JP4888876B2 - アルツハイマー病の治療のための組換えアデノ随伴ウィルスベクター - Google Patents
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Description
本発明は、アルツハイマー病に対して用いることが可能なＡβペプチドを発現するアデノ随伴ウィルスベクターおよびその医薬品としての使用に関する。
アルツハイマー病は、脳における老人斑、神経原繊維変化、ならびに神経細胞の変化および脱落により特徴づけられる。特に老人斑に沈着するβアミロイドは、アルツハイマー病の病態形成の中心的役割を果たしていると考えられている。このβアミロイド体の主成分であるβアミロイドペプチド (Ａβ)は、神経細胞内のβ−アミロイド前駆体タンパク質 (βＡＰＰ)がβ,γ-分泌酵素によって部分的に分解されることにより生成される。
近年、家族型アルツハイマー病変異を有するヒトアミロイド前駆体タンパク質を強発現するトランスジェニックマウスに対し、アジュバントと共にＡβペプチドを免疫投与することによって、老人斑の形成が抑制され、既に形成されている老人斑も減少することが報告されている（非特許文献1：Schenk D, Barbour R, Dunn W et al.:Nature 400:173-177, 1999）。
上記作用の機序としては、現在３つの説がある。第一の説は、Ａβペプチドを投与しＡβに対する抗体を体内で産生させ、老人斑の中の凝集したＡβに抗体が結合し、それをミクログリアが貪食することにより、老人斑が除去され、分泌されたＡβにも抗体が結合してミクログリアが貪食し、Ａβの神経細胞への毒性を抑え、痴呆の改善などの治療に結びつくという説である。第二の説は、Ａβペプチドを投与することによってＡβに対して産生された抗体は、ＡβのＮ末端のアミノ酸を認識して結合し、凝集・不溶化したＡβを可溶化し、さらに分泌されたＡβの凝集・沈着を抑制することにより、アミロイド沈着を減少させるという説である。第三の説は、Ａβに対する抗体は、血液脳関門を越えず、末梢血・末梢組織においてＡβを減少させることにより、中枢神経系からＡβを末梢に引き出すというｓｉｎｋ説である。
上記の仮説に基づき、ウィルスベクターを用いたアルツハイマー病の予防法および治療法の開発も試みられている。例えば、アデノウィルスベクターにＡβｃＤＮＡを組み込み、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに経口投与することによって、マウス上部消化管組織にＡβを発現させることが可能であり、さらに、このマウスの血清中の抗Ａβ抗体は、in vitroにおいてＡβペプチドの凝集を阻害することが報告されている（非特許文献２：田平 武、原 英夫著、平成１３年度 厚生化学研究「２１世紀型医療開拓推進研究（痴呆分野）研究成果発表報告書」、財団法人 長寿科学振興財団出版、平成１４年３月、ｐ．４９−５４）。しかし、この報告では、in vivo実験は行われておらず、動物における治療効果は確認されていない。
また、サイトカインであるＴＧＦ−β１（Transforming growth factor β１)は、血管内皮細胞での炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β（Interleukin−１β)、ＴＮＦ−α（Tumor necrosis factor−α）など）の産生を促進することが知られている。そして、近年、ＴＧＦ−β１は、脳血管へのアミロイド沈着や、極小血管の変性など、アルツハイマー病と関連する病理変化を促進することが報告されている（非特許文献３；Wyss-Coray, T. et al.: Amyloidogenic role of cytokine TGF-β1 in transgenic mice and Alzheimer’s disease: Nature 389: 603-606, 1997、および非特許文献４；Wyss-Coray, T. et al.： Chronic overproduction of transforming growth factor-β1 by astrocytes promotes Alzheimer's disease-like microvascular degeneration in transgenic mice： Am. J. Pathol. 156： 139-150, 2000）。
アルツハイマー病の治療剤には、中枢神経系での老人斑の形成およびアミロイドの沈着を抑制することが必要とされ、同時に、多臓器への拡散がないこと、脳炎などの副作用を起こさないことなど、安全性も求められる。しかし、これらの条件を満たす、Ａβ抗原を利用した治療剤は、これまで報告されていない。
Schenk D, Barbour R, Dunn W et al.:Nature 400:173-177, 1999
田平 武、原 英夫著、平成１３年度 厚生化学研究「２１世紀型医療開拓推進研究（痴呆分野）研究成果発表報告書」、財団法人 長寿科学振興財団出版、平成１４年３月、ｐ．４９−５４
Wyss-Coray, T. et al.: Amyloidogenic role of cytokine TGF-β1 in transgenic mice and Alzheimer’s disease: Nature 389: 603-606, 1997
Wyss-Coray, T. et al.： Chronic overproduction of transforming growth factor-β1 by astrocytes promotes Alzheimer's disease-like microvascular degeneration in transgenic mice： Am. J. Pathol. 156： 139-150, 2000
本発明者らは、今般、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を用いて、液性免疫を惹起させるＡβ抗原を腸管細胞に発現させ、このＡβ抗原に対する抗体産生を誘導することにより、脳においてアミロイド沈着および老人斑形成が減少することを見出した。さらに、本発明者らは、この組換えアデノ随伴ウイルスを用いると、脳および腎臓などの他臓器に炎症所見が認められないことを見出した。本発明はこれらの知見に基づくものである。
従って、本発明は、アルツハイマー病の治療に用いることのできる、Ａβ抗原を発現するアデノ随伴ウィルスベクターおよびこれを含む医薬組成物の提供を目的とする。
そして、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、βアミロイドペプチドの液性免疫惹起部位を含むペプチド断片を発現しうるアデノ随伴ウィルスベクターであって、このペプチド断片をコードするＤＮＡを機能しうる形で含んでなる、ものである。
