JP5798356B2 - New influenza vaccine stabilizer - Google Patents
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Description
本願発明は、新規なインフルエンザウイルスワクチン、その調製方法、および予防または治療におけるその使用に関する。また、本願発明は、新規なインフルエンザウイルス抗原の安定化剤、またはその調整方法及び使用方法に関する。さらに詳しくは、水溶性の亜鉛化合物を含有するインフルエンザウイルスワクチン及びインフルエンザウイルス抗原の安定化剤に関する。 The present invention relates to a novel influenza virus vaccine, a method for its preparation, and its use in prevention or treatment. The present invention also relates to a novel influenza virus antigen stabilizer, or a method for preparing and using the same. More specifically, the present invention relates to an influenza virus vaccine containing a water-soluble zinc compound and an influenza virus antigen stabilizer.
インフルエンザウイルスは、世界中に存在する最も遍在的なウイルスの１つであり、ヒトと家畜の両方に影響を及ぼすため、その経済的影響は顕著である。一般的なインフルエンザワクチンは、抗原性の異なる3種類のインフルエンザウイルス株由来の抗原調整物が混合された3価ワクチンである。一般的には、当該ワクチンは２種のA型インフルエンザウイルス株（H1N1亜型及びH3N2亜型）および１種のインフルエンザB型株に由来する抗原調整物を含有する。多くの場合、標準的な0.5mL注射用量には、一元放射状免疫拡散法(single-radial-immunodiffusion:SRD)により測定したときに各株に由来する15μgのヘマグルチニン（HA）抗原成分が含まれる。 Influenza virus is one of the most ubiquitous viruses in the world and affects both humans and livestock, so its economic impact is significant. A general influenza vaccine is a trivalent vaccine in which antigen preparations derived from three types of influenza virus strains having different antigenicities are mixed. In general, the vaccine contains antigen preparations derived from two influenza A virus strains (H1N1 subtype and H3N2 subtype) and one influenza B strain. In many cases, a standard 0.5 mL injection dose contains 15 μg of hemagglutinin (HA) antigen component from each strain as measured by single-radial-immunodiffusion (SRD).
現在利用可能なインフルエンザワクチンは、ワクチン組成物中のウイルス活性に応じて、不活化インフルエンザワクチンまたは生の弱毒化インフルエンザワクチンへ分類される。さらに、不活化インフルエンザワクチンは、抗原調製物の形態に応じて3種類へ分類され、（1）ホルマリン等にて不活化された全粒子ウイルス、（2）脂質エンベロープを可溶化させるように精製ウイルス粒子が界面活性剤もしくは他の試薬で破砕されたサブビリオン（いわゆるウイルス成分ワクチン；splitvaccine）、または（3）精製HAおよびNA(サブユニットワクチン）から構成される。 Currently available influenza vaccines are classified as inactivated or live attenuated influenza vaccines, depending on the viral activity in the vaccine composition. Furthermore, inactivated influenza vaccines are classified into three types according to the form of the antigen preparation: (1) whole particle virus inactivated with formalin, etc., (2) purified virus solubilized lipid envelope The particles are composed of subvirions (so-called virus component vaccines; splitvaccine), or (3) purified HA and NA (subunit vaccines), which are disrupted with a surfactant or other reagent.
現在市販のインフルエンザワクチンは、ウイルス成分ワクチンまたはサブユニットワクチンのいずれかである。これらのワクチンは、一般的には有機溶媒または界面活性剤を用いて、ウイルス粒子を破砕し、さまざまな程度までウイルスタンパク質を分離または精製することにより調製される。ウイルス成分ワクチンは、可溶化濃度の有機溶媒または界面活性剤を用いて、感染性または不活化全粒子インフルエンザウイルスを断片化してから、可溶化剤とウイルス脂質物質を除去することにより、調製される。ウイルス成分ワクチンは、一般的には、夾雑マトリックスタンパク質および核タンパク質ならびに時として脂質や膜エンベロープタンパク質を含有する。ウイルス成分ワクチンは、通常、ウイルス構造タンパク質のほとんどまたは全てを含有するであろうが、全ウイルスで見られる比率と必ずしも同じ比率で含有するわけではない。一方、サブユニットワクチンは、本質的には、高精製されたウイルス表面タンパク質、すなわち、ヘマグルチニン（HA）、およびノイラミニダーゼ（NA）からなり、これらのタンパク質はワクチン接種時に所望のウイルス中和抗体を誘導する働きを担う。 Currently marketed influenza vaccines are either viral component vaccines or subunit vaccines. These vaccines are generally prepared by crushing viral particles and separating or purifying viral proteins to varying degrees, using organic solvents or surfactants. Viral component vaccines are prepared by fragmenting infectious or inactivated whole-particulate influenza virus using a solubilizing concentration of organic solvent or surfactant and then removing the solubilizer and viral lipid material. . Viral component vaccines generally contain contaminating matrix proteins and nucleoproteins, and sometimes lipids and membrane envelope proteins. Viral component vaccines will usually contain most or all of the viral structural proteins, but not necessarily in the same proportions found in all viruses. On the other hand, subunit vaccines consist essentially of highly purified viral surface proteins, namely hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA), which induce the desired virus neutralizing antibodies upon vaccination. Take the role of doing.
現在では、市販の不活化インフルエンザワクチンの精製・製剤化工程にて、安定化剤を用いることが標準的な手法となっている。インフルエンザウイルスはステロール含量が高く、一般的には安定なウイルス粒子を形成するが、上述のようにウイルスを破砕し、感染防御抗原を精製・分取した場合、保存期間中に力価の低下等を生じるため、ワクチンの効力を安定に保つことは必ずしも容易ではない。 At present, it is standard practice to use stabilizers in the purification and formulation process of commercially available inactivated influenza vaccines. Influenza virus has a high sterol content and generally forms stable virus particles. However, when the virus is disrupted and the protective antigen is purified and collected as described above, the titer decreases during the storage period, etc. Therefore, it is not always easy to keep the vaccine efficacy stable.
そのため、インフルエンザワクチンの添加剤に関する研究が活発に行なわれている。
α−トコフェロールコハク酸と界面活性剤を用いたミセル形成により、不活化インフルエンザウイルスワクチンのHA抗原を安定化させる報告がある(特許文献１：特表2004-527264)。
疎水性アミノ酸、アルギニン及びその酸付加塩を含む水溶液を用いて、インフルエンザウイルスの凍結乾燥製剤を安定化させる報告がある(特許文献２：WO2008/111532)。
ゼラチンを含むインフルエンザワクチンが報告されている（特許文献３：特表2003-513988）。
安定なオイル・イン・ウォーターエマルションを含むアジュバント組成物であって、組成物に安定化剤（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）およびインフルエンザウイルス抗原をさらに含ませる点が報告されている(特許文献４：特表2002-504106）。
バルク免疫活性剤を提供するステップと、前記バルク免疫活性剤を接線流入濾過に供して免疫活性剤溶液を提供するステップと、少なくとも１つの賦形剤を前記免疫活性剤溶液に加えるステップと、前記免疫活性剤溶液を噴霧乾燥して免疫活性剤生成物を形成するステップとを含む、免疫活性剤の配合方法が報告されている（特許文献５：特表2008-507590）。該特許文献には、免疫活性剤はインフルエンザワクチンを含む点、免疫活性剤溶液は、非還元糖、多糖類、還元糖、及びシクロデキストリンからなる群から選択された安定化剤をさらに含む点が開示されている。
インフルエンザウイルスのような弱毒生ウイルス、および安定化剤を含む組成物であって、安定化剤として、アミノ酸、二糖類、多価アルコールならびに緩衝液が報告されている(特許文献６：特表2000-502672)。
For this reason, research on additives for influenza vaccines has been actively conducted.
There is a report of stabilizing the HA antigen of an inactivated influenza virus vaccine by micelle formation using α-tocopherol succinic acid and a surfactant (Patent Document 1: Special Table 2004-527264).
There is a report that stabilizes a freeze-dried preparation of influenza virus using an aqueous solution containing a hydrophobic amino acid, arginine and an acid addition salt thereof (Patent Document 2: WO2008 / 111532).
An influenza vaccine containing gelatin has been reported (Patent Document 3: Special Table 2003-513988).
It has been reported that an adjuvant composition containing a stable oil-in-water emulsion further comprising a stabilizer (for example, polyoxyethylene sorbitan monooleate) and an influenza virus antigen in the composition (Patent Literature) 4: Special Table 2002-504106).
Providing a bulk immunoactive agent; subjecting the bulk immunoactive agent to tangential inflow filtration to provide an immunoactive agent solution; adding at least one excipient to the immunoactive agent solution; A method of blending an immunoactive agent has been reported, which comprises the step of spray-drying an immunoactive agent solution to form an immunoactive agent product (Patent Document 5: Special Table 2008-507590). In the patent document, the immunoactive agent includes an influenza vaccine, and the immunoactive agent solution further includes a stabilizer selected from the group consisting of non-reducing sugars, polysaccharides, reducing sugars, and cyclodextrins. It is disclosed.
