JP5442641B2

JP5442641B2 - 全インフルエンザ菌の測定方法

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Publication number: JP5442641B2
Application number: JP2010545741A
Authority: JP
Inventors: 尚代増田; 優一石川; 亜友美佐藤; 秀明田中
Original assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-01-07
Filing date: 2010-01-05
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2030-01-05
Also published as: KR20110111381A; JPWO2010079739A1; CN102216781B; AU2010204066A1; EP2375253A4; CN102216781A; AU2010204066B2; US20110294143A1; WO2010079739A1; EP2375253A1; CA2748861A1; EP2657704A1

Description

本発明は、インフルエンザ菌全般を特異的に測定する方法、及び該方法に用いる測定装置に関する。

インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）は、肺炎球菌同様にヒト鼻咽腔の常在菌として知られており、常在化に至っていない特に乳幼児、小児においては気道感染症、中耳炎、髄膜炎、敗血症等の原因菌となることが知られている。他の感染症の原因菌同様に、インフルエンザ菌においても抗菌薬の多用による薬剤耐性化が症状の難治性化、重症化を招く原因として問題となってきており、治療開始時の適切な抗菌薬選択の重要性が増している。感染症治療の原則として、できる限り原因菌を早期に確定し、的確な治療薬を選択することが予後の改善、医療コストの削減、耐性菌発現防止に関して重要であることから、インフルエンザ菌由来共通抗原を迅速に検出する診断試薬が求められる。

現在、インフルエンザ菌判定方法としてグラム染色法、検鏡、培養法、菌体の酵素代謝を利用した呈色反応、ラテックス凝集法、ＰＣＲ法等が用いられている。この内、迅速診断方法としてラテックス凝集法を用いたインフルエンザ菌抗原検出キット（Slidex Meningite-Kit 5. bioMerieux社）があるが、これはｂ型インフルエンザ菌の多糖体抗原を検出するものであり、無莢膜型の判定には用いることが出来ない。またＰＣＲ法によるインフルエンザ菌遺伝子検出測定法や菌株共通抗原のＰ６やＰ４抗原を標的としたそれらの遺伝子検出測定法もあるが、ＰＣＲ法による遺伝子診断測定法は実施施設が限定されることもあり現在のところは一般性に乏しい。またＰ６抗原のモノクローナル抗体に関する報告があり、ウェスタンブロッティングによりインフルエンザ菌を検出している（非特許文献１）。しかし、この方法による感度は低く、臨床検査として用いられるレベルではない。

インフルエンザ菌はグラム陰性桿菌で、菌を被う莢膜の有無から莢膜型と無莢膜型とに大別され、さらに莢膜型には莢膜に存在する多糖抗原の構造の差異に起因する血清型別分類としてａ〜ｆ型が存在し、また無莢膜型は型別不能な型として分類される。ｂ型莢膜多糖であるポリリボシルリビトールホスフェートは、ｂ型特異的抗原として報告されるが、無莢膜型ではこのような特異抗原としての多糖は知られていない。また、無莢膜型の蛋白抗原として菌体外膜蛋白質の１つであるＰ２蛋白質がインフルエンザ菌の主要抗原として知られるが、本抗原は変異が多発するために、菌株により抗原性が異なることが知られている。

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．（１９８９）２２６３−２２６７

前記のようにインフルエンザ菌の共通抗原は見出されておらず、全インフルエンザ菌を同時に検出することができる免疫学的方法はなかった。
本発明は、上記問題を解決することを課題とするもので、全てのインフルエンザ菌を同時に高感度に測定できる免疫学的測定方法及び、当該方法を利用した測定装置を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意努力を重ねた結果、従来インフルエンザ菌に共通に存在し比較的変異の少ないといわれているＰ４及びＰ６タンパクに注目した。当該タンパク質はインフルエンザ菌には他抗原に比べ発現量が少なく、したがって認識抗体を作製しても高感度にしかもすべてのタイプのインフルエンザ菌を全般的に測定することは困難であると考えられていた。また、Ｐ４及びＰ６タンパクにホモロジーの高いタンパクを有する細菌は多数存在するため、インフルエンザ菌を特異的に検出することは困難であると考えられていた。しかしながら、予想に反し本発明者は、高度選択的に認識する抗体を作製することができた。また、当該抗体は測定時に容易に混入する可能性のある緑膿菌、大腸菌等の影響を受けづらいことが判明した。本発明は、本成果を元に完成されたものである。

すなわち、本発明は、インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を用いることを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定方法を提供するものである。
また本発明は、インフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原認識抗体を含有することを特徴とする全インフルエンザ菌の免疫学的測定装置を提供するものである。