さらに、本発明による医薬組成物は、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターを含んでなる、アルツハイマー病を治療するための医薬組成物である。
本発明によれば、組換えアデノ随伴ウィルスベクターを利用して、細胞性免疫を惹起せずに抗体産生を誘導することができ、中枢神経系での老人斑の形成およびアミロイドの沈着を抑制できる。さらに、この組換えアデノ随伴ウイルスを用いると、血中のＴＧＦ−β１濃度を減少させ、脳血管へのアミロイド沈着および脳の極小血管の変性の進行を抑制できる。さらに、本発明による組換えアデノ随伴ウィルスベクターによれば、脳炎、肝障害等の副作用を起こさない安全性の高いアルツハイマー病の治療が可能となる。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、βアミロイドペプチド（Ａβペプチド）の液性免疫惹起部位を含むペプチド断片をコードするＤＮＡを、機能しうる形で含んでなり、これにより該ペプチド断片を発現することができる。ここで「機能しうる形で含んでなる」とは、適切な調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなど）の制御下に、導入遺伝子（ＤＮＡ）の発現を可能にする様式で、そのベクター中に該導入遺伝子が挿入されていることを意味する。
Ａβペプチドの液性免疫惹起部位は、当業者であれば容易に特定することができる。例えば、前記液性免疫惹起部位はＡβペプチドの第４〜１０アミノ酸（Ａβ４−１０）の領域中に存在する。よって、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターによって発現される前記抗原ペプチド断片は、Ａβ４−１０を含んでなることが好ましい。
また、Ａβ４−１０のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第４〜１０アミノ酸が挙げられる。従って、前記抗原ペプチド断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第４〜１０アミノ酸を含んでなることが好ましい。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の第１０〜３０ヌクレオチドが挙げられる。従って、前記抗原ペプチド断片をコードするＤＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の第１０〜３０ヌクレオチドを含んでなることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様によれば、前記抗原ペプチド断片は、Ａβペプチドの第１〜４３アミノ酸（Ａβ１−４３）を含んでなるものとされる。Ａβ１−４３のアミノ酸配列としては、配列番号２で表されるアミノ酸配列が挙げられ、従って、前記抗原ペプチド断片は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号１で表されるヌクレオチド配列が挙げられ、従って、前記抗原ペプチド断片をコードするＤＮＡは、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなることが好ましい。
本発明の他の好ましい実施態様によれば、前記抗原ペプチド断片は、Ａβペプチドの第１〜２１アミノ酸（Ａβ１−２１）を含んでなるものとされる。Ａβ１−２１のアミノ酸配列としては、配列番号４で表されるアミノ酸配列が挙げられ、従って、前記抗原ペプチド断片は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含んでなることが好ましい。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号３で表されるヌクレオチド配列が挙げられ、従って、前記抗原ペプチド断片をコードするＤＮＡは、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含んでなることが好ましい。
前記Ａβ１−４３およびＡβ１−２１のアミノ酸配列には、液性免疫惹起部位のみならず、Ｔ細胞受容体認識配列も含まれるが、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターによって腸管粘膜免疫系にこれら抗原ペプチド断片を発現させた場合、主に抗体産生を誘導し、細胞性免疫はほとんど惹起しない。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターによって発現された前記抗原ペプチド断片を抗原として効率よく提示するためには、感染細胞内での発現の後に、該抗原ペプチド断片が細胞外に分泌されることが好ましい。従って、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、好ましくは、発現された前記抗原ペプチド断片を細胞外に分泌させることができるシグナルペプチドをコードするＤＮＡを、機能しうる形で含んでなるものとされる。ここで「機能しうる形で含んでなる」とは、前記シグナルペプチドが前記抗原ペプチド断片とともに発現され、かつ、発現された前記抗原ペプチド断片が前記シグナルペプチドによって細胞外に分泌されることを意味する。前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡを機能しうる形で本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターに組み込む方法としては、当業者に公知のものを用いることができるが、例えば、前記抗原ペプチド断片のＮ末端に結合した形で前記シグナルペプチドが発現するように、それぞれのＤＮＡを融合させた融合遺伝子を用いることができる。
前記シグナルペプチドとしては、当業者に公知のものを用いることができるが、好ましくはアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）のＮ末端に存在するシグナルペプチドが用いられる。ＡＰＰシグナルペプチドのアミノ酸配列としては配列番号６で表されるアミノ酸配列が挙げられ、よって、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターにより発現される前記シグナルペプチドは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含んでなるものであることが好ましい。このアミノ酸配列をコードするＤＮＡのヌクレオチド配列は特に制限されるものではないが、例えば、配列番号５で表されるヌクレオチド配列が挙げられ、従って、前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡは、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を含んでなることが好ましい。
