JP4755496B2 - ヒアルロン酸修飾物、及びそれを用いた薬物担体 - Google Patents

Description

本発明は、新規なヒアルロン酸修飾物、それを用いた薬物担体に関する。

薬物の徐放、ターゲッティング、血中滞留性延長（ステルス効果）等、薬物の体内動態制御を目的として様々な高分子の利用が検討されている。これらの中で、体内で分解する生分解性高分子は、体内に導入後に取り除く必要が無いため、多く用いられている。実用化された生分解性高分子として良く知られたものに、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を始めとしたこれらの共重合体等がある。これらは共重合比、分子量等で分解速度を制御でき、疎水性薬物の担体に適したものであるが、インジェクタブル（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）な微粒子（マイクロスフィアまたはナノスフィアなど）にした際に、疎水性であるため水溶液中で凝集しやすく、投与液中での、あるいは、投与後の体内での分散性に問題がある。また、皮下で炎症、組織の黒変化を起こすなど、生体適合性の問題もある。

変形性関節症、慢性関節リウマチ等の関節疾患においては、滑膜炎の発生が伴い、これが痛みの原因になっていることが多い。このため、ステロイドや非ステロイド系抗炎症剤等の薬物を経口、あるいは関節腔内に直接注入する治療方法も試みられているが、関節腔内のクリアランスは早く（非特許文献１および非特許文献２を参照）、１回の投与で有効薬効濃度を持続させ、炎症を長期間抑制することは難しい。そこで、抗炎症剤等の薬物を基材に封入することで徐放する試みが種々報告されている。例えば、リポソーム（非特許文献３および非特許文献４を参照。）、アルブミンマイクロスフィア（非特許文献５を参照。）、ゼラチン／コンドロイチン硫酸マイクロスフィア（非特許文献６を参照）、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）マイクロスフィア（非特許文献７を参照）に関しての報告がなされている。

しかしながら、こうした基材そのものに起因する痛み（Ｃｒｙｓｔａｌ−Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐａｉｎ）が引き起こされることも知られている（非特許文献８を参照）。この痛みの原因は分かっていないが、マイクロスフィアのサイズ、生体適合性が関係していると思われる。サイズを小さくしたＰＬＧＡナノスフィアを用いた報告もある（非特許文献９を参照。）が、生体適合性の問題は解決されていない。

多糖類、コラーゲン、ゼラチン等の生体由来の高分子を用いた薬物担体も数多く報告されているが、親水性素材であるため疎水性薬物の担持には適さず、封入効率、徐放期間の点でＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＣＬ、ＰＬＧＡ等には劣る。例えば、デキストランとＰＬＡとを結合させた化合物を用いたナノスフィアの報告もある（非特許文献１０および非特許文献１１を参照）が、ＰＬＡはデキストランとエステル結合しているため、体内での結合部の加水分解は早く（１日程度）、また、デキストランベースの素材であることから、薬物のターゲッティング、徐放の目的には適さない。

一方、ヒアルロン酸（ＨＡ）は、１９３４年、Ｋ．Ｍｅｙｅｒによって牛の眼の硝子体から単離された生体材料（多糖）であり、細胞外マトリックスの主成分として古くから知られている。ＨＡは、Ｄ−グルクロン酸とＮ−アセチルグルコサミンとがβ（１→３）グリコシド結合により連結された二糖単位から成るグルコサミドグリカンの一種である。ＨＡは、その化学的、物理的構造に種差が無く、ヒトも代謝系を持っており、免疫性、毒性といった面でも最も安全な生体材料（Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌ）である。例えば、ＨＡは関節液の主成分の１つであり、その粘弾性効果や炎症抑制効果により関節において鎮痛効果を発揮する。実際に、ＨＡを主成分とした薬物が、変形性関節症、慢性関節リウマチ等の関節症治療薬として既に上市され用いられている（例えば、スベニール（商品名）：製造販売 中外製薬株式会社）。

ＨＡもしくはその誘導体からなるハイドロゲル、マイクロスフィア等を薬物徐放に適用した報告も数多くある（例えば、非特許文献１２、非特許文献１３、特許文献１、特許文献２、特許文献３および特許文献４を参照）が、薬物放出期間は長くても数日以下であり、未だ実用化の域には至っていない。

ＨＡと生分解性高分子を組み合わせたＨＡ修飾物としては、ＨＡにＰＬＧＡをコートしたフィルム（特許文献５を参照）、ＰＬＧＡマイクロスフィアとＨＡを混合した注射剤（特許文献６を参照）、ＰＬＧＡマイクロスフィアをＨＡハイドロゲル中に分散させたタンパク質徐放製剤（特許文献７を参照）、カチオン性界面活性剤を用いたポリカプロラクトン（ＰＣＬ）の静電相互作用によるＨＡコートナノスフィア、ＨＡをポリＬ−リジン側鎖に結合させたＨＡ−ＰＬＬ（非特許文献１４を参照）等のバイオマテリアル、薬物徐放製剤も報告されている。

また、多糖と、ＰＬＡ、ＰＧＡ、ＰＣＬ、ＰＬＧＡ等の生分解性ポリマーとをグラフト結合させた多糖誘導体、およびこの多糖誘導体を用いた微粒子も報告されており、この中で多糖としてＨＡを用いた例も開示されている（特許文献８を参照）が、具体的にはＨＡにＰＣＬがエステル結合したものを合成したことが示されているのみであり、得られたＨＡ誘導体の機能については何ら示されていない。

以上のとおり、安全性、生分解性、体内安定性の全てに優れる、ＨＡとＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡとをグラフト結合したＨＡ修飾物は具体的には知られておらず、その調製方法も知られていなかった。また、従来の薬物担体には、薬物（特に低分子薬物）の封入効率、その徐放期間、水溶液中での分散性、血中滞留性期間、或いは安全性（生体内で炎症が起きる等）に問題があった。更に、粒子間の凝集の少ないインジェクタブルな微粒子からなる生体適合性に優れた薬物担体も知られていなかった。
国際公開公報ＷＯ９８／４３６６４ 国際公開公報ＷＯ００／７８３５６ 特表平１１−５１３０４７号公報 特表平２００３−５２５２３２号公報 特開平８−２０８７０６号公報 国際公開公報ＷＯ０１／２８５９１ 国際公開公報ＷＯ９７／１３５０２ 国際公開公報ＷＯ０１／８８０１９ Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．ＰＨＡｒｍａｃｏｌ．４２，３０１−３０５（１９９２） Ｃｌｉｎ．ＰＨＡｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．３９，３１３−３１７（１９８６） Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１５８，４７３−４７６（１９７６） Ｊ．ＰＨＡｒｍ．ＰＨＡｒｍａｃｏ．４５，５７６−５７８（１９９３） Ｉｎｔ．Ｊ．ＰＨＡｒｍｃｏｌ．３９，１２９−１３６（１９８７） Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｍ．４１，２１．８５−２１９５（１９９８） Ｉｎｔ．Ｊ．ＰＨＡｒｍ．１９５，１７９−１８８（２０００） Ｊ．Ｊｏｉｎｔ Ｓｕｒｇｅｒｙ １１，８７−９５（１９９２） ＰＨＡｒｍ．Ｒｅｓ．１９，４０３−４１０（２００２） Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．５０，５５７−５６５（２０００） ＰＨＡｒｍ．Ｒｅｓ．２０，１２８４−１２９２（２００３） Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．Ｉｎｄ．ＰＨＡｒｍ．２５（１），１５−２０（１９９９） Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．ＰＨＡｒｍ．８７，２１−２９（１９９２） Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．９，４７６−４８１（１９９８）

解決しようとする課題は、従来の薬物担体の問題点を解消した、低分子薬物を効率良く封入し、長期に徐放期間を制御でき、血中滞留性の制御が可能であり、水溶液中での分散性が良く、安全性に問題の無い薬物担体を提供することにある。また、同様に従来の薬物担体の問題点を解消した、粒子間の凝集の少ないインジェクタブルな微粒子からなる生体適合性に優れた薬物担体を提供することにもある。

本発明者は、かかる課題を解決する為に鋭意研究を進めたところ、ヒアルロン酸またはその誘導体と、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択されるポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物が、低分子薬物を効率良く封入し、長期に徐放期間を制御でき、水溶液中での分散性が良く、安全性に問題の無い薬物担体となることを見出し、また、該ヒアルロン酸修飾物が粒子間の凝集の少ないインジェクタブルな微粒子を形成し、生体適合性に優れた薬物担体となることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の１つの側面によれば、ヒアルロン酸またはその誘導体と、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物が提供される。本発明の１つの実施態様において、前記ポリマーは、ヒアルロン酸またはその誘導体の側鎖としてグラフト結合していてもよい。また別の実施態様において、前記ポリマーの大部分またはすべてが、その片末端のみでヒアルロン酸またはその誘導体に結合していてもよい。また本発明の別の実施態様において、前記ポリマーは、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基に結合していてもよい。またさらに別の実施態様において、前記ポリマーは、スペーサーを介して、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基にアミド結合で結合していてもよい。

また、前記ポリマーは、スペーサーを介して、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基にアミド結合で結合していてもよい。

本発明の他の側面によれば、式（Ｉ）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル基およびＣ_１−６アルキルカルボニル基から選択され、
ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ_１−６アルキル基から選択され、
Ｑは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および乳酸・グリコール酸共重合体から選択されるポリマーであり、該ポリマーは末端のカルボキシル基で窒素原子とアミド結合を形成しており、
Ａは、単結合、−（ＣＨ_２）_ｍ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｍ−または−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−であり、
ｍは１〜１０の整数であり、ｎは０〜１０の整数である）
で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、ヒアルロン酸修飾物が提供される。ここで、Ｃ_１−６アルキル基とは、炭素数１〜６の直鎖または分枝鎖アルキル基のことであり、具体的にはメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルなどを含む。Ｃ_１−６アルキルカルボニル基とは、前記Ｃ_１−６アルキル基を分子内に有するアルキルカルボニル基であり、具体的にはアセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基などが含まれる。本発明の一つの実施態様において、ＲａおよびＲｂは共に水素原子であり、Ａは−（ＣＨ_２）_ｍ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｍ−または−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−である。

本発明の別の側面によれば、前記スペーサーが独立に置換されていてもよい２以上のアミノ基を有し、前記ポリマーの末端のカルボキシル基が前記スペーサーの１つのアミノ基とアミド結合を形成し、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基が前記スペーサーの別のアミノ基とアミド結合で結合している、ヒアルロン酸修飾物が提供される。ここでアミノ基の置換基としては、特に限定されないが、Ｃ_１−６アルキル基、Ｃ_１−６アルコキシアルキル基、Ｃ_１−６ハロアルキル基、Ｃ_３−８シクロアルキル基などが挙げられる。

本発明の別の側面によれば、前記ヒアルロン酸誘導体が、式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒａ、ＲｂおよびＡは、既に定義した通りである）
で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、上記のヒアルロン酸修飾物が提供される。

本発明の別の側面によれば、前記ヒアルロン酸誘導体および／またはヒアルロン酸修飾物自体が、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有し、例えば哺乳動物において１８時間以上の平均血中滞留時間を有するヒアルロン酸誘導体が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、前記ヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体もまた提供される。ここで、当該薬物担体の形状は、例えばマイクロスフィアまたはナノスフィアなどの微粒子状であってもよい。また、当該薬物担体は、水溶液中で、前記ポリマーがヒアルロン酸またはその誘導体に被覆されている構造を有しうる。また粒子径は特に限定されないが、ニードルを詰まらせずに通過できるようにするために２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。また、関節投与の場合は、物理的に関節内でフリクションを起こし安く、これが新たな炎症を誘発するため、粒子径が５μｍ以下であることが好ましい。また、静脈注射投与の場合は、末梢血管を閉塞させないために粒子径が５００ｎｍ以下であることが好ましく、２００ｎｍ以下であることが更に好ましい。１つの実施態様において、当該薬物担体は、ＨＡレセプターへのターゲティング能；ヒアルロニダーゼに対する耐性；および粘膜付着性などの特性を有しうる。また、当該薬物担体は、局所刺激性が低減された薬物担体ともなりうる。

本発明のさらに別の側面によれば、上記薬物担体および薬物を含む医薬組成物が提供される。一つの実施態様において、当該医薬組成物は、さらにポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーを含んでいてもよく、好適には当該ポリマーは、ヒアルロン酸修飾物に結合しているポリマーと同種のものである。さらに一つの実施態様において、前記薬物はヒアルロン酸修飾物が形成する微粒子により封入されていてもよい。ここで、当該微粒子は、ヒアルロン酸修飾物のポリマー部分および／または前記ポリマーが形成する疎水性コアを、ヒアルロン酸部分が被覆する形状を有していてもよく、好適には、当該医薬組成物において、薬物は当該疎水性コア部分に封入されている。

本発明のさらに別の側面によれば、末端にカルボキシル基を有するポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択されるポリマーと、式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒａ、ＲｂおよびＡは、上記に定義した通りである）
で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、ヒアルロン酸誘導体とを反応させる工程を含む、ヒアルロン酸修飾物の製造方法が提供される。前記ポリマーは、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジハイドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジハイドロ−３−ハイドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウム ヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等の縮合剤を単独で或いは適宜組み合わせることにより導入することができる。また、前記ポリマーの末端カルボキシル基を反応性の高いエステルまたはアミドに変換した後に導入することもできる。また、前記ポリマーは水溶液中で微粒子を形成していてもよい。

本発明のさらに別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物を用いる、エマルション液中乾燥法、溶媒拡散法または透析法による上記薬物担体の製造方法もまた提供される。

