JP4896022B2

JP4896022B2 - チトクロムｃの免疫化学的測定方法及び測定キット

Info

Publication number: JP4896022B2
Application number: JP2007528145A
Authority: JP
Inventors: 宗夫青山
Original assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Current assignee: Eisai R&D Management Co Ltd
Priority date: 2005-04-15
Filing date: 2006-04-17
Publication date: 2012-03-14
Anticipated expiration: 2026-04-17
Also published as: EP1873523A4; EP1873523A1; US7892757B2; US20090075290A1; JPWO2006112445A1; WO2006112445A1; EP1873523B1

Description

本発明は、体液、特に血中のチトクロムｃを正確に測定する免疫化学的方法、及び測定キットに関する。

チトクロムｃは古くは電子伝達系の蛋白質として、また、近年ではアポトーシス関連蛋白質として研究され、細胞内のチトクロムｃ濃度や血中のチトクロムｃ濃度を免疫化学的に測定する方法が知られている（非特許文献１）。また、血中のチトクロムｃ濃度が体内で起こっているアポトーシスの指標となることが知られ（非特許文献２、特許文献１、２）、多くの疾患の診断薬としての用途が期待されている。

従来のチトクロムｃ測定法や測定キットを用いて体液、特に血中のチトクロムｃを測定する場合、その測定値がチトクロムｃ量を反映し、体内で起こっているアポトーシスを検査する上で支障が無いことは確認されていた。しかしこれまで、測定値が正確に体液中のチトクロムｃ量を反映しているか否かは検証されておらず、体液中のチトクロムｃの測定値を正確に求められる測定方法及び測定キットが求められていた。
WO 01/35093 特開2003-028860 Andrea Renz, et al. Rapid extracellular release of cytochrome c is specific for apoptosis and markers cell death in vivo, BLOOD, 98(5)1542-1548,2001 Z.BEN-ARI, et al. Circulating soluble cytochromec in liver disease as marker of apoptosis, Journal of Internal Medicine, 254,168-175,2003

本発明の課題は、体液、特に血中のチトクロムｃを正確に測定する免疫化学的方法、及び測定キットを提供することにある。

本発明者らは従来のサンドイッチ法で、血清に既知量のチトクロムｃを添加し、その測定値を測定する添加回収試験を行ったところ、添加量の多寡を反映した測定値が得られることが判明したものの、添加量を正確に反映した測定値を得ることができなかった。

種々の測定条件について検討した結果、チトクロムｃと抗チトクロムｃ抗体を反応させる際の緩衝液のpHを酸性領域にすることにより、血清中チトクロムｃの正確な測定値を得ることができることを見出して、発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下に関する。
［１］体液中のチトクロムｃを免疫化学的に測定する方法であって、抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とする方法。
［２］酸性領域がpH 3.5からpH 5.0である［１］に記載の方法。
［３］体液が血液である［１］又は［２］に記載の方法。
［４］体液中のチトクロムｃを免疫化学的に測定するキットであって、抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キット。
［５］酸性領域がpH 3.5からpH 5.0である［４］に記載の測定キット。
［６］少なくとも、
（１）チトクロムｃと反応する抗体及び
（２）酸性領域で反応させる緩衝液
を含む、［４］又は［５］に記載の測定キット。
［７］チトクロムｃと反応する抗体が、固相化した抗体及び／又は標識した抗体である、［６］に記載の測定キット。
［８］体液が血液である［４］〜［７］のいずれか一項に記載の測定キット。

更に本発明者らは、質量解析を用いたプロテオーム技術により、正確なチトクロムｃの定量を妨げるヒト血清中の妨害物質が、α1酸性糖蛋白質(α1-acid glycoprotein)、α1アンチトリプシン等の酸性度の高い蛋白質であることを明らかにした。

本発明は、血清中の酸性度の高い蛋白質がチトクロムｃと抗体との結合に影響を与えること、その影響が酸性領域でチトクロムｃと抗体を反応させることで無くなることを明らかにしたものであり、酸性度の高い蛋白質が、チトクロムｃと抗体との反応に影響を与えることを抑制するその他の方法、例えば反応液の塩濃度を調整する等の方法も、本発明に含まれるものである。

本発明により、体液中、特に血中のチトクロムｃを正確に測定する免疫化学的測定法が確立され、チトクロムｃ測定値の信頼性が高まる。

ヒト血清をゲルろ過に付して得られた各フラクションのチトクロムｃ測定に対する妨害活性を示す。妨害物質が含まれるフラクションの二次元電気泳動の結果を示す（電気泳動写真）。スポットには、同定された蛋白質の名称を付記している。

