JP5823405B2 - 核酸含有脂質粒子および関連方法 - Google Patents

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関連出願の相互参照
本出願は、その全文が参照により本明細書に明確に組み込まれる２００９年１１月４日に出願された米国仮出願第６１／２８０，５１０号の利益を主張する。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、最も臨床的に進んだ薬物送達システムであり、７種のＬＮＰベースの薬物が規制承認を受けている。これらの承認薬は、抗癌薬などの小分子を含有し、「遊離」薬物と比較して、有効性の改善および／または毒性の低減を示す。ＬＮＰ担体技術はまた、治療用タンパク質の発現のためのプラスミドまたは疾患進行の一因となっている遺伝子をサイレンシングするための低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴヌクレオチド（ＯＧＮ）などの「遺伝子」薬の送達にも適用されている。ｓｉＲＮＡ ＯＧＮおよびその他の遺伝子薬の効率的なｉｎ ｖｉｖｏ送達のための方法を考案することが、これらの薬剤の治療薬としての革新的な可能性を妨げる大きな問題となっている。

遺伝子薬のカプセル封入および送達に必要なＬＮＰ技術およびカチオン性脂質の設計における最近の進歩によって、ｉｎ ｖｉｖｏ送達問題を解決するためのＬＮＰシステムの可能性が強調されている。ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムは、静脈内（ｉ．ｖ．）注射後に、非ヒト霊長類を始めとする動物モデルにおいて、治療上関連する標的遺伝子のサイレンシングを誘導することがわかっており、現在、いくつかの臨床試験において評価中である。

遺伝子薬を含有するＬＮＰシステムを製剤するために、種々の方法が開発されている。これらの方法として、エタノールの存在下で、予め形成しておいたＬＮＰを、ＯＧＮと混合することまたはエタノールに溶解した脂質を、ＯＧＮを含有する水性媒体と混合することが挙げられ、その結果、１００ｎｍ以下の直径を有するＬＮＰおよび６５〜９５％のＯＧＮカプセル封入効率が得られる。これらの方法の両方とも、ＯＧＮのカプセル封入を達成するためのカチオン性脂質ならびに凝集および大きな構造の形成を阻害するためのポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質の存在に依存している。サイズおよびＯＧＮカプセル封入効率を始めとする、生じるＬＮＰシステムの特性は、イオン強度、脂質およびエタノール濃度、ｐＨ、ＯＧＮ濃度および混合速度などの種々の製剤パラメータに対して敏感である。一般に、混合の時点での関連脂質およびＯＧＮ濃度などのパラメータならびに混合速度は、現在の製剤手順を使用して制御することが困難であり、その結果、生じるＬＮＰの特徴が、製剤内および製剤間で変動する。

マイクロ流体デバイスは、温度、滞留時間および溶質濃度にわたって精密制御して、ナノリットルスケールで流体を制御可能に、迅速に混合する能力を提供する。制御された迅速なマイクロ流体混合は、これまでに無機ナノ粒子および微粒子の合成において適用されており、ナノ粒子の大規模製造においてマクロスケールシステムより優れたものであり得る。マイクロ流体２相液滴技術は、薬物送達のために単分散高分子微粒子を製造するために、または細胞、タンパク質もしくはその他の生体分子をカプセル封入するための大きなベシクルを製造するために適用されている。試薬の迅速な混合を提供するための、サイズが制御された単分散リポソームを作製するための流体力学的フロー絞り込み、一般的なマイクロ流体技術の使用が実証されている。この技術はまた、高分子ナノ粒子の製造において有用であると証明されており、これでは、バルク製造法と比較して、より小さい、より多くの単分散粒子が得られ、より高い小分子カプセル封入が得られる。

遺伝子薬を含有するＬＮＰシステムのための方法の開発における進歩にもかかわらず、治療材料を含有する脂質ナノ粒子ならびに治療材料を含有する改善された脂質ナノ粒子を調製するためのデバイスおよび方法に対する必要性は存在している。本発明は、この必要性を満たし、さらなる関連する利点を提供しようとするものである。

一態様では、本発明は、核酸を備える脂質粒子を提供する。

一実施形態では、脂質粒子は、（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と、（ｂ）１つまたは複数の第２の脂質と、（ｃ）１つまたは複数の核酸とを備え、ここで、脂質粒子は、本明細書において定義される、実質的に固体のコアを備える。

一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである。特定の実施形態では、粒子は、約３０〜約９５モルパーセントのカチオン性脂質を備える。

一実施形態では、第２の脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである。一実施形態では、第２の脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。特定の実施形態では、粒子は、約１〜約１０モルパーセントの第２の脂質を備える。

核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現できるプラスミドであり得る。

別の実施形態では、脂質粒子は、（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と、（ｂ）１つまたは複数の中性脂質と、（ｃ）１つまたは複数のＰＥＧ−脂質と、（ｄ）１つまたは複数のステロールと、（ｅ）１つまたは複数の核酸とを備え、ここで、脂質粒子は、本明細書において定義される実質的に固体のコアを備える。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである。一実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである。一実施形態では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。一実施形態では、ステロールはコレステロールである。一実施形態では、核酸はｓｉＲＮＡである。

さらなる実施形態では、脂質粒子は、１つまたは複数のカチオン性脂質と、１つまたは複数の核酸とからなる。一実施形態では、脂質粒子は、本明細書において定義される実質的に固体のコアを備える。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである。一実施形態では、核酸は、ｓｉＲＮＡである。

その他の態様では、本発明は、脂質粒子を使用するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、核酸を対象に投与するための方法であって、それを必要とする対象に本発明の脂質粒子を投与することを備える方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、核酸を細胞に導入するための方法であって、細胞を本発明の脂質粒子と接触させることを備える方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節するための方法であって、細胞を本発明の脂質粒子と接触させることを備え、核酸が、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節できる方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に本発明の脂質粒子を投与することを備え、核酸が、ポリペプチドの発現をサイレンシングまたは低減できる方法を提供する。

その他の態様では、本発明は、脂質粒子を製造するための方法を提供する。

一実施形態では、本発明は、核酸を含有する脂質粒子を製造する方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをマイクロ流体デバイスに導入することであって、デバイスは、デバイスに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、１つまたは複数の流れの内容物をマイクロ流体ミキサーを用いて混合するための第２の領域とを有する、ことと；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れをデバイスに導入して、層流条件下を流れる第１および第２の流れを提供することであって、デバイスは、マイクロチャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有し、脂質粒子形成材料はカチオン性脂質を含み、第１および第２の溶媒は同一ではない、ことと；
（ｃ）デバイスの第１の領域からデバイスの第２の領域に、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れを流すことと；
（ｄ）デバイスの第２の領域において層流条件を流れる、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと
を備える方法を提供する。

別の実施形態では、本発明は、核酸を含有する脂質粒子を製造する方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れを、チャネルに導入することであって、デバイスは、チャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する、ことと；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを導入することであって、チャネルは、チャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する、ことと；
（ｃ）チャネルの第１の領域からチャネルの第２の領域に、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れを、２つの流れの物理的分離を維持しながら流すことであって、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れは、チャネルの第２の領域に到達するまで混合しない、ことと；
（ｄ）マイクロチャネルの第２の領域において層流条件下を流れる１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと
を備える方法を提供する。

上記の方法の特定の実施形態では、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合することは、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの濃度または相対混合速度を変更することを備える。

上記の方法の特定の実施形態では、方法は、第３の流れを水性バッファーで希釈することをさらに備える。特定の実施形態では、第３の流れを希釈することは、第３の流れおよび水性バッファーを第２の混合構造中に流すことを備える。

上記の方法の特定の実施形態では、方法は、カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える水性バッファーを透析して、第２の溶媒の量を低減することをさらに備える。

上記の方法の特定の実施形態では、第１の溶媒は水性バッファーである。上記の方法の特定の実施形態では、第２の溶媒は水性アルコールである。

上記の方法の特定の実施形態では、第１および第２の流れの内容物を混合することは、カオス的移流を備える。上記の方法の特定の実施形態では、第１および第２の流れの内容物を混合することは、マイクロミキサーを用いて混合することを備える。

上記の方法の特定の実施形態では、核酸カプセル封入効率は、約９０〜約１００％である。

上記の方法の特定の実施形態では、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの混合は、障壁によって第１の領域では防がれる。特定の実施形態では、障壁は、チャネル壁、シース流体または同心チューブである。

本発明の別の態様では、脂質粒子を製造するデバイスが提供される。一実施形態では、本発明は、核酸をカプセル封入する脂質粒子を製造するデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の溶液を受け取るための第１の入口と、
（ｂ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れを提供するための、第１の入口と流体連通している第１の入口マイクロチャネルと；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の溶液を受け取るための第２の入口と；
（ｄ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを提供するための、第２の入口と流体連通している第２の入口マイクロチャネルと；
（ｅ）第１および第２の流れを受け取るための第３のマイクロチャネルであって、層流条件下でマイクロチャネルに導入された第１および第２の流れを流すように適合されている第１の領域と、第１および第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を含む第３の流れを提供するように適合されている第２の領域とを有する第３のマイクロチャネルと
を備えるデバイスを提供する。

一実施形態では、デバイスは、第３の流れを希釈して、カプセル封入された核酸を有する安定化された脂質粒子を備える希釈流を提供するための手段をさらに備える。特定の実施形態では、第３の流れを希釈するための手段は、マイクロミキサーを備える。

一実施形態では、マイクロチャネルは、約２０〜約３００μｍの流体力学直径を有する。

一実施形態では、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を備える。一実施形態では、マイクロチャネルの第２の領域は、主要な流れ方向および少なくとも１つの溝または突起部が画定されている１つまたは複数の表面を有し、溝または突起部は、主要な方向と角度を形成する配向を有する。一実施形態では、第２の領域は、マイクロミキサーを備える。

特定の実施形態では、デバイスは、第１および第２の流れの流速を変更するための手段をさらに備える。

特定の実施形態では、デバイスは、第１の領域において、１つまたは複数の第１の流れを、１つまたは複数の第２の流れから物理的に分離するのに有効な障壁をさらに備える
上記の態様および本発明の付随する利点の多くは、添付の図面と併せて、以下の詳細な説明を参照することによってより良好に理解されると、より容易に理解されるであろう。

本発明の代表的な流体デバイスの概略図。 図１に示されるデバイスを精緻化したものである本発明の代表的な流体デバイスの概略図。 図２に示されるデバイスを精緻化したものである本発明の代表的な流体デバイスの概略図。 本発明の代表的な流体デバイスおよび方法の概略図。 １０個の図４に示される流体デバイスを備える本発明の代表的なアレイの概略図。 本発明の代表的な流体デバイスの概略図。 １０個の図６に示される代表的な流体デバイスを備える本発明の代表的なアレイの概略図。 ３つの入口および単一の出口を有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図（デバイス８００は、混合チャネル８１０を含む）。 ２つの入口および単一の出口を有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図（デバイス９００は、混合チャネル９１０を含む）。 多数（ｎ）の一連の入口および単一の出口を有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図（デバイス１０００は、混合チャネル１０１０ａ、１０１０ｂ、１０１０ｃおよび１０１０ｄを含む）。 ３つの入口および単一の出口を有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図（デバイス１１００は、混合チャネル１１１０ａ、１１１０ｂおよび１１１０ｃを含む）。 ７つの入口および単一の出口を有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図（デバイス１２００は、混合チャネル１２１０ａ、１２１０ｂ、１２１０ｃおよび１２１０ｄを含む）。 多層型ミキサーを有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図（デバイス１３００は、混合チャネル１３１０を含む）。 図１４に示される多層型ミキサーのクローズアップ図。 脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製造する本発明の代表的なマイクロ流体（ＭＦ）法の概略図：脂質−エタノールおよびｓｉＲＮＡ−水溶液を、マイクロ流体混合デバイスの入口にポンプで入れ；デバイス中のヘリンボーン状の特徴が、層流のカオス的移流を誘発し、脂質種を、水性流と迅速に混合させ、脂質ナノ粒子を形成させる。混合チャネルは、２００μｍの幅で７９μｍの高さである。ヘリンボーン状の構造は、３１μｍの高さで、５０μｍの厚さである。

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を製造するための予備形成ベシクル（ＰＦＶ）法の概略図示す図（ａ）脂質−エタノール溶液を、水溶液、ｐＨ４．０に加えると、その結果、ベシクル型粒子が形成され；（ｂ）Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒを使用して、室温で８０ｎｍポリカーボネートメンブレン（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通して押し出すと、より均一な粒子分布が得られ；（ｃ）ボルテックス処理をしながらｓｉＲＮＡ溶液を加え、３５℃で３０分間インキュベートすることによって、ｓｉＲＮＡのカプセル封入が促進される。
混合およびＬＮＰ粒子サイズに対するマイクロ流体デバイス中の流速の影響を示す図。２種の１０μＭフルオレセイン（ｐＨ８．８で蛍光、ｐＨ５．１５で非蛍光）溶液を混合して完全に蛍光の溶液を製造する。図１６Ａは、平均流体速度および移動の長さ（０．２、０．８、１．４および２ｍＬ／ｍｉｎ）から算出される混合時間（ｍｓｅｃ）の関数として、チャネル幅に沿った平均蛍光強度によって決定される混合の程度（％）を比較する。 混合およびＬＮＰ粒子サイズに対するマイクロ流体デバイス中の流速の影響を示す図。図１６Ｂは、４０：１１．５：４７．５：１のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ｓｉＲＮＡ−総脂質比０．０６ｗｔ／ｗｔからなるＬＮＰの平均粒径を、ｓｉＲＮＡを含有する２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４と混合した１０ｍＭ脂質−エタノール相と比較する。図１６Ｂは、流速（ｍＬ／ｍｉｎ）の関数としてＬＮＰの平均粒径（ｎｍ）を比較する。 混合およびＬＮＰ粒子サイズに対するマイクロ流体デバイス中の流速の影響を示す図。１６Ｃは、４０：１１．５：４７．５：１のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ｓｉＲＮＡ−総脂質比０．０６ｗｔ／ｗｔからなるＬＮＰの平均粒径を、ｓｉＲＮＡを含有する２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４と混合した１０ｍＭ脂質−エタノール相と比較する。図１６Ｃは、エタノール／水性流速比の関数としてＬＮＰの平均粒径（ｎｍ）を比較する。エラーバーは、動的光散乱によって測定される平均粒径の標準偏差を表す。 エタノール（ｍＭ）中の脂質濃度の関数として平均粒径（ｎｍ）を比較することによってＬＮＰ粒子サイズに対する脂質濃度の影響を示す図。脂質濃度の増大の結果、平均粒径が増大する。マイクロ流体チップ中で混合されているエタノール相中の総脂質含量を１０ｍＭ〜５０ｍＭで変えた。ＬＮＰは、４０：１１．５：４７．５：１のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ｓｉＲＮＡ−総脂質比０．０６ｗｔ／ｗｔからなる。マイクロ流体ミキサーの内側の総流速は、２ｍｌ／ｍｉｎで維持した。エラーバーは、動的光散乱によって測定される平均粒径の標準偏差を表す。 ＬＮＰシステムに対するＰＥＧ−脂質およびカチオン性脂質の影響を示す図。図１８Ａは、ＰＦＶおよびＭＦ法によって調製されたＬＮＰの、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ含量（ＬＮＰ中のｍｏｌ％）の関数としての平均粒径（ｎｍ）を比較する。ＰＥＧ−脂質を、ＬＮＰ組成中、１ｍｏｌ％〜１０ｍｏｌ％で変えた。ＰＥＧ脂質含量の改変は、コレステロール含量の調整によって補った。ＬＮＰは、４０：１１．５：４７．５：１（−ｘ）：１（＋ｘ）、（ここで、ｘ＝１〜９）のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ｓｉＲＮＡ−総脂質比０．０６ｗｔ／ｗｔからなっていた。 ＬＮＰシステムに対するＰＥＧ−脂質およびカチオン性脂質の影響を示す図。図１８Ｂは、ＰＦＶおよびＭＦ法によって調製されたＬＮＰの、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ含量（ｍｏｌ％）の関数としての平均粒径（ｎｍ）を比較する。カチオン性脂質は、４０ｍｏｌ％〜７０ｍｏｌ％で変えた。ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡは、１ｍｏｌ％で一定に維持し、ＤＳＰＣ−コレステロールを用いて０．２５モル比を維持した。マイクロ流体ミキサー内の総流速は、２ｍｌ／ｍｉｎで維持した。ｓｉＲＮＡを含有する２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４と混合した１０ｍＭの脂質−エタノール相。エラーバーは、動的光散乱によって測定される平均粒径の標準偏差を表す。 ｓｉＲＮＡ／脂質比（ｗｔ／ｗｔ）（ヌクレオチド（nucelotide）／ホスフェート（Ｎ／Ｐ）としても表される）の関数として、平均粒径（ｎｍ）およびカプセル封入（％）を比較することによって、粒子サイズおよびカプセル封入に対するｓｉＲＮＡ／脂質比の影響を示す図。アニオン交換スピンカラムを使用する遊離ｓｉＲＮＡからのＬＮＰ懸濁液の分離によって求めたカプセル封入。ＬＮＰは、４０：１１．５：４７．５：１のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ｓｉＲＮＡ−総脂質比０．０６ｗｔ／ｗｔからなっていた。マイクロ流体ミキサー内の総流速は、２ｍｌ／ｍｉｎで維持した。ｓｉＲＮＡを含有する２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４と混合した１０ｍＭ脂質−エタノール相。エラーバーは、動的光散乱によって測定される平均粒径の標準偏差を表す。 低温透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用した、マイクロ流体ミキサーによって調製されたＰＥＧ−脂質およびカチオン性脂質ＬＮＰシステムの形態を示す図。Ｃｒｙｏ−ＴＥＭによって２９Ｋ倍率でＬＮＰを撮像した。図２０Ａは、４０：１１．５：４７．５：１のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡからなる空のＬＮＰの像である。 低温透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を使用した、マイクロ流体ミキサーによって調製されたＰＥＧ−脂質およびカチオン性脂質ＬＮＰシステムの形態を示す図。図２０Ｂは、４０：１１．５：４７．５：１のモル比のＤｌｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ、ｓｉＲＮＡ−総脂質比０．０６ｗｔ／ｗｔからなるｓｉＲＮＡを入れたＬＮＰの像である。製剤は、エタノール相中２０ｍＭ脂質でマイクロ流体ミキサーを使用して実施した。中に入っているＬＮＰ−ｓｉＲＮＡおよび空の粒子を含有する１ｍｏｌ％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧは、同一の形態を示し、構造において極めて均質であった。スケールバーは、１００ｎｍを表す。 ４０ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％でＬＮＰ中のＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ含量を変えて、ｓｉＲＮＡ投与量（ｍｇ／ｋｇ）の関数として相対ＦＶＩＩタンパク質レベル（％）を比較することによって、第ＶＩＩ因子マウスモデルにおけるマイクロ流体によって製造されたＬＮＰのｉｎ ｖｉｖｏサイレンシング活性を示す図。１ｍｏｌ％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧおよび６０ｍｏｌ％ ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含有するＬＮＰの製剤によって、代替アプローチを使用してこれまでに報告されたものと同様のＦＶＩＩサイレンシングが得られる。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ含有ＬＮＰの遺伝子サイレンシングは、４０ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％の範囲にわたって徐々に向上する。マウスへのＬＮＰ−ｓｉＲＮＡの全身注射は、尾静脈注射によって実施した（ｎ＝用量レベルあたり３）。血液採取は、注射の２４時間後に実施し、第ＶＩＩ因子レベルを比色アッセイによって調べた。ＬＮＰ ＤＳＰＣ対コレステロール比は、０．２ｗｔ／ｗｔで維持し、１ｍｏｌ％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有していた。ＬＮＰ ｓｉＲＮＡ対脂質比は、０．０６ｗｔ／ｗｔとした。 マイクロ流体法によって調製された脂質ナノ粒子の低温電子顕微鏡検査を示す図。マイクロ流体によって調製された空の脂質ナノ粒子（４０％ ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、１１．５％ ＤＳＰＣ、４７．５％コレステロール、１％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）は、固体コア構造を示す電子密度の高い内部を示した（図２２Ａ）。 マイクロ流体法によって調製された脂質ナノ粒子の低温電子顕微鏡検査を示す図。ＰＯＰＣからなるサンプルは、水性コアベシクルに相当する密度の低い内部を示した（図２２Ｂ）。 マイクロ流体法によって調製された脂質ナノ粒子の低温電子顕微鏡検査を示す図。単層のＰＯＰＣによって囲まれたトリオレインの疎水性コアを有するＰＯＰＣ／トリオレインを含有するシステムは、サンプルＡと同様の電子密度の高い内部を示した（図２２Ｃ）。 ｓｉＲＮＡの存在下で（Ｎ／Ｐ＝１）、またｓｉＲＮＡの非存在下で（ｓｉＲＮＡなし）製造されたＬＮＰのエタノール／水性流速比の関数として平均粒径（ｎｍ）を比較することによって、マイクロ流体混合を使用してＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ／ＰＥＧ−脂質システム（９０／１０、ｍｏｌ／ｍｏｌ）を用いて調製された限界サイズＬＮＰを示す図。製剤は、２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４と混合した１０ｍＭ脂質−エタノール相を使用して実施した。粒子サイズは、動的光散乱によって決定し、数加重平均直径を報告する。 マイクロ流体混合を使用して、５０％ ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、４５％コレステロールおよび５％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ中でカプセル封入されたｓｉＲＮＡの³¹Ｐ ＮＭＲを示す図。ＤＳＰＣは、リン脂質から生じるリンシグナルが対立するのを避けるために省略した。無傷のＬＮＰについて（図２４Ａ）または１５０ｍＭの酢酸アンモニウムの添加後には（図２４Ｂ）、ｓｉＲＮＡからの³¹Ｐシグナルは検出できない。シグナルは、粒子を可溶化するための１％ ＳＤＳの添加後にのみ検出できる（図２４Ｃ）。 ＲＮアーゼ保護アッセイの結果を示す電気泳動ゲルを示す図である図。ｓｉＲＮＡは、マイクロ流体法（ＭＦ）またはＰＦＶアプローチのいずれかを使用してカプセル封入するか、カプセル封入しないままとした。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えて、脂質粒子を完全に可溶化し、溶解した。ゲル電気泳動を２０％未変性ポリアクリルアミドゲルで実施し、ＣＹＢＲ−Ｓａｆｅを用いて染色することによってｓｉＲＮＡを可視化した。 時間（秒）の関数としての脂質混合パーセントとして表される脂質混合融合アッセイの結果を示す図。ＬＮＰの最外層中に存在する曝露されたカチオン性脂質の量を評価するために、３つのＬＮＰシステムを、ｓｉＲＮＡの不在下で（ｓｉＲＮＡなし）、Ｎ／Ｐ＝４およびＮ／Ｐ＝１で調製した。脂質アッセイは、ｐＨ５．５で実施して、カチオン性脂質のほぼ完全なイオン化を確実にし、ＬＮＰを、高度にアニオン性のＤＯＰＳ／ＮＢＤ−ＰＥ／Ｒｈ−ＰＥ（９８：１：１モル比）ベシクルを含有するキュベットに注入することによって反応を開始した。 本発明の方法に従うマイクロ流体混合によって形成された、固体コアＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの模式図。 マイクロ流体ミキサーを使用して調製された逐次脂質ナノ粒子組成物の関数としての平均粒径（ｎｍ）を示す図。 マイクロ流体ミキサーを使用して調製された逐次脂質ナノ粒子組成物の関数としてのゼータ電位（ｍＶ）を示す図。 脂質ナノ粒子の逐次アセンブリーのための本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図。 本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図。 本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図。 本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図。 本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図。

