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JP5742900B2 - 糖尿病治療薬 - Google Patents

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Description

本発明は、血糖降下作用を有する化合物（以下、「血糖降下作用化合物」という）のスクリーニング法、新規な作用メカニズムを有する化合物を含有する糖尿病治療薬などに関する。より詳しくは、本発明は３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用物質のスクリーニング法、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合することを特徴とする血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬などに関する。
糖尿病はインスリンに対する末梢組織の抵抗性上昇、あるいはインスリン分泌量の減少に伴い、血中の糖濃度が上昇する病態である。糖尿病は、種々の重篤な合併症を引き起こすことから、薬剤による治療が必要な疾患である。糖尿病治療薬としては、スルフォニル尿素薬、フェニルアラニン誘導体、αグルコシダーゼ阻害薬、ビクアナイド薬、チアゾリジン誘導体、およびインスリン等が用いられている（非特許文献１：Sheehanら、Clinical Medicine & Research、1、189、(2003)）。
近年、脂肪細胞等の糖の取り込み作用を有する末梢細胞に対し、糖取り込み作用を亢進する化合物（以下、「糖取り込み亢進剤」と記す）が知られている（特許文献１：WO02/44180；特許文献２：WO2005/068467；特許文献３：WO2005/042536；特許文献4：WO2006/118341）。これらの化合物はインスリン非存在下においても脂肪細胞等の糖取り込み作用を亢進することが示されており、さらに糖尿病モデル動物での血糖降下作用が示されている。現在糖尿病治療薬として用いられているインスリンを除く上述した薬剤は、インスリン非存在下での脂肪細胞等の糖取り込みを示さないことから、特許文献１〜４に記載の「糖取り込み亢進剤」は、糖尿病治療薬として有用であると考えられる。しかしながら、これらの「糖取り込み亢進剤」の作用メカニズムに関しては不明であり、これまで報告されていなかった。
また、インスリンによる糖取り込み作用にはAktと呼ばれる蛋白質のリン酸化（Ser473）が必須であることが知られているが（非特許文献２：Hajduchら、FEBS Letters、492、199、(2001)）、上記「糖取り込み亢進剤」の作用とAktのリン酸化との関連性については不明であった。
WO02/44180 WO2005/068467 WO2005/042536 WO2006/118341 Sheehanら、ClinicalMedicine & Research、1、189、(2003) Hajduchら、FEBS Letters、492、199、(2001)
上記記載の「糖取り込み亢進剤」は、上述した通り、現在使用されている糖尿病治療薬とは異なり、インスリン同様に脂肪細胞等の糖取り込み作用を亢進し、有用かつ新しいタイプの糖尿病治療薬となりうると考えられるが、その作用メカニズムは不明であった。
このような状況下、本発明者らは、「糖取り込み亢進剤」の作用を引き起こす細胞内の結合蛋白質（以下「作用標的分子」と記す）、さらにはその作用が起こる分子機構（以下「作用メカニズム」と記す）を明らかにすることによって本発明を完成させた。すなわち、本発明は次のような血糖降下作用を有する化合物または糖尿病治療薬、そのような化合物または糖尿病治療薬のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法で用いることのできるプローブ化合物などを提供する。
（１）下記一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩（当該化合物）と３量体GTP結合蛋白質βサブユニット（当該蛋白質）とを用いて、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定することによって、血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法。
｛式中、Ａ及びＢは同一または異なってもよく、それぞれ独立して置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、
Ｒ1は、置換基を１〜３個有してもよい、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基を示し、
−Ｘ−及び−Ｙ−は同一または異なってもよく、それぞれ独立して水素原子、−Ｏ−、−ＮＲ2−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ3Ｒ4−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−または−ＣＯ−（式中Ｒ2は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示し、Ｒ3及びＲ4は同一または異なってもよく、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、またはトリフルオロメチル基を示す）を示し、
−Ｗ−は、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル鎖であり、その炭素原子の１〜１０個は−Ｏ−、−ＮＲ5−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、または−ＣＯ−で置き換えられていてもよく（式中Ｒ5は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、
Ｑは、水素原子、ビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、酵素、固相、ジアゾ基、またはアジド基を示す。また、式中１つ以上の原子が放射性同位元素であってもよい。但し、
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基（好ましくは、ハロゲン原子、水酸基、アミノ基、低級アルキルアミノ基、アリール基、ヘテロアリール基、低級アルキル基及び低級アルコキシ基）からなる群から選ばれ、また、これらの置換基はビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されてもよく、
ii) −Ｘ−が水素原子である場合は、−Ｗ−、−Ｙ―、または、Ｑをすべて有さず、
iii) −Y−が水素原子である場合は、Qを有さない。｝
（２）一般式（Ｉ）で表されるラクタム化合物のうち、−Ｘ−及び−Y−が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素であり、置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記（１）記載の方法。
（３）一般式（Ｉ）で表されるラクタム化合物のうち、−Ｘ−及び−Ｙ−が共に水素原子以外であり、Ｑが水素原子、ジアゾ基、またはアジド基であり、置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記（１）記載の方法。
（４）一般式（Ｉ）で表されるラクタム化合物のうち、Ｘが水素原子であり、少なくとも一般式（Ｉ）内の１つ以上の原子が放射線同位体である上記（１）記載の方法。
（５）（A）一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩（当該化合物）と３量体GTP結合蛋白質βサブユニット（当該蛋白質）とを接触させる工程、
（B）被検物質の存在下、当該化合物と当該蛋白質とを接触させる工程、および
（C）当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する工程、
を含む、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（５a）固相に固定化した当該蛋白質に、被検物質の存在下または非存在下に当該化合物を接触させ、固相に結合した当該化合物の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記（５）に記載の方法。
（５b）固相に固定化した当該化合物に、被検物質の存在下または非存在下に当該蛋白質を接触させ、固相に結合した当該蛋白質の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記（５）に記載の方法。
（５c）被検物質の存在下または非存在下に、当該化合物と当該蛋白質を接触させ、当該蛋白質と当該化合物の結合量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記（５）に記載の方法。
（５d）被検物質の存在下で接触させた場合の結合量と、被検物質の非存在下で接触させ
た場合の結合量とを比較することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検
物質の阻害活性を測定する、上記（５a）〜（５c）のいずれかに記載の方法。
（５e）さらに、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの存在下（あるいは３量体GTP結合蛋白質βサブユニットと結合した状態で）、被検物質のフォスフォイノシタイド３−キナーゼ（特に、サブタイプβ）に対する酵素活性亢進活性を測定する工程を含む、上記（５）に記載の方法。
（５f）さらに、被検物質のAktリン酸化活性を測定する工程を含む、上記（５）または（５e）に記載の方法。
（５g）さらに、被検物質の糖取り込み活性を測定する工程を含む、上記（５）、（５e）または（５f）に記載の方法。
（６）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを含む細胞、組織あるいはそれらの抽出物を用い、一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩（当該化合物）と３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの結合に対する被検物質の阻害活性を測定することにより、血糖降下作用化合物をスクリーニングする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（７）（A）３量体GTP結合蛋白質βサブユニット（当該蛋白質）を固相に固定する工程、
（B）被検物質を当該蛋白質に接触させる工程、および
（C）一般式（I）で示された化合物またはその製薬学的に許容される塩（当該化合物）、酸、塩基または変性剤を含有する溶液を用いて、工程（Ｂ）において当該蛋白質に結合した化合物を溶出する工程、
を含む血糖降下作用化合物を同定する方法。
（８）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
（８a）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物を哺乳動物に有効量投与することを含む、糖尿病の治療方法。
（８b）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物の糖尿病治療のための使用。
（８c）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する血糖降下作用化合物の、糖尿病治療薬の製造のための使用。
（９）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
（９a）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物を哺乳動物に有効量投与することを含む、糖尿病の治療薬方法。
（９b）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物の糖尿病治療のための使用。
（９c）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物の、糖尿病治療薬の製造のための使用。
（１０）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式（I）で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物を有効成分とする糖尿病治療薬。
（１０a）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式（I）で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物を哺乳動物に有効量投与することを含む、糖尿病の治療方法。
（１０ｂ）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式（I）で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物の糖尿病治療のための使用。
（１０ｃ）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式（I）で示された化合物の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物の、糖尿病治療薬の製造のための使用。
（１０ｄ）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式（I）で示された化合物と競合的に結合する化合物を有効成分とする糖尿病治療剤。
（１１）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検出することを特徴とする血糖降下作用化合物のスクリーニング方法。
（１２）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼの結合を亢進する化合物を検出することを特徴とする血糖降下作用化合物のスクリーニング方法。
（１３）フォスフォイノシタイド３−キナーゼのサブタイプがβであることを特徴とする上記（１１）又は（１２）に記載のスクリーニング方法。
（１４）一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩。
｛式中、Ａ及びＢは同一または異なってもよく、それぞれ独立して置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｒ1は、置換基を１〜３個有してもよい、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基を示し、−Ｘ−及び−Ｙ−は同一または異なってもよく、それぞれ独立して水素原子、−Ｏ−、−ＮＲ2−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ3Ｒ4−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−または−ＣＯ−（式中Ｒ2は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示し、Ｒ3及びＲ4は同一または異なってもよく、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、またはトリフルオロメチル基を示す）を示し、−Ｗ−は、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル鎖であり、その炭素原子の１〜１０個は−Ｏ−、−ＮＲ5−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、または−ＣＯ−で置き換えられていてもよく（式中Ｒ5は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、Ｑは、水素原子、ビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、酵素、固相、ジアゾ基、またはアジド基を示す。また、式中１つ以上の原子が放射性同位元素であってもよい。但し、
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基からなる群から選ばれ、また、これらの置換基はビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されてもよく、
ii) −Ｘ−が水素原子である場合は、−Ｗ−、−Ｙ―、または、Ｑをすべて有さず、
iii) −Y−が水素原子である場合は、Qを有さない。
さらに、一般式（Ｉ）中、以下a)からf)のいずれかの条件が満たされる。
a) Ｘ-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である；
b) -Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑがジアゾ基、またはアジド基である；
c) -Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑが固相である；
d) １つ以上の原子が放射線同位体である；
e) 少なくとも１つ以上の、ビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識された置換基を有する；または
f) 置換基として少なくとも１つ以上のジアゾ基あるいはアジド基を有する。｝
（１５）Ｘ-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である、上記（１４）に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（１６）置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記（１５）記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（１７）-Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑがジアゾ基、またはアジド基である、上記（１４）に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（１８）置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記（１７）記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（１９）-Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑが固相である、上記（１４）記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（２０）一般式（Ｉ）内の１つ以上の原子が放射線同位体である、上記（１４）に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（２１）Ｘが水素原子である、上記（２０）記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（２２）少なくとも１つ以上の、ビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識された置換基を有する、上記（１４）に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（２３）置換基として少なくとも１つ以上のジアゾ基あるいはアジド基を有する、上記（１４）記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
（２４）下記一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩。
｛式中、Ａ及びＢは同一または異なってもよく、それぞれ独立して置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｒ1は、置換基を１〜３個有してもよい、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基を示し、-Ｘ-及び-Ｙ-は同一または異なってもよく、それぞれ独立して-Ｏ-、-ＮＲ2-、-Ｓ-、-ＳＯ-、-ＳＯ2-、-ＣＨ2-、-ＣＲ3Ｒ4-、-ＣＯＯ-、-ＣＯＮＲ2-または-ＣＯ-（式中Ｒ2は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示し、Ｒ3及びＲ4は同一または異なってもよく、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、またはトリフルオロメチル基を示す）を示し、-Ｗ-は、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル鎖であり、その炭素原子の１〜１０個は-Ｏ-、-ＮＲ5-、-Ｓ-、-ＳＯ-、-ＳＯ2-、または-ＣＯ-で置き換えられていてもよく（式中Ｒ5は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、Ｑは水素原子を示す。
但し、
i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基からなる群から選ばれる。｝
本発明によれば、血糖降下作用を有する化合物または糖尿病治療薬、そのような化合物または糖尿病治療薬のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法で用いることのできるプローブ化合物などを提供することができる。
実施例１３におけるAktリン酸化活性の測定結果を示す図である。 実施例１４におけるHLF細胞膜を用いた3H標識化合物１の結合アッセイの結果を示す図である。 実施例１５（１）におけるDigitoninによるHLF細胞膜からの結合蛋白質の抽出結果を示す図である。 実施例１５（２）における、プローブ分子の結合蛋白質に対する結合能の測定を示す図である。 実施例１５（３）における、アフィニティーカラムを用いた結合蛋白質の取得を示す図である。 実施例１６における、アフィニティーカラムからの溶出化合物による活性依存的なGβの溶出を示す図である。 Gβ1γ2を発現させたHEK293T細胞抽出液中の結合蛋白質の存在を示す図である。 昆虫細胞発現Gβに対する化合物のGβ結合能評価を示す図である。 各サブタイプGβγ2-Mycに対する3H標識化合物１の結合活性を示す図である。 Gβγ2-Myc結合スクリーニング系を用いた、化合物のGβ結合能評価を示す図である。 Gβγ2-Myc結合スクリーニング系の性能評価を示す図である。 フォスフォイノシタイド3-キナーゼ（PI3-kinase）βおよびδ特異的阻害剤（TGX-115）による化合物６惹起Aktリン酸化阻害（分化3T3-L1脂肪細胞）を示す図である。 Gβ1γ2-Myc存在下における各サブタイプ（α、β、γ、δ）フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）活性に対するN-deacetylcolchicine(DAC)および化合物１の作用を示す図である。 PI3-kinaseβに対する化合物１および化合物６の活性亢進作用を示す図である。 化合物１、化合物６によるGβ1γ2-Mycとフォスフォイノシタイド3-キナーゼ（PI3-kinase）βとの結合亢進作用を示す図である。 GβのsiRNAによるノックダウン（図右）とノックダウンした細胞を用いた化合物６によるAktリン酸化（図左）の結果を示す図である。 実施例２７記載のスクリーニング方法における、化合物１、化合物６によるPI3-kinaseβに対する活性亢進作用を示す図である。
本明細書において、「低級」とは、例えば、炭素数１〜６個を有することをいう。また、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アルコキシ基またはアシル基中の炭素数は、好ましくは６個まで、より好ましくは３個までである。
また、「芳香環」とは、炭素原子で構成される単環または２つの環からなる芳香環を表し、具体的に例えばベンゼン環、ナフタレン環、インデン環、フルオレン環などがあげられ、好ましくはベンゼン環、ナフタレン環などがあげられる。
また、「複素環」とは、炭素および窒素、酸素、イオウなどで構成される４〜９員の１〜３つの環からなる複素環を表し、具体的に例えば、ピリジン環、ジヒドロピラン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、ピラゾール環、イミダゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、チアジアゾール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、インドール環、イソインドール環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、ベンゾピラゾール環、ベンゾイミダゾール環、ベンゾオキサゾール環、ベンゾチアゾール環、プリン環、ピラゾロピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、ベンゾジアゼピン環、カルバゾール環、ジベンゾフラン環、などがあげられ、好ましくはピリジン環、フラン環、チオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環などがあげられ、より好ましくはチオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環などがあげられる。
また、「脂肪族環」とは、炭素原子で構成される単環または２つの環からなる脂肪族環を表し、具体的に例えばシクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、シクロオクタン環、デカリン環、ノルボルナン環などがあげられ、好ましくはシクロヘキサン環があげられる。
