JP6681804B2 - 変異プライマーの設計方法 - Google Patents

Description

本発明は変異が導入されたプライマーの設計方法に関する。

現在、核酸増幅法は基礎研究分野のみならず、疫学的検査、医学的診断、法医学および遺伝子分析を含む様々な分野において必要不可欠な手法となっている。核酸増幅法は標的核酸配列を特異的に増幅できることから、標的核酸の存在を検出するための高感受性手段として極めて有用である。

核酸増幅法を行うに際しての問題の一つとして非特異的増幅産物の生成が挙げられる。そして、プライマーダイマーの形成やプライマー１分子内でのループ構造の形成が、非特異的増幅が生じる要因となることが知られている。プライマーダイマー又はループ構造の形成に起因する非特異的増幅は、例えば、プライマーの３´末端領域がそれ自体又は他のプライマーとのある程度の相補性を有する場合に生じ得る。
定量的ＰＣＲや等温増幅法のように標的配列の有無を判別するための核酸増幅系において、このような非特異的増幅が生じると、Ｓ／Ｎ比の低下、偽陽性の発生などの問題が生じ、標的配列の検出が不可能になる場合がある。

このような状況下、非特異的増幅反応の原因の一つであるプライマーダイマーの発生を抑制する方法が提案されている。
特許文献１には標識したプライマーを用いＦＲＥＴの原理を応用することで、プライマーダイマーに起因するシグナルが検出されないようにし、Ｓ／Ｎ比を向上させる方法が開示されている。

また、特許文献２には、２’−フルオロ−ヌクレオチド類、２’−アミノヌクレオチド類及びアラビノースヌクレオチド類から成る群から選ばれる修飾されたヌクレオチドを３´末端側の配列内に含むプライマーが開示されている。
同様の技術として特許文献３には、改変されたピリミジン核酸塩基を３´末端側の配列内に含むプライマーが開示されている。
特許文献２及び３には、これらプライマーを用いるとプライマーダイマーの形成が抑制できることが記載されている。

特表２００５−５２８１２１号公報 特開２００２−２９１４９０号公報 特表２００８−５３５５１８号公報

特許文献１に記載の方法は、増幅産物より発される蛍光を読み取ることにより標的核酸の存在の有無又は存在量を検出する定量的ＰＣＲにおいては有効な手段であるが、インターカレーターにより増幅核酸を検出する系には応用できない。また、プライマーダイマー自体の発生は抑制できないため、プライマーダイマーに起因する非特異的増幅産物の生成によるプライマーの枯渇を防ぐことはできない。

特許文献２及び３に記載の方法は、非特異的増幅の原因であるプライマーダイマーの発生自体を抑制するものである。しかし、これらの文献には修飾又は改変ヌクレオチドを導入する位置について「３つの３´末端ヌクレオチド位置内」又は「３´末端から４ヌクレオチド以内」などの抽象的な記載しか無く、より効果的に非特異的増幅を抑制できる修飾プライマーの設計の方法については開示が無い。

このような状況下において、本発明の解決しようとする課題は、プライマーダイマー又はループ構造に起因する非特異的増幅が生じにくい変異プライマーの新規の設計方法を提供することにある。

上記課題を解決する本発明は、核酸増幅法に用いる、変異が導入されたプライマーの設計方法であって、
鋳型ＤＮＡに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する基礎配列設計工程と、
該基礎プライマー配列に含まれる１又は２以上のヌクレオチド残基であって、以下の（１）〜（４）からなる群から選ばれる１又は２以上の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択する変異導入部位選択工程を備える、設計方法である。
（１）プライマーダイマーの形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
（２）プライマー１分子内でのループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
（３）前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
（４）前記基礎プライマー配列からなるプライマーが１分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。

本発明の設計方法によれば、プライマーダイマー又はループ構造に起因する非特異的増幅が生じにくい変異プライマーを容易に設計することができる。

本発明においては、変異プライマーに導入された変異をＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチド残基と認識しないものとすることが好ましい。
このような形態とすることによって、より非特異的増幅が生じにくいプライマーを設計することができる。

本発明の好ましい形態では、変異が以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる群から選ばれる１種又は２種以上である。
（Ａ）前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の５´末端及び３´末端と、それぞれ５´末端及び３´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
（Ｂ）炭素鎖又はＰＥＧ鎖からなるスペーサー鎖。
（Ｃ）一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
一般式１
（一般式１中、ＲはＨ，または水酸基、ｎは自然数を示す。）
（Ｄ）光分解性修飾のされたスペーサー鎖。
変異プライマーに導入する変異を（Ａ）〜（Ｄ）とすることによって、さらに非特異的増幅を生じにくいプライマーを設計することができる。