本発明による、すべてのインフルエンザ菌を対象にした高感度測定方法の確立により、当該測定装置の提供が可能になり、これにより中耳炎などに感染したインフルエンザ菌全般の検出が簡便・迅速にできるようになった。本発明方法は、インフルエンザ菌による中耳炎の検出に特に有用である。

ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ４ＰｏＡｂ（ａ）及び抗Ｐ６ＰｏＡｂ（ｂ）の免疫原のインフルエンザ菌共通抗原（Ｐ６、Ｐ４）に対する反応性を示す。ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ６ＰｏＡｂのＮＴＨｉＰ６（ａ）及びＮＴＨｉ破砕菌体（ｂ）に対する反応性を示す。ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ６ＰｏＡｂの細菌類（表１）に対する反応性を示す。ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ４ＰｏＡｂのＰ４ｒｅｃ．（ａ）及びＮＴＨｉ菌体抽出液（ｂ）に対する反応性を示す。ＥＬＩＳＡにおける、抗Ｐ４ＰｏＡｂの細菌類（表１）に対する反応性を示す。イムノクロマトの一般的構造を示す。イムノクロマトストップへの検体の展開状態を示す。イムノクロマトにおける抗Ｐ６ＰｏＡｂのＮＴＨｉＰ６（ａ）及びＮＴＨｉ破砕抗体に対する反応性を示す。

本発明の測定法の対象となる菌はインフルエンザ菌であり、インフルエンザ菌は莢膜型としてａ〜ｆ型、及び無莢膜型のすべてが測定対象である。具体的には、Ｐ４抗原及びＰ６抗原を発現している菌が対象となる。また、インフルエンザ菌対象疾患として、乳幼児及び小児における気道感染症、中耳炎、髄膜炎及び敗血症などが考えられるが、このような疾患の場合、患部からサンプルを採取した場合、他の菌が混入し測定系に反応する可能性が考えられる。しかし、本発明測定法では、Ｐ６抗原及びＰ４抗原とホモロジーを有する蛋白質を構成成分とする菌、例えばパラインフルエンザ菌、緑膿菌、大腸菌などに対しては、一切反応しないのが特徴である。元来、抗原に対するポリクローナル抗体を調製し、測定系に使用した場合、当然ホモロジーを有する抗原所有菌に対する交叉性が生じるのが通常であり、またＰ６及びＰ４抗原の場合もこのように他菌との交叉性の生じる危惧があった。また、当該抗原はいずれもインフルエンザ菌においては微量成分でありポリクローナル抗体を作製することができたとしても、測定感度の点で不利であるというのも大方の見方であった。以上から当該抗原に対するポリクローナル抗体を用いた測定系の報告はない。しかしながら、本発明の場合、これらポリクローナル抗体を用いた測定系は、予想に反して上述サンプルへの混入の可能性のあるパラインフルエンザ菌、緑膿菌、大腸菌などとの交叉反応性が極めて低く（図３参照）、予想以上に高感度でインフルエンザ菌全般を測定することができる。

本発明で用いるインフルエンザ菌のＰ４抗原又はＰ６抗原を認識する抗体は、Ｐ４抗原又はＰ６抗原を動物に免疫し、その動物の抗血清又は卵等を取得することにより製造することができる。

免疫に用いられるＰ４抗原又はＰ６抗原は、インフルエンザ菌から採取してもよく、組換え法により製造することも可能である。このうち、測定感度の点から、インフルエンザ菌から抽出した抗原を用いるのが好ましい。ここでＰ４抗原又はＰ６抗原としては、Ｐ４タンパク又はＰ６タンパクでもよいし、Ｐ４抗原又はＰ６抗原の一部のポリペプチドでもよい。

また、Ｐ４抗原及びＰ６抗原のうち、Ｐ６抗原を用いるのがインフルエンザ菌に対する特異性及び感度の点で好ましい。

Ｐ６抗原に関するヌクレオチド配列及びそれがコードしているアミノ酸配列を配列番号１に示す（アクセッションＭ１９３９１）。Ｐ４抗原に関するヌクレオチド配列及びそれがコードしているアミノ酸配列を配列番号２に示す（アクセッションＭ６８５０２）。

以下の説明については、Ｐ６抗原に基いて説明するが、Ｐ４抗原の場合も同様にして実施することができる。

Ｐ６及びＰ４抗原の組換え体の作製
Ｐ６抗原に基づき説明する。Ｐ６ポリヌクレオチドは、配列番号１の配列情報に基づいて、化学的ＤＮＡ合成法により製造、取得することができるが、一般的遺伝子工学的手法により容易に製造・取得することができる〔Molecular Cloning 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989)；続生化学実験講座「遺伝子研究法Ｉ、II、III」、日本生化学会編（1986）等参照〕。
化学的ＤＮＡ合成法としては、フォスフォアミダイト法による固相合成法を例示することができる。この合成法には自動合成機を利用することができる。
また、一般的遺伝子工学的手法としては、具体的には、Ｐ６ポリヌクレオチドが発現される適当な起源より、常法に従ってｃＤＮＡライブラリーを調製し、該ライブラリーから、Ｐ６ポリヌクレオチドに特有の適当なプローブや抗体を用いて所望クローンを選択することにより実施できる〔Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981)；Science122,778 (1983)等〕。
ここで、ｃＤＮＡの起源としては、Ｐ６ポリヌクレオチドを発現する微生物であれば特に制限されないが、具体的には、H.influenzaeを好適に用いることができる。

