JP5297886B2 - Cell image analyzer - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、細胞画像を解析して、細胞画像に含まれる各細胞の領域を特定する細胞画像解析装置に関する。 The present invention relates to a cell image analysis device that analyzes a cell image and identifies a region of each cell included in the cell image.
細胞画像解析は、各細胞における特定の蛍光量や、定量化された形態量を抽出し、薬剤応答性などを測定することを目的としている。蛍光量や形態量は検出された細胞領域に依存する量であるため、各細胞の輪郭を正確に検出することが必要となる。特に、細胞の個数を正確に数える、細胞の形状を正確に認識する、細胞内部の明るさ（例えば、蛍光量）を正確に検出する等のためには、細胞の輪郭や細胞内器官の輪郭を正確に検出する必要がある。 The purpose of cell image analysis is to extract a specific amount of fluorescence or a quantified morphological amount in each cell, and measure drug responsiveness and the like. Since the fluorescence amount and the morphological amount depend on the detected cell region, it is necessary to accurately detect the outline of each cell. In particular, in order to accurately count the number of cells, to accurately recognize the shape of the cells, to accurately detect the brightness inside the cells (for example, the amount of fluorescence), the contours of cells and organs of cells Must be detected accurately.
しかし、細胞画像の解析を手動で行う場合には、時間がかかる、大量の解析ができない、領域の決定が恣意的で正確なデータが得られない等の問題がある。
そこで、細胞画像の自動解析を行う分野において、細胞の境界を正確に検出することが重要な課題となっている。
However, when analyzing a cell image manually, there are problems such as time consuming, a large amount of analysis cannot be performed, and determination of a region is arbitrary and accurate data cannot be obtained.
Therefore, in the field of automatic analysis of cell images, it is an important issue to accurately detect cell boundaries.
従来、細胞画像解析装置における、細胞等の輪郭を自動的に検出する方法としては、例えば、単一の輝度を一定の閾値として細胞画像を二値化することによって細胞等の輪郭を検出する方法（特許文献１）や、輝度差を用いて輝度変化の大きい点を細胞の境界の一部として検出する、より詳しくは、細胞画像における隣接するピクセルの輝度差を輝度変化量として算出し、算出した輝度変化量が一定の閾値よりも大きくなる点を細胞の境界の一部として検出する方法（特許文献２）がある。 Conventionally, as a method for automatically detecting the outline of a cell or the like in a cell image analyzer, for example, a method of detecting the outline of a cell or the like by binarizing the cell image with a single luminance as a constant threshold (Patent Document 1) or a point where the luminance change is large is detected as a part of the cell boundary using the luminance difference. More specifically, the luminance difference between adjacent pixels in the cell image is calculated as the luminance change amount. There is a method (Patent Document 2) for detecting a point at which the luminance change amount becomes larger than a certain threshold as a part of a cell boundary.
単一輝度を一定の閾値として二値化する方法の問題点
しかし、特許文献１に記載のような、単一の輝度を一定の閾値として細胞画像を二値化することによって細胞等の輪郭を検出する方法では、細胞の境界を正確に検出することが難しい。例えば、その全領域が閾値の輝度に満たない暗い細胞は、認識することができない。
特に、染色方法・対象の違い、あるいは複数の細胞種が混在して、細胞によって明るさが大きく異なるような実験系では、単一の閾値でもって細胞領域とそれ以外の領域とを切り分けることはできない。
However, the problem of the method of binarizing with a single luminance as a constant threshold However, as described in Patent Document 1, the contour of a cell or the like is defined by binarizing a cell image with a single luminance as a constant threshold. With the detection method, it is difficult to accurately detect cell boundaries. For example, a dark cell whose entire area is less than the threshold luminance cannot be recognized.
In particular, in an experimental system where the brightness varies greatly depending on the cell due to the difference in staining method and target, or multiple cell types, it is not possible to separate the cell area from the other areas with a single threshold. Can not.
このことを、図１１を用いて説明する。
図１１は明るさの異なる複数の細胞を単一の閾値で二値化する方法及びその方法により検出される細胞の輪郭の一例を示す説明図で、(a)は各細胞の輝度断面と閾値との関係を示す図、(b)は(a)の閾値で二値化することによって検出される細胞の輪郭と本来の輪郭を示す図である。図１１(a)中、Ｃ１〜Ｃ３は、それぞれ通常の明るさよりも暗い細胞１、通常の明るさよりも明るい細胞２、通常の明るさの細胞３の輝度断面を示している。
ここで、細胞３の輪郭が、本来の輪郭とほぼ同じサイズに検出される所定の輝度を一定の閾値として、図１１(a)に示した輝度断面を有する細胞画像を二値化する。すると、図１１(b)に示すように、細胞１の輪郭は、本来の輪郭よりも小さいサイズに検出され、細胞２の輪郭は本来の輪郭よりも大きいサイズに検出されてしまう。
This will be described with reference to FIG.
FIG. 11 is an explanatory view showing an example of a method of binarizing a plurality of cells having different brightness with a single threshold value and an example of a cell outline detected by the method. FIG. 11A shows a luminance cross section of each cell and a threshold value. (B) is a diagram showing the contour of the cell and the original contour detected by binarization with the threshold value of (a). In FIG. 11 (a), C1 to C3 indicate the luminance cross sections of the cell 1 darker than the normal brightness, the cell 2 brighter than the normal brightness, and the cell 3 of the normal brightness, respectively.
Here, the cell image having the luminance cross section shown in FIG. 11 (a) is binarized, with a predetermined luminance at which the contour of the cell 3 is detected to be approximately the same size as the original contour as a certain threshold value. Then, as shown in FIG. 11 (b), the outline of the cell 1 is detected to be smaller than the original outline, and the outline of the cell 2 is detected to be larger than the original outline.
輝度差を用いて輝度変化量の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法の問題点
また、特許文献２に記載のような、細胞画像における隣接するピクセルの輝度差を用いて輝度変化量の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法には、次のような問題点がある。
細胞の輪郭周辺領域の輝度変化量は対象とする細胞の明るさに依存する。このため、単一の閾値で二値化する方法と同様に、細胞の明るさに依存した問題がある。即ち、輝度差に対して一定の閾値を用いても、細胞が認識されない、細胞の輪郭の位置が本来の輪郭の位置からずれて検出されてしまうなどの問題が起こりうる。
Problems of a method of detecting a point having a large amount of change in luminance using a luminance difference as a part of a cell boundary Also, as described in Patent Document 2, a luminance change using a luminance difference between adjacent pixels in a cell image The method for detecting a large amount of points as part of the cell boundary has the following problems.
The amount of luminance change in the peripheral region of the cell depends on the brightness of the target cell. For this reason, there is a problem depending on the brightness of the cell, as in the method of binarizing with a single threshold. That is, even if a certain threshold value is used for the luminance difference, problems such as that the cell is not recognized and the position of the outline of the cell is deviated from the original outline position may occur.
このことを図１２を用いて説明する。
図１２は輝度差を用いて輝度変化の大きい点を細胞の境界の一部として検出する方法を示す説明図である。図１２中、Ｃ３’、Ｃ１’、Ｃ２’はそれぞれ通常の明るさの細胞３’、暗い細胞１’、明るい細胞２’の輝度断面、Ｓ３’、Ｓ１’、Ｓ２’はそれぞれ、各細胞における隣接するピクセルの輝度差を示している。
図１２に示すように、各細胞における隣接する輝度差に対して通常の明るさの細胞３’の輪郭を正確に検出可能な一定の閾値１を設定し、閾値１を上回る輝度差を生じる点を細胞領域の一部として検出するようにすると、暗い細胞１’は細胞周辺領域での輝度差が小さいため、全体が閾値を下回り、細胞の輪郭が検出されず、また、明るい細胞２’の輪郭は本来の輪郭よりも大きく検出されてしまう。また、例えば、暗い細胞１’の輪郭を正確に検出できるように閾値２を設定しても、閾値２では通常の明るさの細胞３’や明るい細胞２’についての輪郭を正確に検出できない。
This will be described with reference to FIG.