また、本発明は、上述の設計方法により設計されたプライマー及び当該プライマーを用いる核酸増幅法にも関する。
本発明のプライマー及び核酸増幅方法によれば、核酸増幅における非特異的増幅を低減することができる。

本発明の核酸増幅補法は、等温増幅法に適用することが特に好ましい。
等温増幅法はＰＣＲ法とは異なり、二本鎖ＤＮＡの変性工程を含まず非特異的増幅が生じ易いため、本発明の核酸増幅法を適用することが特に好ましい。

また、本発明は、上述の設計方法の各工程を手順としてコンピュータに実行させるためのプログラムにも関する。
本発明のプログラムによれば、非特異的増幅を生じにくい変異プライマーを簡便に設計することができる。

本発明によれば、非特異的増幅を生じにくい変異プライマー及び核酸増幅法を提供することができる。

通常の核酸の構造を表す図である。 （Ａ）の変異が導入されたプライマーの構造を表す図である。 （Ｂ）の変異として炭素鎖が導入されたプライマーの構造を表す図である。 （Ｂ）の変異としてＰＥＧ鎖が導入されたプライマーの構造を表す図である。 （Ｃ）の変異として一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖が導入されたプライマーの構造を表す図である。 （Ｄ）の変異として光分解性修飾のされたスペーサー鎖が導入されたプライマーの構造を表す図である。 プライマーダイマーの模式図である。黒塗りの矢印は変異導入部位を表す。左右方向の矢印は核酸合成が行われる方向を表す。２つのプライマー間の縦線は水素結合を表す。 変異が導入されたプライマーの模式図である。ｍは変異を示す。×印は核酸合成が行われないことを表す。２つのプライマー間の縦線は水素結合を表す。 ループ構造の模式図である。黒塗りの矢印は変異導入部位を表す。左方向の矢印は核酸合成が行われる方向を表す。縦線は水素結合を表す。 変異が導入されたプライマーの模式図である。ｍは変異を示す。×印は核酸合成が行われないことを表す。２つのプライマー間の縦線は水素結合を表す。 プライマーダイマーの模式図である。黒塗りの矢印は変異導入部位を表す。左右方向の矢印は核酸合成が行われる方向を表す。２つのプライマー間の縦線は水素結合を表す。 変異が導入されたプライマーの模式図である。ｍは変異を示す。×印と左右方向の矢印は、×印の位置において矢印の方向の核酸合成が停止することを表す。２つのプライマー間の縦線は水素結合を表す。 非特異的増幅産物が新たな非特異的増幅のプライマーとして機能し非特異的増幅が連鎖する様子を表す模式図である。黒塗りの矢印は変異導入部位を表す。左右方向の矢印は核酸合成が行われる方向を表す。２つのプライマー間の縦線は水素結合を表す。 変異の導入によりプライマーの形成に起因する非特異的増幅の連鎖が抑制されることを表す模式図である。ｍは変異を示す。 ループ構造の模式図である。黒塗りの矢印は変異導入部位を表す。左方向の矢印は核酸合成が行われる方向を表す。縦線は水素結合を表す。 変異の導入によりループ構造の形成に起因する非特異的増幅の連鎖が抑制されることを表す模式図である。ｍは変異を示す。 試験例１の増幅曲線を表す。 時間軸を拡大した試験例１の増幅曲線を表す。 試験例２の増幅曲線を表す。 時間軸を拡大した試験例２の増幅曲線を表す。 ２つのＦプライマーのプライマーダイマーにより非特異的増幅が生じ、非特異的増幅産物であるＰ１が形成される様子を表す図である。 非特異的増幅産物であるＰ１がプライマー、Ｒプライマーが鋳型として非特異的増幅が生じ、非特異的増幅の産物であるＰ２が形成される様子を表す図である。 プライマーセット２により非特異的増幅反応が抑制されるメカニズムを説明する図である。変異が導入された２つのＦプライマーのプライマーダイマーにより非特異的増幅が生じ、非特異的増幅産物であるＰ１´が形成される様子を表す。 プライマーセット２により非特異的増幅反応が抑制されるメカニズムを説明する図である。非特異的増幅産物であるＰ１´がプライマー、Ｒプライマーが鋳型として非特異的増幅が生じ、非特異的増幅の産物であるＰ２´が形成される様子を表す。 プライマーセット３により非特異的増幅反応が抑制されるメカニズムを説明する図である。変異が導入された２つのＦプライマーのプライマーダイマーにより非特異的増幅が生じ、非特異的増幅産物であるＰ１´´が形成される様子を表す。 プライマーセット３により非特異的増幅反応が抑制されるメカニズムを説明する図である。非特異的増幅産物であるＰ１´´がプライマー、Ｒプライマーが鋳型として非特異的増幅が生じ、非特異的増幅の産物であるＰ２´´が形成される様子を表す。 試験例３の増幅曲線を表す。 時間軸を拡大した試験例３の増幅曲線を表す。 試験例４の増幅曲線を表す。 時間軸を拡大した試験例４の増幅曲線を表す。