また、これらからの全ＲＮＡの分離、ｍＲＮＡの分離や精製、ｃＤＮＡの取得とそのクローニング等はいずれも常法に従って実施することができる。また、Ｐ６ポリヌクレオチドをｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングする方法も、特に制限されず、通常の方法に従うことができる。具体的には、例えばｃＤＮＡによって産生されるポリペプチドに対して、該ポリペプチド特異抗体を使用した免疫的スクリーニングにより対応するｃＤＮＡクローンを選択する方法、目的のヌクレオチド配列に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション等やこれらの組合せ等を例示できる。

ここで用いられるプローブとしては、Ｐ６ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に関する情報をもとにして化学合成されたＤＮＡ等が一般的に例示できる。また、本発明のポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づき設定したセンスプライマー及び／又はアンチセンスプライマーをスクリーニング用プローブとして用いることもできる。

Ｐ６ポリヌクレオチドの取得に際しては、ＰＣＲ法〔Science130, 1350 (1985)〕又はその変法によるＤＮＡ若しくはＲＮＡ増幅法が好適に利用できる。殊に、ライブラリーから全長のｃＤＮＡが得られ難いような場合には、ＲＡＣＥ法〔Rapid amplification of cDNA ends；実験医学、12(6), 35 (1994)〕、特に５’−ＲＡＣＥ法〔M.A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998 (1988)〕等の採用が好適である。

かかるＰＣＲ法の採用に際して使用されるプライマーは、Ｐ６ポリヌクレオチドの配列情報に基づいて適宜設定することができ、これは常法に従って合成できる。尚、増幅させたＤＮＡ若しくはＲＮＡ断片の単離精製は、前記の通り常法に従うことができ、例えばゲル電気泳動法、ハイブリダイゼーション法等によることができる。

Ｐ６ポリヌクレオチドによれば、通常の遺伝子工学的手法を用いることにより、該ポリヌクレオチドの産物（すなわち、上記ポリペプチド）を容易に大量に、安定して製造することができる。

発現ベクター
発現ベクターは、Ｐ６ポリヌクレオチドを含んでおり、且つ該Ｐ６ポリヌクレオチドを発現できるものであれば特に制限されず、一般に宿主細胞との関係から適宜選択される。

宿主細胞として原核生物の細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、例えば該宿主細胞中で複製可能なプラスミドベクターであって、このベクター中に上記ポリヌクレオチドが発現できるように上記ポリヌクレオチドの上流にプロモーター及びＳＤ（シヤイン・アンド・ダルガーノ）塩基配列を付与した発現プラスミドを挙げることができる。具体的には、Ｐ_Lプロモーター、Ｔ７プロモーター及びｌａｃプロモーターを利用した発現プラスミドを挙げることができる。他の好ましい細菌発現ベクターとしてはｔａｃプロモーター又はｔｒｃプロモーターを利用したプラスミドｐＫＫ２３３−２及びｐＫＫ２３３−３等を挙げることができる。ただし、これらに限定されず公知の各種の菌株及びベクターをも利用できる。

また、宿主細胞として脊椎動物細胞を使用する場合、発現ベクターとしては、通常発現しようとする上記ポリヌクレオチドの上流に位置するプロモーター、ＲＮＡのスプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写終了配列等を保有するものを使用でき、これはさらに必要により複製起点を有していてもよい。上記ポリヌクレオチドを挿入するのに有用な真核生物ベクターはよく知られている。例えば、適当な真核生物ベクターとしてはｐＣＤ及びｐＣＭＶを例示することができる。また、これらの他には、必要に応じて、ＭＭＴＶ又はＳＶ４０後期プロモーターを利用したｐＭＳＧ及びｐＳＶＬを挙げることができる。

