JP7158552B2

JP7158552B2 - 抗Ｔｉｍ－３抗体及びその使用

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Publication number: JP7158552B2
Application number: JP2021175867A
Authority: JP
Inventors: トンジャン; リュウシュエ; チーリュウ; ハオポン; ミンウェイ; カンリー
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Filing date: 2021-10-27
Publication date: 2022-10-21
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Description

本明細書はＴ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（Ｔｉｍ－３）に特異的に結合する抗体を開示する。

Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（Ｔｉｍ－３、ＨＡＶＣＲ２、又はＣＤ３６６）は、３３ＫＤタイプのＩ膜貫通糖タンパク質であり、慢性ウイルス感染及び免疫監視からの腫瘍エスケープの両方におけるＴ細胞の消耗の増大において重要な役割を果たすＴ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン含有類に含まれるものである（Monney et al.、2002 Nature 415:536-541；Sanchez-Fueyo A, et al.、2003 Nat Immunol. 4: 1093-101; Sabatos CA, et al.、2003 Nat Immunol. 4: 1102-10；Anderson et al.、2006 Curr Opin Immunol. 18: 665-669）。Ｔｉｍ－３をコーディングする遺伝子及びｃＤＮＡはマウス及びヒトにおいてクローン化され、特徴付けがなされている（Monney et al.、2002 Nature 415: 536-541；McIntire et al.、2001 Nat. Immunol. 2: 1109-1116）。成熟したヒトのＴｉｍ－３は２８０のアミノ酸残基を含む（NCBI accession number: NP_116171.3）。それの細胞外ドメインはアミノ酸残基１～１８１から成り、膜貫通ドメイン及び細胞質Ｃ末端鎖は残基１８２～２８０を含む。免疫受容体チロシン系阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ（Immunoreceptor Tyrosine-Based Inhibitory Motif））及びチロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ（Immunoreceptor Tyrosine Switch Motif））等の、細胞質ドメインで見つかる既知の阻害性シグナル伝達モチーフ存在しない。

Ｔｉｍ－３は最初にＴｈ１細胞で特定された。その後の研究によって、Ｔ細胞に加えて、Ｔｉｍ－３もＮＫ細胞、マクロファージ、ＤＣ、及びマスト細胞等の他の種類の免疫細胞において発現されることが示された（Hastings et al.、2009 Eur J Immunol 39: 2492-2501；Anderson et al.、2007 Science 318: 1141-1143；Phong BL, et al.、2015 J Exp Med. pii: jem. 20150388）。Ｔｉｍ－３が他のヒト組織で発現することはほとんどない。Ｔ細胞では、Ｔｉｍ－３の発現はＴＣＲ／ＣＤ３活性化を介して明白に調節されている（Hastings et al.、2009 Eur J Immunol 39: 2492-2501）。さらに、（ＩＬ－２、ＩＬ－７、ＩＬ－１５及びＩＬ－２１等の）一般的なγ鎖サイトカインもまた、ＰＩ－３キナーゼに依存した様式でＴｉｍ－３発現を増加させる（Mujib S, et al.、2012 J Immunol. 188:3745-56）。多くの場合、腫瘍微小環境（ＴＭＥ（Tumor Microenvironment））においてＴ細胞は、ＰＤ－１、Ｌａｇ－３及びＴｉｇｉｔ等の他の「チェックポイント」の阻害性免疫受容体と同時発現する。（Fourcade J, et al.、2010 J Exp Med. 207:2175-86；Gros A, et al.、2014 J Clin Invest. 124: 2246-59）。