以下、本発明の実施の形態について詳しく説明を加える。なお、本発明の技術的範囲は以下の実施の形態に限定されるものではない。

本発明において核酸増幅法とは核酸を増幅する全ての方法を含み、ＰＣＲ法；ＰＣＲ法より派生した逆転写ＰＣＲ法、リアルタイムＰＣＲ法、ＤＮＡシークエンシング法；ＬＡＭＰ法、ＳｍａｒｔＡｍｐ法、また再表２０１２／１２４６８１号公報に記載の核酸増幅法（TRIAmp増幅法）のような等温増幅法を含む。
本発明の設計方法は特に等温増幅法に用いるためのプライマーの設計のために適用することが好ましい。

本発明においてプライマーとは核酸増幅反応においてＤＮＡポリメラーゼが核酸を合成する際に３´ＯＨを供給する役割をもつ短い核酸の断片のことをいい、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。以下の説明において特に断りが無い場合には、プライマーとはＤＮＡプライマーのことを指す。

本発明は変異が導入されたプライマーの設計方法である。本発明において「変異を導入する」とは、通常の核酸を構成するヌクレオチド残基（アデニンヌクレオチド残基、グアニンヌクレオチド残基、チミンヌクレオチド残基、シトシンヌクレオチド残基、ウラシルヌクレオチド残基）を、修飾が施されたヌクレオチド残基、改変されたヌクレオチド残基、ヌクレオチド残基以外の化学構造、又は通常とは異なる結合態様のヌクレオチド残基等に置換することをいい、「変異」とは上述の化学構造のことをいう。

本発明における変異としては、従来スペーサーとして利用されている化学構造を利用することができる。

特に好ましい変異としては、ＤＮＡポリメラーゼがヌクレオチド残基と認識しない化学構造が挙げられる。このような変異として具体的には以下の（Ａ）〜（Ｄ）の化学構造が挙げられる。
（Ａ）前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の５´末端及び３´末端と、それぞれ５´末端及び３´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
（Ｂ）炭素鎖又はＰＥＧ鎖からなるスペーサー鎖。
（Ｃ）一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
（Ｄ）光分解性修飾のされたスペーサー鎖。

通常、核酸を構成するヌクレオチド残基は、その３´末端において他のヌクレオチド残基の５´末端と結合し、他方、その５´末端において他のヌクレオチド残基の３´末端と結合している（図１）。
（Ａ）の変異が導入されたプライマーは通常のヌクレオチド残基で構成されているが、変異導入部位におけるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチドの結合様式が通常とは逆転しているため、ＤＮＡポリメラーゼがこれをヌクレオチド残基であると認識できず、核酸合成反応を継続することができない（図２）。また、当該変異が導入されたプライマーが相補鎖とハイブリダイゼーションする際に、当該変異は相補鎖側の塩基と水素結合を形成しない。

（Ｂ）の変異はヌクレオチド残基とは全く構造が異なるため、ＤＮＡポリメラーゼがこれをヌクレオチド残基であると認識できず、核酸合成反応を継続することができない（図３及び４）。また、当該変異が導入されたプライマーが相補鎖とハイブリダイゼーションする際に、当該変異は相補鎖側の塩基と水素結合を形成しない。

導入する変異を炭素鎖とする場合には、置換するヌクレオチド残基１個当たりの当該炭素鎖の炭素鎖長は、好ましくは３〜９とすることができる。
また、導入する変異をＰＥＧ鎖とする場合には、置換するヌクレオチド残基１個当たりの当該ＰＥＧ鎖の重合度は、好ましくは１〜３とすることができる。