低級アルキル基とは、炭素数１〜６、好ましくは１〜３の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を示し、具体的に例えばメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｎ-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ-ペンチル基、ネオペンチル基、２-ペンチル基、３-ペンチル基、３-ヘキシル基、２-ヘキシル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基などがあげられ、好ましくはメチル基、エチル基などがあげられる。
低級アルコキシ基とは、低級アルキル基を有するアルコキシ基を示す。
アリール基とは、炭素原子で構成される炭素数５〜１２の単環または２環よりなる芳香族置換基を示し、具体的に例えばフェニル基、インデニル基、ナフチル基、フルオレニル基などがあげられ、好ましくはフェニル基があげられる。
ハロゲン原子とは、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子があげられる。
アルキル基とは、炭素数１〜１８の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を示し、具体的に例えばメチル基、エチル基、ｎ-プロピル基、ｎ-ブチル基、ｎ-ペンチル基、ｎ-ヘキシル基、ｎ-へプチル基、ｎ-オクチル基、ｎ-ノニル基、ｎ-デシル基、ｎ-ウンデシル基、ｎ-ドデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ-ペンチル基、ネオペンチル基、２-ペンチル基、３-ペンチル基、３-ヘキシル基、２-ヘキシル基、ｔｅｒｔ-オクチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、１−アダマンチル基、などがあげられ、好ましくはｎ-ヘキシル基、ｎ-へプチル基、ｎ-オクチル基、ｎ-ノニル基、ｎ-デシル基、ｎ-ウンデシル基、ｎ-ドデシル基、イソプロピル基、イソブチル基、ｓｅｃ-ブチル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、イソペンチル基、ｔｅｒｔ-ペンチル基、ネオペンチル基、２-ペンチル基、３-ペンチル基、３-ヘキシル基、２-ヘキシル基、ｔｅｒｔ-オクチル基、シクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、１−アダマンチル基などがあげられ、より好ましくは、イソプロピル基、ｔｅｒｔ-ブチル基、ｔｅｒｔ-オクチル基、１−アダマンチル基などがあげられる。
アルケニル基とは、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルケニル基を示し、具体的に例えばビニル基、１-プロペニル基、２-プロペニル基、イソプロペニル基、１-ブテニル基、２-ブテニル基、３-ブテニル基などがあげられる。アルキニル基とは、炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖状のアルキニル基を示し、具体的に例えばエチニル基、１-プロピニル基、2-プロピニル基、1-ブチニル基、２-ブチニル基、３-ブチニル基などがあげられる。
アルコキシ基とは、炭素数１〜１８、好ましくは１〜８の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有するアルコキシ基を示し、具体的に例えばメトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、ｎ-ブトキシ基、ｎ-ペンチルオキシ基、ｎ-ヘキシルオキシ基、ｎ-へプチルオキシ基、ｎ-オクチルオキシ基、ｎ-ノニルオキシ基、ｎ-デシルオキシ基、ｎ-ウンデシルオキシ基、ｎ-ドデシルオキシ基、イソプロポキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ-ブトキシ基、ｔｅｒｔ-ブトキシ基、シクロプロピルオキシ基、シクロブトキシ基、シクロペンチルオキシ基、シクロヘキシルオキシ基、シクロヘプチルオキシ基、２−シクロヘキシルエトキシ基、１−アダマンチルオキシ基、２−アダマンチルオキシ基、１−アダマンチルメチルオキシ基、２−（１−アダマンチル）エチルオキシ基、トリフルオロメトキシ基などがあげられ、好ましくはメトキシ基、エトキシ基、ｎ-プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ-ブトキシ基、ｔｅｒｔ-ブトキシ基、ｎ-ペンチルオキシ基、ｎ-ヘキシルオキシ基があげられる。
アルキルチオ基とは、炭素数１〜１２、好ましくは１〜６の直鎖または分岐鎖状または環状のアルキル基を有するアルキルチオ基を示し、具体的に例えばメチルチオ基、エチルチオ基、ｎ-プロピルチオ基、イソプロピルチオ基、ｎ-ブチルチオ基、イソブチルチオ基、ｓｅｃ-ブチルチオ基、ｔｅｒｔ-ブチルチオ基、シクロプロピルチオ基、シクロブチルチオ基、シクロペンチルチオ基、シクロブチルチオ基などがあげられる。
アルキルスルホニル基とは、炭素数１〜１２の直鎖または分岐鎖状または環状のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を示し、具体的に例えばメタンスルホニル基、エタンスルホニル基、プロパンスルホニル基、ブタンスルホニル基、ペンタンスルホニル基、ヘキサンスルホニル基、ヘプタンスルホニル基、オクタンスルホニル基、ノナンスルホニル基、デカンスルホニル基、ウンデカンスルホニル基、ドデカンスルホニル基などがあげられる。
アシル基とは、ホルミル基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を有するアシル基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルケニル基を有するアシル基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキニル基を有するアシル基、または置換されていてもよいアリール基を有するアシル基であり、具体的に例えばホルミル基、アセチル基、プロピオニル基、ブチリル基、イソブチリル基、バレリル基、イソバレリル基、ピバロイル基、ヘキサノイル基、アクリロイル基、メタクリロイル基、クロトノイル基、イソクロトノイル基、ベンゾイル基、ナフトイル基などがあげられる。
アシルオキシ基とは、ホルミルオキシ基、または炭素数１〜６の直鎖もしくは分岐鎖もしくは環状のアルキル基を有するアシルオキシ基、または置換されていてもよいアリール基を有するアシルオキシ基を示し、具体的に例えばホルミルオキシ基、アセチルオキシ基、プロピオニルオキシ基、ブチリルオキシ基、イソブチリルオキシ基、バレリルオキシ基、イソバレリルオキシ基、ピバロイルオキシ基、ヘキサノイルオキシ基、アクリロイルオキシ基、メタクリロイルオキシ基、クロトノイルオキシ基、イソクロトノイルオキシ基、ベンゾイルオキシ基、ナフトイルオキシ基などがあげられる。
アルキルアミノ基とは、アルキル基で一置換もしくは二置換されたアミノ基であり、そのアルキル基の例は前記「アルキル基」で示したものがあげられる。具体的に例えば、アミノ基、メチルアミノ基、エチルアミノ基、プロピルアミノ基、イソプロピルアミノ基、ジメチルアミノ基、ジエチルアミノ基、ジプロピルアミノ基、ジイソプロピルアミノ基、メチルエチルアミノ基などがあげられる。好ましくは炭素数１〜６である。
アルコキシカルボニル基とは、炭素数１〜８の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有するアルコキシカルボニル基を示し、具体的に例えばメトキシカルボニル基、エトキシカルボニル基、プロポキシカルボニル基、イソプロポキシカルボニル基、ｎ-ブトキシカルボニル基、イソブトキシカルボニル基、ｓｅｃ-ブトキシカルボニル基、ｔｅｒｔ-ブトキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基などがあげられる。
カルバモイル基とは、窒素上に炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有してもよいカルバモイル基であり、具体的に例えばカルバモイル基、Ｎ−メチルカルバモイル基、Ｎ−エチルカルバモイル基、Ｎ，Ｎ−ジメチルカルバモイル基、Ｎ−ピロリジルカルボニル基、Ｎ−ピペリジルカルボニル基、Ｎ−モルホリニルカルボニル基などがあげられる。
スルホニル基とは、硫黄原子上に炭素数１〜６の直鎖または分岐鎖または環状のアルキル基を有してもよいスルホニル基であり、具体的に例えばメチルスルホニル基、エチルスルホニル基、プロピルスルホニル基、ブチルスルホニル基、などがあげられる。
また、固相とは、化合物や蛋白質を固定化できる固体、半固体、固溶体であり、具体的には例えば、容器（チューブ、ウェル、プレート）、担体（レジン、ゲル）、シート状、粉末状あるいは棒状の樹脂、ポリマーなどが挙げられるが、化合物や蛋白質を固定化できる器質であればこれらの例には限定されない。
より具体的には、式（Ｉ）において、「Ａ」は、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、インデン環、フルオレン環、ピリジン環、ジヒドロピラン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、ピラゾール環、イミダゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、チアジアゾール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、インドール環、イソインドール環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、ベンゾピラゾール環、ベンゾイミダゾール環、ベンゾオキサゾール環、ベンゾチアゾール環、プリン環、ピラゾロピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、ベンゾジアゼピン環、カルバゾール環、ジベンゾフラン環、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、シクロオクタン環、デカリン環、ノルボルナン環などから選択され、好ましくはベンゼン環、ピリジン環、フラン環、チオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環、キノリン環、ベンゾチアゾール環、ベンゾオキサゾール環などから選択され、より好ましくは、ベンゼン環、チオフェン環、ベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、インドール環、キノリン環などから選択される。
式（Ｉ）において、「Ｂ」は、好ましくは、ベンゼン環、ナフタレン環、インデン環、フルオレン環、ピリジン環、ジヒドロピラン環、ピリダジン環、ピリミジン環、ピラジン環、ピロール環、フラン環、チオフェン環、オキサゾール環、イソオキサゾール環、ピラゾール環、イミダゾール環、チアゾール環、イソチアゾール環、チアジアゾール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ピペラジン環、インドール環、イソインドール環、ベンゾフラン環、イソベンゾフラン環、ベンゾチオフェン環、ベンゾピラゾール環、ベンゾイミダゾール環、ベンゾオキサゾール環、ベンゾチアゾール環、プリン環、ピラゾロピリジン環、キノリン環、イソキノリン環、ナフチリジン環、キナゾリン環、ベンゾジアゼピン環、カルバゾール環、ジベンゾフラン環、シクロプロパン環、シクロブタン環、シクロペンタン環、シクロヘキサン環、シクロヘプタン環、シクロオクタン環、デカリン環、ノルボルナン環などから選択され、より好ましくはベンゼン環、シクロヘキサン環などから選択される。
式（Ｉ）において、「Ｒ1」は、好ましくは、水酸基、アリール基（芳香環基）、ヘテロアリール基（複素環基）、シクロアルキル基、アルコキシ基、ハロゲン原子で置換されている低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基などから選択され、より好ましくは、アリールC1-2アルキルまたはヘロアリールC1-2アルキル（例えば、ピリジルメチル、チアゾリルメチル）、ヒドロキシメチル基、メトキシメチル基などから選択される。
式（Ｉ）において、好ましい-Ｘ-Ｗ-Ｙ-は、−Ｏ-(ＣＨ2)1-2-Ｏ-(ＣＨ2)1-2-ＮＨ−、−Ｏ-(ＣＨ2)1-2-Ｏ-(ＣＨ2)1-2-ＮＨＣＯ（ＣＨ２）4-6-ＮＨ−などである。
なお、式（Ｉ）で示される化合物またはその類似化合物の製造方法は、例えば、特許文献１〜４に記載されており、式（Ｉ）で示される化合物は、これらの文献の記載および当業者の技術常識に基づいて容易に製造することができる。
本明細書中、「プローブ化合物」または「プローブ分子」とは、「糖取り込み亢進剤」の「作用標的分子」、「作用メカニズム」の解明に有用な低分子化合物を表し、または／および「糖取り込み亢進剤」、「血糖降下作用化合物」をスクリーニングする方法に利用可能な低分子化合物を表す。
「糖取り込み亢進剤」とは、生理的に糖（グルコースおよびそのアナログ等）を細胞内に取り込む細胞、組織に添加することにより、糖取り込み能を上昇させる薬剤、化合物を表し、例えば、具体的には特許文献１〜４に記載の化合物のうち、細胞に対して実質的に糖の取り込み促進活性を示す化合物のことを表し、たとえば一般式（I）（Xが水素原子）で示される化合物を表す。
「作用標的分子」とは、「糖取り込み亢進剤」が直接あるいは間接的に結合する、細胞に発現している蛋白質を表し、特に糖取り込み活性あるいはAktリン酸化のために必要な蛋白質を表す。
「作用メカニズム」とは、「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子に対する結合以降に生じる反応、例えば２分子以上の蛋白質間の結合亢進／低下、酵素活性の亢進／低下、蛋白質のリン酸化量の変化等のことを表し、特に糖取り込み活性あるいはAktリン酸化のために必要な変化を表す。
「血糖降下作用化合物」とは、生体に投与した際に血糖値を実質的に降下させる化合物を表し、糖尿病治療薬として使用可能である。
〔１〕本発明の概要
（「糖取り込み亢進剤」の作用指標の検出）
上記の背景に基づき、本発明者らはまず特許文献１〜４（「糖取り込み亢進剤」に関する特許）に記載の一般式（I）（Xが水素原子）の構造を有するいくつかの化合物あるいはその構造をもとに鋭意検討を行い構造展開した化合物を合成し、インスリンの糖取り込み作用時に起きることが知られているAktのリン酸化と（非特許文献２）、糖取り込み活性の強さを測定、比較した。その結果、測定した化合物のAktリン酸化の強さと糖取り込み活性の強さは良い相関を示すことから、「糖取り込み亢進剤」の糖取り込み作用時においても、Aktリン酸化が起きることが示された。
（プローブ化合物）
さらに本発明者らは、特許文献１〜４に記載の化合物をもとに、作用標的分子、作用メカニズムを解明するために使用する化合物（以下「プローブ化合物」と記す）の設計を行った。「プローブ化合物」は、特許文献１〜４に記載の「糖取り込み亢進剤」の活性に必要と思われる母核を持ち、リンカー構造を介して、固相（容器、担体など）に固定可能な残基あるいは結合の検出に有用な残基を結合させた化合物、あるいは検出を可能にするためにラジオアイソトープで原子を置換した化合物を設計、合成を行い、種々の有用な化合物を得た。
このようなプローブ化合物は、後述した通り、「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子、作用メカニズムを解明するために有用である。さらに、これらのプローブ化合物は新たな「糖取り込み亢進剤」を得るためのスクリーニングに用いることが可能であり、有用である。
「プローブ化合物」の設計として、リンカー構造を介して、担体、容器などの固相に固定し検出する方法や結合の検出に有用な残基を持ち検出する方法が一般的に知られている。しかしながら、リンカー部分の結合位置によっては「プローブ化合物」の母核となる化合物本来の活性を失うことが一般的に知られている。本発明者らは、固相（容器、担体など）に固定可能な残基あるいは検出に有用な残基を有し、かつ化合物本来が有する「糖取り込み亢進剤」の活性を失活することのない化合物を設計、合成することを可能にし、「プローブ化合物」を見出すに至った。
（作用標的分子）
本発明者らはさらに、特許文献１〜４に記載の「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子を同定するため、さらに研究を行い、上述した「プローブ化合物」を用いて、それらが結合する細胞内の蛋白質の探索を進めた。まず、「プローブ化合物」の一例として、特許文献３に記載の、強い糖取り込み活性を有する化合物１（後述の実施例１の化合物）に対し、トリチウム原子を含むラジオアイソトープ標識体を合成し、「糖取り込み亢進剤」が作用する培養動物細胞の細胞膜に対する結合能を測定した。「糖取り込み亢進剤」の培養動物細胞への作用は、具体的にはヒト肝臓由来のHLF細胞を用い、作用の指標としてAktのリン酸化作用を測定した。化合物１のAktリン酸化作用とラジオアイソトープ標識体の結合活性はほぼ同程度の濃度において飽和的に見られたことから、ラジオアイソトープ標識体が結合した蛋白質は、「糖取り込み亢進剤」の糖取り込み、Aktリン酸化が生じるための作用標的分子の１つであることが非常に強く示唆された。
この結合蛋白質（「作用標的分子」）の種類を同定するために、鋭意研究を行った。その結果、HLF細胞の細胞膜から界面活性剤を用いて細胞膜上の蛋白質を可溶化したところ、本発明者らは、可溶化した蛋白質中にラジオアイソトープ標識体が高い親和性で結合する蛋白質が存在することを見出した。さらに、作用標的分子に対する結合能を有する低分子プローブのうち、担体に結合可能な、リンカー構造の末端にアミノ基を有する化合物２（後述の実施例２の化合物）を選択し、本化合物を結合した担体を用いたアフィニティークロマトグラフィーを行い、上記化合物１と同等に強い糖取り込み活性、Aktリン酸化活性を有する化合物４によって溶出を行ったところ、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動において35-36KDa付近に泳動される蛋白質を見出し、分子量および抗体の反応性、その部分アミノ酸配列情報より、本蛋白質が３量体GTP結合蛋白質βサブユニットであることを突き止めた。３量体GTP結合蛋白質βサブユニットは細胞内においては他のサブユニットであるα、γサブユニットと結合した３量体構造として存在し、またある状況下ではγサブユニットとの２量体として存在する（非特許文献３：Wettschureckら、Physiological Reviews、85、1159、(2005)）。すなわち、「糖取り込み亢進剤」は３量体GTP結合蛋白質βサブユニット、あるいはβサブユニットを含む３量体、あるいは２量体と結合し、これらの複合体を含め「糖取り込み亢進剤」の作用標的分子が３量体GTP結合蛋白質βサブユニットであることを見出した。
本発明者らはさらに、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを、あるいはγサブニット、あるいはα、γ両サブユニットとともに動物細胞、昆虫細胞に発現させ、その抽出物、あるいは精製した蛋白質に対して、化合物１のラジオアイソトープ標識体が結合することを見出した。さらに本発明者らは鋭意検討を重ねた結果、抽出あるいは精製した当該蛋白質と「プローブ化合物」との結合に対する影響、阻害活性を測定することにより、新たな「糖取り込み亢進剤」をスクリーニング、あるいは製造できることを見出し本発明を完成させるに至ったのである。
本発明者らはさらに上記方法を用いて検出することが可能であった、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物が、その結合活性の強さに非常に良く相関して、細胞に対してAktリン酸化作用、糖取り込み作用を引き起こすことを見出した。このように、上記方法を用いて検出することが可能である、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物が糖取り込み亢進作用を示すことは、これまでに知られていない全く新しい知見であり、本発明は３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合することを特徴とする血糖降下剤、すなわち糖尿病治療薬を提供するものである。
〔２〕本発明に係る作用メカニズム
本発明者らは上記知見をもとに、さらに「糖取り込み亢進剤」の作用メカニズムの解明を行った。その結果、まず、阻害剤を用いた種々の検討によるデータから、「糖取り込み亢進剤」の作用メカニズムにフォスフォイノシタイド３−キナーゼのうちβあるいはδサブタイプが関与する知見を得た。フォスフォイノシタイド３−キナーゼβは３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、その酵素作用が亢進することが報告されていることから（非特許文献４：Maierら、Journal of Biological Chemistry、274、29311、(1999)）、本発明者らは、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する「糖取り込み亢進剤」が、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを介してフォスフォイノシタイド３−キナーゼβの活性を亢進する可能性を見出した。
３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物はこれまでいくつか報告されている。例えばScottらは、Ser-Ile-Arg-Lysという配列を含む、あるいはそれに類似するペプチドについて報告しており（非特許文献５：Scottら、The EMBO Journal、20、767、(2001)）、またBonacciらは上記結合ペプチド、およびその結合構造をもとにデザインしたファルマコフォアーをもとに新たな３量体GTP結合蛋白質βサブユニット結合化合物を見出したことを報告している（非特許文献６：Bonacciら、Science、312、443、(2006)）。Bonacciらは３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する複数の化合物が、異なる生理作用を示すことを報告しており、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットへの結合の仕方によって、異なる生理作用を示すことを報告している。このことは、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物は、その結合位置、およびその後に生じる生理作用の違いによって、様々な生理活性を示しうること、その生理作用は鋭意検討を行った結果によってのみ見いだしうることを明らかにしている。本発明者らは、上記「糖取り込み亢進剤」について鋭意検討を行い、また３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合することが報告されている（非特許文献６）化合物M201（以下N-deacetylcolchicine）についての生理活性を比較したところ、下記の知見を得た。
i)「糖取り込み亢進剤」は糖取り込み活性を示すがN-deacetylcolchicineは示さない。
ii)「糖取り込み亢進剤」はAktのリン酸化を示すがN-deacetylcolchicineは示さない。
iii)「糖取り込み亢進剤」とN-deacetylcolchicineの３量体GTP結合蛋白質βサブユニット結合に対する結合は互いに競合しない。
iv)「糖取り込み亢進剤」はフォスフォイノシタイド３−キナーゼβの活性の亢進作用を３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下で示すのに対し、N-deacetylcolchicineはフォスフォイノシタイド３−キナーゼγの活性の亢進作用を３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下で示すことが報告されている。（しかしながら、本発明で実施した限りでは、報告されているような亢進作用は見られなかった。）
上記の知見より、本発明者らは、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する「糖取り込み亢進剤」が、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを介したフォスフォイノシタイド３−キナーゼβの活性亢進作用を示すという結論に達した。
フォスフォイノシタイド３−キナーゼβはインスリンによる糖取り込み作用に関与することが報告されており（非特許文献７：Asanoら、Journal of Biological Chemistry、275、17671、(2000)）、フォスフォイノシタイド３−キナーゼβによって生成された細胞膜上のファスファチジルイノシトール-[3,4,5]-３リン酸（以下PtdIns[3,4,5]P3）に対するAktの結合、さらにSer473位のリン酸化によってAktの活性化が生じることは広く知られているシグナル伝達経路であり、Aktリン酸化は糖取り込みの上流のシグナルと広く認知されている（非特許文献２）。また、前述したようにフォスフォイノシタイド３−キナーゼβは３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、その酵素作用が亢進することが報告されている（非特許文献４：Maierら、Journal of Biological Chemistry、274、29311、(1999)）。すなわち、本発明者らは上記発明の結果、および上記一般的な情報を総合的に勘案し、「糖取り込み亢進剤」の糖取り込み作用メカニズムの１つが、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することであることを見出し、本発明を完成させるに至った。３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼとの協奏作用の測定法は、すでに多くの報告によって一般的に知られており（非特許文献４、非特許文献１０：Kerchnerら、Journal of Biological Chemistry、279、44554、(2004)）、本発明は、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進する化合物が「糖取り込み亢進剤」としての作用をなし得るという結果を得たことにより、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼの結合を亢進する化合物を検出することを特徴とする糖尿病治療化合物のスクリーニングが可能であることを開示するものである。