現在までに、２つの主要なＴｉｍ－３リガンド（Ｔｉｍ－３Ｌ）と考えられているガレクチン－９及びホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）を含む、複数のＴｉｍ－３リガンドが報告されている（Anderson AC、2012 Curr Opin Immunol. 24:213-6）。Ｔｉｍ－３ＬのＴｉｍ－３受容体への結合は、Ｔ細胞の活性化を阻害する細胞内シグナル伝達を誘発し、細胞増殖の減少、ＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌をもたらす（Dekruyff et al.、2010 J. Immunol. 184:1918-1930；Zhu et al.、2005 Nat. Immunol. 6: 1245-1252）。Ｔ細胞におけるＴｉｍ－３シグナル伝達の詳細なメカニズムは依然としてほとんどわかっていない。Ｔｉｍ－３がＴＣＲと相互作用すると、免疫学的シナプスのために取り入れられ、ＳｒｃキナーゼＬｃｋを隔離することにより、それのシグナル伝達、特にＮＦＡＴシグナル伝達経路を阻害することが複数の研究によって示されている（Tomkowicz B, et al.、2015 PLoS One 10: e0140694；Clayton KL, et al.、2014 J. Immunol. 192: 782-91）。

癌及びウイルス感染において、Ｔｉｍ－３シグナル伝達の活性化は免疫細胞機能不全を促進し、癌の成長又はウイルス感染の増大につながる。肺癌（Zhuang X, et al.、Am J Clin Pathol 2012 137: 978-985）、肝臓癌（Li H, et al.、Hepatology 2012 56: 1342-1351）、胃癌（Jiang et al.、PLoS One 2013 8: e81799）、腎臓癌（Komohara et al.、Cancer Immunol Res. 2015 3: 999-1000）、乳癌（Heon EK, et al.、2015 Biochem Biophys Res Commun. 464: 360-6）、結腸癌（Xu et al.、Oncotarget 2015）、メラニン細胞癌（Gros A, et al.、2014 J Clin Invest. 2014 124: 2246-2259）、及び子宮頸癌（Cao et al.、PLoS One 2013 8: e53834）等の多くの種類の癌において、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬｓ（Tumor-Infiltrating Lymphocytes））、マクロファージ、及び腫瘍細胞におけるＴｉｍ－３発現のアップレギュレーションが報告されている。これらの癌におけるＴｉｍ－３の発現の増加は患者の生存転帰に対する予後不良と関連付けられている。Ｔｉｍ－３シグナル伝達のアップレギュレーションは癌に対する免疫寛容においてだけでなく、慢性的なウイルス感染に対しても重要な役割を果たす。ＨＩＶ及びＨＣＶの感染中、Ｔ細胞のＴｉｍ－３の発現は健康な人と比較して著しく高く、ウイルスの量及び疾患の進行と明らかな関連がある（Jones RB, et al.、2008 J Exp Med. 205: 2763-79；Sakhdari A, et al.、2012 PLoS One 7: e40146；Golden-Mason L, et al.、2009 J Virol. 83: 9122-30；2012 Moorman JP, et al.、J Immunol. 189: 755-66）。さらに、Ｔｉｍ－３受容体を単独で、又はＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１遮断と組み合わせて遮断すると、生体外と生体内の両方において機能的に「消耗した」Ｔ細胞を救済することができる。（Dietze KK, et al.、2013 PLoS Pathog 9: e1003798；Golden-Mason L, et al.、2009 J Virol. 83: 9122-30）。したがって、治療薬によるＴｉｍ－３シグナル伝達の調節は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージ（Ｍφ）等の免疫細胞を寛容状態から救済し、腫瘍又は慢性的なウイルス感染を根絶するための効率的な免疫反応を誘発するだろう。

いくつかの抗体は細胞の表面上のそれの標的に結合すると内在化することができることが報告されている（Hurwitz E, et al.、1995、Proc Natl Acad Sci USA 92: 3353-7；Poul MA, et al.、2000、J Mol Biol. 301: 1149-61；Fischer E, et al.、2012、Clin Cancer Res. 18: 6208-18）。抗体により誘発された受容体のとり込みは、細胞表面上の受容体の下方調節及び受容体依存のシグナル伝達の阻害をもたらす（Liu L, et al.、2014、Clin Cancer Res. 20: 6059-70）。抗体の内在化は受容体の表面の発現を減少させるので、通常、持続的な内在化は受容体の抗体にとって望ましい。