（Ｂ）の変異としては、3-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)propyl-1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]- phosphoramiditeから誘導される構造（通称Spacer C3）、8-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-triethyleneglycol, 1-[(2-cyanoethyl)- (N,N-diisopropyl)]-phosphoramiditeから誘導される構造（通称Spacer 9）などが例示できる。

（Ｃ）の変異は塩基を有さないため、ＤＮＡポリメラーゼがこれをヌクレオチド残基であると認識できず、核酸合成反応を継続することができない（図５）。また、当該変異が導入されたプライマーが相補鎖とハイブリダイゼーションする際に、当該変異は相補鎖側の塩基と水素結合を形成しない。

（Ｃ）の変異としては、5'-O-Dimethoxytrityl-1',2'-Dideoxyribose-3'-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramiditeから誘導される構造（通称dSpacer）、5-O-Dimethoxytrityl-1-O-tert-butyldimethylsilyl-2-deoxyribose-3-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite（通称Abasic）から誘導される構造などが例示できる。
なお、AbasicのＴＢＤＭＳ保護基（tert-butyldimethylsily基）はプライマー合成の際に脱保護される。そのため、Abasicを導入した後のプライマーの構造は、図５においてＲをＯＨとした構造となる。

なお、導入する変異を一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖とする場合には、置換するヌクレオチド残基１個当たりのｎの値は、好ましくは１とすることができる。

（Ｄ）の変異はヌクレオチド残基とは全く構造が異なるため、ＤＮＡポリメラーゼがこれをヌクレオチド残基であると認識できず、核酸合成反応を継続することができない（図６）。また、当該変異が導入されたプライマーが相補鎖とハイブリダイゼーションする際に、当該変異は相補鎖側の塩基と水素結合を形成しない。

なお、光分解性修飾のされたスペーサー鎖とはＵＶまたは可視光の曝露によって分解する性質を持つ化合物で修飾されたスペーサー鎖であって、本明細書においてはニトロベンゼン骨格を有することを特徴の一つとして有している化合物群（特許第４８７０７９１号参照）を指す。

（Ｄ）の変異としては、1-[2-Nitro-5-(6trifluoroacetylcaproamidomethyl)phenyl]-ethyl- [2-cyano-ethyl(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite から誘導される構造（通称PC 5'-Amino-Modifier）、1-[2-Nitro-5-(6-(N-(4,4'dimethoxytrityl))biotinamidocaproamidomethyl)phenyl]-ethyl-[2cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite から誘導される構造（通称PC 5'-Biotin）、3-(4,4'-Dimethoxytrityl)-1-(2nitrophenyl)-propane-1,3-diol-[2cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)]phosphoramidite から誘導される構造（通称PC Linker）、[4-(4,4'-Dimethoxytrityloxy)butyramidomethyl)-1-(2-nitrophenyl)-ethyl]-2-cyanoethyl-(N,N-diisopropyl)-phosphoramiditeから誘導される構造（通称PC Spacer）などが例示できる。

１つのプライマーに導入する変異の数はプライマーの特異性を失わない範囲で適宜設定することができる。プライマーの特異性は一般的なプライマー設計ツールにより算出することができる。

次に、本発明の設計方法の各工程について説明する。
本発明のプライマーの設計方法は、基礎配列設計工程を含む。基礎配列設計工程は鋳型ＤＮＡに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する工程であり、通常の核酸増幅法におけるプライマーの設計と同様に行うことができる。すなわち、特異性、ＧＣ含有量、Ｔｍ値などの観点からプライマーに適した１５〜５０塩基程度の塩基配列を、標的とする塩基配列の中から選択する。特異性やＧＣ含有量、Ｔｍ値などの算出方法は制限されず、手計算でもよいし一般的に利用されている計算ツールなどを使用してもよい。

１つの系において設計する基礎プライマー配列の数は、目的とする核酸増幅法の系によって適宜変更する。すなわち、目的とする核酸増幅法が、通常のＰＣＲ法である場合においてはＦプライマーとＲプライマーの２種、Ｌａｍｐ法のような３種以上のプライマーを要する系である場合においては３種以上の基礎プライマー配列を設計する。