本発明は、治療薬を含有する脂質粒子、治療薬を含有する脂質粒子を製造するための方法およびデバイスならびに脂質粒子を使用して治療薬を送達する方法を提供する。

［脂質粒子］
一態様では、本発明は、治療薬を含有する脂質粒子を提供する。脂質粒子は、１つまたは複数のカチオン性脂質、１つまたは複数の第２の脂質および１つまたは複数の核酸を含む。

［カチオン性脂質］ 脂質粒子は、カチオン性脂質を含む。本明細書において、用語「カチオン性脂質」とは、カチオン性であるか、またはｐＨが脂質のイオン化できる基のｐＫより低下するとカチオン性（プロトン化）になるが、高いｐＨ値では徐々により中性になる脂質を指す。ｐＫより低いｐＨ値では、脂質は負に帯電した核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）と結合できる。本明細書において、用語「カチオン性脂質」は、ｐＨ低下時には正電荷を帯びる両性イオン脂質を含む。

用語「カチオン性脂質」とは、生理学的ｐＨなどの選択的ｐＨで正味の正電荷を保持する任意のいくつかの脂質種を指す。このような脂質として、それだけには限らないが、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチル塩化アンモニウム（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル塩化アンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。さらに、本発明において使用できる、カチオン性脂質のいくつかの市販の調製物が利用可能である。これらとして、例えば、リポフェクチン（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ製の、ＤＯＴＭＡおよび１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）を備える市販のカチオン性リポソーム）；リポフェクタミン（登録商標）（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ製の、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）および（ＤＯＰＥ）を備える市販のカチオン性リポソーム）；およびトランスフェクタム（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ製のエタノール中にジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）を備える市販のカチオン性脂質）が挙げられる。以下の脂質は、カチオン性であり、生理学的ｐＨよりも下で正電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。

一実施形態では、カチオン性脂質は、アミノ脂質である。本発明において有用な適したアミノ脂質として、参照によりその全文が本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０９６５５８に記載されるものが挙げられる。代表的なアミノ脂質として、１，２−ジリノレイオキシ−３−（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＤＡＣ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−モルホリノプロパン（ＤＬｉｎ−ＭＡ）、１，２−ジリノレオイル−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルチオ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−Ｓ−ＤＭＡ）、１−リノレオイル−２−リノレイルオキシ−３−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ−２−ＤＭＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＭＡ−Ｃｌ）、１，２−ジリノレオイル−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＬｉｎ−ＴＡＰ−Ｃｌ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ−メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ−ＭＰＺ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジリノレイルアミノ）−１，２−プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３−（Ｎ，Ｎ−ジオレイルアミノ）−１，２−プロパンジオ（ｄｉｏ）（ＤＯＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキソ−３−（２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ−ＥＧ−ＤＭＡ）および２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ）が挙げられる。

適したアミノ脂質として、次式：

［式中、Ｒ₁およびＲ₂は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ₁₀〜Ｃ₂₄アルキル、任意に置換されたＣ₁₀〜Ｃ₂₄アルケニル、任意に置換されたＣ₁₀〜Ｃ₂₄アルキニルまたは任意に置換されたＣ₁₀〜Ｃ₂₄アシルであり；
Ｒ₃およびＲ₄は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ₁〜Ｃ₆アルキル、任意に置換されたＣ₂〜Ｃ₆アルケニルもしくは任意に置換されたＣ₂〜Ｃ₆アルキニルであるか、またはＲ₃およびＲ₄は結合して、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有する任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ₅は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は水素またはＣ₁〜Ｃ₆アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同一であるかまたは異なり、独立に、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；
ＹおよびＺは、同一であるかまたは異なり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである］
を有するものが挙げられる。

一実施形態では、Ｒ₁およびＲ₂は各々、リノレイルであり、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。一実施形態では、アミノ脂質は、ジリノレイルアミノ脂質である。

代表的な有用なジリノレイルアミノ脂質は、次式：

［式中、ｎは、０、１、２、３または４である］
を有する。

一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡである。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（上記のＤＬｉｎ−Ｋ−ＤＭＡ、ここで、ｎは２である）。

その他の適したカチオン性脂質として、具体的に上に記載されるものに加えて、ほぼ生理学的ｐＨで正味の正電荷を保持するカチオン性脂質、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ−Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；１，２−ジオレイルオキシ−３−トリメチルアミノプロパン塩化物塩（ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ）；３β−（Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキサミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムトリフルオロアセテート（trifluoracetate）（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）およびＮ−（１，２−ジミリスチルオキシプロパ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）が挙げられる。さらに、例えば、リポフェクチン（ＤＯＴＭＡおよびＤＯＰＥを含む、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）およびリポフェクタミン（ＤＯＳＰＡおよびＤＯＰＥを備える、ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手可能）など、いくつかの市販のカチオン性脂質の調製物も使用してよい。

カチオン性脂質は、脂質粒子中に、約３０〜約９５モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質は、脂質粒子中に、約３０〜約７０モルパーセントの量で存在する。一実施形態では、カチオン性脂質は、脂質粒子中に、約４０〜約６０モルパーセントの量で存在する。

一実施形態では、脂質粒子は、１つまたは複数のカチオン性脂質と、１つまたは複数の核酸のみを含む（「からなる」）。カチオン性脂質および核酸からなる本発明の脂質粒子の調製および特性決定は、例５に記載する。

［第２の脂質］ 特定の実施形態では、脂質粒子は、１つまたは複数の第２の脂質を含む。適した第２の脂質は、粒子の形成の際にその形成を安定化する。

用語「脂質」とは、脂肪酸のエステルであり、水に不溶性であるが、多くの有機溶媒には可溶性であることを特徴とする有機化合物の群を指す。脂質は、普通、少なくとも３つのクラス：（１）脂肪およびオイルならびに蝋を含む「単純脂質」；（２）リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」ならびに（３）ステロイドなどの「誘導脂質」に分けられる。

適した安定化脂質として、中性脂質およびアニオン性脂質が挙げられる。

［中性脂質］ 用語「中性脂質」とは、生理学的ｐＨで、無電荷または中性いずれかの両性イオンの形態で存在するいくつかの脂質種のいずれか１つを指す。代表的な中性脂質として、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドが挙げられる。

例示的脂質として、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）およびジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジル（phosphatidy）エタノールアミン（ＳＯＰＥ）および１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ（phopho）エタノールアミン（トランスＤＯＰＥ）が挙げられる。

一実施形態では、中性脂質は、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。

［アニオン性脂質］ 用語「アニオン性脂質」とは、生理学的ｐＨで負に帯電している任意の脂質を指す。これらの脂質として、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノール−アミン、Ｎ−スクシニルホスファチジルエタノールアミン、Ｎ−グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイル（oleyol）ホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）および中性脂質と結合しているその他のアニオン性修飾基が挙げられる。

その他の適した脂質として、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシドＧＭ₁）が挙げられる。その他の適した第２の脂質として、ステロール、例えば、コレステロールが挙げられる。

［ポリエチレングリコール−脂質］ 特定の実施形態では、第２の脂質は、ポリエチレングリコール−脂質である。適したポリエチレングリコール−脂質として、ＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾されたセラミド（例えば、ＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４またはＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾されたジアルキルグリセロールが挙げられる。代表的なポリエチレングリコール−脂質として、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡおよびＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧが挙げられる。一実施形態では、ポリエチレングリコール−脂質は、Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）₂₀₀₀）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシ（dimyristyloxl）プロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一実施形態では、ポリエチレングリコール−脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ）である。

特定の実施形態では、第２の脂質は、約１〜約１０モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。一実施形態では、第２の脂質は、約１〜約５モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。一実施形態では、第２の脂質は、約１モルパーセントの量で脂質粒子中に存在する。

［核酸］ 本発明の脂質粒子は、核酸の全身または局所送達にとって有用である。本明細書に記載されるように、核酸は、脂質粒子の形成の際に脂質粒子中に組み込まれる。

本明細書において、用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むものとする。最大５０ヌクレオチドを含有する断片は、一般に、オリゴヌクレオチドと呼ばれ、より長い断片は、ポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、２０〜５０ヌクレオチドの長さである。本発明の関連で、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」とは、天然に存在する塩基、糖および糖間（主鎖）結合からなる、ヌクレオチドまたはヌクレオシドモノマーのポリマーまたはオリゴマーを指す。用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」はまた、同様に機能する天然に存在しないモノマーまたはその一部を備えるポリマーまたはオリゴマーを含む。このような修飾または置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、増強された細胞取り込みおよびヌクレアーゼの存在下での安定性の増大などの特性のために未変性の形態を上回って好ましいことが多い。オリゴヌクレオチドは、デオキシリボオリゴヌクレオチドまたはリボオリゴヌクレオチドとして分類される。デオキシリボオリゴヌクレオチドは、代替の非分岐ポリマーを形成するよう、この糖の５’および３’炭素でリン酸と共有結合によって結合しているデオキシリボース（deosyhbose）と呼ばれる５炭糖からなる。リボオリゴヌクレオチドは、５炭糖がリボースである同様の反復構造からなる。本発明による脂質粒子中に存在する核酸は、公知である核酸の任意の形態を含む。本明細書に使用される核酸は、一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドであり得る。二本鎖ＤＮＡの例として、構造遺伝子、制御領域および終結領域を含む遺伝子、ウイルスまたはプラスミドＤＮＡなどの自己複製系が挙げられる。二本鎖ＲＮＡの例として、ｓｉＲＮＡおよびその他のＲＮＡ干渉試薬が挙げられる。一本鎖核酸として、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、マイクロＲＮＡおよび三重鎖形成オリゴヌクレオチドが挙げられる。

一実施形態では、ポリ核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、核酸は、アンチセンス核酸、リボザイム、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、予備縮合（pre-condensed）ＤＮＡまたはアプタマーである。

用語「核酸」とはまた、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、修飾ホスフェート−糖−主鎖オリゴヌクレオチド、その他のヌクレオチド、ヌクレオチド類似体およびそれらの組合せを指し、一本鎖であっても、二本鎖であってもよく、または必要に応じて、二本鎖および一本鎖配列両方の部分を含有してもよい。

本明細書において、用語「ヌクレオチド」とは、一般に、以下に定義される以下の用語を包含する：ヌクレオチド塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド類似体およびユニバーサルヌクレオチド。

本明細書において、用語「ヌクレオチド塩基」とは、置換または非置換親芳香環（単数または複数）を指す。いくつかの実施形態では、芳香環（単数または複数）は、少なくとも１個の窒素原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド塩基は、適切に相補的なヌクレオチド塩基とワトソン−クリックおよび／またはフーグスティーン水素結合を形成できる。例示的ヌクレオチド塩基およびその類似体として、それだけには限らないが、プリン、例えば、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、アデニン（Ａ）、エテノアデニン、Ｎ６−２−イソペンテニルアデニン（６ｉＡ）、Ｎ６−２−イソペンテニル−２−メチルチオアデニン（２ｍｓ６ｉＡ）、Ｎ６−メチルアデニン、グアニン（Ｇ）、イソグアニン、Ｎ２−ジメチルグアニン（ｄｍＧ）、７−メチルグアニン（７ｍＧ）、２−チオピリミジン、６−チオグアニン（６ｓＧ）ヒポキサンチンおよびＯ６−メチルグアニン；７−デアザ−プリン、例えば、７−デアザアデニン（７−デアザ−Ａ）および７−デアザグアニン（７−デアザ−Ｇ）；ピリミジン、例えば、シトシン（Ｃ）、５−プロピニルシトシン、イソシトシン、チミン（Ｔ）、４−チオチミン（４ｓＴ）、５，６−ジヒドロチミン、Ｏ４−メチルチミン、ウラシル（Ｕ）、４−チオウラシル（４ｓＵ）および５，６−ジヒドロウラシル（ジヒドロウラシル；Ｄ）；インドール、例えば、ニトロインドールおよび４−メチルインドール；ピロール、例えば、ニトロピロール；ネブラリン；塩基（Ｙ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド塩基は、ユニバーサルヌクレオチド塩基である。さらなる例示的ヌクレオチド塩基は、Ｆａｓｍａｎ、１９８９年、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、３８５〜３９４頁、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａ．およびそれに引用される参考文献に見出すことができる。ユニバーサル塩基のさらなる例は、例えば、Ｌｏａｋｅｓ、Ｎ．Ａ．Ｒ．２００１年、第２９巻：２４３７〜２４４７頁およびＳｅｅｌａ Ｎ．Ａ．Ｒ．２０００年、第２８巻：３２２４〜３２３２頁に見出すことができる。