組換え細胞
Ｐ６ポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質転換させれば組換え細胞（形質転換体）が得られる。
組換え細胞に使用される宿主細胞としては、原核細胞及び真核細胞のいずれを使用してもよい。
宿主細胞として使用される原核細胞としては、遺伝子組換えで良く用いられる細菌を用いることができ、大腸菌、ストレプトミセス、枯草菌、ストレプトコッカス、スタフィロコッカス等を例示することができる。特に、大腸菌、枯草菌などを好適な例としてあげることができる。
宿主細胞として使用される真核細胞としては、例えば、酵母、アスペルギルス等の真核微生物；ドロソフィラＳ２、スポドプテラＳｆ９等の昆虫細胞；Ｌ細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｃ１２７細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞（ジヒドロ葉酸レダクターゼやチミジンキナーゼなどを欠損した変異株を含む）、ＢＨＫ２１細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｂｏｗｅｓメラノーマ細胞、卵母細胞等の動植物細胞等を例示することができる。

また、上記発現ベクターを宿主細胞に導入する方法は、特に制限されず、一般的な各種方法を採用することができる。例えば、上記発現ベクターの宿主細胞への導入は、Ｄａｖｉｓら（BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1986）及びＳａｍｂｒｏｏｋら（MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）等の多くの標準的な実験室マニュアルに記載される方法に従って行うことができ、その具体的手法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、トランスベクション（transvection）、マイクロインジェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、スクレープローディング（scrape loading）、弾丸導入（ballistic introduction）、感染等が挙げられる。

組換え細胞を用いたＰ６抗原ペプチドの製造
Ｐ６ポリヌクレオチドが導入された組換え細胞を培養し、細胞及び又は培養物からＰ６ポリペプチドを回収することにより、Ｐ６ポリペプチドを製造することができる。

培養は、宿主に適した培地を用いて継代培養又はバッチ培養を行えばよい。培養は、組換え細胞の内外に生産されたＰ６ポリペプチド量を指標にして、Ｐ６ポリペプチドが適当量得られるまで行えばよい。
該培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択利用でき、培養も宿主細胞の生育に適した条件下で実施できる。

また、斯くして得られるＰ６ポリペプチドは、所望により、その物理的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作〔「生化学データーブックII」、1175-1259頁、第１版第１刷、1980年6月23日株式会社東京化学同人発行；Biochemistry, 25(25), 8274 (1986);Eur. J. Biochem., 163, 313 (1987) 等参照〕により分離、精製できる。具体的には、下記「抗原の抽出及び単離」の欄において記載された目的タンパク質を単離精製する方法と同様の方法が例示される。

Ｐ６抗原ペプチドの抽出及び単離法
以下、Ｐ６ポリペプチド産生能を有する微生物から、Ｐ６ペプチドを単離精製する方法について説明する。先ず、Ｐ６ポリペプチド産生能を有する微生物の菌体を破砕し、該微生物の粗抽出物を得る。ここで、菌体の破砕には、フレンチプレス、セルミル等の破砕機による処理；低張溶液下超音波処理等の通常の菌体破砕処理に使用されている方法が使用される。また、得られた粗抽出物には、適当な緩衝液を添加しておいてもよい。

得られた粗抽出物に対しては、その精製度を上げるために、さらに、硫酸アンモニウム沈殿、エタノール等を利用した有機溶媒沈殿、又は等電点沈殿等の精製処理に供しても良い。次いで、粗抽出物を、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、各種アフィニテイークロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー等の処理に供することにより、Ｐ６ポリペプチドを含む画分を得ることができる。なお、これらのクロマトグラフィーによる処理は、必要に応じてオープンカラムを使用してもよく、またＨＰＬＣを使用してもよい。また、斯くして得られたＰ６ポリペプチドを含む画分の純度については、電気泳動、特にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、可視的に簡便に推定できる。また、Ｐ６ポリペプチドは、アミノ酸配列分析法；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳ、ＥＳＩＱ−ＴＯＦＭＳ又はＭＡＬＤＩＱ−ＴＯＦＭＳ等の質量分析装置を利用した質量分析法；ペプチドマスフィンガープリンテイング法等によって確認することもできる。

抗体の取得
測定に用いるＰ６抗原ペプチド又はＰ６抗原ペプチド認識抗体の取得に関しては、常法に従い取得することができる。ポリクローナル抗体を使用するのが好ましい。
ポリクローナル抗体を作製する場合は、ウサギ、ヒツジ、モルモット、ニワトリのような温血動物に、上記目的抗原を通常、フロイントの完全アジュバントと混和して調製した乳化物を、複数回免疫し、得られる抗血清を常法に従い取得することが可能である。また、ニワトリの場合には、上記免疫抗原を複数回免疫して、該ニワトリが産卵する鶏卵にＩｇＹを産生させ、そして該鶏卵の卵黄より、常法に従いＩｇＹを取得することができる。