１つの実施態様において、本発明の薬物担体の製造方法はエマルション液中乾燥法を用いて行われ、例えば以下の工程：
ａ）１以上の有機溶媒を含む、水に混和しない有機相に、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーを溶解させる工程；
ｂ）水相に、前記ヒアルロン酸修飾物を溶解または分散させる工程；
ｃ）前記ａ工程により得られたポリマー溶液と、前記ｂ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液または分散液とを混合して、エマルションを形成させる工程；および
ｄ）前記ｃ工程により得られたエマルションを液中乾燥し、薬物担体微粒子を形成させる工程、
を含んでいてもよく、または、以下の工程；
ａ）１以上の有機溶媒を含む水に混和しない有機相に、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーを溶解させる工程；
ｂ）前記ａ工程により得られたポリマー溶液を水相に混合して、エマルションを形成させる工程；
ｃ）前記ｂ工程により得られたエマルションを液中乾燥し、ポリマー微粒子を形成させる工程；
ｄ）別の水相に、前記ヒアルロン酸修飾物を溶解または分散させる工程；および
ｅ）前記ｃ工程により得られたポリマー微粒子と、前記ｄ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液または分散液とを混合して、薬物担体微粒子を形成させる工程、
を含んでいてもよい。

さらに１つの実施態様において、本発明の薬物担体の製造方法は溶媒拡散法を用いて行われ、例えば、以下の工程；
ａ）１以上の有機溶媒を含む水に混和する有機相（ただし、水は含まない）に、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーを溶解させる工程；
ｂ）水相に、前記ヒアルロン酸修飾物を溶解または分散させる工程；および
ｃ）前記ａ工程により得られたポリマー溶液を、前記ｂ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液または分散液に滴下して、薬物担体微粒子を形成させる工程、
を含んでいてもよく、または、以下の工程；
ａ）１以上の有機溶媒を含む水に混和する有機相（ただし、水は含まない）に、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーならびに前記ヒアルロン酸修飾物を溶解させる工程；および
ｂ）前記ａ工程により得られたポリマー・ヒアルロン酸修飾物溶液を、水相に滴下して薬物担体微粒子を形成させる工程、
を含んでいてもよい。

さらに一つの実施態様において、溶媒拡散法による本発明の薬物担体の製造方法は、以下の工程；
ａ）１以上の有機溶媒を含む水に混和する有機相（ただし、水は含まない）に、前記ポリマーを溶解させる工程；
ｂ）前記ａ工程により得られたポリマー溶液を、水相に滴下してポリマー微粒子を形成させる工程；
ｃ）別の水相に、前記ヒアルロン酸修飾物を溶解または分散させる工程；および
ｄ）前記ｂ工程により得られたポリマー微粒子と、前記ｃ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液または分散液とを混合して、薬物担体微粒子を形成する工程、
を含んでいてもよい。

さらに１つの実施態様において、本発明の薬物担体の製造方法は透析法を用いて行われ、例えば、以下の工程；
ａ）１以上の有機溶媒を含む水に混和する有機相（ただし、水は含まない）に、前記ポリマーおよび前記ヒアルロン酸修飾物を溶解させる工程、および、
ｂ）前記ａ工程により得られたポリマー・ヒアルロン酸修飾物溶液を、水相に対して透析して微粒子を形成させる工程、
を含んでいてもよく、または、以下の工程：
ａ）１以上の有機溶媒を含む水に混和する有機相（ただし、水は含まない）に、前記ポリマーを溶解させる工程；
ｂ）前記ａ工程により得られたポリマー溶液を、水相に対して透析してポリマー微粒子を形成させる工程；
ｃ）別の水相に、前記ヒアルロン酸修飾物を溶解または分散させる工程；および
ｄ）前記ｂ工程により得られたポリマー微粒子と、前記ｃ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液または分散液とを混合して、薬物担体微粒子を形成する工程、
を含んでいてもよい。

本発明の別の側面によれば、上記の薬物担体の製造方法を含む、医薬組成物の製造方法もまた提供される。

さらに本発明の別の側面によれば、以下の工程：
ａ）１以上の有機溶媒を含む有機相（ただし、水は含まない）に、上記のヒアルロン酸修飾物を溶解させる工程；および
ｂ）前記ａ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液の溶媒を、溶媒拡散法または透析法を用いて水に置換する工程、
を含むヒアルロン酸修飾物水溶液または分散液の調製方法もまた提供される。一つの実施態様において、前記調製方法のｂ工程において溶媒拡散法を用いることもでき、例えば、前記調製方法は、以下の工程：
ａ）１以上の有機溶媒を含む有機相（ただし、水は含まない）に、上記のヒアルロン酸修飾物を溶解させる工程；および
ｂ）前記ａ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液を、水相に滴下して溶媒を水に置換する工程、
を含んでいてもよい。

さらに別の実施態様において、前記調製方法のｂ工程において透析法を用いることもでき、例えば、前記調製方法は、以下の工程：
ａ）１以上の有機溶媒を含む有機相（ただし、水は含まない）に、上記のヒアルロン酸修飾物を溶解させる工程；および
ｂ）前記ａ工程により得られたヒアルロン酸修飾物溶液を、水相に対して透析して溶媒を水に置換する工程、
を含んでいてもよい。

本発明のさらに別の側面によれば、上記のヒアルロン酸修飾物水溶液または分散液の調製方法を含む、医薬組成物の製造方法もまた提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、式（ＩＩＩ）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル基およびＣ_１−６アルキルカルボニル基から選択され、
Ｒａ、Ｒｂ、ＲｃおよびＲｄは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ_１−６アルキル基から選択され、
Ｑは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンまたはこれらの共重合体から選択されるポリマーであり、該ポリマーは末端のカルボキシル基で窒素原子と結合しており、
ｎは、０〜６の整数である）
で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、ヒアルロン酸修飾物が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、末端にカルボキシル基を有するポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトンまたはこれらの共重合体から選択されるポリマーと、式（ＩＶ）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒａ、Ｒｂ、Ｒｃ、Ｒｄおよびｎは、既に定義した通りである）
で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、ヒアルロン酸誘導体とを反応させる工程を含む、上記のヒアルロン酸修飾物の製造方法もまた提供される。

以下、本発明を更に具体的に説明する。

本発明のヒアルロン酸修飾物は、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体と、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）または乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から選択される１以上のポリマーとが結合したものである。

本発明において、ヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体とポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）または乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から選択されるポリマーとは、静電相互作用等の物理的相互作用による結合でなく、化学的に共有結合されている。このため、投与後の塩濃度変化、ｐＨ変化等の環境変化によっても、ＨＡまたはその誘導体から前記ポリマーが脱離することはない。ＨＡまたはその誘導体と前記ポリマーとが結合するに際しては、結合を制御しやすくするため、スペーサー部分を介して結合していてもよい。また、ＨＡ誘導体がポリマーとの結合のためのスペーサー部分を含んでいてもよい。例えば、複数のアミノ基を有する化合物（ジヒドラジド化合物、ジアミン化合物、ヒドラジン化合物など）をヒアルロン酸中のグルクロン酸部分のカルボキシル基と反応させることにより、ヒドラジド基やアミノ基を有するスペーサー部分を導入することができる。特定の実施態様においては、式Ｈ_２Ｎ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ_２（式中、ｎは０〜１０の整数である。）、式Ｈ_２Ｎ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｎ−ＮＨ_２（式中、ｎは０〜１０の整数である。）で表されるジアミン化合物、式Ｈ_２ＮＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨＮＨ_２（式中、ｎは０〜１０の整数である。）で表されるジヒドラジド化合物、或いは、式ＮＨ（Ｒ_１０）−ＮＨ（Ｒ_１１）（式中、Ｒ_１０およびＲ_１１は独立して水素原子またはＣ_１−６アルキル基である）で表されるヒドラジン化合物などをスペーサー部分として導入することができる。

ＨＡ誘導体にスペーサー部分を導入した後にポリマーを導入する方法を用いる場合、スペーサーによるカルボン酸の修飾率と、ポリマーによるスペーサーの修飾率を独立して制御することができる。

ＨＡまたはその誘導体に前記ポリマーが結合する部位としては、ＨＡまたはその誘導体の末端であってもよく、或いは、前記ポリマーがＨＡまたはその誘導体の側鎖として導入されていてもよい。ＨＡは水溶液中で非常に嵩高い分子であるため、一般的に前記ポリマーが末端に結合したＨＡまたはその誘導体を用いて生体分解性微粒子を作成する場合はＨＡ層の厚みが厚くなる。また、前記ポリマーが側鎖としてグラフト結合したＨＡまたはその誘導体を用いる場合は、ＨＡまたはその誘導体はループ状で生分解性微粒子表面にコートされ、ＨＡ層の厚みを小さくできる。このうち、前記ポリマーがＨＡまたはその誘導体の側鎖にグラフト結合しているのが好ましい。

前記ポリマーまたはスペーサー部分の、修飾されるＨＡまたはその誘導体への導入位置としては、ＨＡ分子内の水酸基とカルボキシル基が挙げられる。このうち、水酸基に導入する場合は、活性化したカルボキシル基などと当該水酸基を反応させカルボン酸エステルを形成することにより導入することができ、また、イソシアネート基などと当該水酸基を反応させカルバミン酸エステルを形成することによっても導入することができる。

カルボキシル基に導入する場合は、アミド基、ヒドラジド基、ジアシルヒドラジド基、カルボン酸エステル基を形成することにより、前記ポリマーまたはスペーサー部分を導入することができる。

前記ポリマーまたはスペーサー部分を導入する上述の方法のうち、カルボン酸エステルを形成して前記ポリマーまたはスペーサー部分を導入したＨＡ修飾物は、投与液内、生体内での加水分解による前記ポリマーの脱離が比較的短時間で生じる。従って、一般的には、加水分解速度の遅いカルバミン酸エステル、もしくはアミド基、ヒドラジド基などを介して修飾するほうが好ましい。

このうち、前記ポリマーが、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基に結合しているのが更に好ましく、その中でも、前記ポリマーがアミド基、ヒドラジド基などを介して、ヒアルロン酸またはその誘導体のカルボキシル基にアミド結合により結合しているのが特に好ましい。

ＨＡまたはその誘導体の末端にポリマーを結合させる方法としては、例えば、ＨＡまたはその誘導体の還元末端のアルデヒドと、前記ポリマーおよびスペーサー部分の末端に導入したヒドラジド（ＨＺ）基、アミノ（ＡＭ）基などのアルデヒド基と反応性をもつ官能基とにより形成するシッフ塩基を、水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＢＨ_４）等の還元剤で処理することにより導入する方法が挙げられる。

ＨＡまたはその誘導体の側鎖としてポリマーを化学的にグラフト結合させる方法としては、例えば、ヒドラジド（ＨＺ）基、アミノ（ＡＭ）基等、活性エステルと反応性をもつ官能基を含むスペーサー部分を導入したＨＡ誘導体を、テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩にイオン交換し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）／Ｎ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）でカルボキシル基を活性化したポリマーと反応させる方法を用いることができる。本発明の一つの実施態様においては、スペーサーを導入したＨＡ誘導体は、式（ＩＩ）：

（式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒａ、ＲｂおよびＡは、上記に定義した通りである）
の繰り返し構造を分子内に含みうる。

あるいは他の導入方法として、予めポリマーの末端カルボキシル基をＥＤＣ／ＮＨＳで活性化し、これとジアミン、ジヒドラジド等とを反応させることでアミノ基、ヒドラジド基末端を持つポリマーを合成し、これを直接ＨＡまたはその誘導体のカルボキシル基にＥＤＣ／ＮＨＳ等の縮合剤で結合させる方法を用いることができる。本発明の一つの実施態様においては、アミノ基、ヒドラジド基末端を持つポリマーとして、式（Ｖ）：

（式中、Ｒａ、Ｒｂ、ＱおよびＡは、上記に定義した通りである）
の化合物を用いることができる。

本発明のＨＡまたはその誘導体においては、前記ポリマーの大部分が、その片末端のみでＨＡまたはその誘導体に結合していることが望ましい。ここで、「片末端で結合している」とは、前記ポリマーの末端反応基のうちの１箇所で結合している状態を指す。また、この「大部分」とは、特に限定されないが、具体的には、その片末端のみでＨＡまたはその誘導体と結合しているポリマーの量が、結合している全ポリマーの量に対して７０％ｗ／ｗ以上である状態を指し、好ましくは８５％ｗ／ｗ以上である状態を指し、特に好ましくは９５％ｗ／ｗ以上である状態を指す。なお、何れの場合においても、ポリマーの両末端がＨＡまたはその誘導体に導入されている率は、ＨＡまたはその誘導体中のグルクロン酸当たり５モル％以下であり、好ましくは３モル％以下であり、特に好ましくは１モル％以下である。当然のことながら、本発明ヒアルロン酸修飾物は、前記ポリマーが、その片末端のみでＨＡまたはその誘導体に結合しているヒアルロン酸修飾物のみで構成されていてもよい。

