６Ｎ４
ＭＧ６７１．１６
Ｒｆ＝０．４２（９：１ ｖ／ｖ塩化メチレン／メタノール）
１Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣＬ３）：
０．８８（ｔｒ、６Ｈ、ＣＨ３）；１．２６（“ｓ”、６０Ｈ、ＣＨ２）；１．４２（ｍ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２ＣＨ ２）２．４２（ｍ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；２．４８（ｔｒ、４Ｈ、ＣＨ２-ＣＮ）；２．５０（ｍ、２Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；２．５０（ｍ、２Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；２．９２（ｔｒ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）
収率：３３０ｍｇ（２０％）
【００８４】
Ｎ’，Ｎ’-ビス（３-アミノプロピル）-Ｎ，Ｎ-ジオクタデシルエチレンジアミン（ＴＦＡ塩）の合成
２．５ｇレイニーニッケルが２０ｍｌ水に添加される。これに、攪拌しながら、水がちょうど沸騰しすぎず、かつそれに続き３０分間攪拌されるように、４．５ｇ水酸化ナトリウムが素早く添加される。３２０ｍｇ（０．４８ｍｍｏｌ、ＭＧ６７１．２）Ｎ’，Ｎ’-ビス-（２-シアノエチル）-Ｎ，Ｎ-ジオクタデシルエチレンジアミンが０．５Ｍ水酸化カリウム溶液（ＥｔＯＨ／水９５：５ｖ／ｖ）５００ｍｌに入れられる。活性化されたレイニーニッケルが上澄みから傾瀉により分離され、かつ抽出溶液に加えられる。その後２４時間水素化装置で水素化される。この溶剤を回転させた後、残渣が塩化メチレン５ｍｌに溶解される。これに５００ｍｇ（２．０２ｍｍｏｌ、ＭＧ２４６．２７）Ｏ-（ｔｅｒｔ．-ブトキシカルボニル）-フェニルグリオキシル-アシッドニトリロキシム（ＢＯＣ-ＯＮ）が添加され、かつ室温で２４時間攪拌される。その後回転される。粗生成物がフラッシュクロマトグラフィを介して洗浄される。その後この生成物がトリフルオロ酢酸と塩化メチレンとから成る混合物１：３ｖ／ｖ１０ｍｌに入れられる。２−３時間後に回出され、かつ０．５時間高真空で乾燥される。最後にブタノール／水（１：１ｖ／ｖ）から凍結真空乾燥される。
Ｃ４４Ｈ９４Ｎ４ｘ４ＣＦ３ＣＯＯＨ
ＭＧ６７９．２１（＋４ｘ１１４＝１１３５．２１）
ＭＳ（ＥＳＩ）：６８０．２
収率：２５０ｍｇ（ニトリルに対して５８％）
【００８５】
例３：分枝した頭基：
Ｎ-（ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル）-３-ブロムプロピルアミンの合成
５００ｍｇ（２．２８ｍｍｏｌ；ＭＧ２１８．９４）３-ブロム-１-プロピルアミン ヒドロブロミド（アルドリッヒ）が１．１３（４．５９ｍｍｏｌ；ＭＧ２４６．２７）Ｏ-（ｔｅｒｔ．-ブトキシカルボニル）-フェニルグリオキシル-アシッドニトリロキシム（ＢＯＣ-ＯＮ）および０．６５ｍｌ（０．４６ｇ；４．６ｍｍｏｌ）トリエチルアミンと共にアセトンと水（１：１、ｖ／ｖ）とから成る混合物に溶解される。２時間攪拌後、濃縮され、かつ塩化メチレンに入れられる。この有機相が水で洗浄され、硫酸ナトリウムで乾燥され、かつ回転される。粗生成物がフラッシュクロマトグラフィを介して洗浄される。
Ｃ８Ｈ１６Ｏ２ＮＢｒ
ＭＧ２３８．３１
Ｒｆ＝０．８４（９：１ ｖ／ｖ塩化メチレン／メタノール）
１Ｈ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
１．３６（ｂｒ ｓ、９Ｈ、ＣＨ３ＢＯＣ）；１．９８（ｍ、２Ｈ、Ｃ-ＣＨ２-Ｃ）；３．１９（ｍ、２Ｈ、Ｂｒ-ＣＨ ２）；３．３８（ｍ、２Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；４．９０（ｂｒ ｓ、１Ｈ、Ｎ-Ｈ）
１３Ｃ-ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
２８．２（ＣＨ３）；３０．６、３２．６、３８．８（ＣＨ２）；７９．１（Ｃｑ）；１５５．８（Ｃ＝Ｏ）
収率：２５０ｍｇ（４６％）
【００８６】
Ｎ’，Ｎ’-ビス（３-アミノプロピル）-Ｎ，Ｎ-ジオクタデシルエチレンジアミン（ＴＦＡ塩）の合成
２００ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ、ＭＧ６６５．１２）Ｎ-ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレンジアミンがトリフルオロ酢酸と塩化メチレン（１：３ｖ／ｖ）とから成る混合物２ｍｌに溶解される。２時間後、回出され、かつ２時間高真空で乾燥される。その後２０ｍｌクロロホルムに入れられ、かつ１ｍｌ（９２０ｍｇ、４．５ｍｍｏｌ、ＭＧ１０１．１５、ｄ＝０．９２）４-メチルモルフォリンが添加される。それに続き６４０ｍｇ（２．６８ｍｍｏｌ、ＭＧ２３８．１３）Ｎ-（ｔｅｒｔ．-ブチルオキシカルボニル-３-ブロムプロピルアミンが添加される。４８時間の煮沸後に還流しながら回転され、ＢＯＣ-保護された前駆体生成物がフラッシュクロマトグラフィを介して洗浄される。それに続きトリフルオロ酢酸と塩化メチレン（１：３ｖ／ｖ）とから成る混合物２ｍｌに溶解され、回転され、かつ凍結真空乾燥される。
Ｃ４４Ｈ９４Ｎ４ｘ４ＣＦ３ＣＯＯＨ
ＭＧ６７９．２１（＋４ｘ１１４＝１１３５．２１）
ＭＳ（ＥＳＩ）：６８０．２
収率：４６ｍｇ（１３％）
【００８７】
Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-トリス（シアノエチル）-オルニチンの合成
９５０ｍｇ水酸化ナトリウムが２０ｍｌ水に溶解される。苛性ソーダ溶液に２ｇ（１１．８６ｍｍｏｌ、ＭＧ１６８．６２）オルニチン塩酸塩が溶解される。その後３ｍｌ（４５．５７ｍｍｏｌ）アクリロニトリルが滴下され、かつ２４時間室温で攪拌される。１．７ｍｌ２５％塩酸の添加後、固形物が沈殿する。これが冷却後に吸引濾過される。
Ｃ１４Ｈ２１Ｏ２Ｎ５ｘＨＣｌ
ＭＧ３２７．８２
Ｒｆ＝０．７１（１：１：１ ｖ／ｖ／ｖイソプロパノール／エタノール／水）１Ｈ-ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：