したがって、Ｔｉｍ－３受容体に対して高い親和性及び特異性を有し、好ましくは、さらにＴｉｍ－３受容体の持続的な内在化をもたらす抗Ｔｉｍ－３抗体が必要である。

本明細書は高い親和性及び特異性でＴｉｍ－３に結合する抗体分子を開示する。詳細には、本明細書に開示された抗Ｔｉｍ－３抗体はＴｉｍ－３受容体の持続的又は耐久性のある内在化をもたらす。本明細書はまた、抗体分子をコーディングする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び抗体分子の作製方法を提供する。本明細書はまた、抗体分子を含む医薬組成物を提供する。本明細書に開示される抗Ｔｉｍ－３抗体分子は、免疫障害、癌、感染症、クローン病、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ（Systemic Inflammatory Response Syndrome））、及び糸球体腎炎等の、Ｔｉｍ－３によって媒介される細胞内シグナル伝達による免疫細胞の抑制に関連付けられる疾患を治療、予防、及び／又は診断するために、単独で、又は他の薬剤若しくは治療法と組み合わせて使用することができる。したがって、本明細書は、抗Ｔｉｍ－３抗体分子を使用して上記の多様な障害又は疾患を治療するための組成物及び方法を開示し、また、上記の多様な障害又は疾患を治療するための医薬品の製造における抗Ｔｉｍ－３抗体分子の使用を提供する。

特定の態様において、本開示は、配列ＩＤ番号３～８、又は２６～２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む、少なくとも１、２、３、４、５、又は６つの相補性決定領域（ＣＤＲ’ｓ（Complementarity Determining Regions））を含む、ヒトのＴｉｍ－３に結合することが可能な抗Ｔｉｍ－３抗体を提供する。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号３～５又は２６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ（heavy chain variable region））からの、少なくとも１、２又は３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号６～８又は２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ（light chain variable region））からの、少なくとも１、２又は３つのＣＤＲを含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号３～８、又は２６～２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む重鎖又は軽鎖可変領域からの、少なくとも１、２、３、４、５、又は６つのＣＤＲを含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号３～８、又は２６～２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む重鎖又は軽鎖可変領域からの６つのＣＤＲを含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号３、４、５、又は２６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体から選択される、１、２又は３つのＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は
（ｂ）配列ＩＤ番号６、７、８、又は２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体から選択される、１、２又は３つのＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号３又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号４又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号８又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｂ）配列ＩＤ番号３又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号２６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号８又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、
（ｃ）配列ＩＤ番号３又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号４又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｄ）配列ＩＤ番号３又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号２６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれの変異体のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号３のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号４のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号８のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）、又は
（ｂ）配列ＩＤ番号３のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号２６のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号２７のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はヒト化した抗体分子である。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はヒト化したモノクローナル抗体（ｍＡｂ（Monoclonal Antibody））分子である。