片末端のみでＨＡまたはその誘導体と結合している前記ポリマーの量の、結合している前記ポリマーの両末端がＨＡまたはその誘導体に導入されている率を定量する方法としては、プロトンＮＭＲで得られる前記ポリマーの導入量と、これらポリマーを結合させることによるポリマー導入前のヒドラジド（ＨＺ）化もしくはアミノ（ＡＭ）化されたＨＡ誘導体中のヒドラジド基、またはアミノ基の実際の減少量との比較から求めることができる。例えば、アジピン酸ジヒドラジドでヒドラジド基を導入したＨＡ−ＨＺのプロトンＮＭＲから得られる遊離のヒドラジド基由来のピーク（２．２〜２．３ｐｐｍ：測定溶媒ＤＭＳＯ−ｄ_６）、またはエチレンジアミンでアミノ基を導入したＨＡ−ＡＭのプロトンＮＭＲから得られる遊離のアミノ基由来のピーク（２．９〜３．１ｐｐｍ：測定溶媒ＤＭＳＯ−ｄ_６）は、これらのポリマーの導入率に比例して減少するはずであるから、このピークとＨＡ由来のピーク（１．８〜１．９ｐｐｍ：測定溶媒ＤＭＳＯ−ｄ_６）の比を実測する（Ｘ）。一方で、これらポリマーの導入が１００％片末端であると仮定して、ポリマー導入率から比例的に計算される遊離のヒドラジド基またはアミノ基のピークの、ＨＡ由来のピークに対する比を計算する（Ｙ）。この実測値の比が理論値の比より小さくなった割合が両末端で結合したポリマーの割合になる。グルクロン酸に対するポリマーの導入率をＺ％、ＨＡ−ＨＺのヒドラジド基導入率またはＨＡ−ＡＭのアミノ基導入率をＨ％とすると、片末端のみでＨＡまたはその誘導体と結合しているポリマーの量の結合している全ポリマーの量に対する割合は、１−（ＨＺ）／Ｚ（１−Ｘ／Ｙ）で、両末端がＨＡまたはその誘導体に導入されている率は、グルクロン酸当たり、（ＨＺ）×（１−Ｘ／Ｙ）で表される。

本発明に用いられるヒアルロン酸（ＨＡ）またはその誘導体とは、ＨＡまたはその薬学的に許容される塩、或いはそれらを誘導体化したものであってもよい。

ＨＡまたはその薬学的に許容される塩としては、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩等のアルカリ金属塩を挙げることができ、特に好ましい塩は、医薬品として繁用されているナトリウム塩である。ＨＡまたはその薬学的に許容される塩は、鶏冠や豚皮下等の生物由来のものを抽出する方法や生物発酵法等の各種公知の方法を用いて製造することができ、あるいは市販のものを購入して（例えば、電気化学工業株式会社、株式会社資生堂、生化学工業株式会社等から）入手することも可能である。

ＨＡまたはその薬学的に許容される塩を誘導体化したＨＡ誘導体としては、そのグルクロン酸のカルボキシル基を化学的に修飾したものが挙げられる。この際、グルクロン酸のカルボキシル基の修飾状態によって、体内動態を制御することも可能である。

ＨＡ誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシル基修飾率が低ければ（例えば１０モル％以下）、炎症部位や腫瘍部位に大量に発現しているＣＤ４４を始めとするＨＡレセプターや、ＨＡの主な代謝系である肝臓、リンパ系組織へのターゲティング効果を期待できる。例えば、変形性関節症やリウマチ患者の炎症を起こした滑膜細胞へのターゲッティング、レセプター依存型のエンドサイトーシスによる細胞内への取り込み、細胞内での薬物放出による炎症治癒が期待できる。

また、ＨＡ誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシル基修飾率が高ければ、ＨＡレセプターへの結合が抑制され、体内でステルス効果をもつ滞留性の長い薬物担体微粒子となる。この場合、ＥＰＲ効果を利用した腫瘍細胞へのターゲッティング効果も期待できる。更に、一定時間経過後にカルボキシル基の修飾が切れ、修飾基がＨＡから脱離するように結合様式を設計しておけば（例えばエステルやアミド結合）、ＥＰＲ効果で腫瘍組織に受動的ターゲッティングした後、ＨＡレセプターを介した能動的ターゲッティングで腫瘍細胞内に薬物の入った本発明の微粒子を高い効率でデリバリーすることもできる。

ＨＡまたはその誘導体のグルクロン酸部分のカルボキシル基を修飾する方法としては、特に限定されないが、例えば、ポリマーの修飾前にＨＡまたはその誘導体のカルボキシル基を、Ｎ，Ｎ’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エトキシカルボニル−２−エトキシ−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン）−４−メチルモルホリウム（ＤＭＴ−ＭＭ）、２−ベンゾトリアゾール−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム４フッ化ホウ酸塩（ＴＢＴＵ）、３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＤｈｂｔ）、ベンゾトリアゾール−１−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウム６フッ化リン酸塩（ＰｙＢＯＰ）、ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）フォスフォニウム ヘキサフルオロフォスフェート（ＢＯＰ）または１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）またはＮ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等の縮合剤を単独でまたは適宜組み合わせて利用して活性エステル化し、これをヒドラジド基、アミノ基等の活性エステルと反応性をもつ官能基を結合させたＨＡ誘導体と反応させ、化学的に結合させる方法が挙げられる。なお、先にＨＡまたはその誘導体をポリマーで修飾し、得られたヒアルロン酸修飾物の残存しているカルボキシル基を、同様に反応させ修飾してもよい。

本発明に用いられるＨＡまたはその誘導体の分子量は、特に限定はされないが、ＨＡまたはその誘導体分子自体の水溶液中での大きさが他の分子に比べて非常に大きい（例えば、粘度平均分子量２００万ダルトンのＨＡは２００〜３００ｎｍのサイズがある）ため、粒子系の小さなナノスフィア等の調製には分子量の小さな（例えば、粘度平均分子量で３０万ダルトン以下、例えば５０００〜１０万ダルトン）ＨＡまたはその誘導体を使用することが好ましい。

本発明に用いられるポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）または乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）から選択されるポリマーの分子量は、特に限定はされないが、ＨＡまたはその誘導体との反応効率の面から、通常、粘度平均分子量１０万ダルトン以下のもの、例えば１０００〜５万ダルトンのものを使用することが好ましい。これらのポリマーは、Ａｌｋｅｒｍｅｓ、ＢｉｒｍｉｎｇＨＡＭ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ、和光純薬工業株式会社などから購入することも可能であるし、無触媒脱水重縮合法（特開昭６１−２８５２１号公報）あるいは、環状ジエステル化合物からの触媒を用いた開環重合法（Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉｃ ＨＡｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ＰａｒｔＡＭａｔｅｒｉａｌｓ，Ｖｏｌ．２，ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．（１９９５））を用いて製造することもできる。

本発明に用いられるポリマーの選択は、例えば、ターゲッティングを目的とした薬物担体の場合は、ターゲット部位に到達するまでの生体内での薬物放出は最小限に抑制したいため、ＰＬＡ等の分解速度（即ち、薬物放出速度）の遅いポリマーを選択する方が好ましい。また、体内での薬物徐放を目的とする場合は、目的に応じた薬物放出速度を実現するため、これらの共重合体を用いて薬物放出速度を制御することができる。

本発明において、ＨＡまたはその誘導体とＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択されるポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物およびその塩は、導入したポリマー（ＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡ）の重量比に依らず、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦなどの有機溶媒、およびこれらに十分な割合で混和する溶媒（例えば、テトラヒドロフラン、メタノール、エタノールなど）との混合溶媒には可溶性であるが、例えばアセトニトリル、アセトン、塩化メチレン、酢酸エチルなどの有機溶媒にほとんど溶解しない。

本発明において、ＨＡまたはその誘導体とＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択されるポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物およびその塩をそのまま水に溶解または分散させる際には、共有結合によって導入するポリマー（ＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡ）の重量比は、５０％以下、好ましくは３０％以下になるように調節されたヒアルロン酸修飾物を用いることが好ましい。

本発明において、ＨＡまたはその誘導体とＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択されるポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物およびその塩は、導入したポリマー（ＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡ）の重量比に依らず、いったんＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはこれらに十分な割合で混和する溶媒との混合溶媒に溶解させ、その後、透析法や溶媒拡散法などにより溶媒を水に置換することで、水に溶解もしくは分散させることが可能である。特に限定はされないが、その際ヒアルロン酸修飾物は、自発的に疎水性ポリマー部分をコア部分として集積させ、親水性のＨＡまたはその誘導体部分を表面に向けた状態で水中に存在すると考えられる。

本発明のヒアルロン酸修飾物は、薬物担体として用いることができる。常法に従い、本発明ヒアルロン酸修飾物に、薬物を封入、包含、担持および／または分散させればよい。

本発明に用いられる薬物は、生分解性高分子に担持可能な薬物であれば特に限定されず、低分子化合物、タンパク質、ペプチド等を用いることが可能である。

低分子化合物の例としては、例えば、制癌剤（例えば、アルキル化剤、代謝拮抗剤、アルカロイド等）、免疫抑制剤、抗炎症剤（ステロイド剤、非ステロイド剤系抗炎症剤、等）、抗リウマチ剤、抗菌剤（β−ラクタム系抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、マクロライド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、新キノロン系抗生物質、サルファ剤、等）などを挙げることができる。

タンパク質、ペプチドの例としては、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、グラニュロサイトコロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、β、γ、（ＩＮＦ−α、β、γ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、シリアリーニュートロフィクファクター（ＣＮＴＦ）、チューマーネクローシスファクター（ＴＮＦ）、チューマーネクローシスファクター結合タンパク質（ＴＮＦｂｐ）、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、ＦＭＳ類似チロシンカイネース（Ｆｌｔ−３）、成長ホルモン（ＧＨ）、インシュリン、インシュリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インターロイキン−１レセプターアンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、ブレイン由来ニューロトロフィクファクター（ＢＤＮＦ）、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、メガカリオサイト成長分化因子（ＭＧＤＦ）、オステオプロテゲリン（ＯＰＧ）、レプチン、副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）、塩基性フィブロブラスト成長因子（ｂ−ＦＧＦ）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、抗体、ダイアボディー、ミニボディー、断片化抗体等を挙げることができる。

本発明の最も好ましい態様として、薬物担体が微粒子状に形成されているものが挙げられる。本願ヒアルロン酸修飾物は、ＨＡまたはその誘導体部分が親水性であり、ポリマーが疎水性であることから、水溶液中では、ポリマーの表面をＨＡまたはその誘導体が被覆する構造をとり、微粒子状となる。この微粒子中に薬物を封入、包含、担持および／または分散することができる。この薬物担体は、粒子表面が親水性のＨＡまたはその誘導体で被覆されているため、投与水溶液内、生体内での粒子の凝集、フリクションを防ぎ、且つ、生体適合性の高いＨＡ表面を有するため、コア部分のポリマーが生体組織に直接接触する事が無く、炎症等の問題が緩和される。

微粒子状の本発明薬物担体の粒子径は、ニードルを詰まらせずに通過できるようにするために２００μｍ以下であることが好ましく、１００μｍ以下であることが更に好ましい。また、関節投与の場合は、物理的に関節内でのフリクションが生じやすく、これが新たな炎症を誘発するため、粒子径が５μｍ以下であることが好ましい。また、静脈注射投与の場合は、末梢血管を閉塞させないために粒子径が５００ｎｍ以下であることが好ましく、２００ｎｍ以下であることが更に好ましい。

また、本発明の微粒子は生体適合性が良く、炎症性が無く、ヒアルロン酸自体に粘膜付着性があることから、粒子径を制御することで、経鼻、経肺、経口等の非侵襲投与用途にも使用可能である。粘膜付着性は、ＨＡのカルボン酸の量で調節することが可能で、その量は多い方が好ましく、スペーサーやポリマーなどによる修飾率は低いほうが好ましい。

本発明の微粒子調製方法は、例えば、エマルション液中乾燥法、あるいは、溶媒拡散法（Ｊ．Ｃｏｎｔｒ．Ｒｅｌ．８３，３６５−３７５（２００２））、透析法等が挙げられる。具体的には、ポリマー微粒子調製後にその表面にＨＡまたはその誘導体を化学結合させポリマー微粒子をコートする方法、ＨＡまたはその誘導体の末端や側鎖にポリマーを化学的に結合させたヒアルロン酸修飾物を予め合成し、これを用いてエマルション液中乾燥法、溶媒拡散法、透析法などによる微粒子調製の際、微粒子生成時に自発的にＨＡで被覆する方法、微粒子調製後に自発的にＨＡで被覆する方法が挙げられる。

ポリマー微粒子調製後にその表面にＨＡまたはその誘導体を化学結合させポリマー微粒子をコートする場合は、常法に従いポリマーからなる微粒子を調製した後、粒子表面のカルボキシル基を１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）、Ｎ−ハイドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）等の縮合剤で活性エステル化し、これをヒドラジド（ＨＺ）基、アミノ（ＡＭ）基等の活性エステルと反応性をもつ官能基を含むスペーサーを導入したＨＡまたはその誘導体と反応させ、化学的に結合を形成することにより本願ヒアルロン酸修飾物からなる微粒子を製造することができる。

本発明の別の実施態様において、エマルション液中乾燥法によりさらにＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択される１以上のポリマーを含む、ヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子を調製することができる。すなわち、塩化メチレン、酢酸エチルなどの水に混和しない有機溶媒またはこれらに十分な割合で混和する溶媒との混合溶媒にＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡを溶解させておき、一方、本発明のヒアルロン酸修飾物は水相に溶解もしくは分散させ、エマルション調製後、液中乾燥することにより本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子を調製することができる。特に限定はされないが、この調製方法において、本発明のヒアルロン酸修飾物は疎水部と親水部を一分子内に持つ両親媒性分子であるため、界面活性作用を示すと考えられる。

本発明の別の実施態様において、溶媒拡散法によりさらにＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択される１以上のポリマーを含む、ヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子を調製することができる。すなわち、アセトン、アセトニトリルなどの水に混和する有機溶媒またはこれらに十分な割合で混和するエタノール、メタノールなどの有機溶媒との混合溶媒にＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡを溶解させておき、水相に混合すると有機溶媒が拡散するとともに微粒子が生成するが、その水相に本発明のヒアルロン酸修飾物を溶解もしくは分散させて用いることができ、微粒子生成時に、その微粒子を本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆することができる。

溶媒拡散法や透析法を用いる場合で、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはこれらに十分な割合で混和する溶媒との混合溶媒を使用する場合、本発明のヒアルロン酸修飾物は有機相に溶解させて用いることもできる。有機相に溶解させた本発明のヒアルロン酸修飾物もしくはＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択されるポリマーとの混合物は、水相に対して透析もしくは滴下されることによって溶媒が水へと置換される際に、疎水性ポリマーの集積による微粒子の形成とともに、親水性のＨＡ部分は微粒子表面に集積することで微粒子を本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆することができる。また、溶媒拡散法や透析法を用いる場合で、ＤＭＳＯ、ＤＭＡｃ、ＤＭＦなどの有機溶媒、またはこれらに十分な割合で混和する溶媒との混合溶媒を使用する場合、本発明のヒアルロン酸修飾物を水相に溶解もしくは分散させて用いることもでき、微粒子生成時に、その微粒子を本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆することができる。

微粒子調製方法に依らず、ＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから成る微粒子表面は疎水性であることから、これらの微粒子を本発明のヒアルロン酸修飾物を溶解もしくは分散させた水溶液に混合することで、疎水性相互作用による微粒子表面への吸着が起こり、親水性の本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子を調製することができる。

本発明の微粒子調製において用いる水相は、水のみからなっていてもよく、水に十分な割合で混和する溶媒との混合溶媒になっていてもよい。また所望により、当該技術分野で通常用いられる添加物、例えば界面活性剤、ｐＨ調整剤や緩衝剤など含んでいてもよく、ｐＨや塩濃度を適宜調節されていてもよい。

本発明のヒアルロン酸修飾物のみを用いて微粒子を形成することができるが、当該技術分野で通常用いられる添加物、例えば界面活性剤、ｐＨ調整剤、酸化防止剤などとともに、本発明のヒアルロン酸修飾物を含む微粒子を形成することもできる。本発明の一つの実施態様において、本発明のヒアルロン酸修飾物を含む微粒子は、そのコア部分にＰＬＡ、ＰＧＡまたはＰＬＧＡから選択されるＨＡが結合していないポリマーを含むことができる。前記添加物や当該ポリマーを添加することにより、微粒子の粒径および薬物担持能力を調節することができる。

本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子のうち、特にＣＤ４４をはじめとするＨＡレセプターへのターゲティングを目的とした微粒子を調製する場合、その粒子サイズは５μｍ以下、例えば１ｎｍ〜５μｍであることが好ましく、その調製法は透析法、溶媒拡散法、エマルション液中乾燥法などを用いることができる。この際に用いるヒアルロン酸修飾物は、ＨＡレセプターへの結合が抑制されないように、ＨＡのグルクロン酸部分のカルボン酸の修飾率が１０モル％以下、例えば０．１〜１０％であることが好ましい。

本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子のうち、特に血中滞留性延長、腫瘍組織、炎症組織への集積性を目的とした微粒子を調製する場合、その粒子サイズは２００ｎｍ以下、例えば１ｎｍ〜２００ｎｍであることが好ましく、その調製法は透析法、溶媒拡散法、エマルション液中乾燥法などを用いることができる。この際に用いるヒアルロン酸修飾物は、ＨＡレセプターへの結合が抑制されるようにＨＡのグルクロン酸部分のカルボン酸が、３０〜１００％、好ましくは５０〜９０％の修飾率で修飾されたものを用いることが好ましい。

本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子のうち、局所刺激性の低減を目的とした微粒子を調製する場合、その粒子サイズは２００μｍ以下、例えば１ｎｍ〜２００μｍであることが好ましく、その調製法は透析法、溶媒拡散法、エマルション液中乾燥法を用いることができる。

本発明のヒアルロン酸修飾物で被覆された微粒子のうち、粘膜付着性を持ち非侵襲投与用途を目的とした微粒子を調製する場合、その粒子サイズは２００μｍ以下、例えば１ｎｍ〜２００μｍであることが好ましく、その調製法は透析法、溶媒拡散法、エマルション液中乾燥法を用いることができる。用いるヒアルロン酸修飾物は、粘膜付着性を持つようにＨＡのカルボン酸の修飾率は低いものが好ましい。

薬物のこれら微粒子への封入方法は、通常、薬物をポリマーに封入する方法が用いられる。例えば、微粒子調製時にポリマーをＤＭＳＯ等の有機溶媒に溶解した時に薬物も共存させておき、そのまま微粒子を調製すればよい。薬物の水溶性が高い場合等には、薬物を水に対する溶解性の低い塩に変更したり、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルション法を用いたりすることで封入効率を上げることができる。

調製した微粒子が凍結乾燥後に再分散しにくい場合は、トレハロース、マンニトール等の分散剤を共存させて凍結乾燥を行うこともできる。

本発明ヒアルロン酸修飾物の用途に合わせて、本発明ヒアルロン酸修飾物の血中滞留時間は、ＨＡ自体の血中滞留時間に比べて延長されているものであってもよい。ここで、血中滞留時間が延長された本発明ヒアルロン酸修飾物を得るために、原料として血中滞留時間が延長されたヒアルロン酸誘導体を用いることができる。血中滞留時間は、平均血中滞留時間（以下、ＭＲＴとも称す）、血中半減期（以下、ｔ１／２とも称す）、血中クリアランス（以下、Ｃｌとも称す）などの公知の代表的なパラメーターを利用して適宜比較することができる。本発明のヒアルロン酸修飾物にステルス効果を期待する場合、ヒトを含む哺乳類における血中滞留時間は、実用面から平均血中滞留時間（ＭＲＴ）が１８時間以上のものであることが好ましく、３０時間以上のものがより好ましい。

また、別の側面によれば、本発明ヒアルロン酸修飾物は、その用途に合わせて、ＨＡ自体に比べてヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものであってもよい。ここで、ＨＡ自体に比べてヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する本発明ヒアルロン酸修飾物を得るために、原料としてＨＡ自体に比べてヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するヒアルロン酸誘導体を用いることができる。「ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する」とは、ＨＡ自体と本発明ヒアルロン酸修飾物または原料であるヒアルロン酸誘導体をそれぞれヒアルロニダーゼにより酵素分解させた際に、ＨＡ自体よりも分解速度が遅いかまたは分解が進まない性質を有することを指す。例えば、一定時間ヒアルロニダーゼ処理した際に、ＨＡ自体では観察される２糖分解ピークが観察されなければ「分解が進まない」性質を有する（即ち、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する）と判定することができる。なお、ＨＡの分解速度や分解状態はゲル浸透クロマトグラフィー（以下、ＧＰＣとも称す）などの常法を用いて観察することができる。

本発明により、ヒアルロン酸またはその誘導体と、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物が提供される。当該ヒアルロン酸修飾物を用いて、低分子薬物を効率良く封入し、長期に徐放期間を制御でき、血中滞留性を制御でき、水溶液中での分散性が良く、安全性に問題の無い薬物担体が提供される。さらに、本発明のヒアルロン酸修飾物により、粒子間の凝集が少なく、粒子径の制御が可能でしかもインジェクタブルな微粒子からなる生体適合性に優れた薬物担体も提供される。

図１は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるマイクロスフィアをＳＥＭで撮影した写真の一例である。 図２は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるマイクロスフィアを３Ｄレーザー顕微鏡で撮影した写真の一例である。 図３は、比較例としてのＰＬＧＡマイクロスフィアをＳＥＭで撮影した写真の一例である。 図４は、比較例としてのＰＬＧＡマイクロスフィアを３Ｄレーザー顕微鏡で撮影した写真の一例である。 図５は、本発明のヒアルロン酸修飾物を、ＧＰＣにて測定した結果の一例である。 図６は、本発明のヒアルロン酸修飾物を、ＮＭＲにて測定した結果の一例である。 図７は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるナノスフィアの分散溶液（ＨＡ（２５ｋダルトン）−ＰＬＡナノスフィア）を、１ヶ月４℃で保存した後の写真の一例である。 図８は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるナノスフィアの分散溶液（ＨＡ（１９０ｋダルトン）−ＰＬＡナノスフィア）を、１ヶ月４℃で保存した後の写真の一例である。 図９は、ＰＬＡナノスフィアの分散溶液（比較例）を、１ヶ月４℃で保存した後の写真の一例である。 図１０は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるナノスフィアの分散溶液（ＨＡ（２５ｋダルトン）−ＰＬＡナノスフィア）を、１ヶ月４℃で保存した後のＳＥＭ写真の一例である。 図１１は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるナノスフィアの分散溶液（ＨＡ（１９０ｋダルトン）−ＰＬＡナノスフィア）を、１ヶ月４℃で保存した後のＳＥＭ写真の一例である。 図１２は、ＰＬＡナノスフィアの分散溶液（比較例）を、１ヶ月４℃で保存した後のＳＥＭ写真の一例である。 図１３は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるナノスフィアの分散溶液の水溶液中でのプロトンＮＭＲスペクトルの一例である。 図１４は、本発明のヒアルロン酸修飾物からなるナノスフィアの分散溶液の水溶液中でのプロトンＮＭＲスペクトルの一例である。 図１５は、実施例４−１において得られたＨＡ−ＨＺのＮＭＲスペクトルの一例である。 図１６は、実施例４−１において得られたＨＡ−ＨＺについてのヒアルロニダーゼＳＤに対する分解性試験結果および、未修飾ＨＡを同条件でヒアルロニダーゼＳＤ処理した場合の結果の一例である。 図１７は、実施例５−１において得られたＨＡ−ＡＭのプロトンＮＭＲスペクトルの一例である。 図１８は、実施例５−１〜５−３において得られたＨＡ−ＡＭについてのヒアルロニダーゼＳＤに対する分解性試験結果および、未修飾ＨＡを同条件でヒアルロニダーゼＳＤ処理した場合の結果の一例である。 図１９は、実施例６−２で得たＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡのＧＰＣクロマトグラムの一例である。 図２０は、実施例６−２で得たＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡのプロトンＮＭＲスペクトルの一例である。 図２１は、実施例６−３で得たＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡのＧＰＣクロマトグラムである。 図２２は、実施例６−３で得たＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡのプロトンＮＭＲスペクトルの一例である。 図２３は、実施例７−７で得たＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡのプロトンＮＭＲスペクトルの一例である。

以下、本発明の好適な実施例についてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。なお、以下においては、結合様式を問わず、ＨＡとＰＬＡとが結合したものを総称してＨＡ−ＰＬＡと称する。また、スペーサー分子としてジヒドラジド化合物を含む場合は、ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ、ジアミン化合物を含む場合はＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡと称する場合もある。

トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）によるアミノ基の定量は、「学会出版センター 生物化学実験法１２ 蛋白質の化学修飾＜上＞ 初版」３７ページに記載の方法（ＴＮＢＳ法）に従った。ただし、ＴＮＢＳ溶液は０．５Ｍに調製し、ヒドラジド基を定量するために５００ｎｍの吸光度を測定した。

なお、ＮＭＲ測定はＮＭＲ分光計としてＪＮＭ−ＥＣＡ５００（５００ＭＨｚ分光計）を使用し、以下の条件（パラメーター）で測定を行なった。

ＮＭＲ条件
Ｄａｔａ ｐｏｉｎｔｓ（Ｘ ｐｏｉｎｔ）： １６３８４
Ｓｐｅｃｔｒａｌ ｗｉｄｔｈ（Ｘ ｓｗｅｅｐ）： １５ｐｐｍ
Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｔｉｍｅ（Ｘ ａｃｑ ｔｉｍｅ）： １．７４９ｓ
Ｐｕｌｓｅ ｄｅｌａｙ（Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ ｄｅｌａｙ）： ３０ｓ
Ｔｒａｎｓｉｅｎｔｓ（Ｓｃａｎｓ）： ６４
温度：室温
〔実施例１〕ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
（実施例１−１）ヒドラジド基（ＨＺ）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
分子量２．５×１０^４ダルトンのヒアルロン酸（ＨＡ）（電気化学工業株式会社製）１００ｍｇを１％濃度で蒸留水に溶解し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に調製した。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（シグマ−アルドリッチ社製）とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）（シグマ−アルドリッチ社製）を、用いるヒアルロン酸に含まれるグルクロン酸（カルボキシル基）に対してモル比で５倍のＥＤＣおよび４０倍のＡＤＨを添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。１００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液、２５％エタノール水溶液で透析（スペクトラポア７、分画分子量（ＭＷＣＯ）：１２ｋ−１４ｋダルトン）し、凍結乾燥して標題のヒドラジド基（ＨＺ）が導入されたヒアルロン酸誘導体（ＨＡ−ＨＺ）８８ｍｇを得た。