本明細書において、用語「ヌクレオシド」とは、ペントース糖のＣ−１’炭素と共有結合によって結合しているヌクレオチド塩基を有する化合物を指す。いくつかの実施形態では、結合は、複素芳香環窒素を介する。通常のペントース糖として、それだけには限らないが、１個または複数の炭素原子が、１つまたは複数の同一であるかまたは異なる−Ｒ、−ＯＲ、−ＮＲＲまたはハロゲン基で各々独立に置換されているペントースが挙げられ、ここで、各Ｒは、独立に、水素、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルまた（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールである。ペントース糖は、飽和または不飽和であり得る。例示的ペントース糖およびその類似体として、それだけには限らないが、リボース、２’−デオキシリボース、２’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボース、２’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボース、２’，３’−ジデオキシリボース、２’，３’−ジデヒドロリボース、２’−デオキシ−３’−ハロリボース、２’−デオキシ−３’−フルオロリボース、２’−デオキシ−３’−クロロリボース、２’−デオキシ−３’−アミノリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルリボース、２’−デオキシ−３’−（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシリボースおよび２’−デオキシ−３’−（Ｃ５〜Ｃ１４）アリールオキシリボースが挙げられる。また、例えば、２’−Ｏ−メチル、４’−α−アノマーヌクレオチド、１’−α−アノマーヌクレオチド（Ａｓｓｅｌｉｎｅ （１９９１年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１９巻：４０６７〜７４頁）、２’−４’−および３’−４’−結合およびその他の「ロックド」または「ＬＮＡ」、二環式糖修飾（ＷＯ９８／２２４８９；ＷＯ９８／３９３５２；ＷＯ９９／１４２２６）も参照のこと。「ＬＮＡ」または「ロックド核酸」は、リボース環が、２’−酸素と３’−または４’−炭素間のメチレン結合によって制約されるように立体構造的にロックされたＤＮＡ類似体である。結合によって課される立体構造制限は、相補的配列の結合親和性を高め、このような二本鎖の熱安定性を高めることが多い。

糖は、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、メトキシエチル、アルコキシ、フェノキシ、アジド、アミノ、アルキルアミノ、フルオロ、クロロおよびブロモなどの２’−または３’位の修飾を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、天然Ｄ立体配置異性体（Ｄ型）、ならびにＬ立体配置異性体（Ｌ型）（Ｂｅｉｇｅｌｍａｎ、米国特許第６，２５１，６６６号；Ｃｈｕ、米国特許第５，７５３，７８９号；Ｓｈｕｄｏ、ＥＰ０５４０７４２；Ｇａｒｂｅｓｉ（１９９３年）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第２１巻：４１５９〜６５頁；Ｆｕｊｉｍｏｒｉ（１９９０年）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１２巻：７４３５頁；Ｕｒａｔａ、（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒ．第２９巻：６９〜７０頁）を含む。核酸塩基がプリン、例えば、ＡまたはＧである場合は、リボース糖は、核酸塩基のＮ９−位と結合している。核酸塩基が、ピリミジン、例えば、Ｃ、ＴまたはＵである場合は、ペントース糖は、核酸塩基のＮ１−位と結合している（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｂａｋｅｒ、（１９９２年）ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ、２．ｓｕｐ．ｎｄ Ｆｒｅｅｍａｎ編、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆ．）。

ヌクレオシドの１個または複数のペントース炭素は、リン酸エステルで任意に置換された。いくつかの実施形態では、リン酸エステルは、ペントースの３’−または５’−炭素と結合している。いくつかの実施形態では、ヌクレオシドは、ヌクレオチド塩基が、プリン、７−デアザプリン、ピリミジン、ユニバーサルヌクレオチド塩基、特定のヌクレオチド塩基またはその類似体であるものである。

本明細書において、用語「ヌクレオチド類似体」とは、ペントース糖および／またはヌクレオチド塩基および／またはヌクレオシドの１個もしくは複数のリン酸エステルが、そのそれぞれの類似体で任意に置換された実施形態を指す。いくつかの実施形態では、例示的ペントース糖類似体は、上記のものである。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド類似体は、上記のヌクレオチド塩基類似体を有する。いくつかの実施形態では、例示的リン酸エステル類似体として、それだけには限らないが、アルキルホスホネート、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニリデート、ホスホロアミデート、ボロノホスフェートが挙げられ、関連対イオンを含み得る。その他の核酸類似体および塩基として、例えば、介在核酸（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ａｎｄ Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、２００２年に記載されるＩＮＡ）およびＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ、米国特許第５，４３２，２７２号）が挙げられる。種々の核酸類似体のさらなる説明は、例えば、（Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９（１０）：１９２５頁（１９９３年）およびその中の参考文献；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第３５巻：３８００頁（１９７０年）；Ｓｐｒｉｎｚｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第８１巻：５７９頁（１９７７年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１４巻：３４８７頁（１９８６年）；Ｓａｗａｉら、Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．８０５頁（１９８４年）、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ． Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１０巻：４４７０頁（１９８８年）；およびＰａｕｗｅｌｓら、Ｃｈｅｍｉｃａ Ｓｃｒｉｐｔａ第２６巻：１４１ ９１９８６））、ホスホロチオエート（Ｍａｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１９巻：１４３７頁（１９９１年）；および米国特許第５，６４４，０４８号にも見出すことができる。その他の核酸（nucleic）類似体は、ホスホロジチオエート（Ｂｒｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１１巻：２３２１頁（１９８９年）、Ｏ−メチルホスホロアミダイト（phophoroamidite）結合（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ参照のこと）、正の主鎖を有するもの（Ｄｅｎｐｃｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第９２巻：６０９７頁（１９９５年）；非イオン性主鎖（米国特許第５，３８６，０２３号、同５，３８６，０２３号、同５，６３７，６８４号、同５，６０２，２４０号、同５，２１６，１４１号および同４，４６９，８６３号、Ｋｉｅｄｒｏｗｓｈｉら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ． Ｅｎｇｌｉｓｈ第３０巻：４２３頁（１９９１年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．第１１０巻：４４７０頁（１９８８年）；Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ ＆ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ第１３巻：１５９７頁（１９４）：第２章および第３章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編；Ｍｅｓｍａｅｋｅｒら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第４巻：３９５頁（１９９４年）；Ｊｅｆｆｓら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＮＭＲ第３４巻：１７頁（１９９４年）；Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．第３７巻：７４３頁（１９９６年））および非リボース主鎖、例えば、米国特許第５，２３５，０３３号および同５，０３４，５０６号ならびに第６章および第７章、ＡＳＣ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ Ｓｅｒｉｅｓ ５８０、「Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、Ｙ．Ｓ．ＳａｎｇｈｕｉおよびＰ．Ｄａｎ Ｃｏｏｋ編に記載されるものを備える。１つまたは複数の炭素環式糖を含有する核酸もまた、核酸の定義内に含まれる（Ｊｅｎｋｉｎｓら、Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．（１９９５年）１６９〜１７６頁参照のこと）。いくつかの核酸類似体がまた、Ｒａｗｌｓ、Ｃ ＆ Ｅ Ｎｅｗｓ１９９７年６月２日、３５頁に記載されている。

本明細書において、用語「ユニバーサルヌクレオチド塩基」または「ユニバーサル塩基」とは、窒素原子を含有する場合も、含有しない場合もある芳香環部分を指す。いくつかの実施形態では、ユニバーサル塩基を、ペントース糖のＣ−１’炭素と共有結合によって結合して、ユニバーサルヌクレオチドを製造してもよい。いくつかの実施形態では、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、別のヌクレオチド塩基と特異的に水素結合しない。いくつかの実施形態では、ユニバーサルヌクレオチド塩基は、特定の標的ポリヌクレオチド中、最大ですべてのヌクレオチド塩基を含めた、ヌクレオチド塩基と水素結合する。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド塩基は、疎水性スタッキングによって同一核酸鎖上の隣接するヌクレオチド塩基と相互作用し得る。ユニバーサルヌクレオチドとして、それだけには限らないが、デオキシ−７−アザインドールトリホスフェート（ｄ７ＡＩＴＰ）、デオキシイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＩＣＳＴＰ）、デオキシプロピニルイソカルボスチリルトリホスフェート（ｄＰＩＣＳＴＰ）、デオキシメチル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＭ７ＡＩＴＰ）、デオキシＩｍＰｙトリホスフェート（ｄＩｍＰｙＴＰ）、デオキシＰＰトリホスフェート（ｄＰＰＴＰ）またはデオキシプロピニル−７−アザインドールトリホスフェート（ｄＰ７ＡＩＴＰ）が挙げられる。このようなユニバーサル塩基のさらなる例は、中でも、米国特許出願第１０／２９０６７２号および米国特許第６，４３３，１３４号に見出すことができる。

本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用され、ヌクレオチド間リン酸ジエステル結合鎖、例えば、３’−５’および２’−５’、反転結合、例えば、３’−３’および５’−５’、分岐構造またはヌクレオチド間類似体によって連結された２’−デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）およびリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を含めたヌクレオチドモノマーの一本鎖および二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、Ｈ＋、ＮＨ４＋、トリアルキルアンモニウム、Ｍｇ２＋、Ｎａ＋などといった会合している対イオンを有する。ポリヌクレオチドは、完全にデオキシリボヌクレオチドからなる場合もあり、完全にリボヌクレオチドからなる場合もあり、それらのキメラ混合物からなる場合もある。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド間、核酸塩基および／または糖類似体からなる場合もある。ポリヌクレオチドのサイズは、通常、当技術分野で、オリゴヌクレオチドと呼ばれることが多い、数個の単量体の単位、例えば、３〜４０個から数千の単量体のヌクレオチドの単位の範囲である。別に示されない限り、ポリヌクレオチド配列が表される場合にはいつも、ヌクレオチドは、左から右に５’から３’の順であり、別に断りのない限り、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表し、「Ｃ」は、デオキシシトシンを表し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表し、「Ｔ」は、チミジンを表すと理解されよう。

本明細書において、「核酸塩基」とは、核酸技術を利用するか、またはペプチド核酸技術を利用し、それによって、核酸と配列特異的に結合できるポリマーを作製する人にはよく知られている、天然に存在する、および天然に存在しない複素環式部分を意味する。適した核酸塩基の限定されない例として、アデニン、シトシン、グアニン、チミン、ウラシル、５−プロピニル−ウラシル、２−チオ−５−プロピニル−ウラシル、５−メチルシトシン、シュードイソシトシン、２−チオウラシルおよび２−チオチミン、２−アミノプリン、Ｎ９−（２−アミノ−６−クロロプリン）、Ｎ９−（２，６−ジアミノプリン）、ヒポキサンチン、Ｎ９−（７−デアザ−グアニン）、Ｎ９−（７−デアザ−８−アザ−グアニン）およびＮ８−（７−デアザ−８−アザ−アデニン）が挙げられる。適した核酸塩基のその他の限定されない例として、Ｂｕｃｈａｒｄｔら（ＷＯ９２／２０７０２またはＷＯ９２／２０７０３）の図２（Ａ）および２（Ｂ）に示される核酸塩基が挙げられる。

本明細書において、「核酸塩基配列」とは、核酸塩基含有サブユニットを備えるポリマーの、任意のセグメントまたは２以上のセグメントの凝集体（例えば、２以上のオリゴマーブロックの凝集体核酸塩基配列）を意味する。適したポリマーまたはポリマーセグメントの限定されない例として、オリゴデオキシヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）、オリゴリボヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＰＮＡキメラ、ＰＮＡ組合せオリゴマー、核酸類似体および／または核酸ミミックが挙げられる。

本明細書において、「ポリ核酸塩基鎖」とは、核酸塩基サブユニットを備える完全な単一のポリマー鎖を意味する。例えば、二本鎖核酸の単一の核酸鎖は、ポリ核酸塩基鎖である。

本明細書において、「核酸」とは、核酸塩基配列含有ポリマーまたはヌクレオチドもしくはその類似体から形成される主鎖を有するポリマーセグメントである。

好ましい核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡである。

本明細書において、核酸はまた、核酸サブユニット（またはその類似体）だけでなく、２以上のＰＮＡサブユニット（残基）を備える、任意のオリゴマーまたはポリマーセグメント（例えば、ブロックオリゴマー）を意味する「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」を指す場合もあり、それだけには限らないが、そのすべてが参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，５３９，０８２号、同５，５２７，６７５号、同５，６２３，０４９号、同５，７１４，３３１号、同５，７１８，２６２号、同５，７３６，３３６号、同５，７７３，５７１号、同５，７６６，８５５号、同５，７８６，４６１号、同５，８３７，４５９号、同５，８９１，６２５号、同５，９７２，６１０号、同５，９８６，０５３号および同６，１０７，４７０号においてペプチド核酸として言及または特許請求されるオリゴマーまたはポリマーセグメントのいずれかを含む。用語「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」はまた、以下の刊行物に記載される核酸ミミックの２以上のサブユニットを備える任意のオリゴマーまたはポリマーセグメントにも適用されるべきである：Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４巻：１０８１〜１０８２頁（１９９４年）；Ｐｅｔｅｒｓｅｎら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第６巻：７９３〜７９６頁（１９９６年）；Ｄｉｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．第３７巻：４７５〜４７８頁（１９９６年）；Ｆｕｊｉｉら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第７巻：６３７〜６２７頁（１９９７年）；Ｊｏｒｄａｎら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．７：６８７〜６９０頁（１９９７年）；Ｋｒｏｔｚら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．第３６巻：６９４１〜６９４４頁（１９９５年）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．第４巻：１０８１〜１０８２頁（１９９４年）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第７巻：１７４３〜１７４６頁（１９９７年）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１、（１９９７年）１：５３９〜５４６頁；Ｌｏｗｅ ｅｔ Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．１１：５４７〜５５４頁（１９９７年）；Ｌｏｗｅら、Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．第１１巻：５５５〜５６０頁（１９９７年）；Ｈｏｗａｒｔｈら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．第６２巻：５４４１〜５４５０頁（１９９７年）；Ａｌｔｍａｎｎ，Ｋ−Ｈら、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ、第７巻：１１１９〜１１２２頁（１９９７年）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎ，Ｕ．、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．、第８巻：１６５〜１６８頁（１９９８年）；Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓｅｎら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．、第３７巻：３０２〜３０５頁（１９９８年）；Ｃａｎｔｉｎら、Ｔｅｔｔ．Ｌｅｔｔ．、第３８巻：４２１１〜４２１４頁（１９９７年）；Ｃｉａｐｅｔｔｉら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、第５３巻：１１６７〜１１７６頁（１９９７年）；Ｌａｇｒｉｆｆｏｕｌｅら、Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．、３：９１２〜９１９頁（１９９７年）；Ｋｕｍａｒら、Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ第３巻（９）：１２６９〜１２７２頁（２００１年）；およびＷＯ９６／０４０００において開示されるＳｈａｈらのＰｅｐｔｉｄｅ−Ｂａｓｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｍｉｍｉｃｓ（ＰＥＮＡＭＳ）。

［脂質粒子特徴］
［形態］ 本発明の脂質粒子は、その他の同様に構成された材料とは、その形態が異なり、実質的に固体のコアを有すると特徴付けられる。実質的に固体のコアを有する脂質粒子とは、内部に広がった水性領域を有さない、主に脂質である内部を有する粒子である。一実施形態では、広がった領域とは、粒子容積の半分を超える容積を有する連続する水性領域である。第２の実施形態では、広がった水性領域とは、粒子容積の２５％超である。内部水性領域の範囲は、電子顕微鏡によって決定してもよく、低電子密度の領域として見える。さらに、固体コアナノ粒子の内部は、主に脂質であるので、粒子を構成する脂質あたりの粒子の水性含量（「トラップ容積」）は、同じ半径を有する単層二分子膜脂質ベシクルについて予測されるものよりも少ない。一実施形態では、トラップ容積は、同じ半径の単層二分子膜ベシクルについて予測されるものの５０％未満である。第２の実施形態では、トラップ容積は、同じサイズの単層二分子膜ベシクルについて予測されるものの２５％未満である。第３の実施形態では、トラップ容積は、粒子の総容積の２０％未満である。一実施形態では、脂質あたりのトラップ容積は、脂質１マイクロモルあたり２マイクロリットル未満である。別の実施形態では、トラップ容積は、脂質１マイクロモルあたり１マイクロリットル未満である。さらに、ベシクルの半径が増大するにつれて、二分子膜脂質ベシクルの脂質あたりのトラップ容積は大幅に増大するが、固体コアナノ粒子の半径が増大するにつれて、脂質あたりのトラップ容積は大幅には増大しない。一実施形態では、脂質あたりのトラップ容積は、平均のサイズが直径２０ｎｍから直径１００ｎｍに増大するにつれ、５０％未満増大する。第２の実施形態では、脂質あたりのトラップ容積は、平均のサイズが直径２０ｎｍから直径１００ｎｍに増大するにつれ、２５％未満増大する。トラップ容積は、文献に記載される種々の技術を使用して測定できる。固体コアシステムは、粒子の内側に脂質を含有するので、脂質１モルあたりの、生じた所与の半径の粒子の総数は、二分子膜ベシクルシステムについて予測されるものより少ない。脂質１モルあたりの、生じた粒子の数は、中でも蛍光技術によって測定できる。

本発明の脂質粒子はまた、電子顕微鏡によっても特性決定できる。実質的に固体のコアを有する本発明の粒子は、電子顕微鏡によって見られるように、電子密度の高いコアを有する。電子密度が高いとは、固体コア粒子の投影された領域（２−Ｄ低温ＥＭ像において見られるような）の内部５０％の領域平均の電子密度が、粒子の外面での最大電子密度のｘ％未満ではない（ｘ＝２０％、４０％、６０％）ように定義される。電子密度は、ナノ粒子を含有しない領域におけるバックグラウンド強度からの、対象の領域の像の強度の相違の絶対値として算出する。