本発明の主題は、体液中、特に血中のチトクロムｃの量を測定する免疫化学的測定方法において、酸性領域で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃを反応させ、抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの結合に影響を与える体液中の妨害物質の影響を減弱させて、正確なチトクロムｃの測定値が得られるようにする方法にある。

従って本明細書でいう酸性領域とは、抗体とチトクロムｃの結合に影響を与える体液中の妨害物質の影響が減弱するpH領域である。pHを低下させることにより妨害物質の影響を減弱させることができるが、同時に抗体とチトクロムｃの結合も弱くなるため、本発明の免疫化学的な測定におけるpHは、下記１及び２を満たすpHに決められる。

１．緩衝液中で10 ng/mL、好ましくは1 ng/mLのチトクロムｃが定量可能な測定感度が得られる。
２．体液存在下での添加回収試験における回収率が70%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上得られる。

抗体とチトクロムｃの結合に及ぼすpHの効果は用いる抗体により異なるため、当該免疫化学的測定方法に用いるpHは、抗体毎に最適なpHを決めることができる。好ましくはpH 7以下、更に好ましくはpH 3〜pH 6、更に好ましくはpH 3.5〜pH 5、更に好ましくはpH 3.5〜pH 4.5である。

以下に、本発明の免疫化学的な測定におけるpHを決める方法を具体的に示すが、pHを決める方法は、これに限定されるものではない。

１．測定感度へのpHの影響
必要によりBSA等の適当な蛋白質、NaCl等の適当な塩類、必要により適当な界面活性剤他を含むpH 3〜pH 7.5の緩衝液に、チトクロムｃを1〜1000 ng/mLに希釈する。

当該免疫化学的な測定法が２ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロムｃと固相化した抗チトクロムｃ抗体を反応させ、洗浄後、標識した抗チトクロムｃ抗体を加えて標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。

また、当該免疫化学的な測定法が１ステップサンドイッチ法の場合、希釈したチトクロムｃと固相化した抗チトクロムｃ抗体、標識した抗チトクロムｃ抗体を加えて反応させ、標識物質に対応した活性、放射性標識であれば放射活性、酵素標識であれば酵素活性により標識物質を検出する。

10 ng/mL、好ましくは1 ng/mLのチトクロムｃを含む検体から得られるシグナルが、チトクロムｃを含まない緩衝液のみの検体のシグナルと比較して充分に強ければ、当該pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液のpHの候補として挙げられる。

２．添加回収へのpHの影響
免疫化学的測定法に用いる検体に対応した体液、例えば血清中のチトクロムｃを測定するのであれば血清に、既知量のチトクロムｃを添加する。チトクロムｃを添加した血清、及び添加しなかった血清中のチトクロムｃ量を、当該免疫化学的な方法により測定し、理論値に対する測定値の比率を回収率とする。

回収率は、添加したチトクロムｃ量をＡ、チトクロムｃ未添加血清中のチトクロムｃ測定値をＢ、チトクロムｃ添加血清中のチトクロムｃ測定値をＣとして、
(1).測定値（Ｃ）／理論値（ＡとＢの加重平均）、
(2).チトクロムｃ添加による測定値の上昇値（Ｃ−Ｂ）／添加量（Ａ）、
の何れでも計算できる。

回収率が70%以上、好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上の場合、当該pHは免疫化学的測定法に用いる緩衝液のpHの候補として挙げられる。

当該免疫化学的な方法に用いる緩衝液のpHは１．測定感度へのpHの影響、２．添加回収へのpHの影響を勘案して決定する。

また本発明の、免疫化学的なチトクロムｃの測定に当たり、酸性領域の緩衝液を用いる方法は、固相化した抗体と検体中のチトクロムｃとを反応させる第１反応のみならず、第１反応で妨害物質が除去しきれなかった時に、第２反応（チトクロムｃと標識抗体を反応させる工程）に用いても有効である。
本発明の方法は、第１反応で酸性領域の緩衝液を用いる方法に限られるものではない。

血液中のチトクロムｃとチトクロムｃに対する抗体を酸性領域で反応させる緩衝液は、上記１．測定感度へのpHの影響、２．添加回収へのpHの影響を勘案して決定される。緩衝液の種類は、酸性条件に調整し得る緩衝液であれば特に制限されないが、例えばこはく酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液などが挙げられる。

本発明の方法は、上述のように、酸性領域で抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃを反応させる他は、通常の、体液中のチトクロムｃの量を測定する免疫学的方法と同様でよい。