得られたＨＡ−ＨＺ中のＨＺ導入率をプロトンＮＭＲ法（測定溶媒：Ｄ_２Ｏ）で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の６５％がＨＺ化されていた（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、２．１ｐｐｍ、ＨＺ：アジピン酸部分のメチレン基、１．７ｐｐｍ、２．４ｐｐｍ）。また、ＴＮＢＳ法で定量したところ、３４．９％であった。
（実施例１−２）ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
ＰＬＧＡ７５１０（和光純薬工業：分子量１万ダルトン）を塩化メチレン（純正化学）１０ｍＬを加えて溶解させ１０％（ｗ／ｖ）の溶液を調製した。これを１％ポリビニルアルコール、（８７−８９％ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ、分子量１３０００−２６０００）水溶液（ＰＶＡ水溶液）９０ｍＬに１：９（ｖ／ｖ）となるように混合し、スターラーで約７００ｒｐｍにて撹拌させてｏｉｌ−ｉｎ−ｗａｔｅｒ（Ｏ／Ｗ）エマルジョンを得た。このエマルジョンを１％ＰＶＡ水溶液９００ｍＬ中に入れて約２００ｒｐｍにて一晩撹拌し、溶媒を留去させることでマイクロスフィアの懸濁液を得た。この懸濁液を１０００ｒｐｍ、４℃にて１０分間遠心させ上澄みを除去し、水にて十分洗浄を行い、凍結乾燥したものをマイクロスフィアとして回収した。ＳＥＭ画像解析による粒径測定の結果、３０〜８０μｍ程度の粒子径のマイクロスフィアが得られた。
（実施例１−３）ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
実施例１−２のＰＬＧＡマイクロスフィアの表面カルボン酸をＥＤＣおよびＳｕｌｆｏ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）（ピアス社製）を用いて活性化し（ＰＬＧＡ／ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ＝１／５／５モル比、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ５．８）中で室温で１時間攪拌）、実施例１−１のＨＡ−ＨＺ水溶液（０．１％、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０））に投入、室温で２時間攪拌後、１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄し、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアを得た。得られたヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの、ＳＥＭおよび３Ｄレーザー顕微鏡の写真を図１および図２に示す。ＳＥＭ写真（乾燥状態）（図１）によれば、ＨＡコートによりＰＬＧＡマイクロスフィア表面が滑らかなったことが分かる。３Ｄレーザー顕微鏡写真（図２）によれば、水溶液中では、得られたヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアは、ＰＬＧＡ粒子がＨＡのゲル状のシェルに被覆されていることが分かる。
〔実施例２〕ヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製
（実施例２−１）ＰＬＡが導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＰＬＡ）の合成
実施例１−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＨＺ１００ｍｇを２０ｍＬの水に溶かし（０．５％濃度）、Ｈ型にしたカチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８−４００、４．８ｍｅｑ／ｇ）４ｍＬを添加（ＨＡのカルボキシル基の１００倍のイオン交換能）室温で３日放置した。上澄みを回収、０．２２μｍフィルターを通し、１Ｍ ＴＢＡ−ＯＨ（テトラ−Ｎ−ブチルアンモニウムヒドロキシド）溶液を１５０μＬ添加、ｐＨ８に調整した後、凍結乾燥した。凍結乾燥したＨＡ−ＨＺ−ＴＢＡに含まれるグルクロン酸（カルボキシル基）に対して、それぞれモル比で５倍となる量のＰＬＡ０００５（分子量５０００ダルトン）、ＥＤＣ、ＮＨＳを１０ｍＬのＤＭＳＯに溶かし、室温で２時間放置、ＰＬＡのカルボキシル基を活性エステル化した。一方でＨＡ−ＨＺ−ＴＢＡを２０ｍＬのＤＭＳＯに溶かし、これらを混合、室温で１晩放置した。この反応液をＤＭＳＯに対して透析（ＭＷＣＯ：２５０００、室温、１０日間）することで活性化試薬を除去し、次に水に対して透析（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、室温、３日間）を行い、得られた白濁溶液（２５ＫダルトンのＨＡ由来のＨＡ−ＰＬＡを含むナノスフィア分散溶液）を凍結乾燥した（なお、得られた白濁溶液についてＧＰＣで定量したところＨＡ−ＰＬＡ：ＰＬＡはおよそ１：９であった。）。未反応のＰＬＡを除去するために、この凍結乾燥品をアセトン中に投入し不溶物をアセトン洗浄、乾燥しＨＡ−ＰＬＡを得た。ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）の測定データ（溶媒：ＤＭＳＯ）を図５に示す。ピーク位置からＨＡ−ＴＢＡをスタンダードに分子量を見積もると、ＰＬＡの結合により、分子量が当初の２５Ｋダルトンから９７Ｋダルトンになっていることが確認された。得られたＨＡ−ＰＬＡのプロトンＮＭＲを図６に示す。ＨＡ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をプロトンＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ、ＨＡのカルボン酸の４３モル％がＰＬＡ化されていた（ＨＡ：Ｎ−アセチル基、１．５−１．９ｐｐｍ、ＰＬＡ：ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。
ＧＰＣ条件
溶出液： ＤＭＳＯまたは５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＮＯ_３を含むＤＭＳＯ
流速： １．０ｍＬ／分
検出器：ＲＩ、ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：ＴＯＳＯＨ ＴＳＫｇｅｌ ＧＭＨ_ＨＲ−Ｈ
カラム温度： ４０℃
サンプル室温： ２５℃
サンプル濃度： １０ｍｇ／ｍＬ、５０μＬ
（実施例２−２）ヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの透析法による調製
実施例２−１の手順において、水に対しての透析後に得られる白濁溶液を、２５ＫダルトンのＨＡ由来のＨＡ−ＰＬＡを含むナノスフィア分散溶液として使用した。

一方、分子量が１９０ＫダルトンのＨＡを用い、当該ＨＡを０．５％濃度で蒸留水に溶解した以外は実施例１−１と同様の方法によりＨＡ−ＨＺを調製し、実施例２−１と同様の方法で調製したＤＭＳＯ透析後の反応液を水に対して透析（ＭＷＣＯ：２５０００、室温、３日間）し、１９０ＫダルトンのＨＡ由来のＨＡ−ＰＬＡを含むナノスフィア分散溶液を調製した。

得られた分散溶液は、どちらも精製操作後は白濁していた（沈殿物は見られなかった）。これを１００倍希釈してＤＬＳ（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）によって粒径を測定したところ、１９０ｋダルトンのＨＡを用いたもので２６３．８ｎｍ、２５ｋダルトンのＨＡを用いたもので２４３．８ｎｍであった。得られた分散溶液を４℃で１ヶ月間保存しても凝集沈殿物はほとんど無かった。保存１ヵ月後の写真を図７および図８にＳＥＭ写真を図１０および図１１に示す。
（実施例２−３）ヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの溶媒拡散法による調製
実施例２−１の２５ｋダルトンのＨＡを用いたもののうち、アセトン再沈殿による精製前の分散溶液（ＨＡ−ＰＬＡ：ＰＬＡがおよそ１：９）を凍結乾燥したもの、およびアセトン再沈殿後のＨＡ−ＰＬＡをそれぞれ２０ｍｇを秤取し、１．０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これを４．０ｍＬの水に攪拌しながら滴下したところ、ともに薄い白色半透明溶液になった。この混合溶液を透析チューブ（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ４）に移し、水に対して透析を行った（室温、３日間）。得られたナノスフィア分散溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行ったところナノスフィアの粒径は精製前のもので１７．６ｎｍ、製精後のもので１５．２ｎｍであった。また、このナノスフィア分散溶液をＤ_２Ｏに対して透析を行い（４℃、２日間）、プロトンＮＭＲ測定（ＪＮＭ−ＥＣＰ５００ ＦＴ ＮＭＲ ＳＹＳＴＥＭ、ＪＯＥＬ、測定溶媒：Ｄ_２Ｏ）を行ったところ（精製前：図１３、精製後：図１４）、ともにＨＡ−ＨＺ由来のプロトンピークが確認されたことから、ナノスフィアの表面がＨＡ分子によって被覆されていることが示唆された。
〔実施例３〕ジクロフェナック封入ヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製
（実施例３−１）調製方法
・溶媒拡散法
実施例２−２と同様の操作により調製した、２５ｋダルトンのＨＡ由来のＨＡ−ＰＬＡを含むナノスフィア分散溶液（ＨＡ−ＰＬＡ：ＰＬＡがおよそ１：９）を凍結乾燥したもの４０ｍｇ、ジクロフェナック（シグマ社より購入したものを塩酸再沈でＨ型にイオン交換し、純水で洗浄、乾燥したもの）１０ｍｇをそれぞれ秤取し、１．０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これを４．０ｍＬの水に攪拌しながら滴下したところ薄い白色半透明溶液になった。この混合溶液を透析チューブ（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ４）に移し、水に対して透析を行った（３日、室温）。得られた水溶液を遠心（１０００ｒｐｍ×１０分）によって沈殿と上澄みを分離、上澄みを回収し、凍結乾燥した。
・透析法
実施例２−２と同様の操作により調製した、２５ＫダルトンのＨＡ由来のＨＡ−ＰＬＡを含むナノスフィア分散溶液（ＨＡ−ＰＬＡ：ＰＬＡがおよそ１：９）を凍結乾燥したもの４０ｍｇ、ジクロフェナック１０ｍｇをそれぞれ秤取し、１．０ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これを透析チューブ（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ４）に移し、水に対して透析を行ったところ、すぐに白濁し沈殿も生じた（３日、室温）。得られた水溶液を遠心（１０００ｒｐｍ×１０分）によって沈殿と上澄みを分離、上澄みを回収し、凍結乾燥した。
（実施例３−２）ナノスフィア中のジクロフェナック定量
・標準溶液の調製
ジクロフェナック、５．１３ｍｇ／ｍＬ−アセトニトリルの２倍希釈列（６列）を調製した（Ａ）。内部標準（ＩＳ）溶液として、ｎ−ヘプチル ４−ヒドロキシベンゾエート、２．６０ｍｇ／ｍＬ−アセトニトリル溶液を調製した（Ｂ）。２００μＬ（Ａ）と２０μＬ（Ｂ）を混合し、ジクロフェナック定量用の標準溶液とした（Ｃ）。
・ナノスフィアからのジクロフェナックの抽出・サンプル調製
溶媒拡散法・透析法によって調製したナノスフィアをそれぞれ４．９１ｍｇ、５．４５ｍｇ秤取し、１．０ｍＬのアセトニトリルに溶解した。充分攪拌した後、遠心（１５００ｒｐｍ×５分）することで、サンプル中のジクロフェナックを抽出し、上澄みを回収した（Ｄ）。２００μＬ（Ｄ）と２０μＬ（Ｂ）を混合し、ジクロフェナック定量サンプルとした（Ｅ）。
・ＲＰＨＰＬＣによるジクロフェナックの定量
（Ｃ）および（Ｅ）についてＲＰＨＰＬＣ測定を行い、ＩＳ法によるジクロフェナックの定量を行った。
ＨＰＬＣ条件
溶出液：０．１％ＴＦＡ ６０％ＭｅＣＮａｑ
検出器：ＵＶ（２８０ｎｍ）
カラム：Ｉｎｔａｋｔ Ｃａｄｅｎｚａ ＣＤ−Ｃ１８
流速：１．０ｍＬ／分
サンプル注入量：１０μＬ
この結果、ジクロフェナック封入率は、溶媒拡散法で、４．９重量％、透析法で１．４重量％であった。
〔比較例１〕ＰＬＡナノスフィアの調製
（比較例１−１）ＰＬＡナノスフィアの調製
ＰＬＡをＤＭＳＯに溶かし（０．３１６ｇ／ｍＬ ＤＭＳＯ）、実施例２−３と同様の方法で水に対して透析した。白濁水溶液が得られたが、沈殿物も確認された。分散溶液の粒径を測定した結果、２７３．３ｎｍであった。４℃で１ヶ月間保存したが、保存１日後でほとんどが凝集沈殿した。保存１ヵ月後の写真を図９に、同ＳＥＭ写真を図１２に示す。粒子が凝集していることが分かる。
〔実施例４〕ヒドラジド基の導入によるステルス性ヒアルロン酸修飾物の合成および機能評価
（実施例４−１）ＨＺ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）の合成
ＨＡ（電気化学工業株式会社：粘度平均分子量２５ｋダルトン）８４０ｍｇを、０．１％濃度で蒸留水／ＥｔＯＨ＝５０／５０に溶解した。ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：４：４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００）し、凍結乾燥してヒドラジド基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）８６．６ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＨＺのＤ_２Ｏ中でのＮＭＲスペクトル測定結果を図１５に示す。ＨＺ基導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡユニット（２糖）に対して６３．０％であった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ、ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレンプロトン、１．５、２．１および２．２５ｐｐｍ）。
（実施例４−２）ＨＡ−ＨＺの酵素耐性評価
実施例４−１で得られたＨＡ−ＨＺを０．５ｍｇ／ｍＬ濃度に０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）に溶解した。この溶液８０μＬにヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）０．５Ｕ／ｍＬ溶液３２μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。対照として酵素非添加群も同様に行った（データ省略）。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、ＧＰＣとも称す）に供してＨＡ−ＨＺの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した。ＧＰＣの条件を以下に示す。
ＧＰＣ条件
ＧＰＣカラム： Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ ＨＲ １０／３０、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＨＲ １０／３０（全てアマシャムバイオサイエンス株式会社製）（３本連結）
移動相： ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
溶出モード： Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
流速： ０．４ｍＬ／分
サンプル注入量： ５０μＬ
検出器：ＵＶ、Ａｂｓ． ａｔ ２３２ｎｍ
酵素分解産物のＧＰＣプロファイルを図１６に示した。検討におけるＧＰＣ条件下、ＨＡ−ＨＺのピークトップは保持時間およそ７５分に、酵素分解産物である２糖は保持時間およそ１３０分に観察される。

実施例４−１で得られた試料は、酵素分解による分子量の低下が著しく抑制されたことが示された。
（実施例４−３）薬物動態試験のためのＦＩＴＣ化ＨＡ−ＨＺの合成
実施例４−１で得られたＨＡ−ＨＺ（３８．９ｍｇ）を、２．０ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解した。ＨＡのユニットに対して０．１５モル倍のフルオレセインイソチオシアネート（以下、ＦＩＴＣとも称す）（ピアス社製）をＨＡ−ＨＺ溶液の１／１０容量のジメチルスルホキシド（以下、ＤＭＳＯとも称す）溶液として加えて室温で１時間撹拌した。脱塩カラムＰＤ−１０（アマシャムバイオサイエンス社製）で未反応のＦＩＴＣを除去した後、ＨＡのユニットに対して４０モル倍の無水コハク酸（和光純薬工業社製）をＰＤ−１０で粗精製した溶液の１／１０容量のＤＭＳＯ溶液として加えた。室温で１時間撹拌して反応させた後、大過剰量の水に対して透析して精製し、凍結乾燥して実施例４−１のＨＡ−ＨＺをＦＩＴＣ標識した蛍光標識ＨＡ−ＨＺ（３８０ｍｇ）を得た。

