JP5120848B2

JP5120848B2 - 血管新生阻害剤及び血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤並びに食品

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Description

本発明は、ビルベリー抽出物を有効成分とする血管新生阻害剤，及び血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，並びに血管新生阻害用の食品に関する。

血管新生（angiogenesis）とは、成人の健常人体にみられる生理的な現象であり、「生体内に元々ある血管から、新しい血管が形成されるプロセス」である。
つまり、血管新生は、人体に必要な生理現象である。

その一方、加齢性黄斑変性症（ARMD），糖尿病性網膜症，癌，乾癬，慢性関節性リウマチ，変形性関節症等に代表される、種々の眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症その他の疾病において、腫瘍や癌の増殖・転移，組織の肥大化の際、癌・腫瘍・肥大化組織への栄養供給のために血管新生が起こっていることが分かっている。

従って、これらの疾病は、「血管新生」と「血管新生の抑制」のバランスを、健常人の持つ適度な状態に戻すことによって、予防または治療できると考えられる。

近年、血管新生促成因子として知られている血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ：ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）の阻害剤（抗VEGFアプタマー），つまり一種の血管新生阻害剤の、臨床応用が実現し、増殖糖尿病網膜症に対する治療剤としての有効性が確認されている。

一方、ビルベリー抽出物は、非特許文献１に記載されているように、その成分であるアントシアニンによる効能が種々知られており、例えば、糖尿病や網膜症，関節炎等に対する治療効果が示唆されている。

しかしながら、この文献においては、血管新生阻害に関する記載は一切無く、「血管拡張作用，血栓形成予防，血行促進，毛細血管を強くする」等の記載からは、ここで示唆する「糖尿病性網膜症に対する治療効果」とは、血管が脆くなり出血する網膜出血への治療効果を意味していると考えられる。つまり、この文献では、血管新生阻害とは関係の無い、血管増強剤としての効果が述べられているに過ぎない。

機能性食品素材便覧（特定保健用食品からサプリメント・健康食品まで）（薬事日報社，2004年4月20日発行，P.385〜386）

本発明の目的は、ビルベリー抽出物の新たな効能に着目し、新規な血管新生阻害剤，及び血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，あるいは食品を提供することにある。

上述の目的は、ビルベリー抽出物を含むことを特徴とする血管新生阻害剤，ビルベリー抽出物を含むことを特徴とする、PLCγからＥＲＫ１又はＥＲＫ２へのシグナル伝達の阻害剤，ビルベリー抽出物を含むことを特徴とする、VEGFレセプターからＡｋｔへのシグナル伝達の阻害剤，ビルベリー抽出物が、ビルベリーのエタノール抽出物又は含水エタノール抽出物であることを特徴とする前記血管新生阻害剤，前記血管新生阻害剤を有効成分として含むことを特徴とする、血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，血管新生を伴う疾病が、眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症である、前記疾病予防又は治療剤，及び血管新生を伴う疾病が、加齢性黄斑変性症，糖尿病性網膜症，新生血管緑内障，増殖性糖尿病網膜症，未熟児網膜症，滲出型加齢黄斑変性症，血管新生緑内障，網膜静脈閉塞症，網膜動脈閉塞症，翼状片，ルベオーシス，角膜新生血管症，固型腫瘍，骨髄腫，血管腫，慢性関節性リウマチ，乾癬，又は変形性関節症である、前記疾病予防又は治療剤，並びに前記血管新生阻害剤を含む血管新生阻害用の食品によって達成される。

本発明の血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤は、増殖糖尿病網膜症等の疾病における血管新生を有意に抑制することから、いわゆる実験・研究用試薬として使用可能である他、過剰な血管新生を伴う疾病の予防又は治療剤，あるいは健康食品等の有効成分として有用である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の血管新生阻害剤やシグナル伝達阻害剤においては、有効成分としてビルベリー抽出物を有効成分として用いる。

ビルベリー（bilberry，whortleberry，huckleberry，Vaccinium myrtillus）とは、ローブッシュ・ブルーベリーと言われるブルーベリーの一種であり、つつじ科コケモモ属に属する。ビルベリーは、アメリカやカナダ，北欧等に広く自生している。