基礎配列設計工程における基礎プライマー配列の設計の後、変異導入部位選択工程を行う。変異導入部位選択工程は、以下の（１）〜（４）からなる群から選ばれる１又は２以上の条件に合致するヌクレオチド残基を基礎プライマー配列から選択し、変異導入部位とする工程である。
（１）プライマーダイマーの形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
（２）プライマー１分子内でのループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基。
（３）前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
（４）前記基礎プライマー配列からなるプライマーが１分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。

基礎プライマー配列からなるプライマーが、プライマーダイマー又はループ構造を形成するか否か、また形成する場合には何れのヌクレオチド残基が寄与するのか予測する手段は特に限定されず、一般的に利用されている計算ツールなどを使用してもよい。

まず、（１）の条件に合致するヌクレオチド残基は、例えば図７に示すヌクレオチド残基（ＦプライマーのＴＡＡ、ＲプライマーのＴＴＡ）のような、プライマーダイマーの形成に寄与、つまり、相補鎖の塩基と水素結合を形成する可能性のあるヌクレオチド残基である。プライマーダイマーが形成されると、図７に示すようにプライマー自体が鋳型となり、非特異的増幅が生じてしまう。
（１）の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し（図７中黒塗り矢印）、変異を導入することでプライマーダイマーの形成を抑制し、非特異的増幅の発生を抑えることができる（図８）。

図７及び８にはＦプライマーとＲプライマーという互いに異なるプライマー同士のプライマーダイマーの形成を抑制する場合の概要を示したが、同一のプライマー同士のプライマーダイマーの形成に寄与するヌクレオチド残基も（１）の条件に合致することは言うまでもない。

（２）の条件に合致するヌクレオチド残基は、例えば図９に示すヌクレオチド残基（５´側のＴＡＡ、３´側のＴＴＡ）のような、ループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基である。ループ構造が形成されると、図９に示すようにプライマー自体が鋳型となり、非特異的増幅が生じてしまう。
（２）の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し（図９中黒塗り矢印）、変異を導入することでループ構造の形成を抑制し、非特異的増幅の発生を抑えることができる（図１０）。

（３）の条件に合致するヌクレオチド残基は、例えば図１１に示すヌクレオチド残基（ＦプライマーのＣ、ＲプライマーのＧ）のような、基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基である。
プライマーダイマーが形成されると、図１１に示すようにプライマー自体が鋳型となり、ＤＮＡポリメラーゼが最大限合成可能な鎖長にまで非特異的増幅が生じてしまう。（３）の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し（図１１中黒塗り矢印）、変異を導入することで、変異導入部位においてＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応を阻害し、非特異的増幅産物の鎖長を短く抑制することができる（図１２）。

（３）の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択することは、例えば図１３に示すような、非特異的増幅産物が新たな非特異的増幅のプライマーとして機能し得る場合に特に有効である。図１３に示したプライマーにより生じた非特異的増幅産物であるＰ１とＰ２は、変性し一本鎖となった後、再び互いにハイブリダイズし、新たな非特異的増幅を引き起こす。この新たな非特異的増幅の産物はさらに別の非特異的増幅を生じるプライマーとして機能し得るため、非特異的増幅の連鎖は止まらないこととなる。

この場合に（３）の条件に合致するヌクレオチド残基に変異を導入すると、図１４に示すように非特異的増幅産物Ｐ１´及びＰ２´が新たな非特異的増幅のプライマーとして機能しないため、非特異的増幅の連鎖を防止することができる。

図１３及び１４にはＦプライマーとＲプライマーという互いに異なるプライマー同士のプライマーダイマーの形成を抑制する場合の概要を示したが、同一のプライマー同士のプライマーの形成に寄与するヌクレオチド残基も（３）の条件に合致することは言うまでもない。

（４）の条件に合致するヌクレオチド残基は、例えば図１５に示すヌクレオチド残基（Ｃ）のような、基礎プライマー配列からなるプライマーが１分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基である。ここで、「ループ構造を構成する領域」とは、ループ状となっている配列領域、並びに、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域のことをいう。

ループ構造が形成されると、図１５に示すようにプライマー自体が鋳型となり、ＤＮＡポリメラーゼが最大限合成可能な鎖長にまで非特異的増幅が生じてしまう。（４）の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し（図１５中黒塗り矢印）、変異を導入することで、変異導入部位においてＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ合成反応を阻害し、非特異的増幅産物の鎖長を短く抑制することができる（図１６）。