［粒子サイズ］ 本発明の脂質粒子は、約１５〜約３００ｎｍの直径（平均粒径）を有する。いくつかの実施形態では、脂質粒子は、約３００ｎｍ以下、２５０ｎｍ以下、２００ｎｍ以下、１５０ｎｍ以下、１００ｎｍ以下または５０ｎｍ以下の直径を有する。一実施形態では、脂質粒子は、約１５〜約１００ｎｍの直径を有する。これらの粒子は、一般に、大きな粒子と比較して、ｉｎ ｖｉｖｏでの循環寿命の増大を示す。一実施形態では、脂質粒子は、約１５〜約５０ｎｍの直径を有する。これらの粒子は、血管系を免れることができるので有利である。一実施形態では、脂質粒子は、約１５〜約２０ｎｍの直径を有する。これらの粒子は、核酸を含有する粒子の限界のサイズに近く；このような粒子は、単一のポリヌクレオチド（例えば、ｓｉＲＮＡ）を含み得る。

本発明の脂質粒子は、そのサイズ分布において実質的に均質である。特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、約６５〜約２５％の平均粒径標準偏差を有する。一実施形態では、本発明の脂質粒子は、約６０、５０、４０、３５または３０％の平均粒径標準偏差を有する。

［カプセル封入効率］ 本発明の脂質粒子は、カプセル封入効率によってさらに区別することができる。以下に記載するように、本発明の脂質粒子は、形成プロセスにおいて使用される核酸のほぼ１００％が、粒子中にカプセル封入されるプロセスによって調製される。一実施形態では、脂質粒子は、形成プロセスにおいて使用される核酸の約９０〜約９５％が、粒子中にカプセル封入されるプロセスによって調製される。

［脂質粒子を製造するためのマイクロ流体法］
一態様では、本発明は、治療薬を含有する脂質粒子を製造する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、
（ａ）第１の溶媒中に治療薬（例えば、ポリ核酸）を備える第１の流れを、マイクロチャネル中に導入することであって、マイクロチャネルは、マイクロチャネル中に導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する、ことと；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れをマイクロチャネルに導入して、層流条件下を流れる第１および第２の流れを提供することであって、脂質粒子形成材料は、イオン化できる脂質を備え、第１および第２の溶媒は、同一ではない、ことと；
（ｃ）マイクロチャネルの第１の領域から、マイクロチャネルの第２の領域に、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れを流すことと；
（ｄ）マイクロチャネルの第２の領域において層流条件下を流れる１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された治療薬を有する脂質粒子を備える第３の流れを提供することと
を含む。

第１および第２の流れの内容物は、カオス的移流によって混合してもよい。一実施形態では、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合することは、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの濃度または相対混合速度を変更することを備える。上記の実施形態では、既知方法とは異なり、本方法は、混合後の希釈を含まない。

本方法は、カプセル封入された治療薬を有する脂質粒子を含有する第３の流れをさらに安定化するために、第３の流れを水性バッファーで希釈することを備えることをさらに含んでもよいが、必要ではない。一実施形態では、第３の流れを希釈することは、第２の混合構造中に、第３の流れおよび水性バッファーを流すことを含む。別の実施形態では、カプセル封入された治療薬を有する脂質粒子を備える水性バッファーを透析して、第２の溶媒の量を低減する。

第１の流れは、第１の溶媒中に治療薬を含む。適した第１の溶媒は、治療薬が可溶性であり、第２の溶媒と混和できる溶媒を含む。適した第１の溶媒として、水性バッファーが挙げられる。代表的な第１の溶媒として、クエン酸および酢酸バッファーが挙げられる。

第２の流れは、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を含む。適した第２の溶媒として、イオン化できる脂質が可溶性であり、第１の溶媒と混和できる溶媒が挙げられる。適した第２の溶媒として、１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、酸およびアルコールが挙げられる。代表的な第２の溶媒として、水性エタノール９０％が挙げられる。

本発明の方法は、いくつかの点で、その他のマイクロ流体混合法から区別される。特定の既知方法が、同等または実質的に同等の割合の水性および有機溶媒（すなわち１：１）を必要とするが、本発明の方法は、一般に、１：１を越える水性対有機の溶媒比を使用する。特定の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約２：１である。特定の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約３：１である。特定の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約４：１である。特定のその他の実施形態では、水性対有機の溶媒比は、約５：１、約１０：１、約５０：１、約１００：１またはそれ以上である。

本発明の脂質粒子は、比較的迅速な混合および高い流速を利用するマイクロ流体プロセスにおいて形成されることが有利である。迅速な混合は、サイズ、均質性、カプセル封入効率を始めとする上記の有利な特性を有する脂質粒子を提供する。本発明の方法の実施において使用される混合速度は、約１００μｓｅｃ〜約１０ｍｓｅｃの範囲である。代表的な混合速度として、約１〜約５ｍｓｅｃが挙げられる。流体力学的フロー絞り込み法は、比較的低い脂質容積で、比較的低い流速（例えば、５〜１００μＬ／ｍｉｎ）で作動するが、本発明の方法は、比較的高い脂質容積で、比較的高い流速で作動する。特定の実施形態では、単一の混合領域（すなわち、ミキサー）を組み込む方法については、流速は、約１ｍＬ／ｍｉｎである。ミキサーアレイ（例えば、１０個のミキサー）を利用する本発明の方法については、４０ｍＬ／ｍｉｎの流速が使用される（１００個のミキサーには、流速４００ｍＬ／ｍｉｎ）。このように、本発明の方法は、容易に拡大縮小して、厳しい製造要求に必要な脂質粒子の量を提供できる。本発明の方法は、実現される有利な粒子サイズおよび均質性およびカプセル封入効率と相まって、脂質粒子を製造するための既知マイクロ流体法の不利点を克服する。脂質粒子を製造するための本発明の方法の１つの利点は、拡大縮小可能であることであり、これは、本方法が拡大縮小時に変わらないことおよび拡大縮小時に優れた対応があることを意味する。

［脂質粒子を製造するためのマイクロ流体デバイス］
別の態様では、本発明は、核酸をカプセル封入している脂質粒子を製造するためのデバイスを提供する。一実施形態では、デバイスは、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の溶液を受け取るための第１の入口と；
（ｂ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れを提供するための第１の入口と流体連通している第１の入口マイクロチャネルと；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の溶液を受け取るための第２の入口と；
（ｄ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを提供するための第２の入口と流体連通している第２の入口マイクロチャネルと；
（ｅ）第１および第２の流れを受け取るための第３のマイクロチャネルであって、層流条件下でマイクロチャネルに導入された第１および第２の流れを流すように適合されている第１の領域と、第１および第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える第３の流れを提供するように適合されている第２の領域とを有する第３のマイクロチャネルと
を含む。

一実施形態では、デバイスは、第３の流れを希釈して、安定化された、カプセル封入された治療薬を有する脂質粒子を備える希釈流を提供するための手段をさらに含む。

本発明のデバイスは、１つまたは複数のマイクロチャネル（すなわち、１ミリメートル未満の最大寸法を有するチャネル）を含むマイクロ流体デバイスである。一実施形態では、マイクロチャネルは、約２０〜約３００μｍの流体力学直径を有する。上記のように、マイクロチャネルは、２つの領域を有する：層流条件下で、少なくとも２つの流れを受け取り、流すための第１の領域（例えば、１つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れ）。第１および第２の流れの内容物は、マイクロチャネルの第２の領域において混合される。一実施形態では、マイクロチャネルの第２の領域は、参照によりその全文が本明細書に明確に組み込まれる、米国特許出願公開第２００４／０２６２２２３号に記載されるように、主要な流れの方向および本明細書に定義される少なくとも１つの溝または突起部を有する１つまたは複数の表面を有し、溝または突起部は、主要な方向と角度を形成する配向を有する（例えば、互い違いのヘリンボーン状ミキサー）。一実施形態では、マイクロチャネルの第２の領域は、浅浮き彫り構造を備える。最大混合速度を達成するためには、混合領域の前の過度の流体抵抗を避けることが有利である。したがって、本発明の一実施形態は、単一の混合チャネルに流体を送達するために１０００ミクロンを超える寸法を有する非マイクロ流体チャネルが使用されるデバイスである。

本発明のその他の態様では、第１および第２の流れを、その他のマイクロミキサーを用いて混合する。適したマイクロミキサーとして、液滴ミキサー、Ｔ−ミキサー、ジグザグミキサー、多層型ミキサーまたはその他のアクティブミキサーが挙げられる。

第１および第２の流れの混合はまた、第１および第２の流れの濃度および相対流速を変更するための手段を用いて達成できる。

別の実施形態では、核酸をカプセル封入している脂質粒子を製造するためのデバイスは、第１および第２の流れを受け取るためのマイクロチャネルを含み、マイクロチャネルは、層流条件下でマイクロチャネル中に導入された第１および第２の流れを流すように適合されている第１の領域と、第１および第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された治療薬を有する脂質粒子を備える第３の流れを提供するように適合されている第２の領域とを有する。この実施形態では、上記の第１および第２のマイクロチャネル以外の手段によって、第１および第２の流れをマイクロチャネル中に導入する。

最大混合速度を達成するためには、混合領域の前の過度の流体抵抗を避けることが有利である。したがって、本発明の一実施形態は、単一の混合チャネルに流体を送達するために１０００ミクロンを超える寸法を有する非マイクロ流体チャネルが使用されるデバイスである。核酸をカプセル封入している脂質粒子を製造するためのこのデバイスは、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の溶液と、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の溶液の両方を受け取るための単一の入口マイクロチャネルと；
（ｂ）第１および第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える第３の流れを提供するように適合されている第２の領域と
を含む。

このような実施形態では、第１および第２の流れは、単一の入口によって、またはマイクロ寸法を有さない１つもしくは２つのチャネル、例えば、１０００μｍを超える寸法（例えば、１５００または２０００μｍ以上）を有するチャネル（単数または複数）によってマイクロチャネル中に導入される。これらのチャネルは、隣接するまたは同心のマクロサイズチャネルを使用して入口マイクロチャネルに導入されてもよい。

図１は、本発明の代表的な流体デバイスの概略図である。図１を参照すると、デバイス１００は、第１の溶媒中に治療薬を備える第１の流れを受け取るための領域Ａと、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える流れを受け取るための領域Ｂとを含む。第１および第２の流れは、領域Ｃ中に導入され、層流条件下を、領域Ｄに流れ、ここで迅速な混合が起こり、次いで、領域Ｅに流れ、ここで、最終生成物、治療薬を含有する脂質粒子がデバイスを出る。

図２は、図１に示されるデバイスおよび方法を精緻化したものである、本発明の代表的な流体デバイスの概略図である。図２を参照すると、デバイス２００は、マイクロチャネル中に第１の溶媒中に治療薬を備える第１の流れを受け取るための領域Ａを含み、ここで、マイクロチャネルは、１つまたは複数の流れを流し（Ａ−ａ）、導入し（Ａ−ｂ）、混合する（Ａ−ｃ）ように適合されている第１の領域を有し；第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを受け取るための領域Ｂを含み、ここで、マイクロチャネルは、１つまたは複数の流れを流し（Ｂ−ａ）、導入し（Ｂ−ｂ）、混合する（Ｂ−ｃ）ように適合されている第１の領域を有し；層流条件下（Ｃ−ａ）で領域Ａおよび領域Ｂの流れを導入し、迅速に混合する（Ｃ−ｂ）領域Ｃを含み；製剤が希釈、ｐＨ調整またはナノ粒子合成に必要なその他の事象などのさらなる処理のために準備ができており、最終生成物、治療薬を含有する脂質粒子がデバイスを出る領域Ｄを含む。

図３は、図２に示されるデバイスおよび方法を精緻化したものである、本発明の代表的な流体デバイスの概略図である。図３を参照すると、デバイス３００は、第１の溶媒中に治療薬を備える第１の流れを受け取り、マイクロチャネル中に入る領域Ａを含み、ここで、マイクロチャネルは、１つまたは複数の流れを流し（Ａ−ａ）、導入し（Ａ−ｂ）、混合する（Ａ−ｃ）ように適合されている第１の領域を有し；第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを受け取るための領域Ｂを含み、ここで、マイクロチャネルは、１つまたは複数の流れを流し（Ｂ−ａ）、導入し（Ｂ−ｂ）、混合する（Ｂ−ｃ）ように適合されている第１の領域を有し；層流条件下（Ｃ−ａ）で領域Ａおよび領域Ｂの流れを導入し、迅速に混合する（Ｃ−ｂ）領域Ｃを含み；さらなる粒子形成材料、希釈、ｐＨ調整またはナノ粒子合成に必要なその他の事象を始めとする任意のいくつかの材料を備える第３の流れを受け取るための領域Ｄを含み；層流条件下（Ｅ−ａ）で領域Ｃおよび領域Ｄの流れを導入し、迅速に混合する（Ｅ−ｂ）領域Ｅを含み；製剤が、希釈、ｐＨ調整またはナノ粒子合成に必要なその他の事象のようなさらなる処理のために準備ができており、最終生成物、治療薬を含有する脂質粒子がデバイスを出る領域Ｆを含む。

図４は、本発明の別の代表的な流体デバイス（４００）の概略図である。図５は、図４に示される代表的な流体デバイスの代表的なアレイの概略図である。

図６は、本発明の別の代表的な流体デバイス（６００）の概略図である。図６を参照すると、デバイス６００は、混合チャネル６１０ａ、６１０ｂおよび６１０ｃを含む。図７は、図６に示される代表的な流体デバイスの代表的なアレイの概略図である。

マイクロ流体デバイスでのナノ粒子の形成は、混合事象に関与する試薬容積と、漏出が生じる前にデバイスが耐えることができる限界背圧とによって制限される。単一の要素のヘリンボーン状ミキサーまたは多層型ミキサーは、液滴またはフロー絞り込みアプローチと比較して１００〜１０００倍の流速の増大を達成する。製造規模の処理量を達成するために、複数のミキサー要素を配置してもよい。一実施形態では、低インピーダンスバスチャネルを使用して個々のミキサー要素に各試薬を分配する。バスチャネルのインピーダンスが、ミキサー要素のインビーダンスと比較して無視できる程である場合は、各ミキサーの入口での個々の流速は同一である。複数のミキサー要素が並行して作動されるので、システムのインピーダンスが低下し、その結果、高い容積処理量が得られる。

これは、単一ミキサー要素を使用して観察される混合特徴を、ミキサーアレイにおいて維持できるという利点を有する。一実施形態では、各ミキサーアレイ要素における混合は、複数の流れをマイクロチャネル中に導入することによって達成される。この場合には、流れは拡散によって混合する。流線の幅は、注入チャネルを通る相対流速を制御することによって（例えば、これらのチャネルの寸法を調整することによって（図５）変えてもよい。別の実施形態では、混合はカオス的移流によって達成される（互い違いのヘリンボーン状ミキサー、ＳＨＭ）。図７に示されるように、アレイの各ミキサー要素が、一連のミキサーからなる場合もある。各アレイサブセットに要素を加えることによって、さらなる機能性を、マイクロ流体デバイスでインラインで統合することができる。このような機能性として、オンチップ希釈、透析、ｐＨ調整または組み合わされた流線、同一チャネルを共有する流れまたは多孔性材料によって互いに分離している流れを必要とするその他の事象を挙げることができる。一実施形態では、１００％エタノールに１０ｍＭ ＰＯＰＣを溶解し、各アレイサブセットの第１のミキサー要素においてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４と混合する。混合物をＰＢＳを用いて２倍で希釈することによって、混合後に形成されるＬＮＰを安定化する。

表１は、単一のミキサーおよび１０個の個々のミキサーからなるミキサーアレイで形成された粒子サイズ分布を比較する。単一のミキサーを通る総流速は、各交差点で５０：５０の混合比を用いて、４ｍｌ／ｍｉｎであり得る。容積処理量は、１０台のミキサーを並行して作動させることによって１０倍増大でき、その結果、４０ｍｌ／ｍｉｎの総容積流速が得られる。アレイの処理量が、製造規模の合成に適していながら、ＬＮＰ寸法が維持される。

任意の数の並行試薬入口、逐次混合チャンバーおよび分岐構造の任意の組合せを使用して、ナノ粒子形成プロセスを最適化できる。これは、異なる製剤プロセスを正確に制御でき、ナノ粒子製剤プロセスの複数の段階を統合できるという利点を有する。例として、それだけには限らないが、以下が挙げられる：（ａ）独立した投入制御を可能にするための別個の（図８）または同一の（図９）試薬の組合せからなる２以上の入口の導入（使用は、投入試薬間の比などを変更する、投入試薬の流速の独立した制御を含む）（ｂ）ナノ粒子試薬の逐次添加または製剤処理ステップを可能にする順序正しい２以上ミキサー（図１０）（使用は、ナノ粒子の制御されたボトムアップアセンブリーのための順序正しい投入試薬の添加、希釈、ｐＨ調整またはナノ粒子合成に必要なその他の事象のような製剤プロセスの組込みなどを含む；または（ｃ）投入、混合チャンバーおよび分岐構造の任意の組合せ、図１１および図１２は、変動する数の並行試薬投入および分岐マイクロ流体構造を有する、２段階および３段階ミキサーを例示する（使用は、ナノ粒子試薬のチップ混合、ナノ粒子核生成および成長、オンチップ希釈、透析、ｐＨ調整またはナノ粒子合成に必要なその他の事象を含む、製剤プロセスの複数の段階の組込みを含む。

図１３は、多層型ミキサーを有する本発明の代表的な流体デバイスの概略図である。図１３を参照すると、デバイス１３００は、混合チャネル１３１０を含む。図１４は、図１４に示される多層型ミキサーのクローズアップ図である。

上記のように、脂質マイクロ／ナノ粒子を製造する方法は、水中に脂質を分散させることによって大きな構造が形成され、続いて、１００ｎｍなどのポアサイズを有するポリカーボネートフィルターによって、あるいは、チップ超音波処理を使用して多層ベシクル（ミクロンサイズ範囲）を破壊する従来「トップダウン」アプローチであった。

このようなバッチプロセスを欠いている１つの態様は、各脂質混合物構成要素の構造およびアセンブリーを正確に制御する能力である。特定の構成要素がその外部環境に曝されると容易に分解する場合には、またはターゲッティング目的で、特定のリガンドが粒子の外側に存在しなければならない場合には、これは特に重要である。例えば、治療薬に関しては、まず、特定の治療薬と結合するための正味の正または負の表面電荷を有する粒子を製造することが重要であり得る。次いで、その他の脂質材料を用いてこのような粒子をカプセル封入することによってアセンブリーを完了するために、またはその表面特徴を修飾するために、さらなる処理が必要である場合もある。これは、例えば、正味の中性な粒子を製造するための脂質の添加または機能上の目的のために粒子の外側に存在しなくてはならないターゲッティング分子の添加を含み得る。