本発明の好ましい実施態様によれば、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＰＰシグナルペプチドがＡβ１−４３のＮ末端に連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを含んでなるものとされる。この融合タンパク質のアミノ酸配列としては、配列番号８で表されるアミノ酸配列が挙げられ、これをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列としては、配列番号７で表されるヌクレオチド配列中の第９〜１９１ヌクレオチドが挙げられる。
本発明の他の好ましい実施態様によれば、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、ＡＰＰシグナルペプチドがＡβ１−２１のＮ末端に連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを含んでなるものとされる。この融合タンパク質のアミノ酸配列としては、配列番号１０で表されるアミノ酸配列が挙げられ、これをコードするＤＮＡのヌクレオチド配列としては、配列番号９で表されるヌクレオチド配列中の第１７〜１３３ヌクレオチドが挙げられる。
さらに、本発明によるアデノ随伴ウイルスベクターは、目的のＤＮＡを効率よく発現させるための調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写ターミネーターなどを含んでいてもよく、必要に応じて、翻訳開始コドン、翻訳終止コドンなどを挿入してもよい。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、当技術分野で周知となっている標準的方法により調製することができる。例えば、米国特許第５，８５８，３５１号およびそこに引用される参考文献には、遺伝子治療における使用に適切な種々の組換えアデノ随伴ウィルス、ならびにそれらのベクターの作製方法および増殖方法が記載されている（例えば、Kotin(1994)Human Gene Therapy 5:793〜801、またはBerns「Parvoviridae and their Replication」Fundamental Virology、第２版、Fields＆Knipe編など）。
アデノ随伴ウィルスベクターを作製するための好ましい方法によれば、まず、野生型アデノ随伴ウィルスの両端のＩＴＲを残し、その間に目的の遺伝子を挿入することによりプラスミドを作製する（ＡＡＶベクタープラスミド）。一方、Ｒｅｐ遺伝子（複製蛋白をコードする遺伝子）およびＣａｐ遺伝子（ウイルスの頭殻蛋白をコードする遺伝子）を発現するプラスミド、ならびにアデノウイルス遺伝子であるＥ２Ａ、Ｅ４、およびＶＡの各遺伝子を発現するプラスミドを用意する。次いで、これら３種のプラスミドを、Ｅ１遺伝子を発現するパッケージング細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクションし、この細胞を培養する。これにより、哺乳動物細胞対して高い感染能力を持つアデノ随伴ウィルスベクター粒子を産生することができる。このような方法は、ＡＡＶ−Ｈｅｌｐｅｒ−Ｆｒｅｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Stratagene）などの市販のキットを用いて容易に行なうことができる。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、哺乳動物のアルツハイマー病の治療に用いることができる。従って、本発明によれば、治療上有効量の本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターを被験者に投与することを含んでなる、アルツハイマー病の治療方法、ならびにアルツハイマー病の治療剤の製造における、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターの使用が提供される。ここで、「治療」には、確立された病態を治療することだけでなく、将来確立される可能性のある病態を予防することをも含む。前記被験者は哺乳動物、例えば、げっ歯類、イヌ、ネコ、ウシ、霊長類などとされ、好ましくはヒトとされる。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターの投与方法は、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、腹腔内注入、気管内注入、気管支内注入および直接的な気管支内滴注、皮下注入、経皮輸送、動脈内注入、静脈内注入等（FlotteおよびCarter,Gene Therapy 2:357-362(1995)参照）とされる。さらに、アデノ随伴ウィルスは、胃液によって分解されにくいため、経口投与できるという利点を有する。また、経口投与は、被験者が自ら投与することができるという点で、特に好ましい。
投与されるアデノ随伴ウィルスベクターの量は治療上有効量であればよく、このような量は遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。また、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって調整することが好ましいが、このような投与量の調整は、医師または獣医によって適宜行なわれる。例えば、経口投与されるアデノ随伴ウィルスベクターの量は、通常０．５×１０１１〜２．０×１０１２viral genome／体重ｋｇであり、好ましくは１．０×１０１１〜１．０×１０１２viral genome／体重ｋｇ、より好ましくは１．０×１０１１〜５．０×１０１１viral genome／体重ｋｇとされる。本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは上記の投与量の範囲内において、医薬上安全である。ここで、「viral genome」という単位は、アデノ随伴ウイルスのゲノムの分子数（ウイルス粒子数）を表すものであり、アデノ随伴ウイルスベクターの量を示すものとして当業者には周知である。その数値は、精製したアデノ随伴ウイルス溶液を希釈してドットブロットハイブリダイゼーションを行ない、そのシグナル強度を所定の分子数のプラスミドＤＮＡと比較することにより決定することができる。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、一旦被験者に投与すると、比較的長期間にわたってアルツハイマー病の治療作用が持続する。特に、上記の量で経口投与した場合には、腸管上皮細胞において抗原が少なくとも６ヶ月以上提示され、これに対する抗体産生が誘導されることが確認されている。この点に鑑み、当業者であれば適切な投薬計画を作成することができる。