FIG. 12 is an explanatory diagram showing a method of detecting a point having a large luminance change as a part of the cell boundary using the luminance difference. In FIG. 12, C3 ′, C1 ′, and C2 ′ are normal brightness cells 3 ′, dark cells 1 ′, and bright cell 2 ′ cross sections, and S3 ′, S1 ′, and S2 ′ are in each cell. The luminance difference between adjacent pixels is shown.
As shown in FIG. 12, a certain threshold value 1 is set that can accurately detect the outline of the normal brightness cell 3 ′ with respect to the adjacent luminance difference in each cell, resulting in a luminance difference exceeding the threshold value 1. Is detected as a part of the cell region, the dark cell 1 'has a small luminance difference in the cell peripheral region, so the whole is below the threshold, the cell outline is not detected, and the bright cell 2' The contour is detected larger than the original contour. For example, even if the threshold value 2 is set so that the contour of the dark cell 1 ′ can be accurately detected, the threshold value 2 cannot accurately detect the contour of the normal brightness cell 3 ′ or the bright cell 2 ′.
特に、複数の細胞が近接している場合は、上記２つの方法のいずれを用いても細胞の境界を正確に検出することが難しい。
このことを図１３を用いて説明する。
図１３は複数の細胞が近接している状態と輝度断面との関係を示す説明図で、(a)は２つの細胞が近接した状態を示す図、(b)は(a)の状態における輝度断面を示す図である。
細胞が近接している場合、図１３(b)に示すように、近接する細胞に挟まれた領域（細胞間領域）で輝度が高くなる。このため、上述した単一の輝度を一定の閾値とする方法、輝度差を用いる方法のいずれでも、個々の細胞領域の検出が困難になる。
In particular, when a plurality of cells are close to each other, it is difficult to accurately detect the cell boundary using either of the above two methods.
This will be described with reference to FIG.
FIG. 13 is an explanatory diagram showing a relationship between a state in which a plurality of cells are close to each other and a luminance cross section. FIG. 13 (a) is a diagram showing a state in which two cells are close to each other, and (b) is a luminance in the state of (a). It is a figure which shows a cross section.
When the cells are close to each other, as shown in FIG. 13 (b), the brightness is increased in a region (intercellular region) sandwiched between the adjacent cells. For this reason, it is difficult to detect individual cell regions by either the above-described method using a single luminance as a constant threshold or the method using a luminance difference.
問題点１：精度の問題
このように、従来の細胞画像解析装置においては、細胞等の境界を自動検出する精度に問題があった。問題を引き起こす要因は、次のようなものである。
・バックグランド（あるいは、光の当たり方）が一様ではないため、細胞の位置によって明るさが変わること。
・細胞ごとに、蛍光標識による染色の度合いが異なり、発する蛍光の明るさが異なること。
・同じ細胞において、その内部で染色の度合いが異なり、よく染色されている領域とそれほど染色されていない領域とが混在すること。
・明視野観察の場合、得られる細胞画像の輝度が全体的に大きく、細胞とバックグランドとの輝度差が小さいため、そもそも単一の閾値を用いて細胞の境界を判別することが難しいこと。
Problem 1: Accuracy problem As described above, the conventional cell image analysis apparatus has a problem in the accuracy of automatically detecting boundaries of cells and the like. Factors that cause problems are as follows.
-Since the background (or how the light strikes) is not uniform, the brightness changes depending on the position of the cell.
-The degree of staining with fluorescent labels varies from cell to cell, and the brightness of the emitted fluorescence varies.
-In the same cell, the degree of staining is different in the inside, and a well-stained region and a region that is not so stained are mixed.
In the case of bright field observation, since the brightness of the obtained cell image is large overall and the brightness difference between the cell and the background is small, it is difficult to determine the cell boundary using a single threshold in the first place.
問題点２：操作性の問題
従来の方法を用いて輪郭を正確に検出するためには、例えば、図１２で示したような輝度差の閾値を、細胞の明るさに応じて複数設定する必要がある。しかし、それでは、操作・設定が煩雑になってしまう。
Problem 2: Problem of operability In order to accurately detect the contour using the conventional method, for example, it is necessary to set a plurality of threshold values of luminance difference as shown in FIG. 12 according to the brightness of the cell. There is. However, this makes the operation / setting complicated.
本発明は、このような従来の問題点に鑑みてなされたものであり、複数の細胞群の画像、特に異なる輝度をもつ細胞群の画像に対して、煩雑な操作・設定を行うことなく、細胞の境界を正確に検出可能な細胞画像解析装置を提供することを目的としている。 The present invention has been made in view of such conventional problems, and without performing complicated operations and settings on images of a plurality of cell groups, particularly images of cell groups having different luminances, An object of the present invention is to provide a cell image analysis apparatus capable of accurately detecting cell boundaries.
上記目的を達成するため、本発明による細胞画像解析装置は、蛍光細胞画像を用いて細胞の境界を検出する、コンピュータを備えた細胞画像解析装置であって、前記コンピュータを、一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、細胞領域とバックグランド領域と細胞領域及びバックグラウンド領域以外の境界周辺領域とに分類する領域分類手段、前記領域分類手段が分類した細胞領域又はバックグランド領域と細胞領域及びバックグラウンド領域以外の境界周辺領域との両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する信号変化量算出手段、前記所定の局所的な領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する境界候補領域検出手段、として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴としている。 To achieve the above object, a cell image analysis apparatus according to the present invention is a cell image analysis apparatus including a computer that detects a cell boundary using a fluorescent cell image, and uses the computer with a certain threshold value. Te, the area of the fluorescence cell image, fine alveolar region and the background region and the cell region and the area classification means for classifying the boundary peripheral region other than the background area, and the cell region area classification means classifies or background area in a given local area spanning both the cell region and a background region other than the boundary peripheral area, the signal change amount calculating means for calculating a predetermined signal change amount corresponding to a change in position, the predetermined local Within the region, the region where the change tendency of the predetermined signal variation calculated by the signal variation calculation means is the same as the boundary candidate region It is characterized by comprising automatically detecting boundary candidate region detection means, an image analysis software to function as Te.