いくつかの実施形態において、抗体は、配列ＩＤ番号９、１７、２８又は４０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、配列ＩＤ番号９、１７又は２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、配列ＩＤ番号１１、１９、３０又は３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｂ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｃ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｄ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｅ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｆ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｇ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｈ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｉ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｊ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｋ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｌ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｍ）配列ＩＤ番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｎ）配列ＩＤ番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｏ）配列ＩＤ番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、又は
（ｐ）配列ＩＤ番号４０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｂ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｃ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｄ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｅ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｆ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｇ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｈ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｉ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｊ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、
（ｋ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域、又は
（ｌ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｄ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｅ）配列ＩＤ番号４０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｂ）配列ＩＤ番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号１９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
（ｃ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｄ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、配列ＩＤ番号１３、２２又は３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、配列ＩＤ番号１５、２４、３４又は３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｂ）配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｃ）配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｄ）配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｅ）配列ＩＤ番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｆ）配列ＩＤ番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｇ）配列ＩＤ番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｈ）配列ＩＤ番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｉ）配列ＩＤ番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号１５のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｊ）配列ＩＤ番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、
（ｋ）配列ＩＤ番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号３４のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖、又は
（ｌ）配列ＩＤ番号３２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖、及び配列ＩＤ番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号１３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｂ）配列ＩＤ番号２２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号２４のアミノ酸配列を含む軽鎖、
（ｃ）配列ＩＤ番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖、又は
（ｄ）配列ＩＤ番号３２のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列ＩＤ番号３８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号２４の位置１にアスパラギン酸からグルタミン酸への突然変異を有する軽鎖、
（ｂ）配列ＩＤ番号２４の位置４にロイシンからメチオニンへの突然変異を有する軽鎖、
（ｃ）配列ＩＤ番号２４の位置６２にバリンからイソロイシンへの突然変異を有する軽鎖、
（ｄ）配列ＩＤ番号２４の位置７４にアスパラギン酸からグルタミン酸への突然変異を有する軽鎖、
（ｅ）配列ＩＤ番号２４の位置９６にメチオニンからロイシンへの突然変異を有する軽鎖、
（ｆ）配列ＩＤ番号２２の位置５９にフェニルアラニンからチロシンへの突然変異を有する重鎖、
（ｇ）配列ＩＤ番号２２の位置６０にプロリンからバリンへの突然変異を有する重鎖、
（ｈ）配列ＩＤ番号２２の位置７７にセリンからスレオニンへの突然変異を有する重鎖、及び
（ｉ）配列ＩＤ番号２２の位置７８にシステインからロイシンへの突然変異を有する重鎖のうちの１つ以上を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）である。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はそれらの変異体のサブクラスの重鎖定常領域、及びカッパ若しくはラムダ又はそれらの変異体の軽鎖定常領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号２１のアミノ酸配列を含む変異型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、及びヒトカッパ軽鎖定常領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は単離型又は組換え型である。

特定の態様において、本開示は少なくとも本明細書に記載される抗体分子の少なくとも１つ、及び薬学的に許容可能な賦形剤を含む組成物、例えば、医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態において、医薬組成物は抗Ｔｉｍ－３抗体と１つ以上の他の薬剤、例えば治療薬又は他の抗体分子との組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は標識又は治療薬に結合される。

特定の態様において、本開示はまた、被験者の免疫反応を刺激する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の抗体（例えば、治療的に有効な量の抗Ｔｉｍ－３抗体分子）を単独で、又は１つ以上の薬剤又は処置と組み合わせて被験者に投与することを含む。

特定の態様において、本開示はまた、被験者の癌又は腫瘍を治療する（例えば、癌又は腫瘍の進行を減少させる、抑制する、又は遅らせる等のうちの１つ以上を行う）方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の抗体（例えば、治療的に有効な量の抗Ｔｉｍ－３抗体分子）を単独で、又は１つ以上の薬剤又は処置と組み合わせて被験者に投与することを含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は化学療法、標的療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫療法、サイトカイン、外科的処置、放射線処置、共刺激性分子の活性化剤、阻害性分子の阻害剤、ワクチン、又は細胞性免疫療法との組み合わせで投与される。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、Ｌａｇ－３、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、Ｔｉｇｉｔ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、又はＴＧＦＲから選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は（米国特許第８７３５５５３号に記載されており、Ｈｕ３１７－４Ｂ６、３１７－４Ｂ６／ＩｇＧ４ｍｔ１０と名付けられた）抗ＰＤ－１ｍＡｂ、３１７－４Ｂ６との組み合わせで投与される。

特定の実施形態において、癌は、肺癌、肝臓癌、胃癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、大腸癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌、頭頸部癌、又は癌の転移性病変を含むが、これらに限定されるものではない。

他の態様において、本開示は、単独で、又は１つ以上の薬剤若しくは処置と組み合わせて、本明細書に記載の抗Ｔｉｍ－３抗体の治療的に有効な量を被験者に投与することを含む、感染症を治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、感染症はＨＩＶ感染及びＨＣＶ感染から選択される慢性的なウイルス感染症である。