A composition comprising a live attenuated virus such as an influenza virus and a stabilizer, and amino acids, disaccharides, polyhydric alcohols and buffers have been reported as stabilizers (Patent Document 6: Special Table 2000). -502672).
一方、従来から亜鉛化合物はアジュバント用途の目的でワクチンへ添加されており、亜鉛塩を添加したポリオ混合ワクチン（特許文献７：特表2010-502679）、亜鉛化合物を含有するパラインフルエンザウイルスワクチン（特許文献８：特表平11-513372）が報告されている。 On the other hand, zinc compounds have been conventionally added to vaccines for the purpose of adjuvant use. Polio mixed vaccines with added zinc salts (Patent Document 7: Special Table 2010-502679), parainfluenza virus vaccines containing zinc compounds (patents) Reference 8: JP-T 11-513372) has been reported.
特に、亜鉛化合物を含むインフルエンザワクチンとしては、以下の報告がある。
金属塩粒子上に吸着された免疫活性剤を含むアジュバント組成物へ抗原（インフルエンザウイルス抗原など）を混同したワクチン組成物が報告されている。（特許文献９：特表2003-519084）。該特許文献において、金属塩粒子はアルミニウムや亜鉛等の塩を含み、免疫刺激剤が金属塩粒子上に吸着された状態とある。しかしながら、該特許文献では、金属塩として水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウムしか実施されておらず、亜鉛塩のアジュバント効果は示されていない。
また、生物適合性の親水性ポリマー、薬剤、及びワクチンを含む微小球、ならびに前記微小球と生物適合担体との懸濁液が報告されている(特許文献１０：特表2003-528130）。該特許文献では、生物適合担体はナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、およびアンモニウムからなる群より選択される陽イオンの塩であって、懸濁液に約0.01M〜約5Mで含ませる点が開示されている。
さらに、生理活性物質、陰イオン性のカルボキシル基または硫酸基を有する多糖類、および二価または多価の金属カチオンの塩を含む固体薬学的組成物が報告されている（特許文献１１：特表2007-504129）。該特許文献において固体薬学的組成物はワクチンを含み、金属カチオンが亜鉛を含む点が開示されている。当該文献において、非常に低い溶解性の金属イオンの塩を用いることで、処方物粒子の表面上のポリマーを架橋またはゲル化させ、薬物送達に効果的なインサイチュゲルを形成させている。実施例では、０.００１９％から０．５％の範囲の濃度で塩化亜鉛を使用し、ゲルを形成する濃度として０．０１５６％以上である点が開示されている。
In particular, there are the following reports as influenza vaccines containing zinc compounds.
A vaccine composition in which an antigen (such as influenza virus antigen) is confused with an adjuvant composition containing an immunoactive agent adsorbed on metal salt particles has been reported. (Patent Document 9: Special Table 2003-519084). In this patent document, the metal salt particles include a salt such as aluminum or zinc, and the immunostimulant is in a state of being adsorbed on the metal salt particles. However, in this patent document, only aluminum hydroxide or aluminum phosphate is carried out as a metal salt, and the adjuvant effect of zinc salt is not shown.
In addition, microspheres containing biocompatible hydrophilic polymers, drugs, and vaccines, and suspensions of the microspheres and biocompatible carriers have been reported (Patent Document 10: JP 2003-528130). In the patent document, the biocompatible carrier is a salt of a cation selected from the group consisting of sodium, potassium, calcium, magnesium, iron, zinc, and ammonium, and is included in the suspension at about 0.01M to about 5M. The points to be disclosed are disclosed.
Furthermore, a solid pharmaceutical composition containing a physiologically active substance, a polysaccharide having an anionic carboxyl group or sulfate group, and a salt of a divalent or polyvalent metal cation has been reported (Patent Document 11: Special Table) 2007-504129). The patent document discloses that the solid pharmaceutical composition contains a vaccine and the metal cation contains zinc. In the literature, very low solubility metal ion salts are used to crosslink or gel the polymer on the surface of the formulation particles to form an in situ gel effective for drug delivery. In Examples, it is disclosed that zinc chloride is used at a concentration in the range of 0.0019% to 0.5%, and the concentration to form a gel is 0.0156% or more.
しかしながら、亜鉛化合物によるインフルエンザウイルス抗原の安定化効果、当該効果を利用した安定化したインフルエンザウイルス抗原を含有するワクチン、当該ワクチンの製造方法は報告されていない。 However, there are no reports on the stabilizing effect of influenza virus antigens by zinc compounds, vaccines containing stabilized influenza virus antigens utilizing the effects, and methods for producing the vaccines.
従来、数人分の量が入ったワクチンではバイアルに何回か注射針を刺すため、細菌・真菌の混入を防ぐための保存剤としてチメロサールが使用されてきた。しかしながら、インフルエンザワクチンなどの保存剤として使用されているチメロサールは、公衆的に神経系の発達に関する危険性が懸念されている。そのため、製造プロセスにおいてチメロルサールを使用しないでワクチンを製造する方法を見出すことが被接種者にとって有益であると考えられる。 Conventionally, in a vaccine containing several doses, thimerosal has been used as a preservative to prevent contamination with bacteria and fungi because the needle is inserted into the vial several times. However, thimerosal, which is used as a preservative for influenza vaccines, is publicly concerned about the dangers associated with nervous system development. Therefore, it would be beneficial for the recipient to find a way to produce a vaccine without using thimerolsar in the manufacturing process.
また、インフルエンザワクチンに製造に使用されるワクチン株は毎年世界保健機構から推奨されたものをもとに、厚生労働省により決定される。そのため、毎年ワクチン製造株が変更される場合や、ワクチン製造株と抗原性が若干異なる株が流行する可能性もある。そのため、理想としては、様々な種類のインフルエンザウイルスによって製造されたワクチン原液を一度に大量生産した後にストックしておき、毎年の流行株に最適なワクチンを臨機応変に製造することや、ワクチン製造株が実際の流行株と異なる場合であっても、ワクチン原液を保管しておいて、翌年以降の製造に使用することが考えられる。しかしながら、多くのワクチン原液は1年程度しか抗原の安定性を担保できていない現状にある。そのため、流行株と異なるワクチン株で製造したワクチン原液は、場合によっては破棄される事態も想定される。すなわち、ワクチン原液における抗原の安定性が足枷となって、ワクチン原液の破棄などの製造資源の浪費を招いている現状にある。 In addition, the vaccine strains used for manufacturing influenza vaccines are determined by the Ministry of Health, Labor and Welfare based on what is recommended by the World Health Organization every year. Therefore, when a vaccine manufacturing strain is changed every year, or a strain slightly different in antigenicity from a vaccine manufacturing strain may be prevalent. Therefore, ideally, vaccine stock solutions manufactured by various types of influenza viruses are stocked after mass production at the same time, and the optimal vaccine for the epidemic strain of each year can be manufactured flexibly, or the vaccine manufacturing strain Even if it is different from the actual epidemic strain, it is conceivable to store the vaccine stock solution and use it for production in the following year. However, many vaccine stock solutions have been able to ensure the stability of the antigen for only about one year. Therefore, it is assumed that the vaccine stock solution manufactured with a vaccine strain different from the epidemic strain may be discarded in some cases. In other words, the stability of the antigen in the vaccine stock solution has become a hindrance, leading to waste of manufacturing resources such as discarding the vaccine stock solution.
その一方で、インフルエンザワクチンにおけるチメロサールは、保存剤としての役割以外にもヘマグルチニン（HA）抗原を安定化させる役割が公知である（特許文献１）。従って、インフルエンザワクチンからチメロサールを除去するか、または少なくとも最終ワクチン中のチメロサール濃度を低減させることが人体への安全性の観点から望ましいが、チメロサールを使用しない場合にはHA抗原の安定性が低下する懸念がある。特に新型インフルエンザの場合、複数年にわたって流行が繰り返される場合が通例であり、その際に流行発生のない時期に製造備蓄を行っておくことは重要で、安定剤の必要性は高い。また、H5N1亜型の場合、フルパンデミックワクチンとしてのワクチン原液備蓄が各国で進められている。この場合は、３から５年の長期にわたって安定性を確保する必要がある。 On the other hand, thimerosal in influenza vaccine is known to have a role of stabilizing hemagglutinin (HA) antigen in addition to a role as a preservative (Patent Document 1). Therefore, it is desirable to remove thimerosal from the influenza vaccine, or at least reduce the thimerosal concentration in the final vaccine from the viewpoint of safety to the human body, but the stability of the HA antigen is reduced when thimerosal is not used There are concerns. In particular, in the case of the new influenza, it is usual that the epidemic is repeated over several years, and at that time it is important to stockpile manufacturing at a time when the epidemic does not occur, and the need for stabilizers is high. In addition, in the case of H5N1 subtype, storage of vaccine stock solutions as a full pandemic vaccine is being promoted in each country. In this case, it is necessary to ensure stability over a long period of 3 to 5 years.
したがって、人体への安全性が考慮されると共に、従来のワクチンやワクチン原液と比べて同等ないしそれ以上に抗原の安定性を担保させる方法、当該方法を利用したワクチン、ワクチン原液、及び抗原の安定化剤を提供することが課題である。 Therefore, safety to the human body is taken into account, and a method for ensuring the stability of the antigen to the same level or higher than that of conventional vaccines and vaccine stock solutions, vaccines using the method, vaccine stock solutions, and antigen stability The challenge is to provide an agent.