１．５８（ｍ、２Ｈ、ＣＨ ２-ＣＨＯｍ）；１．９０（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｏｍ）；２．６１（ｍ、６Ｈ、ＮＣ-ＣＨ ２）；２．８６（ｔｒ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；２．９８（ｔｒ、２Ｈ、Ｎ-ＣＨ２-ＣＨ ２）；３．３９（ｔｒ、２Ｈ、、Ｎ-ＣＨ２）；３６８（ｔｒ、１Ｈ、ＣＨＯｍ）
収率：２．１ｇ（５４％）
【００８８】
Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’-テトラ（シアノエチル）-オルニチンの合成
９８０ｍｇ水酸化ナトリウムが２０ｍｌ水に溶解される。苛性ソーダ溶液に２ｇ（１１．８６ｍｍｏｌ、ＭＧ１６８．６２）オルニチン塩酸塩が溶解される。その後３．９ｍｌ（５９．３ｍｍｏｌ）アクリロニトリルが滴下され、８日間室温で攪拌される。その後もう一度３ｍｌアクリロニトリルが滴下され、さらに６時間攪拌される。１．７ｍｌ２５％塩酸の添加後、生成物は３回酢酸エステルで振出される。有機相が硫酸ナトリウムを介して乾燥され、かつ回転される。
Ｃ１７Ｈ２４Ｏ２Ｎ６ｘＨＣｌ
ＭＧ３４４．４１８２
Ｒｆ＝０．８４（１：１：１ ｖ／ｖ／ｖイソプロパノール／エタノール／水）１Ｈ-ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）：
１．６０（ｍ、２Ｈ、ＣＨ ２-ＣＨＯｍ）；１．９２（ｍ、２Ｈ、ＣＨ２Ｏｍ）；２．５２（ｍ、８Ｈ、ＮＣ-ＣＨ ２）；２．６１（ｔｒ、４Ｈ、ＣＨ２Ｏｍ）；２．８７（ｔｒ、４Ｈ、、Ｎ-ＣＨ２）；３．０３（ｔｒ、４Ｈ、Ｎ-ＣＨ２）；３．３８（ｍ、１Ｈ、ＣＨＯｍ）
収率：２．４ｇ（５９％）
【００８９】
例４：
リポソーム／ミセル製剤
ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロールまたはコレステリルアミンが有機溶剤（たとえばクロロホルム）に溶解される。例１からの脂質がそれ自体としてまたは塩の形態で、たとえばトリフルオロ酢酸塩の形態で有機溶剤（たとえばクロロホルム）の中に溶解される。異なる溶液を種々の量で組合せることにより、コリピドと触媒脂質とから成る種々の組成物が製造される。ガラスフラスコの中に回転蒸発器を利用して脂質薄膜が作られる。この薄膜が高真空中で溶剤残基から遊離される。この薄膜は溶液１ｍｌあたり脂質２ｍｇの濃度になるまで水または水性緩衝剤で水素化される。その後、冷却しながら超音波（３ｘ１５分）で処理される。この製剤がフィルタ（孔径０．２μｍ）に殺菌濾過される。
【００９０】
例５：
脂質溶液
脂質がそれ自体としておよびコリピドを含有するまたは含有しないＴＦＡ塩の形態でエタノールに溶解される。水と混合することにより異なる組成の溶液が得られる。
【００９１】
例６：
細胞培養
細胞株ＣＶ−１、ヘラＳ３およびＮＩＨ３Ｔ３が１０％胎内凝乳血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ-グルタミン（Ｇｌｕ）、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００Ｕ／ｍｌ ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシンを含有する‘ダルベッコ修飾イーグル培養液’（ＤＭＥＭ）で培養器（５％ＣＯ２-雰囲気）の中で培養される。
【００９２】
例７：
トランスフェクション
細胞が密度１〜１．５ｘ１０５を有する１２-ウェル-微量滴定プレート上で滴出され、かつ夜通し約６０〜８０％の合流に培養される。細胞を‘ウェル’に転移させるために、１．５μｇのｐＣＭＶ＜スポーツ＞β-ガルが５０μｌ血清および抗生物質を含有しないＤＭＥＭに溶解される。エタノール溶液またはリポソーム製剤としての陽イオン脂質（たとえば３、６、９、１２μｌ）が同様に５０μｌ血清および抗生物質を含有しないＤＭＥＭに溶解される。この両方の溶液がポリスチレン容器の中で混合され、かつ脂質／ＤＮＡ複合体の形成を可能にするため、１０〜１５分間放置される。
【００９３】
その間に細胞が一度ＰＢＳ（リン酸緩衝サリン）で洗浄される。それぞれ所望の条件（血清を含有しないまたは血清を含有する環境でのトランスフェクション）に応じて、０．４ｍｌの抗生物質を含有しないＤＭＥＭが血清と一緒にまたはなしで細胞に供与される。ＤＮＡ／脂質複合体が直接細胞に供与され、かつ孵化器で６時間培養される。このため培養液が１０％血清の最終濃度を有するように、血清および抗生物質を含有するＤＭＥＭが１ｍｌまで充填される。この細胞がさらに２０時間培養される。その後、β-ガラクトシダーゼ定量キットのメーカのデータに従ってβ-ガラクトシダーゼが試験される。開発されたＯ-ニトロフェノールが光度計測により４０５ｎｍで測定される。
【００９４】
結果
下表および以下の棒グラフはヘラＳ３細胞の例を比較したトランスフェクション効率を示す。
トランスフェクション試薬１：
Ｎ-［２，５-ビス（（３-アミノプロピル）アミノ）-１-オキソペンチル］-Ｎ’，Ｎ’-ジオクタデシルエチレン-ジアミン（ＴＦＡ塩）がリポソーム製剤として２５Ｍｏｌ％ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンで水性滅菌溶液の中に使用された。
全脂質量：２ｍｇ／ｍｌ。
【００９５】
トランスフェクション試薬２：
Ｎ’，Ｎ’-ビス-（３-アミノプロピル）Ｎ，Ｎ-ジオクタデシルエチレン-ジアミン（ＴＦＡ塩）がリポソーム製剤として５０Ｍｏｌ％ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンで水性滅菌溶液の中に使用された。全脂質量：２ｍｇ／ｍｌ。
【００９６】
トランスフェクション試薬３：
リポフェクタミンＴＭ（ジブコ-ＢＲＬ：ライフテクノロジーインコーポレーテッド）がメーカから得られた。
【００９７】
吸着値４０５ｎｍの場合：
【表１】
Figure 0004504559
【００９８】
【表２】
Figure 0004504559

Claims (17)

  1. 一般式Ｉの化合物またはその塩：
    式Ｉ：
    Figure 0004504559
     不斉中心が存在する時にＤ-、Ｌ-またはＤＬ-形態で存在し、ここでＲ１は次の一般式の脂肪親和性の残基であり：
    Figure 0004504559
     式中Ｒ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシル、オクタデセニルであるか、又は飽和若しくは不飽和であってもよく、分枝若しくは非分枝又はフッ素化若しくは非フッ素化されていてもよい、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の炭素原子からなる他のアルキル残基であり、