いくつかの態様において、本開示は、本明細書に記載の多様な障害又は疾患を治療するための薬剤の製造における抗Ｔｉｍ－３抗体分子の使用を提供する。

本明細書に記載の抗Ｔｉｍ－３抗体分子は、免疫細胞におけるＴｉｍ－３を媒介とした細胞のシグナル伝達を阻害し、免疫細胞を再活性化し、免疫を増強させることができる、効果器機能と物理化学的性質の特別な組を示す。そして、変更された重鎖定常領域を有する全長を有する（すなわち、省略されていない）ヒトＩｇＧ１の形式のｍＡｂは、効果器機能に関して特有の特徴の組を有する。抗Ｔｉｍ－３ｍＡｂもまた、ヒト抗体分子との非常に類似な様式でヒト化した。さらに、抗Ｔｉｍ－３抗体は抗ＰＤ－１抗体と相乗作用し、生体内でＴ細胞を活性化し、腫瘍増殖を減少させることができる。それによって、本明細書に開示される抗Ｔｉｍ－３抗体は、免疫寛容又は「消耗」と機械的に関連付けられる癌、ウイルス感染、及び他のヒトの疾患の治療において治療的有用性を有するだろう。

Ｔｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａ（上段）及びＴｉｍ－３－ｈｕＩｇＧ１（下段）の概略図を示し、ここでＬはリンカーであり、ＮはＮ末端であり、ＣはＣ末端である。抗Ｔｉｍ－３抗体の系統樹を示している。抗Ｔｉｍ－３抗体の系統樹を示している。図２Ａは抗Ｔｉｍ－３抗体重鎖可変（Ｖｈ）領域の系統樹を示し、図２Ｂは抗Ｔｉｍ－３抗体軽鎖可変（Ｖｌ）領域の系統樹を示している。ＤＮＡＳＴＡＲのＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアを使用して、合計で２３個のＴｉｍ－３のＶｈ及び２０個のＶκ配列を整列させた。系統樹に、配列の相同性が示された。ＥＬＩＳＡにおけるｈｕ４２５－２Ｅ－１及びｈｕ４２５－２Ｆ－１のＴｉｍ－３結合親和性とｈｕ４２５－１－１の結合親和性との比較を示している。ＥＬＩＳＡにおけるｍＡｂ１Ｇ５及びＡｂ２０００のＴｉｍ－３結合親和性及びｈｕ４２５－２－３ｂの結合親和性示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂによるＴｉｍ－３媒介食作用の抑制を示している。一次ヒトＰＢＭＣにおける、ｃｈ４２５及びｈｕ４２５－１－１を含む抗Ｔｉｍ－３抗体によるＩＦＮ－γ分泌の活性化を示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂによるＣＭＶに特異的なヒトＴ細胞の活性化を示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂがＮＫ細胞を媒介とした細胞傷害性を促進することを示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂがＮＫ細胞を媒介とした細胞傷害性を促進することを示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂがＴｉｍ－３受容体の表面の発現を低下させることを示している。抗Ｔｉｍ－３抗体のＴｉｍ－３受容体（ｈｕ４２５－２－３ｂ、Ａｂ１及びＡｂ２）の内在化を示している。単独で、又は抗ＰＤ－１抗体ｈｕ３１７－４Ｂ６との組み合わせで、抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂがＭＬＲにおけるＩＦＮ－γ分泌を増強することを示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂがＡＤＣＣ（Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity）（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（Complement Dependent Cytotoxicity）（相補依存性細胞傷害）を誘発しなかったことを示している。抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂがＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘発しなかったことを示している。ヒトＡ４３１同種異系異種移植片モデルにおける抗Ｔｉｍ－３抗体ｃｈ４２５、抗ＰＤ－１抗体ｈｕ３１７－４Ｂ６、及びそれらの組み合わせの抗腫瘍効果を示している。

例としての保存的アミノ酸置換

本明細書の他の箇所で具体的に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。

文脈的に明確に指定しない限り、添付の特許請求の範囲を含む本明細書で使用される「１つ」及び「その」等の単語の単数形は、それらの対応する複数のものも含む。

文脈的に明確に指定しない限り、用語「又は」は用語「及び／又は」を意味するために使用され、それと互換的に使用される。

文脈的に明確に指定しない限り、本明細書及びそれに続く特許請求の範囲を通して、用語「含む（comprise）」並びに「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」などの変形は記載のアミノ酸配列、ＤＮＡ配列、工程、又はそれの群の包含を意味するものであり、他のアミノ酸配列、ＤＮＡ配列、工程を排除するものではない。本明細書において、用語「含む（comprising）」は用語「含む（containing）」、「含む（including）」又は「有する（having）」で置き換えることができる。