３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進する化合物が糖取り込み亢進作用を示すことは、これまでに知られていない全く新しい知見であり、さらにこのような活性を示す化合物はこれまでには知られていない。本発明は３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することを特徴とする血糖降下剤、すなわち糖尿病治療薬を提供するものである。
以下、本発明のプローブ化合物、治療剤、スクリーニング方法などについて詳細に説明する。
〔３〕本発明のプローブ化合物
本発明のプローブ化合物は、上記一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩である。一般式（Ｉ）で表されるラクタム化合物のうち、−Ｘ−及び−Y−が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素であり、置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記（１４）記載のラクタム化合物またはその製薬学的に許容される塩がより好ましい。その中でも、Qはビオチンが好ましい。
また、一般式（Ｉ）で表されるラクタム化合物のうち、−Ｘ−及び−Ｙ−が共に水素原子以外であり、Ｑが水素原子、またはジアゾ基、アジド基であり、置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、上記（１４）記載のラクタム化合物またはその製薬学的に許容される塩がさらに好ましい。その中でも、Yは、−NH−、Qは水素原子が好ましい。
また、一般式（Ｉ）で表されるラクタム化合物のうち、Ｘが水素原子であり、少なくとも一般式（Ｉ）内の１つ以上の原子が放射線同位体である上記（１４）記載のラクタム化合物またはその製薬学的に許容される塩が特に好ましい。その中でも、R1が置換基を有してもよい低級アルキル基を有し、そのうちの1つ以上の原子が放射性同位体であることが好ましい。
これらの化合物は、例えば、特許文献１〜４に記載の公知の調製方法に従い合成することが可能である。放射性標識は、例えば3H、14C、125I、32P、33P、35S等のラジオアイソトープを分子内に有する化合物を表し、これらラジオアイソトープを含む化合物を原料として用いることで調製することが可能であり、一つの例としてはNaBH4の代わりにNaB3H4を用いて化合物の還元反応を行うことによって調製可能である。また、発蛍光団標識は、例えばフルオロセイン、クマリン、ローダミン、テキサスレッド、Cy3、Cy5、Alaxa化合物等、例えばHandbook of Fluorescent Probes and Research Products, Ninth Edition（Richard P. Haugland著, Molecular Probes社版）に記載の蛍光を有する化合物を、目的の化合物の原料となる化合物のアミノ基、カルボキシル基、水酸基、チオール基等に反応させ結合することにより調製可能である。発色団標識は、例えばニトロベンゼン、ニトロアニリン、アミノピリジン等の置換芳香環、置換複素芳香環を有する残基、あるいはピレン、アクリジン等の高度に共役した芳香環、複素芳香環を有する残基等、好ましくは230nm以上の高波長の極大値におけるモル吸光係数（log10ε）が3.5以上、より好ましくは4.0以上である残基を含む吸光性の高い化合物、あるいは色素化合物を、化学発光標識は、例えばルシフェリン等の酵素存在下で発光反応を示す化合物あるいはルミノールなどの金属イオン存在下で発光反応を示す化合物等、酵素標識は、例えばアルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ等の酵素を、上記発蛍光団標識と同様の方法、あるいはクロスリンカー化合物を用いて分子間に架橋を行うことによって調製可能である。
上記（１４）〜（２３）記載の化合物は、「糖取り込み亢進剤」の「作用標的分子」の解析、「作用メカニズム」の解明のための「プローブ分子」として有用である。また、これらの化合物は、上記（１）〜（７）に記載した「血糖降下作用化合物」を取得する方法・スクリーニング方法に利用可能である。なお、上記（２４）に記載の化合物は、上記（１４）〜（２３）に記載の化合物の中間体として有用である。上記（１４）〜（２４）に記載の化合物は、特許文献１〜4の記載および当業者の技術常識（例えば、公知の有機合成法）に基づいて容易に製造することができる。
〔４〕本発明のスクリーニング方法
次に、本発明は、（１）上記一般式（I）で示される化合物（当該化合物）及び３量体GTP結合蛋白質βサブユニット（当該蛋白質）を用いて、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定することによって、血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
さらに、本発明は、（５）
（A）上記一般式（I）で示される化合物（当該化合物）と３量体GTP結合蛋白質βサブユニット（当該蛋白質）とを接触させる工程、
（B）被検物質の存在下、当該化合物と当該蛋白質とを接触させる工程、および
（C）当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する工程、
を含む血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
ここで、「３量体GTP結合蛋白質βサブユニット」とは、単量体でも良く、γサブユニットとの２量体でも良く、またα、γ両サブユニットとの３量体でも実質的にβサブユニットを有していれば良い。３量体GTP結合蛋白質βサブユニットはいかなる生物由来のものでも良く、例えばヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウサギ由来のものなどが挙げられる。また、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットは自然界に存在する細胞、組織から抽出したものでも良いが、遺伝子工学的手法を用いて細胞、組織に発現させたものを抽出して用いても良く、さらに未精製のものを用いても良いが、精製したものでも良い。３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの精製法は、自然界に存在する３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの精製法の一例としては、Sternweisら（非特許文献８：Sternweisら、Journal of Biological Chemistry、259、13806、(1984)）の報告した方法等が挙げられる。遺伝子工学的に作成した３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの精製法の一例としては、Kozasaら（非特許文献９：Kozasaら、Journal of Biological Chemistry、270、1734、(1995)）の報告した方法等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
さらに、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットは１〜５のサブタイプが存在するが、いずれのサブタイプでも構わない。自然界に存在する３量体GTP結合蛋白質βサブユニットは、それぞれの種に対して報告されているアミノ酸配列のものを用いることが出来るが、アミノ酸の変異が起こっているものでも、実質的な活性を保っているものであれば構わない。アミノ酸配列の一例としては、配列番号：１６、２０、２４、２８または３２に記載のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない。例えば、配列番号：１６、２０、２４、２８または３２に記載のアミノ酸配列に対して、例えば、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上の同一性を有するアミノ酸配列を有する蛋白質、配列番号：１６、２０、２４、２８または３２に記載のアミノ酸配列において、１〜数個（例えば、６個）のアミノ酸が欠失・置換・付加したアミノ酸配列を有する蛋白質なども本発明において使用可能である。
遺伝子工学的手法を用いて取得した３量体GTP結合蛋白質βサブユニットは、それぞれ報告されているアミノ酸配列のものをそのまま使用することも出来るが、遺伝子変異により適宜アミノ酸配列の変異を行ったものであっても、実質の活性を保っているものであれば使用可能である。さらに、３量体GTP結合蛋白質α、β、γのサブユニットのうちいずれかあるいは複数のサブユニットのアミノ末端、カルボキシ末端あるいはアミノ酸配列の途中部分に、検出あるいは精製を容易にするためのアミノ酸配列、具体例としてヒスチジン残基あるいはその連続配列（poly-His）、c-Myc部分ペプチド（Myc-tag）、hemagglutinin部分ペプチド（HA-tag）、Flag部分ペプチド（Flag-tag）、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）、マルトース結合蛋白質（MBP）等の配列を有するアミノ酸配列を挿入したものでも構わない。
また、遺伝子工学的手法を用いて３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを得る際には、動物細胞、昆虫細胞、大腸菌等の細菌等の細胞を用い、適切なプロモーターを有するベクターに当該遺伝子を導入し、細胞に導入、培養を行うことにより得ることが可能である。あるいは、大腸菌抽出物、小麦胚芽抽出物などを用いた無細胞系の蛋白質発現系を用いることも可能である。さらに、本明細書記載の３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとは、当該蛋白質にビオチン化、フルオレセイン等の蛍光物質による標識、Euキレート標識、発色団、発光団、酵素標識、125I、トリチウム等のラジオアイソトープ標識、あるいは固相（容器、担体など）に対して結合が容易になるようなヒドロキシスクシイミド残基、ビニルピリジン残基等を含む化合物を結合等の修飾をしたものを含み、修飾はβサブユニット自体でも良いが多量体として存在するα、γいずれのサブユニットでも良い。
上記（A）に記載の工程は、具体的には上記一般式（I）で示される化合物（以下、「当該化合物」という）と３量体GTP結合蛋白質βサブユニット（以下、「当該蛋白質」という）を液相上で、あるいはいずれか一方、あるいは両方を固相（例えば、容器、担体）に固定して、両者を接触させる工程である。化合物の固相への固定は、例えば、ビオチン基を有する化合物をストレプトアビジンを固相化した固相に結合する方法、アミノ基を有する化合物をアミノ基と反応する例えばヒドロキシスクシイミド基等を表面に有する固相への結合、カルボキシル基を有する化合物をカルボキシル基と反応する例えばヒドラジン基等を表面に有する固相への結合、チオール基を有する化合物をチオール基と反応する例えばビニルピリジン基等を表面に有する固相への結合、等を行うことによって可能であるが、これ以外の方法でも一般的に用いられている化合物の固相への固定法を用いて行うことが可能である。また、当該蛋白質の固相（例えば、容器、担体）への固定は、例えば、静電引力や分子間力を利用したポリスチレン樹脂、ガラスをはじめとする素材で作られた固相に対する吸着、ビオチン化した当該蛋白質をストレプトアビジンを固相化した固相に結合する方法、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットあるいは多量体として存在するα、γ各サブユニットに対する抗体を固相化した固相に結合する方法、poly-His、Myc-tag、HA-tag、Flag-tag、GST、MBP等の当該蛋白質に付加したアミノ酸配列に対する抗体を固相化した固相に結合する方法、poly-Hisを付加した当該蛋白質の金属キレートを表面に有する固相に結合する方法、GSTを付加した当該蛋白質のグルタチオンを表面に有する固相に結合する方法、MBPを付加した当該蛋白質のマルトースなどの糖を表面に有する固相に結合する方法、等が一例として挙げられるが、これ以外の方法でも一般的に用いられている蛋白質の固相（例えば、容器、担体）への固定法を用いて行うことが可能である。
さらに当該蛋白質と当該化合物の接触過程は、それらを含む溶液、固定化された担体をチューブやマルチウェルプレート等の容器中で混合することによって可能であり、また使用する容器の固相上に当該蛋白質あるいは当該化合物を固定化したものに対し、当該蛋白質あるいは当該化合物を含む溶液、当該蛋白質あるいは当該化合物を固定化した担体を含む溶液を加えることによって可能である。
上記（B）に記載の工程は、具体的には上記（A）の当該蛋白質と当該化合物を接触させる際に、被検物質（あるいは被検物質を含む化合物混合物）を作用させる工程である。被検物質（あるいは被検物質を含む化合物混合物）の添加は、（A）の工程の次に行っても、（A）の工程の前に行っても、また（A）の工程と同時に行っても良い。
上記（C）に記載の工程は、具体的には、液相の、あるいは固相（例えば、容器、担体）に固定した当該化合物と、液相の、あるいは固相に固定した当該蛋白質との結合を、被検物質（あるいは被検物質を含む化合物混合物）の添加の有無の各状態において測定し、添加によるその結合の変化を比較することによって、当該化合物と当該蛋白質との結合に対する、被検物質（あるいは被検物質を含む化合物混合物）の阻害作用を評価する工程である。当該化合物と当該蛋白質の結合の測定法としては、両者を分離した後測定する方法と、両者を分離せずに測定する方法が挙げられる。
両者を分離する方法としては、ゲルろ過、アフィニティー樹脂、イオン交換樹脂などのカラム法、遠心分離、洗浄等の方法が一例として挙げられる。例えばゲルろ過、アフィニティー樹脂、イオン交換樹脂などのカラム法によって液相中の当該蛋白質を液相より分離し、当該蛋白質に結合した当該化合物の量を測定することができる。当該化合物、当該蛋白質のうち一方を固相（容器、担体など）に固定している場合には、遠心分離、洗浄、分配、沈殿等の操作を行うことによって、一方が固定されている固相（容器、担体など）を液相と分離することが可能であり、分離後に固相（容器、担体など）に結合している当該化合物あるいは当該蛋白質の量を測定することにより直接的に、あるいは液相に残った当該化合物あるいは当該蛋白質の量を測定することにより間接的に、両者の結合量を測定することが可能である。液相で当該化合物と当該蛋白質を分離する方法としては、いずれかに反応する特異的な蛋白質、あるいは抗体を利用して、免疫沈降法を用いる方法の他、ゲルろ過、アフィニティー樹脂、イオン交換樹脂などのカラム法、遠心分離、洗浄等の方法等が挙げられる。また、分離後に結合した当該化合物あるいは当該蛋白質の量を測定することにより直接的に、あるいは両者が結合した画分から分離された画分に含まれる当該化合物あるいは当該蛋白質の量を測定することにより間接的に、両者の結合量を測定することが可能である。
結合した、あるいは溶液中に含まれる当該化合物量の測定は、例えば上記（１）〜（４）に記載の化合物のように、ビオチン標識、放射性標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識された化合物を用いることで行うことが可能である。ビオチン標識された化合物量の測定は、例として、アビジンあるいはストレプトアビジンあるいはそれらの変異体蛋白質であってビオチンと高い親和性をもって結合する蛋白質を用い（以下アビジン類）、例えば放射性原子、蛍光団、発光団、酵素等の検出が容易な標識を行ったアビジン類と化合物に含まれるビオチンと結合後、測定することが可能である。放射性物質の測定は、シンチレーションカウンター、ガンマカウンター、ＧＭ計測器などの一般的な放射線を測定する装置を用いて測定することが可能である。蛍光物質の測定は蛍光測定装置、発色物質の測定は吸光光度計、発光物質の測定は発光測定装置を用いて行うことが可能である。また、酵素で標識された化合物の測定は、その酵素による反応によって発色、蛍光、発光を生じるような化合物に変化する化合物を利用することにより容易に行うことが可能である。
結合した、あるいは溶液中に含まれる当該蛋白質量の測定は、一例として下記の方法で行うことが可能である。例えば、ビオチン化、フルオレセイン等の蛍光物質による標識、Euキレート標識、発色団標識、発光団標識酵素標識、125I、トリチウム等のラジオアイソトープ標識等の標識を行った当該蛋白質は、上記に記載した方法と同様にして測定することが可能である。また、ビオチン化した当該蛋白質に対するストレプトアビジン等の蛋白質を利用、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットあるいは多量体として存在するα、γ各サブユニットに対する抗体を利用、poly-His、Myc-tag、HA-tag、Flag-tag、GST、MBP等の当該蛋白質に付加したアミノ酸配列に対する抗体を利用、poly-Hisを付加した当該蛋白質に対する金属キレートを有する分子の利用、GSTを付加した当該蛋白質に対するグルタチオンを有する分子の利用、MBPを付加した当該蛋白質に対するマルトースなどの糖を有する分子の利用、等を行うことにより、免疫沈降法、ウェスタンブロット法、酵素免疫固相アッセイ法（Enzyme-linked immuno-sorbent assay：ELISA法）、ラジオイムノアッセイ法等のサンドウィッチ法により、測定することが可能である。
両者を分離しない方法としては、具体的にはシンチレーション・プロキシミティ・アッセイ法（ScintilationProximity Assay: SPA法）、蛍光共鳴エネルギー転移法（FluorescenceResonance Energy Transfer: FRET法）、AlphaScreen法等が代表例として挙げられる。上記SPA法としては、ラジオアイソトープ標識した当該化合物の、シンチレーション分子を含む担体、容器に直接あるいは間接的に結合させた当該蛋白質との結合を、シンチレーションカウンターあるいはCCDカメラ等の測定機器を用いて測定する方法が代表例として挙げられる。また、同様の原理を用いたImaging beads法、Flashplate法等もこの範囲に含まれる。上記FRET法としては、当該化合物に蛍光物質を直接あるいは間接的に結合し、当該蛋白質にも蛍光物質を直接あるいは間接的に結合し、当該化合物と当該蛋白質との結合によって生じる両蛍光物質間での共鳴エネルギー転移によって生じる蛍光の強度を測定する方法が代表例として挙げられ、時間分解蛍光測定法を用いた、Eu、Sm、Tbなどのランタン原子イオンを含むキレートを利用したTR-FRET法等もこの範囲に含まれる。AlphaScreen法としては、当該化合物、当該蛋白質ともそれぞれ別の種類の担体に直接あるいは間接的に結合し、両者の結合によって生じる両担体の空間的な接近を、光照射によって一方の担体（ビーズ）から産生される一重項酸素の、他方の担体（ビーズ）との反応による発光反応を測定する方法等が代表例として挙げられる。
より具体的な一例としては、γサブユニットにMyc-tag配列を付加した３量体GTP結合蛋白質βγサブユニット２量体と、トリチウム標識した化合物１の接触を、96穴マルチウェルプレートを用い、抗Myc抗体（マウス由来モノクローナル抗体）および抗マウスイムノグロブリン抗体固定化SPAビーズ存在下において、被検物質存在下／非存在下で結合反応を行い、一定時間経過後シンチレーションカウンターを用いて３量体GTP結合蛋白質βγサブユニット２量体と、トリチウム標識した化合物１との結合量を測定し、被検物質存在下／非存在下でのカウント値の比較を行うことによって、被検物質による当該化合物と当該蛋白質との結合に対する阻害作用を測定する方法が挙げられる。
本発明においては、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する手法は特に限定されないが、例えば、次のような方法が例示される。
（５a）固相に固定化した当該蛋白質に、被検物質の存在下または不存在下に当該化合物を接触させ、固相に結合した当該化合物の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記（５）に記載の方法。
（５b）固相に固定化した当該化合物に、被検物質の存在下または不存在下に当該蛋白質を接触させ、固相に結合した当該蛋白質の量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記（５）に記載の方法。
（５c）被検物質の存在下または不存在下に、当該化合物と当該蛋白質を接触させ、当該蛋白質と当該化合物の結合量を測定することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定する、上記（５）に記載の方法。
なお、上記（５a）〜（５c）の方法では、例えば、被検物質の存在下で接触させた場合の結合量と、被検物質の不存在下で接触させた場合の結合量とを比較することによって、当該化合物と当該蛋白質の結合に対する被検物質の阻害活性を測定することができる。
なお、上記「血糖降下作用のスクリーニング」とは、構造が既知、あるいは不明の化合物、あるいは化合物の混合物を用い、その方法にしたがった操作を行うことにより、目的とする活性を有する化合物を取得、特定し、結果として血糖降下作用を示す化合物を取得、特定する方法を表す。
上記（５a）に記載の方法は、具体的には、当該蛋白質を容器、担体等の固相に固定化し、被検物質あるいは被検物質を含む化合物混合物を作用させ、同時にあるいはその前後に当該化合物を作用させ、固相に結合した当該化合物の量を測定する方法を表す。その一例としては、当該蛋白質として、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとMyc-tag配列を付加した３量体GTP結合蛋白質γサブユニットの複合体を、抗Myc-tag抗体、抗マウス抗体を介して、SPAビーズに固定化し、当該化合物として、トリチウム標識した化合物１を用いて、被検物質の存在／非存在下での両者の結合を測定することによって、被検物質による両社両者の結合に対する阻害活性を測定する方法が挙げられる。
上記（５b）に記載の方法は、具体的には、当該化合物を容器、担体等の固相に固定化し、被検物質あるいは被検物質を含む化合物混合物を作用させ、同時にあるいはその前後に当該蛋白質を作用させ、固相に結合した当該蛋白質の量を測定する方法を表す。その一例としては、当該化合物として、リンカー構造の末端にアミノ基を有する化合物２をヒドロキシスクシイミド基が結合している担体に化学反応を用いて固定化し、当該蛋白質として、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを含む細胞膜の抽出物を用いて、当該化合物が結合した担体のカラムに当該蛋白質を結合し、被検物質を含む溶液をそのカラムに流すことによって溶出される当該蛋白質量を、ウェスタンブロット法を用いて測定するすることによって、間接的に結合している当該蛋白質量を測定する方法が挙げられる。
上記（５c）に記載の方法は、具体的には、当該蛋白質に被検物質あるいは被検物質を含む化合物混合物を作用させ、同時にあるいはその前後に当該化合物を作用させ、当該蛋白質と当該化合物の結合量を測定する方法を表す。その一例としては、当該蛋白質として、３量体GTP結合蛋白質βおよびγサブユニットを同時に発現させた動物細胞の抽出液、あるいは３量体GTP結合蛋白質α（poly-His配列を含む）、βおよびγ（Myc-tag配列を含む）サブユニットを同時に発現した昆虫細胞の抽出物あるいは精製したβγ２量体を用い、当該化合物として、トリチウム標識した化合物１を用いて、被検物質の存在／非存在下で両者を結合後、ゲルろ過を用いて当該蛋白質を含む高分子画分を回収し、その画分に含まれる放射活性を測定することによって当該化合物の量を測定し、被検物質による両者の結合に対する阻害活性を測定する方法が挙げられる。
ただし、これらのスクリーニング法は、単なる例示であり、本発明の範囲はこれに限られるものではない。
また、本発明は、（６）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを実質的に含む細胞、組織あるいはそれらの抽出物あるいは抽出液を用い、当該化合物と３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの結合に対する被検物質の阻害活性を測定することによって血糖降下作用化合物をスクリーニングする、上記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法を提供する。
３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを実質的に含む細胞、組織とは、いかなる種類の生物由来のものでも良く、いかなる組織、細胞でも良い。自然界に存在する組織、細胞でも良いが、遺伝子工学的な手法で３量体GTP結合蛋白質βサブユニット、あるいはそれと結合しうる蛋白質を共発現させた動物細胞、昆虫細胞、細菌いずれを用いても構わない。それらの抽出物とは、例えば細胞膜、マイクロソーム、核、ゴルジ体等の細胞分画物、あるいはサイトゾールを表し、抽出液とは、細胞そのものあるいは前記抽出物から、ホモジナイズ、超音波処理、界面活性剤処理、バッファー抽出等の操作を行った溶液を表す。
さらに、本発明は、（７）
（A）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットを固相に固定する工程、
（B）該３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに被検物質を接触させる工程、および