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出する境界検出手段として機能させることを特徴としている。 In the cell image analysis apparatus according to the present invention, the image analysis software further includes a predetermined signal calculated by the signal change amount calculation unit in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit. It is characterized by functioning as a boundary detecting means for detecting a region where the degree of change in the amount of change changes as a cell boundary.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、一画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。 In the cell image analysis apparatus of the present invention, the predetermined signal change amount is a luminance increase amount in an adjacent region that is composed of one pixel and is adjacent to the reference region with respect to the luminance in an arbitrary reference region that is composed of one pixel. Or it is preferable that it is a reduction amount.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度が最大となる隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。 Further, in the cell image analysis apparatus of the present invention, the predetermined signal change amount is one pixel and a plurality of adjacent regions adjacent to the reference region with respect to the luminance in an arbitrary reference region including one pixel. It is preferable that the amount of increase or decrease in luminance in the adjacent region where the luminance is maximum.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。 In the cell image analysis apparatus of the present invention, the predetermined signal change amount is a luminance in a plurality of adjacent regions each composed of one pixel and adjacent to the reference region with respect to a luminance in an arbitrary reference region composed of one pixel. The average value of the amount of increase or decrease is preferably.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。 In the cell image analysis apparatus of the present invention, the predetermined signal change amount is a luminance in an adjacent region that is composed of a plurality of pixels and is adjacent to the reference region with respect to an average value of luminance in an arbitrary reference region composed of a plurality of pixels. It is preferable that the average value is an increase amount or a decrease amount.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度の平均値が最大となっている隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。 In the cell image analysis apparatus of the present invention, the predetermined signal change amount is a plurality of adjacent pixels each having a plurality of pixels and adjacent to the reference region with respect to an average luminance value in an arbitrary reference region having a plurality of pixels. It is preferable that the amount of increase or decrease of the average value of luminance in the adjacent region where the average value of luminance is the maximum among the regions.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。 In the cell image analysis apparatus of the present invention, the predetermined signal change amount is a plurality of adjacent pixels each having one pixel and adjacent to the reference region with respect to an average value of luminance in an arbitrary reference region having a plurality of pixels. The average value of the increase or decrease amount of the average value of the luminance in the region is preferable.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準画素の輝度と、該基準画素に隣接する所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値又は該基準画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値との比較を該基準画素及び該基準画素に隣接する所定画素数の大きさの領域又は該基準画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域を一画素ずつずらしながら順次行い、該輝度の平均値と該基準画素の輝度との大小関係が変わるときの基準画素を細胞の境界として検出するのが好ましい。 Further, in the cell image analysis apparatus of the present invention, the boundary detection means is one-dimensionally oriented in a one-dimensional direction from one end to the other end of the boundary candidate area within the boundary candidate area detected by the boundary candidate area detection means. the luminance of an arbitrary reference pixels comprising pixels, the radius or average value of the brightness in the size of the area of the predetermined number of pixels around the said reference pixels adjacent to the reference pixel in the area of the size of the predetermined number of pixels The comparison with the average value of luminance is performed by shifting the reference pixel and a region having a predetermined number of pixels adjacent to the reference pixel or a region having a predetermined number of radii centered on the reference pixel one pixel at a time. sequentially performed, it is preferable to detect the reference pixel when changing the magnitude relationship between the brightness average value and the reference pixel of the luminance as a boundary of a cell.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素からなり且つ該基準領域を該一次元方向に挟んで隣接する２つの隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び２つの隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するのが好ましい。 Further, in the cell image analysis apparatus of the present invention, the boundary detection means is one-dimensionally oriented in a one-dimensional direction from one end to the other end of the boundary candidate area within the boundary candidate area detected by the boundary candidate area detection means. The calculation of the average value of the luminance in the region that is composed of an arbitrary reference region composed of pixels and two adjacent regions each composed of one pixel and sandwiching the reference region in the one-dimensional direction, and the calculated luminance The comparison between the average value and the luminance in the reference area is sequentially performed while shifting the reference area and two adjacent areas one pixel at a time, and the magnitude relationship between the calculated average value of the luminance and the luminance in the reference area changes. It is preferable to detect the reference region at the time as a cell boundary.
また、本発明の細胞画像解析装置においては、前記境界検出手段は、前記境界候補領域検出手段が検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素又は所定数の複数画素からなり且つ該基準領域を該二次元方向に囲んで隣接する複数の隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び複数隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するのが好ましい。 Further, in the cell image analysis apparatus of the present invention, the boundary detection means is one-dimensionally oriented in a one-dimensional direction from one end to the other end of the boundary candidate area within the boundary candidate area detected by the boundary candidate area detection means. Calculation of the average value of luminance in an arbitrary reference region composed of pixels and a region composed of a single pixel or a predetermined number of pixels and a plurality of adjacent regions surrounding the reference region in the two-dimensional direction. And the comparison of the average value of the calculated brightness and the brightness in the reference area is sequentially performed while shifting the reference area and the areas to be a plurality of adjacent areas one pixel at a time, and the calculated average value of brightness and the brightness in the reference area It is preferable to detect the reference region as the cell boundary when the magnitude relationship changes.
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、複数の局所的な領域内において、前記領域分類手段、前記信号変化量算出手段、前記境界候補領域検出手段、前記境界検出手段を介してそれぞれ検出された、複数の細胞の境界をつなげて、細胞の輪郭を特定する細胞輪郭特定手段として機能させることを特徴としている。 In the cell image analysis apparatus according to the present invention, the image analysis software further includes: the computer, in a plurality of local regions, the region classification unit, the signal change amount calculation unit, and the boundary candidate region detection unit. The cell boundary specifying means for connecting the boundaries of a plurality of cells detected through the boundary detection means to specify the outline of the cell is used.
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する細胞輪郭補正手段として機能させることを特徴としている。 In the cell image analysis apparatus according to the present invention, the image analysis software may further cause the computer to fragment each contour fragment fragmented when the cell contour identified by the cell contour identifying means is fragmented. Cell contour correction for extracting the luminance in each pixel region, providing a plurality of luminance contour lines for each contour fragment, averaging the contour lines into a single closed curve, and specifying the single closed curve as the cell contour It is characterized by functioning as a means.
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する細胞輪郭判別手段として機能させることを特徴としている。 In the cell image analysis apparatus according to the present invention, the image analysis software is further multiplexed when the computer is specified by a closed curve in which the cell outlines specified by the cell outline specifying means are multiplexed. It is characterized by functioning as a cell contour discriminating means for discriminating the outermost closed curve among the closed curves as the cell contour.
また、本発明による細胞画像解析装置は、前記画像解析ソフトウェアは、さらに、前記コンピュータを、前記細胞輪郭特定手段が特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、前記細胞輪郭判別手段が判別した閉曲線以外の閉曲線を、前記細胞内小器官又は細胞上の小さい斑点状のものの輪郭として判別する細胞内小器官等判別手段として機能させることを特徴としている。 In the cell image analysis apparatus according to the present invention, the image analysis software is further multiplexed when the computer is specified by a closed curve in which the cell outlines specified by the cell outline specifying means are multiplexed. Among the closed curves, the closed curve other than the closed curve determined by the cell contour determining unit is made to function as a determining unit for determining an intracellular organelle or the like as a contour of the intracellular organelle or a small spot on the cell. Yes.
本発明によれば、複数の細胞群の画像、特に異なる輝度をもつ細胞群の画像に対して、煩雑な操作・設定を行うことなく、細胞の境界を正確に検出可能な細胞画像解析装置が得られる。 According to the present invention, there is provided a cell image analysis apparatus capable of accurately detecting cell boundaries without performing complicated operations / settings on images of a plurality of cell groups, particularly images of cell groups having different luminances. can get.
本発明の一実施形態にかかる細胞画像解析装置の全体構成を示すブロック図である。
本実施形態の細胞画像解析装置１は、領域分類手段１ａと、信号変化量算出手段１ｂと、境界候補領域検出手段１ｃと、境界検出手段１ｄと、細胞輪郭特定手段１ｅと、細胞輪郭補正手段１ｆと、細胞輪郭判別手段１ｇと、細胞特徴量抽出手段１ｈと、統計・出力手段１ｉとを機能させる画像解析ソフトウェアと、画像解析ソフトウェアを備えるコンピュータとで構成されている。
1 is a block diagram showing an overall configuration of a cell image analysis apparatus according to an embodiment of the present invention.
The cell image analysis apparatus 1 of the present embodiment includes a region classification unit 1a, a signal change amount calculation unit 1b, a boundary candidate region detection unit 1c, a boundary detection unit 1d, a cell contour specifying unit 1e, and a cell contour correction unit. 1f, cell contour discriminating means 1g, cell feature amount extracting means 1h, and statistical / output means 1i functioning image analysis software, and a computer equipped with image analysis software.
領域分類手段１ａは、一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、細胞領域とバックグランド領域と細胞領域及びバックグラウンド領域以外の境界周辺領域とに分類する。例えば、細胞領域とバックグランド領域と細胞の境界周辺領域とに分類できる。
信号変化量算出手段１ｂは、領域分類手段１ａが分類した細胞領域又はバックグランド領域と細胞領域及びバックグラウンド領域以外の境界周辺領域との両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する。
境界候補領域検出手段１ｃは、信号変化量算出手段１ｂが算出した所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する。
境界検出手段１ｄは、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、信号変化量算出手段１ｂが算出した所定の信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出する。
細胞輪郭特定手段１ｅは、複数の局所的な領域内において、領域分類手段１ａ、信号変化量算出手段１ｂ、境界候補領域検出手段１ｃ、境界検出手段１ｄを介してそれぞれ検出された、複数の細胞の境界をつなげて、細胞の輪郭を特定する。
細胞輪郭補正手段１ｆは、細胞輪郭特定手段１ｅが特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する。
細胞輪郭判別手段１ｇは、細胞輪郭特定手段１ｆが特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する。
細胞特徴量抽出手段１ｈは、取得した細胞領域内での画像を用いて、各細胞の明るさ、形態などの細胞の特徴量を抽出する。
統計・出力手段１ｉは、グループごとの細胞特徴量の平均化、比較などの統計処理や処理結果の出力を行う。
Area classification means 1a, using a fixed threshold value, the area of the fluorescence cell image is classified into fine alveolar region and the background region and the cell region and a background region other than the boundary peripheral area. For example, it can be classified into a cell region, a background region, and a cell peripheral region.