こうして得られた蛍光標識ＨＡ−ＨＺを０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度で５０ｍＭ炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）に溶解し、その溶液の４９４ｎｍにおける吸光度からＦＩＴＣ濃度を定量し、以下の連立方程式を解いて各ユニットの濃度を算出した。さらに、モル分率への変換、ＨＡ修飾物中のＨＡ由来の重量分率算出を行った。

未修飾ＨＡユニット： ｘ ｎｍｏｌ／ｍＬ
ＨＡ−ＳＵＣユニット： ｙ ｎｍｏｌ／ｍＬ（残存ＨＺが無水コハク酸処理されたユニット）
式１：（３７９．３ × ｘ）＋（６３５．５７ × ｙ）＋（９２４．８８ ×（ ＦＩＴＣ濃度））＝２５０ｍｇ
式２： ｘ／（ｙ＋（ＦＩＴＣ濃度））＝（１００−ＨＺ（％））／ＨＺ（％）
実施例４−３の蛍光標識ＨＡ−ＨＺは、ＨＺ ６３％、ＦＩＴＣ １．５％の導入率であることが示された。
（実施例４−４）薬物動態試験によるステルス性評価
・ＨＡ投与ラット血漿サンプル
実施例４−３の蛍光標識ＨＡ誘導体をヒアルロン酸換算１０ｍｇ／ｋｇの用量でラット静脈内に単回投与し、投与前および投与後０．２５、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、３０、５４時間に採血（ヘパリン処理）し、遠心分離により血漿を得た。この血漿サンプルは測定まで−２０℃以下で凍結保存した。
・測定方法
ＧＰＣにより検量線用標準試料および測定用試料の分析を行う。以下に条件を示す。
ＧＰＣ条件
ＧＰＣカラム： ＴＳＫｇｅｌ Ｇ６０００ＰＷＸＬ
移動相： ＰＢＳ（ｐＨ７．４）
溶出モード： Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
流速： ０．５ｍＬ／分
サンプル注入量： ４０μＬ
検出器： 蛍光（ＥＸ：４９０、ＥＭ：５１８）
・検量線用試料： 各蛍光標識ＨＡ誘導体をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で希釈して、１、５、１０、５０、１００、５００μｇ／ｍＬおよび０μｇ／ｍＬ（対照、ＰＢＳ（ｐＨ７．４））の標準液を調製する。この標準液に等容量の正常ラット血漿を添加し検量線用試料を調製した。
・測定用試料の調製： ＨＡ修飾物投与ラット血漿サンプルに等容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）を添加して測定用試料を調製した。
・血漿中のＨＡ修飾物濃度の算出： 解析ソフトＭｉｌｌｅｎｉｕｍを用いてピーク面積を算出した。各標準試料のピーク面積から得られた検量線より血漿中のＨＡ修飾物濃度を算出した。
薬物動態データ
実施例４−３の蛍光標識ＨＡ誘導体の血中濃度推移のデータについて、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ Ｖｅｒ ３．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ社）で薬物動態学的パラメーターを算出した。各個体の最終測定点３点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、半減期（ｔ１／２）、平均血中滞留時間（ＭＲＴ）を算出した。算出した薬物動態学的パラメーターを表１に示す。

蛍光標識ＨＡ誘導体を用いた薬物動態試験により、ヒドラジド基を導入したＨＡ誘導体は、未修飾のＨＡと比較して、ラット単回静脈内投与後の血中滞留時間が改善されることが確認された。未修飾のＨＡの血中半減期（ｔ１／２）は数分程度であるのに対して、ヒドラジド基を導入することで血中半減期が２５．２±２．０（時間）となった。
〔実施例５〕アミノ基の導入によるステルス性ヒアルロン酸修飾物の合成・機能評価
（実施例５−１）ＡＭ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）の合成−１
テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡ）塩化したＤＯＷＥＸ ５０ＷＸ８−４００（アルドリッチ社製）を用いてＴＢＡ塩化したＨＡ−ＴＢＡ（ＨＡ：電気化学工業株式会社：粘度平均分子量１９ｋダルトン）３０５．２ｍｇを、２ｍｇ／ｍＬ濃度でＤＭＳＯに溶解した。ＨＡのユニット：ＢＯＰ（和光純薬工業社製）：エチレンジアミン（ＥＤＡ）（シグマ−アルドリッッチ社製）＝１：１．１：５０モル比になるようにＥＤＡ、ＢＯＰの順に添加し、室温下で一晩反応させた。その後８０ｍＬを分取し、１Ｍ ＮａＣｌ水溶液を１／２量の４０ｍＬ加えた後、５Ｎ ＨＣｌにてｐＨ３まで低下させ、さらに２Ｎ ＮａＯＨにて中和を行った。大過剰量の水に対して透析精製し（スペクトラポア７、ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００ダルトン）、限外ろ過後、凍結乾燥して標題のアミノ基が導入されたヒアルロン酸１１０ｍｇを得た。得られたＨＡ−ＡＭのＤ_２Ｏ中でのＮＭＲスペクトル測定結果を図１７に示す。

ＨＺ基導入率をＡＭ導入率としてプロトンＮＭＲ法で定量したところ、ＨＡユニット（２糖）に対して９４．０％であった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ、ＡＭ：ＥＤＡ由来の１つのメチレンプロトン、２．９８ｐｐｍ）。なお、ＮＭＲ測定はＮＭＲ分光計としてＪＮＭ−ＥＣＡ５００（５００ＭＨＺ分光計）を使用し、実施例４−１と同様の条件（パラメーター）で測定を行なった。
（実施例５−２）ＡＭ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）の合成−２
ＴＢＡ塩化したＨＡ−ＴＢＡ（ＨＡ：電気化学工業株式会社：粘度平均分子量２００ｋダルトン）を用い、ＨＡのユニット：ＢＯＰ：エチレンジアミン（ＥＤＡ）＝１：１．０８：５０のモル比以外は実施例５−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）を得た。プロトンＮＭＲ法（測定溶媒：Ｄ_２Ｏ）で定量したところ、ＨＡユニット（２糖）に対して６８．０％であった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８９ｐｐｍ、ＨＺ：ＡＭ由来の１つのメチレンプロトン、３．００ｐｐｍ）。
（実施例５−３）ＡＭ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）の合成−３
ＨＡのユニット：ＢＯＰ：２，２−（エチレンジオキシ）ビス（エチルアミン）（ＥＤＯＢＥＡ）（シグマ−アルドリッチ社製）＝１：１．０：５０のモル比以外は実施例５−１と同様の方法で、アミノ基が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ）を得た。プロトンＮＭＲ法（測定溶媒：Ｄ_２Ｏ）で定量したところ、ＨＡユニット（２糖）に対して５８．０％であった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８９ｐｐｍ、ＨＺ：ＡＭ由来の１つのメチレンプロトン、３．０５ｐｐｍ）。
（実施例５−４）ＨＡ−ＡＭの酵素耐性評価
実施例５−１〜５−３で得られたＨＡ−ＡＭを２ｍｇ／ｍＬ濃度に水に溶解した。この溶液５５μＬに０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２）１３２μＬおよび水７７μＬを加え、ヒアルロニダーゼＳＤ（生化学工業株式会社製）１Ｕ／ｍＬ溶液（０．０１％ＢＳＡを含む０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ６．２））４４μＬを加えて３７℃で２４時間インキュベートした。対象として酵素非添加群も同様に行った（データ省略）。それぞれゲル浸透クロマトグラフィー（以下、ＧＰＣとも称す）に供してＨＡ−ＡＭの分子量の変化、分解産物の生成パターンを観察した。なお、ＧＰＣは実施例４−２と同様の条件（パラメーター）で測定を行なった。

酵素分解産物のＧＰＣプロファイルを図１８に示した。本検討におけるＧＰＣ条件下、酵素分解産物である２糖は、保持時間およそ１３０分に観察される。実施例５−１〜５−３で得られた試料は、酵素分解による分子量の低下が著しく抑制されたことが示された。
〔実施例６〕ＰＬＡが導入されたヒアルロン酸の合成・溶解性評価
（実施例６−１）ＨＺ基の導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ）のＴＢＡ塩化
実施例４−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＨＺ １０００ｍｇを１０００ｍＬの蒸留水に溶かし（０．１％濃度）、Ｈ型にしたカチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８−４００、２．１ｍｅｑ／ｇ）３７．５ｍＬを添加（ＨＡのカルボキシル基の１００倍のイオン交換能）室温で１晩放置した。上澄みを回収、０．２２μｍフィルターで濾過した後、４０ｗｔ％ＴＢＡ−ＯＨ水溶液を１．８５μＬ添加することで、ｐＨ７．０に調整し、得られた水溶液を凍結乾燥することでＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺの白色粉末を得た。収量は９３２．８ｍｇであった。
（実施例６−２）ＰＬＡ（粘度平均分子量５ｋダルトン）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）の合成
ＰＬＡ濃度２５ｍｇ／ｍＬ、ＰＬＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ＝１／１／１（モル比）となるように、ＰＬＡ−０００５（和光純薬工業：粘度平均分子量５ｋダルトン、数平均分子量２．８３ｋダルトン）、ＥＤＣ、ＮＨＳを無水ＤＭＳＯに溶かし、密栓下、室温で３時間攪拌することで、ＰＬＡの末端カルボキシル基を活性エステル化した。一方で、実施例６−１で調製したＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺを５ｍｇ／ｍＬになるように無水ＤＭＳＯに溶かした。ＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ溶液に無水ＤＭＳＯ、活性エステル化ＰＬＡ溶液を表２（ａ〜ｊ）に示す割合で順に添加し（最終的なＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ濃度、１．５ｍｇ／ｍＬ）、これらを混合、密栓下、室温で１晩攪拌した。この反応液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、室温、３日間）を行い、得られた白濁溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥物を過剰のアセトンで洗浄、次に過剰のエタノールで洗浄し不溶物を減圧乾燥しＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末を得た。ＤＭＳＯを溶媒にした時のＧＰＣクロマトグラムを図１９に示す。ＧＰＣの条件は以下に示す通りである。
ＧＰＣ条件
ＧＰＣカラム： ＧＭＨＨＲ−Ｈ（ＴＯＳＯＨ製）
移動相： １０ｍＭ ＮａＮＯ_３（ｐＨ７．４）
溶出モード： Ｉｓｏｃｒａｔｉｃ
流速： １．０ｍＬ／分
サンプル注入量： ５０μＬ
検出器： ＵＶ、Ａｂｓ． ａｔ ２８０ｎｍ
サンプル濃度：５．０ｍｇ／ｍＬ
ピーク位置が高分子側にシフトしていたことからＰＬＡが導入されたことで分子量が増加したことが示唆された。得られたＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡのＤＭＳＯ−ｄ_６中でのプロトンＮＭＲを図２０に示す。ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法で定量したところ表３に示すように、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して１．０〜４６．１％であった。またＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は５．７〜７３．４％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。

（実施例６−３）ＰＬＡ（粘度平均分子量２０ｋダルトン）が導入されたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）の合成
実施例６−２のＰＬＡ−０００５をＰＬＡ−００２０（和光純薬工業：粘度平均分子量２０ｋダルトン、数平均分子量８．７３ｋダルトン）に変更、ＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ溶液と無水ＤＭＳＯ、活性エステル化ＰＬＡ溶液の混合比を表４（ｋ〜ｔ）に変更し、その他は実施例６−２と同様の方法でＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末を得た。このときのＧＰＣクロマトグラムを図２１に、プロトンＮＭＲを図２２に示す。ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ表５に示すように、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して０．９〜１２．８％であった。またＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は１３．５〜６９．９％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。

（実施例６−４）ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの水およびＤＭＳＯにおける分散性または溶解性
実施例４−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＨＺ、実施例６−２、および実施例６−３において合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末をそれぞれ約５ｍｇ秤取し、５ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水を添加し、室温で一晩攪拌した。攪拌を停止し、その後３日間室温において静置したときの外観を目視によって確認した結果を表６に示す。この結果、ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡはＰＬＡの重量比５．７〜１９．６％ｗ／ｗの範囲において、水へ均一に分散しやすく、これ以上のＰＬＡ重量比においては、水に分散しにくいことが示唆された。さらに、沈殿物が見られなかったものについては、それぞれの溶液を遠心（１５００ｇ、１０分）したころＨＡ−ＨＺ水溶液を除いて、全て白色の沈殿物が見られた。この結果、ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡは実施例６−２および６−３で実施した範囲（ＰＬＡの重量比５．７〜７３．４％ｗ／ｗ）において水中に溶解しにくく、また分散してもその分散安定性は低いことが示唆された。

次に、実施例４−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＨＺ、実施例６−２、および実施例６−３において合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末をそれぞれ約５ｍｇ秤取し、５ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、室温で一晩攪拌した。そのときの溶解性を目視によって確認した結果を表６に示す。その結果、ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡは、少なくともＰＬＡの重量比５．７〜７３．４％ｗ／ｗの範囲においてＤＭＳＯに溶解性を持つことが示唆された。