（C）一般式（I）で示された化合物（例えば、実施例１〜実施例１０記載の化合物）に結合する化合物、あるいは酸、塩基、変性剤等を加えた溶液を用いて、結合した化合物を溶出する工程を順次行うことによって血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法を提供する。
上記工程（A）、（B）に関しては、上記（５）で述べたとおりである。上記工程（C）によって、容器、担体等の固相に固定した当該蛋白質に結合した化合物を、一般式（Ｉ）で示された化合物のうち当該蛋白質に実質的に結合する化合物を添加することにより競合的に、あるいは酸、塩基、変性剤等を加えた溶液を用いて当該蛋白質と結合した血糖降下作用化合物との親和性を弱めることにより、結合した血糖降下作用化合物を取得することが可能である。
例えば、上記のように合成された化合物ならびに化合物の混合物からなる調製物について、上記（１）〜（７）記載の方法を用いて、活性の高い血糖降下作用化合物を取得することが可能である。すなわち、上記（１）〜（７）記載の方法を用いて、活性の高い血糖降下作用化合物を取得する、あるいは活性の強さの異なる化合物の混合物中からより活性の高い血糖降下作用化合物を取得することが可能であり、この方法を用いて、より有効な血糖降下作用化合物を取得することが可能である。
上記スクリーニング方法によって得られた、より有効な血糖降下作用化合物は、単一である場合、混合物である場合いずれにおいても、そのまま薬剤の原料として使用することが可能である。また、上記スクリーニング方法によって得られる化合物の量が少ない場合は、得られた化合物の構造を特定し、その構造式に従って再合成することにより、より多くの化合物を得ることが可能である。
〔５〕本発明の治療剤
本発明の概要の項で述べたように、本発明者らは３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物が、その結合活性の強さに非常に良く相関して、細胞に対してAktリン酸化作用、糖取り込み作用を引き起こすことを見出した。このように、上記方法を用いて特定することが可能である、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合する化合物が糖取り込み亢進作用を示すことは、これまでに知られていない全く新しい知見である。したがって、本発明は、（８）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合することを特徴とする血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬を提供する。
また、上記したとおり、本発明は、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進する化合物を発見したこと、さらにそのような活性を有する化合物がいずれも細胞に対してAktリン酸化、糖取り込み作用を有することを示したものであり、これらの化合物は糖尿病治療薬として利用可能な血糖降下作用物質である。したがって、本発明は、（９）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進することを主作用とする血糖降下作用化合物を有効成分とする糖尿病治療薬をも提供する。亢進されるフォスフォイノシタイド３−キナーゼのサブタイプはいずれのものでも良く、また複数のサブタイプに対してでも良いが、好ましくはサブタイプがβであることが良く、より好ましくはβに対して作用を持ち、かつγに対して作用を持たないものが良い。
一方、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、本明細書で「プローブ分子」として用いた一般式（I）で示された化合物に結合する化合物（例えば、実施例１〜実施例１０記載の化合物）と同一の結合部位に結合する化合物は、本明細書の実施例に示した事実から、Aktリン酸化、糖取り込み活性を示すことがわかり、このことは本発明における新規な知見である。さらに、GTP結合蛋白質βサブユニットに低分子化合物が結合し何らかの生理反応が起こることによって、Aktリン酸化、糖取り込み活性が生じることはこれまで全く知られていなかった。したがって、本発明は、（１０）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対し、一般式（I）で示された化合物（例えば、化合物１〜７）の、当該蛋白質に結合する部位と同一の部位に結合する化合物を有効成分とする糖尿病治療薬をも提供する。
ここで、当該蛋白質に対して、当該蛋白質に実質的に結合する一般式（I）で示された化合物の結合部位と同一の部位に結合する化合物は、当該蛋白質に対して両者の結合が実質的に競合することを以って定義することができ、例えば本明細書記載の実施例１６、実施例２２の方法を用いて、簡便に試験することが可能である。
なお、本発明の糖尿病治療薬は、糖尿病治療における全く新たなメカニズム（薬理作用）を知見したことを基礎としている。したがって、本発明の糖尿病治療薬はこの薬理作用を有する化合物を広範に含むものであるが、糖尿病治療作用を有することが知られていた公知化合物（例えば、実施例３、５及び６に記載の化合物）を含むものではない。
また、本発明の糖尿病治療薬は、好ましくは、実施例１１に記載の糖取り込み活性の測定方法によって測定された値であって、10μＭ以下のＥＣ50値を有するものが好ましく、０．１μＭ以下のＥＣ50値がより好ましく、0.01μＭ以下のＥＣ50値を有するものが特に好ましい。
本発明の治療剤は、例えば、糖尿病、糖尿病性末梢神経障害、糖尿病性腎症、糖尿病性網膜症、糖尿病性大血管症、耐糖能異常、または肥満症の予防および／または治療薬として使用することができる。この場合、経口投与、静脈内投与、または経皮投与することができる。投与量は投与する患者の症状、年齢、投与方法によって異なるが、有効成分である化合物の量として通常0.001〜1000mg／kg／日である。
本発明の治療剤は常法により製剤化することができる。製剤の形としては注射剤、錠剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、カプセル剤、クリーム剤、座薬などが挙げられ、製剤用担体としては、例えば、乳糖、ブドウ糖、Ｄ-マンニトール、澱粉、結晶セルロース、炭酸カルシウム、カオリン、デンプン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、エタノール、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム塩、ステアリン酸マグネシウム、タルク、アセチルセルロース、白糖、酸化チタン、安息香酸、パラオキシ安息香酸エステル、デヒドロ酢酸ナトリウム、アラビアゴム、トラガント、メチルセルロース、卵黄、界面活性剤、白糖、単シロップ、クエン酸、蒸留水、エタノール、グリセリン、プロピレングリコール、マクロゴール、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム、ブドウ糖、塩化ナトリウム、フェノール、チメロサール、パラオキシ安息香酸エステル、亜硫酸水素ナトリウム等があり、製剤の形に応じて、本発明の化合物と混合して使用される。
さらに、本発明の製剤中における本発明の有効成分の含有量は、製剤の形によって大きく変動し、特に限定されるものではないが、通常は、組成物全量に対して0.01〜100重量％、好ましくは１〜100重量％である。
〔６〕本発明の他の態様に係るスクリーニング方法
３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼとの協奏作用の測定法は、すでに多くの報告によって一般的に知られており（非特許文献４、非特許文献１０：Kerchnerら、Journal of Biological Chemistry、279、44554、(2004)）、本発明においては、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに結合し、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を亢進する化合物が「糖取り込み亢進剤」としての作用をなし得るという結果を得たことにより、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼの結合を亢進する化合物を特定することによって血糖降下作用化合物のスクリーニングが可能となる。
フォスフォイノシタイド３−キナーゼはヘテロ２量体からなる分子であり、その酵素活性サブユニットの違いにより、α、β、γおよびδの４種の存在が知られており、すでに記載したとおり、そのうちβ、γは３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下でその活性が上昇することが知られている（非特許文献４）。実施例に示したとおり、上記（１）〜（７）の方法で活性が認められた化合物は、フォスフォイノシタイド３−キナーゼの３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下での活性をさらに亢進することが見出され、上記（１）〜（７）の方法で活性が認められた化合物がAktリン酸化、糖取り込み作用を引き起こすことから、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検知することによって、血糖降下作用化合物のスクリーニングを行うことが可能であることを見出した。
フォスフォイノシタイド３−キナーゼの活性化によってAktのリン酸化が生じることは広く知れており、本発明の３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物が、Aktリン酸化、さらに糖取り込み活性を示すことは想定でき得るが、本発明のような３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用を直接亢進し、さらにAktリン酸化、糖取り込み活性を示すような化合物はこれまでに全く知られておらず、本発明は３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検出することが、血糖降下作用化合物の効果的なスクリーニングとなりうることを初めて実証したものである。
したがって、本発明は、（１１）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検出することを特徴とする血糖降下作用化合物のスクリーニング方法を提供する。
３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用をさらに亢進する化合物を検出する具体的な方法としては、例えば実施例に示したとおり、Maierら（非特許文献４）、Kerchnerら（非特許文献１０）によって報告された方法を用いることが可能である。この方法は、フォスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸、およびラジオアイソトープ標識したATPを基質として、反応によって生じたファスファチジルイノシトール-[3,4,5]-３リン酸を定量する方法であるが、フォスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸の代わりにフォスファチジルイノシトールを基質として用い、生じたフォスファチジルイノシトール-[3]-リン酸を定量する方法（非特許文献１１：Leopoldtら、Journal of Biological Chemistry、273、7024、(1998)）等も一般的に行われており、本発明の方法は、上記に例示した方法に限定されるものではなく、実質的にフォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素反応によって生じた生成物を測定できる方法を用いることが出来る。また、ラジオアイソトープ標識したATPを用いずに、フォスファチジルイノシトール-[3,4,5]-３リン酸に対する抗体（非特許文献１２：Dowlerら、Science STKE、L6、(2002)）あるいは特異的に結合する蛋白質（非特許文献１３：Choら、Annual Reviews of BiophysicalBiomolecular Structure、34、119、(2005)）を用いて、精製したフォスファチジルイノシトール-[3,4,5]-３リン酸を定量する方法、反応によって生じたADPを定量する方法などを用いて、フォスフォイノシタイド３−キナーゼ活性を測定することも可能である。
また、使用するフォスフォイノシタイド３−キナーゼはα、β、γ、δいずれのサブタイプを使用することが可能であるが、好ましくは３量体GTP結合蛋白質βサブユニットによって酵素活性が亢進されるβ、γを使用することが本方法として挙げられ、特に好ましくはβサブタイプを使用することが本方法として挙げられる。また、使用するフォスフォイノシタイド３−キナーゼは細胞、組織から抽出したものでも良く、組み換え体として作成したものでも良く、また精製、あるいは粗精製されたものでも良いが、実質的に目的とする酵素活性を検出できれば未精製のものでも構わない。また、フォスフォイノシタイド３−キナーゼα、βおよびδはp85、あるいはp55と呼ばれる制御サブユニットと、それぞれp110α、βおよびδと呼ばれる酵素活性サブユニットよりなるヘテロ２量体として存在するが、これらをこのヘテロ２量体として用いることが望ましいが、酵素活性サブユニット単体として用いることも可能である。また、フォスフォイノシタイド３−キナーゼγはp101と呼ばれる制御サブユニットと、p110γと呼ばれる酵素活性サブユニットよりなるヘテロ２量体として存在するが上記と同様である。いずれのサブユニットも、精製、検出等に用いるための人為的なアミノ酸配列を、そのアミノ末端、カルボキシ末端あるいは配列の途中に挿入されたものでも、実質的な酵素活性を有するものであれば本発明に使用可能である。
Bonacciら（非特許文献６）は、N-deacetylcolchicine（文献中ではM201と記載）について、フォスフォイノシタイド３−キナーゼγヘテロ２量体の３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下でのフォスファチジルイノシトールを基質とした酵素活性を亢進することを報告しているが、実施例２１に示したとおり、N-deacetylcolchicineは、フォスフォイノシタイド３−キナーゼγヘテロ２量体の３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下でのフォスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸を基質とした酵素活性に対する亢進作用を示さなかった。さらに、BonacciらはN-deacetylcolchicineに関するAktリン酸化、糖取り込み活性等については一切報告していない。これに対し、本明細書記載の「糖取り込み亢進剤」は、フォスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸を基質に用いた場合の、３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下でのフォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素活性を著しく亢進する。したがって、本発明はフォスフォイノシタイド３−キナーゼの、より好ましくはフォスフォイノシタイド３−キナーゼβに対して、３量体GTP結合蛋白質βサブユニット存在下で活性化する物質が存在すること、またそのような活性を指標にスクリーニングすることにより得られる化合物がAktリン酸化、糖取り込み活性を引き起こすことを初めて明らかにしたものであり、その内容、方法を開示するものである。また、スクリーニング法としてより好ましくは基質としてフォスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸を用いる方法が挙げられるが、上述した通り、実質的にフォスフォイノシタイド３−キナーゼの酵素反応によって生じた生成物を測定する方法を用いることが出来る。
次に、本発明は、（１２）３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼの結合を亢進する化合物を検出することを特徴とする血糖降下作用化合物のスクリーニング方法を提供する。
実施例２５に示したとおり、上記（１）〜（７）の方法で活性が認められた化合物は、フォスフォイノシタイド３−キナーゼと３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの結合を亢進することが見出され、３量体GTP結合蛋白質βサブユニットとフォスフォイノシタイド３−キナーゼとの結合を亢進する化合物を検出することによって、血糖降下作用化合物のスクリーニングを行うことが可能である。
フォスフォイノシタイド３−キナーゼと３量体GTP結合蛋白質βサブユニットの結合は、一例として、実施例に示したとおり、両蛋白質の反応後、一方の蛋白質に対する抗体を用いた免疫沈降を行った後、沈降物中に含まれる他方の蛋白質の量を、その蛋白質に対する抗体を用いたウェスタンブロッティング法を用いて測定することが可能である。ただし、上記方法は単なる一例に過ぎず、例えば両蛋白質の抗体を用いたサンドウィッチ法により、測定することが可能である。サンドウィッチ法の具体例としては、酵素免疫固相アッセイ法（Enzyme-linked immuno-sorbent assay：ELISA法）、ラジオイムノアッセイ法等が挙げられ、それぞれの蛋白質をラジオアイソトープ標識、あるいはビオチン標識しておけば、必ずしも抗体を用いなくても両蛋白質の結合を測定することが可能である。具体的には、上記〔４〕で示したように、シンチレーション・プロキシミティ・アッセイ法（Scintilation Proximity Assay: SPA法）、蛍光共鳴エネルギー転移法（Fluorescence Resonance Energy Transfer: FRET法）（TR-FRET法を含む）、AlphaScreen法等の方法が挙げられる。
上記に記載のスクリーニング方法に用いるフォスフォイノシタイド３−キナーゼのサブタイプはいずれのものでも良く、また混合物でも良いが、好ましくはサブタイプがβであることが良く、より好ましくはβに対して作用を持ち、かつγに対して作用を持たないものを見出す方法がスクリーニング方法として挙げられる。したがって、本発明は（１３）フォスフォイノシタイド３−キナーゼのサブタイプがβであることを特徴とする上記（１１）又は（１２）に記載のスクリーニング方法をも提供する。
本発明は、糖尿病治療薬の有効成分となりうる血糖降下作用化合物のスクリーニング法を提供するものである。スクリーニングを行うためには、(i)３量体GTP結合蛋白質βサブユニットに対する結合、好ましくは一般式（I）記載の化合物の３量体GTP結合蛋白質βサブユニット結合に対する阻害活性を指標にした上記（１）〜（７）に記載の方法、(ii)３量体GTP結合蛋白質βサブユニットのフォスフォイノシタイド３−キナーゼに対する酵素活性亢進作用を指標にした上記（１１）に記載の方法あるいは／および両者の結合亢進作用を指標にした上記（１２）記載の方法のうち、(i)あるいは(ii)、あるいは(i)と(ii)を組み合わせることで実施可能である。
さらに上記スクリーニングを実施して見出した所望の活性、機能を有する化合物に対して、さらに、(iii)糖取り込み作用が検出可能である細胞／組織を用いた糖取り込み作用に対する亢進活性、(iv)動物に対して投与した際の血糖降下作用などの指標を順次測定することにより、本スクリーニング法は完結する。(iii)で言う、糖取り込み作用が検出可能である細胞／組織とは、例えば脂肪組織、脂肪細胞、前脂肪細胞、筋組織、筋細胞、前筋細胞、肝組織、肝細胞、前肝細胞等の他、3T3-L1細胞あるいはそれを分化させた分化3T3-L1細胞、L6細胞、Glut4を発現させた動物細胞等が挙げられるが、実質的に糖の取り込み作用を検出可能である細胞であればいずれの組織／細胞でも良い。また、(iv)で言う動物とは、正常の動物でも良いが糖尿病モデル動物でも良く、動物の種類としてマウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、イヌ、サル等が代表例として挙げられ、人（糖尿病患者、非糖尿病患者）での効果を判定材料にしても良いが、実施可能ないずれの種類の動物であっても構わない。
これまで知られている同様の糖取り込み活性を有する血糖降下作用化合物をスクリーニングする方法は、上記(i)、(ii)の知見がこれまでには得られていなかったため、(iii)、(iv)を行うことのみが可能であった。(iii)は細胞、組織を、(iv)は動物を使用する方法であることから、調製のために労力がかかる、調製ごとに値が異なるなど、スクリーニングには不向きであった。また、膜透過性の低い化合物、細胞に生理的な何らかの影響、毒性を与える化合物の評価を行うことは難しく、有望な新規母核を有する化合物を発見できないリスクが非常に高い。これに対して、(i)、(ii)の方法は、細胞を用いず、常に同じ材料を使用することが可能であり、スクリーニング系として非常に適した方法である。
以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。しかし、以下に記載するものに限定するものではない。
＜実施例１＞ 化合物１
WO02/44180記載の方法を用いて、工程１、工程２は実施した。
＜工程１＞ ピロリジン−２、４−ジオン（テトラミン酸）の合成
グリシンエチルエステル塩酸塩（54.68g, 0.392mol）のジクロロメタン溶液（800ml）に、トリエチルアミン（72g, 0.713mmol）を加え0℃に冷却した。3−クロロ−3−オキソブタン酸メチル（48.5g, 0.355mmol）のジクロロメタン溶液（100ml）を３０分かけて滴下し、さらに室温で4時間攪拌した。反応終了後、水（1000ml）を加えてジクロロメタン層を分離し、食塩水で洗浄、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、溶媒を留去した。ここにメタノール（600ml）と活性炭（10g）を加えた。しばらく攪拌し、セライトろ過後、溶媒を除去して、３−エトキシカルボニルメチルアミノ−３−オキソブタン酸メチル（66.9g, 93%）を黄色油状物として得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=1.17(t, J=7.2Hz, 3H), 3.30(s, 2H), 3.60(s,3H), 3.83(d, J=5.7Hz, 2H), 4.07(q, J=7.2Hz, 2H), 8.50(broad t, 1H).
得られた３−エトキシカルボニルメチルアミノ−３−オキソブタン酸メチル（66.9g, 0.33mol）にメタノール（40ml）とトルエン（400ml）を加え、よく攪拌しながら、２８％−ナトリウムメトキシド／メタノール溶液（70g, 0.363mol）を滴下し、６５℃で１時間加熱した。反応終了後、２N塩酸（185ml, 0.37mol）を加えて中和し、得られた固体をろ取後乾燥し、３−メトキシカルボニルピロリジン−２，４−ジオン（39.5g, 0.25mol）をベージュ色パウダーとして得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=3.62(s, 3H), 3.82(s, 2H), 7.50(broad s,1H).
得られた３−メトキシカルボニルピロリジン−２，４−ジオン（39.5g, 0.25mol）に１、４−ジオキサン（2400ml）と水（240ml）を加え、３０分間加熱還流した。反応終了後に溶媒を留去し、ピロリジン−２，４−ジオン（テトラミン酸）（24.4g, 100%）を淡黄色固体として得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) ケトン型 δ=2.93(s, 2H),3.77(s, 2H), 8.23(s, 1H)、エノール型 δ=3.74(s, 2H), 4.75(s,1H), 7.07(s, 1H). ケトン型：エノール型＝３：２.
＜工程２＞ ４−（（２−アミノフェニル）アミノ）−３−ピロリン−２−オンの合成 工程１で得られたピロリジン−２，４−ジオン（6.93g, 70mmol）と１，２−フェニレンジアミン（7.88g, 70mmol）のメタノール溶液を６℃にて１時間攪拌した。反応溶液を冷却後、析出した結晶をろ取し、４−（（２−アミノフェニル）アミノ）−３−ピロリン−２−オン（11.6g, 87%）を合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=3.94(s, 2H), 4.56(s, 1H), 4.91(bs, 2H),6.55(dt, J=1.5, 7.5Hz, 1H), 6.72(dd, J=1.5, 7.8Hz, 1H), 6.80(s, 1H), 6.86(dt,J=1.5, 7.5Hz, 1H), 7.02(dd, J=1.5, 7.8Hz, 1H), 8.03(s, 1H); ESI-MS(m/z)190(M+H)+.
＜工程３＞
ベンゾチオフェン−７−アルデヒド（419mg, 2.58mmol）と工程２で得た４−（（２−アミノフェニル）アミノ）−３−ピロリン−２−オン（504mg 2.58mmol）をエタノール（26ml）に溶解した。その溶液に酢酸（30ul, 0.516mmol）を加えて、６０℃で１８時間攪拌した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝９１：９）にて精製し、目的物（315mg, 36.7%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.76-0.95 (m, 1H), 1.00-1.23(m, 3H),1.41-1.62(m, 3H), 1.85-1.97(m, 1H), 2.00-2.12(m, 1H), 2.80-2.91(m, 1H), 3.80(d,J=16.4Hz, 1H), 3.95(d, J=16.4Hz, 1H), 5.06(s, 1H), 6.44(s, 1H), 6.82(s, 1H),6.96(d, J=7.0Hz, 1H), 7.29(dd, J=7.0, 7.9Hz, 1H), 7.45(d, J=5.3Hz, 1H), 7.72(d, J=5.3Hz, 1H), 7.76 (d, J=7.9Hz, 1H); ESI-MS(m/z) 340(M+H)+.