Signal change amount calculating unit 1b, in the area classification means 1a classify cells region or background region and a cell region and a background of a predetermined spanning both the boundary peripheral region other than the region localized area, the change in position A predetermined signal change amount corresponding to is calculated.
The boundary candidate region detection unit 1c automatically detects a region where the change tendency of the predetermined signal change amount calculated by the signal change amount calculation unit 1b is the same as a boundary candidate region.
The boundary detection unit 1d detects, as a cell boundary, a region in which the degree of change of the predetermined signal change amount calculated by the signal change amount calculation unit 1b changes in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit 1c. .
The cell contour specifying unit 1e includes a plurality of cells detected in each of the local regions through the region classifying unit 1a, the signal change amount calculating unit 1b, the boundary candidate region detecting unit 1c, and the boundary detecting unit 1d. The boundary of the cell is connected to specify the outline of the cell.
When the cell contour specified by the cell contour specifying unit 1e is fragmented, the cell contour correcting unit 1f extracts the luminance in each pixel region of each fragmented contour fragment, and the luminance for each contour fragment. A plurality of contour lines are provided, and the contour lines are averaged to form a single closed curve, and the single closed curve is specified as a cell outline.
When the cell contour specified by the cell contour specifying unit 1f is specified by a multiplexed closed curve, the cell contour determining unit 1g determines the outermost closed curve among the multiplexed closed curves as the cell contour.
The cell feature amount extraction unit 1h extracts a feature amount of a cell such as brightness and form of each cell using the acquired image in the cell region.
The statistics / output means 1i performs statistical processing such as averaging and comparison of cell feature values for each group and outputs processing results.
本発明では、個々の細胞の明るさが異なり、各細胞の輝度断面が、単一の閾値で各細胞の輪郭を正確に検出することができない分布を持つ、細胞群に対して、細胞ごとの閾値の操作・設定を行うことなく、細胞の輝度に応じた閾値で、細胞の輪郭を正確に検出するために、次のような原理を応用している。 In the present invention, the brightness of each cell is different, and the brightness cross section of each cell has a distribution in which the outline of each cell cannot be accurately detected with a single threshold value. The following principle is applied in order to accurately detect the outline of a cell with a threshold corresponding to the luminance of the cell without performing the operation / setting of the threshold.
細胞検出方法の原理１：細胞画像の輝度分布の特性
一般的に、蛍光細胞画像は、細胞の境界周辺領域において、輝度シグナルが安定的（滑らか）に大きく減衰していくという、輝度分布の特性を有している。本発明では、この特性を応用している。
図２は細胞画像における一つの細胞についての、細胞外領域であるバックグランド、細胞の境界周辺領域、細胞領域での輝度変化の一般的な特性を示す説明図である。
一般的に、細胞領域での蛍光シグナルの輝度は、その細胞内部の各点での染色の度合いが異なること等を原因として、所定の輝度値の幅においてランダムに近い状態で変化する。
また、バックグランドでの蛍光シグナルの輝度も、細胞領域での蛍光シグナルと同様、所定の輝度範囲内においてランダムに近い状態で変化する。
Principle of cell detection method 1: Characteristics of luminance distribution of cell image In general, a fluorescent cell image has a characteristic of luminance distribution in which a luminance signal attenuates stably (smoothly) greatly in a peripheral region of the cell. have. In the present invention, this characteristic is applied.
FIG. 2 is an explanatory diagram showing general characteristics of a background, which is an extracellular region, a cell boundary peripheral region, and a luminance change in the cell region, for one cell in a cell image.
In general, the luminance of a fluorescent signal in a cell region changes in a state close to random within a predetermined luminance value range, for example, because the degree of staining at each point inside the cell is different.
In addition, the luminance of the fluorescent signal in the background also changes in a nearly random state within a predetermined luminance range, like the fluorescent signal in the cell region.
細胞検出方法の原理２：細胞の境界周辺領域での輝度分布の特性
これに対し、細胞の境界周辺領域でのシグナルの輝度は、光学的な特性に依存して滑らかに変化する。また、その変化量は、細胞領域やバックグランドでの輝度シグナルの変化量に比べて大きい。
例えば、理想的な実験系として、光源となる蛍光物質が一点に存在する細胞を、顕微鏡に備わる撮像装置で撮像した場合を考える。すると、輝度断面は、図２(a)に示すように、裾が穏やかに変化するカーブを描く。
実際の細胞内には、このような蛍光物質が集団を形成して存在している。集団を形成している物質の輝度断面は、上述した一点での輝度分布を重ね合わせたものとなる。そして、細胞の境界周辺領域では、図２(b)に示すように、緩やかな傾斜を描き、かつ、裾が滑らかに変化する。
つまり、細胞の境界周辺領域の各点の輝度は、安定的（即ち、滑らかに）、かつ、単調的に（即ち、輝度変化量の符号を同じに保ちながら）変化する。
そこで、本発明の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアが、信号変化量算出手段１ｂ、境界候補領域検出手段１ｃとして機能させることによって、細胞の位置の変化に対応した、輝度の変化量などの所定の信号変化量の変化傾向が同じになっている（輝度変化量の符号を同じに保ちながら変化する）領域を境界候補領域として自動的に検出するように構成されている。
Principle 2 of Cell Detection Method: Characteristics of Luminance Distribution in the Area Around the Cell Boundary On the other hand, the signal luminance in the area around the cell boundary changes smoothly depending on the optical characteristics. Further, the amount of change is larger than the amount of change in luminance signal in the cell region or background.
For example, as an ideal experimental system, consider a case where a cell in which a fluorescent substance serving as a light source is present at one point is imaged by an imaging device provided in a microscope. Then, as shown in FIG. 2A, the luminance cross section draws a curve whose skirt changes gently.
In the actual cells, such fluorescent substances are present in a group. The luminance cross section of the substance forming the group is obtained by superimposing the luminance distributions at one point described above. In the peripheral region of the cell boundary, as shown in FIG. 2B, a gentle slope is drawn and the skirt changes smoothly.
That is, the luminance of each point in the cell boundary peripheral region changes stably (that is, smoothly) and monotonously (that is, while keeping the sign of the luminance variation amount the same).
Therefore, in the cell image analysis apparatus of the present invention, the image analysis software functions as the signal change amount calculation unit 1b and the boundary candidate region detection unit 1c, so that the amount of change in luminance corresponding to the change in the position of the cell is determined. An area in which the change tendency of the predetermined signal change amount is the same (changes while maintaining the same sign of the luminance change amount) is automatically detected as a boundary candidate area.
なお、所定の信号変化量は、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、一画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度が最大となる隣接領域における輝度の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、一画素からなる任意の基準領域における輝度に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量は、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ複数画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域のうち輝度の平均値が最大となっている隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量であるのが好ましい。
あるいは、所定の信号変化量が、複数画素からなる任意の基準領域における輝度の平均値に対する、それぞれ一画素からなり且つ該基準領域に隣接する複数の隣接領域における輝度の平均値の増加量又は減少量の平均値であるのが好ましい。
Note that the predetermined signal change amount is preferably an increase or decrease in luminance in an adjacent region composed of one pixel and adjacent to the reference region with respect to luminance in an arbitrary reference region composed of one pixel.