（４）の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択することは、図１３及び１４を参照しながら説明したものと同様の原理によって非特異的増幅産物が新たな非特異的増幅のプライマーとして機能し得る場合に特に有効である。（４）の条件に合致するヌクレオチド残基に変異を導入することで、非特異的増幅の連鎖を防止することができる。

本発明の設計方法により設計するプライマーには、非特異的増幅の抑制以外の目的をもって各種修飾を行っても良い。

＜試験例１＞
Mycobacterium bovis BCG str. Tokyo 172株のゲノムDNAにおけるDirect Repeat配列を、再表２０１２／１２４６８１号公報に記載の核酸増幅法（TRIAmp増幅法）により増幅するため、同公報においてDRa-21及びDRb-19として記載のプライマーのセットを用意した。これらプライマーの配列を表１上段にプライマー１Ｆ及びプライマー１Ｒとして示す。なお、特に指定のない場合には、本試験例記載のプライマーの溶媒は１×TE buffer である。

ウェブ上で利用可能な、また、ダウンロードすることにより利用可能な一般的な計算プログラムを用いて、プライマー１Ｆ及び１Ｒの配列中、ヘアピンループ、ホモダイマー、ヘテロダイマーの形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基を選出した。
これにより選出されたヌクレオチド残基を変異導入部位として選択し、表１に示すプライマーセット２及び３のプライマーを設計し、これを調製した。
また、プライマーセット２及び３における変異導入部位より３´末端側の配列からなるプライマーを用意した（プライマーセット４及び５、表１）。

表１に示すＦプイライマー及びＲプライマーのプライマーセットを用いて、表２に示す反応溶液を調製し、TRIAmp増幅法を行った。TRIAmp増幅反応はＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｄｉｃｅ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｔｅ ＴＰ７１０を使用して６８℃で２時間行い、ＦＡＭ検出モードにより反応を追跡した。その結果算出された増幅曲線とＣｔ値を図１７、１８及び表３にそれぞれ示す。なお、TRIAmp増幅反応はそれぞれのプライマーの組み合わせについて反応溶液を２セット調製し（以下、それぞれのサンプルをサンプル１及びサンプル２という）、それぞれについて増幅曲線とＣｔ値を算出した。

図１７、１８及び表３に示すように、極端にプライマー長が短いプライマーセット５以外のプライマーを用いた場合には、最終的な輝度には多少の差があるものの、その増幅速度はいずれも同程度であった。
これらの結果は、本発明の方法で変異が導入されたプライマーは、同プライマーの変異導入部位から５´末端側を単純に欠損させたプライマーとは機能が異なるということを示している。

＜試験例２＞
表１に示すＦプライマー及びＲプライマーのプライマーセットを用いて、表２に示す組成においてテンプレートＤＮＡを水に代えた反応溶液を調製し、試験例１と同様の条件でTRIAmp増幅反応を行い増幅曲線及びＣｔ値を算出した。結果を表４及び図１９、２０に示す。
なお、TRIAmp増幅反応はそれぞれのプライマーの組み合わせについて反応溶液を４セット調製し（以下、それぞれのサンプルを非特異的サンプル１〜４という）、それぞれについて増幅曲線とＣｔ値を算出した。

図１９、２０及び表４に示すように、テンプレートＤＮＡを含まない系での核酸増幅、すなわち非特異的増幅速度は、変異が導入されていないプライマーセット１を用いた場合と比較して、変異を導入したプライマーセット２、３を用いた場合の方が顕著に遅くなっていることがわかる。特にプライマーセット３を用いた場合には、４サンプル中３サンプルにおいて核酸の非特異的増幅が起こらなかった。
この結果は、プライマーへの変異の導入により、非特異的増幅が強く抑制されていることを示している。

プライマーセット４はプライマーセット２における変異導入部位より３´末端側の配列を有する。表４に示す通り、プライマーセット４を用いてTRIAmp増幅反応を行った場合、プライマーセット１を用いた場合に比べて非特異的増幅速度は遅くなっている。しかし、プライマーセット４よりも、プライマーセット２を用いたときの方が、非特異的増幅速度の抑制効果が強く表れている（表４）。
また、プライマーセット５はプライマーセット３における変異導入部位より３´末端側の配列を有するが、プライマー５を用いた場合では、反応溶液にテンプレートＤＮＡが含まれていたとしても、核酸増幅反応が起こらない。
これらの結果は、本発明の方法で変異が導入されたプライマーは、同プライマーの変異導入部位から５´末端側を単純に欠損させたプライマーとは機能が異なるということを示している。