上記の課題を克服するために、本願発明者らが鋭意検討した結果、亜鉛化合物が従来の報告にない、インフルエンザウイルス抗原の安定化効果を奏する点を見出した。すなわち、本願発明は以下に示すとおりである。
［１］インフルエンザウイルス抗原、及び亜鉛化合物を含むインフルエンザウイルスワクチン。
［２］前記亜鉛化合物が、水溶性の亜鉛化合物である、［１］に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
［３］前記亜鉛化合物が、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛からなる群より選ばれた１ないし２以上の化合物を含む、［１］又は［２］に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
［４］前記ワクチンが、液状のワクチンである、［１］から［３］のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
［５］前記亜鉛化合物が、１ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの濃度である、［１］から［４］のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
［６］前記ワクチンが、チメロサールを実質的に含有しない［１］から［５］のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
［７］さらに、ホルマリン、フェノキシエタノール、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸２水素ナトリウムからなる群から選ばれた１ないし２以上の化合物を含む［１］から［６］のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスワクチン。
［８］［１］から［７］のいずれか一項に記載のインフルエンザウイルスワクチンの製造方法。
［９］インフルエンザウイルス抗原、及び亜鉛化合物を含むワクチン原液。
［１０］前記亜鉛化合物が、水溶性の亜鉛化合物である、［９］に記載のワクチン原液。
［１１］前記亜鉛化合物が、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛からなる群より選ばれた１ないし２以上の化合物を含む、［９］又は［１０］に記載のワクチン原液。
［１２］前記ワクチン原液が、液状のワクチン原液である、［９］から［１１］のいずれか一項に記載のワクチン原液。
［１３］前記亜鉛化合物が、１ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの濃度である、［９］から［１２］のいずれか一項に記載のワクチン原液。
［１４］前記ワクチン原液が、チメロサールを実質的に含有しない［９］から［１３］のいずれか一項に記載のワクチン原液。
［１５］さらに、ホルマリン、フェノキシエタノール、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸２水素ナトリウムからなる群から選ばれた１ないし２以上の化合物を含む［９］から［１４］のいずれか一項に記載のワクチン原液。
［１６］［９］から［１５］のいずれか一項に記載のワクチン原液の製造方法。
［１７］亜鉛化合物を含むインフルエンザウイルス抗原用の安定化剤。
［１８］前記亜鉛化合物が水溶性の亜鉛化合物である、［１７］に記載の安定化剤。
［１９］前記亜鉛化合物が、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛からなる群より選ばれた１ないし２以上の化合物を含む、［１７］又は［１８］に記載の安定化剤。
［２０］前記亜鉛化合物が、１ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの濃度である、［１７］から［１９］のいずれか一項に記載の安定化剤。
［２１］さらに、ホルマリン、フェノキシエタノール、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸２水素ナトリウムからなる群から選ばれた１ないし２以上の化合物を含む［１７］から［２０］のいずれか一項に記載の安定化剤。
［２２］［１７］から［２１］のいずれか一項に記載の安定化剤の製造方法。
［２３］インフルエンザウイルス抗原、及び亜鉛化合物を混合するインフルエンザウイルス抗原の安定化方法。
［２４］前記亜鉛化合物が水溶性の亜鉛化合物である、［２３］に記載の安定化方法。
［２５］前記亜鉛化合物が、酢酸亜鉛、塩化亜鉛、硫酸亜鉛からなる群より選ばれた１ないし２以上の化合物を含む、［２３］又は［２４］に記載の安定化方法。
［２６］前記亜鉛化合物が、１ｐｐｍ〜２００ｐｐｍの濃度である、［２３］から［２５］のいずれか一項に記載の安定化方法。
［２７］さらに、ホルマリン、フェノキシエタノール、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、及びリン酸２水素ナトリウムからなる群から選ばれた１ないし２以上の化合物を混合する［２３］から［２６］のいずれか一項に記載の安定化方法。
As a result of intensive studies by the present inventors in order to overcome the above-mentioned problems, the present inventors have found that a zinc compound has an effect of stabilizing an influenza virus antigen that has not been reported in the past. That is, the present invention is as follows.
[1] An influenza virus vaccine comprising an influenza virus antigen and a zinc compound.
[2] The influenza virus vaccine according to [1], wherein the zinc compound is a water-soluble zinc compound.
[3] The influenza virus vaccine according to [1] or [2], wherein the zinc compound includes 1 to 2 or more compounds selected from the group consisting of zinc acetate, zinc chloride, and zinc sulfate.
[4] The influenza virus vaccine according to any one of [1] to [3], wherein the vaccine is a liquid vaccine.
[5] The influenza virus vaccine according to any one of [1] to [4], wherein the zinc compound has a concentration of 1 ppm to 200 ppm.
[6] The influenza virus vaccine according to any one of [1] to [5], wherein the vaccine does not substantially contain thimerosal.
[7] Any one of [1] to [6], further comprising one or more compounds selected from the group consisting of formalin, phenoxyethanol, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, and sodium dihydrogen phosphate. The influenza virus vaccine described in 1.
[8] The method for producing an influenza virus vaccine according to any one of [1] to [7].
[9] A vaccine stock solution containing an influenza virus antigen and a zinc compound.
[10] The vaccine stock solution according to [9], wherein the zinc compound is a water-soluble zinc compound.
[11] The vaccine stock solution according to [9] or [10], wherein the zinc compound contains 1 to 2 or more compounds selected from the group consisting of zinc acetate, zinc chloride, and zinc sulfate.
[12] The vaccine stock solution according to any one of [9] to [11], wherein the vaccine stock solution is a liquid vaccine stock solution.
[13] The vaccine stock solution according to any one of [9] to [12], wherein the zinc compound has a concentration of 1 ppm to 200 ppm.
[14] The vaccine stock solution according to any one of [9] to [13], wherein the vaccine stock solution does not substantially contain thimerosal.
[15] Any one of [9] to [14], further comprising one or more compounds selected from the group consisting of formalin, phenoxyethanol, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, and sodium dihydrogen phosphate. The vaccine stock solution described in 1.
[16] The method for producing a vaccine stock solution according to any one of [9] to [15].
[17] A stabilizer for influenza virus antigens containing a zinc compound.
[18] The stabilizer according to [17], wherein the zinc compound is a water-soluble zinc compound.
[19] The stabilizer according to [17] or [18], wherein the zinc compound includes one or more compounds selected from the group consisting of zinc acetate, zinc chloride, and zinc sulfate.
[20] The stabilizer according to any one of [17] to [19], wherein the zinc compound has a concentration of 1 ppm to 200 ppm.
[21] Any one of [17] to [20], further comprising one or more compounds selected from the group consisting of formalin, phenoxyethanol, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, and sodium dihydrogen phosphate The stabilizer described in 1.
[22] The method for producing a stabilizer according to any one of [17] to [21].
[23] A method for stabilizing an influenza virus antigen, comprising mixing an influenza virus antigen and a zinc compound.
[24] The stabilization method according to [23], wherein the zinc compound is a water-soluble zinc compound.
[25] The stabilization method according to [23] or [24], wherein the zinc compound includes one or more compounds selected from the group consisting of zinc acetate, zinc chloride, and zinc sulfate.
[26] The stabilization method according to any one of [23] to [25], wherein the zinc compound has a concentration of 1 ppm to 200 ppm.
[27] Furthermore, one or more compounds selected from the group consisting of formalin, phenoxyethanol, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, and sodium dihydrogen phosphate are mixed, and any one of [23] to [26] The stabilization method according to item.
本願発明では、インフルエンザウイルス抗原と亜鉛化合物を混合することにより、抗原の安定性が向上する効果を見出した。上記の効果は3種のインフルエンザウイルス（A型H1N1、A型H3N1、B型）を含有するインフルエンザワクチン、インフルエンザB型ウイルスを含有するワクチン原液において格別顕著な効果を奏する。そのため、本願発明では、ワクチン製造時の安定化剤として、人体への危険性が懸念されているチメロサールを使用せずに、亜鉛化合物を用いることにより、安全性の問題が克服される。また、本願発明では、インフルエンザウイルス抗原へ亜鉛化合物を添加することにより、抗原の安定性が向上するため、抗体誘導能が向上したワクチンの提供が期待できる。さらに、本願発明により、製造工程の重要中間体であるワクチン原液において抗原の安定性が向上するため、原液の使用期限が延長する効果が期待される。上記の効果の結果として、製造スケジュールに自由度が生まれ、原液の廃棄等を最小限に抑えて、製造資源の浪費を抑制する効果が期待される。 In this invention, the effect which improves stability of an antigen was discovered by mixing influenza virus antigen and a zinc compound. The above effects are particularly remarkable in influenza vaccines containing three types of influenza viruses (type A H1N1, type A H3N1, and type B) and vaccine stock solutions containing influenza B virus. Therefore, in this invention, the problem of safety is overcome by using a zinc compound as a stabilizer at the time of vaccine production without using thimerosal, which is concerned about the danger to the human body. Moreover, in this invention, since the stability of an antigen improves by adding a zinc compound to an influenza virus antigen, provision of the vaccine which improved the antibody induction ability can be expected. Furthermore, according to the present invention, the stability of the antigen is improved in the vaccine stock solution, which is an important intermediate in the production process, so that the effect of extending the expiration date of the stock solution is expected. As a result of the above effects, a degree of freedom is produced in the production schedule, and an effect of suppressing waste of production resources by minimizing disposal of the stock solution and the like is expected.