ここで免疫化学的方法とは、チトクロムｃに対する抗体を用いて、チトクロムｃを定量する方法である。免疫化学的方法としては、チトクロムｃを標識する競合法、抗体を標識するサンドイッチ法、抗体コートしたビーズの凝集を観察するラテックスビーズ法等、様々な方法があるが、チトクロムｃに対する抗体を用いた方法であれば、本発明の方法に含まれる。抗チトクロムｃ抗体は、チトクロムｃを検出できるものであれば特に制限はなく、IgG、IgG F(ab’)₂フラグメントやFabフラグメントでもよく、モノクローナル抗体でも、ポリクローナル抗体でも良い。また抗体は固相化されたものでも、標識されたものでもよい。標識には、放射性同位元素による標識、電気化学発光する化合物による標識、蛍光標識、酵素標識、ビオチン標識等、様々な方法があるが、本発明はこれらの例に限られるものではない。抗体の作製法及び標識法は、例えば続生化学実験講座５免疫生化学研究法（社団法人日本生化学会編株式会社東京化学同人発行）または新生化学実験講座１２分子免疫学 III（社団法人日本生化学会編株式会社東京化学同人発行）に記載されている。

本明細書中において体液としては、生体より採取された血液・血漿・血清・脳脊髄液・臍帯血・尿・羊水・気管支肺洗浄液等が挙げられるが、このうち血液が好ましい。

本発明の方法では、通常には、酸性領域で抗チトクロムｃ抗体と試料中のチトクロムｃを反応させた後に、反応したチトクロムｃの検出を行う。検出は、好ましくは洗浄を行った後、標識された２次抗体を反応させ、標識に応じた検出法により、検出する方法が挙げられる。例えば、ビオチン標識された２次抗体を用いる場合は、さらに、アビジン標識されたペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼなどの酵素を反応させた後、該酵素の基質を用いて発光又は発色により検出することができる。また、酵素標識された２次抗体、蛍光標識された２次抗体、ルテニウム標識された２次抗体などを用いてもよい。

チトクロムｃを測定する免疫化学的方法の例としては、例えば下記の参考例に記載した方法で調製したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体を用いる方法が挙げられる。

さらに本発明は、体液中のチトクロムｃを免疫化学的に測定するキットに関する。本発明のキットは、抗チトクロムｃ抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キットである。例えば、キット付属の使用説明書に、酸性条件でチトクロムｃと抗チトクロムｃ抗体の反応を行う旨が記載されたキットが挙げられる。また、酸性に調整した反応用緩衝液を含むキットでもよい。本発明のキットは抗チトクロムｃ抗体の他に、２次抗体、チトクロムｃ標準液、希釈液、洗浄液、検出用の基質などを含むものでもよい。

通常には、本発明のキットは、体液、特に血液中のチトクロムｃをチトクロムｃに対する抗体を用いて定量するための試薬（チトクロムｃ測定試薬）を含む。チトクロムｃ測定試薬の一例として、サンドイッチ法によりチトクロムｃを測定する測定試薬は、例えば1).抗チトクロムｃ抗体コートカップ、あるいは抗チトクロムｃ抗体コートビーズ、2).標識抗チトクロムｃ抗体を含み、好ましくは更に3).既知濃度のチトクロムｃ標準液、4).希釈液、5).洗浄液を含有する試薬である。更に酵素標識であれば、6).発色基質、7).反応停止液が含まれてもよい。

本発明の測定キットは、血液中のチトクロムｃとチトクロムｃに対する抗体を酸性領域で反応させる緩衝液を含むことが好ましい。

本発明の測定キットに含まれる緩衝液は、そのままで反応に用いることができる緩衝液であっても、希釈して用いる緩衝液であっても許される。また、適当な量の酸性あるいはアルカリ性の溶液を加えて本発明に適した酸性領域のpHとなるように調整されたもの、あるいはその様な指示書を含むものであっても良い。

以下に、具体的な例をもって本発明を示すが、本発明はこれに限られるものではない。

［参考例１］抗チトクロムｃIgGの精製
ラットチトクロムｃ（シグマ社製）をウサギに免疫し、チトクロムｃに対する抗血清を得た。その抗血清に最終濃度2 Mになるように硫酸アンモニウムを添加し、室温（20-30℃）で５時間撹拌した。撹拌した溶液を10000回転で30分遠心し上清を捨て、沈殿物に0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2を加え溶解後、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.2にて透析した。

透析した溶液を、ウシチトクロムｃ（シグマ社）を結合したCNBr-Sepharose4B（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラムに流し、0.15M NaClを含む0.01Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5でカラムを洗浄後、0.1 M塩酸グアニジンでIgGを溶出した。溶出されたIgGを0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で透析し抗チトクロムｃIgG精製物とした。