一実施形態では、脂質ナノ粒子を製造する方法は、電荷結合による脂質ナノ粒子の逐次アセンブリーおよび成長を含み、さらに、治療用低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のカプセル封入を提供し得る。この方法を使用して、表面電荷特徴を正味の正から正味の負に完全に変更できる、逆もまた同様。

約２の電荷比（正／負）を用いて、ｓｉＲＮＡ（負）をカプセル封入する脂質ナノ粒子を調製した。脂質は、９０ｍｏｌ％ ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（正）および１０ｍｏｌ％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡを含んでいた。得られた粒子は、直径２３ｎｍであり（図２８Ａ）、約７ｍＶの正ゼータ電位を有していた（図２８Ｂ）。アニオン性脂質を、マイクロ流体混合によってカチオン性脂質に対して４倍過剰で組み込んだ。これは、３３ｎｍへの粒子サイズの増大および−１４ｍＶという負のゼータ電位へのシフトをもたらした。追加のカチオン性脂質のさらなる組み込み（これまでのＤＯＰＳに対して４倍過剰で）、次いで、ＤＯＰＳの組み込みは、粒子サイズの継続した増大をおよび正味の正および正味の負のゼータ電位間の変更をもたらした。

結果は、単一のマイクロ流体ミキサーにおいて混合し、回収し、次いで、マイクロミキサーに再投入して次の脂質成分を添加することによって得た。しかし、単一のマイクロ流体デバイスは、このような粒子を連続法で製造するよう設計できた（図２９）。

以下のデバイスは、マイクロミキサーに入る前の流体インピーダンスならびに脂質および水性流体間の相互作用を最小にする。

図３０は、本発明の代表的なデバイス３０００および方法の模式図である。図３０を参照すると、デバイス３０００は、第１の溶媒中にポリ核酸を備える第１の流れが大きな幅（＞２ｍｍ）のチャネル中に入る領域Ａおよび第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える流れが大きな幅（＞２ｍｍ）のチャネル中に入る領域Ｂを含む。流れは、マイクロミキサー中で迅速な混合が起こる領域Ｃに導入され、次いで、最終的に領域Ｄ、最終生成物に導入される。

図３１は、本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図である。図３１を参照すると、デバイス３１００は、第１の溶媒中にポリ核酸を備える第１の流れが大きな幅（＞２ｍｍ）のチャネル中に入る領域Ａおよび第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える流れが大きな幅（＞２ｍｍ）のチャネル中に入る領域Ｂを含む。流れは、マイクロミキサー中で迅速な混合が起こる領域Ｃに導入され、次いで、最終的に領域Ｄ、最終生成物に導入される。

図３２は、本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図である。図３２を参照すると、デバイス３２００は、第１の溶媒中にポリ核酸を備える第１の流れが大きな幅（＞２ｍｍ）のチャネル中に入る領域Ａと、第１の溶媒を備える第２の流れが領域Ａのフローのシース流体として作用する領域Ｂと、第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える流れが大きな幅（＞２ｍｍ）のチャネル中に入る領域Ｃと、第２の溶媒を備える第２の流れが領域Ｃのフローのシース流体として作用する領域Ｄとを含む。流れは、マイクロミキサー中で迅速な混合が起こる領域Ｅに導入され、次いで、最終的に領域Ｆ、最終生成物に導入される。点線は、流体の界面を表す。

図３３は、本発明の代表的なデバイスおよび方法の模式図である。図３３を参照すると、デバイス３３００は、領域Ａを含み、ここで、第１の溶媒中にポリ核酸を備える第１の流れおよび第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れがチャネルに同心性に流され、領域Ｂに導入され、ここで、マイクロミキサー中で迅速な混合が起こり、次いで、最終的に、最終生成物が得られる領域Ｃに導入される。領域Ａでは、２種の流体は、横断面図に示されるように、物理的な障壁によって分離されても、またはシース流体によって分離されてもよい。

［脂質粒子を使用して治療薬を送達する方法］
本発明の脂質粒子を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで細胞に治療薬を送達してもよい。特定の実施形態では、治療薬は核酸であり、これを、本発明の核酸−脂質粒子を使用して細胞に送達する。本方法および組成物は、このような治療から利益を得る任意の疾患または障害の治療のための任意の適した治療薬の送達に容易に適応させることができる。

特定の実施形態では、本発明は、細胞に核酸を導入する方法を提供する。細胞への導入にとって好ましい核酸として、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド，プラスミド、アンチセンスおよびリボザイムがある。これらの方法は、本発明の粒子または組成物を、細胞内送達が起こるのに十分な時間の間、細胞と接触させることによって実施できる。

通常の適用は、周知の手順を使用して、ｓｉＲＮＡの細胞内送達を提供して、特定の細胞標的をノックダウンまたはサイレンシングすることを含む。あるいは、適用は、治療上有用なポリペプチドをコードするＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列の送達を含む。このように、遺伝病の治療は、遺伝子産物の欠損または非存在を供給することによって提供される。本発明の方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで実施しても、ｅｘ ｖｉｖｏで実施しても、ｉｎ ｖｉｖｏで実施してもよい。例えば、本発明の組成物はまた、当業者に公知である方法を使用してｉｎ ｖｉｖｏで細胞への核酸の送達のために使用してもよい。

本発明の脂質粒子によるｓｉＲＮＡの送達および遺伝子発現をサイレンシングすることにおけるその有効性を以下に記載する。

医薬組成物は、ｉｎ ｖｉｖｏ投与のために、非経口的に（例えば、関節内に、静脈内に、腹膜内に、皮下にまたは筋肉内に投与されることが好ましい。特定の実施形態では、医薬組成物を、ボーラス注射によって静脈内に、または腹膜内に投与する。その他の投与経路として、局所（皮膚、眼、粘液膜）、経口、肺、鼻腔内、舌下、直腸および経膣が挙げられる。

一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節する方法を提供する。これらの方法は、一般に、細胞を、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節できる核酸と会合している本発明の脂質粒子と接触させることを備える。本明細書において、用語「調節すること」とは、標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を変更することを指す。調節することとは、増大させることもしくは増強することを意味し、または低下させることもしく低減することを意味する場合もある。

関連する実施形態では、本発明は、対象に、対象においてポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、本発明の医薬組成物を提供することを備え、治療薬は、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現できるプラスミドから選択され、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと特異的に結合するポリヌクレオチドまたはその相補体を備える、方法を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明の脂質粒子と、医薬上許容される担体または希釈液とを備える医薬組成物を提供する。代表的な医薬上許容される担体または希釈剤として、静脈内注射用の溶液（例えば、生理食塩水またはデキストロース）が挙げられる。組成物は、クリーム、軟膏、ゲル、懸濁液またはエマルジョンの形態をとってもよい。

以下は、代表的なＬＮＰシステム、ＬＮＰシステムを製造するためのデバイスおよび方法ならびに治療薬を送達するためにＬＮＰを使用する方法の説明である。

［迅速マイクロ流体混合によって、単分散脂質ナノ粒子の製造が可能となる］
脂質ナノ粒子の製剤は、カオス的移流を誘発し、中間レイノルズ数（２４＜Ｒｅ＜２４０）の制御された混合環境を提供するよう設計されたマイクロ流体ミキサー内で、脂質−エタノール溶液を、水性バッファーと迅速に混合することによって実施した（図１５Ｂ）。マイクロ流体チャネルは、半サイクルの間に、ヘリンボーン構造の配向を変更し、局所回転の中心および伸長フローに周期的変化を引き起こすことによってカオス的フローを生成するヘリンボーンを含有する。

デバイスの内の混合性能を調べるために、フルオレセインのｐＨ感受性を使用し、これでは、２つの１０μＭフルオレセイン流、一方はｐＨ８．８８で蛍光、もう一方はｐＨ５．１５で非蛍光を混合した。混合が起こるのに必要なチャネル長（混合の程度＞９５％）は、０．８ｃｍから１．０ｃｍの間であるとわかった。これは、それぞれ、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、０．４ｍｌ／ｍｉｎ、０．７ｍｌ／ｍｉｎおよび１．０ｍｌ／ｍｉｎの流速について、およそ４５ｍｓ、１０ｍｓおよび５ｍｓおよび３ｍｓの混合時間をもたらした。カオス的フローでは、ベクレ数で対数的にのみ増大する、混合長のわずかな相違が予測される（Ｐｅ＝Ｕｌ／Ｄ、式中、Ｕは、流体速度であり、ｌは、断面図チャネル長であり、Ｄは、分子の拡散性である）。

以下の代表的な製剤は、イオン化できるカチオン性脂質、６．７という見かけのｐＫａを有し、脂質を低ｐＨでのｓｉＲＮＡのカプセル封入にとって適したものにし、生理学的ｐＨでほぼ中性のカチオン性表面電荷密度を提供するＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含む。モデルシステムとして、このＬＮＰ−ｓｉＲＮＡスキームを使用して、ＬＮＰ製剤に対する流速の効果を調べた。流速を高めるにつれ、混合時間が劇的に低下するので、脂質が水相に導入される速度が、その最終サイズおよび分散度に影響を及ぼすと予測した。図１６Ｂは、チャネルあたり０．１ｍｌ／ｍｉｎ〜１ｍｌ／ｍｉｎの同一流速を使用して、マイクロ流体ミキサーによって製造されたＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムの平均粒径を示す図である。バッファーは、０．０６（ｗｔ／ｗｔ）のｓｉＲＮＡ／総脂質比をもたらすようにｓｉＲＮＡを含有し、ＬＮＰ混合物をバッファーに直接希釈して、エタノール含量をおよそ２２ｖｏｌ％に低下させた。総流速を０．２ｍｌ／ｍｉｎ〜２ｍｌ／ｍｉｎに増大させると粒子サイズは大幅に減少した。粒子サイズは、０．２ｍｌ／ｍｉｎの流速下で最大であり、ＬＮＰは、およそ４０ｎｍの限界サイズに達したと、数加重粒子直径から求められた。あるいは、エタノールおよび水性の流れの比を変更することによって混合時間も調整した。水性の流れの流速を増大させると、脂質の、水性の流れでのより速い希釈が実際に提供される。脂質−エタノールの流れを、０．５ｍｌ／ｍｉｎで一定に維持しながら、水性の流速を増大した結果、粒子サイズが減少した（図１６Ｃ）。水性の流速を３倍増大した場合の、約７０ｎｍから３５ｎｍへの粒子サイズの実質的な低下は、エタノール含量を迅速に低下させることの重要性を強調する。

これらのＬＮＰは、脂質が、より水性の環境に遭遇すると自発的に形成すると予測されるので、脂質濃度の効果を調査することも重要であった。脂質濃度を増大するにつれ、ＬＮＰに組み込むために利用可能な脂質の量は増大するか、そうでなければ、さらなる粒子を形成すると予測される。これを、脂質濃度を、エタノール流中で１０ｍＭから５０ｍＭに増大しながらモニタリングした。脂質濃度のこの増大後に、約４０ｎｍから７０ｎｍへの平均粒径の増大を観察した（図１７）。

［迅速なマイクロ流体混合は、ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムの広い製剤範囲を提供する］ カチオン性脂質の最近の改善によってＬＮＰの効力は数倍高まったが、ＬＮＰ組成を最適化することによってさらなる改善を提供できるということも明らかとなった。特に、その二分子膜不安定化能およびエンドソーム溶解能に影響を及ぼし得るか、または生理学的ｐＨでのその循環挙動に影響を及ぼす可能性がある。例えば、少ないＰＥＧ−脂質および増大したカチオン性脂質を有する製剤は、肝臓の肝細胞を標的とするＬＮＰシステムのｉｎ ｖｉｖｏ有効性において著しい改善を示した。これは、第ＶＩＩ因子マウスモデルの最近の報告において観察され、最適化されたＬＮＰにおいてＥＤ５０のさらに５倍の低減を提供した。ＰＥＧ−脂質は、微粒子の安定性にとって必要であるが、これらのＬＮＰシステムの膜不安定化特性を弱め得る。予備形成ベシクル（ＰＦＶ）法を用いると、５ｍｏｌ％未満のＰＥＧ−脂質を用いてＬＮＰシステムを製造しようとする場合には困難に遭遇した。これは、おそらくは、ＬＮＰ間の融合を増大させる、ベシクルの外側でのＰＥＧ含量が少ないことによる。さらに、予備形成脂質粒子の再構築およびｓｉＲＮＡのカプセル封入にとって必要なインキュベーションステップには、３０％（ｖ／ｖ）の範囲のエタノール溶液が必要である。この脂質の流動性の増大が、不安定性を促進し、予備形成脂質粒子のさらなる凝集および融合につながり得る。

ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡを使用する、ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムを製造するためのマイクロ流体（ＭＦ）法の能力（迅速な混合時間および２５％エタノール（ｖ／ｖ）を下回るＬＮＰの希釈前の短い滞留）を、ＰＥＧ−脂質含量を変更して調査した。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡの最初の組成（４０：１１．５：３８．５：１０ｍｏｌ／ｍｏｌ）を０．０６（ｗｔ／ｗｔ）のｓｉＲＮＡ／総脂質比と共に使用した。さらなるコレステロールを使用して、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡの量の減少を補填した。マイクロ流体アプローチを使用して、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡを２ｍｏｌ％に用量設定することは、粒子サイズのわずかな増大にしかつながらなかった。ＰＥＧを１ｍｏｌ％へさらに減少させることは、約２０ｎｍから約４０ｎｍへの直径の増大につながった（図１８Ａ）。対照的に、ＰＦＶ法を使用する平均粒径は、ＰＥＧ−脂質含量を１ｍｏｌ％に減少させるにつれて、２０ｎｍから７０ｎｍへの粒子直径の一定の増大を示した。少量のＰＥＧ−脂質を用いてＬＮＰを製造することに加えて、カチオン性脂質の量を変更することができることも注目される。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを４０ｍｏｌ％から７０ｍｏｌ％に増大するにつれ、マイクロ流体アプローチによって製造されたものについて、約４０ｎｍから７０ｎｍに粒子サイズの全般的な増大が観察された（図１８Ｂ）。

［マイクロ流体デバイスにおけるセルフアセンブリーによって、ほぼ完全なカプセル封入を伴うＬＮＰが生成し得る］ ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムの製造では、堅牢な過程は必ず、ＯＧＮ製剤の高いカプセル封入パーセントを提供する。１ｍｏｌ％ ＰＥＧを有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ製剤を使用して、ｓｉＲＮＡ／総脂質比を０．０１から０．２（ｗｔ／ｗｔ）に変更することによってｓｉＲＮＡカプセル封入を評価した。ＬＮＰ製剤は、この範囲にわたって１００パーセントに迫るカプセル封入パーセントを達成した（図１９）。０．２１（ｗｔ／ｗｔ）のｓｉＲＮＡ／総脂質比に達した時点で、カチオン性脂質およびアニオン性ｓｉＲＮＡ間の電荷バランス（Ｎ／Ｐ＝１）に対応して、カプセル封入が減少すると観察された（示されていないデータ）。この後者の傾向は、ｓｉＲＮＡと複合体を形成し、ＬＮＰ中にカプセル封入するのに必要なカチオン性電荷が不十分であることによると予測された。

［形態］ マイクロ流体および予備形成ベシクル法によって製造されたＬＮＰをｃｒｙｏ−ＴＥＭを用いて可視化した。ＬＮＰの粒子サイズは、動的光散乱によって測定されたものと同様であった。４０／１１．５／４７．５／１ｍｏｌ％のＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し、０．０６ｗｔ／ｗｔのｓｉＲＮＡ対脂質比を有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムを、図２０Ａに示す。さらに、同一組成の空のＬＮＰサンプルを図２０Ｂに示す。製造された粒子は、主に球形であり、サイズが均質である。予備形成アプローチを用いて製剤され、同一の組成のＬＮＰも撮像した。これらは、同様の特徴をマイクロ流体ＬＮＰと共有していたが、コーヒー豆状の構造などのその他の特徴も観察された。これらのＬＮＰはまた、サイズが大きいことが動的光散乱結果から予測された。

［マイクロ流体によって製造されたＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムは、ｉｎ ｖｉｖｏで高度に強力な遺伝子サイレンシング物質であり得る。］ ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの、ｉ．ｖ．注射後にｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子サイレンシングを誘導する能力を、第ＶＩＩ因子マウモデルを使用して調査した。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧを含有し、０．０６（ｗ／ｗ）のｓｉＲＮＡ対脂質比を有する製剤を、マイクロ流体アプローチを使用して作製した。ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡの投与は、尾静脈注射によって行った。０．２ｗｔ／ｗｔのＤＳＰＣ対コレステロール比を維持しながら、カチオン性脂質、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを３０ｍｏｌ％〜６０ｍｏｌ％に変更した。ＬＮＰ中のカチオン性脂質含量を増大した結果、ＦＶＩＩサイレンシングにおいて進行性の改善が得られた。最高の性能のＬＮＰは、６０ｍｏｌ％ ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含有し、約０．０３ｍｇ／ｋｇで５０％ ＦＶＩＩサイレンシングのための有効用量をもたらした（図２１）。興味深いことに、７０ｍｏｌ％へのさらなる増大は、６０ｍｏｌ％ ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ ＬＮＰを上回る有効性の観察可能な改善につながらなかったことに留意されたい。

結果は、互い違いのヘリンボーン状ミキサーを含有するマイクロ流体デバイスを使用して、ｓｉＲＮＡなどのＯＧＮを効率的にカプセル封入できる、種々の脂質組成を有するＬＮＰを作製できることおよび製造されたＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムが、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で優れた遺伝子サイレンシング能を示すことを実証する。