本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターは、これを含む医薬組成物として被験者に投与することができる。従って、本発明によれば、本発明によるアデノ随伴ウィルスベクターを含んでなる、アルツハイマー病を治療するための医薬組成物が提供される。本発明の好ましい実施形態によれば、この医薬組成物は経口投与のためのものとされる。
本発明による医薬組成物は、その投与経路および剤型に応じて、当技術分野において公知の方法により調製することができる。例えば、経口投与のための医薬組成物としては、カプセル剤、溶液剤等の剤型が使用可能である。従って、本発明による医薬組成物は、それぞれの剤型に応じて、医薬上許容される担体、希釈剤、保存剤等を含むことができる。
以下、本発明を実施例によってより具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。なお、以下の試験例で用いるマウスは、アルツハイマー病のモデルマウスのＡＰＰトランスジェニックマウス(Ｔｇ２５７６, Taconic社、Mayo Clinic) である。
実施例１
ＡＰＰ シグナル配列 ＋ Ａβ１−４３ ｃＤＮＡを発現するアデノ随伴ウィルスベクターの構築
アミロイド−β１−４３(Ａβ１−４３) ｃＤＮＡは、ヒトアミロイド前駆タンパク質 (ＡＰＰ) 遺伝子を鋳型として以下のプライマーを用いるＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ反応液の組成は、ＴＡＰＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ９．３）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）、鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、およびプライマー（各０．２μＭ）とした。サイクル反応の温度条件は、９４℃で３０秒間、６８℃で１分間、および７２℃で３分間を１サイクルとし、これを３０サイクルとした。
ＡＰＰ シグナル配列 ＋ Ａβ１−４３ ｃＤＮＡを発現するアデノ随伴ウィルスベクターの構築
アミロイド−β１−４３(Ａβ１−４３) ｃＤＮＡは、ヒトアミロイド前駆タンパク質 (ＡＰＰ) 遺伝子を鋳型として以下のプライマーを用いるＰＣＲにて増幅した。ＰＣＲ反応液の組成は、ＴＡＰＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ９．３）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）、鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、およびプライマー（各０．２μＭ）とした。サイクル反応の温度条件は、９４℃で３０秒間、６８℃で１分間、および７２℃で３分間を１サイクルとし、これを３０サイクルとした。
プライマー
フォワード : 5'-GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGA-3'（配列番号１１）；および
リバース : 5'-GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC-3'（配列番号１２：3’にAflII部位を有する）。
フォワード : 5'-GATGCAGAATTCCGACATGACTCAGGA-3'（配列番号１１）；および
リバース : 5'-GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC-3'（配列番号１２：3’にAflII部位を有する）。
ＡＰＰの分泌シグナルであるＮ末の最初のシグナル配列(配列番号１０)のアダプターは、以下の２つのオリゴヌクレオチドを９０℃で３分間処理後、室温でアニーリングさせることにより作製した。
オリゴヌクレオチド
センス :5'-GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTT-3'（配列番号１３）；
アンチセンス :5'-AGCGCCCGAGCCGTCCAGGCGGCCAGCAGGAGCAGTGCCAAACCGGGCAGCATTCTAGACC-3'（配列番号１４）。
センス :5'-GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCACTGCTCCTGCTGGCCGCCTGGACGGCTCGGGCGCTT-3'（配列番号１３）；
アンチセンス :5'-AGCGCCCGAGCCGTCCAGGCGGCCAGCAGGAGCAGTGCCAAACCGGGCAGCATTCTAGACC-3'（配列番号１４）。
ＡＰＰの分泌シグナルアダプター(センス鎖の3’側に突出したＴ残基を持つ)とＰＣＲで増幅したＡβ１−４３ ｃＤＮＡ(アンチセンス鎖の3’側に突出したＡ残基を持つ)を結合し、 これを鋳型として以下のプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＡＰＰシグナル配列をＡβ１−４３ｃＤＮＡの5’側に結合させた融合遺伝子：ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡ（配列番号７：この配列中の第３〜８ヌクレオチドはＸｂａＩ認識部位である）を作製した。ＰＣＲ反応液の組成は、ＴＡＰＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ９．３）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）、鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、およびプライマー（各０．２μＭ）とした。サイクル反応の温度条件は、９４℃で３０秒間、６８℃で１分間、および７２℃で３分間を１サイクルとし、これを３０サイクルとした。
プライマー
フォワード :5'-GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3'（配列番号１５：5’側にＸｂａＩ部位を有する）；