Alternatively, the predetermined signal change amount is an increase in luminance in an adjacent region where the luminance is maximum among a plurality of adjacent regions each including one pixel and adjacent to the reference region, with respect to the luminance in an arbitrary reference region including one pixel. An amount or a reduced amount is preferred.
Alternatively, the predetermined signal change amount is an average value of an increase or decrease in luminance in a plurality of adjacent regions each including one pixel and adjacent to the reference region with respect to the luminance in an arbitrary reference region including one pixel. Is preferred.
Alternatively, the predetermined signal change amount is an increase amount or a decrease amount of the average luminance value in an adjacent region that is composed of a plurality of pixels and is adjacent to the average value of luminance in an arbitrary reference region that is composed of a plurality of pixels. Is preferred.
Alternatively, the predetermined signal change amount has a maximum average luminance value among a plurality of adjacent regions each including a plurality of pixels and adjacent to the average luminance value in an arbitrary reference region including a plurality of pixels. It is preferable that the amount of increase or decrease in the average value of luminance in the adjacent region.
Alternatively, the predetermined signal change amount is an increase amount or a decrease in the average brightness value in a plurality of adjacent areas each composed of one pixel and adjacent to the reference brightness area with respect to the average brightness value in an arbitrary reference area including a plurality of pixels. The average value is preferable.
細胞検出方法の原理３：細胞の輪郭の定義
また、本発明の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、信号変化量の変化の度合いが変化する領域を細胞の境界として検出するように構成されている。より詳しくは、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準画素の輝度と、該基準画素に隣接する所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値又は該基準画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域における輝度の平均値との比較を該基準画素及び該基準画素に隣接する所定画素数の大きさの領域又は該基準画素を中心とした半径が所定画素数の大きさの領域を一画素ずつずらしながら順次行い、該輝度の平均値と該基準画素の輝度との大小関係が変わるときの基準画素を細胞の境界として検出するように構成されている。
Principle 3 of Cell Detection Method: Definition of Cell Outline In the cell image analysis apparatus of the present invention, the image analysis software is configured such that the boundary detection unit 1d outputs a signal in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit 1c. A region where the degree of change in the amount of change is detected is detected as a cell boundary. More specifically, in the image analysis software, the boundary detection unit 1d includes one pixel in a one-dimensional direction from one end of the boundary candidate region to the other end in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit 1c. with any of the reference pixel intensity, the average radius or average value of the brightness in the size of the area of the predetermined number of pixels around the said reference pixels adjacent to the reference pixel is a brightness in the area of the size of the predetermined number of pixels A comparison with a value is sequentially performed while shifting the reference pixel and a region having a predetermined number of pixels adjacent to the reference pixel or a region having a radius having a predetermined number of pixels around the reference pixel one by one , a reference pixel when the magnitude relation between the average value and the brightness of the reference pixels of the luminance change is configured to detect a boundary of a cell.
例えば、図４に示すように、細胞の境界周辺領域の輝度断面に対し、次のようなピクセルの数列をとる。
Ａ(1)，Ａ(2)，Ａ(3)（ここではＡ(3)が細胞領域に近づく方向とする。）
シグナルが安定している場合、Ａ(i)の列における輝度ａ(i)は単調に増加する。
一般的に、輝度の変極点は細胞の境界の位置と一致する。このため、上記数列に対して、次の条件を満たすｉ（細胞の境界周辺領域の輝度断面に対する点）を特定することで、細胞の境界の位置が求まる。
Δａ(i)＝ａ(i)−ａ(i-1)
としたとき、
Δa（i）＜Δa（i＋1）が、Δa（i）＞Δa（i＋1）へと不等号の向きが変わるi
画像解析ソフトウェアは、この輝度の変極点を信号変化量の変化の度合いが変化する領域として検出する。
For example, as shown in FIG. 4 , the following number sequence of pixels is taken for the luminance cross section in the peripheral region of the cell.
A (1), A (2), A (3) (Here, A (3) is closer to the cell region.)
When the signal is stable, the luminance a (i) in the row of A (i) increases monotonously.
In general, the inflection point of the luminance coincides with the position of the cell boundary. For this reason, the position of the cell boundary can be obtained by specifying i (a point with respect to the luminance cross section of the peripheral region of the cell boundary) satisfying the following condition with respect to the above sequence.
Δa (i) = a (i) −a (i−1)
When
Δa (i) <Δa (i + 1) changes the direction of the inequality sign to Δa (i)> Δa (i + 1) i
The image analysis software detects the inflection point of the luminance as a region where the degree of change in the signal change amount changes.
細胞検出方法の原理４：変極点検出の具体例
本発明の細胞画像解析装置における画像解析ソフトウェアによる変極点の具体的な検出手順の一例を説明する。
本例の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素からなり且つ該基準領域を該一次元方向に挟んで隣接する２つの隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び２つの隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するように構成されている。
Principle 4 of Cell Detection Method: Specific Example of Inflection Point Detection An example of a specific inflection point detection procedure by image analysis software in the cell image analysis apparatus of the present invention will be described.
In the cell image analysis apparatus of the present example, the image analysis software causes the boundary detection unit 1d to perform a one-dimensional direction from one end of the boundary candidate region to the other end in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit 1c. Calculating an average value of luminance in an area obtained by combining an arbitrary reference area composed of one pixel and two adjacent areas each composed of one pixel and sandwiching the reference area in the one-dimensional direction. The comparison of the average brightness value and the brightness in the reference area is performed sequentially while shifting the reference area and the two adjacent areas one pixel at a time, and the magnitude relationship between the calculated average brightness value and the brightness in the reference area It is configured to detect a reference region when the value changes as a cell boundary.
まず、Ａ(i−1)，Ａ(i)，Ａ(i＋1)の３点での輝度a(i−1)，a(i)，a(i＋1)の平均を算出する。
ここで、輝度の変化量がΔa（i）＞Δa（i＋1）となる場合、Ａ(i)での輝度ａ(i)を基準としたときのＡ(i+1)での輝度ａ(i+1)の増加量が、Ａ(i)での輝度ａ(i)を基準としたときのＡ(i-1)での輝度ａ(i-1)の減少量より小さいので、Ａ(i)での輝度ａ(i)は、３点の輝度の平均より小さくなる。
逆に、Ａ(i)での輝度ａ(i)が、３点の輝度の平均より大きい場合、Δａ(i)＜Δａ(ｉ+1)と判断することができる。
つまり、細胞の境界周辺領域の輝度断面に対する点ｉを、例えば１ピクセルごとにずらしながら、Ａ(i-1)，Ａ(i)，Ａ(i+1)の３点a(i-1)，ａ(i)，ａ(i+1)での輝度の平均とＡ(i)での輝度a(i)を比較し、その大小関係を検出することで、その大小関係が逆転する点を変極点として検出することができる。
First, the average of the luminances a (i−1), a (i), and a (i + 1) at three points A (i−1), A (i), and A (i + 1) is calculated.
Here, when the amount of change in luminance is Δa (i)> Δa (i + 1), the luminance a (i at A (i + 1) with reference to the luminance a (i) at A (i). Since the increase amount of +1) is smaller than the decrease amount of the luminance a (i-1) at A (i-1) when the luminance a (i) at A (i) is used as a reference, A (i ) Is smaller than the average of the luminance at the three points.
Conversely, when the luminance a (i) at A (i) is larger than the average of the luminances at the three points, it can be determined that Δa (i) <Δa (i + 1).
That is, three points a (i-1) of A (i-1), A (i), and A (i + 1) while shifting the point i with respect to the luminance cross section in the peripheral region of the cell, for example, for each pixel. , A (i), a (i + 1) and the brightness a (i) at A (i) are compared, and the magnitude relationship is detected, so that the magnitude relationship is reversed. It can be detected as an inflection point.