（実施例６−５）溶媒置換によるＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの水への可溶化
実施例４−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＨＺ、実施例６−２、および実施例６−３において合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末をそれぞれ約５ｍｇ秤取し、５ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯに溶解した。このＤＭＳＯ溶液０．６ｍＬを２．４ｍＬの蒸留水に混合し、さらに蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、室温、３日間）したところ、得られた水溶液はすべて無色透明溶液であった。この水溶液を遠心（４００００ｇ、１０分）したところ沈殿物は見られなかった。この結果、ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡはＰＬＡの重量比５．７〜７３．４％ｗ／ｗの範囲において、いったんＤＭＳＯに溶解させ、その後溶媒を水に置換することで水に溶解させることができることが示唆された。
〔実施例７〕ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ（ＰＬＧＡ）微粒子調製法検討のためのＰＬＡが導入されたヒアルロン酸修飾物の合成
（実施例７−１）インタクトＨＡの機能を残存させたＨＡ−ＨＺの合成
ＨＡ（電気化学工業株式会社：粘度平均分子量２３ｋダルトン）１０１２．７ｍｇを、０．１％濃度で蒸留水／ＥｔＯＨ＝５０／５０に溶解した。ＨＡのユニット：ＥＤＣ：ＡＤＨ＝１：０．１：４０モル比になるよう添加し、５Ｎ塩酸でｐＨを４．７〜４．８に保ちながら室温で２時間反応させた。大過剰量の１００ｍＭ塩化ナトリウム溶液、２５％エタノール溶液、蒸留水に対して順に透析（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００）した。ＨＺ基導入率測定用に１０ｍＬほど凍結乾燥した。ＨＺ基導入率をＡＤＨ導入率としてプロトンＮＭＲ法（測定溶媒：Ｄ_２Ｏ）で定量したところ、ＨＡユニット（２糖）に対して、９．０％であった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ、ＨＺ：ＡＤＨ由来の４つのメチレンプロトン、１．５、２．１および２．２５ｐｐｍ）。
（実施例７−２）インタクトＨＡの機能を残存させたＨＡ−ＨＺのＴＢＡ塩化
実施例７−１で調製したＨＡ−ＨＺ水溶液（約０．１％濃度）に、Ｈ型にしたカチオン交換樹脂（Ｄｏｗｅｘ ５０ＷＸ８−４００、２．１ｍｅｑ／ｇ）５０ｍＬを添加、室温で１晩放置した。上澄みを回収、０．２２μｍフィルターで濾過した後、４０ｗｔ％ ＴＢＡ−ＯＨ水溶液を１１５０μＬ添加することで、ｐＨ７．０に調整し、得られた水溶液を凍結乾燥することでＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺの白色粉末を得た。収量は１１１３．６ｍｇであった。
（実施例７−３）ＰＬＡ（５ｋダルトン）が導入されたインタクトＨＡの機能を残存させたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）の合成
実施例７−２で調製したＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺを用い、実施例６−２のＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ溶液と無水ＤＭＳＯ、活性エステル化ＰＬＡ溶液の混合比を表７に変更し、その他は実施例６−２と同様の方法でＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末を得た。ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して８．０％であった。またＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は３６．７％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。
（実施例７−４）ＰＬＡ（２０ｋダルトン）が導入されたインタクトＨＡの機能を残存させたヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）の合成
実施例７−２で調製したＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺを用い、実施例６−２のＰＬＡ−０００５をＰＬＡ−００２０に変更、ＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ溶液と無水ＤＭＳＯ、活性エステル化ＰＬＡ溶液の混合比を表７に変更し、その他は実施例６−２と同様の方法でＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末を得た。ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して１．９％であった。またＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は２９．５％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。
（実施例７−５）ＰＬＡ（５ｋダルトン）が低い導入率で導入されたステルス性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）の合成
実施例６−１と同様の方法で調製したＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺを用い、実施例６−２のＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ溶液と無水ＤＭＳＯ、活性エステル化ＰＬＡ溶液の混合比を表７に変更し、その他は実施例６−２と同様の方法でＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末を得た。ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して４．５％であった。またＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は２１．１％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。
（実施例７−６）ＰＬＡ（５ｋダルトン）が高い導入率で導入されたステルス性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）の合成
実施例６−１と同様の方法で調製したＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺを用い、実施例６−２のＴＢＡ塩化ＨＡ−ＨＺ溶液と無水ＤＭＳＯ、活性エステル化ＰＬＡ溶液の混合比を表７に変更し、その他は実施例６−２と同様の方法でＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡの白色粉末を得た。ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して３０．９％であった。またＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は６５．１％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。

（実施例７−７）ＰＬＡ（５ｋダルトン）が高い導入率で導入されたステルス性ヒアルロン酸（ＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡ）の合成
実施例５−１と同様の方法で得られたＨＡ−ＡＭのＤＭＳＯ溶液をＤＭＳＯ １Ｌに対して透析を４回行い（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、室温）未反応ＥＤＡ、ＢＯＰ等の不純物を除去した。

また、ＰＬＡ濃度１０ｍｇ／ｍＬ、ＰＬＡ／ＥＤＣ／ＮＨＳ＝１／１／１（モル比）となるように、ＰＬＡ−０００５（和光純薬工業：粘度平均分子量５ｋダルトン、数平均分子量２．８３ｋダルトン）、ＥＤＣ、ＮＨＳを無水ＤＭＳＯに溶かし、室温で２０分攪拌することで、ＰＬＡの末端カルボキシル基を活性エステル化した。

この活性エステル溶液をＨＡ−ＡＭのアミノ基に対してカルボン酸が２倍量となるように添加し、室温で１晩撹拌した。

この反応液をＤＭＳＯに対して透析（ＭＷＣＯ：１２０００−１４０００、室温、２日間）を４回、水に対して５回行い、得られた白濁溶液を凍結乾燥した。この凍結乾燥物を過剰のアセトンで洗浄、次に過剰のエタノールで洗浄し不溶物を減圧乾燥しＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡの白色粉末３６５．１ｍｇを得た。

得られたＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡのＤＭＳＯ−ｄ_６中でのプロトンＮＭＲを図２３に示す。ＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡ中のＰＬＡ導入率をＮＭＲ法（測定溶媒：ＤＭＳＯ−ｄ_６）で定量したところ、ＰＬＡの分子量分布が原料と導入されたもので変わらないと仮定した場合、ＨＡユニット（２糖）に対して８７．２％であった。またＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡ分子中のＰＬＡの重量比は８６．１％ｗ／ｗであった（ＨＡ：Ｎ−アセチル基のメチルプロトン、１．８５ｐｐｍ；ＰＬＡ：カルボニル基のα位のメチンプロトン（ただし、ＯＨ末端は除く）、５．０−５．６ｐｐｍ）。
〔実施例８〕ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ（ＰＬＧＡ）微粒子調製法検討のためのＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液の調製
（実施例８−１）ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液の調製
実施例７−３において合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを２５０ｍｇ秤取し、４０ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水を添加し、室温で一晩攪拌することで、溶解させた。得られた水溶液はうっすら白色を呈した透明溶液であった。
（実施例８−２）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液の調製−１
実施例７−４で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを２５０ｍｇ秤取し、５．０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、溶解させた。これを加えたＤＭＳＯの４倍量の蒸留水に対して混合した後、蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、１日間）した。得られた水溶液は無色透明溶液であった。この水溶液を５．０μｍのフィルターで濾過した後、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０ ＭＷＣＯ：１００００、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）により濃縮した。濃度定量は、得られた濃縮溶液２００μＬを凍結乾燥し、乾燥粉末の重量を測定することによって行ったところ５．７ｍｇ／ｍＬであり、さらに２．０ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水を添加し、よく混合した。
（実施例８−３）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液の調製−２
実施例７−５で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを１５０ｍｇ秤取し、５．０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、溶解させた。これを加えたＤＭＳＯの４倍量の蒸留水に対して混合した後、蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。得られた水溶液は無色透明溶液であった。この水溶液を５．０μｍのフィルターで濾過した後、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０ ＭＷＣＯ：１００００、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）により濃縮した。濃度定量は、得られた濃縮溶液２００μＬを凍結乾燥し、乾燥粉末の重量を測定することによって行ったところ、７．２ｍｇ／ｍＬであり、さらに２．０ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水を添加し、よく混合した。
（実施例８−４）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液の調製−３
実施例７−６で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを１５０ｍｇ秤取し、５．０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、溶解させた。これを加えたＤＭＳＯの４倍量の蒸留水に対して混合した後、蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。得られた水溶液は無色透明溶液であった。この水溶液を５．０μｍのフィルターで濾過した後、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０ ＭＷＣＯ：１００００、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）により濃縮した。濃度定量は、得られた濃縮溶液２００μＬを凍結乾燥し、乾燥粉末の重量を測定することによって行ったところ、６．５ｍｇ／ｍＬであり、さらに２．０ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水を添加し、よく混合した。
（実施例８−５）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡ水溶液の調製
実施例７−７で合成したＨＡ−ＡＭ−ＰＬＡを２０ｍｇ秤取し、５．０ｍｇ／ｍＬになるようにＤＭＳＯを添加し、溶解させた。これを加えたＤＭＳＯの４倍量の蒸留水に対して混合した後、蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。得られた水溶液は無色透明溶液であった。この水溶液を５．０μｍのフィルターで濾過した後、限外濾過（Ｖｉｖａｓｐｉｎ２０ ＭＷＣＯ：１００００、Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）により濃縮した。濃度定量は、得られた濃縮溶液２００μｌを凍結乾燥し、乾燥粉末の重量を測定することによって行ったところ、１０．４ｍｇ／ｍＬであり、さらに２．０ｍｇ／ｍＬになるように蒸留水を添加し、よく混合した。
〔実施例９〕ＣＤ４４へのターゲティングを目的としたヒアルロン酸被覆ＰＬＡ（ＰＬＧＡ）微粒子の調製
（実施例９−１）ＤＭＳＯ透析法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製
実施例７−４で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを１２ｍｇ、ＰＬＡ−０００５を１０８ｍｇ秤取し、３ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これを蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）、透析液を３２μｍのふるいにかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５３．２ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１５３μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．２９％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、１．０±０．１μｍであった。
（実施例９−２）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−１
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）、透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は１４０ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は６０μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．４３％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は２２５．３ｎｍであった。
（実施例９−３）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−２
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２３．９ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２２μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．０９％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は３０８．９ｎｍであった。
（実施例９−４）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−３
実施例７−４で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを４ｍｇ、ＰＬＡ−０００５を３６ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）し、透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は３．７ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は７０μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１．８９％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は２８８．２ｎｍであった。
（実施例９−５）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−４
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）、透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は１６．７ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．０１％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は２２０．２ｎｍであった。
（実施例９−６）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−５
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２６．３ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は７μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．０３％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は１９６．９ｎｍであった。
（実施例９−７）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−１
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は１４．５ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１０４μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．７２％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は３６７．８ｎｍであった。
（実施例９−８）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−２
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２０．１ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は９９μｇ微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．４９％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は３３６．９ｎｍであった。
（実施例９−９）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−３
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２０．９ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．０９％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は３２８．３ｎｍであった。
（実施例９−１０）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の調製−４
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２２．９ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２７μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．１２％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は３２８．１ｎｍであった。
（実施例９−１１）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の調製−１
ＰＬＧＡ−７５２０（和光純薬工業：粘度平均分子量２０ｋダルトン、Ｌａｃｔｉｄｅ比７５％ｍｏｌ／ｍｏｌ）を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、回転式ホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ３１００）を用いて乳化（１００００ｒｐｍ、５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３２μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は６２．１ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は６７５μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１．０９％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、２．７±１．１μｍであった。
（実施例９−１２）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の調製−２
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、回転式ホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ３１００）を用いて乳化（１００００ｒｐｍ、５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３２μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物として得られたＰＬＧＡ微粒子と実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、１５分ほど攪拌した後、再度、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は６１．３ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１４０μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．２３％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、１．２±０．２μｍであった。
（実施例９−１３）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の調製−３
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、回転式ホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ３１００）を用いて乳化（１００００ｒｐｍ、５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３２μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５５．０ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２５１μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．４６％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、３．０±１．２μｍであった。
（実施例９−１４）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の調製−４
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、回転式ホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ３１００）を用いて乳化（１００００ｒｐｍ、５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３２μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物として得られたＰＬＧＡ微粒子と実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、１５分ほど攪拌した後、再度、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５６．３ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は６０８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１．０８％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、１．７±０．４μｍであった。
〔比較例２〕ＰＬＧＡ微粒子の調製
（比較例２−１）エマルション液中乾燥法によるＰＬＧＡ微粒子の調製
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを１８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、回転式ホモジナイザー（ポリトロン ＰＴ３１００）を用いて乳化（１００００ｒｐｍ、５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３２μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５７．３ｍｇであった。粒径の測定は、ヒＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、１．７±０．３μｍであった。

〔実施例１０〕血中滞留性延長、腫瘍組織、炎症組織への集積性を目的としたヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製
（実施例１０−１）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−１
実施例７−６で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを４ｍｇ、ＰＬＡ−０００５を３６ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）し、透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２７．８ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２１７８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、７．８２％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）することによって行ったところ、３０４．０ｎｍであった。
（実施例１０−２）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−２
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−３において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）、透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２４０ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１２５７μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、５．２４％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）することによって行ったところ、１６６．９ｎｍであった。
（実施例１０−３）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−３
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−３において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２６．６ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は８４１μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、３．１６％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）することによって行ったところ、１９８．３ｎｍであった。
（実施例１０−４）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−４
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−４において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）、透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は３５．０ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は３５８１μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１０．２３％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は１８３．５ｎｍであった。
（実施例１０−５）ＤＭＳＯ溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−５
ＰＬＡ−０００５を４０ｍｇ秤取し、１ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これをスターラー攪拌下、４ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、得られた混合溶液を蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）した。透析液を５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−４において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液４ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は２８．２ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は３４２μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１．２１％ｗ／ｗ）であった。透析液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は７０．４ｎｍであった。
（実施例１０−６）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−１
ＰＬＡ−０００５を１０ｍｇ秤取し、２ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−３において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液２ｍＬに滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は７．９ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は８８２μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１１．１５％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は１９８．３ｎｍであった。
（実施例１０−７）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−２
ＰＬＡ−０００５を１０ｍｇ秤取し、２ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、２ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−３において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液２ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は３６ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１３７μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、３．８３％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は１９５．６ｎｍであった。
（実施例１０−８）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−３
ＰＬＡ−０００５を１０ｍｇ秤取し、２ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例８−４において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液２ｍＬに滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は７．２ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１０６３μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１４．８５％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は１６３．１ｎｍであった。
（実施例１０−９）アセトン溶媒拡散法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアの調製−４
ＰＬＡ−０００５を１０ｍｇ秤取し、２ｍＬのアセトンに溶解させた。これをスターラー攪拌下、２ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。５．０μｍのフィルターで濾過し凝集塊を除去した後、実施例８−４において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液２ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、遠心（４００００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は７．９ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は３９８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、５．０４％ｗ／ｗ）であった。エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）を行い、粒径の測定値は１８２．１ｎｍであった。