ビルベリー抽出物とは、主にビルベリーの果実からの抽出物が好適に用いられ、例えば実を潰して、下記の抽出溶媒に浸漬することで、製造することができる。

抽出には、例えばアルコール等が用いられ、具体的にはエタノール，含水エタノール（９５％含水エタノール等）等が挙げられる。

抽出は、例えば、ビルベリー１００ｋｇを、エタノール又は９５％含水エタノール５００〜２０００リットルに、５〜２０時間，好ましくは１０〜１７時間浸漬し、濾過することによって製造することができる。

本発明で用いられるビルベリー抽出物を、血管新生阻害剤やシグナル伝達阻害剤，血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤あるいは食品として使用する際には、抽出液そのままで用いることもできるが、濃縮物，乾燥物として用いることもできる。乾燥方法としては、スプレードライ（噴霧乾燥），凍結乾燥，熱風乾燥等が挙げられる。

本発明の血管新生阻害剤やシグナル伝達阻害剤，血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，あるいは食品には、その阻害効果や予防又は治療効果を阻害しない範囲で、他の成分を含有させることができ、例えば薬学的に許容される担体として、賦形剤，滑沢剤，結合剤，崩壊剤，安定剤，矯味矯臭剤，希釈剤，界面活性剤，乳化剤，可溶化剤，吸収促進剤，保湿剤，吸着剤，充填剤，増量剤，付湿剤，防腐剤等の添加剤を用いて周知の方法で製剤化することができる。

ここに、賦形剤としては、有機系賦形剤及び無機系賦形剤等が挙げられる。

本発明の血管新生阻害剤やシグナル伝達阻害剤，血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，あるいは食品は、液状，シロップ状，粉末，顆粒，硬カプセル，軟カプセル，錠剤，散剤，丸剤，トローチ，パップ剤，貼付剤，DDS製剤等の様々な形態で用いることができる。

本発明の血管新生阻害剤やシグナル伝達阻害剤，血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，あるいは食品の投与形態としては、静注等の静脈投与，筋肉内投与，経皮投与，経鼻投与，皮内投与，皮下投与，腹腔内投与，直腸内投与，粘膜投与，吸入，経口投与等が挙げられ、特に限定されない。

眼科疾患の場合には、例えば眼局所投与用製剤を用いた投与は、血管新生阻害作用を有する有効成分が、患部に迅速かつ確実に到達するため、好ましい。

当該眼局所投与用製剤は、前述のビルベリー抽出物を有効成分とし、汎用されている技術を用いて硝子体内投与用注射剤、点眼剤又は眼軟膏などの眼局所投与用製剤に調製することにより製造することができる。

例えば、硝子体内投与用注射剤は、常法によって前記ビルベリー抽出物を注射用蒸留水に溶解させて製造することができ、適宜、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビット、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース等の等張化剤、アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤等を製剤中に添加することができる。又、クエン酸等の酸、ジイソプロパノールアミン等の塩基をｐH調整剤として製剤中に添加することもできる。

硝子体内投与用注射剤は、用時溶解用の凍結乾燥製剤とすることもできる。凍結乾燥製剤は、前記ビルベリー抽出物を常法により凍結乾燥することによって製造することができ、適宜、上記、等張化剤、安定化剤、保存剤、ｐH調整剤等を製剤中に添加することができる。

点眼剤は、常法によって前記ビルベリー抽出物を蒸留水に溶解させて製造することができ、適宜、マンニトール、塩化ナトリウム、グルコース、ソルビット、グリセロール、キシリトール、フルクトース、マルトース、マンノース、グリセリン等の等張化剤、エデト酸ナトリウム、アルブミン等の安定化剤、ベンジルアルコール、パラヒドロキシ安息香酸メチル等の保存剤、ポリオキシエチレンモノオレート、ステアリン酸ポリオキシル４０等の界面活性化剤等を製剤中に添加することができる。又、クエン酸等の酸、ジイソプロパノールアミン等の塩基をｐH調整剤として製剤中に添加することもできる。更に、より優れた効果を得るために、点眼剤に通常用いられる上記の添加剤に加え、ヒアルロン酸又はその塩、及び/又はポリカーボフィル等のポリマーを適宜添加することもできる。