測定系の構築
本発明インフルエンザ菌の測定方法は、Ｐ６抗原又はＰ４抗原を認識するポリクローナル抗体を用いるのが好ましい。被検試料はインフルエンザ菌或いは当該菌の抽出物であってもよい。このうちＰ６抗原を認識するポリクローナル抗体を用いるのが、特に好ましい。
本免疫学的手法を利用した測定装置としては、ＥＬＩＳＡ及びイムノクロマト測定装置を代表例として挙げることができる。他の例としてラジオイムノアッセイ法（ＲＩＡ）などの測定対象物に対する抗体を利用した手法を好適な例として挙げることができる。

ＥＬＩＳＡ測定方法
例えば、サンドイッチ法の場合であれば、通常９６穴プレートに対して、一次抗体（抗Ｐ６ポリクローナル抗体又は抗Ｐ４ポリクローナル抗体）をプレートに固相化しておき、生体由来試料（血液、血清、血漿、或いは他の体液成分特に耳漏れなどの中耳浸出液や咽頭ぬぐい液、尿）或いは、必要に応じて、適当な緩衝液に希釈したものを添加し一定時間抗体と接触させることにより結合させる。その後、適当な緩衝液で洗浄を行った後、標識２次抗体（標識抗Ｐ６抗体又は標識Ｐ４抗体）を反応させる。例えば、標識体がビオチンであればアビジン（或いはストレプトアビジン）標識ペルオキシダーゼを反応させ、適当な反応基質（例えばＴＢＭ）を作用させることにより発色させる。一定時間後、所定の波長この場合であれば４５０ｎｍで測定することにより、比色定量を行う。アビジン標識抗体にペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びチロシナーゼ標識などが考えられる。基質としては、市販で一般に使用されているものであれば特に制限はない。
標識抗体としては、ビオチン標識抗体、これに対してアビジン又はストレプトアビジン、或いは、２次抗体にペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ及びチロシナーゼ標識などが挙げられる。基質としては、市販で一般に使用されているものであれば特に制限はない。

イムノクロマト測定装置
イムノクロマトの構造は図６に示す一般的手法に従うことができる。簡略にはプラスティック台紙上の片側末端に貼り付けられたサンプルアプライ部分（サンプルパッド）、続いて金コロイド標識抗Ｐ６ＰｏＡｂを乾燥保持させた部分（ゴールドパッド）、ニトロセルロース部分、及び過剰なサンプルを吸収する部分（吸収パッド）から構成される。サンプルパッド及び吸収パッドにはガラス繊維濾紙やセルロース製、又はコットン製、さらにはそれらの混合体の濾紙が望ましく、ニトロセルロースはポアサイズ１．０〜２０μｍ（好ましくは５．０〜１０．０μｍ）が望ましい。なお金コロイド標識抗Ｐ６ＰｏＡｂを溶液状態で使用する場合にはゴールドパッドは必要としない。

ニトロセルロース上のテストライン上には、上記のＰ６ＰｏＡｂを０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度（好ましくは０．２〜５ｍｇ／ｍＬ）の濃度で塗布する。コントロールライン上には抗ウサギＩｇＧ活性を有するヤギやマウスのＩｇＧ等を０．１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で塗布する。乾燥後、蛋白質や高分子等でブロッキングを行う。ブロッキング操作にはＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白質や、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の高分子が使用可能である。一方、金コロイドとしては２０〜１５０ｎｍのサイズ（好ましくは３０〜１００ｎｍ）が望ましく、抗体の標識には吸着もしくは他の蛋白質等を介した共有結合が考えられる。さらには着色Ｌａｔｅｘ粒子や他の貴金属コロイドも金コロイドの代わりに使用可能と考えられる。金コロイドのブロッキングはニトロセルロース同様にＢＳＡ、カゼイン、ゼラチン等の蛋白や、ＰＶＡ、ＰＶＰ、ＰＥＧ等の高分子が使用可能である。このようにして組み立てたテストストリップをプラスティックケース内に納めて使用すればよい。

診断キット
被検試料中のＰ４抗原量若しくはＰ６抗原量を測定することにより、中耳炎患者等におけるインフルエンザ菌感染の有無を測定することが出来る。すなわち、ＥＬＩＳＡキット又はイムノクロマト法のための各種試薬を含めたキット組成物を提供することができる。特に、キット中には、Ｐ４抗原若しくはＰ６抗原に対する抗体を含む。キットには他に、ＢＳＡなどのアルブミン、２次抗体、酵素の基質（標識として酵素を使用した場合）などが含まれる。例えば、標識抗体がビオチン標識抗体であれば、該測定キットには２次抗体としてペルオキシダーゼ標識アビジンを含み得る。また、該ペルオキシダーゼに対する基質等を含む全インフルエンザ菌診断キットが提供できる。