プライマーセット１を用いてTRIAmp増幅反応を行った際に非特異的増幅が生じてしまう原因は、図２１及び２２に示すメカニズムによるものであると予想される。すなわち、Ｆプライマーが他のＦプライマーとプライマーダイマーを形成し（図２１上段）、ＤＮＡ合成反応が進むことで非特異的増幅産物であるＰ１が生じる（図２１下段）。次いで、変性し一本鎖になったＰ１がＲプライマーとダイマーを形成し（図２２上段）、ＤＮＡ合成反応が進むことで非特異的増幅産物であるＰ２が生じる（図２２下段）。そして、Ｐ２の３´末端の３ヌクレオチド（ＧＧＧ）と相補的な配列（ＣＣＣ）がＰ１やＰ２中に存在するため、次々と非特異的増幅が進行してしまう。

一方、プライマーセット２を用いた場合には、Ｆプライマーが他のＦプライマーとプライマーダイマーを形成し（図２３上段）、ＤＮＡ合成反応が進んだとしても、その伸長は鋳型となったＦプライマーの５´末端から３番目のヌクレオチド残基（Ｇ）で停止する（図２３下段）。そのため、この非特異的増幅により生じたＰ１´が、その３´末端でＲプライマーとダイマーを形成することが困難となり、非特異的増幅の連鎖は起こらない。仮にＰ１´とＲプライマーがダイマーを形成し（図２４上段）、ＤＮＡ合成反応が起こったとしても、その伸長は鋳型となったＲプライマーの５´末端から３番目のヌクレオチド残基（Ｃ）で停止するため（図２４下段）、この非特異的増幅によって生じたＰ２´がさらなる非特異的増幅の連鎖を生じる可能性は低い。

また、プライマーセット３のＦプライマーには、２つのＦプライマーによるプライマーダイマーの形成に寄与するヌクレオチド残基に変異が導入されているため、プライマーが形成されにくく、ＤＮＡ合成反応が非常に生じにくい（図２５上段）。仮に、ＤＮＡ合成反応が起こり、増幅産物であるＰ１´´が生じ（図２５下段）、これがＲプライマーとプライマーダイマーを形成しＤＮＡ合成反応が起こったとしても（図２６上段）、その反応はＲプライマーの変異導入部位で停止するため（図２６下段）、その増幅産物であるＰ２´´がさらなる非特異的増幅の連鎖を生じる可能性は低い。

以上の理由から、変異が導入されたプライマーからなるプライマーセット２及び３には、非特異的増幅反応速度の抑制効果があるものと考えられる。

＜試験例３＞
表５に示した配列中、ｍで表される位置にSpacer C3、dSpacer、Spacer 9、Abasic、又はPC Spacerから誘導される構造が導入されたＦプライマー及びＲプライマーのプライマーセットを用意した。

表５に示すＦプライマー及びＲプライマーのプライマーセット及び、表１に示すＦプライマー及びＲプライマーのプライマーセット１〜３を用いて、表２に示す組成において試験例１と同様の条件でTRIAmp増幅反応を行い増幅曲線及びＣｔ値を算出した。結果を表６及び図２７、２８に示す。
なお、プライマーセット３ Abasicの溶媒は０．２Ｍトリエチルアミン−酢酸溶液を滅菌水で１０μＭに希釈したものである。

表６及び図２７、２８に示すように、プライマーセット１〜３より多少増幅速度が遅いものの、Spacer C3、dSpacer、Spacer 9、Abasic、又はPC Spacerの何れの変異が導入されたプライマーセットを用いた場合であっても、問題なくＤＮＡの増幅を行うことができた。

＜試験例４＞
また、表５に示すＦプライマー及びＲプライマーのプライマーセット及び、表１に示すＦプライマー及びＲプライマーのプライマーセット１〜３を用いて、表２に示す組成においてテンプレートＤＮＡを水に代えた反応溶液を調製し、試験例１と同様の条件でTRIAmp増幅反応を行い増幅曲線及びＣｔ値を算出した。結果を表７及び図２９、３０に示す。
なお、TRIAmp増幅反応はそれぞれのプライマーの組み合わせについて反応溶液を４セット調製し（以下、それぞれのサンプルを非特異的サンプル１〜４という）、それぞれについて増幅曲線とＣｔ値を算出した。