また、本発明の血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤，又は血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤は、従来知られている眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症の予防又は治療剤との合剤としても良い。

本発明の血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤，又は血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤は、血管新生を有意に抑制することから、血管新生を伴う眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症の予防又は治療剤として有効に用いられる。

本発明の予防又は治療剤の使用対象となる、血管新生を伴う眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症としては、加齢性黄斑変性症，糖尿病性網膜症，新生血管緑内障，増殖性糖尿病網膜症，未熟児網膜症，滲出型加齢黄斑変性症，血管新生緑内障，網膜静脈閉塞症，網膜動脈閉塞症，翼状片，ルベオーシス，角膜新生血管症，固型腫瘍，骨髄腫，血管腫，慢性関節性リウマチ，乾癬，又は変形性関節症等が挙げられる。中でも、糖尿病性網膜症，新生血管緑内障，増殖性糖尿病網膜症等に特に有効である。

本発明の血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤，及び本発明の予防又は治療剤は、食品成分として安全性が確認されているビルベリー抽出成分を用いているため好ましい。また、眼局所に投与した場合、患部にて効果を発現した後、速やかに代謝されることから、安全性が高く、糖尿病網膜症、特に増殖糖尿病網膜症等の眼科疾患の予防又は治療に有効に用いることができる。

本発明の血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤，又は血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤の投与量は、患者の病態、年齢、体重、剤形等によって適宜選択することができ、限定されるものではないが、例えば有効性成分の前記ビルベリー抽出物を、１回当たり0.01〜１０ｇ，好ましくは0.3〜3ｇを、一日１〜数回投与する。
また、眼科疾患の予防又は治療等における、眼局所投与用製剤を用いた投与の場合には、有効性成分の前記ビルベリー抽出物を０．００１〜５重量％含有する眼局所投与用製剤を1日に1回又は数回に分けて適量投与すればよい。例えば、点眼剤の場合、有効性成分の前記ビルベリー抽出物を０．００１〜１重量％含有する当該製剤を１日１回又は数回、1滴〜数滴点眼すればよい。また、硝子体内投与用注射剤の場合、有効性成分の前記ビルベリー抽出物を０．０１〜１重量％含有する当該注射剤を１日１回、０．５ｍｌ〜１ｍｌ投与すればよい。

本発明の血管新生阻害用の食品は、上記血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤等を、食品として用いられる成分とともに配合し、常法により製造することができる。その形態としては、液状，粉末状，顆粒状，ペースト状，ゼリー状等の各種のものが挙げられる。

以下に試験例を挙げて本発明の効果について説明する。

試験例１
血管新生抑制作用（血管新生キットを用いたｉｎｖｉｔｒｏ試験）：
本発明の糖尿病網膜症治療剤の血管新生抑制作用について、血管内皮細胞の管腔形成を指標とする血管新生キットを用いて検討した。

（１）試験成分：
ビルベリーのエタノール抽出物（粉末状）
ビルベリー１００ｋｇに対し、エタノール又は９５％含水エタノール１０００リットルに浸漬し、１５時間時間後、濾過し、更にスプレードライで乾燥することによって、粉末状のビルベリー抽出物を製造した。

（２）試験材料及び試験方法：

（試験材料）
ヒトさい帯静脈血管の血管内皮細胞と線維芽細胞の共培養系である血管新生キット（クラボウ）を用いて検討した。VEGF-Ａ，血管新生専用培地−２，CD３１抗体は、本キットに付属しているものを使用した。

（試験方法）
本試験は、当該血管新生キットの付属説明書に従って実施した。培養系として、正常群（Ｎ），VEGF投与群（Ｖ），VEGF及び各種濃度の試験成分投与群の３群を用意した。試験成分は、DMSO（dimethyl sulfoxide ジメチルスルホキシド＝溶剤・外用消炎鎮痛剤に使用される試薬）で１００ｍM溶液に調製後、０．１〜１００μMの濃度に希釈して本試験に供した。