本願発明は、インフルエンザウイルス抗原及び亜鉛化合物を含む、インフルエンザウイルスワクチンまたはワクチン原液を含む。 The present invention includes an influenza virus vaccine or vaccine stock solution comprising an influenza virus antigen and a zinc compound.
本願発明のインフルエンザウイルスは特に限定されず、A型インフルエンザウイルス株、B型インフルエンザウイルス株を含みうる。また、A型インフルエンザウイルス株は特に限定されず、16種類のHAと9種類のNAの組合せに応じて多種多様な株が含まれ、例えば、H1N1株、H1N2株、H2N2株、H3N2株、H3N8株、H5N1株、H5N2株、H7N7株、H9N2株を含みうる。好ましくは、A型インフルエンザウイルスH1N1株、A型インフルエンザウイルスH3N2株である。A型インフルエンザウイルスH1N1株の種類は特に限定されず、A/Porto Rico/8/34株、A/New Caledonia/20/99株、A/Beijing/262/95株、A/Johannesburg/282/96株、A/Texas/36/91株、A/Singapore株、Ａ/California/7/2009株を含む。A型インフルエンザウイルスH3N2株の種類は特に限定されず、A/Panama/2007/99株、A/Moscow/10/99株、A/Johannesburg/33/94株、Ａ/Victoria/210/2009株を含む。また、B型インフルエンザウイルス株の種類は特に限定されず、B/Johannesburg/5/99株、B/Vienna/1/99株、B/Ann Arbor/1/86株、B/Memphis/1/93株、B/Harbin/7/94株、N/Shandong/7/97株、B/Hong Kong/330/01株、B/Yamanashi/166/98株、Ｂ/Brisbane/60/2008株を含みうる。 The influenza virus of the present invention is not particularly limited, and may include influenza A virus strains and influenza B virus strains. In addition, influenza A virus strains are not particularly limited, and include a wide variety of strains depending on the combination of 16 types of HA and 9 types of NA, for example, H1N1, H1N2, H2N2, H3N2, H3N8 Strains, H5N1 strains, H5N2 strains, H7N7 strains, H9N2 strains. Preferred are influenza A virus H1N1 strain and influenza A virus H3N2 strain. The type of influenza A virus H1N1 strain is not particularly limited. A / Porto Rico / 8/34 strain, A / New Caledonia / 20/99 strain, A / Beijing / 262/95 strain, A / Johannesburg / 282/96 strain Strain, A / Texas / 36/91 strain, A / Singapore strain, A / California / 7/2009 strain. The type of influenza A virus H3N2 is not particularly limited, and A / Panama / 2007/99, A / Moscow / 10/99, A / Johannesburg / 33/94, A / Victoria / 210/2009 Including. The type of influenza B strain is not particularly limited, and B / Johannesburg / 5/99, B / Vienna / 1/99, B / Ann Arbor / 1/86, B / Memphis / 1/93 May include B / Harbin / 7/94, N / Shandong / 7/97, B / Hong Kong / 330/01, B / Yamanashi / 166/98, B / Brisbane / 60/2008 .
本願発明のインフルエンザウイルス抗原は特に限定されず、ヘマグルチニン（HA）、ノイラミニダーゼ（NA）、マトリックス１（M1）、マトリックス２（M2）、核タンパク（NP）を含みうる。ワクチン投与により効果的な免疫を付与させる観点から、好ましくはヘマグルチニン（HA）抗原である。 The influenza virus antigen of the present invention is not particularly limited, and may include hemagglutinin (HA), neuraminidase (NA), matrix 1 (M1), matrix 2 (M2), and nucleoprotein (NP). From the viewpoint of conferring effective immunity by vaccine administration, hemagglutinin (HA) antigen is preferable.
本願発明のインフルエンザウイルス抗原は、抗原を構成する全長のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列のうち1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列、または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列、もしくは前記アミノ酸配列を含有するポリペプチド鎖であっても良い。 The influenza virus antigen of the present invention is a full-length amino acid sequence constituting the antigen, or an amino acid sequence in which one or several amino acids of the amino acid sequence are deleted, substituted or added, or any one of the amino acid sequences described above It may be a partial sequence or a polypeptide chain containing the amino acid sequence.
本願発明のインフルエンザウイルス抗原の調製方法は特に限定されず、公知の方法が限定なく使用できる。例えば、インフルエンザ感染動物またはインフルエンザの患者から単離されたウイルス株を鶏卵や細胞などに感染させて常法により培養し、精製したウイルス原液から抗原を調製しても良い。また、遺伝子工学的に組換えウイルス或は特定抗原を種々の細胞で産生あるいは発現させたものを材料として抗原を調製することも可能である。ウイルスを増殖あるいは抗原を産生させるための細胞培養基材としては、例えば、イヌ腎臓細胞（例えば、MDCK細胞、MDCK様細胞）、サル腎臓細胞（例えば、COS細胞、ベロ細胞、AGMK細胞）、ヒト細胞（例えばMRC-5細胞、Per.C6細胞）、トリ細胞（例えば、EB66細胞）、ハムスター細胞（例えば、CHO細胞,BHK細胞、HKCC細胞）、マウス細胞（3T3細胞）または任意の他のタイプの動物細胞を含みうる。 The preparation method of the influenza virus antigen of this invention is not specifically limited, A well-known method can be used without limitation. For example, a virus strain isolated from an influenza-infected animal or an influenza patient may be infected with chicken eggs or cells and cultured by a conventional method, and an antigen may be prepared from a purified virus stock solution. It is also possible to prepare an antigen using a genetically engineered recombinant virus or a specific antigen produced or expressed in various cells. Examples of cell culture substrates for growing viruses or producing antigens include, for example, canine kidney cells (eg, MDCK cells, MDCK-like cells), monkey kidney cells (eg, COS cells, Vero cells, AGMK cells), humans Cells (eg MRC-5 cells, Per.C6 cells), avian cells (eg EB66 cells), hamster cells (eg CHO cells, BHK cells, HKCC cells), mouse cells (3T3 cells) or any other type Animal cells.
本願発明のヘマグルチニン（HA）抗原は、インフルエンザウイルスを感染させた、鶏卵または培養細胞由来の培養液を由来としてもよく、HA蛋白合成遺伝子を組み込んだ遺伝子組換え細胞の培養液を由来としてもよい。 The hemagglutinin (HA) antigen of the present invention may be derived from a culture fluid derived from chicken eggs or cultured cells infected with influenza virus, or may be derived from a culture fluid of genetically modified cells incorporating an HA protein synthesis gene. .
本願発明のヘマグルチニン（HA）抗原のワクチンないしワクチン原液における濃度は、SRD試験により測定した場合、好ましくは1〜1000μg/mL、より好ましくは3〜300μg/mL、さらに好ましくは3〜30μg/mL、さらに好ましくは約30μg/mLである。 The concentration of the hemagglutinin (HA) antigen of the present invention in the vaccine or vaccine stock solution is preferably 1 to 1000 μg / mL, more preferably 3 to 300 μg / mL, still more preferably 3 to 30 μg / mL, as measured by the SRD test. More preferably, it is about 30 μg / mL.
本願発明の亜鉛化合物は特に限定されず、サリチル酸亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、炭酸亜鉛、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛、乳酸亜鉛、酢酸亜鉛、酸化亜鉛、上記亜鉛化合物の水和物、およびこれらの2種類以上の化合物を含む混合物が例示される。また、亜鉛酸イオンの塩等のように錯体としても用いることができる。ワクチン、ワクチン原液、安定化剤が液状である場合、亜鉛化合物は水溶性の亜鉛化合物が好ましい。水溶性の亜鉛化合物としては、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、上記の亜鉛化合物の水和物、及びこれらの2種類以上の化合物を含む混合物を例示される。 The zinc compound of the present invention is not particularly limited. Zinc salicylate, zinc phosphate, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc iodide, zinc fluoride, zinc chloride, zinc bromide, zinc carbonate, zinc pt-butylbenzoate Zinc thiocyanate, zinc lactate, zinc acetate, zinc oxide, hydrates of the above zinc compounds, and mixtures containing two or more of these compounds. It can also be used as a complex such as a salt of zincate ion. When the vaccine, vaccine stock solution, and stabilizer are in liquid form, the zinc compound is preferably a water-soluble zinc compound. Examples of the water-soluble zinc compound include zinc sulfate, zinc chloride, zinc acetate, hydrates of the above zinc compounds, and mixtures containing two or more of these compounds.