図２７〜３０及び表６、７に示すように、テンプレートＤＮＡを含まない系での核酸増幅、すなわち非特異的増幅速度は、炭素鎖又はＰＥＧ鎖からなるスペーサー鎖、一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖、光分解性修飾のされたスペーサー鎖、の変異を導入したプライマーセットを用いた場合においても変異を導入していないプライマーセット１と比較して顕著に遅くなっていることがわかる。
この結果は、本発明の方法によるプライマーへの変異の導入により、非特異的増幅が強く抑制されていることを示している。

本発明は核酸増幅法における非特異的増幅の低減方法に応用することができる。

Claims (6)

1. 核酸増幅法に用いる、変異が導入されたプライマーの設計方法であって、
   鋳型ＤＮＡに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する基礎配列設計工程と、
   該基礎プライマー配列に含まれる１又は２以上のヌクレオチド残基であって、以下の（１）〜（４）からなるヌクレオチド残基群から選ばれる１又は２以上の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択する変異導入部位選択工程を備え、
   前記変異が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる変異群から選ばれる１種又は２種以上である、設計方法。
   ［ヌクレオチド残基群］
   （１）プライマーダイマーの形成に寄与すると予測されるヌクレオチド残基。
   （２）プライマー１分子内でのループ構造の形成に寄与すると予測されるヌクレオチド残基。
   （３）前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
   （４）前記基礎プライマー配列からなるプライマーが１分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
   ［変異群］
   （Ａ）前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の５´末端及び３´末端と、それぞれ５´末端及び３´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
   （Ｂ）炭素鎖又はＰＥＧ鎖からなるスペーサー鎖。
   （Ｃ）一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
   一般式１
   
   
   （一般式１中、ＲはＨ，または水酸基、ｎは自然数を示す。）
   （Ｄ）光分解性修飾のされたスペーサー鎖。
2. 核酸増幅法に用いる、変異が導入されたプライマーの設計方法であって、
   鋳型ＤＮＡに完全に相補的な塩基配列を基礎プライマー配列として設計する基礎配列設計工程と、
   該基礎プライマー配列に含まれる、プライマーダイマー又はループ構造の形成に寄与する可能性のあるヌクレオチド残基を予測する、予測工程と、
   前記予測工程の後に、該基礎プライマー配列に含まれる１又は２以上のヌクレオチド残基であって、以下の（１）〜（４）からなるヌクレオチド残基群から選ばれる１又は２以上の条件に合致するヌクレオチド残基を変異導入部位として選択する変異導入部位選択工程を備え、
   前記変異が、以下の（Ａ）〜（Ｄ）からなる変異群から選ばれる１種又は２種以上である、設計方法。
   ［ヌクレオチド残基群］
   （１）前記予測工程において、プライマーダイマーの形成に寄与すると予測されたヌクレオチド残基。
   （２）前記予測工程において、プライマー１分子内でのループ構造の形成に寄与すると予測されたヌクレオチド残基。
   （３）前記予測工程の結果、前記基礎プライマー配列からなるプライマーがプライマーダイマーを形成することが予測される場合において、プライマーが相補的又は非相補的にハイブリダイズする領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
   （４）前記予測工程の結果、前記基礎プライマー配列からなるプライマーが１分子内でループ構造を形成することが予測される場合において、ループ構造を構成する領域以外の領域に位置するヌクレオチド残基。
   ［変異群］
   （Ａ）前記変異導入部位の前後に位置するヌクレオチド残基の５´末端及び３´末端と、それぞれ５´末端及び３´末端を結合してなるヌクレオチド残基又はポリヌクレオチド。
   （Ｂ）炭素鎖又はＰＥＧ鎖からなるスペーサー鎖。
   （Ｃ）一般式１で表されるテトラヒドロフラン誘導体からなるスペーサー鎖。
   一般式１
   
   （一般式１中、ＲはＨ，または水酸基、ｎは自然数を示す。）
   （Ｄ）光分解性修飾のされたスペーサー鎖。
3. 請求項１又は２に記載の設計方法により設計されたプライマーを合成する工程を含む、変異プライマーの製造方法。
4. 請求項３に記載の製造方法により合成されたプライマーを用いることを特徴とする、核酸増幅法。
5. 等温増幅法であることを特徴とする請求項４に記載の核酸増幅法。
6. 請求項１又は２に記載の設計方法の各工程を手順としてコンピュータに実行させるためのプログラム。