本試験の評価は、１群あたり４ウェルを使用し、培地交換は、培養１日（キット入荷日）、４日、７日及び９日目に行い、培養１１日目に細胞をエタノール固定後、CD３１抗体により血管内皮細胞を染色した後、顕微鏡下で各ウェルの上下左右及び中央の５点をデジタルカメラで撮影し、血管新生定量ソフトウェアVer.2（クラボウ）を用いて、〈１〉管腔面積（ａｒｅａ）、〈２〉管腔長（length）、〈３〉管腔分岐点数（ｊｏｉｎｔ）及び〈４〉枝数（ｐａｔｈ）の4項目を解析することにより行った。

（統計処理）
VEGFの血管新生促進効果を確認するため、正常群とVEGF投与群とをＳｔｕｄｅｎｔ‘ｓｔｔｅｓｔで解析した。また、試験成分の血管新生抑制効果を確認するため、VEGF投与群と、VEGFと試験成分を投与した群とを、Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓｍｕｌｔｉｐｌｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｅｓｔで解析した。両検定とも有意水準は5％とした。

（３）試験結果：
試験結果は、上記〈１〉〜〈４〉の4項目それぞれについて、撮影した上記5点の平均値を各ウェル値とし、平均値±標準誤差を図１〜４に示した（Mean ±S.E.M（n=3-6). **p＜0.01 vs VEGF）。また、血管新生抑制作用を示す管腔形成図を図５〜８に示した。

図１〜４及び５〜８に示すとおり、ビルベリーのエタノール抽出物は、VEGFによる血管新生促進効果を濃度依存的に、有意に抑制した。また、培養期間中の顕微鏡下における観察において、ビルベリーのエタノール抽出物の影響による細胞の形態変化が認められず、ビルベリーのエタノール抽出物の細胞毒性は確認されなかった。

試験例２
血管新生抑制作用（マウス高酸素負荷網膜血管新生モデルによるｉｎｖｉｖｏ試験）：
本発明の血管新生阻害剤の血管新生抑制作用について、マウス高酸素負荷網膜血管新生モデルを用いて検討した。

（１）試験成分：
ビルベリーのエタノール抽出物（粉末状）
試験例１と同様にして製造した、粉末状のビルベリー抽出物を使用した。

（２）試験材料及び試験方法：

（試験材料）
試験動物としては、妊娠18日目のマウスC57/black6（日本エスエルシー株式会社）を購入し、その新生児を使用した。

（試験方法）
（２）−１高酸素負荷条件：
本モデルはスミス等の方法（スミスリー（Smith LE）等, Invest Ophthalmol Vis Sci. 1994;35(1):101-111.）に準じて行った。すなわち、生後7日目(postnatal day 7:P7)のマウスを75±１％の高酸素条件下、動物用チャンバーでP12まで飼育した。
酸素濃度の制御は、PROOX model 110（Biospherix）を使用した。
高酸素負荷後、マウスを動物用チャンバーから取り出し、P17まで正常条件下で飼育した。

（２）−２硝子体内投与
高酸素負荷後(P12）、新生児マウスを2.5% イソフルレン下で麻酔し、左眼にSaline（溶媒：生理食塩水）を、右眼に0.3 mg/mLビルベリー抽出物を各々1μL投与した。投与針はハミルトン・シリンジに32Gの針を付けたものを使用した。溶媒又はビルベリー抽出物を硝子体内に投与後、投与による細菌感染や炎症を抑えるため、眼表面にクラビット点眼液（登録商標）（参天製薬株式会社）を１μL滴下した。