用語「Ｔｉｍ－３」は多様な哺乳類のアイソフォーム、例えば、ヒトＴｉｍ－３、ヒトＴｉｍ－３の種相同体、及びＴｉｍ－３内の少なくとも１つのエピトープを含む類似体を含む。そして、ヒトＴｉｍ－３等のＴｉｍ－３のアミノ酸配列、及びそれをコーディングするヌクレオチド配列は当技術分野において公知である。

本明細書における「投与」、「投与する」、「治療する」及び「治療」という用語が動物、ヒト、実験の被験者、細胞、組織、器官、又は生物学的流体に適用される場合、それらは外因性薬剤、治療薬、診断薬、又は成分の動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官、又は生物学的流体への接触を意味する。細胞の処理は試薬と細胞との接触、及び流体が細胞と接触している状態での試薬と該流体との接触を含む。「投与」及び「治療」という用語はまた、例えば、試薬、診断、結合化合物、又は他の細胞による生体内及び生体外治療を意味する。本明細書における「被験者」という用語は全ての生物、好ましくは動物、より好ましくは哺乳類（例えば、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ）、最も好ましくはヒトを含む。

抗体又は抗体分子
本明細書は高い親和性及び特異性でＴｉｍ－３に結合する抗体分子を開示する。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、配列ＩＤ番号３～８、又は２６～２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む、少なくとも１、２、３、４、５、又は６つの相補性決定領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号３～５又は２６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）からの、少なくとも１、２又は３つのＣＤＲを含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号６～８又は２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）からの、少なくとも１、２又は３つのＣＤＲを含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、
（ａ）配列ＩＤ番号３、４、５、又は２６又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体から選択される、１、２又は３つのＣＤＲアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は
（ｂ）配列ＩＤ番号６、７、８、又は２７又は１つ以上の保存的な置換を含むそれらの変異体から選択される、１、２又は３つのＣＤＲアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はヒト化したモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスの変異型重鎖定常領域を含み、該変異型重鎖定常領域は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ（Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity））又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ（Complement-Dependent Cytotoxicity））等の効果器機能の減少又は排除をもたらす。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域又はその変異体を含む。より好ましい実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体はＥ_２３３Ｐ、Ｌ_２３４Ａ、Ｌ_２３５Ａ、Ｌ_２３６Ａ及びＰ_３２９Ａからなる群より選択される１つ以上の突然変異を含むヒトＩｇＧ１の変異型重鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は配列ＩＤ番号２１のアミノ酸配列を含む変異型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域、及びヒトカッパ軽鎖定常領域を含む。

いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は少なくとも１つの抗原結合部位、又は少なくとも可変領域を含む。いくつかの実施形態において、抗Ｔｉｍ－３抗体は本明細書に記載の抗体からの抗原結合フラグメントを含む。

本明細書において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、具体的には、（全長を有するモノクローナル抗体を含む）抗体、及びＴｉｍ－３、ＰＤ－１等の、抗原を認識する抗体フラグメントを含む。抗体は通常、単一特異的であるが、特異的、異種特異的、又は多重特異的として記載されてもよい。抗体分子は特異的結合部位によって、特異的抗原決定基又は抗原のエピトープに結合する。