［参考例２］抗チトクロムｃIgGF(ab’)₂ポリクローナル抗体の調製
精製した抗チトクロムｃIgGを0.1 M酢酸緩衝液pH 4.2で透析し、ペプシン（シグマ社）を蛋白質濃度比で20:1の割合になるように加え、37℃で16時間反応させた。1 N NaOHを加えpHを7.5に調整し、0.15 M NaClを含む0.01 Mトリス塩酸緩衝液pH 7.5で平衡化したSephacryl S-200（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラムに流しゲル濾過を行った。フラクションの第一ピークを集め、濃縮し、抗チトクロムｃIgG F(ab’)₂ポリクローナル抗体とした。

［参考例３］抗チトクロムｃモノクローナル抗体の作製
ヒトチトクロムｃ（R&D Systems社）110μg/100μLと65 mMリン酸緩衝液pH 7.5に溶解した2 mg/mLオブアルブミン55μLを混合して、そこへ65 mMリン酸緩衝液pH 7.5で希釈した1 mMグルタルアルデヒド42μLを加え、室温で２時間撹拌した。次に、0.15 M NaClで４℃において４８時間透析し、等量のFCAとアジュバントを作製し、BALB/Cマウス腹腔に0.1 mL免疫した。２週間おきに合計３回同様に免疫した。３回目の免疫の２週間後、マウスに生理食塩水に溶解したヒトチトクロムｃ50μg/100μLを尾静脈より静注した。３日後マウスから脾臓を摘出して、常法に従い、脾臓リンパ球をポリエチレングリコール法によりミエローマ細胞P3X63 Ag8U.1と細胞融合した。ヒトチトクロムｃを抗原としてスクリーニングを行い、ヒトチトクロムｃに対するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ（clone：3G7および27G9）を樹立した。

樹立したハイブリドーマをエスクロンSF-B培地（三光純薬社）で培養して増殖させ、BALB/Cマウス腹腔に接種した。１週間後、腹水を採取した。採取した腹水からプロテインＡを用いてIgGを精製し、抗チトクロムｃ抗体（3G7抗体および27G9抗体）を得た。

［参考例４］抗チトクロムｃ抗体固相化ビーズの作製
抗チトクロムｃモノクローナル抗体（clone：2B5F8（R&D Systems社）またはclone：6H2.B4（BectonDickinson社））を、0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）で透析し、OD 280 nmが0.56になるよう0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）で希釈した。希釈した抗体1.67 mLを、あらかじめ磁石を用いて0.15M NaClを含む0.1 M酢酸緩衝液（pH 4.2）3 mLで3回洗浄したビーズ（Dynabeads^R M-450 Epoxy, Dynal社）3.36 mL分と混合し、室温で１７時間撹拌した。次にビーズをブロッキングバッファー（50 mM Tris・HCl, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 0.1% NaN₃, pH7.5）3 mLで懸濁し、室温で７時間撹拌してビーズをブロッキングした。ブロッキングされたビーズを使用時に濃度を調整して測定に用いた。

［参考例５］ルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体の作製
参考例３で作製した抗チトクロムｃモノクローナル抗体（3G7抗体または27G9抗体）あるいは参考例２で作製した抗チトクロムｃIgG F(ab’)₂ポリクローナル抗体をPBSで透析し、抗体濃度を0.5 mg/mLから2 mg/mLの範囲に調製する。抗体1 mLに、ジメチルスルホキシドに10mg/mL濃度で溶解したルテニウム錯体（ruthenium(II) tris(bipyridyl) - N-hydroxysuccinimide, IGEN Corp. USA）を12.2μL加え室温で３０分撹拌した。次に2 M グリシンを50μL加え、室温で１０分撹拌した。それを、PBS-3（10 mMリン酸カリウム, 0.15M NaCl, 0.05% NaN₃, pH 6.0）であらかじめ平衡化したSephadex G-25（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラム（1.5 cmφ x 30 cm）にアプライしてPBS-3で溶出し、1 mLでフラクション分取した。各フラクションのOD 280 nmを測定し、第１ピークのフラクションを集めルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体とした。抗体濃度をMicro BCA protein Assay kit（PIERCE社）を用いて測定した。

［参考例６］ヒトチトクロムｃ標準抗原の調製
チトクロムｃ標準抗原は、ヒトチトクロムｃ（R&D Systems社）を5% BSA、0.15 M NaCl, 0.1% NaN₃を含む0.15 Mリン酸ナトリウム緩衝液pH 7.4で1000 ng/mL, 500 ng/mL, 100 ng/mL, 50 ng/mL, 10 ng/mLに希釈して作製した。