〈硝子体内投与の群構成〉

硝子体の容積を約10μLとして、ビルベリー抽出物の硝子体内推定濃度を算出した。

（２）−３ FITC-dextranによる網膜血管の染色
マウスをネンブタールで麻酔後、左心室から2×106 FITC-dextran (20 mg/mL, Sigma)を1 mL全身灌流した。全身灌流後、眼球を摘出し、4%パラホルムアルデヒド中で4〜24時間固定した。固定した眼球は角膜・水晶体を除去し網膜を採取してスライドグラス上でフラットマウントにした。フラットマウント状の網膜はVECTASHIELD(Vector)にて封入しカバーガラスをのせ、縁を透明なマニュキュアで覆った。

（２）−４ FITC-dextran染色された網膜血管の撮影
フラットマウントにした網膜を、ハロゲンランプ（U-UHL, OLYMPUS）を用いて顕微鏡（BX50, OLYMPUS）下で観察し、各蛍光像を高感度冷却CCDカメラ（DP30BW, OLYMPUS）で撮影した。

（２）−５新生血管房領域の算出
CCDカメラで取得した画像は、画像解析ソフト（Metamorph, Molecular Devices）を用いて新生血管房の面積を測定した。新生血管房の面積が小さい程、血管新生が抑制されていることを示す。

結果は平均値±標準誤差で示した（mean ± SEM.）。また、FITC-dextranの全身灌流の際、灌流不良などの理由により網膜血管が染色されなかった標本についてはデータから除外した。

（２）−６統計処理
溶媒投与群とビルベリー抽出物投与群の2群間についてPaired t testで解析し、有意水準は5％とした（*p ＜ 0.05 vs. saline (paired t-test )。

（３）試験結果：
マウス高酸素負荷網膜血管新生モデルを用いてビルベリー抽出物の血管新生抑制効果について評価した。高酸素負荷後、溶媒（Saline）およびビルベリー抽出物を硝子体内投与した。

高酸素負荷においた後、溶媒投与したマウス，及びビルベリー抽出物を投与したマウスの、網膜の血管造影図を各々図９，１０として示す。

前網膜新生血管（新生血管房）領域は溶媒投与群で0.98±0.24 mm² (n = 9)であったのに対し、ビルベリー抽出物投与群では0.51±0.07 mm² (n = 9)であった。
つまり、ビルベリー抽出物投与群は溶媒投与群に比して有意(p ＜ 0.05)に網膜血管新生を抑制した（図１１)。
なお、その他、被験動物に何ら異常は認められなかった。

従って、上記ｉｎｖｉｔｒｏ及びｉｎｖｉｖｏ試験の結果から、本発明の血管新生阻害剤は、血管新生を有意に抑制し、眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症等の血管新生を伴う疾病の予防又は治療に用いることができることは明らかである。

試験例３
VEGF-A（Vascular endothelial growth factor;血管内皮増殖因子）が誘導するHUVEC（Human umbilical vein endothelial cell;ヒト臍帯静脈内皮細胞）増殖に対する、ビルベリー抽出物の作用試験：

（２）試験方法：

標記確認試験を、Matsubaraらの増殖試験方法（Proliferation assay）を参照にして行った（Matsubara, K et al. J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 6272‐6275）。
HUVECを1ウェルあたり2000 cellずつ96ウェルマルチウェルプレートへ播種し、培養12時間後、2％FBS（ウシ胎児血清）を含有したHuMedia-EB2（倉敷紡績株式会社）へ培地交換し、6時間培養した。その後、図面に記載した濃度の、VEGF-A（終濃度10 ng/ml）及び／又は各種濃度のビルベリー抽出物（終濃度それぞれ0.3，1，3，10，30 μg/ml）をそれぞれ添加した。培養48時間後、2％FBS含有HuMedia-EB2培地へ交換し、再度、VEGF-A及び／又はビルベリー抽出物をそれぞれ添加しさらに48時間培養した。
細胞増殖測定キットに使用するCCK-8溶液（株式会社同仁科学研究所製）を各ウェルへ10μlずつ添加し、3時間、37℃において反応させ、492 nmの吸光度（参照波長 660 nm）を測定した。