リバース :5'-GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC-3'（配列番号１２：5’側にＡｆｌＩＩ部位を有する）。
フォワード :5'-GGTCTAGAATGCTGCCCGGTTTGGCAC-3'（配列番号１５：5’側にＸｂａＩ部位を有する）；
リバース :5'-GTCTTAAGTCGCTATGACAACACCGCCC-3'（配列番号１２：5’側にＡｆｌＩＩ部位を有する）。
効率よくアデノ随伴ウイルスのＤＮＡパッケージングを得るには、適度な長さ(４〜４．５ｋｂｐ)のＤＮＡが必要であるので、ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡ （ＸｂａＩ−ＡｆｌＩＩ／ｂｌｕｎｔ)に、非機能的な”stuffer” ＤＮＡとしてｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡのＰｖｕＩＩ−ＳａｌＩ断片を結合させ、標準的なアデノ随伴ウイルスベクター(ｐＸＸＵＦ１)のＸｂａＩ−ＳａｌＩ部位に組み込んだ。
さらに、上記の組換えｐＸＸＵＦ１、 ならびに標準的なＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、およびＥ２Ａ／Ｅ４／ＶＡプラスミドの３種類のベクターをＨＥＫ２９３細胞にリン酸カルシウム法にて遺伝子導入し、ＨＥＫ２９３細胞を大量培養後、細胞溶解物からウイルス粒子をＣｓＣｌの超遠心により精製して、ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡを有するアデノ随伴ウイルスベクターを得た。
実施例２
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−２１ｃＤＮＡを発現するアデノ随伴ウィルスベクターの構築
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡ(ＸｂａＩ−ＡｆｌＩＩ／ｂｌｕｎｔ) をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＸｂａＩ−ＳｍａＩ）に組み込んだ。これを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−２１ｃＤＮＡを発現するアデノ随伴ウィルスベクターの構築
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡ(ＸｂａＩ−ＡｆｌＩＩ／ｂｌｕｎｔ) をｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド（ＸｂａＩ−ＳｍａＩ）に組み込んだ。これを鋳型として、以下のプライマーを用いてＰＣＲを行った。
プライマー
フォワード：5'-TGGCGGCCGCTCTAGAATG-3'（配列番号１６：5'側にＮｏｔＩ部位を有する）；
リバース：5'-CACATCTTAAGCAAAGAACACC-3'（配列番号１７）。
フォワード：5'-TGGCGGCCGCTCTAGAATG-3'（配列番号１６：5'側にＮｏｔＩ部位を有する）；
リバース：5'-CACATCTTAAGCAAAGAACACC-3'（配列番号１７）。
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−２１ｃＤＮＡ（配列番号９：この配列中の第３〜１０ヌクレオチドはＮｏｔＩ認識部位であり、第１１〜１６ヌクレオチドはＸｂａＩ認識部位である）のＰＣＲ産物を、ＮｏｔＩ−ＡｆｌＩＩ／ｂｌｕｎｔ処理し、上記の"stuffer" ｐＢＲ３２２ ＰｖｕＩＩ−ＳａＩＩ断片とともにｐＸＸＵＦ１(ＮｏｔＩ−ＳａｌＩ)に組み込んだ。
さらに、実施例１と同様にして、ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−２１ｃＤＮＡを有するアデノ随伴ウイルスベクターを得た。
比較例１
コントロールとして、ＧＦＰ グリーン蛍光タンパク質)を発現するアデノ随伴ウイルス (ＧＦＰｒＡＡＶ)を作製した。
コントロールとして、ＧＦＰ グリーン蛍光タンパク質)を発現するアデノ随伴ウイルス (ＧＦＰｒＡＡＶ)を作製した。
試験例１
ウエスタンブロット解析
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡを発現ベクターｐＸＸＵＦ１に組み込み、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００(Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いてＨＥＫ２９３細胞へ導入した４８時間後に培養上清と細胞溶解物を抽出し、それぞれ抗Ａβ抗体(４Ｇ８)で免疫沈降後、SDS-PAGEゲルに電気泳動した。そして、ニトロセルロース膜に蛋白を転写した後、抗Ａβ抗体によってＡβ蛋白の検出を試みた。その結果、Ａβはオリゴマーを形成しながら細胞外に分泌されること、および細胞内では多量の４ｋＤａのＡβペプチドモノマー蛋白が生成していることが確認された。
ウエスタンブロット解析
ＡＰＰシグナル配列＋Ａβ１−４３ｃＤＮＡを発現ベクターｐＸＸＵＦ１に組み込み、ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００(Ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ)を用いてＨＥＫ２９３細胞へ導入した４８時間後に培養上清と細胞溶解物を抽出し、それぞれ抗Ａβ抗体(４Ｇ８)で免疫沈降後、SDS-PAGEゲルに電気泳動した。そして、ニトロセルロース膜に蛋白を転写した後、抗Ａβ抗体によってＡβ蛋白の検出を試みた。その結果、Ａβはオリゴマーを形成しながら細胞外に分泌されること、および細胞内では多量の４ｋＤａのＡβペプチドモノマー蛋白が生成していることが確認された。
試験例２
マウス血清の採取
１５週齢のマウスに、実施例１のアデノ随伴ウィルスベクター５×１０１１viral genomeを１回のみ経口投与した。このマウスの血清を１ヶ月後、４ヶ月後、および６ヶ月後にそれぞれ採取した。
マウス血清の採取
１５週齢のマウスに、実施例１のアデノ随伴ウィルスベクター５×１０１１viral genomeを１回のみ経口投与した。このマウスの血清を１ヶ月後、４ヶ月後、および６ヶ月後にそれぞれ採取した。
マウス血清中の抗Ａβ抗体の検出