［実施例１］ヒト血清中のチトクロムｃ測定値に対するpHの影響
緩衝液に30、100、500、1000 ng/mLとなるように希釈したヒトチトクロムｃ（抗原１、抗原２、抗原３、抗原４）、血清１、血清２及び血清３の20μLを、酸性検体希釈液（0.15M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102（日本油脂社製）, 0.1% NaN₃を含む0.1 Mクエン酸リン酸緩衝液pH 4.0）、または中性検体希釈液（0.15M NaCl, 15mM EDTA, 5% N102（日本油脂社製）, 0.1% NaN₃を含む0.1Mクエン酸リン酸緩衝液pH 7.5）200μLに加えた。

以下の測定は、電気化学発光酵素免疫測定機ピコルミ^R８２２０（三光純薬社）を用いて行った。

1% BSA, 0.3% スクロース, 0.01 容量% Tween 20, 0.1% NaN₃を含む0.15 M PBS, pH 7.5でビーズ濃度1mg/mLに調整した抗チトクロムｃ抗体固相化ビーズ25μLを加えて９分反応させ、ピコルミ^R BF洗浄液（三光純薬社）350μLで2回洗浄後、1% BSA, 0.3% スクロース, 0.01 容量% Tween 20, 0.1% NaN₃を含む0.15 M PBS, pH 7.5で0.5−１μg/mL濃度に調整したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体200μLを加えて９分反応させた。ピコルミ^R BF洗浄液350μLで2回洗浄後、ピコルミ^R発光電解液（三光純薬社）を300μL加えて発光カウント値を計測した。

横軸にヒトチトクロムｃ標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロムｃ標準抗原のカウント値をプロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、抗原１、抗原２、抗原３、抗原４、血清１、血清２及び血清３の発光カウント値からそれぞれに含まれるチトクロムｃ量を算出した。

次いで、抗原と抗原、あるいは抗原と血清をそれぞれ10μLずつ混合し、同様に酸性検体希釈液あるいは中性検体希釈液200μLを加えて、電気化学発光酵素免疫測定法にてチトクロムｃ量を算出して、その実測値と理論値を比較して回収率を求めた。ビーズに抗チトクロムｃモノクローナル抗体6H2.B4抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として抗チトクロムｃIgG F(ab’)₂ポリクローナル抗体を用いた結果を表１に、ビーズに2B5F8モノクローナル抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として27G9モノクローナル抗体を用いた結果を表２に示す。

どちらの抗体系を用いた場合においても、抗原のみの場合はpHにかかわらず100%に近い回収率を示すのに対し、血清が加わるとpH 7.5では回収率が2-20%近くまで低下し、pH 4にすることで回収率が100%に回復することが明らかとなった。

また、どちらの組合せの抗体を用いた場合でも、pH 4の緩衝液中での測定感度が、1 ng/mL以上であることが確認され、この条件が感度・回収率の両方を満たすものであることが示された。

［実施例２］こはく酸緩衝液を用いたヒト血清中のチトクロムｃ測定
クエン酸リン酸緩衝液に代えてこはく酸緩衝液を用いてヒト血清中のチトクロムｃの測定を行った。

検体希釈液（0.1M こはく酸, 0.15M NaCl, 2% リピジュアBL802（日本油脂社）, 2% リピジュアBL405（日本油脂社）, 15mM EDTA・2Na, 0.1% NaN₃, pH4.0）200μLに、緩衝液（0.05M Tris・HCl, pH7.8, 5% BSA, 0.15M NaCl, 0.1% NaN₃）で5、10、100、1000、3000 ng/mLとなるように希釈したヒトチトクロムｃ（抗原１、抗原２、抗原３、抗原４、抗原５）、血清１、血清２、血清３及び血清４の20μLを加えた。

1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3％トレハロース, 0.01 v/v % Tween20, 10-mM EDTA・2Na, 25μg/mLマウスIgG, 0.1% NaN₃を含む0.05 M Tris・HCl, pH7.5,でビーズ濃度1mg/mLに調整した抗チトクロムｃ抗体固相化ビーズ25μLを加えて９分反応させ、ピコルミ^R BF洗浄液（三光純薬社）350μLで2回洗浄後、1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3％トレハロース, 0.01 v/v % Tween20, 0.3% NaN₃を含む0.05M Tris・HCl, pH7.5で濃度1μg/mLに調整したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体200μLを加えて９分反応させた。ピコルミ^R BF洗浄液350μLで2回洗浄後、ピコルミ^R発光電解液（三光純薬社）を300μL加えて発光カウント値を計測した。

横軸にヒトチトクロムｃ標準抗原濃度、縦軸にヒトチトクロムｃ標準抗原のカウント値をプロットして標準曲線を描き、その標準曲線を基に、抗原１、抗原２、抗原３、抗原４、抗原５、血清１、血清２、血清３及び血清４の発光カウント値からそれぞれに含まれるチトクロムｃ量を算出した。