（３）試験結果：
ビルベリー抽出物添加により、濃度依存的かつ有意にVEGF-A誘導によってHUVECの増殖を抑制することが分かった（図１２）。
エラーバーは、標準誤差を示す。**はコントロールに対して有意水準0.01未満、#はVEGF単独に対して有意水準0.05未満、##はVEGF単独に対して有意水準0.01未満をそれぞれ示す。例数は5〜8である。
尚、ビルベリー抽出物単独（VEGF-A無添加）によるHUVECの減少は観察されなかったことから、ビルベリー抽出物による細胞毒性はないと考えられる。

試験例４
VEGF-Aが誘導するHUVEC遊走に対する、ビルベリー抽出物の作用試験
（本法はKim らの方法を参照にして行った。Kin, K.S. et al., J. Biol. Chem. 2003, 278, 11449-11456.)遊走試験（Migration assay)

（２）試験方法：

標記試験には、セルカルチャーインサート（株式会社ベクトンディッキンソン）を用いた。セルカルチャーインサートの上部チャンバーへ0.1%BSA（ウシ血清アルブミン）含有のHuMedia-EB2にて懸濁したHUVECを１ウェル当たり50000 cellずつ播種した。上部チャンバーへビルベリー抽出物、下部チャンバーへ、図面に記載した濃度のビルベリー抽出物及び／又はVEGF-Aをそれぞれ添加し、培養した（終濃度：ビルベリー抽出物3,10,30μg/ml,VEGF-A 10ng/ml）。
培養4時間後、遊走していないHUVECを綿棒にて拭い取り、遊走している細胞を固定した。固定後、セルカルチャーインサートの膜を切り離し、ヘマトキシリン染色を行い、遊走細胞を染色した。染色した細胞をデジタルカメラで撮影し、染色した細胞の数を数え、測定した。

（３）試験結果：
ビルベリー抽出物添加により、濃度依存的かつ有意にVEGF-A誘導によってHUVECの遊走を抑制することが分かった（図１３）。
エラーバーは、標準誤差を示す。**はコントロールに対して有意水準0.01未満、##はVEGF単独に対して有意水準0.01未満をそれぞれ示す。例数は5または6である。
尚、ビルベリー抽出物単独（VEGF-A無添加）によるHUVECの減少は観察されなかったことから、ビルベリー抽出物による細胞毒性はないと考えられる。

試験例３，４の結果から、ビルベリー抽出物によるVEGF-A誘導の管腔形成の抑制のメカニズムは、HUVECの増殖及び遊走を抑制することにあることが判明した。

試験例５
VEGF-Aが誘導するERK1，ERK2（extracellular signal-regulated kinase 1 or 2），PLCγ（phospholipase Cγ），又はAkt（serine/threonine protein kinase family protein kinase B）のリン酸化に対する、ビルベリー抽出物の作用試験

（２）試験方法：
約80％コンフルエントHUVECを2％FBS（Aktは0.5％FBS）及び25mＭの2-[4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonic acid (HEPES)含有のダルベッコ改変イーグル培地(D-MEM)へ培地交換を行い、培養した。
培養1時間後（Aktは18時間後）、10 ng/ml VEGF-A及び／又は30μg/mlビルベリー抽出物を含有した2％FBS（Aktは0.5％FBS）及び25 mM HEPES含有D-MENで培地交換を行い、反応させた。
反応後、2回洗浄を行い、細胞溶解用RIPA緩衝液（シグマアルドリッチ株式会社製）を添加し、細胞を破壊し、−80℃にて保存した。
タンパク質は7.5％SDS-ポリアクリルアミアミドゲル電気泳動を行い、ウェスタンブロッティング法を用いてバンドの輝度を解析した。
一次抗体は抗リン酸化ERK1/2抗体，抗トータルERK１/2抗体，抗リン酸化PLCγ抗体，抗トータルPLCγ抗体，抗リン酸化Akt抗体，抗トータルAkt抗体（セルシグナリングバイオテクノロジー社製）そして抗β-アクチン抗体（シグマアルドリッチ株式会社）を用いた。
二次抗体としては、抗ERK抗体，抗PLC抗体，抗Akt抗体に対しては、ヤギ抗ウサギHRP（西洋わさびペルオキシダーゼ）抗体を、抗βアクチン抗体に対しては、ヤギ抗マウスHRP抗体を使用した。