    かつＸは次の基の１つであり：
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｈ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｈ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｈ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｈ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｈ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｈ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｒ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｒ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｒ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｒ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｒ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｒ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｋ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６、ｔ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または 式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６およびｌ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０かつｎ＝０であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝１であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝２かつｎ＝２であり、この場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    Figure 0004504559
     式中ｍ＝０およびｎ＝０であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０およびｎ＝１であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝０およびｎ＝２であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    または
    式中ｍ＝１およびｎ＝１であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝１およびｎ＝２であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、または
    式中ｍ＝２およびｎ＝２であり、かつこの場合にはｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８、ａ＝０、１、２、３、４、５または６、ｂ＝０、１、２、３、４、５または６、ｃ＝０、１、２、３、４、５または６、ｄ＝０、１、２、３、４、５または６、ｅ＝０、１、２、３、４、５または６、ｆ＝０、１、２、３、４、５または６とすることができ、
    ただし、上記の全ての場合において、ａ＝０のとき、ｂは１より小さいか、もしくは１と等しく、ｅ＝０のとき、ｆは１より小さいか、もしくは１と等しく、かつａ＝ｂ＝ｃ＝ｄ＝ｅ＝ｆ＝０の場合が除外される。
  2. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｇ＝５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  3. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｈ＝０、１、２、３、４、５または６およびｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  4. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｒ＝０、１、２、３、４、５または６およびｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  5. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｋ＝１、２、３、４、５または６およびｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  6. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｔ＝１、２、３、４、５または６およびｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  7. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  8. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  9. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｌ＝０、１、２、３、４、５または６およびｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  10. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  11. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