ビーズに抗チトクロムｃモノクローナル抗体2B5F8抗体を固相化し、ルテニウム錯体標識抗体として抗チトクロム27G9モノクローナル抗体あるいは6H2.B4モノクローナル抗体を用いた結果を表３に示す。この試薬を用いた場合においても、回収率が100%を示し、測定感度が、1 ng/mL以上であることが確認され、この条件も感度・回収率の両方を満たすものであることが示された。

［実施例３］チトクロムｃの正確な測定を妨げるヒト血清中の妨害物質の同定
（１）ヒト血清のゲルろ過
ヒト血清2mLを、PBSを溶出液としてSephacryl S-200（GEヘルスケアバイオサイエンス社）カラムゲルクロマトグラフィー（サイズφ2.5cm × 120cm）によりゲルろ過し、１フラクション約7 mLで分取した。各フラクション0.5 mLに、ヒトチトクロムc（R&D Systems社）を10μg/mLの濃度に精製水で溶解したものを 50μL加えて混合し、その50μLを反応用溶液（0.15 M PBS, 15 mMEDTA, 1% BSA, 0.1% NaN₃, pH 7.5）50μLで希釈した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ^R8220（三光純薬社）を用い、参考例で作製した抗チトクロムｃ抗体(2B5F8)結合ビーズ、1% BSA, 0.3% スクロース, 0.01容量% Tween20, 0.1% NaN₃を含む0.15M PBS, pH7.5で2μg/mLに希釈した参考例で作製したルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体(3G7)、ピコルミ^R発光電解液（三光純薬社）、ピコルミ^R BF洗浄液（三光純薬社）、ピコルミ^Rセルクリーナー液（三光純薬社）、ピコルミ^Rノズルリンス液（三光純薬社）をセットし、抗チトクロムc抗体結合ビーズ分注量25μL、ルテニウム標識抗チトクロムc抗体分注量100μL、ピコルミ^R発光電解液分注量300μL、１ステップ、反応時間26分の条件で測定した。

その結果、フラクションNo.41付近で発光カウント値が減少した。したがって、フラクションNo.41にチトクロムcと抗チトクロムc抗体との反応を阻害する妨害物質が含まれていることがわかった（図１）。

（２）妨害物質が含まれるフラクションの２次元電気泳動と質量分析による同定
Hiroyuki Katayama et al., Optimization of in-gel protein digestion system in combination with thin-gel separation and negative staining in 96-well plate format : Rapid Commun. in Mass Spectrom. 2003; 17 : 1071-1078に記載されている方法を参考にして、妨害物質が含まれるフラクションを２次元電気泳動で分離し、各スポットを質量分析により同定した（プロテオーム技術）。

ゲルろ過フラクションNo.41の0.5 mLをSwell Gel^RBlue Albumin Removal kit (PIERCE社)を用いて、アルブミン除去処理した。次に、二次元電気泳動を行うため、膨潤バッファー（8 M 尿素, 2%CHAPS, 0.5% IPG Buffer, ブロモフェノールブルー, 0.6% ジチオスレイトール）0.44 mLとアルブミン除去したゲルろ過フラクション0.11 mLを混合し、そこへ等電点電気泳動用ゲルImmobilize Dry Strip pH3-10, 18cm (GEヘルスケアバイオサイエンス社)を浸し、室温で一晩放置し、ゲルを膨潤させた。ゲルをCoolPhoreStarIPG-IEF Type-P（アナテック社）にセットし、PowerPhoreStar Pro（アナテック社）で500V2h, 700V1h, 1000V1h, 1500V1h, 2000V1h, 2500V1h, 3000V1h, 3500V10h〜の電圧をかけて、電気泳動を行った。泳動したゲルをSDS処理バッファー（50 mM Tris・HCl, pH 6.8, 6 M 尿素, 0.25% ジチオスレイトール, 2% SDS, 0.0025%ブロモフェノールブルー, 30容量% グリセロール）に浸して室温で10min撹拌し、次に、還元アルキル化処理バッファー（50 mMTris・HCl, pH 6.8, 6 M 尿素, 2%SDS, 0.0025%ブロモフェノールブルー, 30容量% グリセロール, 4.5%ヨードアセトアミド）に浸して室温で10 min撹拌した後、2Dクイックゲル（アナテック社）にセットし、電気泳動した。泳動したゲルをCoomasie Briliant blueで染色して、スポットをカッターで切り出した。