本発明のマイクロ流体デバイスおよびシステムは、ＬＮＰおよび１００ｎｍ以下のサイズのＯＧＮを含有するＬＮＰ形成を可能にし、ＯＧＮカプセル封入１００％を提供する。ＬＮＰの形成に関しては、混合速度および混合比は明確に、重要なパラメータである。エタノール−脂質溶液を水性バッファーと迅速に混合することは、溶解される脂質の溶解度を低下させる培地の極性の増大をもたらし、溶液から析出させて、ナノ粒子を形成させる。迅速な混合は、溶液に混合容積全体にわたる脂質ユニマーの高度に過飽和の状態を迅速に達成させ、迅速で、均質なナノ粒子の核生成をもたらす。ナノ粒子の核生成および成長の増大は、遊離脂質の周囲の液体を枯渇させ、それによって、遊離脂質の凝集によるその後の成長を制限する。この提案されている機序は、エタノール中の低濃度の脂質（減少した遊離脂質）がより小さいＬＮＰをもたらし（図１７参照のこと）、過飽和へのより迅速な、より均質なアプローチを引き起こす高い流速がより小さいＬＮＰの形成につながり、水性対有機溶媒構成要素の相対比を増大することもより小さい粒子をもたらすという観察結果と一致する（図１７）。

マイクロ流体法によって製剤された本発明のＬＮＰ ＯＧＮシステムは、１００％に迫るＯＧＮカプセル封入効率を示す。アンチセンスＯＧＮに対してＰＦＶ技術を使用するこれまでのｃｒｙｏ−ＴＥＭ研究は、小さい多層ベシクルの存在を示しており、これは、カプセル封入が、予備形成ベシクルへのＯＧＮ吸着を含み、これが元のベシクルを包み込むさらなる予備形成ベシクルとの会合のための核生成点として働くという可能性につながる。対照的に、マイクロ流体法によって製造されたＬＮＰ ＯＧＮ のｃｒｙｏ−ＴＥＭ研究は、ＬＮＰシステムの大部分は、「固体コア」構造であることを示し、異なる機序のＯＧＮカプセル封入が働いていることを示唆する。特に、これらの構造は、ナノ粒子アセンブリーの前またはそれと同時のｓｉＲＮＡのカチオン性脂質モノマーとの会合と一致する。マイクロ流体法の、核酸組成物と無関係に１００％に迫るようにアンチセンスおよびｓｉＲＮＡ ＯＧＮのカプセル封入効率を高める能力は、これまでに報告された方法を上回る大きな利点である。

マイクロ流体法は、ＬＮＰを製造するための伝統的な押し出し手順、予備形成ベシクル法およびＯＧＮカプセル封入のための自発的なベシクル形成法を含む３つの代替ＬＮＰ合成技術を上回る利点を提供する。マイクロ流体法は、カチオン性脂質が存在する場合には、１００ｎｍのサイズ範囲またはそれより小さいＬＮＰを提供し、低レベルの安定化ＰＥＧ−脂質を用いてＬＮＰが形成されることを可能にする。マイクロ流体法の不利点は、調製後にエタノールを除去する必要性、特定の脂質が、エタノールに比較的不溶性であるという事実および拡張性の可能性の問題に関する。マイクロ流体法は、カプセル封入効率における利点、ＰＦＶプロセスを使用しながら用いることは困難である高いカチオン性脂質含量および低いＰＥＧ−脂質レベルの使用、予備形成ベシクルを作製する必要性を取り除くことおよび装置の小さいデッドボリューム（１μｌ）のために損失がほとんどない、わずかに１５０μｇのオリゴヌクレオチドを使用する小スケールバッチを製造する能力を提示する。

ＯＧＮが入っているＬＮＰシステムを作製するための、ＳＶＦ「Ｔチューブ」手順と比較して、マイクロ流体法の利点は、予備形成ベシクルは必要ではないという点を除いてＰＦＶプロセスについて示されたものと同様である。Ｔチューブの開口部は、直径およそ１．５ｍｍであり、迅速な混合が起こるのに必要な速度を達成するのに高い流速（＞１ｍｌ／ｓ）を必要とする。マイクロミキサーは、かなり低い流速で、明確に定義された再現性のある条件下でＬＮＰ ＯＧＮ製剤が起こることを可能にし、デッドボリュームによる損失を低減し、ＬＮＰ最適化およびｉｎ ｖｉｔｒｏ試験のための小スケールバッチのより直接的な調製を可能にする。

ＬＮＰ ＯＧＮシステムはスケールアップすることができる。１ｍｌ／ｍｉｎの最大流速を有するデバイスでは不十分である場合もあるが、単一のマイクロ流体チップは、約１０ｍＬ／ｍｉｎの総流速を達成するために１０個以上のマイクロミキサーを含有し得る。この技術の比較的安価な性質を考えると、いくつかのこのようなチップが並列で使用されることは実用的であり、単一の卓上機器から１００ｍｌ／ｍｉｎ以上の流速を可能にする可能性がある。さらに、複数の構成要素から正確にプログラム可能な製剤、合成製剤およびパラメータのスクリーニングおよび最適化において高度に有利であろう特性を可能にするために、このようなデバイスに上流流体ハンドリングを容易に組み込むことができる。

［固体コアＬＮＰ］
ＬＮＰ ｓｉＲＮＡ製剤の特定のモデルは、水性内部中、内側にｓｉＲＮＡを有するＬＮＰの二分子膜ベシクル構造を示唆する。しかし、いくつかの観察結果は、少なくともマイクロ流体混合アプローチによって作製されたＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムについては、このようなモデルは不正確であると示唆する。例えば、マイクロ流体混合によって製造されたＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの低温電子顕微鏡検査は、ベシクル構造と一致した水性コアというよりも電子密度の高いコアの存在を示す。上記のように、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの製剤は、日常的に１００％に迫るｓｉＲＮＡカプセル封入効率をもたらし得、５０％の最大カプセル封入効率が予測される二分子膜構造と一致しない観察結果である。

ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの構造を、種々の物理的および酵素的アッセイを使用して評価した。得られた結果は、これらのＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムは、カチオン性脂質ならびに逆ミセルまたは関連構造に組織された脂質と複合体を形成しているｓｉＲＮＡモノマーからなる固体コア内部を有することを示す。

ＬＮＰシステムは、カプセル封入されたｓｉＲＮＡの存在下および不在下で、ｃｒｙｏ ＥＭによって示されるように電子密度の高い固体コア構造を示す。マイクロ流体混合によって製造されたＬＮＰシステムは、代替法によって作製されたＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムについて示唆される水性コア構造とは対照的に、ｃｒｙｏ ＥＭによって可視化されるように電子密度の高いコアを示し、固体コアと一致する。これは、図２２Ａで示されるように、０．０６ｓｉＲＮＡ／脂質（ｗｔ／ｗｔ）含量でｓｉＲＮＡを含有するＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−脂質（４０／１１．５／４７．５／１；ｍｏｌ／ｍｏｌ）からなるＬＮＰ ｓｉＲＮＡ製剤について確認され、４の、正電荷（完全にプロトン化したカチオン性脂質上）に対する負の電荷（ｓｉＲＮＡ上）Ｎ／Ｐ比に対応する。結果として、ＬＮＰ中で、およそ７５％のカチオン性脂質がｓｉＲＮＡと複合体を形成していない。固体コアの電子密度の高い構造は、ＰＯＰＣからなるベシクルシステムの電子密度の低い内部（図２２Ｂ）と対照的であり、ＰＯＰＣ／トリオレイン（ＰＯＰＣ／ＴＯ）ＬＮＰの電子密度の高い内部（図２２Ｃ）と視覚的に同様である。マイクロ流体混合によって製造されたＰＯＰＣ／ＴＯ ＬＮＰ は、ＰＯＰＣの単層によって囲まれたＴＯの疎水性コアからなる。

図２２Ａの興味深い特徴は、イオン化できるカチオン性脂質の７５％は、ｓｉＲＮＡと複合体を形成していないが、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡ粒子は全体として固体コア内部を示すということである。これは、カチオン性脂質は、ｓｉＲＮＡと複合体を形成していない場合でさえも固体コア内部に貢献し得るということを示唆する。同一の脂質組成を有するがｓｉＲＮＡを有さないＬＮＰシステムを、マイクロ流体プロセスを使用して製剤し、ｃｒｙｏ ＥＭによって特性決定した。図２２Ｂに示されるように、ｓｉＲＮＡの不在下で電子密度の高いコアが観察され、これは、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡなどのイオン化できるカチオン性脂質は、おそらくは、ＤＳＰＣおよびコレステロールと組み合わせて、ＬＮＰ内部において非層状の電子密度の高い構造をとり得るということを示す。

ＬＮＰ構造は、限界サイズ示し、これは、イオン化できるカチオン性脂質は、ＬＮＰ内部において逆ミセル構造を形成することを示す。電子密度の高いＬＮＰコアに対するカチオン性脂質の貢献は、このようなＬＮＰシステムの分子構造はどのようなものであり得るかという問題を提起する。カチオン性脂質は、対イオンと会合して、逆ミセルなどの逆構造をとるということを提案することが論理的であり、アニオン性脂質との混合物中の六方晶系のＨ_II相などの逆構造に対するこれらの脂質の傾向と一致する。さらに、これは、純粋なカチオン性脂質からなるＬＮＰシステムは、本質的に、直径２〜３ｎｍを有する逆ミセル内部を囲む２つの二分子膜の厚さである１０ｎｍの範囲の直径を有する限界サイズを示すはずであるということを示唆する。Ｈ_II相中のホスファチジルエタノールアミンについて見られる水性チャネルの直径は、２．６ｎｍである。マイクロ流体製剤プロセスは、迅速な混合動態を提供し、これがＬＮＰシステムの限界サイズシステムの生成を駆動する。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＰＥＧ−脂質システム（９０／１０、ｍｏｌ／ｍｏｌ）について達成され得る限界サイズを評価した。図２３に示されるように、マイクロ流体法によって形成されたこれらのＬＮＰでの動的光散乱による測定によって、粒子サイズは、直径およそ１０ｎｍである、すなわち、相当な水性コアまたはトラップ容積とは一致しない知見が確認される。

関連する問題として、カチオン性脂質−ｓｉＲＮＡ複合体の構造に関わるものがある。やはり、ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドを囲むカチオン性脂質の歪んだ逆ミセルからなると想定することが論理的である。さらに、この逆ミセル中に含有されるｓｉＲＮＡが、カチオン性脂質の内側の単層と、残りの脂質の外側の単層によって囲まれており、ｓｉＲＮＡの寸法が直径２．６ｎｍ、長さ４．８ｎｍであると仮定すると、これは１５〜２０ｎｍの範囲の限界サイズを示唆する。これが実験結果と一致するかどうかを調べるために、１のＮ／Ｐ比に対応する、高レベルのｓｉＲＮＡのＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡおよびＰＥＧ−脂質（９０／１０；ｍｏｌ／ｍｏｌ）からなるＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの限界サイズを調べた。図２３に示されるように、ｓｉＲＮＡを含めた結果、仮説と一致する、およそ２１ｎｍの直径の限界サイズシステムが得られた。

カプセル封入されたｓｉＲＮＡは、ＬＮＰ中に固定される。ｓｉＲＮＡがカチオン性脂質と複合体を形成し、ＬＮＰ内の固体コア中に局在化される場合には、二分子膜ベシクルシステムの水性内部中で自由に動き回っている場合よりも可動性が低いと予測される。ｓｉＲＮＡの可動性は、³¹Ｐ ＮＭＲ技術を使用して探ることができる。特に、複合体形成されたｓｉＲＮＡについては、限定された運動の平均化があり得、これが、リン酸態リンの大きな化学シフト異方性による極めて広い「固体状態」³¹Ｐ ＮＭＲ共鳴につながることが予測される。使用される条件下では、このような共鳴は検出可能ではない。他方、ｓｉＲＮＡが水性環境中を自由に動き回ることができる場合には、迅速な運動の平均化は、狭い、容易に検出可能³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルにつながると予測される。この仮説を試験するために、リン脂質リンに起因する³¹Ｐ ＮＭＲシグナルから生じる複雑化の要因を排除するためにＬＮＰの製剤からＤＳＰＣを省いた。図２４Ａに示されるように、脂質組成ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−脂質（５０／４５／５ｍｏｌ％）を有し、ｓｉＲＮＡ（０．０６ｓｉＲＮＡ／脂質；ｗｔ／ｗｔ）を含有する、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムについて、³¹Ｐ ＮＭＲシグナルは、カプセル封入されたｓｉＲＮＡについて観察可能ではなく、ＬＮＰコア内の固定化と一致する。図２４Ｃに示されるように、ＬＮＰを可溶化し、カプセル封入されたｓｉＲＮＡを放出するよう界面活性剤ドデシル硫酸ナトリウム（１％）を添加すると、狭い³¹Ｐ ＮＭＲシグナルが検出される。

カプセル封入されたｓｉＲＮＡは、外部のＲＮアーゼＡによる分解から十分に保護される。ｓｉＲＮＡの内部移行の試験は、ｓｉＲＮＡがＬＮＰコア中に隔離されていれば、外部から添加されたＲＮアーゼによる分解から十分に保護されるはずであるというものである。脂質組成ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−脂質（４０／１１／４４／５ｍｏｌ％）を有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムを、ＲＮアーゼＡとともにインキュベートして、カプセル封入されたｓｉＲＮＡ消化され得るかどうかを調べた。図２５に示されるゲルにおいて示されるように、遊離ｓｉＲＮＡは分解されるが、マイクロ流体法によって製造されたＬＮＰ粒子内に結合されたｓｉＲＮＡは、完全に保護される（図２５矢印）。また、図２５に示されるように、ＬＮＰへの界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加は、ＬＮＰの溶解、ｓｉＲＮＡの放出およびＲＮアーゼの存在下での分解をもたらす。

カプセル封入されたｓｉＲＮＡは、内部移行されたカチオン性脂質と複合体を形成する。ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの固体コアは、カチオン性脂質と複合体を形成しているカプセル封入されたｓｉＲＮＡからなり、残りの脂質（カチオン性脂質、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質）は、逆ミセルまたは同様の構造中のコア中に存在するか、またはＬＮＰの外側に存在するのいずれかである。高ｓｉＲＮＡ含量について、本質的にすべてのカチオン性脂質が内部移行されたｓｉＲＮＡと複合体を形成している場合、ほとんどのカチオン性脂質がＬＮＰの外側に局在しないことが予測される。蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイを開発して、外側のカチオン性脂質を調べた。アッセイには、高（自己消光）濃度のＦＲＥＴ対、ＮＢＤ−ＰＥ／Ｒｈ−ＰＥを含有した、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）からなる負に帯電したベシクルのＬＮＰの調製が必要であった。次いで、負に帯電したＤＯＰＳ ＬＮＰを、ｐＨ５．５のＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／Ｃｈｏｌ／ＰＥＧ−脂質（４０／１１．５／４７．５／１ｍｏｌ％）からなるＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムとともにインキュベートした。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡのｐＫａは、６．７であり、ＬＮＰの外側のほぼすべてのＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡはｐＨ５．５で帯電し、負に帯電したＤＯＰＳ ＬＮＰとの相互作用および潜在的には融合を促進する。融合は、ＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈ−ＰＥプローブが脂質混合後に希釈されるので５３５ｎｍのＮＢＤ−ＰＥ蛍光の増大として報告される。

図２６に示されるように、ＬＮＰシステムがｓｉＲＮＡを含有しない場合には、実質的な融合が観察され、ＬＮＰシステムの外側の単層上に存在する相当な割合のＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡと一致する。しかし、ＬＮＰシステムが、４の正（カチオン性脂質）電荷対負（ｓｉＲＮＡ）Ｎ／Ｐ電荷比に対応する０．０６（ｗｔ／ｗｔ）のｓｉＲＮＡ対脂質比でｓｉＲＮＡを含有する場合には、融合は相当に減少し（図２６）、１のＮ／Ｐを用いて調製されたＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムについては、融合はほとんどまたは全く観察されなかったが、これは、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡの外側にＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡがほとんどまたは全く存在しなかったことを示す。これは、高ｓｉＲＮＡ含量では、本質的にすべてのカチオン性脂質がｓｉＲＮＡと複合体を形成し、ＬＮＰ内部に隔離されるという仮説を支持する。

結果は、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムの内部は、カチオン性脂質ならびに逆ミセルまたは関連構造に配置された脂質と複合体を形成しているｓｉＲＮＡモノマーから構成される固体コアからなる証拠を提供する。これらの結果は、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡ構造のモデルを暗示し、達成され得る高いｓｉＲＮＡカプセル封入効率の論理的根拠を提供し、特定の適用にとって適当な特性を有するＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムを製造するための方法を示唆する。

結果に基づくＬＮＰ ｓｉＲＮＡ構造のモデルを図２７に示す。モデルは、カプセル封入されたｓｉＲＮＡは、カチオン性脂質によって囲まれた歪んだ逆ミセル中に存在することおよび残りの脂質はアニオン性対イオンを囲む逆ミセルに組織され、最外の単層を構成することを提案する。

モデルは、マイクロ流体混合製剤プロセスの際に、１００％に迫るｓｉＲＮＡカプセル封入効率が、どのように達成され得るかについての理解を提供する。カチオン性脂質が二分子膜の両側上に等しく分散されると仮定すると、最大５０％のｓｉＲＮＡ内部移行が予測されるので、これは二分子膜システムにおけるｓｉＲＮＡカプセル封入の大きな問題である。モデルは、ＬＮＰ ｓｉＲＮＡの大きさ、組成および表面電荷を容易に調整できる方法を提示する。サイズに関しては、限界サイズ構造は、粒子あたり１個のｓｉＲＮＡモノマーを含有するものであることは明確であり、およそ１５〜２０ｎｍの限界サイズを示唆する。このようなＬＮＰ ｓｉＲＮＡ粒子は、本発明のマイクロ流体法を使用して容易に達成される。ｓｉＲＮＡのモノマーからなる限界サイズＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムをビルディングブロックとして使用し、マイクロ流体混合技術を使用して、変動する組成および表面電荷のＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムを達成できる可能性がある。予備形成限界サイズＬＮＰ ｓｉＲＮＡの、負に帯電した脂質を含有するエタノー溶液との迅速な混合は、例えば、過剰のカチオン性脂質との相互作用をもたらし、内部逆ミセルコア構造および負に帯電した表面を生成すると予測され得る。