なお、上記変極点の検出方法では、細胞領域の方向がわからないと、上記のようなピクセル数列を定義することができないという問題がある。
また、細胞領域の方向を定義しておき、その定義に基づいて細胞領域の方向を検出するのでは、細胞の境界の検出処理が煩雑になるという欠点がある。
The above inflection point detection method has a problem that it is impossible to define the above-described pixel number sequence unless the direction of the cell region is known.
Moreover, if the direction of the cell region is defined and the direction of the cell region is detected based on the definition, there is a drawback that the detection process of the cell boundary becomes complicated.
そこで、本発明の細胞画像解析装置では、より好ましくは、図５に示すような方法を用いる。
本例の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアは、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内において、該境界候補領域の一端から他端へ向かう一次元方向に、一画素からなる任意の基準領域とそれぞれ一画素又は所定数の複数画素からなり且つ該基準領域を該二次元方向に囲んで隣接する複数の隣接領域とを合わせた領域における、輝度の平均値の算出及び、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度の比較を、該基準領域及び複数隣接領域とする領域を一画素ずつずらしながら順次行い、算出した輝度の平均値と該基準領域における輝度との大小関係が変わるときの基準領域を細胞の境界として検出するように構成されている。
Therefore, the cell image analysis apparatus of the present invention preferably uses a method as shown in FIG.
In the cell image analysis apparatus of the present example, the image analysis software causes the boundary detection unit 1d to perform a one-dimensional direction from one end of the boundary candidate region to the other end in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit 1c. The average value of the luminance in an arbitrary reference area composed of one pixel and an area composed of one pixel or a predetermined number of pixels and a plurality of adjacent areas surrounding the reference area in the two-dimensional direction. And the comparison of the average luminance value and the luminance value in the reference area are sequentially performed while shifting the reference area and the plurality of adjacent areas one pixel at a time, and the calculated average luminance value and the reference area The reference region when the magnitude relationship with the brightness changes is detected as a cell boundary.
図５に示すように、細胞画像上の細胞の境界候補領域において、所定の一点とその一点に２次元方向に隣接する点を備えた、任意の領域を抽出し、その任意の領域内での各点の輝度の平均を算出する。図５(a)は細胞画像における任意の領域の一例を示す説明図、図５(b)は図５(a)における任意の領域周辺の画像を拡大して示す概念図、図５(c)は図５(b)の画像から任意の領域を抽出して示す概念図である。
図５中、Ａ１１〜Ａ３３で示される領域（点）は、それぞれピクセルを示している。図５では、ピクセルＡ１１，Ａ１２，Ａ１３は細胞領域外、ピクセルＡ２１，Ａ２２，ａ２３は細胞の境界、ピクセルＡ３１，Ａ３２，Ａ３３は細胞領域内に位置している。
As shown in FIG. 5, in a cell boundary candidate region on a cell image, an arbitrary region having a predetermined point and a point adjacent to the one point in a two-dimensional direction is extracted, and the region within the arbitrary region is extracted. The average brightness of each point is calculated. FIG. 5A is an explanatory diagram showing an example of an arbitrary region in the cell image, FIG. 5B is a conceptual diagram showing an enlarged image around the arbitrary region in FIG. 5A, and FIG. FIG. 6 is a conceptual diagram showing an arbitrary region extracted from the image of FIG.
In FIG. 5, areas (points) indicated by A11 to A33 each indicate a pixel. In FIG. 5, pixels A11, A12, and A13 are located outside the cell region, pixels A21, A22, and a23 are located at the cell boundary, and pixels A31, A32, and A33 are located within the cell region.
ここで、図５(c)に示す任意の領域内のピクセルＡ１１〜Ａ３３の平均輝度と、任意の領域の中心に位置するピクセルＡ２２の輝度とを比較する。
任意の領域は、図５(a)に示すように、細胞のサイズ、言い換えれば、細胞の境界の全長に対して非常に小さいサイズの領域である。このため、任意の領域では、図５(b)、図５(c)に示すように、細胞の境界（ピクセルＡ２１，Ａ２２，Ａ２３の領域）を中間領域として、細胞に近い細胞領域内（ピクセルＡ１１，Ａ１２，Ａ１３の領域）、細胞に遠い細胞領域外（ピクセルＡ３１，Ａ３２，Ａ３３）が規則的に並ぶ。
Here, the average luminance of the pixels A11 to A33 in the arbitrary region shown in FIG. 5C is compared with the luminance of the pixel A22 located at the center of the arbitrary region.
As shown in FIG. 5A, the arbitrary region is a region having a very small size with respect to the cell size, in other words, the entire length of the cell boundary. For this reason, in an arbitrary region, as shown in FIGS. 5B and 5C, the cell boundary (pixel A21, A22, A23 region) is an intermediate region within the cell region (pixel). A11, A12, and A13 areas) and outside the cell area far away from the cells (pixels A31, A32, and A33) are regularly arranged.
このため、図５に示すように、細胞画像上の細胞の境界候補領域内における所定の一点とその一点に２次元方向に隣接する点とからなる任意の領域を抽出した場合においても、図４で示した、１次元方向のピクセルの数列Ａ(i−1)，Ａ(i)，Ａ(i＋1)の３点を用いた場合と同様に、任意の領域における輝度が滑らかに変化する場合、その任意の領域内での各点の輝度の平均とその任意の領域の中心点での輝度との大小関係が変化する変極点を検出することによって、その変極点を細胞の境界として検出することができる。 Therefore, as shown in FIG. 5, even when an arbitrary region consisting of a predetermined point in the cell boundary candidate region on the cell image and a point adjacent to the one point in the two-dimensional direction is extracted, FIG. As in the case of using the three points A (i−1), A (i), and A (i + 1) of the number of pixels in the one-dimensional direction shown in FIG. Detecting the inflection point as a cell boundary by detecting the inflection point where the average relationship between the average brightness of each point in the arbitrary region and the luminance at the center point of the arbitrary region changes Can do.
細胞検出方法の原理５：光学系依存量に対する補正方法
上述した例では、各ピクセルでの輝度を比較したが、ピクセルの数は、画像の解像度や画像撮像装置における撮像光学系のレンズの倍率などに依存する。
そこで、本発明の細胞画像解析装置では、それらの撮像光学系に依存するピクセルの数に対する補正を行うため、ピクセル間の輝度を比較する代わりに、任意の距離単位を設定し、設定した任意の距離単位ごとの輝度を用いて上記と同じ方法で細胞の境界を検出するようにしてもよい。
例えば、点Ａ(i)，Ａ(i＋1)の間を１ピクセルではなく、３ピクセルの距離として定義して上記と同様の方法で細胞の境界を検出してもよい。
Principle 5 of cell detection method: Correction method for optical system-dependent amount In the above-described example, the luminance at each pixel is compared, but the number of pixels is the resolution of the image, the magnification of the lens of the imaging optical system in the imaging device, etc. Depends on.
Therefore, in the cell image analysis apparatus of the present invention, in order to correct the number of pixels depending on the imaging optical system, instead of comparing the luminance between pixels, an arbitrary distance unit is set, and the set arbitrary You may make it detect the boundary of a cell by the same method as the above using the brightness | luminance for every distance unit.
For example, the boundary between cells A (i) and A (i + 1) may be defined as a distance of 3 pixels instead of 1 pixel, and the cell boundary may be detected by the same method as described above.