本願発明の亜鉛化合物の状態は特に限定されず、化合物が粉末状態で存在する場合、溶液中にて化合物の状態で存在する場合、溶液中にて亜鉛化合物から亜鉛イオンへ電離された状態を含みうる。投薬時の利便性の観点から、好ましくは、亜鉛化合物は溶液中に存在する場合である。 The state of the zinc compound of the present invention is not particularly limited. When the compound is present in a powder state, when the compound is present in a solution state, it includes a state in which the zinc compound is ionized into zinc ions in the solution. sell. From the viewpoint of convenience during administration, the zinc compound is preferably present in the solution.
本願発明の亜鉛化合物の濃度は特に限定されず、好ましくは10ppm以上である。さらに、人体への安全性を考慮する場合、好ましくは10ppm〜200ppmである。さらに好ましくは、10ppm〜150ppmである。さらに好ましくは、10ppm〜100ppmである。亜鉛化合物の濃度は剤形、抗原量、抗原の種類、インフルエンザウイルス株の種類に応じて、適宜変更しても構わない。 The concentration of the zinc compound of the present invention is not particularly limited, and is preferably 10 ppm or more. Furthermore, when considering the safety to the human body, it is preferably 10 ppm to 200 ppm. More preferably, it is 10 ppm to 150 ppm. More preferably, it is 10 ppm to 100 ppm. The concentration of the zinc compound may be appropriately changed according to the dosage form, the amount of antigen, the type of antigen, and the type of influenza virus strain.
本願発明のインフルエンザウイルスワクチンは単一のウイルス抗原を含有してもよく、2種類以上のウイルス抗原を含有してもよい。特定のインフルエンザウイルスが流行し、特定の株のワクチンを迅速に製造供給する場合には、ワクチンは単一のウイルス抗原を含有する場合が好ましい。ワクチン投与により広域なウイルス株に対する免疫を付与させる点を鑑みるならば、好ましくは、ワクチンは2種類以上のウイルス抗原を含有する場合である。インフルエンザウイルスワクチンは、好ましくは、A型インフルエンザウイルス抗原、B型インフルエンザウイルス抗原、又はそれらの混合物を含む場合であり、さらに好ましくは、A型インフルエンザウイルスH1N1抗原、A型インフルエンザウイルスH3N2抗原、B型インフルエンザウイルス抗原、又はそれらの混合物を含む場合である。インフルエンザウイルスワクチンに2種類以上のウイルス抗原が含まれる場合、各ウイルス由来の抗原量は特に限定されないが、好ましくは各ウイルス由来の抗原がワクチン中に等量含まれている場合である。 The influenza virus vaccine of the present invention may contain a single virus antigen or two or more kinds of virus antigens. When a specific influenza virus is prevalent and a specific strain of vaccine is rapidly manufactured and supplied, it is preferred that the vaccine contains a single viral antigen. In view of conferring immunity against a wide range of virus strains by vaccine administration, the vaccine preferably contains two or more types of viral antigens. The influenza virus vaccine is preferably a case containing an influenza A virus antigen, an influenza B virus antigen, or a mixture thereof, more preferably an influenza A virus H1N1 antigen, an influenza A virus H3N2 antigen, an influenza B type This is the case when it contains an influenza virus antigen, or a mixture thereof. When two or more types of virus antigens are included in the influenza virus vaccine, the amount of antigen derived from each virus is not particularly limited, but it is preferable that an equal amount of antigen derived from each virus is included in the vaccine.
本願発明のインフルエンザワクチンの剤形は特に限定されず、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態を含みうる。ワクチン投与時の利便性の観点から、ワクチンの剤形は好ましくは液状である。 The dosage form of the influenza vaccine of the present invention is not particularly limited, and may include liquid form, powder form (freeze-dried powder, dry powder), capsule form, tablet, and frozen state. From the viewpoint of convenience during vaccine administration, the dosage form of the vaccine is preferably liquid.
本願発明のインフルエンザワクチンは、バイアル、シリンジ、接種作業に使用可能なカートリッジ等を備えたプレフィルドシリンジ等としてもよい。 The influenza vaccine of the present invention may be a vial, a syringe, a prefilled syringe equipped with a cartridge that can be used for inoculation, or the like.
本願発明のワクチン原液は、薬剤容器へ分注前であって、ウイルス抗原を主成分とする組成物を広く意味し、単一のウイルス抗原を含有しても良く、2種類以上のウイルス抗原を含有しても構わない。好ましくは、A型インフルエンザウイルス抗原、B型インフルエンザウイルス抗原、又はそれらの混合物を含む場合であり、さらに好ましくは、インフルエンザウイルスはA型インフルエンザウイルスH1N1抗原、A型インフルエンザウイルスH3N2抗原、B型インフルエンザウイルス抗原、またはそれらの混合物のいずれかである。亜鉛化合物の添加による抗原（特にヘマグルチニン抗原）の安定化効果を鑑みるならば、好ましくはA型インフルエンザウイルスH1N1抗原、A型インフルエンザウイルスH3N2抗原、及びB型インフルエンザウイルス抗原の混合物、またはB型インフルエンザウイルス抗原である。 The vaccine stock solution of the present invention means a composition mainly composed of a viral antigen before dispensing into a drug container, may contain a single viral antigen, and may contain two or more viral antigens. You may contain. Preferably, it includes a type A influenza virus antigen, a type B influenza virus antigen, or a mixture thereof, and more preferably the influenza virus is an influenza A virus H1N1 antigen, an influenza A virus H3N2 antigen, an influenza B virus Either an antigen, or a mixture thereof. In view of the effect of stabilizing an antigen (particularly hemagglutinin antigen) by adding a zinc compound, preferably a mixture of influenza A virus H1N1 antigen, influenza A virus H3N2 antigen, and influenza B virus antigen, or influenza B virus It is an antigen.
本願発明のインフルエンザワクチン、及びワクチン原液は、必要に応じて、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。前記医薬として許容されうる担体としては、ワクチン製造に用いられる担体を限定なく使用することができ、具体的には、糖類、無機塩類、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液、界面活性剤、乳化剤、保存剤、等張化剤、pH調整剤及び不活化剤、及びこれらの２種類以上の組み合わせが適宜配合される。さらに具体的には、ホルマリン、フェノキシエタノール、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ポリソルベート80、及びこれらの２種類以上の組み合わせが適宜配合される。
The influenza vaccine and vaccine stock solution of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier, if necessary. As the pharmaceutically acceptable carrier, carriers used for vaccine production can be used without limitation. Specifically, sugars, inorganic salts, buffered saline, dextrose, water, glycerol, isotonic aqueous buffers , A surfactant, an emulsifier, a preservative, an isotonic agent, a pH adjuster and an inactivator, and a combination of two or more thereof are appropriately blended. More specifically, formalin, phenoxyethanol, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate,
本願発明のインフルエンザワクチン、及びワクチン原液は免疫増強剤（アジュバント）を含有していても構わない。アジュバントとしては鉱物含有組成物、油性エマルジョン、サポニン組成物、ビロゾームおよびウイルス様粒子（VLP）、細菌誘導体または微生物誘導体（腸内細菌リポポリサッカリドの非毒性誘導体、脂質Ａ誘導体、免疫刺激性オリゴヌクレオチドADPリボシル化毒素およびその解毒誘導体）、などが例示される。 The influenza vaccine and vaccine stock solution of the present invention may contain an immunopotentiator (adjuvant). Adjuvants include mineral-containing compositions, oily emulsions, saponin compositions, virosomes and virus-like particles (VLP), bacterial or microbial derivatives (non-toxic derivatives of enterobacterial lipopolysaccharides, lipid A derivatives, immunostimulatory oligonucleotides ADP ribosylated toxin and its detoxified derivatives), and the like.
さらに、本願発明はインフルエンザウイルス抗原および亜鉛化合物を混合する、インフルエンザウイルスワクチン又はワクチン原液の製造方法を含む。 Furthermore, this invention includes the manufacturing method of the influenza virus vaccine or vaccine stock solution which mixes an influenza virus antigen and a zinc compound.
該製造方法は、インフルエンザウイルスを宿主（鶏卵ないし培養細胞）へ感染させる工程、ウイルス粒子を濃縮精製する工程、ウイルス粒子をエーテル等により処理して抗原を回収する工程、ホルマリン等でウイルスを不活化する工程、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液等を用いて抗原が規定量含まれるよう希釈調製してワクチン原液を製造する工程を含む。ワクチンの製造方法の場合には、さらにワクチン原液を薬剤容器へ充填する工程、必要に応じて凍結乾燥等の製剤化工程が適宜組み合わされる。また、ワクチンやワクチン原液が2種類以上の抗原を含有する場合には抗原の混合化工程が適宜組み合わされる。 The production method comprises infecting a virus (eg, eggs or cultured cells) with an influenza virus, concentrating and purifying virus particles, recovering antigens by treating the virus particles with ether or the like, and inactivating the virus with formalin or the like. And a step of producing a vaccine stock solution by diluting and preparing a predetermined amount of antigen using a phosphate buffered sodium chloride solution or the like. In the case of a method for producing a vaccine, a step of filling a vaccine stock solution into a drug container and a formulation step such as lyophilization as needed are combined as appropriate. In addition, when the vaccine or vaccine stock solution contains two or more types of antigens, antigen mixing steps are appropriately combined.