本明細書に記載される本発明の脂質粒子は、列挙された構成要素を含む（すなわち、含む）。特定の実施形態では、本発明の粒子は、列挙された構成要素と、粒子（すなわち、本質的に列挙された構成要素からなる粒子）の特徴に影響を及ぼさないその他のさらなる構成要素とを含む。粒子の特徴に影響を及ぼすさらなる構成要素として、粒子の治療プロフィールおよび有効性を不利に変更するか、または影響を及ぼすさらなる治療薬などの構成要素、列挙された治療薬構成要素を可溶化する粒子の能力を不利に変更するか、または影響を及ぼすさらなる構成要素、列挙された治療薬構成要素のバイオアベイラビリティを増大する粒子の能力を不利に変更するか、または影響を及ぼすさらなる構成要素が挙げられる。その他の実施形態では、本発明の粒子は、列挙された構成要素のみを含む（すなわち、からなる）。

以下の例は、例示目的で提供するものであって、特許請求される発明を制限するものではない。

例
［材料］
１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホセリン（ＤＯＰＳ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル）（ＮＢＤ−ＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（リサミンローダミンＢスルホニル）（Ｒｈ−ＰＥ）は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ、ＡＬ）から入手した。４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）およびコレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）₂₀₀₀）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシル（dimyristyloxl）プロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）は、ＡｌＣａｎａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって合成された。２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）は、ＢＤＨから入手した。酢酸アンモニウム、酢酸ナトリウムおよび塩化ナトリウムは、Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｆａｉｒ Ｌａｗｎ、ＮＪ）から入手した。ＲＮアーゼＡは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ａｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）から入手した。第ＶＩＩ因子（ＦＶＩＩ）を標的とするｓｉＲＮＡおよび低ＧＣ陰性対照ｓｉＲＮＡは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）から購入した。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡ：（配列番号１）５’−ＧＧＡＵＣＡＵＣＵＣＡＡＧＵＣＵＵＡＣＴＴ−３’（ＦＶＩＩセンス）および（配列番号２）５’−ＧＵＡＡＧＡＣＵＵＧＡＧＡＵＧＡＵＣＣＴＴ−３’（ＦＶＩＩアンチセンス）。ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡは、ＡｌＣａｎａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ．（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）から入手した。

例１
［ＬＮＰシステムの調製：予備形成ベシクル法］
この例では、予備形成ベシクル法を使用するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムの調製を説明する。

ＬＮＰ ｓｉＲＮＡシステムを、予備形成ベシクル法を使用して、図１５Ａに表され、Ｎ． Ｍａｕｒｅｒ、Ｋ．Ｆ． Ｗｏｎｇ、Ｈ． Ｓｔａｒｋ、Ｌ． Ｌｏｕｉｅ、Ｄ． ＭｃＩｎｔｏｓｈ、Ｔ． Ｗｏｎｇ、Ｐ． Ｓｃｈｅｒｒｅｒ、Ｓ． Ｓｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ｐ．Ｒ． Ｃｕｌｌｉｓ、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ Ｅｎｔｒａｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ Ｕｐｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｅｔｈａｎｏｌ Ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ Ｃａｔｉｏｎｉｃ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ： Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ、Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｊ．；第８０巻：２３１０〜２３２６頁（２００１年）に記載されるように製造した。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質を、適当なモル比でエタノールに最初に可溶化した。次いで、脂質混合物を、ボルテックス処理しながら、水性バッファー（クエン酸または酢酸バッファー、ｐＨ４）に滴加し、３０％（ｖ／ｖ）の最終エタノールおよび脂質濃度とした。次いで、水和した脂質を、室温で、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を使用して２枚重ねた８０ｎｍポアサイズのフィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）を通して５回押し出した。ベシクル懸濁液に、混合しながらｓｉＲＮＡ（３０％エタノールを含有する同一の水溶液に可溶化した）を加えた。通常、０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の標的ｓｉＲＮＡ／脂質比を使用した。この混合物を、３５℃で３０分間インキュベートし、ベシクル再構築およびｓｉＲＮＡのカプセル封入を可能にした。次いで、エタノールを除去し、５０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ４．０に対する透析（１２〜１４ｋ ＭＷカットオフ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｍｅｄｉｃａｌ機器）およびＰＢＳ、ｐＨ７．４に対する透析によって、外部のバッファーをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で置換した。

例２
［ＬＮＰシステムの調製：マイクロ流体互い違いヘリンボーン状ミキサー］
この例では、マイクロ流体互い違いヘリンボーン状ミキサーを使用する本発明の代表的なＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムを説明する。

［ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ調製］ オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）溶液をｐＨ４．０の２５ｍＭ酢酸バッファーで調製した。所望のオリゴヌクレオチド対脂質比および製剤濃度に応じて、０．３ｍｇ／ｍｌ総脂質〜１．９ｍｇ／ｍｌ総脂質の標的濃度で溶液を調製した。エタノール中に、適当なモル比でＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、コレステロールおよびＰＥＧ−脂質を含有する脂質溶液を調製し、２５ｍＭ酢酸バッファーで希釈して９０％（ｖ／ｖ）のエタノール濃度を達成した。図１５Ｂは、この例において使用したマイクロ流体装置の概略図である。デバイスは、２つの入口、上記で調製された溶液の各々のためのものと、１つの出口とを有する。マイクロ流体デバイスをソフトリソグラフィー、エラストマーの微細加工されたマスターのレプリカモールディングによって製造した。デバイスは、２００μｍの幅および７９μｍの高さの混合チャネルを特徴とし、チャネルの最高部に３１μｍの高さおよび５０μｍの厚みの特長によって形成されるヘリンボーン状構造を有する。流体連結部は、シリンジと連結するための２１Ｇ１ニードルに取り付けられた１／３２” Ｉ．Ｄ．、３／３２” Ｏ．Ｄ．チューブを用いて製造した。通常、両方の入口の流れに１ｍｌシリンジを使用した。二重のシリンジポンプ（ＫＤ２００、ＫＤ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、デバイスを通る流速を制御した。各流れの流速を０．１ｍｌ／ｍｉｎ〜１ｍｌ／ｍｉｎで変更した。シリンジポンプは、マイクロ流体デバイスに２種の溶液を導入し（図１５Ｂにおける入口ａおよび入口ｂ）、ここで、それらはＹ字路で接触する。この時点で拡散によって層流下でわずかな混合が起こるが、２種の溶液は、ヘリンボーン状構造に沿って通過するときに混合した状態になる。

混合は、これらの構造中でカオス的移流によって起こり、層流の特徴的分離を次第に小さくさせ、それによって迅速な拡散を促進する。この混合は、ミリ秒時間スケールで起こり、その結果、脂質が、漸進的により水性の環境に移され、その溶解度が低下し、ＬＮＰの自発的な形成をもたらす。脂質組成物中にカチオン性脂質を含むことによって、オリゴヌクレオチド種の封入は、正に帯電した脂質頭部基と、負に帯電したオリゴヌクレオチドとの会合によって得られる。マイクロ流体デバイスにおける混合後、通常、ＬＮＰ混合物を、２容積の撹拌バッファーを含有するガラスバイアル中に希釈した。最後に、５０ｍＭクエン酸バッファー、ｐＨ４．０に対する透析およびＰＢＳ、ｐＨ７．４に対する透析によってエタノールを除去する。バッファー溶液にオリゴヌクレオチドがない空のベシクルを同様に製造した。

［ＬＮＰ画像解析］ 種々のｐＨ値を有するフルオレセイン溶液の混合の蛍光イメージングによって混合時間を測定した。１０ｘ対物および１ラインあたり２スキャンを用いるカルマンフィルタモードを使用するオリンパス倒立共焦点顕微鏡を使用して像を集めた。チャネルの高さに沿って２５の等間隔の切片をとり、組み合わせて総強度プロフィールを求めた。撮像された各位置について、流れの方向に沿って１０の隣接するピクセル列の平均をとって、チャネルの幅に沿った強度プロフィールを得、これを使用して混合の程度を求めた。混合実験は、ナトリウムおよびリン酸イオン濃度の大きな差による液間電位差の形成を抑制するために０．５Ｍ ＮａＣｌを補給した２種の１０μＭフルオレセイン溶液を用いて実施した。一方の溶液は、１４ｍＭのｐＨ８．８８のリン酸バッファーを含有していたが、もう一方は、１ｍＭのｐＨ５．１５のリン酸バッファーを含有していた。最初に、ｐＨ５．１５の溶液の蛍光の増大が、塩基性溶液中の蛍光のわずかな低下を圧倒し、総蛍光強度の２倍の増大をもたらす。混合の程度は、０．１ｍｌ／ｍｉｎ、０．４ｍｌ／ｍｉｎ、０．７ｍｌ／ｍｉｎおよび１．０ｍｌ／ｍｉｎの個々の流れの流速を使用してチャネルの長さに沿っておよそ２．１ｍｍ、６．２ｍｍおよび１０．１ｍｍで求めた。

［ＬＮＰ特性決定］ 粒子サイズは、Ｎｉｃｏｍｐモデル３７０サブミクロン粒子選別器（粒子サイジングシステム、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して動的光散乱によって求めた。数加重および強度加重分布データを使用した。脂質濃度は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）製のコレステロールＥ酵素アッセイを使用して総コレステロールを測定することによって確認した。遊離ｓｉＲＮＡの除去は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＧｍｂＨ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。次いで、溶出物を７５％エタノールに溶解し、２６０ｎｍでの吸光度を測定することによってｓｉＲＮＡを定量化した。カプセル封入効率は、脂質含量に対して正規化された、遊離オリゴヌクレオチド含量の除去の前後のオリゴヌクレオチドの比から求めた。

［ＬＮＰ低温透過型電子顕微鏡］ サンプルは、穴の開いた炭素フィルムを有する標準電子顕微鏡グリッドに、３μＬの、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの総脂質でＬＮＰを含有するＰＢＳを適用することによって調製した。Ｖｉｔｒｏｂｏｔシステム（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を用いて吸い取ることによって過剰の液体を除去し、次いで、液体エタン中のＬＮＰ懸濁液をプランジ凍結して、ベシクルをアモルファス氷の薄いフィルムに迅速に凍結した。像は、低温条件下で、ＡＭＴ ＨＲ ＣＣＤサイドマウントカメラを用いて２９Ｋの倍率で取った。像のコントラストを増強するために５〜８μｍのアンダーフォーカスを用いて低用量条件下で、ＦＥＩ Ｇ２０ Ｌａｂ６ ２００ｋＶ ＴＥＭ中のＧａｔａｎ７０度クライオトランスファーホルダーを用いてサンプルを載せた。

［ＦＶＩＩ活性に対するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡのＩｎ ｖｉｖｏ活性］ ６〜８週齢の雌のＣ５７Ｂｌ／６マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手した。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡを０．２μｍフィルターを通して濾過し、使用の前に滅菌リン酸緩衝生理食塩水で必要な濃度に希釈した。製剤は、１０ｍｌ／ｋｇの容積で外側尾静脈を介して静脈内に投与した。２４時間後、ケタミン／／キシラジンを用いて動物に麻酔し、心穿刺によって血液を採取した。サンプルを血清に処理し（Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ Ｓｅｒｕｍ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ Ｔｕｂｅｓ； Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、ＮＪ）、直ちに試験し、血清第ＶＩＩ因子レベルのその後の分析のために−７０℃で保存した。すべての手順を、地方、州および連邦の規制に規定どおりに従って実施し、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。

血清第ＶＩＩ因子レベルは、比色分析Ｂｉｏｐｈｅｎ ＶＩＩアッセイキット（Ａｎａｉｒａ）を使用して求めた。対照血清をプールし、段階希釈して（２００％〜３．１２５％）、処理動物におけるＦＶＩＩレベルを算出するための較正曲線を製造した。処理動物から得た適当に希釈した血漿サンプル（ｎ＝投与量あたり３）および生理食塩水対照群（ｎ＝４）をＢｉｏｐｈｅｎ ＶＩＩキットを製造業者の使用説明書に従って使用して分析した。分析は、９６ウェル、平底、非結合性ポリスチレンアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）で実施し、４０５ｎｍの吸光度を測定した。処理動物における第ＶＩＩ因子レベルは、段階希釈した対照血清を用いて作製した較正曲線から求めた。

例３
［ＬＮＰシステム：固体コア］
この例では、固体コアを有する本発明の代表的なＬＮＰ−ｓｉＲＮＡシステムの構造を説明する。

［脂質ナノ粒子の調製］ ＬＮＰは、上記のマイクロミキサーを使用して、エタノール中の所望の容積の脂質保存溶液を水相と混合することによって調製した。ｓｉＲＮＡのカプセル封入のために、所望の量のｓｉＲＮＡを、ｐＨ４の２５ｍＭ酢酸ナトリウムバッファーと混合した。混合を促進するためにヘリンボーン状構造を含有するマイクロミキサーにおいて、当容積の脂質／エタノール相およびｓｉＲＮＡ／水相を組み合わせた。マイクロミキサーを出るとすぐに、酢酸ナトリウムバッファーを用いてエタノール含量を２５％に迅速に希釈した。マイクロ混合を通る流速を、二重シリンジポンプ（Ｋｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して調節した。次いで、脂質混合物を、５０ｍＭ ＭＥＳ／ナトリウムクエン酸バッファー（ｐＨ６．７）中で４時間の透析と、それに続く、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中での一晩の透析に付した。

［Ｃｒｙｏ−ＥＭ］ サンプルは穴の開いた炭素フィルムを有する標準電子顕微鏡グリッドに、３μＬの、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの総脂質でＬＮＰを含有するＰＢＳを適用することによって調製した。Ｖｉｔｒｏｂｏｔシステム（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）を用いて吸い取ることによって過剰の液体を除去し、次いで、液体エタン中のＬＮＰ懸濁液をプランジ凍結して、ベシクルをアモルファスガラス様氷の薄いフィルムに迅速に凍結した。像は、低温条件下で、ＡＭＴ ＨＲ ＣＣＤサイドマウントカメラを用いて２９Ｋの倍率で取った。像のコントラストを増強するために５〜８ｕｍのアンダーフォーカスを用いて低用量条件下で、ＦＥＩ Ｇ２０ Ｌａｂ６ ２００ｋＶ ＴＥＭ中のＧａｔａｎ７０度クライオトランスファーホルダーを用いてサンプルを載せた。

［ＲＮアーゼ保護アッセイ］ 第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡは、マイクロ流体混合法を使用し、４０％ ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、１１％ ＤＳＰＣ、４４％コレステロールおよび５％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡを用いてカプセル封入した。１ｕｇのｓｉＲＮＡを、５０ｕＬの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中の０．０５ｕｇのＲＮアーゼＡ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの最後に、反応混合物の１０ｕＬのアリコートを、３０ｕＬのＦＡ色素（脱イオン化ホルムアミド、ＴＢＥ、ＰＢＳ、キシレンシアノール、ブロモフェノールブルー、酵母ｔＲＮＡ）に加えて、ＲＮアーゼ反応を停止した。２０％未変性ポリアクリルアミドゲルを使用してゲル電気泳動を実施し、ＣＹＢＲ−Ｓａｆｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて染色することによって核酸を可視化した。

［³¹Ｐ−ＮＭＲ研究］ １６２ＭＨｚで作動するＢｒｕｋｅｒ ＡＶＩＩ ４００スペクトロメーターを使用してプロトンデカップリングされた³¹Ｐ ＮＭＲスペクトルを得た。パルス間減衰および６４ｋＨｚのスペクトル幅を有する１５μｓ、５５度パルスを用いて、約１０⁴スキャンに対応する自由誘導減衰（ＦＩＤ）を得た。５０Ｈｚの線の広がりに対応する指数関数的な増大をＦＩＤに適用し、その後フーリエ変換を行った。サンプル温度は、Ｂｒｕｋｅｒ ＢＶＴ３２００温度ユニットを使用して調節した。測定は２５℃で実施した。

［ＦＲＥＴ膜融合研究］ ＬＮＰ ｓｉＲＮＡナノ粒子と、アニオン性ＤＯＰＳベシクルとの間の融合を、蛍光共鳴エネルギー移動を使用する脂質混合アッセイによってアッセイした。脂質フィルムを適当なバッファーで直接再水和し、続いて、Ｌｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒを使用して１００ｎｍポアサイズのポリカーボネートメンブレンを通して１０回押し出すことによって、ＮＢＤ−ＰＥおよびＲｈ−ＰＥ（各１ｍｏｌ％）を含有する標識したＤＯＰＳベシクルを調製した。４０％ ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、１１．５％ ＤＳＰＣ、４７．５％コレステロール、１％ ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡを含むＬＮＰを、０、０．０６および０．２４のｓｉＲＮＡ対脂質比（Ｄ／Ｌ比、ｗｔ／ｗｔ）を用いて調製した。Ｄ／Ｌ＝０．２４は、等モル比の正（カチオン性脂質）対負（ｓｉＲＮＡ）電荷（Ｎ／Ｐ＝１）に相当する。脂質混合実験を実施した。ｐＨ５．５に平衡化した１０ｍＭ酢酸、１０ｍＭ ＭＥＳ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１３０ｍＭ ＮａＣｌ ２ｍＬを含有する撹拌キュベット中に、標識されたＤＯＰＳベシクルおよび非標識ＬＮＰを１：２ｍｏｌ比で混合した。ＮＢＤ−ＰＥの蛍光を、連続低速撹拌下で、１×１ｃｍキュベットを使用し、ＬＳ−５５ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ蛍光光度計を使用し、４６５ｎｍの励起および５３５ｎｍの発光を使用してモニタリングした。脂質混合を、およそ１０分間モニタリングし、その後、２０μＬの１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を加えて、すべての脂質ベシクルを破壊し、無限のプローブ希釈に相当するものとした。無限プローブ希釈のパーセンテージとしての脂質混合を方程式：を使用して求めた。脂質混合％＝（Ｆ−Ｆ_o）／（Ｆ_max−Ｆ_o）×１００（式中、Ｆはアッセイの間の５３５ｎｍの蛍光強度であり、Ｆ_oは、初期蛍光強度であり、Ｆ_maxは、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００の添加後の無限プローブ希釈での最大蛍光強度である。