（３）試験結果：
ビルベリー抽出物は、VEGF-A誘導によるHUVECの増殖において、PLCγより下流であり、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２より上流のシグナル経路を抑制することが明らかになった（図１４，１５）。
また、ビルベリー抽出物は、VEGF-A誘導によるHUVECの遊走において、Aktより上流のシグナル経路を抑制することが明らかとなった（図１６）。
図１４，１５，１６において、エラーバーは、標準誤差を示す。*はコントロールに対して有意水準0.05未満、#はVEGF単独に対して有意水準0.05未満、##はVEGF単独に対して有意水準0.01未満をそれぞれ示す。例数は4〜７である。

以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明するが、これらの実施例により本発明は限定されるものではない。

実施例１，２（硝子体内投与用注射剤）
試験例１と同様の方法で、粉末状ビルベリー抽出物を得る。この粉末状ビルベリー抽出物（1重量部）を注射用蒸留水（１０重量部又は１００重量部）に溶解し、１ｍｌずつ分注してそれぞれ、実施例１，２の注射剤とする。

実施例３，４（点眼剤）
試験例１と同様の方法で、粉末状ビルベリー抽出物を得る。この粉末状ビルベリー抽出物（1重量部）を蒸留水（１０重量部又は１００重量部）に溶解し、１０ｍｌずつ分注してそれぞれ、実施例３，４の点眼剤とする。

本発明の血管新生阻害剤，シグナル伝達阻害剤は、血管新生を有意に抑制することから、いわゆる実験・研究用試薬として使用可能である他、血管新生を伴う、眼科疾患，腫瘍又は癌疾患，あるいは慢性炎症の予防又は治療剤，あるいは健康食品等の有効成分として有用である。

本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生（〈１〉管腔面積（ａｒｅａ））抑制作用を示す図である。尚、図中のVとはVEGFを表す。本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生（〈２〉管腔長（length））抑制作用を示す図である。尚、図中のVとはVEGFを表す。本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生（〈３〉管腔分枝点数（ｊｏｉｎｔ））抑制作用を示す図である。尚、図中のVとはVEGFを表す。本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生（〈４〉枝数（ｐａｔｈ））抑制作用を示す図である。尚、図中のVとはVEGFを表す。 VEGFの、in vitroでの血管新生作用を示す管腔形成図である。本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生抑制作用を示す管腔形成図である。本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生抑制作用を示す管腔形成図である。本発明の治療剤の、in vitroでの血管新生抑制作用を示す管腔形成図である。高酸素負荷においた後、溶媒投与したマウスの、網膜の血管造影図である。高酸素負荷においた後、ビルベリー抽出物を投与したマウスの、網膜の血管造影図である。本発明の治療剤の、in vivoでの血管新生抑制作用を示す図である。本発明の治療剤の、血管新生抑制作用が、HUVECの増殖を抑制することに起因することを示す図である。本発明の治療剤の、血管新生抑制作用が、HUVECの遊走を抑制することに起因することを示す図である。本発明の治療剤の、血管新生抑制作用が、ＥＲＫ１又はＥＲＫ２より上流のシグナル経路を抑制することよるHUVECの増殖抑制に起因することを示す図である。本発明の治療剤の、血管新生抑制作用が、PLCγより下流のシグナル経路を抑制することよるHUVECの増殖抑制に起因することを示す図である。本発明の治療剤の、血管新生抑制作用が、VEGFレセプターより下流であり、Aktより上流のシグナル経路を抑制することによるHUVECの遊走抑制に起因することを示す図である。

Claims

ビルベリー抽出物を含むことを特徴とする、PLCγからＥＲＫ１又はＥＲＫ２へのシグナル伝達の阻害剤（血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，及び血管新生阻害用の食品に用いるものを除く。）。
ビルベリー抽出物を含むことを特徴とする、VEGFレセプターからＡｋｔへのシグナル伝達の阻害剤（血管新生を伴う疾病に対する予防又は治療剤，及び血管新生阻害用の食品に用いるものを除く。）。