また、該製造方法は遺伝子組換え技術を用いたウイルス抗原の製造方法を含み、ウイルス抗原をコードする遺伝子を挿入した発現ベクターを構築する工程、培養細胞に発現ベクターを導入し、抗原を発現させる工程、発現細胞ないし発現細胞の培養液から抗原を回収・精製する工程、リン酸塩緩衝塩化ナトリウム液等を用いて抗原が規定量含まれるよう希釈調製する工程を含む。ワクチンの製造方法の場合には、さらにワクチン原液を薬剤容器へ充填する工程、必要に応じて凍結乾燥等の製剤化工程が適宜組み合わされる。また、ワクチンやワクチン原液が2種類以上の抗原を含有する場合には抗原の混合化工程が適宜組み合わされる。抗原遺伝子は培養細胞のゲノムに挿入されてもよく、ゲノムとは分離して存在しても構わない。また、抗原遺伝子から抗原の発現は恒常的であっても一過性であっても構わない。 In addition, the production method includes a method for producing a viral antigen using a gene recombination technique, a step of constructing an expression vector into which a gene encoding the viral antigen is inserted, an expression vector is introduced into cultured cells, and the antigen is expressed. A step, a step of recovering and purifying the antigen from the expression cell or the culture solution of the expression cell, and a step of diluting and preparing the antigen to contain a predetermined amount using a phosphate buffered sodium chloride solution or the like. In the case of a method for producing a vaccine, a step of filling a vaccine stock solution into a drug container and a formulation step such as lyophilization as needed are combined as appropriate. In addition, when the vaccine or vaccine stock solution contains two or more types of antigens, antigen mixing steps are appropriately combined. The antigen gene may be inserted into the genome of the cultured cell, or may exist separately from the genome. Further, the expression of the antigen from the antigen gene may be constant or transient.
上記の回収・精製方法としては、特に限定されないが、例えば、塩析法、遠心分離法、超遠心分離法、密度勾配遠心分離法、精密ろ過法、限外濾過法、等電点沈殿法、電気泳動法、逆相クロマトグラフィー法、ゲル濾過クロマトグラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィニティクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー法等を適宜組み合わせて構わない。 The recovery / purification method is not particularly limited. For example, salting out, centrifugation, ultracentrifugation, density gradient centrifugation, microfiltration, ultrafiltration, isoelectric precipitation, Electrophoresis, reverse phase chromatography, gel filtration chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, hydroxyapatite chromatography, and the like may be combined as appropriate.
上記のウイルス増殖や抗原産生に使用する培養細胞としては、例えば、イヌ腎臓細胞（例えば、MDCK細胞、MDCK様細胞）、サル腎臓細胞（例えば、COS細胞、ベロ細胞、AGMK細胞）、ヒト細胞（例えばMRC-5細胞、Per.C6細胞）、トリ細胞（例えば、EB66細胞）、ハムスター細胞（例えば、CHO細胞,BHK細胞、HKCC細胞）、マウス細胞（3T3細胞）または任意の他のタイプの動物細胞を含みうる。 Examples of cultured cells used for the above virus growth and antigen production include canine kidney cells (eg, MDCK cells, MDCK-like cells), monkey kidney cells (eg, COS cells, Vero cells, AGMK cells), human cells ( Eg MRC-5 cells, Per.C6 cells), avian cells (eg EB66 cells), hamster cells (eg CHO cells, BHK cells, HKCC cells), mouse cells (3T3 cells) or any other type of animal Cells can be included.
上記の製造方法にて、亜鉛化合物を混合する段階は特に限定されず、ウイルス粒子を精製する工程、ウイルス抗原を回収する工程、ウイルスを不活化する工程、抗原量を調整する工程、抗原を混合化する工程、ワクチンへ製剤化する工程、それらの工程の2以上の工程であっても構わない。 In the production method described above, the step of mixing the zinc compound is not particularly limited. The step of purifying the virus particles, the step of recovering the virus antigen, the step of inactivating the virus, the step of adjusting the antigen amount, and mixing the antigen There may be two or more of these steps, the step of formulating into a vaccine, the step of formulating into a vaccine.
本願発明のインフルエンザワクチンの投与方法は特に限定されず、経皮投与、舌下投与、点眼投与、皮内投与、筋肉内投与、経口投与、経腸投与、経鼻投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、口からは肺への吸入投与、これらの投与方法の2種類以上組合せを含みうる。投与法の利便性の観点から、好ましくは皮下投与である。 The administration method of the influenza vaccine of the present invention is not particularly limited, transdermal administration, sublingual administration, eye drop administration, intradermal administration, intramuscular administration, oral administration, enteral administration, nasal administration, intravenous administration, subcutaneous administration. , Intraperitoneal administration, inhalation administration into the lungs from the mouth, and combinations of two or more of these administration methods. From the viewpoint of convenience of administration, it is preferably subcutaneous administration.
さらに、本願発明はインフルエンザウイルス抗原、及び亜鉛化合物を混合するインフルエンザウイルス抗原の安定化方法を含む。 Furthermore, the present invention includes an influenza virus antigen and a method for stabilizing an influenza virus antigen by mixing a zinc compound.
本願発明のインフルエンザウイルス抗原の安定化方法は、インフルエンザウイルス抗原と亜鉛化合物を混合化する方法を含む。亜鉛化合物を混合する段階は特に限定されず、ウイルス抗原を回収する工程、ウイルスを不活化する工程、抗原量を調整する工程、抗原を混合化する工程、ワクチンへ製剤化する工程、それらの2以上の工程であっても構わない。 The method for stabilizing an influenza virus antigen of the present invention includes a method of mixing an influenza virus antigen and a zinc compound. The step of mixing the zinc compound is not particularly limited. The step of recovering the virus antigen, the step of inactivating the virus, the step of adjusting the antigen amount, the step of mixing the antigen, the step of formulating into a vaccine, those 2 You may be the above process.
本願発明の安定化とは、一般的な抗原含量試験にあたるSRD試験にて、亜鉛化合物の添加の有無で沈降リングサイズを比較し、亜鉛化合物を添加していない場合のリングサイズを100％とした場合、リングサイズが110％以上、好ましくは120％以上、好ましくは130％以上、好ましくは140％以上、好ましくは150％以上、好ましくは160％以上、好ましくは170％以上、好ましくは180％以上、好ましくは190％以上、好ましくは200％以上、好ましくは210％以上向上することを意味する。 The stabilization of the present invention means that the SRD test, which is a general antigen content test, compares the precipitated ring size with and without the addition of a zinc compound, and sets the ring size when no zinc compound is added to 100%. The ring size is 110% or more, preferably 120% or more, preferably 130% or more, preferably 140% or more, preferably 150% or more, preferably 160% or more, preferably 170% or more, preferably 180% or more. , Preferably 190% or more, preferably 200% or more, preferably 210% or more.
さらに、本願発明は亜鉛化合物を含む、インフルエンザウイルス抗原用の安定化剤、及びその製造方法を含む。 Furthermore, this invention includes the stabilizer for influenza virus antigens containing a zinc compound, and its manufacturing method.
本願発明の安定化剤における亜鉛化合物の種類は特に限定されない。好ましくは、サリチル酸亜鉛、リン酸亜鉛、硫酸亜鉛、硝酸亜鉛、ヨウ化亜鉛、フッ化亜鉛、塩化亜鉛、臭化亜鉛、炭酸亜鉛、ｐ−ｔ−ブチル安息香酸亜鉛、チオシアン酸亜鉛、乳酸亜鉛、酢酸亜鉛、酸化亜鉛、上記亜鉛化合物の水和物、およびこれらの2種類以上の化合物を含む混合物が例示される。また、亜鉛酸イオンの塩等のように錯体としても用いることができる。安定化剤が液状である場合、亜鉛化合物は水溶性の亜鉛化合物が好ましい。水溶性の亜鉛化合物としては、硫酸亜鉛、塩化亜鉛、酢酸亜鉛、上記の亜鉛化合物の水和物、及びこれらの2種類以上の化合物を含む混合物が例示される。 The kind of zinc compound in the stabilizer of the present invention is not particularly limited. Preferably, zinc salicylate, zinc phosphate, zinc sulfate, zinc nitrate, zinc iodide, zinc fluoride, zinc chloride, zinc bromide, zinc carbonate, zinc pt-butylbenzoate, zinc thiocyanate, zinc lactate, Examples include zinc acetate, zinc oxide, hydrates of the above zinc compounds, and mixtures containing two or more of these compounds. It can also be used as a complex such as a salt of zincate ion. When the stabilizer is liquid, the zinc compound is preferably a water-soluble zinc compound. Examples of the water-soluble zinc compound include zinc sulfate, zinc chloride, zinc acetate, hydrates of the above zinc compounds, and mixtures containing two or more of these compounds.