実施例１
図６は本発明の実施例１にかかる細胞画像解析装置を用いた細胞画像解析の全体的な処理手順の概要を示すフローチャートである。図７は図６の細胞画像解析装置による細胞境界の検出処理手順を示すフローチャートである。
実施例１の細胞画像解析装置の基本構成は、図１に示した実施形態の細胞画像解析装置と同じである。
実施例１の細胞画像解析装置を用いた細胞画像解析では、図６に示すように、まず、所定の画像取得装置を用い細胞画像として、例えば、複数色の蛍光（透過）画像を取得する（ステップＳ１）。
次いで、細胞画像解析装置の領域分類手段１ａが、画像領域を分類し、細胞のおおよその存在領域を検出し、さらに、境界候補領域検出手段１ｃが、細胞の境界候補領域を検出する（ステップＳ２）。
次いで、境界検出手段１ｄが、境界候補領域検出手段１ｃが検出した細胞の境界候補領域から細胞境界を特定する。さらに、この段階では、細胞輪郭特定手段１ｅが、境界検出手段１ｄが特定した細胞境界を用いて細胞の輪郭を特定するとともに、細胞輪郭補正手段１ｆが細胞の輪郭の補正、細胞輪郭判別手段１ｇが細胞の判別を行い正確な細胞領域を取得する（ステップＳ３）。
次いで、細胞特徴量抽出手段１ｈが、取得した細胞領域内での画像を用いて、各細胞の明るさ、形態などの細胞の特徴量を抽出する（ステップＳ４）。
次いで、統計・出力手段１ｉが、グループごとの細胞特徴量の平均化、比較などの統計処理や処理結果の出力を行う（ステップＳ５）。
Example 1
FIG. 6 is a flowchart showing an outline of an overall processing procedure of cell image analysis using the cell image analysis apparatus according to Example 1 of the present invention. FIG. 7 is a flowchart showing a cell boundary detection processing procedure by the cell image analysis apparatus of FIG.
The basic configuration of the cell image analyzer of Example 1 is the same as that of the cell image analyzer of the embodiment shown in FIG.
In cell image analysis using the cell image analysis apparatus of Example 1, as shown in FIG. 6, first, for example, a fluorescence (transmission) image of a plurality of colors is acquired as a cell image using a predetermined image acquisition apparatus ( Step S1).
Next, the region classification unit 1a of the cell image analysis apparatus classifies the image region and detects an approximate existence region of the cell, and further, the boundary candidate region detection unit 1c detects the boundary candidate region of the cell (step S2). ).
Next, the boundary detection unit 1d specifies a cell boundary from the boundary candidate regions of the cells detected by the boundary candidate region detection unit 1c. Further, at this stage, the cell contour specifying means 1e specifies the cell contour using the cell boundary specified by the boundary detecting means 1d, and the cell contour correcting means 1f corrects the cell contour, and the cell contour determining means 1g. Discriminates the cells and obtains an accurate cell region (step S3).
Next, the cell feature amount extraction unit 1h extracts the feature amount of the cell such as the brightness and form of each cell using the acquired image in the cell region (step S4).
Next, the statistic / output unit 1i performs statistical processing such as averaging and comparison of cell feature values for each group and outputs processing results (step S5).
ここで、画像領域の分類〜細胞の境界候補領域の抽出処理（ステップＳ２）と細胞境界の特定処理（ステップＳ３）の処理手順を、図７を用いて説明する。
画像領域の分類〜細胞の境界候補領域の抽出処理（ステップＳ２）では、まず、領域分類手段１ａが、一定の閾値を用い、例えば、細胞画像の全体領域の平均輝度を算出し、算出した平均輝度と所定の領域内での平均輝度を比較することで、およその細胞領域を特定するなど、ある程度絞り込むようにして、細胞画像を、図８(a)に示すように、バックグランド、細胞領域、細胞の境界候補領域の３領域に分類する。
次いで、信号変化量算出手段１ｂが、分類した細胞領域又はバックグランド領域とそれ以外の領域の両方にまたがる所定の局所的な領域内において、上述の「細胞検出方法の原理２」で述べたように、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出し、境界候補領域検出手段１ｃが、該所定の局所的な領域内における所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として検出する。
Here, the processing procedure of image region classification to cell boundary candidate region extraction processing (step S2) and cell boundary identification processing (step S3) will be described with reference to FIG.
Extraction of a boundary candidate region classification-cells of the image area in (step S2), the first, the area classification means 1a, have use a threshold value of a certain, if example embodiment, calculates the average luminance of the entire region of the cell image By comparing the calculated average brightness with the average brightness within a predetermined area, the approximate cell area is specified, and the cell image is displayed as shown in FIG. Classify into three areas: ground, cell area, and cell boundary candidate area.
Next, the signal change amount calculation means 1b performs the above described “Principle of cell detection method 2” in a predetermined local region extending over both the classified cell region or the background region and the other region. In addition, a predetermined signal change amount corresponding to the change in position is calculated, and the boundary candidate region detecting unit 1c calculates a region where the change tendency of the predetermined signal change amount in the predetermined local region is the same. , Detected as a boundary candidate region.
細胞境界の特定処理（ステップＳ３）では、境界検出手段１ｄが、まず、境界候補領域検出手段１ｃが検出した境界候補領域内における、任意の点を細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）とし、例えば、図５に示したような任意の領域を抽出する。そして、任意の領域の中心に位置する細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）での輝度ａ（ｘ，ｙ）を検出する。細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）に対して２次元方向に隣接する点、あるいは細胞の境界候補の基準領域の点（ｘ，ｙ）を基準とする半径内において指定される点で囲まれた領域の平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）を算出する（ステップＳ３１）。 In the cell boundary specifying process (step S3), the boundary detection unit 1d first selects an arbitrary point in the boundary candidate region detected by the boundary candidate region detection unit 1c as a point (x, For example, an arbitrary area as shown in FIG. 5 is extracted. Then, the luminance a (x, y) at the point (x, y) of the reference region of the cell boundary candidate located at the center of the arbitrary region is detected. A point adjacent to the reference region point (x, y) of the cell boundary candidate in a two-dimensional direction, or designated within a radius based on the reference region point (x, y) of the cell boundary candidate The average luminance A (x, y) of the area surrounded by the points is calculated (step S31).
次いで、輝度ａ（ｘ，ｙ）と平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）との大小関係が変化する点（ｘ，ｙ）を細胞の境界として検出する（ステップＳ３２）。 Next, a point (x, y) where the magnitude relationship between the luminance a (x, y) and the average luminance A (x, y) changes is detected as a cell boundary (step S32).
ところで、上記方法を用いても、ある領域においては、輝度ａ（ｘ，ｙ）と平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）との大小関係が変化する点（ｘ，ｙ）が特定できず、細胞輪郭特定手段１ｅを介して特定される細胞の輪郭が断片化する場合や、細胞内小器官が存在する領域においては、輝度ａ（ｘ，ｙ）と平均輝度Ａ（ｘ，ｙ）との大小関係が変化する点（ｘ，ｙ）が複数特定され、細胞輪郭特定手段１ｅを介して細胞内小器官の輪郭も検出されてしまう場合が起こりうる。
そこで、本実施例の細胞画像解析装置では、画像解析ソフトウェアが、検出手段１ｄが検出した境界を用いて細胞輪郭特定手段が特定した細胞の輪郭に対して、細胞輪郭補正手段１ｆ、細胞輪郭判別手段１ｇを機能させて、次のような補正等を行う（ステップＳ３３）。
By the way, even if the above method is used, in a certain region, the point (x, y) where the magnitude relationship between the luminance a (x, y) and the average luminance A (x, y) changes cannot be specified, and the cell contour is determined. In the case where the outline of the cell specified through the specifying means 1e is fragmented, or in the region where the organelle is present, the magnitude relationship between the luminance a (x, y) and the average luminance A (x, y) It is possible that a plurality of points (x, y) at which the change occurs are specified, and the contour of the subcellular organelle is also detected via the cell contour specifying means 1e.
Therefore, in the cell image analysis apparatus of the present embodiment, the image analysis software uses the boundary detected by the detection unit 1d to determine the cell contour correction unit 1f and the cell contour discrimination for the cell contour specified by the cell contour specification unit. The means 1g is operated to perform the following corrections (step S33).