〔実施例１１〕局所刺激低減を目的としたヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
（実施例１１−１）透析法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−１
実施例９−１と同様の手順で調製した。
（実施例１１−２）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−１
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５２．４ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．０５％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、６．８±３．６μｍであった。
（実施例１１−３）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−２
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物として得られたＰＬＧＡ微粒子と実施例８−１において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、１５分ほど攪拌した後、再度、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５８．８ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１８８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．３２％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、７．４±２．７μｍであった。
（実施例１１−４）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−３
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５５．４ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は８３μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．１５％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、６．８±３．３μｍであった。
（実施例１１−５）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−４
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物として得られたＰＬＧＡ微粒子と実施例８−２において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、１５分ほど攪拌した後、再度、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は６０．８ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は８３μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．１４％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、７．８±５．４μｍであった。
（実施例１１−６）透析法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−１
実施例７−６で合成したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡを１２ｍｇ、ＰＬＡ−０００５を１０８ｍｇ秤取し、３ｍＬのＤＭＳＯに溶解させた。これを蒸留水に対して透析（ＭＷＣＯ：１００００、室温、３日間）、透析液を３２μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は９１．７ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２５６０μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、２．７９％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、１．６±０．４μｍであった。
（実施例１１−７）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−５
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを実施例８−３において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５８０ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は２６１μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．４５％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、６．１±６．２μｍであった。
（実施例１１−８）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−６
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物として得られたＰＬＧＡ微粒子と実施例８−３において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、１５分ほど攪拌した後、再度、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５８．６ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は１５８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．２７％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、７．７±５．７μｍであった。
（実施例１１−９）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−７
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを実施例８−４において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５７．５ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は３０６８μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、５．３４％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、６．９±３．５μｍであった。
（実施例１１−１０）エマルション液中乾燥法によるヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製−８
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物として得られたＰＬＧＡ微粒子と実施例８−４において調製したＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液８ｍＬと混合し、１５分ほど攪拌した後、再度、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は６５．０ｍｇであった。この白色粉末を過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し不溶物（ＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ）を減圧乾燥したところ、その重量は３９０μｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、０．６０％ｗ／ｗ）であった。粒径の測定は、ヒアルロン酸被覆ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、５．６±２．３μｍであった。
〔比較例３〕ＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
（比較例３−１）エマルション液中乾燥法によるＰＬＧＡマイクロスフィアの調製
ＰＬＧＡ−７５２０を８０ｍｇ秤取し、２ｍＬの塩化メチレンに溶解させた。これを１８ｍＬの１％ｗ／ｖ ＰＶＡ水溶液と混合し、メカニカルスターラー（ＥＹＥＬ４、ＭＡＺＥＲＡ Ｚ）を用いて乳化（４００ｒｐｍ、１５分）した。この乳濁液を開放系で一晩スターラーで攪拌することで、塩化メチレンを除去した。３００μｍのふるいをかけ凝集塊を除去した後、遠心（１５００ｇ、１０分）、上澄み除去、蒸留水添加、といった洗浄操作を３回ほど繰り返し、沈殿物（ＰＬＧＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は５３．９ｍｇであった。こ粒径の測定は、ＰＬＧＡ微粒子の白色粉末を蒸留水に対して再分散させ、光学顕微鏡観察により無作為に５０個の微粒子を抽出し画像解析することによって、その平均値および標準偏差を求めたところ、５．３±２．５μｍであった。

〔実施例１２〕ヒアルロン酸被覆ＰＬＡナノスフィアへのパクリタキセル（ＰＴＸ）封入
（実施例１２−１）アセトン溶媒拡散法による調製−１
パクリタキセル（以下、ＰＴＸとも称す）（Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．Ｌｏｔ Ｎｏ．１５０２０６６０２−１）１０ｍｇを秤取し２ｍＬのアセトンに溶解させた。ＰＬＡ−０００５を９．０ｍｇ秤取し、ＰＴＸのアセトン溶液に添加して溶解させた。これをスターラー攪拌下、実施例７−６と同様の方法で合成し実施例８−４と同様の方法で得たＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液２ｍＬに滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。その後、脱塩カラム（ＰＤ−１０）による精製を行い、遠心（４００００ｇ、１０分）、沈殿物（ＰＴＸ封入ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は８．３ｍｇであった。粒径の測定は、エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）することによって行ったところ、９９．０±４１．３ｎｍであった。得られた白色粉末６．８ｍｇを秤取し、過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し減圧乾燥したところ、その重量は１．３ｍｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１９．１％ｗ／ｗ）であった。

ＰＴＸの定量は、逆相クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）を用いた内標準物質（ＩＳ）法によって行った。ＩＳ溶液は、約０．７ｍｇ／ｍＬ ｎ−ヘキシル−ｐ−ハイドロキシベンゾエートのアセトニトリル溶液を調製した。検量線作成のための標準溶液は１０ｍｇ／ｍＬのＰＴＸアセトニトリル溶液の５倍希釈列（８列）を調製した。また、ＰＴＸ封入ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子の白色粉末を１．５ｍｇ秤取し、１ｍＬのアセトニトリルを添加、よく攪拌した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みをＰＴＸ濃度定量用溶液として用いた。標準溶液およびＰＴＸ濃度定量用溶液４００μＬに対してＩＳ溶液２５μＬの割合で混合し、ＲＰ−ＨＰＬＣ測定を行ったところ、ナノスフィア中のＰＴＸ含量は９．９％ｗ／ｗであった。ＲＰ−ＨＰＬＣの測定条件を以下に示す。
ＲＰ−ＨＰＬＣ条件
カラム： Ｃａｄｅｎｚａ−Ｃ−１８Ｃ（Ｉｍｔａｋｔ）
流速： ０．７５ｍＬ／分
溶出液：
Ａ：ＭｅＣＮ、Ｂ：超純水（ＭｉｌｌｉＱ水）
Ａ：Ｂ＝
５０：５０（０−１０分、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
５０：５０→０：１００（１０−１２分、ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）
０：１００（１２−１９分、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）
０：１００→５０：５０（１９−２０分、ｌｉｎｅａｒ ｇｒａｄｉｅｎｔ）
５０：５０（２０−２５分、ｉｓｏｃｒａｔｉｃ）計２５分
検出器： ＵＶ（２３０ｎｍ）
カラム温度： ４０℃
サンプル温度： ４℃
サンプル注入量： １０μＬ
（実施例１２−２）アセトン溶媒拡散法による調製−２
ＰＴＸ１０ｍｇを秤取し２ｍＬのアセトンに溶解させた。ＰＬＡ−０００５を９．０ｍｇ秤取し、ＰＴＸのアセトン溶液に添加して溶解させた。これをスターラー攪拌下、２ｍＬの蒸留水に対して滴下・混合し、１５分ほど攪拌した後、得られた混合溶液をエバポレーションすることによってアセトンを除去した。その後、実施例７−６と同様の方法で合成し実施例８−４と同様の方法で得たＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ水溶液２ｍＬに滴下・混合、１５分ほど攪拌した後、脱塩カラム（ＰＤ−１０）による精製を行い、遠心（４００００ｇ、１０分）、沈殿物（ＰＴＸ封入ヒアルロン酸被覆ＰＬＡ微粒子）を回収し凍結乾燥した。得られた白色粉末の収量は８．４ｍｇであった。粒径の測定は、エバポレーション後の溶液についてＤＬＳ測定（Ｎｉｃｏｍｐ３７０）することによって行ったところ、１４２．７±４４．４ｎｍであった。得られた白色粉末６．９ｍｇを秤取し、過剰のアセトンでよく洗浄した後、遠心（１００００ｇ、１０分）、上澄みを除去し減圧乾燥したところ、その重量は０．７ｍｇ（微粒子中のＨＡ−ＨＺ−ＰＬＡ比、１０．７％ｗ／ｗ）であった。ＰＴＸの定量は、実施例１２−１と同様の方法で行ったところナノスフィア中のＰＴＸ含量は９．９％ｗ／ｗであった。

本発明の、ヒアルロン酸またはその誘導体と、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択されるポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物により、低分子薬物を効率良く封入し、長期に徐放期間を制御でき、血中滞留性が制御でき、水溶液中での分散性が良く、安全性に問題の無い薬物担体が提供される。また、本発明ヒアルロン酸修飾物により、粒子間の凝集の少ないインジェクタブルな微粒子からなる生体適合性に優れた薬物担体が提供される。

Claims (23)

1. ヒアルロン酸誘導体と、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーとが結合したヒアルロン酸修飾物であって、
   前記ヒアルロン酸誘導体が、式（ＩＩ）：
   

   

   （式中、Ｒ _１ 、Ｒ _２ 、Ｒ _３ およびＲ _４ は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ _１−６ アルキル基およびＣ _１−６ アルキルカルボニル基から選択され、
   ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ _１−６ アルキル基から選択され、
   Ａは、単結合、−（ＣＨ _２ ） _ｍ −、−ＣＨ _２ −ＣＨ _２ −（Ｏ−ＣＨ _２ −ＣＨ _２ ） _ｍ −または−ＮＨＣＯ−（ＣＨ _２ ） _ｎ −ＣＯＮＨ−であり、
   ｍは１〜１０の整数であり、ｎは、０〜１０の整数である）
   で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、前記ヒアルロン酸修飾物。
2. 式（Ｉ）：
   

   

   （式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３およびＲ_４は、それぞれ独立に、水素原子、Ｃ_１−６アルキル基およびＣ_１−６アルキルカルボニル基から選択され、
   ＲａおよびＲｂは、それぞれ独立に、水素原子およびＣ_１−６アルキル基から選択され、
   Ｑは、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および乳酸・グリコール酸共重合体から選択されるポリマーであり、該ポリマーは末端のカルボキシル基で窒素原子とアミド結合を形成しており、
   Ａは、単結合、−（ＣＨ_２）_ｍ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｍ−または−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−であり、
   ｍは１〜１０の整数であり、ｎは、０〜１０の整数である）
   で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含む、請求項１に記載のヒアルロン酸修飾物。
3. ＲａおよびＲｂが共に水素原子であり、Ａが−（ＣＨ_２）_ｍ−、−ＣＨ_２−ＣＨ_２−（Ｏ−ＣＨ_２−ＣＨ_２）_ｍ−または−ＮＨＣＯ−（ＣＨ_２）_ｎ−ＣＯＮＨ−である、請求項２に記載のヒアルロン酸修飾物。
4. ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のヒアルロン酸修飾物。
5. 哺乳動物において１８時間以上の平均血中滞留時間を有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のヒアルロン酸修飾物。
6. 前記ヒアルロン酸誘導体が、ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有するものである請求項１〜５のいずれか１項に記載のヒアルロン酸修飾物。
7. 前記ヒアルロン酸誘導体が、哺乳動物において１８時間以上の平均血中滞留時間を有する、請求項１〜３および６のいずれか１項に記載のヒアルロン酸修飾物。
8. 請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸修飾物を含む薬物担体。
9. 微粒子状である請求項８に記載の薬物担体。
10. 粒子径が２００μｍ以下である請求項９に記載の薬物担体。
11. ＨＡレセプターへのターゲティング能を有する請求項８〜１０のいずれか１項に記載の薬物担体。
12. ヒアルロニダーゼによる分解に対して耐性を有する請求項８〜１１のいずれか１項に記載の薬物担体。
13. 局所刺激性が低減されている請求項８〜１２のいずれか１項に記載の薬物担体。
14. 粘膜付着性を有する請求項８〜１３のいずれか１項に記載の薬物担体。
15. 請求項８〜１４のいずれか１項に記載の薬物担体および薬物を含む医薬組成物。
16. さらにポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択される１以上のポリマーを含む、請求項１５に記載の医薬組成物。
17. 前記ポリマーが、ヒアルロン酸修飾物に結合しているポリマーと同種のものである請求項１６に記載の医薬組成物。
18. 前記薬物が、前記ヒアルロン酸修飾物が形成する微粒子により封入されている請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の医薬組成物。
19. 水溶液中で前記ヒアルロン酸修飾物のポリマー部分が形成する疎水性コアを、ヒアルロン酸部分が被覆する形状の微粒子を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 前記薬物が、前記のヒアルロン酸修飾物のポリマー部分により形成される疎水性コア部分に封入されている、請求項１９に記載の医薬組成物。
21. 水溶液中で前記ヒアルロン酸修飾物のポリマー部分および／または前記ポリマーが形成する疎水性コアを、ヒアルロン酸部分が被覆する形状の微粒子を含む、請求項１５〜１８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
22. 前記薬物が、前記のヒアルロン酸修飾物のポリマー部分および／またはポリマーにより形成される疎水性コア部分に封入されている請求項２１に記載の医薬組成物。
23. 末端にカルボキシル基を有するポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸・グリコール酸共重合体から選択されるポリマーと、式（ＩＩ）：
    

    

    （式中、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒａ、ＲｂおよびＡは、請求項１に定義した通りである）
    で表される繰り返し構造を分子内に少なくとも１以上含むヒアルロン酸誘導体とを反応させる工程を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のヒアルロン酸修飾物の製造方法。

Images