     式中ｇ＝１、２、３、４、５、６、７または８とすることができ、かつＲ２およびＲ３が互いに独立してドデシル、ドデセニル、テトラデシル、テトラデセニル、ヘキサデシル、ヘキサデセニル、オクタデシルまたはオクタデセニルとすることができる。
  12. 次の構造を有する請求項１に記載の化合物またはその塩：
    Figure 0004504559
  13. ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジオレオイルホスファチジルコリン、コレステロールまたはコレステリルアミンからなる群から選択されるコリピドを含むまたは含まない、請求項１−１２のいずれかに記載の化合物またはその塩の少なくとも１つを含有する組成物。
  14. 請求項１ないし１２のいずれか１項記載の少なくとも１つの化合物もしくはその塩または請求項１３記載の組成物を含有する医学的または診断的な組成物。
  15. 請求項１−１２のいずれか１項記載の化合物またはその塩が組入れる化合物と複合体を形成し、かつ発生した複合体が真核細胞と試験管内で接触させられるＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド類、ペプトイド類およびタンパク質類からなる群から選択される生物学的に実効のある化合物を真核細胞内に組入れる方法。
  16. 生体内または試験管内でＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスＤＮＡ、ＰＮＡ、ペプチド類、ペプトイド類およびタンパク質類からなる群から選択される、生物学的に実効のある化合物を真核細胞内に組入れるための薬剤または試薬を製造するための請求項１−１２のいずれか１項記載の化合物もしくはその塩または請求項１３もくしは１４記載の組成物の使用。
  17. 請求項１−１２のいずれか１項記載の化合物またはその塩がエンハンサーと組合せて使用される請求項１６記載の使用。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU768542C (en) 1998-04-08 2004-06-17 Celltech R & D Limited Lipids
US6852334B1 (en) * 1999-04-20 2005-02-08 The University Of British Columbia Cationic peg-lipids and methods of use
EP1187807B1 (en) * 1999-04-26 2007-07-25 Celltech R&D Limited Bipolar lipids and their use for the delivery of bioactive substances
EP1237581A1 (en) * 1999-12-17 2002-09-11 Gene Therapy Systems, Inc. Use of cationic lipids for intracellular protein delivery
US7189705B2 (en) 2000-04-20 2007-03-13 The University Of British Columbia Methods of enhancing SPLP-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
US7294511B2 (en) * 2001-03-22 2007-11-13 Chromos Molecular Systems, Inc. Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof
US7001925B1 (en) 2002-09-27 2006-02-21 University Of Central Florida Research Foundation, Inc. Compounds and method for enhancing the efficacy of anti-cancer drugs
US7906122B2 (en) * 2003-06-18 2011-03-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jersusalem Sphingoid polyalkylamine conjugates for Hepatitis B virus vaccination
JP4782675B2 (ja) * 2003-06-18 2011-09-28 イッスム・リサーチ・ディベロップメント・カンパニー・オブ・ザ・ヘブルー・ユニバーシティ・オブ・エルサレム ワクチン接種用スフィンゴイドポリアルキルアミン抱合体
US20110045001A1 (en) * 2008-03-28 2011-02-24 Biontex Laboratories Gmbh Transfection results of non-viral gene delivery systems by influencing of the innate immune system
WO2013016058A1 (en) * 2011-07-22 2013-01-31 Merck Sharp & Dohme Corp. Novel bis-nitrogen containing cationic lipids for oligonucleotide delivery
WO2016075154A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Ethris Gmbh Induction of osteogenesis by delivering bmp encoding rna
BR112021014528A2 (pt) 2019-02-14 2021-10-13 Ethris Gmbh Composição farmacêutica, e, método para analisar o efeito de um polirribonucleotídeo na ciliogênese
EP4240396B1 (en) 2020-11-04 2025-01-01 Ethris GmbH Ifn-lambda mrna for treating viral infections