＜工程４＞
工程３で得た化合物（315mg, 0.927mmol）と（２Ｅ）−３−（ピリジル−２−イル）−アクリル酸（414mg, 2.78mmol）をジメチルホルムアミド（10ml）に溶解した。その溶液に1−エチル−(3−ジエチルアミノプロピル)−カルボジイミド塩酸塩（以後、EDClと記載する。）（524mg, 2.78mmol）を加えて、室温で18時間攪拌した。その間、原料が消失するまで適時試薬を同量追加した。溶媒を減圧除去後、酢酸エチルを加えて、水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）にて精製し、目的物（157mg, 36.0%）を得た。
1H-NMR(300MHz, CDCl3) δ=0.564-0.765(m, 1H), 1.02-1.38(m,3H), 1.39-1.58(m, 2H), 1.68-1.98(m, 2H), 2.51-2.74(m, 1H), 2.95-3.13(m, 1H),3.90 (d, J = 15.8Hz, 1H), 3.99 (d, J = 15.8Hz, 1H), 4.37-4.54(m, 2H), 5.30(s,1H), 5.69(s, 1H), 6.52(s, 1H), 7.16-7.23(m, 1H), 7.32-7.51(m, 3H), 7.60-7.75(m,2H), 7.79 (d, J = 7.9Hz, 1H), 7.99 (d, J = 15.2Hz, 1H), 8.54-8.71(m, 1H);ESI-MS(m/z) 471(M+H)+.
＜工程５＞
工程４で得た化合物（145mg, 0.304mmol）をメタノール（3.0ml）に溶解した。その溶液に、水素化ホウ素ナトリウム（23.0mg,0.608mmol）、ニッケルクロライド６水和物（14.5mg, 0.061mmol）を順次加え、室温で３時間攪拌した。原料が消失するまで、適時試薬を追加した。反応溶液に飽和塩化アンモニウム水溶液を加えて、酢酸エチルで抽出し、飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮後、実施例１化合物（135mg, 94.0%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.35-3.10(m, 13H), 3.81(d, J=16.5Hz, 1H),3.91(d, J=16.5Hz, 1H), 3.90-4.05(m, 1H), 5.90(s, 1H), 6.81(s, 1H), 6.84(s, 1H),7.00-7.90(m, 8H), 8.45-8.50(m, 1H); ESI-MS(m/z) 473(M+H)+.
また、上記工程５において、同様の反応を用いて、水素化ホウ素ナトリウムの代わりに[3H]水素化ホウ素ナトリウムを用いることで、トリチウム（3H）標識の化合物１を合成した。
＜実施例２＞ 化合物２
＜工程1＞
実施例１の工程３の方法に従い、ベンゾチオフェン−７−アルデヒドの代わりに２−（２−エトキシメチル）−ベンズアルデヒドを用いて合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.83-1.33(m, 7H), 1.44-1.69(m, 2H),1.75-1.97(m, 2H), 2.08-2.23(m, 1H), 2.77-2.92(m, 1H), 3.84(d, J=16.4Hz, 1H),3.69(q, J=7.3Hz, 2H), 3.71(d, J=16.4Hz, 1H), 5.06(s, 1H), 5.32(s, 2H), 6.31(s,1H), 6.68(s, 1H), 6.78-6.91(m, 2H), 6.97-7.21(m, 2H) ; ESI-MS(m/z) 358(M+H)+.
＜工程2＞
工程１で得た化合物（699mg, 1.96mmol）と（２Ｅ）−３−(１，３−チアゾル−２−イル)−アクリル酸（1.22g, 7.83mmol）をジメチルホルムアミド（10ml）に溶解した。その溶液にEDCl（1.50g, 7.83mmol）を加えて、室温で２日半攪拌した。溶媒を減圧除去後、酢酸エチルを加えて水、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で順次洗浄した。無水硫酸ナトリウムで乾燥後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝２０：１）にて精製し、目的物（512mg, 53%）を得た。
ESI-MS(m/z) 495(M+H)+.
＜工程3＞
工程２で得た化合物（512mg, 1.04mmol）をメタノール（10ml）に溶解した。その溶液に、ニッケルクロライド６水和物（49.2mg,0.207mmol）と水素化ホウ素ナトリウム（78.5mg, 2.07mmol）を順次加えた。室温で１時間攪拌後、飽和塩化アンモニウム水溶液を加え酢酸エチルで抽出した。有機層を飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、目的物（511mg, 99.4%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.53-0.76(m, 1H), 0.87-1.33(m, 8H),1.37-1.61(m, 2H), 1.92-2.10(m, 1H), 2.67-2.96(m, 2H), 3.14-3.28(m, 2H),3.48-3.65(m, 2H), 3.76(d, J=16Hz, 1H), 3.84(d, J=16Hz, 1H), 3.95-4.09(m, 1H),5.18-5.32(m, 2H), 5.86(s, 1H), 6.70(s, 1H), 6.75(s, 1H), 6.94(t, J=7.3Hz, 1H),7.00-7.13(m, 2H), 7.23-7.32(m, 1H), 7.54(d, J=3.2Hz, 1H), 7.68(d, J=3.2Hz, 1H);ESI-MS(m/z) 497(M+H)+.
工程３で得た化合物（510mg, 1.03mmol）をメタノール（10ml）に溶解した。その溶液に、濃塩酸（0.1ml）を加えて５５℃で１４時間半攪拌した。反応溶液に、１N水酸化ナトリウム（1.1ml）を加えて中性にした。酢酸エチルで抽出後、有機層を飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去し、目的物（367mg, 81.4%）を
得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.53-0.75(m, 1H), 0.90-1.21(m, 3H),1.39-1.58(m, 2H), 1.91-2.06(m, 1H), 2.42-2.60(m, 1H), 2.69-2.86(m, 1H),2.87-3.00(m, 1H), 3.14-3.27(m,2H), 3.76(d, J=16Hz, 1H), 3.83(d, J=16Hz, 1H),3.91-4.08(m, 2H), 5.82(s, 1H), 6.65(s, 1H), 6.70(s, 1H), 6.74(dd, J=7.3, 7.6Hz,1H), 6.83(d, J=7.3Hz, 1H), 6.94(d, J=7.6Hz, 1H), 7.11(dd, J=7.3, 7.6Hz, 1H),7.54(d, J=3.5Hz, 1H), 7.67(d, J=3.5Hz, 1H), 9.72(s, 1H); ESI-MS(m/z) 440(M+H)+.
＜工程5＞
ビス−（２−ブロモエチル）エーテル（2.04ml, 16.2mmol）とカリウムスクシンイミド（1.50g, 8.10mmol）をジメチルホルムアミドに溶解した。その溶液を８０℃に加熱し、１９時間攪拌した。溶媒を減圧除去し、酢酸エチルを加えた。有機層を水, 飽和炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサン:酢酸エチル＝５：１）にて精製し、ブロモ体（1.64g, 68.0%）を得た。
ESI-MS(m/z) 299(M+H)+.
工程３で得た化合物（380mg, 0.865mmol）とブロモ体（309mg, 1.04mmol）をジメチルホルムアミド（5.0ml）に溶解した。その溶液に炭酸カリウム（359mg, 2.60mmol）を加えて、70℃に加熱し20時間半攪拌した。再度、同量のブロモ体と炭酸カリウムを加えて、さらに４時間半攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加え、水、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン:メタノール＝９５：５）にて精製し、目的物（205mg, 36.1%）を得た。
ESI-MS(m/z) 656(M+H)+.
＜工程6＞
工程5で得た化合物（205mg, 0.313mmol）とヒドラジン１水和物（150μl, 3.13mmol）をエタノールに溶解した。その溶液を７０℃で１時間２０分攪拌した。析出した白色固体をろ過し除去することで、実施例２化合物（113mg, 68.7%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.52-0.73(m, 1H), 0.88-1.19(m, 4H),1.37-1.56(m, 3H), 1.90-2.05(m, 1H), 2.56-2.67(m, 4H), 2.68-2.93(m, 2H),3.10-3.30(m, 5H), 3.59-3.73(m, 2H), 3.76(d, J=16Hz, 1H), 3.84(d, J=16Hz, 1H),3.92-4.06(m, 1H), 4.06-4.22(m, 2H), 5.84(s, 1H), 6.68(s, 1H), 6.73(s, 1H), 6.87-6.95(m,1H), 6.98-7.07(m, 2H), 7.23-7.34(m, 1H), 7.54(d, J=3.2Hz, 1H), 7.67(d, J=3.2Hz,1H); ESI-MS(m/z) 526(M+H)+.
＜実施例３＞ 化合物３
実施例１の工程３の方法に従い、ベンゾチオフェン−７−アルデヒドの代わりに２−メトキシベンズアルデヒドを用い、実施例１化合物の工程４の方法に従い、３−（ピリジン−２−イル）−プロピオン酸の代わりに（２Ｅ）−３−（１，３−チアゾル−２−イル）−アクリル酸を用いて合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.55-3.05(m, 9H), 3.74(d, J=16.5Hz, 1H),3.82(d, J=16.5Hz, 1H), 3.90-4.05(m, 1H), 3.83(s, 3H), 4.05-4.20(m, 1H), 6.01(s,1H), 6.73(s, 1H), 6.73(s, 1H), 6.86-7.10(m, 4H), 7.50(d, J=15.3Hz, 1H), 7.76(d,J=15.6Hz, 1H), 7.84(d, J=3.0Hz, 1H), 7.94(d, J=3.0Hz, 1H); ESI-MS(m/z) 449(M-H)-.
＜工程２＞
工程１で得た化合物（38.3mg, 0.085mmol）をエタノール（5.0ml）に溶解した。その溶液に１０％パラジウム炭素（50%含水, 15mg）を加え、水素雰囲気下で２日間攪拌した。反応溶液をセライトろ過後、溶媒を減圧濃縮することで、実施例４化合物(33mg, 87%)を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.50-3.40(m, 9H), 3.73(s, 3H),3.70-3.85(m, 2H), 3.90-4.05(m, 1H), 5.81(s, 1H), 6.67(s, 1H), 6.71(s, 1H),6.86-7.31(m, 4H), 7.53(d, J=3.3Hz, 1H), 7.67(d, J=3.3Hz, 1H); ESI-MS(m/z)453(M+H)+, 451(M-H)-.
＜実施例４＞ 化合物４
＜工程１＞
実施例１化合物の方法に従い、ベンゾチオフェン−７−アルデヒドの代わりにベンゾチオフェン−３−アルデヒドを用いることで、実施例３化合物を合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.408-0.646(m, 1H), 0.750-0.918(m, 1H),0.918-1.17(m, 2H), 1.28-2.03(m, 3H), 2.35-2.46(m, 1H), 2.65-2.81(m, 1H),2.81-2.96(m, 1H), 2.96-3.20(m, 2H), 3.80(d, J = 16.4Hz, 1H), 3.87(d, J =16.4Hz, 1H), 3.93-4.07(m, 1H), 5.97(s, 1H), 6.74(s, 1H), 6.82(s, 1H),7.16-7.25(m, 1H), 7.26-7.35(m, 2H), 7.35-7.49(m, 2H), 7.69(dd, J = 7.0, 7.0Hz,1H), 7.90(d, J=6.5Hz, 1H), 7.99(d, J=6.5Hz, 1H), 8.52(s, 1H); ESI-MS(m/z)473(M+H)+.
＜実施例５＞ 化合物５
＜工程１＞
実施例化合物１の工程３の方法に従い、ベンゾチオフェン−７−アルデヒドの代わりにベンゾフラン−７−アルデヒドを用いることで合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.75-1.20(m, 4H), 1.35-1.55 (m, 2H),1.75-1.90 (m, 1H), 2.10-2.25 (m, 2H), 2.75-2.90 (m, 1H), 3.72 (d, J=16.8Hz,1H), 3.84 (d, J=16.8Hz, 1H), 5.30 (s, 1H), 6.36 (s, 1H), 6.72 (s, 1H), 6.80 (d,J=7.5Hz, 1H), 6.93 (d, J=2.1Hz, 1H), 7.09 (t, J=7.5Hz, 1H), 7.48 (d, J=7.5Hz,1H), 7.98 (d, J=2.1Hz, 1H); ESI-MS(m/z) 324(M+H)+.
＜工程２＞
工程１で得た化合物（75mg, 0.232mmol）をジメチルホルムアミド（6ml）に溶解し、シクロプロパンカルボン酸（370ml, 4.65mmol）およびEDCl（712mg, 3.71mmol）を加え、室温で３日間撹拌した。反応溶液を減圧濃縮し、酢酸エチルを加え、飽和炭酸水素ナトリウム、飽和食塩水で洗浄した後、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。減圧濃縮して得た残渣を逆相HPLCで精製することにより、実施例５化合物（61mg, 67%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.45-1.14(m, 8H), 1.30-1.48(m, 2H),1.88-2.02(m, 1H), 2.22-2.52(m, 2H), 2.83-2.96(m, 2H), 3.83(d, J=16.8Hz, 1H),3.86(d, J=16.8Hz, 1H), 3.95-4.08(m, 1H), 6.61(s, 1H), 6.73(s, 1H), 6.99(d,J=2.1Hz, 1H), 6.99(d, J=7.5Hz, 1H), 7.22(t, J=7.5Hz, 1H), 7.62(d, J=7.5Hz, 1H),8.03(d, J=2.1Hz, 1H); ESI
-MS(m/z) 392(M+H)+.
＜実施例６＞ 化合物６
＜工程１＞
実施例１の工程３の方法に従い、ベンゾチオフェン−７−アルデヒドの代わりにベンズアルデヒドを用いることで合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.50-3.40(m, 10H), 3.69(d, J=16.0Hz, 1H),3.84(d, J=16.0Hz, 1H), 4.79(s, 1H), 6.32(s, 1H), 6.75(s, 1H), 7.10-7.30(m, 5H);284(M-H)+.
＜工程２＞
工程１化合物（200mg, 0.707mmol）をジクロロメタン（50ml）に溶解し、アセトキシ酢酸（500mg, 4.24mmol）、トリエチルアミン（209μl, 1.41mmol）及びEDCl（543mg, 2.83mmol）を加え、室温で４時間撹拌した。反応溶液に0.1Ｎ塩酸を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、残渣をメタノール（10ml）に溶解し、炭酸カリウム（488mg, 3.54mmol）を加えて、室温で30分攪拌した。不溶物をセライトろ過にて除き、水を加え、酢酸エチルで抽出し、有機層を飽和食塩水にて洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、残渣にジエチルエーテル／ジクロロメタン（容積比８／１）の溶液を加え、析出してきた結晶をろ過し、実施例６化合物（185mg, 77%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.50-2.79(m, 9H), 3.75-4.05(m, 4H),4.42(m, 1H), 4.72(m, 1H), 5.54(s, 1H), 6.74(s, 1H), 6.80(s, 1H), 7.22-7.37(m,5H); ESI-MS(m/z) 342(M+H)+
＜実施例７＞ 化合物７
実施例４の方法を用いて、（２Ｅ）−３−（１，３−チアゾル−２−イル)―アクリル酸の代わりに（２Ｅ）−３−（ピリジン−２−イル）−アクリル酸を用いることで、実施例７化合物を合成した。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.49-0.70(m, 1H), 0.81-1.19(m, 4H),1.35-1.57(m, 3H), 1.89-2.06(m, 1H), 2.54-2.64(m, 4H), 2.69-2.90(m, 2H),3.00-3.49(m, 5H), 3.67-3.74(m, 2H), 3.78(d, J=16.8Hz, 1H), 3.85(d, J=16.8Hz,1H), 3.92-4.06(m, 1H), 4.06-4.21(m ,2H), 5.87(s, 1H), 6.68(s, 1H), 6.72(m, 1H),6.90(dd, J=7.6, 7.6Hz, 1H), 6.98-7.05(m, 2H), 7.16-7.23(m, 1H), 7.25(s, 1H),7.27(s, 1H), 7.68(ddd, J=1.8, 7.6, 7.6Hz, 1H), 8.45-8.52(m, 1H); ESI-MS(m/z)520(M+H)+.
＜実施例８＞
＜工程１＞
実施例２化合物（20mg, 0.0381mmol）とビオチン（37.2mg,0.152mmol）をジメチルホルムアミド（1.0ml）に溶解した。その溶液にEDCl（29.1mg, 0.152mmol）を加えて、室温で21時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えて、炭酸水素ナトリウム水溶液、brineで洗浄し、無水硫酸ナトリウムで攪拌した。溶媒を減圧除去後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ジクロロメタン：メタノール＝９５：５）にて精製し、実施例８化合物（11.1mg, 39.5%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.51-0.76(m, 1H), 0.79-1.18(m, 4H),1.21-1.40(m, 4H), 1.42-1.80(m, 10H), 1.90-2.16(m, 2H), 2.57-2.69(m, 2H),2.69-2.95(m, 3H), 2.98-3.15(m, 2H), 3.62-3.71(m, 2H), 3.79(d, J=16.4Hz, 1H),3.86(d, J=16.4Hz, 1H), 3.95-4.06(m, 1H), 4.06-4.24(m, 3H), 4.24-4.43(m, 1H),5.86(s, 1H), 6.36(s, 1H), 6.42(s, 1H), 6.72(s, 1H), 6.77(s, 1H), 6.88-6.97(m,1H), 6.99-7.09(m, 2H), 7.23-7.38(m, 1H), 7.47-7.60(m, 1H), 7.64-7.74(m, 1H);ESI-MS(m/z) 738.
＜実施例９＞
＜工程1＞
実施例２化合物（20mg, 0.0381mmol）とN−tert−ブチルオキシカルボニル−６−アミノカプロン酸（17.6mg,0.0761mmol）をジメチルホルムアミド（1.0ml）に溶解した。その溶液にEDCl（14.6mg, 0.0761mmol）を加えて、室温で17時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えて炭酸水素ナトリウム水溶液、飽和食塩水で洗浄して、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、残渣をトリフルオロ酢酸（0.3ml）とジクロロメタン（0.1ml）に溶解して、室温で30分攪拌した。反応溶液に炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて、ジクロロメタンで抽出した。有機層を飽和食塩水にて洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、実施例９化合物（19.8mg, 81.5% for 2steps）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.49-0.72(m, 1H), 0.89-1.14(m, 3H),1.14-1.38(m, 4H), 1.40-1.69(m, 4H), 1.93-2.09(m, 2H), 2.14-2.25(m, 1H),2.71-2.94(m, 2H), 3.01-3.29(m, 4H), 3.57-3.75(m, 2H), 3.77(d, J=16.4Hz, 1H),3.85(d, J=16.4Hz, 1H), 3.92-4.19(m, 3H), 5.85(s, 1H), 6.70(s, 1H), 6.76(s, 1H),6.87-6.93(m, 1H), 6.97-7.09(m, 2H), 7.23-7.35(m, 1H), 7.38(d, J=3.2Hz, 1H),7.67(d, J=3.2Hz, 1H), 7.74-7.84(m, 1H); ESI-MS(m/z) 639.
＜実施例１０＞
＜工程1＞
実施例７化合物（25.3mg, 0.0488mmol）とビオチン（35mg, 0.146mmol）をジメチルホルムアミド（2.0ml）に溶解した。その溶液にEDCl（28.1mg, 0.146mmol）を加えて、室温で16時間攪拌した。反応溶液に酢酸エチルを加えて、水、飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧除去後、実施例１０化合物（37.1mg, 99%）を得た。
1H-NMR(300MHz, DMSO-d6) δ=0.51-0.69(m, 1H), 0.79-1.15(m, 4H),1.21-1.70(m, 4H), 1.42-1.80(m, 10H), 1.90-2.23(m, 2H), 2.53-2.63(m, 2H),2.76-2.87(m, 3H), 2.92-3.00(m, 2H), 3.53-3.77(m, 2H), 3.78(d, J=16.7Hz, 1H),3.85(d, J=16.7Hz, 1H), 3.95-4.06(m, 1H), 4.07-4.17(m, 2H), 4.26-4.34(m, 2H),5.87(s, 1H), 6.36(s, 1H), 6.38(m, 1H), 6.68(s, 1H), 6.74(m, 1H), 6.85-6.95(m,1H), 6.99-7.05(m, 2H), 7.14-7.22(m, 1H), 7.23-7.33(m, 2H), 7.63-7.72(m, 1H),7.75-7.83(m, 1H), 8.53-8.51(m, 1H); ESI-MS(m/z) 747.