本発明方法によれば、種々の感染症におけるインフルエンザ菌が特異的に検出できる。従って、本発明方法により陽性と判断された感染症の病因菌はインフルエンザ菌であると判定できる。本発明の対象疾患としては、乳幼児及び小児における気道感染症、中耳炎、敗血症が挙げられるが、中耳炎ではパラインフルエンザ菌の感染がほとんどない（International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology(2003)67,43-51）。従って、本発明方法は、中耳炎における全インフルエンザ菌の測定に特に有用である。

以下に本発明の実施例を示すが、これに限定されるべきものではない。

１．抗Ｐ６又はＰ４抗体の作製
Ｐ６又はＰ４各蛋白質を、菌体からの直接抽出又は大腸菌リコンビナントとして作製し、ウサギに免疫することでポリクローナル抗体を得た。続いて得られた抗体によりＥＬＩＳＡ系を構築し評価した。さらに、イムノクロマト系に転化し迅速診断の可能性を検討した。

１−１．抗原作製
１−１−１．Ｐ６抗原の調製
Ｐ６抗原はインフルエンザ菌からの直接抽出及び大腸菌リコンビナント作製の２法により実施した。

菌体からの抽出
Ｋｏｄａｍａ等の方法（Infection and Immunity, 68, 2294-2300(2000)）に従い、菌体からＰ６抗原を抽出した。すなわち、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ（ＡＴＣＣＮｏ．９３３３））をバシトラシン添加チョコレート寒天培地（ＢＤ社）上で培養し、掻き取り法や遠心法により沈殿物として回収した。沈澱を１％ＳＤＳ／０．１ＭＴｒｉｓ／０．５ＭＮａＣｌ／０．１％２−メルカプトエタノール（ｐＨ８．０）の緩衝液に懸濁、超音波破砕後に３７℃、３０分間加温した。遠心で得られた沈殿物を１０ｕｇ／ｍＬＲＮａｓｅＡ（ＳＩＧＭＡ社）を添加した上記の緩衝液で懸濁、超音波破砕し再度３７℃、３０分間加温した。続いて遠心で沈殿物を得た後にＲＮａｓｅＡ無添加の緩衝液で懸濁、超音波破砕、加温の一連の操作を２回繰り返した。遠心後の沈殿物を０．０１ＭＴｒｉｓ／０．１５ＭＮａＣｌ（ｐＨ７．４）の緩衝液に懸濁し、超音波破砕後、６５℃、３０分間加温した。遠心にて得られた上清を遠心型限外濾過により濃縮し、これを抗原として使用した。

大腸菌リコンビナントの作製
インフルエンザ菌ｂ型（Ｈｉｂ）（ＡＴＣＣＮｏ．１０２１１）の菌体をテンプレートに用いてｄｉｒｅｃｔＰＣＲを行いシグナル配列の欠いたＰ６遺伝子（ｍａｔｕｒｅｆｏｒｍ）を増幅した。フォワードプライマーには5'-GCGGGATCCTGTAGTTCCTCTAACAACGATGCT-3'（配列番号３）を、リバースプライマーには5'-GCGGAGCTCGTACGCTAACACTGCACGACGGTT-3'（配列番号４）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ^TMＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００（ＰＥＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）でＴａＫａＲａｒＴａｑ（ＴａＫａＲａ社）を使用し得られた増幅断片をサブクローニング用ベクターｐＣＲ^TM２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に挿入した。増幅したＰ６遺伝子（ｍａｔｕｒｅｆｏｒｍ）の配列を確認後、続けてＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩサイトを利用して切り出した断片を発現ベクターｐＥＴ２１ａ（ＭＥＲＣＫ社）に挿入し、リコンビナントＰ６発現用ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐ６−ｐＥＴ２１ａ）を作製した。大腸菌ＢＬ２１に形質導入後、１ｍＭＩＰＴＧ、３７℃、３時間の条件下でリコンビナントＰ６抗原の発現誘導を行った。遠心による集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ^TMＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ（ＭＥＲＣＫ社）で溶菌し、遠心操作により可溶性画分を回収した。ヒスチジンタグの結合したリコンビナントＰ６抗原は、平衡化用緩衝液（１００ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ７．８）にて平衡化済みのＮｉカラム（ＨｉｓＴｒａｐ^TMＨＰ；ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ社）へ結合させ、平衡化用緩衝液、洗浄用緩衝液（１００ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭＮａＣｌ，５０ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ６）で順次洗浄後、溶出用緩衝液（１００ｍＭＰｈｏｓｐｈａｔｅ，３００ｍＭＮａＣｌ，２００ｍＭｉｍｉｄａｚｏｌｅ，ｐＨ６）で溶出した。精製後のリコンビナントＰ６抗原はＤ−ＰＢＳ（−）で４℃、１晩の透析を行ったのちに遠心型限外濾過により濃縮した。