本明細書において、用語「モノクローナル抗体」又は「ｍＡｂ」又は「Ｍａｂ」は、実質的に同種の抗体の集団を意味する。すなわち、それに含まれる抗体分子が、それに少量存在する自然に生じる可能な突然変異を除いて、アミノ酸配列において同一である集団を意味する。一方、従来の（ポリクローナル）抗体調製物は通常、それらの可変領域、特にそれらの相補性決定領域（ＣＤＲ）に異なるアミノ酸配列を有する多数の異なる抗体を含み、多くの場合、それらは異なるエピトープに対して特異的である。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に同種の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は当業者に周知の方法によって取得することができる。例えば、Kohler G et al.、Nature 1975 256: 495-497；米国特許第４３７６１１０号；Ausubel FM et al.、CURRENT ROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 1992；Harlow E et al.、ANTIBODIES: A LABORATORY ANUAL、Cold spring Harbor Laboratory 1988；及び Colligan JE et al.、CURRENT PROTOCOLS N IMMUNOLOGY 1993を参照。本明細書に開示されたｍＡｂはＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、及びそれらの任意サブクラスを含む、任意の免疫グロブリンクラスのものであってもよい。ｍＡｂを製造するハイブリドーマは生体内で培養されてもよいし、生体外で培養されてもよい。高い力価を有するｍＡｂを以下の方法で、生体内製造で取得することができる。すなわち、個々のハイブリドーマからの細胞をプリスティンプライム化Ｂａｌｂ／ｃマウス等の、マウスに腹腔内注射し、高濃度で所望のｍＡｂを含む腹水液を製造することができる。アイソタイプＩｇＭ又はＩｇＧのＭＡｂは、当業者に周知のコラムクロマトグラフィー法を使用して、上記の腹水液又は培養物の上清から精製されてもよい。

一般に、基本的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体はポリペプチド鎖の２つの同一の組を含み、各組は１つの「軽鎖」（約２５ｋＤａ）及び１つの「重鎖」（約５０～７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部は抗原認識に本質的に関与する約１００～１１０以上のアミノ酸の可変領域を含む。重鎖のカルボキシ末端部は、効果器機能に本質的に関与する定常領域を規定してもよい。通常、ヒト軽鎖はカッパ及びラムダ軽鎖として分類される。さらに、ヒト重鎖は、一般に、α、δ、ε、γ又はμとして分類され、それぞれ、抗体のアイソタイプをＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭとして規定する。軽鎖及び重鎖内で、可変領域及び定常領域は、約１２以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖はさらに、約１０以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む。

各重鎖／軽鎖（ＶＬ／ＶＨ）の組の可変領域は抗体結合部位を形成する。したがって、一般に、完全な状態の抗体は２つの結合部位を有する。二官能性又は二重特異性抗体を除くと、上記の２つの結合部位は通常、同一である。

通常、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ（framework regions））の間に配置されている、「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とも呼ばれる３つの超可変領域を含む。ＣＤＲは通常、フレームワーク領域によって整列され、特定のエピトープへの結合を可能にする。一般に、軽鎖及び重鎖の両方の可変領域は、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＦＲ－１（又はＦＲ１）、ＣＤＲ－１（又はＣＤＲ１）、ＦＲ－２（ＦＲ２）、ＣＤＲ－２（ＣＤＲ２）、ＦＲ－３（又はＦＲ３）、ＣＤＲ－３（ＣＤＲ３）、及びＦＲ－４（又はＦＲ４）を含む。一般に、各ドメインへのアミノ酸の割り当ては「Sequences of Proteins of Immunological Interest」Kabat, et al.、National Institutes of Health、Bethesda、Md.; 5<m>ed.; NIH Publ. No. 91-3242 (1991); Kabat (1978) Adv. Prot. Chem. 32: 1-75; Kabat, et al.、(1977) J. Biol. Chem. 252: 6609-6616; Chothia、et al、(1987) J Mol. Biol. 196: 901-917 or Chothia、et al、(1989) Nature 342: 878-883の定義に従っている。

用語「超可変領域」は抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変領域中のＶＬ－ＣＤＲ１、ＶＬ－ＣＤＲ２及びＶＬ－ＣＤＲ３、並びに重鎖可変領域中のＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２及びＶＨ－ＣＤＲ３）からのアミノ酸残基を含む。Kabat et al. (1991)「Sequences of Proteins of Immunological Interest」5th Ed. Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.（抗体のＣＤＲ領域を配列により規定）を参照。また、Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917（抗体のＣＤＲ領域を構造により規定）を参照。本明細書において、用語「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書でＣＤＲ残基として規定される超可変領域残基以外の可変領域残基を意味する。