＜実施例１１＞ 糖取り込み活性の測定
雄性Wistarラットを断頭放血後に開腹し、傍精巣脂肪組織を摘出した。これをBSA（ウシ血清アルブミン）を含むKRH（Krebs-Linger Hepes： 130mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4、1mM CaCl2、25mM HEPES）中で細断し、コラゲナーゼ（タイプI）を加えて約40分間消化処理を行い、単離された脂肪細胞を得た。バッファー交換によりコラゲナーゼを除去後、2%BSA/KRH溶液を加えて再浮遊させ、脂肪細胞けん濁液を得た。
被検化合物の糖取り込み活性評価は、文献（非特許文献１４：Simpsonら、Annual Review of Biochemistry、55、1059、(1986)）を参考に行った。すなわち、上記脂肪細胞けん濁液をポリスチレン製試験管に200μlずつ分中し、被検化合物を含む溶液を100μl加え、振とう後、37℃で30分間培養した。糖取り込み活性は、単位時間あたりに取り込まれた2-[14C(U)]-deoxy-D-glucoseの量を測定することにより評価した。すなわち、前培養を終えた脂肪細胞けん濁液に2-[14C(U)]-deoxy-D-glucoseを添加し、（最終濃度0.5μCi/サンプル）、5分後にサイトカラシンB（終濃度10μM）を加えることにより糖取り込みを停止させた。フタル酸ジノニルを重層してから遠心して脂肪細胞とバッファーを分離させ、脂肪細胞層に含まれる2-[14C(U)]-deoxy-D-glucoseの量を液体シンチレーションカウンターで測定し、取り込まれた糖の量を定量した。本評価において、インスリン（100nM）も同時に評価を行い、インスリン（100nM）の糖取り込みの値を100%として、各化合物についてEC50値を求めた。
本評価系を用いた被検化合物の糖取り込み活性（EC50値、μM）を表１に示した。また、N-deacetylcolchicine（Toront社、製品番号198920）は糖取り込み活性を有さなかった。
＜実施例１２＞ 「糖取り込み亢進剤」のdb/dbマウスを用いた血糖降下作用の検討
約20時間絶食したC57BL/KsJ-db/dbJclマウスに対して、物性、安定性の良い化合物５、化合物６、について経口投与し、投与直前と投与後30、60、120、180分に尾静脈より採血を行い、血糖値を測定した。投与媒体として0.5%メチルセルロースまたは50%ポリエチレングリコールを用いた。
化合物３、化合物５、化合物６はいずれも100mg/kg（化合物５は10mg/kg）単回投与において、対照群に対して25%以上の血糖降下作用を示した。
＜実施例１３＞ Aktリン酸化活性の測定
ヒト肝臓由来HLF細胞を用い、被検化合物によるAktリン酸化作用の測定を下記の通り行った。HLF細胞を2x104細胞/wellとなるように、10%ウシ胎児血清（FCS）を含むダルベッコMEM培地を用いて96穴プレートに播種し、約5時間、37℃、5%CO2存在下で培養し、十分に付着させた後、培地を吸引除去し、血清を含まず0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地で、同様に終夜培養した。培地を吸引除去した後、被検化合物を含む0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地を添加し、37℃、5%CO2存在下で15分間の被検化合物処理を行った後、96穴プレートを氷上に置き、培地を吸引除去した後、氷温のリシスバッファー（1mM PMSFを含む）を加え、-80℃で凍結した。リシスバッファーはリン酸化Akt測定キット（Cell Signaling Technologies社、製品番号7160、PathScanR Phospho-Akt1 (Ser473)Sandwich ELISA Kit）に添付のものを、添付文書に従って作成したものを使用した。上記凍結した96穴プレートを室温に戻して抽出液（lysate）を融解した後、上記リン酸化Akt測定キットを用い、添付文書に従ってリン酸化Akt量を測定した。各被検物質によるAktリン酸化の度合いを図１に示した。
表１および図１から明らかなように、各被検化合物の糖取り込み活性と、Aktリン酸化活性は非常に良い相関を示し、両者が同じシグナル経路に存在することを強く示唆した。また、N-deacetylcolchicineはAktリン酸化活性を有さなかった。
＜実施例１４＞ HLF細胞膜を用いた3H標識化合物１の結合アッセイ
ヒト肝臓由来HLF細胞の細胞膜の調製は下記の通り行った。まず、直径15cmの細胞培養用ディッシュに10%FCSを含むダルベッコMEM培地でほぼコンフルエントに培養したHLF細胞、30枚分を、HMEEバッファー（20mMHEPES-KOH、1mM EDTA、1mM EGTA、2mM MgCl2）存在下でセルスクレーパーを用いて細胞をかき取り、約30mlの細胞けん濁液を得た。本けん濁液をテフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いてホモジナイズを行い（氷温、1000 rpm、15 stroke）、低速の遠心（1500rpm、5分）後の上清を再度高速で遠心（12000rpm、30分）を行い、沈殿を1mlのHMEEバッファーにけん濁し、細胞膜溶液とした。プロテインアッセイ（BioRad社）を用いた、BSAを標品とした蛋白質定量の結果、上記細胞膜溶液中の蛋白質濃度は3.5mg/mlであった。
上記のように得た細胞膜に対する3H標識化合物１の結合アッセイを下記のように行った。96穴プレートに、RBAバッファー（75mMTris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4）で６倍に希釈した上記細胞膜溶液25μl、400μM（アッセイの終濃度100μM）の非標識の化合物１あるいは化合物１を含まないRBAバッファー25μlを加え、さらに3H標識化合物１を含むRBAバッファー50μlを加え、室温で１時間振とうした後、あらかじめ2%BSA、0.5%ポリエチレンイミンを含むRBAバッファーでブロッキングしたフィルタープレート（Unifilter GF/C、パーキンエルマー社、製品番号6005174）に、セルハーベスターを用いて細胞膜を捕集し、0.05% Twee-20を含むTBS（20mMTris-HCl、0.15M NaCl、pH7.4）を用いて良く洗浄した後、よく乾燥したフィルタープレートに液体シンチレーター（マイクロシンチ０、パッカード社）を30μl加え、トップカウント（パッカード社）を用い、3Hのカウントを測定した。終濃度100μMの非標識の化合物１を加えていたサンプルを非特異的な3H標識化合物１の結合とし、非標識の化合物１を加えないサンプルの値からこの値を引いた値を、特異的な結合とした。
図２に示したように、3H標識化合物１のHLF細胞膜に対する飽和的な結合が観察され、スキャッチャードプロットを用いて計算した結果、化合物１のKd値は、0.93μMと計算された。この値は、実施例１３に示した化合物１のAktリン酸化活性に近い値であり、見られた細胞膜上の蛋白質への結合はAktリン酸化、糖取り込みにつながる反応であることが強く示唆された。
＜実施例１５＞ HLF細胞膜からの3H標識化合物１結合蛋白質の抽出アフィニティー精製、結合蛋白質の同定
（１）HLF細胞膜からの結合蛋白質の抽出
上記実施例１４で見られた3H標識化合物１の結合蛋白質（以下結合蛋白質）の可溶化を下記のように行った。上記実施例１４に示したとおり作成したHLF細胞膜（3.5mg/ml）のHMEEバッファー溶液100μlに、400μlの0.25%および0.125%のDigitoninを含むRBAバッファーを加え、終濃度をそれぞれ0.2%、0.1%とし、混合した後、室温で1時間静置した。遠心（15000rpm、30分）によって得た上清を、各抽出液とし、下記のPD10（GEヘルスケア社、製品番号17-0851-01）を用いたゲルろ過によって含まれる蛋白質に対する3H標識化合物１の特異的な結合を測定する方法（以下PD10法）を用い、抽出液中の結合蛋白質量を測定した。
PD10法は下記の通り行った。マイクロチューブ中に250μlのRBAバッファー、100μlの未標識の化合物１（500μM）を含むあるいは含まないRBAバッファー、100μlの上記各抽出液、50μlの3H標識化合物１を含むRBAバッファー（2.5μM）を順次加え、攪拌した後室温で1時間静置した。反応液全量（0.5ml）を、RBAバッファーに良く置換したPD10カラムに供し、2mlのRBAバッファーをPD10カラムに流した後、さらに1.5mlのRBAバッファーで溶出した溶出液を、蛋白質を含む高分子画分として分取し、15mlの液体シンチレータを加え、シンチレーションカウンターを用い、高分子画分に含まれる3H標識化合物１の量を測定した。未標識の化合物１（終濃度100μM）を加えたサンプルのカウントを非特異的な結合によるカウント、未標識の化合物１を加えないサンプルのカウントから非特異的な結合によるカウントを差し引いた値を特異的な結合によるカウントとし、抽出液中に含まれる結合蛋白質の量を評価した結果、図３に示したように、0.2% Digitoninによって結合蛋白質が細胞膜から抽出されたと判断した。
（２）アフィニティーカラムの作成
上記実施例２および７〜１０記載の「プローブ分子」として合成した化合物が、化合物１と同じ結合蛋白質に結合するかを確かめるため、上記実施例１４に示した方法を用い、HLF細胞膜への3H標識化合物１結合に対する各化合物の阻害活性を測定した。同時に実施例１１に示した糖取り込み作用および実施例１３に示したAktリン酸化活性が比較的強かった化合物３を同時に評価した。その結果、図４に示したように、いずれの化合物もある程度の3H標識化合物１の細胞膜に対する結合を阻害し、結合蛋白質に対する結合能を有することが分かった。
そこで、上記結果より、実施例２記載の化合物２を選び、アフィニティーカラム作成を行った。化合物２の固定化は、リンカーに接続したアミノ基を利用して、N-ヒドロキシスクシイミド基を有する担体を用いたアフィニティー用カラムである、NHS-ActivatedSeparose HP （GEヘルスケア社、製品番号17-0716-01、HiTrap NHS-Activated Separose HP (1ml)）に対して行った。上記カラムを5mlの1mM塩酸で洗浄した後、0.2MのNaHCO3に溶解した化合物２（2mM）を1.5ml流し、室温で1時間静置した。さらに3mlの1M Tris-HCl（pH8.5）を流した後、室温で30分静置してブロッキングを行い、5mlの蒸留水を用いてカラムを洗浄することで、化合物２を固定化したアフィニティーカラムを作成した。化合物２の結合は、上記手順でカラムを素通りした化合物２の量を、逆相HPLCで定量することによって確認した。また、実施例７記載の化合物７に関しても、上記化合物２と同様の操作を行うことで、化合物７を固定化したアフィニティーカラムを作成した。
（３）HLF細胞膜からの結合蛋白質のアフィニティー精製、結合蛋白質の同定
HLF細胞膜からの結合蛋白質の抽出は、下記の通り行った。実施例１４と同様の方法で作成したHLF細胞膜（3.7mg/ml）1.2mlに、0.25% Digitoninを含むRBAバッファー4.8mlを加え、軽く攪拌した後室温で1時間静置した。遠心（15000rpm、30分）により不溶物を除いた上清（6ml）を、RBAバッファー24mlで希釈し、HLF細胞膜抽出液とした。
上記（２）の通り作成した、化合物２を固定化したアフィニティーカラムの上流側に、化合物を固定せず、1MTris-HCl（pH8.5）によるブロッキングのみを行ったカラム２本をつなぎ、上記HLF細胞膜抽出液全量を、室温、0.5ml/分の流速でこのカラムに流して結合蛋白質を吸着させた。化合物２を固定化したアフィニティーカラムのみを取り出し、このカラムを0.04% Digitoninを含むRBAバッファーを用い、流速1ml/分で約25分間洗浄した。洗浄過程で溶出された溶出液のうち最後の3分間分を「洗浄」画分（3ml）として分取した。さらに、実施例１１で糖取り込み活性、および実施例１３でAktリン酸化活性の強かった化合物４を200μM含む、上記洗浄液と同一組成の溶液（溶出液）を用い、流速1ml/分で3分間溶出、分取した（「溶出」画分、3ml）。上記「洗浄」、「溶出」画分全量を、Centricon-10を用いた限外ろ過を用いて約45μlに濃縮し、そのうちそれぞれ7.5μlずつをSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、銀染色（Silver Stain Kit,Protein、GEヘルスケア社、製品番号17-1150-01、方法は添付のマニュアルの方法を用いて行った）を行い、両画分に含まれる蛋白質の比較を行った。その結果、図５に示したように、約36KDaの位置に泳動されるバンドは、「溶出」画分特異的なバンドであることが確認された。また、ブロッキングのみを行ったカラムについても同様の操作を行ったが、約36KDaの位置に泳動されるバンドは見られなかった。
さらに、同様の方法を用いて、化合物２を固定したアフィニティーカラムを用い、化合物４で溶出された画分について、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、CBB染色し、上記36KDaに相当する特異的なバンドを切り出し、シリコナイズ処理済マイクロテストチューブに移した。600μｌのアセトニトリルで3回洗浄し50mＭ炭酸水素アンモニウム水溶液で3回洗浄した。さらに、25mＭ炭酸水素アンモニウム50％アセトニトリル溶液で約15分間3回洗浄後、溶液を除去し後、6Mグアニジン塩酸/ 2mＭ EDTA/ 0.5M トリス塩酸（pH 8）を100μｌ添加後、10μｌの還元溶液（DTTを含む6Mグアニジン塩酸/ 2mＭ EDTA / 0.5M トリス塩酸（pH 8）を添加し、約２時間室温で還元反応を行なった。その後、遮光し、ヨード酢酸を含む溶液（25mg ヨード酢酸を0.3ｍｌの6Mグアニジン塩酸/ 2mＭ EDTA / 0.5M トリス塩酸（pH 8））を添加し、約30分間放置することにより、遊離チオール基のアルキル化を行なった。反応溶液を除去後、アセトニトリルを添加し、ゲルの脱水を行なった後、遠心濃縮機を用いて溶媒を除去し、ゲルの乾燥を行なった。10μlのトリプシン溶液（トリプシン：シグマ社プロテオミクスグレード、50mM 炭酸水素アンモニウム（pＨ7.6））を加えて、36℃で約15時間酵素消化を行なった。トリプシン消化後、反応溶液を別のシリコナイズ処理済マイクロテストチューブに移した。さらに、ゲルを100μlの0.1% ギ酸−60% アセトニトリルで20分間洗浄し、溶液を同じシリコナイズ処理済マイクロテストチューブに移し、これを3回繰り返し、ペプチドの抽出を行なった。得られたトリプシン消化液は、減圧遠心濃縮機で溶媒を除去し、ナノーLC/MS/MS測定用の試料とした。トリプシン消化物をナノーLC/MS/MS（HPLC:Paradaigm MS4 MicromBioresourcey社、MS:エレクトロスプレーイオン化リニアトラップ質量分析計LTQ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）に供した。得られたMSおよびMS/MSデータは、データベース検索ソフト（Mascot、マトリックスサイエンス社）を用いて解析を行なった。検索対象データベースは、MSDBおよびNCBI nrを用い、生物種はHomo Sapienceとした。その結果、どちらのデータベースを用いた場合においても、高いスコアーで（それぞれMascot score 245 および244）GTP結合蛋白質βサブユニット（以下Gβ）が帰属されたことから、本蛋白質がGβであることが明らかとなった。
＜実施例１６＞ アフィニティーカラムを用いた結合蛋白質（Gβ）の化合物による溶出
実験
上記実施例１５に示した化合物２を固定化したアフィニティーカラムに加え、実施例１５（２）で化合物２と同等の、結合蛋白質に対する結合活性を有する化合物７を同様に固定化したアフィニティーカラムを作成し、実施例１５と同様のアフィニティーカラム操作を行った。
カラムは洗浄を行ったのち、化合物３、化合物４（いずれも200μM）を含むRBAバッファー（0.02% Digitoninを含む）で順次溶出した。実施例１１、１３の結果より、化合物３は化合物４に比べ活性が弱いことが確認されている。化合物２、化合物７を固定化したアフィニティーカラムそれぞれからの、化合物３、化合物４で順次溶出、その後pH4のバッファーを用いて溶出した溶出液について、実施例１５と同様に濃縮後、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、銀染色、および抗Gβ抗体（SantaScuz社、製品番号sc-261）を用いたウェスタンブロット法を用いて検出を行ったところ、いずれの検出法を用いても、溶出化合物の活性依存的なGβの溶出が確認された（図６）。
なお上記において、化合物３、化合物４を適当な被検物質に替えてアフィニティーカラムからのＧβの溶出を検出することにより、プローブ化合物（化合物２、化合物７を固定化したアフィニティーカラム）とＧβとの結合阻害活性を測定し、血糖降下作用物質のスクリーニングを行うことが可能である。
＜実施例１７＞ 動物細胞発現系（Gβ1、Gγ2）の作成
配列番号１、２の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ1の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1056bpのDNAを制限酵素HindIII、XhoIで消化し、GFXキット（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて精製した。ベクターpcDNA3.1Hyg(+)（インビトロジェン社）のHindIII、XhoI部位にクローニングした後、本プラスミドを有する大腸菌JM109株のシングルコロニー培養液よりプラスミドを調製してDNAシーケンシングを行い、配列番号３で示した塩基配列（配列番号４はアミノ酸配列を示す）を確認し、pcDNA3.1Hyg(+)-GNB1を作成した。さらに本大腸菌培養液からQIAprepplasmid purification kit(QIAGEN)を用いてプラスミドDNAを調製し、動物細胞トランスフェクション用に供した。また、配列番号５、６の合成DNAをプライマーとし、ヒトGγ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた255bpのDNAを制限酵素EcoRI、XhoIで消化し、GFXキット（アマシャムバイオサイエンス社）を用いて精製した。ベクターpcDNA3.1(+)（インビトロジェン社）のEcoRI、XhoI部位にクローニングした後、配列番号７で示した塩基配列（配列番号８はアミノ酸配列を示す）を確認し、pcDNA3.1(+)-GNG2を作成した。さらに形質転換した大腸菌JM109株の培養液からプラスミドDNAを調製し、動物細胞トランスフェクション用に供した。
＜実施例１８＞ Gβ1、Gγ2発現HEK293T細胞抽出液を用いた3H標識化合物１の結合測定
上記実施例１７に記載したとおり調製した発現プラスミドを用い、HEK293T細胞を用いた蛋白質の発現を行った。HEK293T細胞を、直径10cmの細胞培養用ディッシュに培養し、Lipofectamine 2000（インビトロジェン社、製品番号11618-019）を用い、添付のマニュアルに従った方法を用いて、Gβ1とGγ2を同時にトランスフェクションし、発現細胞（Gβ1γ2）を回収した。コントロールとして、発現ベクターの代わりに遺伝子を未挿入のベクターを同様にトランスフェクションした細胞（Mock）を作成、回収した。回収した細胞は、PBSを用いた洗浄後、リシスバッファー（75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4、プロテアーゼインヒビターカクテル（Rosch Diagnostics社、11-697-498-001）、0.3% CHAPS）1mlにけん濁し、超音波破砕を行い、遠心（15000rpm、20分）を行うことによって上清を抽出液として得た。プロテインアッセイ（BioRad社）を用いた、BSAを標品とした蛋白質定量を行うことで、Gβ1γ2、Mockそれぞれの抽出液の蛋白質濃度が同等であることを確かめた。
上記抽出液中に含まれる蛋白質に対する、3H標識化合物１結合活性は、実施例１５（１）に記載のPD10法を用いて行った。すなわち、上記抽出液300μl、未標識の化合物４（500μM）を含むあるいは含まないRBAバッファー（75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4）100μl、3H標識化合物１を含むRBAバッファー（1.25μM、100μl）を順次加え、攪拌した後室温で1時間静置した。反応液全量（0.5ml）を、RBAバッファーに良く置換したPD10カラムに供し、2mlのRBAバッファーをPD10カラムに流した後、さらに1.5mlのRBAバッファーで溶出した溶出液を、蛋白質を含む高分子画分として分取し、15mlの液体シンチレータを加え、シンチレーションカウンターを用い、高分子画分に含まれる3H標識化合物１の量を測定した。未標識の化合物４（終濃度200μM）を加えたサンプルのカウントを非特異的な結合によるカウント、未標識の化合物１を加えないサンプルのカウントから非特異的な結合によるカウントを差し引いた値を特異的な結合によるカウントとし、抽出液中に含まれる結合蛋白質の量を評価した結果、図７に示したように、Gβ1γ2を発現させた抽出液中には、Mockのものに比べ高い結合蛋白質の存在が見られた。
さらに、上記抽出液の一部を用い、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動後、抗Gβ抗体（SantaCcuz社、製品番号sc-261）を用いたウェスタンブロット法を用い、Gβ1γ2を発現させた抽出液中には、Mockのものに比べGβの発現量が上昇していることが確認された。
＜実施例１９＞ 昆虫細胞発現系の作成（Gβ1〜5、Gγ2-Myc、Gαi1-His）と生産
（１）6xHis-Gαi1の発現系の構築
配列番号９、１０の合成DNAをプライマーとし、ヒト３量体GTP結合蛋白質αi1サブユニット（Gαi1）の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1116bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号１１で示した塩基配列（配列番号１２はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素BamHI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-6xHis-GNAI1を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、アミノ末端にHisタグ配列を付加した6xHis-Gαi1蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。ウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについて特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（２）Gβ1の発現系の構築
配列番号１３、１４の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ1の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1051bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号１５で示した塩基配列（配列番号１６はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB1を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ1蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（３）Gβ2の発現系の構築