本願発明の亜鉛化合物の状態は特に限定されず、化合物が粉末状態で存在する場合、溶液中にて化合物の状態で存在する場合、溶液中にて亜鉛化合物から亜鉛イオンへ電離された状態を含みうる。投薬時の利便性の観点から、好ましくは、亜鉛化合物は溶液中に存在する場合である。 The state of the zinc compound of the present invention is not particularly limited. When the compound is present in a powder state, when the compound is present in a solution state, it includes a state in which the zinc compound is ionized into zinc ions in the solution. sell. From the viewpoint of convenience during administration, the zinc compound is preferably present in the solution.
本願発明の亜鉛化合物の濃度は特に限定されず、好ましくは10ppm以上である。さらに、人体への安全性を考慮する場合、好ましくは10ppm〜200ppmである。さらに好ましくは、10ppm〜100ppmである。亜鉛化合物の濃度は剤形、抗原量、抗原の種類、インフルエンザウイルス株の種類に応じて、適宜変更しても構わない。 The concentration of the zinc compound of the present invention is not particularly limited, and is preferably 10 ppm or more. Furthermore, when considering the safety to the human body, it is preferably 10 ppm to 200 ppm. More preferably, it is 10 ppm to 100 ppm. The concentration of the zinc compound may be appropriately changed according to the dosage form, the amount of antigen, the type of antigen, and the type of influenza virus strain.
本願発明の安定化剤は亜鉛化合物以外に必要に応じて、医薬として許容されうる担体を含んでいてもよい。具体的には、糖類、無機塩類、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、等張水性緩衝液、界面活性剤、乳化剤、保存剤、等張化剤、ｐＨ調整剤及び不活化剤、及びこれらの２種類以上の組み合わせが適宜配合される。さらに具体的には、ホルマリン、フェノキシエタノール、塩化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸２水素ナトリウム、リン酸二水素カリウム、ポリソルベート80、及びこれらの２種類以上の組み合わせが適宜配合される。
The stabilizer of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable carrier as required in addition to the zinc compound. Specifically, sugars, inorganic salts, buffered saline, dextrose, water, glycerol, isotonic aqueous buffers, surfactants, emulsifiers, preservatives, isotonic agents, pH adjusters and inactivators, and these These two or more combinations are appropriately blended. More specifically, formalin, phenoxyethanol, sodium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, potassium dihydrogen phosphate,
本願発明の安定化剤の剤形は特に限定されず、液状、粉末状（凍結乾燥粉末、乾燥粉末）、カプセル状、錠剤、凍結状態を含みうる。 The dosage form of the stabilizer of the present invention is not particularly limited, and may include liquid, powder (freeze-dried powder, dry powder), capsule, tablet, and frozen state.
以下、実施例により本願発明を詳細に説明するが、本願発明はこれらの実施例に何ら限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although an Example demonstrates this invention in detail, this invention is not limited to these Examples at all.
「ワクチン原液の製造」
インフルエンザHAワクチン原液として、約10日齢の発育鶏卵しょう尿膜腔にA型インフルエンザウイルスH1N1、A型インフルエンザウイルスH3N2、ないしB型インフルエンザウイルスを接種し、32-36℃で2日間培養する。発育鶏卵からしょう尿液を回収し、遠心して不純物を除去した上清からウイルス粒子を集め、ショ糖密度勾配遠心法で精製後、エーテル及びTween80を用いて脂質を除去し部分分解後、ホルマリンで不活化した。
「3価ワクチンの調製」
上記方法で製造されたA型インフルエンザ2種(H1N1、H3N2)及びB型1種をそれぞれ30μg/mL/株になるように混合する。この時点でのワクチン1mL当たりの組成は、各HA抗原30μg、ホルムアルデヒド0.01w/v％、フェノキシエタノール 0.0045mL、塩化ナトリウム8.1mg、リン酸水素ナトリウム水和物 2.5mg、リン酸二水素カリウム 0.4mgとなる。また、3価ワクチンの総タンパク質量は240μg以下となる。
「酢酸亜鉛の添加」
３価ワクチンに終濃度1もしくは10ppmにて酢酸亜鉛2水和物（Wako 263-00232）を添加する。比較対照として、酢酸亜鉛を添加しない群を作成した。
「加速試験」
3価ワクチンを37℃で4日間または７日間加温することで、模擬的に10℃以下で約６ヶ月（37℃で４日間）または約1年（37℃で７日間）保存した状態にして、HA含量を後述のSRD法で検出した。
「SRD試験」
調製した3価ワクチンのHA含量は以下の方法(SRD試験法)を用いて解析した。
"Manufacture of vaccine stock solutions"
As an influenza HA vaccine stock solution, inoculate influenza virus H1N1, influenza A virus H3N2, or influenza B virus into the urinary urinary tract cavity of a 10-day-old chicken and culture at 32-36 ° C. for 2 days. Collecting urine fluid from growing chicken eggs, collecting virus particles from the supernatant after centrifugation to remove impurities, purifying by sucrose density gradient centrifugation, removing lipids using ether and Tween80, partially digesting, and then using formalin Inactivated.
"Preparation of trivalent vaccine"
Two types of influenza A (H1N1, H3N2) and one type B produced by the above method are mixed at 30 μg / mL / strain. The composition per 1 mL of vaccine at this time is 30 μg of each HA antigen, 0.01 w / v% formaldehyde, 0.0045 mL of phenoxyethanol, 8.1 mg of sodium chloride, 2.5 mg of sodium hydrogen phosphate hydrate, 0.4 mg of potassium dihydrogen phosphate, Become. In addition, the total protein amount of the trivalent vaccine is 240 μg or less.
"Addition of zinc acetate"
Zinc acetate dihydrate (Wako 263-00232) is added to the trivalent vaccine at a final concentration of 1 or 10 ppm. As a comparative control, a group to which no zinc acetate was added was prepared.
"Accelerated test"
By heating the trivalent vaccine at 37 ° C for 4 days or 7 days, it is simulated to be stored at 10 ° C or lower for about 6 months (37 ° C for 4 days) or about 1 year (37 ° C for 7 days). The HA content was detected by the SRD method described later.
"SRD test"
The HA content of the prepared trivalent vaccine was analyzed using the following method (SRD test method).
１，抗血清入りアガロースゲルの作製
アガロース（Lonza 50011）を1w/v%になるようにPBS（GIBCO 10010-023）に添加し、加熱により完全に可溶化する。60℃程度まで温度が低下してきたら、SPFヒツジ由来の抗インフルエンザHA抗血清を適量添加し、直径10cmのガラス製シャーレに15mL程度添加し、室温で冷却して固形化する。専用のパンチでアガロースゲルに抗原添加用の穴（直径4mm）を開け、SRD解析用のアガロースゲルを作製する。
1. Preparation of antiserum-containing agarose gel Agarose (Lonza 50011) is added to PBS (GIBCO 10010-023) at 1 w / v% and completely solubilized by heating. When the temperature drops to about 60 ° C, add an appropriate amount of anti-influenza HA antiserum derived from SPF sheep, add about 15 mL to a glass petri dish with a diameter of 10 cm, and cool at room temperature to solidify. A hole for antigen addition (4mm in diameter) is made in the agarose gel with a special punch to prepare an agarose gel for SRD analysis.
２，検体調製
HA抗原が30μg/mLになるように標準抗原を注射用水で完全に溶解する。適当な界面活性剤を用いてワクチン抗原を可溶化し、標準抗原及びワクチン抗原を0.75、0.5、0.25倍になるようにPBSで希釈しSRD試験用検体を調製する。
2, sample preparation
The standard antigen is completely dissolved in water for injection so that the HA antigen is 30 μg / mL. A vaccine antigen is solubilized using an appropriate surfactant, and a standard antigen and a vaccine antigen are diluted with PBS so as to be 0.75, 0.5, and 0.25 times to prepare a specimen for SRD test.
３，免疫沈降反応
調製した検体を20μLずつアプライし、ゲルに吸収させる。25℃インキュベーターで18時間以上反応させる。超純水でゲル表面を洗い、ろ紙を用いて水分を吸い取る。このとき、約500gの重りにてプレスする。2〜3回ろ紙を交換し、約20分プレス後、重りと紙を取り外し、50℃の恒温乾燥機に入れ、乾燥させる。乾燥させたゲルプレートにCBB染色液（0.25ｗ/v% Coomassie Brilliant Blue R-250 (Biorad 161-0400)、5v/v% 酢酸(Wako 017-00256)、50% メタノール(Wako 137-01823)）を約10mL入れ、約10分間振とうする。CBB脱色液（25v/v% メタノール（Wako 137-01823）、7.5% 酢酸(Wako 017-00256)）を入れ適宜交換しながら、沈降リングが明瞭でバックグラウンドが綺麗になるまで脱色を繰り返し、最後に蒸留水で約10分間振とうする。その後、プレートを乾燥させて沈降リングの大きさを測定する。SRD試験は、沈降リングのサイズが小さくなるに従い、抗原性が低下しているといえ、沈降サイズの±10％未満は誤差範囲となる。酢酸亜鉛を未添加時の沈降サイズを100％とし、酢酸亜鉛添加時の沈降サイズと比較した。
3.