１−１−２．Ｐ４抗原の調製
Ｐ４抗原は大腸菌リコンビナントのみ作製した。作製手順等はリコンビナントＰ６抗原とほぼ同様であるが、まず、無莢膜型インフルエンザ菌（ＮＴＨｉ）（ＡＴＣＣＮｏ．９３３３）の菌体をテンプレートに用いてｄｉｒｅｃｔＰＣＲを行いシグナル配列の欠いたＰ４遺伝子（ｍａｔｕｒｅｆｏｒｍ）を増幅した。フォワードプライマーには5'-GCGGGATCCTGTGGTTCACACCAAATGAAATC-3'（配列番号５）を、リバースプライマーには5'-GCGCTCGAGTTTACCATCCCAAGCTTGTACTG-3'（配列番号６）を使用し、ＧｅｎｅＡｍｐ^TMＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９７００でＴａＫａＲａＥｘＴａｑ（ＴａＫａＲａ社）を使用し得られた増幅断片をＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩによる制限酵素処理後、これら両サイトを利用して発現ベクターｐＥＴ２１ａに挿入し、リコンビナントＰ４発現用ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐ４ｍ−ｐＥＴ２１ａ）を作製した。大腸菌ＢＬ２１に形質導入後、１ｍＭＩＰＴＧ、３７℃、３時間の条件下でリコンビナントＰ４抗原の発現誘導を行った。遠心による集菌後、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ^TMＰｒｏｔｅｉｎＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＲｅａｇｅｎｔで溶菌し、遠心操作により可溶性画分を回収した。ヒスチジンタグの結合したリコンビナントＰ４抗原は、平衡化用緩衝液にて平衡化済みのＮｉカラムへ結合させ、平衡化用緩衝液、洗浄用緩衝液で順次洗浄後、溶出用緩衝液で溶出した。精製後のリコンビナントＰ４抗原はＤ−ＰＢＳ（−）で４℃、１晩の透析を行ったのちに遠心型限外濾過により濃縮した。

１−２．抗体作製
得られた各免疫原をウサギの皮下にフロイント等のアジュバントと共に免疫した。免疫量は１００μｇ／ｂｏｄｙを用い、隔週で５〜６回程の免疫を行った。各抗原につき２個体ずつ免疫し、得られた全血を遠心分離後、抗血清として凍結保管した。抗血清は適量を解凍後、ＰｒｏｔｅｉｎＡを用いたアフィニティ精製やゲル濾過により精製し、得られた抗体をポリクローナル抗体（ＰｏＡｂ）として使用した。

１−３．ＰｏＡｂの反応性
上記方法により作製した各ＰｏＡｂの力価は以下のＥＬＩＳＡ法により評価した。まず、免疫原であるリコンビナントＰ４抗原、リコンビナントＰ６抗原及び抽出Ｐ６抗原を１μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化後、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）等でブロッキングした。リコンビナントＰ４抗原固相プレートには、２個体から精製した抗Ｐ４ＰｏＡｂを、またリコンビナントＰ６抗原及び抽出Ｐ６抗原固相プレートには２種のＰ６抗原より得られた計４種の抗Ｐ６ＰｏＡｂを各１μｇ／ｍＬの濃度で反応させた。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識した抗ウサギＩｇＧ抗体（ＺＹＭＥＤ社）を反応させ、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）で発色させた。なお、コントロール抗原としてＢＳＡ固相プレートを使用した。さらに、得られた各ＰｏＡｂの菌体への反応性を確認するために、ＮＴＨｉを界面活性剤又は超音波等により破砕したＮＴＨｉ（ＡＴＣＣＮｏ．９３３３）の破砕菌体を、１μｇ／ｍＬで固相化したプレートを用いて同様にＥＬＩＳＡを行った。結果は、図１のａ、ｂに示すが抗Ｐ４、抗Ｐ６ＰｏＡｂの何れも、免疫原だけでなく、破砕菌体に対しても反応性を有することから、インフルエンザ菌抗原検出サンドイッチＥＬＩＳＡの構築が可能と推測された。

２．Ｐ６又はＰ４抗原検出用ＥＬＩＳＡの構築及び性能評価（ＥＬＩＳＡ実施例）
２−１．Ｐ６抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡ
抗Ｐ６ＰｏＡｂ（抗ＮＴＨｉＰ６ＰｏＡｂＮｏ．２）を５μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化後、ＢＳＡ等でブロッキングした。本抗体固相プレートに対し、適宜段階希釈した免疫原又は破砕菌体を反応させた。洗浄後、固相した抗Ｐ６ＰｏＡｂと同一のＰｏＡｂのビオチン標識体をそれぞれ反応させ、再度洗浄後、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンを反応させ、ＴＭＢで発色させた。用量依存曲線の一例を図２のａ、ｂに示すが、３０ｐｇ／ｍＬ以上のＰ６抗原を検出可能であり、またＮＴＨｉ（ＡＴＣＣＮｏ．８１４９）の破砕菌体では、１０³〜１０⁷ＣＦＵ／ｍＬの検出が可能であった。