補正方法１：断片化に対する補正
輪郭の断片化に対しては、細胞輪郭補正手段１ｆが、これらの断片をつなぎ合わせて閉じた曲線を作ることで補正を行う。
図９(a)は本来の細胞の輪郭を示す図、図９(b)は細胞の輪郭が断片化して検出された例を示す図、図９(c)は図９(b)の断片化された領域に等高線を引いた状態を示す図である。
図９(c)に示すように、図９(b)に示した輪郭断片の各輝度を検出し、これらの輝度に対して画像中に輝度等高線を引くと、各細胞領域を閉じた曲線で定義することができ、図９(a)に示した本来の輪郭に近い輪郭が得られる。これらの等高線を平均化することで単一の曲線にして輪郭を得る。
即ち、特定した細胞の輪郭が断片化されていた場合、断片化されたそれぞれの輪郭断片の各画素領域における輝度を抽出し、それぞれの輪郭断片に対する輝度の等高線を複数設け、それらの等高線を平均化して単一の閉曲線とし、該単一の閉曲線を細胞の輪郭として特定する。
Correction method 1: For the fragmentation of the correction contour for fragmentation, the cell contour correction means 1f performs correction by connecting these fragments to form a closed curve.
9A is a diagram showing the outline of the original cell, FIG. 9B is a diagram showing an example in which the contour of the cell is fragmented, and FIG. 9C is the fragmentation of FIG. 9B. It is a figure which shows the state which pulled the contour line in the made area | region.
As shown in FIG. 9 (c), when each luminance of the contour fragment shown in FIG. 9 (b) is detected and luminance contour lines are drawn in the image with respect to these luminances, each cell region is a closed curve. It is possible to define a contour that is close to the original contour shown in FIG. By averaging these contour lines, a contour is obtained by making a single curve.
That is, when the contour of the specified cell is fragmented, the brightness in each pixel area of each fragmented contour fragment is extracted, and a plurality of brightness contour lines are provided for each contour fragment, and the contour lines are averaged. Into a single closed curve, and the single closed curve is specified as a cell outline.
補正方法２：細胞内小器官に対する補正
上述したように、本発明の細胞画像解析装置において、図１０に示すように、細胞の輪郭の他に、細胞内小器官の輪郭を検出してしまう場合がある。
この場合、細胞輪郭判別手段１ｇが、細胞輪郭特定手段１ｅが特定する細胞の境界を結んで作成された複数の閉曲線に対し、「各細胞の一番外側の閉曲線が細胞の境界になる」ことを用いて、「抽出された境界で結ばれる複数の閉曲線の包含関係を定義しておき、その定義に基づいて細胞内小器官と細胞の境界を分類する」ことで補正を行う。
即ち、細胞輪郭特定手段１ｅが特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、最も外側の閉曲線を細胞の輪郭として判別する。
これらの処理を行うことで、細胞の境界を極力正確に検出することができる。
なお、画像解析ソフトウェアは、さらに、コンピュータを、細胞輪郭特定手段１ｅが特定する細胞の輪郭が多重化した閉曲線で特定されていた場合、多重化された閉曲線のうち、細胞輪郭判別手段１ｇが判別した閉曲線以外の閉曲線を、細胞内小器官又は細胞上の小さい斑点上のものの輪郭として判別する細胞内小器官等判別手段として機能させるようにしてもよい。
Correction method 2: Correction for intracellular organelles As described above, in the cell image analysis apparatus of the present invention, as shown in FIG. There is.
In this case, the cell contour discriminating means 1g is “the outermost closed curve of each cell is the cell boundary” with respect to a plurality of closed curves created by connecting the cell boundaries specified by the cell contour specifying means 1e. Is used to perform correction by defining an inclusive relation of a plurality of closed curves connected by the extracted boundary and classifying the boundary between the organelle and the cell based on the definition.
That is, when the cell contour specified by the cell contour specifying unit 1e is specified by a multiplexed closed curve, the outermost closed curve among the multiplexed closed curves is determined as the cell contour.
By performing these processes, the cell boundary can be detected as accurately as possible.
In addition, the image analysis software further identifies the computer by the cell contour determining unit 1g out of the multiplexed closed curves if the computer is specified by the closed curve in which the cell contour specified by the cell contour specifying unit 1e is multiplexed. A closed curve other than the closed curve may be caused to function as a means for discriminating intracellular organelles or the like for discriminating the contours of intracellular organelles or small spots on cells.
本発明の細胞画像解析装置は、細胞画像の自動解析分野に有用である。 The cell image analysis apparatus of the present invention is useful in the field of automatic analysis of cell images.
１ 細胞画像解析装置
１ａ 領域分類手段
１ｂ 信号変化量算出手段
１ｃ 境界候補領域検出手段
１ｄ 境界検出手段
１ｅ 細胞輪郭特定手段
１ｆ 細胞輪郭補正手段
１ｇ 細胞輪郭判別手段
１ｈ 細胞特徴量抽出手段
１ｉ 統計・出力手段
Ａ(1)、Ａ(2)、Ａ(3)、Ａ(i)、Ａ１１、Ａ１２、Ａ１３、Ａ２１、Ａ２２、Ａ２３、Ａ３１、Ａ３２、Ａ３３ 細胞の境界周辺領域内における画素領域
ａ(1)、a(2)、a(3)、ａ(i) 細胞の境界周辺領域内における画素領域での輝度
Δａ(i)、Δａ(I+1) 細胞の境界周辺領域内における画素領域での輝度の変化量
ｉ 細胞の境界周辺領域の輝度断面に対応する画素領域の点
ａ（ｘ，ｙ） 細胞の境界候補の基準領域とする点（ｘ，ｙ）における輝度
Ａ（ｘ，ｙ） 細胞の境界候補の基準領域とする点（ｘ，ｙ）含む所定領域における平均輝度
DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Cell image analyzer 1a Area classification | category means 1b Signal variation | change_quantity calculation means 1c Boundary candidate area | region detection means 1d Boundary detection means 1e Cell outline specification means 1f Cell outline correction means 1g Cell outline discrimination means 1h Cell feature-value extraction means 1i Statistics and output Means A (1), A (2), A (3), A (i), A11, A12, A13, A21, A22, A23, A31, A32, A33 Pixel area within the boundary area of the cell a (1 ), A (2), a (3), a (i) Luminance in the pixel area in the peripheral area of the cell Δa (i), Δa (I + 1) In the pixel area in the peripheral area of the cell boundary Amount of change in luminance i Pixel in the pixel region corresponding to the luminance cross section in the peripheral region of the cell a (x, y) Luminance A (x, y) at the point (x, y) as the reference region of the cell boundary candidate In a predetermined area including the point (x, y) as the reference area of the boundary candidate Average brightness
Claims (15)
前記コンピュータを、
一定の閾値を用いて、蛍光細胞画像の領域を、細胞領域とバックグランド領域と細胞領域及びバックグラウンド領域以外の境界周辺領域とに分類する領域分類手段、
前記領域分類手段が分類した細胞領域又はバックグランド領域と細胞領域及びバックグラウンド領域以外の境界周辺領域との両方にまたがる所定の局所的な領域内における、位置の変化に対応した所定の信号変化量を算出する信号変化量算出手段、
前記所定の局所的な領域内において、前記信号変化量算出手段が算出した所定の信号変化量の変化傾向が同じとなっている領域を、境界候補領域として自動的に検出する境界候補領域検出手段、
として機能させる画像解析ソフトウェアを備えたことを特徴とする細胞画像解析装置。 A cell image analysis apparatus equipped with a computer for detecting cell boundaries using fluorescent cell images,
The computer,
Using a certain threshold, fluorescent cells image areas of the narrow alveolar region and the background region and the cell region and the area classification means for classifying the boundary peripheral region other than the background area,
In said area classification means of a predetermined spanning both the classification cell region or background region and a cell region and a background region other than the boundary peripheral area local area, the predetermined signal change amount corresponding to the change in position Signal change amount calculating means for calculating
Boundary candidate area detection means for automatically detecting, as a boundary candidate area, an area in which the change tendency of the predetermined signal change amount calculated by the signal change amount calculation means is the same in the predetermined local area. ,
A cell image analysis apparatus comprising image analysis software that functions as a computer.
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