その結果、37℃加速４日後において、1ppmまたは10ppmにて酢酸亜鉛を添加した場合、未添加の場合と比較して、HA抗原の安定性がそれぞれ120％、約140％へ有意に向上した（図１ d4）。同様に、37℃加速７日後において、1ppmまたは10ppmにて酢酸亜鉛を添加した場合、未添加の場合と比較して、HA抗原の安定性がそれぞれ約150％、約160％へ向上した（図１ d7）。 As a result, after 4 days of acceleration at 37 ° C, when zinc acetate was added at 1 ppm or 10 ppm, the stability of HA antigen was significantly improved to 120% and 140%, respectively, compared to the case where zinc acetate was not added ( Figure 1 d4). Similarly, after 7 days of acceleration at 37 ° C, the stability of HA antigen was improved to approximately 150% and 160%, respectively, when zinc acetate was added at 1 ppm or 10 ppm compared to the case without addition (Fig. 1 d7).
インフルエンザワクチンに安定化剤を添加することで、10℃以下保存1年に相当する37℃加速7日後において、現行ワクチン抗原と比較し、標準的な定量法(特にSRD法) により解析された抗原性が添加量依存的に向上する。 Antigen analyzed by standard quantification method (especially SRD method) compared with current vaccine antigen after 7 days acceleration at 37 ° C, which corresponds to 1 year of storage at 10 ° C or less, by adding a stabilizer to influenza vaccine The property is improved depending on the amount added.
実施例１の「ワクチン原液の製造」ならびに「3価ワクチンの調製」に即して得られた３価ワクチンに対して、終濃度１、10、50、100、及び200ppmにて酢酸亜鉛2水和物（Wako 263-00232）を添加する。比較対照として、酢酸亜鉛を添加しない群を作成した。その後、実施例１の「加速試験」を37度で7日間おこない、実施例１の「SRD試験」を実施した。
その結果、酢酸亜鉛を添加した場合、未添加の場合と比較して、HA抗原の安定性が1ppm添加で146％、10ppm添加で144%、50ppm添加で190%、100ppm添加で172%、及び200ppm添加で206%へ向上した（図２）すなわち、酢酸亜鉛添加によるHA抗原の安定性改善効果は、1ppmから200ppmまである程度の濃度依存的な効果として確認された。
Zinc acetate 2 water at final concentrations of 1, 10, 50, 100, and 200 ppm with respect to the trivalent vaccine obtained according to “Manufacture of vaccine stock solution” and “Preparation of trivalent vaccine” in Example 1 Add Japanese (Wako 263-00232). As a comparative control, a group to which no zinc acetate was added was prepared. Thereafter, the “acceleration test” of Example 1 was performed at 37 degrees for 7 days, and the “SRD test” of Example 1 was performed.
As a result, when zinc acetate was added, the stability of the HA antigen was 146% when added 1 ppm, 144% when added 10 ppm, 190% when added 50 ppm, 172% when added 100 ppm, and The addition of 200 ppm improved it to 206% (FIG. 2). That is, the effect of improving the stability of HA antigen by adding zinc acetate was confirmed as a concentration-dependent effect from 1 ppm to 200 ppm.
実施例１の「ワクチン原液の製造」ならびに「3価ワクチンの調製」に即して得られた３価ワクチンに対して、終濃度40ppmにて塩化亜鉛（ナカライテスク 36920-24）を添加する。比較対照として、塩化亜鉛を添加しない群を作成した。その後、実施例１の「加速試験」を37度で7日間おこない、実施例１の「SRD試験」を実施した。その結果、40ppmにて塩化亜鉛を添加した場合、未添加の場合と比較して、HA抗原の安定性が114％へ向上した（図３）すなわち、酢酸亜鉛と同様に亜鉛イオンを供給する塩化亜鉛においてもHA抗原の安定性改善効果が認められた。 Zinc chloride (Nacalai Tesque 36920-24) is added at a final concentration of 40 ppm to the trivalent vaccine obtained in accordance with “Production of vaccine stock solution” and “Preparation of trivalent vaccine” in Example 1. As a comparative control, a group not added with zinc chloride was prepared. Thereafter, the “acceleration test” of Example 1 was performed at 37 degrees for 7 days, and the “SRD test” of Example 1 was performed. As a result, when the zinc chloride was added at 40 ppm, the stability of the HA antigen was improved to 114% as compared with the case where it was not added (FIG. 3). That is, the chloride supplying zinc ions in the same manner as zinc acetate. Zinc was also found to improve the stability of HA antigen.
実施例１の「ワクチン原液の製造」ならびに「3価ワクチンの調製」に即して得られた３価ワクチンに対して、終濃度1、10、100ppmにて硫酸亜鉛（WAKO 268-00422）を添加する。比較対照として、硫酸亜鉛を添加しない群を作成した。その後、実施例１の「加速試験」を37度で7日間おこない、実施例１の「SRD試験」を実施した。その結果、10ppmにて硫酸亜鉛を添加した場合、未添加の場合と比較して、HA抗原の安定性が218％へ向上した（図４）すなわち、酢酸亜鉛や塩化亜鉛と同様に亜鉛イオンを供給する硫酸亜鉛においてもHA抗原の安定性改善効果が認められた。 Zinc sulfate (WAKO 268-00422) was added at final concentrations of 1, 10, and 100 ppm to the trivalent vaccine obtained in accordance with “Manufacture of vaccine stock solution” and “Preparation of trivalent vaccine” in Example 1. Added. As a comparative control, a group to which no zinc sulfate was added was prepared. Thereafter, the “acceleration test” of Example 1 was performed at 37 degrees for 7 days, and the “SRD test” of Example 1 was performed. As a result, when zinc sulfate was added at 10 ppm, the stability of HA antigen was improved to 218% compared to the case where zinc sulfate was not added (FIG. 4). That is, zinc ions were added in the same manner as zinc acetate and zinc chloride. The stability of HA antigen was also improved in the supplied zinc sulfate.
ワクチン製造の重要中間体であるワクチン原液においても、亜鉛化合物のHA抗原の安定性向上効果を確認した。実施例１の「ワクチン原液の製造」に即して、B型インフルエンザウイルスのみを用いて、B型インフルエンザウイルス原液を製造した。終濃度1ppm、10ppm、100ppm、ならびに200ppmにて酢酸亜鉛2水和物（Wako 263-00232）を当該原液へ添加する。比較対照として、酢酸亜鉛を添加しない群を作成した。実施例１の「加速試験」を37度で7日間おこない、実施例１の「SRD試験」を実施した。その結果、酢酸亜鉛の未添加群と比較して、10ppm、100ppm、200ppmにて酢酸亜鉛を添加した群は、それぞれHA抗原の安定性が約140％、約150％、へ向上した（図５）。すなわち、原液中のインフルエンザウイルスB型のHA抗原に対しても、酢酸亜鉛は安定性向上効果を示した。1ppmにて酢酸亜鉛を添加した群では有意差が見られなかった。 In the vaccine stock solution, which is an important intermediate for vaccine production, the effect of improving the stability of the HA antigen of zinc compounds was confirmed. In accordance with “Manufacture of vaccine stock solution” in Example 1, a influenza B virus stock solution was prepared using only influenza B virus. Zinc acetate dihydrate (Wako 263-00232) is added to the stock solution at final concentrations of 1 ppm, 10 ppm, 100 ppm, and 200 ppm. As a comparative control, a group to which no zinc acetate was added was prepared. The “acceleration test” of Example 1 was performed at 37 degrees for 7 days, and the “SRD test” of Example 1 was performed. As a result, as compared with the group not added with zinc acetate, the group to which zinc acetate was added at 10 ppm, 100 ppm, and 200 ppm improved the stability of HA antigen to about 140% and about 150%, respectively (FIG. 5). ). That is, zinc acetate also showed an effect of improving the stability against influenza virus B type HA antigen in the stock solution. There was no significant difference in the group to which zinc acetate was added at 1 ppm.
本願発明ではインフルエンザウイルス抗原と亜鉛化合物を混合することにより、人体への安全性、抗原の安定性に富む、インフルエンザウイルス抗原の安定化方法、ならびに当該方法を利用したウイルス抗原の安定化剤、ワクチン、及びワクチン原液を提供する。 In the present invention, by mixing an influenza virus antigen and a zinc compound, a method for stabilizing an influenza virus antigen that is rich in safety to the human body and antigen stability, and a virus antigen stabilizer and vaccine using the method And providing a vaccine stock solution.
Claims (7)
（１）インフルエンザウイルス感染宿主または遺伝子組み換え技術により得られたインフルエンザウイルス抗原発現細胞を培養し、培養物からウイルスを精製する工程(1) A step of culturing influenza virus antigen-expressing cells obtained by an influenza virus-infected host or gene recombination technique, and purifying the virus from the culture.
（２）前記（１）の工程により得られたウイルスを、リン酸塩を含む緩衝液を用いてワクチン原液を調製する工程、及び(2) a step of preparing a vaccine stock solution using a buffer solution containing a phosphate from the virus obtained by the step (1), and
（３）前記（２）の工程により調製されたワクチン原液に請求項４又は５に記載の安定化剤を混合する工程。(3) The process of mixing the stabilizer of Claim 4 or 5 with the vaccine stock solution prepared by the process of said (2).
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