２−２．Ｐ６抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡの交差反応性
上記サンドイッチＥＬＩＳＡにより、表１に示す各種細菌類への交差反応性を評価した結果を図３に示すが、目的通りに莢膜型、無莢膜型両方のインフルエンザ菌株すべてを検出した。

２−３．Ｐ４抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡ
測定手順等は上記Ｐ６抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡと同じであるが、抗Ｐ４ＰｏＡｂ（抗Ｐ４ｒｅｃ．ＰｏＡｂＮｏ．２）を５μｇ／ｍＬの濃度でそれぞれＥＬＩＳＡプレートに固相化後、ＢＳＡ等でブロッキングした。本抗体固相プレートに対し、適宜段階希釈した免疫原又は破砕菌体を反応させた。洗浄後、固相した抗Ｐ４ＰｏＡｂと同一のＰｏＡｂのビオチン標識体をそれぞれ反応させ、再度洗浄後、ＨＲＰ標識したストレプトアビジンを反応させ、ＴＭＢで発色させた。用量依存曲線の一例を図４のａ、ｂに示すが、１００ｐｇ／ｍＬ以上のＰ４抗原を検出可能であり、またＮＴＨｉの破砕菌体では、１０³〜１０⁷ＣＦＵ／ｍＬの検出が可能であった。

２−４．Ｐ４抗原検出用サンドイッチＥＬＩＳＡの交差反応性
サンドイッチＥＬＩＳＡにより、表１に示す各種細菌類への交差反応性を評価した結果を図５に示すが、目的通りに莢膜型、無莢膜型両方のインフルエンザ菌株すべてを検出した。

以上の結果から、何れの抗Ｐ６ＰｏＡｂ、抗Ｐ４ＰｏＡｂにおいても主にインフルエンザ菌抗原を検出可能なサンドイッチＥＬＩＳＡの測定系を組めたことから、イムノクロマトによる測定系の構築が可能と推測された。

３．Ｐ６抗原検出用イムノクロマトの構築及び性能評価
３−２．抗Ｐ６ＰｏＡｂを用いたサンドイッチイムノクロマトの性能
上記操作によって作製した金コロイド標識抗Ｐ６ＰｏＡｂを、界面活性剤を含有するリン酸緩衝液等で希釈後に抽出Ｐ６抗原と混和し図７の右側に示すような手法を用いて、抗体固相テストストリップに展開した。上記緩衝液で洗浄後、現れた各テストラインの信号強度をデンシトメーターにより解析し数値化した。結果、図８のａ、ｂに示すように、免疫原では今回の測定最小濃度１ｎｇ／ｍＬ以上でテストラインの信号強度の検出が可能であった。またＮＴＨｉの破砕菌体では３ｘ１０⁴ＣＦＵ／ｍＬ以上において菌体濃度依存的なテストラインの信号強度の検出が可能であった。これらの結果から、抗Ｐ６ＰｏＡｂによりインフルエンザ菌抗原を検出するイムノクロマト測定系の構築ができた。

Claims

菌体由来のＰ６抗原又はリコンビナントＰ６抗原を抗原として得られたインフルエンザ菌のＰ６抗原認識ポリクローナル抗体であって、莢膜型のａ〜ｆ型及び無莢膜型インフルエンザ菌と反応し、パラインフルエンザ菌、緑膿菌及び大腸菌と反応しないポリクローナル抗体を用いることを特徴とする、全インフルエンザ菌のＥＬＩＳＡ又はイムノクロマトによる免疫学的測定方法。
前記ポリクローナル抗体が、莢膜型のａ〜ｆ型及び無莢膜型インフルエンザ菌と反応し、Haemophilus parainfluenzae、Staphylococcus aureus及びPseudomonas aeruginosaと反応しないポリクローナル抗体である請求項１記載の測定方法。
菌体由来のＰ６抗原又はリコンビナントＰ６抗原を抗原として得られたインフルエンザ菌のＰ６抗原認識ポリクローナル抗体であって、莢膜型のａ〜ｆ型及び無莢膜型インフルエンザ菌と反応し、パラインフルエンザ菌、緑膿菌及び大腸菌と反応しないポリクローナル抗体を含有することを特徴とする、全インフルエンザ菌のＥＬＩＳＡ又はイムノクロマトによる免疫学的測定装置。
前記ポリクローナル抗体が、莢膜型のａ〜ｆ型及び無莢膜型インフルエンザ菌と反応し、Haemophilus parainfluenzae、Staphylococcus aureus及びPseudomonas aeruginosaと反応しないポリクローナル抗体である請求項３記載の測定装置。