Ａβ１−４２ペプチド(５ｍｇ／ｍＬ)を９６ウェルプレート (Nunc，MaxiSorpp製)の各ウェルに付着させ、５％ non-fat milk/TBS-T bufferでブロックした後、上記の採取したマウス血清を加え（５００倍希釈）、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。抗体価の評価は、ＥＬＩＳＡリーダーでの吸光度測定により行った。その結果を図１に示す。
Ａβ１−４２ペプチド(５ｍｇ／ｍＬ)を９６ウェルプレート (Nunc，MaxiSorpp製)の各ウェルに付着させ、５％ non-fat milk/TBS-T bufferでブロックした後、上記の採取したマウス血清を加え（５００倍希釈）、ペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ抗体で検出した。抗体価の評価は、ＥＬＩＳＡリーダーでの吸光度測定により行った。その結果を図１に示す。
血清中の抗体価は、主として経口投与後１ヶ月でピークを示し、６ヶ月後まで抗体の持続的産生を認めた。
試験例３
マウス血清によるＡβ凝集反応の阻害試験
Ａβ１−４０ペプチドを１２０ｍＭの濃度に調整し、３７℃でインキュベーションした。２４時間後にＡβの凝集が開始するのが見られた。このＡβの凝集物にマウスの血清を１：１０および１：２０(ｖｏｌ: ｖｏｌ)の濃度で加え、３７℃で１週間インキュベーションした。Ａβ１−４０の結合・凝集をマウスの血清が阻害するかどうか、２ｍＭチオフラビン−Ｔを加え、分光蛍光計(４４５ｎｍでの励起; ４９０ｎｍでの発光)を用いて測定した。その結果を図２に示す。
マウス血清によるＡβ凝集反応の阻害試験
Ａβ１−４０ペプチドを１２０ｍＭの濃度に調整し、３７℃でインキュベーションした。２４時間後にＡβの凝集が開始するのが見られた。このＡβの凝集物にマウスの血清を１：１０および１：２０(ｖｏｌ: ｖｏｌ)の濃度で加え、３７℃で１週間インキュベーションした。Ａβ１−４０の結合・凝集をマウスの血清が阻害するかどうか、２ｍＭチオフラビン−Ｔを加え、分光蛍光計(４４５ｎｍでの励起; ４９０ｎｍでの発光)を用いて測定した。その結果を図２に示す。
試験例１で示したアデノ随伴ウィルスベクター投与後６ヶ月のマウス血清は、コントロールのマウス血清と比べ、有意にin vitroでＡβ１−４０の凝集・結合を阻害した。
試験例４
組織からのＤＮＡ抽出及びＰＣＲ
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与した後、２８週間のマウスより、心、肺、脾臓、肝臓、上部消化管および腎臓を摘出し、Tris溶液中で組織をホモジネートした後、プロテイナーゼＫで蛋白を分解し、フェノール／クロロホルム処理し、ＤＮＡを精製した。次に、アデノ随伴ウイルスベクター(ｐＸＸＵＦ１)のプロモーター領域の５’側塩基配列とベクターの３’側塩基配列から以下のプライマーを作製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は、ＴＡＰＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ９．３）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）、鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、およびプライマー（各０．２μＭ）とした。サイクル反応の温度条件は、９４℃で１分間、６８℃で２０秒間、および７２℃で１分間を１サイクルとし、これを３０サイクルとした。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロミドで染色した。
組織からのＤＮＡ抽出及びＰＣＲ
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与した後、２８週間のマウスより、心、肺、脾臓、肝臓、上部消化管および腎臓を摘出し、Tris溶液中で組織をホモジネートした後、プロテイナーゼＫで蛋白を分解し、フェノール／クロロホルム処理し、ＤＮＡを精製した。次に、アデノ随伴ウイルスベクター(ｐＸＸＵＦ１)のプロモーター領域の５’側塩基配列とベクターの３’側塩基配列から以下のプライマーを作製し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は、ＴＡＰＳ緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ９．３）、ＫＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（２ｍＭ）、２−メルカプトエタノール（１ｍＭ）、ｄＮＴＰｓ（１００μＭ）、鋳型ＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、およびプライマー（各０．２μＭ）とした。サイクル反応の温度条件は、９４℃で１分間、６８℃で２０秒間、および７２℃で１分間を１サイクルとし、これを３０サイクルとした。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲルにて電気泳動し、エチジウムブロミドで染色した。
プライマー
フォワード：5'-AGTGAACCGTCAGATCGC-3'（配列番号１８）；
リバース：5'-CGGTATCAGCTCACTCAA-3'（配列番号１９）。
フォワード：5'-AGTGAACCGTCAGATCGC-3'（配列番号１８）；
リバース：5'-CGGTATCAGCTCACTCAA-3'（配列番号１９）。
目的とするＰＣＲ産物を示す５００bpのバンドは、上部消化管組織のみに認められた。
試験例５
マウス脾細胞のＡβ１−４２ペプチドに対する細胞増殖反応
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与した後２８週間のマウスより脾細胞を分離し、９６ウェルプレートの1ウェルあたり５×１０４細胞を加え、Ａβ１−４２ペプチドを各濃度で加えた培養液中で４８時間培養した。細胞培養終了後、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を加えた。テトラゾリウム塩は、生細胞にのみ活性のあるミトコンドリアのコハク酸テトラゾリウム還元酵素によりホルマザン色素に変換されるので、ＥＬＩＳＡリーダーで色素溶液の吸光度を測定することにより、細胞増殖能反応を判定した。その結果を図３に示す。
マウス脾細胞のＡβ１−４２ペプチドに対する細胞増殖反応
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与した後２８週間のマウスより脾細胞を分離し、９６ウェルプレートの1ウェルあたり５×１０４細胞を加え、Ａβ１−４２ペプチドを各濃度で加えた培養液中で４８時間培養した。細胞培養終了後、テトラゾリウム塩（ＷＳＴ−１）を加えた。テトラゾリウム塩は、生細胞にのみ活性のあるミトコンドリアのコハク酸テトラゾリウム還元酵素によりホルマザン色素に変換されるので、ＥＬＩＳＡリーダーで色素溶液の吸光度を測定することにより、細胞増殖能反応を判定した。その結果を図３に示す。