例４
［脂質ナノ粒子の逐次アセンブリー］
この例では、本発明の代表的な方法、脂質ナノ粒子を製造するための逐次アセンブリーを説明する。

オリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）溶液を、ｐＨ４．０の２５ｍＭ酢酸バッファー中、１．３１ｍｇ／ｍｌで調製した。脂質混合物は、９０ｍｏｌ％のカチオン性脂質（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）と１０ｍｏｌ％のＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ（エタノールに溶解した１０ｍＭ総脂質）とを含有するよう調製した。２種の溶液を、マイクロ流体ミキサーを総流速２ｍｌ／ｍｉｎで使用して混合し、ｐＨ４．０の２５ｍＭ酢酸バッファーを用いて２倍に希釈して、エタノールを約２３ｖｏｌ％に低下させ、最初の、すなわち、コアのナノ粒子を形成した。この最初の脂質粒子懸濁液をとり、メタノールに溶解したアニオン性脂質ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）を含有する別の脂質溶液と混合し、さらにおよそ２５ｖｏｌ％溶媒（メタノールおよびエタノール）に希釈することによって逐次アセンブリーを実施した。第２の脂質、ＤＯＰＳは、カチオン性脂質に対して約４ｘモル過剰で加えた。逐次アセンブリープロセスを、カチオン性脂質およびアニオン性脂質環を変更することによって反復した。

粒子サイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を使用して動的光散乱によって求めた。数加重分布データを使用した。ＬＮＰシステムの表面電荷の尺度を提供するゼータ電位を、ディスポーサブルキャピラリーセル（ＤＴＳ１０６０、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ．）を使用するＭａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを用いて測定した。ＬＮＰシステムを、２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．０でおよそ０．３ｍｇ／ｍｌ総脂質に希釈した。

例５
［代表的な脂質粒子の調製および特性決定］
この例では、カチオン性脂質と、核酸（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ−ｓｉＲＮＡ）とのみからなる本発明の代表的な脂質粒子を説明する。

ｓｉＲＮＡ溶液を、ｐＨ４．０の２５ｍＭ酢酸バッファー中、０．３８ｍｇ／ｍｌで調製した。脂質溶液は、エタノール中、１０ｍＭの濃度でＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡを含有するよう調製した。ｓｉＲＮＡ対脂質比は、０．０６（ｗｔ／ｗｔ）とした。各溶液を、等しい流速、２ｍｌ／ｍｉｎの総流速でマイクロ流体ミキサー中に投入した。サンプルを２５ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．０を用いてさらに希釈し、エタノール含量を２５ｖｏｌ％にした。

粒子サイズは、Ｎｉｃｏｍｐモデル３７０サブミクロン粒子選別器（粒子サイジングシステム、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ、米国）を使用して動的光散乱によって求めた。サンプル測定は、２５ｍＭ酢酸中で実施し、数加重分布データを使用した。粒子は、１４．２ｎｍの平均粒径、０．４８７の変動係数および１．９３のχ²を有していた。

例示的実施形態を示し、記載したが、当然のことではあるが、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それに種々の変法を行うことができる。
以下に本願発明の実施態様を記載する。
（１）
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）１つまたは複数の第２の脂質と；
（ｃ）１つまたは複数の核酸と
を備え、固体コアを備える脂質粒子。
（２）
前記カチオン性脂質が、アミノ脂質である、（１）に記載の粒子。
（３）
前記カチオン性脂質が、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＲＩＥからなる群から選択される、（１）または（２）に記載の粒子。
（４）
前記カチオン性脂質が、次式を有する、（１）から（３）のいずれか一項に記載の粒子：

式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルケニル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキニルまたは任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アシルであり；
Ｒ3およびＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル、任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルケニルもしくは任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルキニルであるか、またはＲ3およびＲ4は結合して、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有する任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ5は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同一であるかまたは異なり、独立に、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；
ＹおよびＺは、同一であるかまたは異なり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
（５）
前記カチオン性脂質が、ジリノレイルアミノ脂質である、（１）から（４）のいずれか一項に記載の粒子。
（６）
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである、（１）から（５）のいずれか一項に記載の粒子。
（７）
約３０〜約９５モルパーセントのカチオン性脂質を備える、（１）から（６）のいずれか一項に記載の粒子。
（８）
前記第２の脂質が、ＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾されたセラミド、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾されたジアルキルグリセロールからなる群から選択される、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（９）
前記第２の脂質が、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡおよびＰＥＧ−ｃ−ＤＭＧからなる群から選択される、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１０）
前記第２の脂質がＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１１）
前記第２の脂質が中性脂質である、（１）から（１０）のいずれか一項に記載の粒子。
（１２）
前記第２の脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１３）
前記第２の脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される中性脂質である、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１４）
前記第２の脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１５）
前記第２の脂質がステロールである、（１）から（７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１６）
約１〜約１０モルパーセントの第２の脂質を備える、（１）から（１５）のいずれか一項に記載の粒子。
（１７）
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現できるプラスミドである、（１）から（１６）のいずれか一項に記載の粒子。
（１８）
前記核酸が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡである、（１）から（１７）のいずれか一項に記載の粒子。
（１９）
前記核酸が、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、（１）から（１７）のいずれか一項に記載の粒子。
（２０）
前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、（１）から（１９）のいずれか一項に記載の粒子。
（２１）
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）中性脂質と；
（ｃ）ＰＥＧ−脂質と；
（ｄ）ステロールと；
（ｅ）１つまたは複数の核酸と
を備え、固体コアを備える脂質粒子。
（２２）
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである、（２１）に記載の粒子。
（２３）
前記ＰＥＧ−脂質が、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡである、（２１）に記載の粒子。
（２４）
前記中性脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、（２１）に記載の粒子。
（２５）
前記ステロールがコレステロールである、（２１）に記載の粒子。
（２６）
前記核酸がｓｉＲＮＡである、（２１）に記載の粒子。
（２７）
（ａ）１つまたは複数のカチオン性脂質と；
（ｂ）１つまたは複数の核酸と
からなり、固体コアを備える脂質粒子。
（２８）
前記カチオン性脂質が、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡである、（２１）に記載の粒子。
（２９）
前記核酸がｓｉＲＮＡである、（２１）に記載の粒子。
（３０）
核酸を対象に投与するための方法であって、それを必要とする対象に、（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子を投与することを備える方法。
（３１）
核酸を細胞に導入するための方法であって、細胞を（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子と接触させることを備える方法。
（３２）
標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節するための方法であって、細胞を（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子と接触させることを備え、前記核酸が標的ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現を調節できる方法。
（３３）
対象におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、対象に（１）から（２９）のいずれか一項に記載の脂質粒子を投与することを備え、前記核酸がポリペプチドの発現をサイレンシングまたは低減できる方法。
（３４）
核酸を含有する脂質粒子を製造するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをマイクロ流体デバイスに導入することと、
ここで、前記デバイスは、前記デバイスに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物をマイクロ流体ミキサーを用いて混合するための第２の領域とを有する；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを前記デバイスに導入して、層流条件下を流れる第１および第２の流れを提供することと、
ここで、前記デバイスは、前記マイクロチャネルに導入される１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有し、前記脂質粒子形成材料はカチオン性脂質を含み、前記第１および第２の溶媒は同一ではない；
（ｃ）前記デバイスの前記第１の領域から前記デバイスの前記第２の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを流すことと；
（ｄ）前記デバイスの前記第２の領域において層流条件下を流れる、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと
を備える方法。
（３５）
核酸を含有する脂質粒子を製造するための方法であって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをチャネルに導入することと、
ここで、デバイスは、前記チャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する；
（ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを導入することと、
ここで、前記チャネルは、前記チャネルに導入された１つまたは複数の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物を混合するための第２の領域とを有する；
（ｃ）前記チャネルの前記第１の領域から前記チャネルの前記第２の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを、前記２つの流れの物理的分離を維持しながら流すことと、
ここで、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れは、前記チャネルの前記第２の領域に到達するまで混合しない；
（ｄ）前記マイクロチャネルの前記第２の領域において層流条件下を流れる、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することと、
を備える方法。
（３６）
前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの内容物を混合することが、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの濃度または相対混合速度を変更することを備える、（３４）または（３５）に記載の方法。
（３７）
前記第３の流れを水性バッファーで希釈することをさらに備える、（３４）から（３６）のいずれか一項に記載の方法。
（３８）
前記第３の流れを希釈することが、前記第３の流れおよび水性バッファーを第２の混合構造中に流すことを備える、（３７）に記載の方法。
（３９）
カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える前記水性バッファーを透析して、前記第２の溶媒の量を低減することをさらに備える、（３４）から（３８）のいずれか一項に記載の方法。
（４０）
前記第１の溶媒が水性バッファーである、（３４）から（３９）のいずれか一項に記載の方法。
（４１）
前記第２の溶媒が水性アルコールである、（３４）から（４０）のいずれか一項に記載の方法。
（４２）
前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現できるプラスミドである、（３４）から（４２）のいずれか一項に記載の方法。
（４３）
前記アミノ脂質が、次式を有する、（３４）から（４２）のいずれか一項に記載の方法：

式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルケニル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキニルまたは任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アシルであり；
Ｒ3およびＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル、任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルケニルもしくは任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルキニルであるか、またはＲ3およびＲ4は結合して、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有する任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ5は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
ｍ、ｎおよびｐは、同一であるかまたは異なり、独立に、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
ｑは、０、１、２、３または４であり；
ＹおよびＺは、同一であるかまたは異なり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
（４４）
前記第２の流れが、第２の脂質をさらに備える、（３４）から（４３）のいずれか一項に記載の方法。
（４５）
前記第１および第２の流れの内容物を混合することが、カオス的移流を備える、（３４）から（４４）のいずれか一項に記載の方法。
（４６）
前記第１および第２の流れの内容物を混合することが、マイクロミキサーを用いて混合することを備える、（３４）から（４５）のいずれか一項に記載の方法。
（４７）
核酸カプセル封入効率が、約９０〜約１００％である、（３４）から（４６）のいずれか一項に記載の方法。
（４８）
前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れの混合が、障壁によって前記第１の領域では防がれる、（３５）に記載の方法。
（４９）
前記障壁が、チャネル壁、シース流体または同心チューブである、（４８）に記載の方法。
（５０）
（３４）から（４９）のいずれか一項に記載の方法によって製造される脂質粒子。
（５１）
核酸をカプセル封入する脂質粒子を製造するためのデバイスであって、
（ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の溶液を受け取るための第１の入口と、
（ｂ）前記第１の溶媒中に前記核酸を備える第１の流れを提供するための、前記第１の入口と流体連通している第１の入口マイクロチャネルと；
（ｃ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の溶液を受け取るための第２の入口と；
（ｄ）前記第２の溶媒中に前記脂質粒子形成材料を備える第２の流れを提供するための、前記第２の入口と流体連通している第２の入口マイクロチャネルと；
（ｅ）前記第１および第２の流れを受け取るための第３のマイクロチャネルであり、層流条件下で前記マイクロチャネルに導入された前記第１および第２の流れを流すように適合されている第１の領域と、前記第１および第２の流れの内容物を混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質粒子を備える第３の流れを提供するように適合されている第２の領域とを有する第３のマイクロチャネルと
を備えるデバイス。
（５２）
前記第３の流れを希釈して、カプセル封入された核酸を有する安定化された脂質粒子を備える希釈流を提供するための手段をさらに備える、（５１）に記載のデバイス。
（５３）
前記マイクロチャネルが、約２０〜約３００μｍの流体力学直径を有する、（５１）または（５２）に記載のデバイス。
（５４）
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、浅浮き彫り構造を備える、（５１）から（５３）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５５）
前記マイクロチャネルの前記第２の領域が、主要な流れ方向および少なくとも１つの溝または突起部が画定されている１つまたは複数の表面を有し、前記溝または突起部が前記主要な方向と角度を形成する配向を有する、（５１）から（５４）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５６）
前記第２の領域がマイクロミキサーを備える、（５１）から（５５）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５７）
前記第１および第２の流れの流速を変更するための手段をさらに備える、（５１）から（５６）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５８）
前記第３の流れを希釈するための手段が、マイクロミキサーを備える、（５２）から（５７）のいずれか一項に記載のデバイス。
（５９）
前記第１の領域において、前記１つまたは複数の第１の流れを、前記１つまたは複数の第２の流れから物理的に分離するのに有効な障壁をさらに備える、（５２）から（５８）のいずれか一項に記載のデバイス。

Claims (32)

1. （ａ）核酸、カチオン性脂質および任意に第２の脂質からなるコア；および
   （ｂ）該コアを囲むＰＥＧ脂質
   を備え、
   前記第２の脂質は、中性脂質、アニオン性脂質、ステロールおよびＰＥＧ脂質から選択され、
   溶液中で測定された脂質粒子の ³¹ P核磁気共鳴スペクトルが、核酸による共鳴を示さない、
   脂質粒子。
2. ３０〜９５モルパーセントのカチオン性脂質を備える、請求項１に記載の粒子。
3. さらに前記コアを囲む第２の脂質を備える、請求項１に記載の粒子。
4. １．０〜１０モルパーセントのＰＥＧ脂質を備える請求項１に記載の粒子。
5. 直径が１５〜３００ｎｍである、請求項１に記載の粒子。
6. 粒子が、低温透過型電子顕微鏡で可視化したときに高電子密度である、請求項１に記載の粒子。
7. 核酸を細胞に導入するための方法であって、細胞を請求項１に記載の脂質粒子とｉｎ ｖｉｔｒｏで接触させることを備える方法。
8. 請求項１から６のいずれか1項に記載された核酸を含有する脂質粒子を製造するための方法であって、
   （ａ）第１の溶媒中に核酸を備える第１の流れをデバイスに導入することと、
   ここで、前記デバイスは、前記デバイスに導入された１つまたは複数の流れをデバイスに流すように適合されている第１の領域と、前記１つまたは複数の流れの内容物をミキサーを用いて混合するための第２の領域とを有する；
   （ｂ）第２の溶媒中に脂質粒子形成材料を備える第２の流れを前記デバイスに導入して第１および第２の流れを提供することと、
   ここで、前記脂質粒子形成材料はカチオン性脂質を含み、前記第１および第２の溶媒は同一ではない；
   （ｃ）前記デバイスの前記第１の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを流し、ここで前記第１の流れと前記第２の流れの容積比が１．０を超え、
   （ｄ）前記デバイスの前記第１の領域から前記デバイスの前記第２の領域に、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを層流条件下で流し；
   （ｅ）前記デバイスの前記第２の領域において、前記１つまたは複数の第１の流れおよび前記１つまたは複数の第２の流れを１００μｓ〜１０ｍｓの間混合して、カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子を備える第３の流れを提供することとを備える方法。
9. １つまたは複数の第１の流れおよび１つまたは複数の第２の流れの流速が、１ｍＬ／ｍｉｎから４０ｍＬ／ｍｉｎである、請求項８記載の方法。
10. 脂質粒子形成材料の濃度が１０ｍＭ〜５０ｍＭである、請求項８記載の方法。
11. カプセル封入された核酸を有する脂質ナノ粒子が、１５〜３００ｎｍの直径を有する、請求項８記載の方法。
12. ミキサーがマイクロミキサーである請求項８記載の方法。
13. 脂質粒子における核酸カプセル封入効率が、９０〜１００％である、請求項８に記載の方法。
14. 前記カチオン性脂質がイオン化できる脂質である、請求項１に記載の粒子。
15. 前記カチオン性脂質が、アミノ脂質である、請求項１に記載の粒子。
16. 前記カチオン性脂質が、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＴＭＡ、ＤＤＡＢ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＡＰ−Ｃｌ、ＤＣ−Ｃｈｏｌ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＧＳ、ＤＯＰＥ、ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡおよびＤＭＲＩＥからなる群から選択される、請求項１に記載の粒子。
17. 前記カチオン性脂質が、次式を有する、請求項１に記載の粒子：
    

    

    式中、Ｒ1およびＲ2は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルケニル、任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アルキニルまたは任意に置換されたＣ10〜Ｃ24アシルであり；
    Ｒ3およびＲ4は、同一であるかまたは異なり、独立に、任意に置換されたＣ1〜Ｃ6アルキル、任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルケニルもしくは任意に置換されたＣ2〜Ｃ6アルキニルであるか、またはＲ3およびＲ4は結合して、４〜６個の炭素原子ならびに窒素および酸素から選択される１もしくは２個のヘテロ原子を有する任意に置換された複素環を形成し；
    Ｒ5は、存在しないかまたは存在し、存在する場合は水素またはＣ1〜Ｃ6アルキルであり；
    ｍ、ｎおよびｐは、同一であるかまたは異なり、独立に、０または１のいずれかであり、ただし、ｍ、ｎおよびｐは、同時に０ではなく；
    ｑは、０、１、２、３または４であり；
    ＹおよびＺは、同一であるかまたは異なり、独立に、Ｏ、ＳまたはＮＨである。
18. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ修飾されたホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾されたホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾されたセラミド、ＰＥＧ修飾されたジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾されたジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾されたジアルキルグリセロールからなる群から選択される、請求項１に記載の粒子。
19. １〜５モルパーセントのＰＥＧ脂質を備える、請求項１に記載の粒子。
20. 前記ＰＥＧ脂質が、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡおよびＰＥＧ−ｃ−ＤＭＧからなる群から選択される、請求項１に記載の粒子。
21. 前記第２の脂質が、両性イオン性脂質、ステロールおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３に記載の粒子。
22. 前記第２の脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される、請求項３に記載の粒子。
23. 前記第２の脂質が、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシドからなる群から選択される、請求項３に記載の粒子。
24. 前記第２の脂質が、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である、請求項３に記載の粒子。
25. 前記第２の脂質が、ステロールである、請求項３に記載の粒子。
26. 前記第２の脂質が、コレステロールである、請求項３に記載の粒子。
27. 前記核酸が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸、核酸類似体またはＤＮＡもしくはＲＮＡを発現できるプラスミドである、請求項１に記載の粒子。
28. 前記核酸が、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡである、請求項１に記載の粒子。
29. 前記核酸が、ｓｉＲＮＡまたはマイクロＲＮＡである、請求項１に記載の粒子。
30. 前記核酸が、アンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の粒子。
31. ３０〜２００ｎｍの直径を有する、請求項１に記載の粒子。
32. 複数の請求項１に記載の脂質粒子を備える、組成物。

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