切り出したゲルをカッターで細かく砕き、チューブに入れ50 mM NH₄HCO₃:アセトニトリル=1:1を100μL注入し、室温で60分撹拌した。50 mM NH₄HCO₃:アセトニトリル=1:1を入れ替え、さらに室温で40分撹拌しCoomasie Briliantblueを脱色した。

洗浄液（50% メタノール、10% 酢酸、40% 精製水）100μLで置換し、4℃で保存一時保存した。洗浄液を除去し、50 mM NH₄HCO₃:アセトニトリル=1:1を用いて100μL/tubeで3回洗浄した。次に、100 mM NH₄HCO₃を100μL/tube入れて、室温で5分間撹拌した。液を除去し、DTT 2.5 mg/mLを含む100 mM NH₄HCO₃を100μL/tube入れて、15分間撹拌した。液を除去し、アクリルアミド45 mg/mLを含む100 mM NH₄HCO₃を100μL/tube入れ15分間撹拌した。液を除去し、メタノール：酢酸：精製水＝5：1：4を500μL/tube入れ、室温で16時間撹拌した。液を入れ替えてさらに室温で30分間撹拌した。液を除去し、50 mM NH₄HCO₃を500μL/tube入れ、室温で10分間撹拌した。液を除去し、アセトニトリル500μL/tube入れ、室温で5分間撹拌した。

チューブのふたを開け、減圧遠心乾燥機（トミー精工社、Speed vac）にセットし、乾固するまで減圧乾燥させた。次に、0.2% n-オクチルグルコシド（シグマ社）液：50 mM NH₄HCO₃＝1：1液45μLに200μg/mLトリプシンを5μL加えた液を2.5μLとり、乾燥させたゲルに加え、室温で5分間反応させた。そこへ50 mM NH₄HCO₃:0.2% n−オクチルグルコシド液＝1：1を8μL加え、37℃で16時間放置した。そこへ、0.1% TFAを含む50% アセトニトリルを40μL加え、10分間超音波水槽にかけた。液を別なチューブに移し、残ったゲルに、0.1% TFAを含む75%アセトニトリルを40μL入れ、超音波水槽で10分間処理した。液を取り出し、先に別チューブに移しておいた液と合わせた。次に、凍結真空乾燥機で液を乾燥させた。

乾燥させたサンプルに0.1% TFAを含む5%アセトニトリルを50μL入れ、撹拌してサンプルを溶解した。C18逆相クロマトグラフィー用ゲルを詰め、あらかじめメタノール200μLと50μLで2回洗浄したカラムに、溶解したサンプルを全量アプライした。2000 rpm、5分遠心し、アプライしたサンプルを完全に流した。次に、カラムに0.1% TFAを含む5%アセトニトリルを50μL入れ、2000 rpm、 5分遠心し洗浄した。この洗浄を3回行った。次に、0.1% TFAを含む95%アセトニトリルを25μL入れ、2000 rpm、 5分遠心しサンプルを溶出した。溶出された液を37℃に放置し、液を乾燥させた。

0.1% TFAを含む5%アセトニトリルをチューブに入れてサンプルを溶解し、LC-MASS分析装置（サーモエレクトロン社、LCQ）を用いて、質量解析を行い、二次元電気泳動において得られたスポットを同定した。結果を図２に示した。

（３）同定された蛋白質のチトクロムｃ測定に対する影響
同定された蛋白質のうち、アルブミンを除く市販されていて入手可能なものについて、蛋白質をチトクロムcの測定系に添加して、チトクロムc測定を行い、妨害活性があるか調べた。

1).ヒトトランスフェリン(Biogenesis社)6.5 mgを精製水0.65 mLで溶解し10 mg/mLのトランスフェリン溶液を調製した。
2).ヒトα1酸性糖蛋白質（Athens Research&Technology社）1 mgを0.5 mLのPBS-1で溶解し、α1酸性糖蛋白質溶液とした。
3).ヒトα1アンチトリプシン（CALBIOCHEM社）1 mgを0.33 mLの精製水で溶解し、α1アンチトリプシン溶液とした。
4).ヒトトランスチレチン(プレアルブミン)（Sigma社）1 mgを0.3 mLの0.15 M NaClを含む50mM リン酸緩衝液pH 7.5で溶解しトランスチレチン溶液とした。
5).ヒトビタミンD結合蛋白質(Gc-グロブリン)(CALBIOCHEM社)1 mgを0.5 mLの精製水で溶解し、ビタミンD結合蛋白質溶液とした。