WO2024121160A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Ethris Gmbh Regulator(s) of energy homeostasis-encoding rna molecule(s) with increased translation efficiency

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE1963189A1 (de) 1969-12-17 1971-06-24 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von flammfesten,Urethangruppen aufweisenden Schaumstoffen
US4339767A (en) 1980-05-05 1982-07-13 International Business Machines Corporation High performance PNP and NPN transistor structure
CA2049287C (en) 1989-03-21 2005-03-29 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
FR2645866B1 (fr) * 1989-04-17 1991-07-05 Centre Nat Rech Scient Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi
US5538722A (en) 1989-06-13 1996-07-23 Stanford University Isolation, growth, differentiation and genetic engineering of human muscle cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
IL103059A0 (en) 1991-09-30 1993-02-21 Boehringer Ingelheim Int Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
DE4139001A1 (de) 1991-11-27 1993-06-03 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur einschleusung von nukleinsaeuren in zellen
US5972600A (en) 1992-04-03 1999-10-26 The Regents Of The University Of California Separation of active complexes
US5334761A (en) * 1992-08-28 1994-08-02 Life Technologies, Inc. Cationic lipids
GB9218762D0 (en) 1992-09-04 1992-10-21 Exxon Chemical Patents Inc Esters
CA2158655A1 (en) 1993-03-19 1994-09-29 Max L. Birnstiel Process for preparing cancer vaccines
US5777153A (en) 1994-07-08 1998-07-07 Gilead Sciences, Inc. Cationic lipids
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5939401A (en) 1994-12-09 1999-08-17 Genzyme Corporation Cationic amphiphile compositions for intracellular delivery of therapeutic molecules
US5650096A (en) * 1994-12-09 1997-07-22 Genzyme Corporation Cationic amphiphiles for intracellular delivery of therapeutic molecules
CA2223088A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Bob Dale Brown Novel carbamate-based cationic lipids
CA2223179A1 (en) 1995-06-07 1996-12-19 Bob Dale Brown Phosphonic acid-based cationic lipids
JP2001516329A (ja) 1995-06-07 2001-09-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア ポリヌクレオチド複合体の安定化
US5811406A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Regents Of The University Of California Dry powder formulations of polynucleotide complexes
DE19521412A1 (de) 1995-06-14 1996-12-19 Boehringer Mannheim Gmbh Neue kationische und polykationische Amphiphile, diese enthaltende Reagenzien und deren Verwendung
CA2227373A1 (en) 1995-07-21 1997-02-06 Promega Biosciences, Inc. Novel amide-based cationic lipids
DE19607686A1 (de) 1996-02-29 1997-09-04 Chemicon Lab Gmbh Neue metabolisierbare Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung
US5747509A (en) 1996-06-03 1998-05-05 Schering Aktiengesellschaft Method for lowering plasma levels of lipoprotein(a)

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