配列番号１７、１８の合成DNAをプライマーとし、ヒトGβ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1048bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号１９で示した塩基配列（配列番号２０はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（４）Gβ3の発現系の構築
配列番号２１、２２の合成DNAをプライマーとし、正常ヒト皮膚線維芽細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1078bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号２３で示した塩基配列（配列番号２４はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB3を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ3蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（５）Gβ4の発現系の構築
配列番号２５、２６の合成DNAをプライマーとし、ヒト肝癌由来HLF細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1055bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号２７で示した塩基配列（配列番号２８はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB4を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAを昆虫細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ4蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（６）Gβ5の発現系の構築
配列番号２９、３０の合成DNAをプライマーとし、ヒト肝癌由来HLF細胞のcDNAライブラリーをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた1093bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号３１で示した塩基配列（配列番号３２はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-GNB5を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、Gβ5蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞抽出液について特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（７）Myc-Gγ2の発現系の構築
配列番号３３、３４の合成DNAをプライマーとし、ヒト３量体GTP結合蛋白質γ2サブユニット（Gγ2）の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた290bpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、製品番号K2875）にサブクローニングした後、配列番号３５で示した塩基配列（配列番号３６はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-Myc-GNG2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、アミノ末端Mycタグ配列付加Myc-Gγ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについてMycタグ配列特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
（８）Gβ1~5とMyc-Gγ2およびGαi1-HisのSf21を用いた共発現、Ni-NTAレジンを用いた精製
昆虫細胞Sf21株を用いた蛋白質の発現、生産は、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）添付のマニュアル（Instruction Manual）記載の方法に従って行った。具体的には、プラークアッセイを用いてタイターを確認した３次、あるいは４次ウイルス溶液を用い、Gβ、Myc-Gγ2および6xHis-Gαi1遺伝子を含むバキュロウイルスを、それぞれMOI=2.5となるように、250ml容の三角フラスコを用い、108細胞/100mlのSF900IISFM培地（Invitrogen社、製品番号10902-096）中で、65時間、28℃で振とう培養を行った。Gβに関しては、Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4、Gβ5の各サブタイプそれぞれについて培養を実施した。培養後、遠心（1000rpm、5分）により細胞を回収し、Insect Cell PBS（7.3mM NaH2PO4(pH6.2)、58mM KCl、47mM NaCl、5mM CaCl2）10mlで洗浄した後、さらに遠心（3000rpm、5分）によって細胞を回収し凍結保存した。
上記のように得た各Gβの発現細胞のうち、Gβ2／Myc-Gγ2の２量体（Gβ2γ2-Myc）の精製を下記の通り行った。方法は、Davisら（非特許文献１５：Davisら、Biochemistry、44、10593、(2005)）によって報告されている方法に基づいて行った。すなわち、108細胞を、2mlのLysis Buffer（50mMHEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル（Rosch Diagnostics社、11-697-498-001）、1mM EDTA、100mM NaCl）を用いて細胞をけん濁した後、100000g、20分の遠心を行い、ペレットを得た。さらにこのペレットを2mlのExtraction Buffer（50mM HEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10ｍM 2-メルカプトエタノール、10μMGDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、50mM NaCl、1%コール酸ナトリウム）を用いてけん濁、さらに4℃、１時間の攪拌を行った後、さらに100000G、20分の遠心を行い、その上清を抽出液（2ml）として得た。抽出液（2ml）にBuffer A（50mMHEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、100mM NaCl、0.5% Lubrol）8mlを加え、さらに200μlのNi-NTAagarose（QIAGEN社、製品番号30210）を添加して、4℃、1時間攪拌を行った後、遠心（3000rpm、5分）によってNi-NTA agaroseを回収し、上記Buffer Aにさらに300mMNaCl、5mMイミダゾールを加えたバッファー（0.5ml）で３回洗浄した。さらにNi-NTA agaroseをElution Buffer（50mM HEPES (pH8.0)、53mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、250mM NaCl、5mMイミダゾール、10mM NaF、30μM AlCl3、1%コール酸ナトリウム）にけん濁し、室温、1時間攪拌を行ってGβ2／Myc-Gγ2を溶出し、遠心（10000rpm、2分）によってNi-NTA agaroseを除いた上清をGβ2／Myc-Gγ2溶液とした。
得られたGβ2／Myc-Gγ2について、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、抗Gβ2抗体を用いたウェスタンブロッティング法により、それぞれの精製を確認し、細胞抽出液からの回収率は約20%であった。
＜実施例２０＞ Gβ発現昆虫細胞抽出液を用いた3H結合、および化合物のGβ結合能評価
上記実施例１９（８）記載の通り調製したGβ1とMyc-Gγ2およびGαi1-Hisを発現した凍結昆虫細胞Sf21、107細胞を、融解後、1% Triton X-100を含むRBAバッファー（75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4）1.3mlでけん濁、超音波処理によって蛋白質の抽出を行い、遠心（15000rpm、15分、4℃）によって得た上清をGβ1γ2-Myc 抽出液（1.3ml）とした。
上記抽出液を用い、Gβ1γ2-Mycの3H標識化合物１に対する阻害活性を、Gβ1γ2-Mycに対する結合活性と考え、化合物１、化合物３、化合物６のGβ1γ2-Mycに対する結合活性の測定を行った。上記抽出液中に含まれる蛋白質に対する、3H標識化合物１結合活性は、実施例１５（１）に記載のPD10法を用いて行った。すなわち、上記抽出液100μl、被検物質を含むあるいは含まないRBAバッファー（75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4）300μl、3H標識化合物１を含むRBAバッファー（1.25μM、100μl）を順次加え、攪拌した後室温で1時間静置した。反応液全量（0.5ml）を、RBAバッファーに良く置換したPD10カラムに供し、2mlのRBAバッファーをPD10カラムに流した後、さらに1.5mlのRBAバッファーで溶出した溶出液を、蛋白質を含む高分子画分として分取し、15mlの液体シンチレータを加え、シンチレーションカウンターを用い、高分子画分に含まれる3H標識化合物１の量を測定した。
化合物を添加しないサンプルのカウントを0%阻害、未標識の化合物１（終濃度100μM）を加えたサンプルのカウントを100%阻害とし、各濃度の各化合物による、Gβγ2-Mycに対する3H標識化合物１結合に対する阻害活性を計算した結果を図８に示した。このように、化合物１、化合物３、化合物６はいずれもGβγ2-Mycに結合することが示され、結合の強さは化合物１＞化合物３＞化合物６の順であり、これは実施例１１に示した糖取り込み活性、実施例１３に示したAktリン酸化活性と、非常に良い相関を示すものであった。
＜実施例２１＞ 各サブタイプGβγ2-Myc発現昆虫細胞lysateを用いた、3H結合アッセイ
上記実施例１９（８）で取得したGβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4、Gβ5の各サブタイプを発現した凍結昆虫細胞Sf21、108細胞を、融解、3mlのLysis Bufferを用いてけん濁後、1% Triton X-100を含むRBAバッファー（75mM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、2mM EDTA、pH7.4）2mlでけん濁、４℃、１時間攪拌して、蛋白質の抽出を行い、遠心（100000G、20分、4℃）によって得た上清をGβγ2-Myc抽出液とした。
上記各Gβγ2-Mycに対する3H標識化合物１の結合アッセイは、Gβγ2-Mycに結合する抗cMyc抗体（モノクローナル抗体9E10）、抗ｃMyc抗体を結合する抗マウスIgG抗体を固相化したSPA（Scintillation Proximity Assay）ビーズ（Anti-Mouse PVT SPA Scintillation Beads 、GEヘルスケア社、製品番号RPNQ0017）を用い、SPAビーズに結合したGβγ2-Mycに結合した3Hの3H標識化合物１の放射活性を、SPA法によって測定する原理を用いた。
白色96穴プレートに、上記各サブタイプのGβγ2-MyclysateをRBAバッファーで２倍に希釈した溶液（40μl）、未標識の化合物１（500μM）を含むあるいは含まないRBAバッファー（25μl）、3H標識化合物１溶液（1.25μM、25μl）、抗ｃMyc抗体（9E10、200μg/ml、SantaCruz社、製品番号sc-40）溶液（10μl）、SPAビーズ（20mg/ml、25μl）を順次加え、1時間振とう後、室温で終夜静置し、トップカウントを用い放射活性を測定した。未標識の化合物１（終濃度100μM）を加えたサンプルのカウントを非特異的な結合によるカウント、未標識の化合物１を加えないサンプルのカウントから非特異的な結合によるカウントを差し引いた値を特異的な結合によるカウントとした。（上記方法を、以下「SPA法」と表す。）
図９に示したとおり、Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4では高い3H標識化合物１の高い特異的な結合見られ、Gβ5では低い結合が見られた。
＜実施例２２＞ 各サブタイプGβγ2-Myc発現昆虫細胞lysateを用いた、各化合物のGβ結合活性の評価
各サブタイプGβγ2-Myc発現昆虫細胞lysateを用いた、実施例１１および１３で活性の見られた化合物（化合物１、化合物３、化合物５、化合物６）、およびN-deacetylcolchicineのGβ結合作用の評価を、実施例２１に記載の方法に準じて、3H標識化合物１の結合アッセイに対する阻害活性を測定することによって行った。
まず、実施例１９（８）記載の方法と同様に取得した、Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4と、Myc-Gγ2および6xHis-Gαi1を共発現した昆虫細胞Sf21を取得し、-80℃で凍結保存した。Gβ1、Gβ2、Gβ3、Gβ4の各サブタイプを発現した凍結昆虫細胞Sf21、2.5x108細胞を、融解後、4mlのLysis Bufferでけん濁し、遠心（10000G、20分、４℃）を行いペレットを得た。ペレットを1%コール酸ナトリウムを含む extraction バッファー（ 50mM HEPES 、ｐH8.0、3mMMgCl2、１mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、50mM NaCl、1%コール酸ナトリウム ） 5ml でけん濁、４℃、１時間攪拌して蛋白質の抽出を行い、遠心（100000G、20分、4℃）によって得た上清をGβγ2-Myc 抽出液とした。
上記各Gβγ2-Mycに対する3H標識化合物１の結合アッセイは、RBAバッファー中に 0.1 %のTriton X-100を加えることとプレートサイズの変更以外は、実施例２１記載の方法と同様に行った。すなわち、白色96穴halfプレートに、抗ｃMyc抗体（9E10、54μg/ml、ZYMED社 製品番号18-0176ｚ）とSPAビーズ（13.3mg/ml）を含む混合溶液(18.7μl）、上記各サブタイプのGβγ2-Myc抽出液（6.25μl）、被検物質を含むあるいは含まないRBAバッファー（75ｍM Tris-HCl、12.5mM MgCl2、２ｍM EDTA、ｐH7.4、12.5μl）、3H標識化合物１溶液（1.25μM、12.5μl）、を順次加え、1時間振とう後、室温で終夜静置し、トップカウントを用い放射活性を測定した。化合物を添加しないサンプルのカウントを0%阻害、未標識の化合物１（終濃度50-100μM）を加えたサンプルのカウントを100%阻害とし、各濃度の各化合物による、Gβγ2-Mycに対する3H標識化合物１結合に対する阻害活性を計算した。結果の代表例として、Gβ1、およびGβ4に対応する発現蛋白質を用いた評価結果を、図１０に示した。その他のサブタイプのGβに対応する発現蛋白質を用いた評価結果も、これらに類似の値であった。すなわち、図１０より、化合物１、化合物３、化合物４、化合物５、化合物６のGβ結合活性は、実施例１３に示したAktリン酸化活性と非常に良い相関を示すものであり、その結果実施例１１に示した糖取り込み活性につながることが強く示唆された。
さらに、スクリーニング系としての安定性を見るため、Gβ1γ2-Mycを用い、上記被検物質として化合物１（100μM）および被検物質非添加について、それぞれn=6で、平均値、標準偏差、Z'値を算出した。その結果、Z'=0.63と計算され、ハイスループットスクリーニング（HTS）が十分可能と判断されるZ'>0.5を大きく超え（非特許文献１６：Zhangら、Journal of Biomolecular Screening、4、67、(1999)）、本アッセイ系はHTSに十分実用可能であることが分かった（図１１）。本方法をスクリーニング系として用いて血糖降下作用物質のスクリーニングが可能である。
＜実施例２３＞フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）βおよびδ特異的阻害剤を用いた、化合物６によるAktリン酸化に対する阻害活性の測定 フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）βおよびδ特異的阻害剤としてKnightら（Bioorganic & Medicinal Chemistry、12、4749、(2004)）によって報告されたTGX-115を合成した。合成は公開特許（特許文献５：WO01/53266）記載の方法を用いて行った。
脂肪細胞に分化した、分化3T3L1細胞を用い、上記フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）βおよびδ特異的阻害剤（TGX-115）を用いた、化合物６によるAktリン酸化に対する阻害活性の測定を下記の通り行った。3T3L1細胞を1.5x104細胞/dishとなるように、10%ウシ胎児血清（FCS）を含むダルベッコMEM培地を用いて60mm Collagen type I coated dish（IWAKI4010-010）に播種し、37℃、5%CO2存在下で4日間培養後、10μg/ml Insulin(SIGMA I-9278)、1μM Dexamethasone(nacalai tesque109-31)、0.5mM IBMX(WAKO 099-03411)、10%FCSを含むダルベッコMEM培地で2日間培養し、さらに10μg/ml Insulin(SIGMA I-9278)、10% FCSを含むダルベッコMEM培地で2日間培養した後、10%FCSを含むダルベッコMEM培地で4日間培養した細胞を分化3T3L1細胞として用いた。分化3T3L1細胞を4x104細胞/wellとなるように、10%FCSを含むダルベッコMEM培地を用いて96穴プレート（Collagentype I coated plate、IWAKI社、製品番号4860-010)に播種し、約16時間、37℃、5%CO2存在下で培養し、十分に付着させた後、培地を吸引除去し、血清を含まず0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地で、6時間培養した。培地を吸引除去した後、TGX-115を含む0.1%BSA／ダルベッコMEM培地（90μl）を添加し、37℃、5%CO2存在下で15分間の前処理を行った後、さらに化合物６（3mM）を含む0.1%BSA／ダルベッコMEM培地（10μl）を添加し、さらに37℃、5%CO2存在下で10分間の処理を行った。96穴プレートを氷上に置き、培地を吸引除去した後、氷温のリシスバッファー（1mM PMSFを含む）を加え、-80℃で凍結した。リシスバッファーはリン酸化Akt測定キット（Cell Signaling Technologies社、製品番号7160、PathScanR Phospho-Akt1 (Ser473)Sandwich ELISA Kit）に添付のものを、添付文書に従って作成したものを使用した。上記凍結した96穴プレートを室温に戻して抽出液（lysate）を融解した後、上記リン酸化Akt測定キットを用い、添付文書に従ってリン酸化Akt量を測定した。
図１２に示したように、フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）βおよびδ特異的阻害剤（TGX-115）によって化合物６によるAktリン酸化が完全に阻害されたことから、化合物６によるAktリン酸化および糖取り込み作用には、フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）βあるいはδが関与することが強く示唆された。
＜実施例２４＞ Gβ1γ2-Myc存在下におけるフォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）活性に対する化合物の作用の検討
（１）MonoQカラム、ゲルろ過を用いたGβ1γ2-Mycの精製
上記実施例１９（８）記載の通り調製したGβ1とMyc-Gγ2およびGαi1-Hisを発現した凍結昆虫細胞Sf21、2.5x108細胞を、融解後、4mlのLysis Buffer（50mM HEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル（Rosch Diagnostics社、11-697-498-001）、1mM EDTA、100mM NaCl）を用いて細胞をけん濁した後、100000g、20分の遠心を行い、ペレットを得た。さらにこのペレットを2mlのExtraction Buffer（50mM HEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10ｍM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、50mM NaCl、1%コール酸ナトリウム）を用いてけん濁、さらに4℃、１時間の攪拌を行った後、さらに100000G、20分の遠心を行い、その上清を抽出液（2ml）として得た。抽出液（2ml）にBuffer A（50mMHEPES (pH8.0)、3mM MgCl2、10mM 2-メルカプトエタノール、10μM GDP、プロテアーゼインヒビターカクテル、100mM NaCl、0.5% Lubrol）16mlを加えた溶液を作成した。
上記の溶液の半量（10ml）を、MonoQ（直径5mm、長さ100mm、アマシャムバイオサイエンス社）に1ml/分の流速で吸着させた。MonoQはバッファーA（50mM HEPES(pH8.0)、0.2mM2-メルカプトエタノール、0.2%コール酸ナトリウム、90mMNaCl）、バッファーB（50mM HEPES(pH8.0)、0.2mM 2-メルカプトエタノール、0.2%コール酸ナトリウム、1M NaCl）を展開溶液として用い、あらかじめバッファーAで十分平衡化した後、上記溶液の吸着を行った。吸着後、バッファーAを用い、1ml/分で約12分間カラムを洗浄した後、NaCl濃度グラジエント（0〜50%B/20分、50〜100%B/5分、100%B/2分）により溶出を行い、溶出液はグラジエント開始時から1分間ごとにフラクション分取した。各フラクションについて、実施例２１記載の方法（SPA法）を用いた3H標識化合物１の結合活性を測定し、活性の高かったフラクションNo.12〜15を分取し、抗Gβ抗体（Upstate Biotechnologies社、製品番号06-238）を用いたウェスタンブロット法を用いたGβの検出を行い、このフラクションにGβが溶出されていることを確認した。
上記フラクションNo.12〜15について、ゲルろ過クロマトグラフィーを用いてさらなる精製を行った。上記フラクション（4ml）を、Centricon-10を用いた限外ろ過によって約1mlまで濃縮し、Superose6 10/30（直径10mm、長さ300mm、アマシャムバイオサイエンス社）を用いゲルろ過を行った。展開溶媒は40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、2mM 2-メルカプトエタノール、0.2%コール酸ナトリウムよりなるバッファーを用いた。ゲルろ過は流速0.5ml/分で行い、開始直後から２分間ごとにフラクション分取した。各フラクションについて、実施例２１記載の方法（SPA法）を用いた3H標識化合物１の結合活性を測定、および抗Gβ抗体（Upstate社、製品番号06-238）を用いたウェスタンブロット法を行い、フラクションNo.16（以下Fr.16、1ml）に3H標識化合物１の結合活性、およびGβ量が集まることを確認した。このFr.16中のGβ濃度の測定は、同様のウェスタンブロット法を行いた市販のGβγ標品（ウシ脳由来精製品、Calbiochem社、製品番号371768）により、約10μg/mlとし、以下精製Gβ1γ2-Mycと表した。