反応用溶液（0.15M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN₃, pH 7.5）100μLに、同定された蛋白質の溶液を0または10μL、ヒトチトクロムc（10μg/mL）を1μL添加した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ^R8220（三光純薬社）を用い、参考例で作製した抗チトクロムｃ抗体(2B5F8)結合ビーズ、ルテニウム錯体標識抗チトクロムｃ抗体(27G9)、ピコルミ^R発光電解液（三光純薬社）、ピコルミ^RBF洗浄液（三光純薬社）、ピコルミ^Rセルクリーナー液（三光純薬社）、ピコルミ^Rノズルリンス液（三光純薬社）をセットし、抗チトクロムc抗体結合ビーズ分注量25μL、ルテニウム標識抗チトクロムc抗体分注量100μL、ピコルミ^R発光電解液分注量300μL、１ステップ、反応時間26分の条件で測定した。その結果、α1酸性糖蛋白質およびα１アンチトリプシンに添加回収率の低下が認められ、妨害活性を有することがわかった（表４）。

（４）同定された妨害物質の酸性領域でのチトクロムｃ測定に対する影響
反応条件を以下に示す酸性条件、または、中性条件で、測定方法に従って測定した。
1）酸性条件
・酸性反応用溶液（0.05 M クエン酸, 1% BSA, 0.15 M NaCl, 15 mM EDTA, pH 4.0）
・ルテニウム希釈液（0.05 M クエン酸, 1% BSA, 0.15M NaCl, 0.3% スクロース, 0.01% Tween20, pH 4.0）
2）中性条件
・中性反応用溶液（0.15 M PBS, 15 mM EDTA, 1% BSA, 0.1% NaN₃, pH7.5）
・ルテニウム希釈液（0.15 M PBS, 1% BSA, 0.3% スクロース, 0.01% Tween20, 0.1% NaN₃, pH 7.5）

3）測定方法
反応用溶液100μLに、妨害活性の認められた蛋白質の溶液であるα1酸性糖蛋白質液（2mg/mL）またはα1アンチトリプシン液（3mg/mL）10μL、及び、ヒトチトクロムc（R&D Systems社）を10μg/mLの濃度に精製水で溶解したもの1μLを加えて混合した。これを、電気化学発光免疫自動測定機ピコルミ^R8220（三光純薬社）を用い、参考例で作製した抗チトクロムｃ抗体(2B5F8)結合ビーズ、ルテニウム希釈液で希釈した参考例で作製したルテニウム標識抗チトクロムｃ抗体(3G7)、ピコルミ^R発光電解液（三光純薬社）、ピコルミ^R BF洗浄液（三光純薬社）、ピコルミ^Rセルクリーナー液（三光純薬社）、ピコルミ^Rノズルリンス液（三光純薬社）をセットし、抗チトクロムc抗体結合ビーズ分注量25μL、ルテニウム標識抗チトクロムc抗体分注量100μL、ピコルミ^R発光電解液分注量300μL、１ステップ、反応時間26分の条件で測定した。

その結果、表５に示すとおり、ヒト血清中での測定と同様に抗原抗体反応時のpHを下げることで妨害活性を回避できることが明らかとなった。

妨害活性を有する物質は共に酸性度の高い蛋白質であり、これら酸性度の高い蛋白質が塩基性の強いチトクロムｃと相互作用することにより、チトクロムｃの測定に影響を与えていたと考えられる。酸性領域で測定することによりチトクロムｃと妨害物質の相互作用は弱くなることから、酸性領域では正確な定量が可能となったものと考えられる。従って、実施例で試験した以外の抗体に関しても、酸性領域とすることでチトクロムｃの正確な測定が可能となるものと考えられる。

産業上の利用の可能性

体液中のチトクロムｃが体内で起こっているアポトーシスの指標となることが知られ、多くの疾患の診断薬として有効であることが明らかとなっている。本願の酸性領域の緩衝液を用いるチトクロムｃの免疫化学的測定法により、より正確なチトクロムｃ量の測定が可能となり、本方法の診断薬への応用が期待される。

Claims

体液中のチトクロムｃを免疫化学的に測定する方法であって、抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うことを特徴とする方法。
酸性領域がpH 3.5からpH 5.0である請求項１に記載の方法。
体液が血液である請求項１又は２に記載の方法。
体液中のチトクロムｃを免疫化学的に測定するキットであって、少なくとも、
（１）チトクロムｃと反応する抗体及び（２）酸性領域で反応させる緩衝液を含む、抗体とチトクロムｃの反応を酸性領域の緩衝液中で行うための測定キット。
酸性領域がpH 3.5からpH 5.0である請求項４に記載の測定キット。
チトクロムｃと反応する抗体が、固相化した抗体及び／又は標識した抗体である、請求項４又は５に記載の測定キット。
体液が血液である請求項４から６のいずれか一項に記載の測定キット。