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与したマウスの脾細胞は、Ａβ１−４２ペプチドの濃度に関係なく、細胞増殖反応は低応答であった。
試験例６
組織染色試験１
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与したマウス（以下「治療群」という）、または未処置の同齢マウス（以下「コントロール群」という）から、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）経過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて以下の実験を行った。組織中のＡβ蛋白や老人斑を検出するために、７０％ギ酸で処理し、５％ Ｈ２Ｏ２で内因性のペルオキシダーゼ活性を失活させた。抗Ａβ抗体(４Ｇ８：１０００倍希釈）またはラビット抗Ａβ４０抗体(１０００倍希釈)と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識２次抗体を加え、ＤＡＢ染色を行った。
組織染色試験１
実施例１のアデノ随伴ウイルスを経口投与したマウス（以下「治療群」という）、または未処置の同齢マウス（以下「コントロール群」という）から、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）経過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて以下の実験を行った。組織中のＡβ蛋白や老人斑を検出するために、７０％ギ酸で処理し、５％ Ｈ２Ｏ２で内因性のペルオキシダーゼ活性を失活させた。抗Ａβ抗体(４Ｇ８：１０００倍希釈）またはラビット抗Ａβ４０抗体(１０００倍希釈)と反応させた後、ペルオキシダーゼ標識２次抗体を加え、ＤＡＢ染色を行った。
コントロール群では、加齢と共にアミロイド沈着が進み、６ヶ月齢では脳に軽度の沈着をが認められ、１０ヶ月齢になるとアミロイド沈着は著明になり、老人斑の形成も認められ、神経細胞内のアミロイド沈着も散見された。
一方、治療群では、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）に解剖したところ、上部消化管上皮細胞にＡβ蛋白の発現が認められた。また、投与後６ヶ月の脳を解析すると、コントロール群に比べ明らかにアミロイド沈着が減少し、老人斑も激減していた。投与後６ヶ月の脳の矢状断面におけるアミロイド斑の数を計測した結果を表１に示す。
コントロール群では、アミロイド斑数は平均７６個であるのに対し、投与群では８個と約９０％減少していた。コントロール群に散見された神経細胞内のアミロイド沈着は、治療群では殆ど認められなかった。
試験例７
組織染色試験２
試験例６と同様に、治療群およびコントロール群から、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）経過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて以下の実験を行った。抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＧＦＡＰ抗体(アストロサイト)、抗Ｉｂａ−１抗体（ミクログリア）などの抗体を用いて凍結切片をＡＢＣ法にて染色して、中枢神経系におけるリンパ球の浸潤の有無を確認した。その結果を表２に示す。
組織染色試験２
試験例６と同様に、治療群およびコントロール群から、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）経過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて以下の実験を行った。抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ＧＦＡＰ抗体(アストロサイト)、抗Ｉｂａ−１抗体（ミクログリア）などの抗体を用いて凍結切片をＡＢＣ法にて染色して、中枢神経系におけるリンパ球の浸潤の有無を確認した。その結果を表２に示す。
脳組織をＴ細胞マーカーであるＣＤ４およびＴ細胞活性化分子であるＣＤ８６でそれぞれ染色したところ、コントロール群および治療群とも陰性であった。末梢のマクロファージマーカーであるＣＤ１１ｂについても陰性であった。アストロサイトマーカーであるＧＦＡＰについては、両群で差が認められなかった。治療群の前頭葉および側頭葉において、活性化したミクログリア(Ｉｂａ−１陽性)の増加が認められた。
試験例８
組織染色試験３
実施例２のアデノ随伴ウイルスを経口投与したマウス（以下「治療群２」という）またはコントロール群から、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）経過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて試験例６と同様にＤＡＢ染色を行った。
組織染色試験３
実施例２のアデノ随伴ウイルスを経口投与したマウス（以下「治療群２」という）またはコントロール群から、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）経過時に組織を得て、その組織の凍結切片を用いて試験例６と同様にＤＡＢ染色を行った。
治療群２において、投与後６ヶ月（１０ヶ月齢）の脳を解析すると、コントロール群に比べ明らかにアミロイド沈着が減少し、老人斑も激減していた。
試験例９
Ａβ蓄積面積率の比較１
４匹のマウスからなる３群を用意し、それぞれ、１５週齢時（以下「Ａ群」という）、３０週齢時（以下「Ｂ群」という）、または４５週齢時（以下「Ｃ群」という）に実施例１のアデノ随伴ウイルス（５．０×１０１１viral genome／匹）を１回経口投与した。また、６匹のマウスからなるコントロール群を用意し、１５週齢時にＰＢＳ（０．１ｍＬ／匹）を経口投与した。その後、１２〜１３ヶ月齢（５２〜５６週齢）の時点で各群を解剖し、前頭葉皮質・頭頂葉・海馬の領域において、それぞれ脳組織切片を得た。そして、これらの組織切片を試験例６と同様に染色し、顕微鏡に連結させた３ＣＣＤカメラ用いて観測し、各領域におけるＡβ蓄積部分の面積を測定した。そして、各測定部位に占めるＡβ蓄積部分の面積率を計算した。その結果を図４に示す。
Ａβ蓄積面積率の比較１