（２）Gβ1γ2-Myc存在下における各サブタイプ（α、β、γ、δ）フォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）活性に対するN-deacetylcolchicineおよび化合物１の作用の検討
上記（１）で取得した精製Gβ1γ2-Mycを用い、Gβ1γ2-Myc存在下における各サブタイプ（α、β、γ、δ）PI3-kinaseの活性に対する、N-deacetylcolchicineおよび化合物１の作用の検討を、報告されているMaierら（非特許文献４）、Kerchnerら（非特許文献１０）の方法を参考に行った。各サブタイプのPI3-kinaseは、α（PI3Kinase (p110α/p85α), active、Upstate社、製品番号14-602）、β（PI3 Kinase(p110β/p85α), active、Upstate社、製品番号14-603）、γ（PI3KγHis-GST(Phosphoinositide 3-kinase p110γHis/p101GST)human, Recombinant, Sf9 insect cell、JENA Bioscience社、製品番号PR-347S）、δ（PI3 Kinase (p110δ/p85α), active、Upstate社、製品番号14-604）をそれぞれ用いた。また、下記の反応において、バッファーとしてPI3Kバッファー（40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、1mMジチオスレイトール、1mMβグリセロ燐酸、10mM MgCl2、0.1% BSA）を用いた。
フォスファチジルエタノールアミン（0.256μmol）、フォスファチジルセリン（0.24μmol）、フォスファチジルコリン（0.112μmol）、スフィンゴミエリン（0.024μmol）およびファスファチジルイノシトール-[4,5]-２リン酸（0.032μmol）の混合液をアルゴンガスで乾燥させたガラスチューブに、氷温のPI3Kバッファー（0.27ml）を加え、氷中で超音波をかけることにより、リピッドミセル溶液を作成した。このリピッドミセル溶液（125μl）に上記（１）で取得した精製Gβ1γ2-Myc溶液（250μl、10μg/ml）を加え、攪拌した後氷中で10分間静置した。このGβ1γ2-Mycを含むリピッドミセル溶液30μlを、1.5ml容マイクロチューブ分注し、5μlの化合物溶液、5μlの各サブタイプPI3-kinase（α、β、δ：5μg/ml、γ：2.5μg/ml）を順次添加し、さらに室温で10分間静置した。本溶液に32P-γ-ATPを含む40μM ATP溶液（10μl）を加え、反応を開始した。32P-γ-ATPは１反応につき約300kBq添加した。反応は室温で30分間行い、80μlの氷温の1NHClを加えることにより反応を停止した。300μlのクロロホルム:メタノール（1:1）溶液を加え、攪拌することにより脂質を抽出し、有機層を80μlの１N HClで２回洗浄した。残った有機層から溶媒を減圧除去した後、20μlのクロロホルム:メタノール（4:1）溶液に残さを溶解し、あらかじめシュウ酸処理（1%シュウ酸カリウムを含む40%メタノール溶液で十分展開後、終夜乾燥、110℃、30分活性化）したTLCプレート（Merck 社、Kieselgel 60）に全量をスポットし、展開溶媒（酢酸:水:1-プロパノール=4:31:65）を用いて、約4時間TLCを行った。展開後、良く乾燥した後、イメージングプレートを用いて感光、BAS2000（フジフィルム社）を用いてデータを取得した。データの解析は、BAS2000のソフトウェアを用い、ファスファチジルイノシトール-[3,4,5]-３リン酸（PIP3）に対応するスポット部分を、各レーン同じ面積になるように領域を設定し、領域内の放射活性に伴うエネルギー（PSL）を数値化した。
図１３に示したとおり、化合物１（30μM）はPI3-kinaseβに対してのみ顕著な活性化作用を示した一方、N-deacetylcolchicine（DACと略した、30μM）はいずれのサブタイプのPI3-kinaseに対しても活性への影響を与えなかった。
（３）PI3-kinaseβに対する化合物１および化合物６の活性亢進作用の測定
上記（２）の結果に基づき、化合物１によるPI3-kinaseβの活性化がGβ（Gβ1γ2-Myc）依存的なものであるかどうか、さらに化合物１以外のGβ結合物質でも同様の活性化が見られるかを確かめるため、さらに下記の検討を行った。
上記（２）の方法と同様にリピッドミセル溶液を作成し、このリピッドミセル溶液（100μl）に上記（１）で取得した精製Gβ1γ2-Myc溶液（200μl、10μg/ml）あるいはGβ1γ2-Mycを含まない同じバッファー（100μl）を加えたものを氷中で10分間静置した。このGβ1γ2-Mycを含む／含まないリピッドミセル溶液30μlを、1.5ml容マイクロチューブ分注し、5μlの化合物溶液、5μlのPI3-kinaseβ（5μg/ml）を順次添加し、さらに室温で10分間静置した。本溶液に32P-γ-ATPを含む40μMATP溶液（10μl）を加え、反応を開始した。32P-γ-ATPは１反応につき約370kBq添加した。反応は室温で15分間行い、以下（２）と同様に操作を行い、生成したPIP3量を測定した。
図１４に示したとおり、化合物１はPI3-kinaseβに対し、Gβ（Gβ1γ2-Myc）非存在下では全く影響を与えなかったが、Gβ（Gβ1γ2-Myc）存在下において濃度依存的（0.1、１、10μM）な顕著な酵素活性亢進作用を示した。また、化合物６も同様にGβ（Gβ1γ2-Myc）存在下における濃度依存的（100μM、1mM）な顕著な酵素活性亢進作用を示したことから、実施例２０、実施例２２でGβに対する結合が検出された化合物はいずれも同様のGβ存在下におけるPI3-kinaseβの活性亢進作用を有し、その結果、その結合の強さに応じた実施例１１に示した糖取り込み活性、実施例１３に示したAktリン酸化活性を示すのものと考えられた。
なお上記において、化合物１、化合物6を適当な被検物質に替えて酵素活性亢進作用を検出することにより、血糖降下作用物質のスクリーニングを行うことが可能である。
＜実施例２５＞ Gβ1γ2-Mycのフォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）β結合に対する化合物１、化合物６の作用の検討
1.5ml容マイクロチューブにPI3Kバッファー（40mM HEPES-Na (pH7.4)、120mM NaCl、1mM EGTA、1mMジチオスレイトール、1mMβグリセロ燐酸、10mM MgCl2、0.1% BSA）中（300μl）に、実施例２０（１）で取得したGβ1γ2-Myc,200ng、PI3-kinaseβ（PI3 Kinase (p110β/p85α), active、Upstate社、製品番号14-603）160ng、被検物質を加え、室温で30分間静置した。これに抗cMyc抗体（9E10、200μg/ml、SantaCruz社、製品番号sc-40）溶液（10μl）を加え、さらに室温で2時間静置した。この溶液に、同バッファーで洗浄した抗マウスIgGアガロースビーズ（American Qualex社、製品番号61060）25μlを加え、室温で1時間攪拌混合した後、遠心（10000rpm、1分）により上清を除き、さらに0.5mlの同バッファーで３回、ビーズの洗浄を行った。ビーズはSDSを含むバッファーで煮沸溶出し、SDSポリアクリルアミド電気泳動後、抗p110β抗体（SantaCruz社、製品番号sc-602）および抗Gβ抗体（SantaCruz社、製品番号sc-261）を用いたウェスタンブロット法により、ビーズに吸着したp110β量、およびGβ量を測定した。
図１５に示したように、抗cMyc抗体に直接結合するGβの含量はいずれもほぼ等しいのに対し、p110βは化合物１および化合物６の存在により含量の上昇が見られ、化合物１および化合物６によってGβとp110β（PI3-kinaseβ）の結合が亢進されることが確かめられた。また、上記実施例２０（２）で示した、Gβ1γ2-Myc存在下でのPI3-kinaseβに対する活性亢進作用が同等である化合物１（0.1μM）と化合物６（1mM）で、ほぼ同等のGβとp110β（PI3-kinaseβ）との結合が亢進が見られたことから、両化合物のGβとp110β（PI3-kinaseβ）の結合亢進によって、Gβ1γ2-Myc存在下でのPI3-kinaseβ活性亢進が起こることが示唆された。
なお上記において、化合物１、化合物6を適当な被検物質に替えてGβとp110β（PI3-kinaseβ）の結合亢進作用を検出することにより、血糖降下作用物質のスクリーニングを行うことが可能である。
＜実施例２６＞ Gβ発現抑制細胞に対するAktリン酸化活性の評価
ヒト肝臓由来HLF細胞の化合物６によるAktリン酸化活性に対する、siRNA法を用いたGβの発現抑制の効果の評価を下記の通り行った。
HLF細胞を3.75x104/wellとなるように、10%FCSを含むダルベッコMEM培地を用いて、24well dish（IWAKI、製品番号3820-024)に播種し、37℃、5%CO2存在下で6時間培養し、細胞を十分に付着させた後、「ネガティブコントロールsiRNA」（Sense:UUCUCCGAACGUGUCACGU
dTdT（配列番号：３７）、Antisense:ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT（配列番号：３８）、キアゲン社、製品番号1027310）、または、Gβ1 siRNA（Sense:GAUCAUUGUUGCACACAAAdTdT（配列番号：３９）、Antisense:UUUGUGUGCAACAAUGAUCdTdG（配列番号：４０）、キアゲン社、製品番号SI00428841）およびGβ2 siRNA（Sense:GCCAUGAAUCCGACAUCAAdTdT（配列番号：４１）、Antisense:UUGAUGUCGGAUUCAUGGCdCdG（配列番号：４２）、キアゲン社、製品番号SI00428848）およびGβ4 siRNA（Sense:CCUUAUAUUUGCAGGUGAAdTdT（配列番号：４３）、Antisense:UUCACCUGCAAAUAUAAGGdTdA（配列番号：４４）、キアゲン社、製品番号SI00130746）を等量ずつ含む「Gβ siRNA」用い、Dharmafect2（Dharmacon社、製品番号T-2002-02）を用いてそれぞれ100nMの濃度でsiRNAの細胞内導入を行い、37℃、5%CO2存在下で48時間培養した。siRNA導入48時間後に10%FCSを含むダルベッコMEM培地0.5mlに置換し、さらに37℃、5%CO2存在下で20時間培養した後、0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地0.5mlに置換し、37℃、5%CO2存在下で4時間培養した後、化合物６および0.1%BSAを含むダルベッコMEM培地0.5mlに置換し、37℃、5%CO2存在下で20分間の処理を行った。その後、0.5ml PBSを用いて洗浄し、リシスバッファー（Cell Signaling Technologies社、製品番号9803、1mM PMSFを含む）100μlにけん濁し、超音波破砕した後、遠心（14000rpm、10分間）を行うことによって上清を抽出液として得た。プロテインアッセイ（BioRad社、製品番号500-0006）を用い、BSAを標品とした蛋白質定量を行い、それぞれの抽出液の蛋白質濃度が同等になるように調整した。SDSポリアクリルアミド電気泳動後、抗リン酸化Akt抗体（Cell Signaling Technologies社、製品番号9271）、および抗Gβ1抗体（SantaCruz社、製品番号sc-379）および抗Gβ2抗体（SantaCruz社、製品番号sc-380）および抗Gβ4抗体（SantaCruz社、製品番号sc-382）を用いたウェスタンブロット法により、リン酸化Akt量およびGβ1量およびGβ2量およびGβ4量を測定した。図16に示したように、「ネガティブコントロールsiRNA」を導入した場合、化合物６濃度依存的にリン酸化Akt量が上昇するのに対し、「GβsiRNA」を導入し、Gβの発現が抑制された場合では、化合物６のいずれの濃度においてもリン酸化Akt は検出されなかった。以上より、化合物６によるAktリン酸化はGβを介していることが明らかとなった。
＜実施例２７＞Gβ1γ2-His存在下におけるフォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）β活性化を用いた血糖降下物質のスクリーニング法
（１）G蛋白質βγ（Gβ1γ2-His）の調製
昆虫細胞を用いたGβ1の発現系の構築は実施例１９（２）に示した通りに行った。昆虫細胞を用いた6xHis-Gγ2の発現系の構築は以下のように行った。
配列番号４５及び４６の合成DNAをプライマーとし、ヒトGγ2の全蛋白コード領域を含むcDNAクローンをテンプレートとして定法によりPCR反応を行った。得られた0.3kbpのDNAを、ベクターpCR4Blunt-TOPO（インビトロジェン社、Cat No.K2875）にサブクローニングした後、配列番号４７で示した塩基配列（配列番号４８はアミノ酸配列を示す）を確認し、さらに制限酵素EcoRI、XhoIで切断し、Bac-to-Bacバキュロウイルス発現システム（インビトロジェン社、Cat No.10359-016）のベクターpFastBac1の同制限酵素部位に挿入し、pFB1-6xHis-GNG2を作成した。さらに添付マニュアルに従い、形質転換した大腸菌DH10Bac株の培養液からバクミドDNAを調製した。このバクミドDNAをカイコ細胞Sf-21株にリポフェクション法により遺伝子導入を行い、6xHis-Gγ2蛋白を発現する組換えウイルスを取得した。マニュアルに従いウイルスは更にSf-21細胞に感染させることにより組換え蛋白を必要な量を確保しうるウイルス力価まで増加させた。目的の組換え蛋白の発現はウイルス感染細胞ライゼートについて6xHisタグ配列特異的抗体を用いたウェスタンブロット法により確認した。
昆虫細胞を用いたGβ1γ2-Hisの生産は以下の方法で行った。昆虫細胞Sf21株を用いたGβ1γ2-His蛋白質の発現、生産は、上記記載のGβ1、およびGγ1-His遺伝子を含むバクミドDNAを用い、Bac-to-Bacバキュロウイルス蛋白発現システム（インビトロジェン社、製品番号10359-016）添付のマニュアル（Instruction Manual）記載の方法に従って行った。具体的には、Gβ1、およびGγ1-His遺伝子を含むバキュロウイルスそれぞれMOI=2以上となるように、250ml容の三角フラスコを用い、108細胞/100mlのSF900IISFM培地（Invitrogen社、製品番号10902-096）中で、65時間、28℃で振とう培養を行った。培養後、遠心（1000rpm、5分）により細胞を回収し、Insect Cell PBS（7.3mM NaH2PO4(pH6.2)、58mM KCl、47mM NaCl、5mM CaCl2）で洗浄した後、さらに遠心（1000rpm、5分）によって細胞を回収し凍結保存した。
Gβ1γ2-Hisの調製は以下のように行った。上記のように得た2.5x108細胞を、10ml Lysis Buffer（20mM HEPES (pH8.0)、150mM NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、プロテアーゼインヒビターカクテル（RoschDiagnostics社、11-697-498-001）、1mMEDTA）を用いて細胞をけん濁した後、超音波破砕し、2600G、10分の遠心を行い、上清12mlを得た。上清に5％ Lubrol 3mlを加え、1％Lubrolとし、4℃、1時間の攪拌を行った後、100000G、20分の遠心を行い、その上清を抽出液（15ml)として得た。抽出液を500μlのNi-NTA agarose（QIAGEN社、製品番号30210）カラムに通し、1% Lubrol を含むlysis Buffer 1mlで洗浄した後、洗浄バッファー１（2ml）（20mM HEPES(pH8.0)、0.4M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.5％ Lubrol、0.15% コール酸ナトリウム、10mM イミダゾール）、洗浄バッファー2（2ml）（20mM HEPES(pH8.0)、0.1M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.25％ Lubrol、0.3%コール酸ナトリウム、10mMイミダゾール）、洗浄バッファー３(1ml)（20mM HEPES(pH8.0)、0.1M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、0.5%コール酸ナトリウム、10mM イミダゾール）で洗浄後、溶出バッファー（1ml）（20mM HEPES (pH8.0)、0.01M NaCl、5mM 2-メルカプトエタノール、1％ コール酸ナトリウム、50mM イミダゾール）を用いて溶出を行った。この溶出液をGβ1γ2-His溶液とした。Gβ1γ2-His蛋白質の濃度の測定は、ウェスタンブロット法を行いた市販のGβγ標品（ウシ脳由来精製品、Calbiochem社、製品番号371768）との比較により、約100μg/mlとし、以下精製Gβ1γ2-Hisと表した。
（２）Gβ1γ2-His存在下におけるフォスフォイノシタイド３−キナーゼ（PI3-kinase）β活性化アッセイ
実施例２４記載（２）の方法に従ってリピッドミセル溶液を作成し、上記（１）で調製したGβ1γ2-Hisを13.3μg/mlの濃度になるように加え、氷上で10分間静置した。本溶液30μlに、化合物１および６を含む溶液5μl、PI3-kinaseβ（5μg/ml）5μlを順次加え、33P-γ-ATPを含む40μMATP溶液10μlを加え、室温で2時間反応を行った。反応後80μlの１N HCｌを加えて反応を停止し、300μlのクロロホルム：メタノール（1:1）で脂質の抽出を行い、80μlの１N HCｌで２回洗浄した後、有機層を10mlの液体シンチレーター（Hionic Fluor）を加えて液体シンチレーションカウンターで33Pを測定した。
図１７に示したように、化合物非添加に対し、化合物１（0.1μM、10μM）、化合物６（100μM）を加えたものは明らかなPI3-kinaseの活性上昇が認められ、本方法がスクリーニング系として実施可能であることが明らかとなった。
すなわち、本方法をスクリーニング系として用い、血糖降下作用物質のスクリーニングが可能であることが明らかとなった。
本発明によれば、血糖降下作用を有する化合物または糖尿病治療薬、そのような化合物または糖尿病治療薬のスクリーニング方法、そのスクリーニング方法で用いることのできるプローブ化合物などを提供することができる。

Claims (6)

  1. 一般式（Ｉ）で示される化合物またはその製薬学的に許容される塩。
    ｛式中、Ａ及びBは同一または異なってもよく、それぞれ独立して置換基を有してもよい芳香環、置換基を有してもよい複素環、または置換基を有してもよい脂肪族環を示し、Ｒ1は、置換基を１〜３個有してもよい、低級アルキル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基または低級アルコキシ基を示し、−Ｘ−及び−Ｙ−は同一または異なってもよく、それぞれ独立して水素原子、−Ｏ−、−ＮＲ2−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、−ＣＨ2−、−ＣＲ3Ｒ4−、−ＣＯＯ−、−ＣＯＮＲ2−または−ＣＯ−（式中Ｒ2は水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示し、Ｒ3及びＲ4は同一または異なってもよく、それぞれ独立して、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、またはトリフルオロメチル基を示す）を示し、−Ｗ−は、置換基を有してもよい炭素数１〜２０のアルキル鎖であり、その炭素原子の１〜１０個は−Ｏ−、−ＮＲ5−、−Ｓ−、−ＳＯ−、−ＳＯ2−、または−ＣＯ−で置き換えられていてもよく（式中Ｒ5は、水素原子、置換基を有してもよい低級アルキル基、置換基を有してもよいアシル基、置換基を有してもよいアルコキシカルボニル基、置換基を有してもよいカルバモイル基、または置換基を有してもよいスルホニル基を示す）、Ｑは、水素原子、ビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、酵素、固相、ジアゾ基、またはアジド基を示す。また、式中１つ以上の原子が放射性同位元素であってもよい。但し、
    i) 置換基を有してもよい場合の置換基とは、ハロゲン原子、水酸基、アルキル基、メルカプト基、アルコキシ基、アルキルチオ基、アルキルスルホニル基、アシル基、アシルオキシ基、アミノ基、アルキルアミノ基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、カルバモイル基、ニトロ基、シアノ基、トリフルオロメチル基、アリール基、ヘテロアリール基、ジアゾ基、及びアジド基からなる群から選ばれ、また、これらの置換基はビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されてもよく、
    ii) −Ｘ−が水素原子である場合は、−Ｗ−、−Ｙ―、または、Ｑをすべて有さず、
    iii) −Y−が水素原子である場合は、Qを有さない。
    さらに、一般式（Ｉ）中、以下a)からc)のいずれかの条件が満たされる。
    a) Ｘ-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である；
    b) Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑがジアゾ基、またはアジド基である；
    c) Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑが固相である。｝
  2. Ｘ-及び-Y-が共に水素原子以外であり、Qがビオチン、発蛍光団、発色団、化学発光官能基、または酵素である、請求項１に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
  3. 置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、請求項２記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
  4. -Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑがジアゾ基、またはアジド基である、請求項１に記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
  5. 置換基を有してもよい場合の置換基がビオチン標識、発蛍光団標識、発色団標識、化学発光標識、あるいは酵素標識されていない、請求項４記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
  6. -Ｘ-及び-Ｙ-が共に水素原子以外であり、Ｑが固相である、請求項１記載の化合物またはその製薬学的に許容される塩。
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