４匹のマウスからなる３群を用意し、それぞれ、１５週齢時（以下「Ａ群」という）、３０週齢時（以下「Ｂ群」という）、または４５週齢時（以下「Ｃ群」という）に実施例１のアデノ随伴ウイルス（５．０×１０１１viral genome／匹）を１回経口投与した。また、６匹のマウスからなるコントロール群を用意し、１５週齢時にＰＢＳ（０．１ｍＬ／匹）を経口投与した。その後、１２〜１３ヶ月齢（５２〜５６週齢）の時点で各群を解剖し、前頭葉皮質・頭頂葉・海馬の領域において、それぞれ脳組織切片を得た。そして、これらの組織切片を試験例６と同様に染色し、顕微鏡に連結させた３ＣＣＤカメラ用いて観測し、各領域におけるＡβ蓄積部分の面積を測定した。そして、各測定部位に占めるＡβ蓄積部分の面積率を計算した。その結果を図４に示す。
コントロール群では、上記Ａβ蓄積部分の３つの脳測定領域における平均面積率は２．６４±１．４６％であった。一方、１５週齢時投与のＡ群では０．５５±０．５０％であり、３０週齢時投与のＢ群では０．４８±０．３５％であり、４５週齢時投与のＣ群では０．４６±０．２７％であり、いずれもコントロール群と比較して、有意に低い値を示した（一元配置分散分析法(one-way variance analysis, ANOVA)およびスチューデントt検定，ｐ＜０．００１）。
試験例１０
Ａβ蓄積面積率の比較２
４匹のマウスからなる３群を用意し、それぞれ、１５週齢時（以下「Ｄ群」という）、３０週齢時（以下「Ｅ群」という）、または４５週齢時（以下「Ｆ群」という）に実施例２のアデノ随伴ウイルス（５．０×１０１１viral genome／匹）を１回経口投与した。その後、各群を試験例９と同様に処理し、各測定部位に占めるＡβ蓄積部分の面積率を計算した。その結果を図５に示す。
Ａβ蓄積面積率の比較２
４匹のマウスからなる３群を用意し、それぞれ、１５週齢時（以下「Ｄ群」という）、３０週齢時（以下「Ｅ群」という）、または４５週齢時（以下「Ｆ群」という）に実施例２のアデノ随伴ウイルス（５．０×１０１１viral genome／匹）を１回経口投与した。その後、各群を試験例９と同様に処理し、各測定部位に占めるＡβ蓄積部分の面積率を計算した。その結果を図５に示す。
上記Ａβ蓄積部分の面積率は、１５週齢時投与のＤ群では０．３９±０．２７％であり、３０週齢時投与のＥ群では０．４５±０．３０％であり、４５週齢時投与のＦ群では０．３７±０．２０％であり、いずれも試験例９に示したコントロール群と比較して、有意に低い値を示した（一元配置分散分析法(one-way variance analysis, ANOVA)およびスチューデントt検定，ｐ＜０．００１）。
試験例１１
ＴＧＦ−β１の測定
試験例９および１０において、解剖時に各群のマウスから採血し、それらの血清を得た。そして、マウス血清中のＴＧＦ−β１濃度を、Quantikine Mouse/Rat/Porcine TGF-β1 Immunoassay（R & D systems社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図６に示す。
ＴＧＦ−β１の測定
試験例９および１０において、解剖時に各群のマウスから採血し、それらの血清を得た。そして、マウス血清中のＴＧＦ−β１濃度を、Quantikine Mouse/Rat/Porcine TGF-β1 Immunoassay（R & D systems社製）を用いて、ＥＬＩＳＡ法により測定した。その結果を図６に示す。
マウス血清中のＴＧＦ−β１濃度は、コントロール群では１１１．６±４０．０ｐｇ／ｍＬであった。一方、試験例９におけるＡ群では８０．５±１２．９ｐｇ／ｍＬであり、Ｂ群では７６．０±６．３ｐｇ／ｍＬであり、Ｃ群では７４．３±２１．０ｐｇ／ｍＬであり、いずれの群もコントロール群と比較して有意に低い値を示した（一元配置分散分析法(one-way variance analysis, ANOVA)およびスチューデントt検定，ｐ＜０．００１）。
さらに、試験例１０におけるＣ群では９９．４±２１．２ｐｇ／ｍＬであり、Ｄ群では８０．２±１７．２ｐｇ／ｍＬであり、Ｅ群では７２．９±１５．８ｐｇ／ｍＬであり、いずれの群もコントロール群と比較して有意に低い値を示した（一元配置分散分析法(one-way variance analysis, ANOVA)およびスチューデントt検定，ｐ＜０．００１）。
Claims (10)
- βアミロイドペプチドを腸管細胞において発現しうるアデノ随伴ウィルスベクターを含んでなる、アルツハイマー病を治療するための経口投与用医薬組成物であって、
前記アデノ随伴ウィルスベクターが、
前記βアミロイドペプチドをコードするＤＮＡと、
前記βアミロイドペプチドを細胞外に分泌させることができるシグナルペプチドをコードするＤＮＡと、
を機能しうる形で含んでなる、経口投与用医薬組成物。 - 前記βアミロイドペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列中の第４〜１０アミノ酸を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記βアミロイドペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列中の第１０〜３０ヌクレオチドを含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記βアミロイドペプチドが、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記βアミロイドペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号１で表されるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記βアミロイドペプチドが、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記βアミロイドペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号３で表されるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記シグナルペプチドが、アミロイド前駆体タンパク質のシグナルペプチドである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記シグナルペプチドが、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
- 前記シグナルペプチドをコードするＤＮＡが、配列番号５で表されるヌクレオチド配列を含んでなるものである、請求項１に記載の経口投与用医薬組成物。
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