特に明示されない限り、「抗体フラグメント」又は「抗原結合フラグメント」は抗体の抗原結合フラグメントを意味する。すなわち、全長を有する抗体によって結合される抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体フラグメント、例えば１つ以上のＣＤＲ領域を保持するフラグメントを意味する。抗原結合フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖフラグメント；二特異性抗体；線形抗体；単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）等の単鎖抗体分子；抗体フラグメントから形成された単一ドメイン抗体及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

特異性を有する特定の標的タンパク質に結合する抗体はまた、特定の標的タンパク質に特異的に結合するとも記載される。これは、抗体が他のタンパク質に比べ該標的へ優先的に結合を示すことを意味するが、この特異性は絶対的な結合特異性を必要とするものではない。例えば偽陽性等の望ましくない結果を生じることなく、抗体の結合がサンプル中の標的タンパク質の存在を決定する場合、該抗体はその意図した標的に対して「特異的」であると見なされる。本発明において有用な抗体又はそれの結合フラグメントは、非標的タンパク質の親和性の少なくとも２倍以上、好ましくは少なくとも１０倍以上、より好ましくは少なくとも２０倍以上、最も好ましくは少なくとも１００倍以上の親和性で標的タンパク質に結合する。本明細書において、抗体が成熟ヒトＴｉｍ－３分子のアミノ酸配列等の、任意のアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合し、その配列を欠くタンパク質に結合しない場合、該抗体は該配列を含むポリペプチドに特異的に結合すると記載される。

本明細書において、用語「ヒト抗体」はヒト免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。ヒト抗体がマウス、マウス細胞、又はマウス細胞に由来するハイブリドーマで製造された場合、該ヒト抗体はマウス糖鎖を含む可能性がある。同様に、「マウス抗体」又は「ラット抗体」は、それぞれマウス又はラットの免疫グロブリンタンパク質配列のみを含む抗体を意味する。

用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体に加え、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）からの配列を含む抗体の形態を意味する。そのような抗体は非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含む。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変領域の実質的に全てを含み、超可変ループの全て又は実質的に全ては非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てはヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むだろう。ヒト化抗体を親のげっ歯類の抗体と区別するために必要である場合、抗体クローンの名称に接頭後「ｈｕｍ」、「ｈｕ」、「Ｈｕ」又は「ｈ」を加える。一般に、げっ歯類の抗体のヒト化された形態は親のげっ歯類の抗体と同一のＣＤＲ配列を含むが、親和性を高めるため、ヒト化抗体の安定性を高めるため、又は他の理由のために特定のアミノ酸置換を含んでもよい。

本明細書において、用語「癌」又は「腫瘍」は、通常、無秩序な細胞増殖によって特徴付けられる哺乳類における生理学的状態を意味又は表現する。癌の例としては、（小細胞肺癌又は非小細胞肺癌を含む）肺癌、副腎癌、肝臓癌、胃癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、大腸癌、白血病、膀胱癌、骨肉腫、脳腫瘍、子宮内膜癌、頭頸部癌、リンパ腫、卵巣癌、皮膚癌、甲状腺腫瘍、又は癌の転移性病変が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

用語「ＣＤＲ」は、特に明示されない限り、Ｋａｂａｔの番号付システムを使用して規定された、免疫グロブリン可変領域における相補性決定領域を意味する。

医薬組成物及び用具（キット）
いくつかの態様において、本開示は組成物、例えば、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と共に調剤される、本明細書に記載の抗Ｔｉｍ－３抗体を含む薬学的に許容可能な組成物を提供する。本明細書において、用語「薬学的に許容可能な賦形剤」は生理学的に適合性のある全ての溶媒、分散媒、等張及び吸収遅延剤等を含む。賦形剤は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与、又は（注射又は注入等による）経皮投与に適している。

本明細書の組成物は多様な形態を有してもよい。これらの形態は、例えば、（注射可能溶液や注入用溶液等の）液体溶液、分散液又は懸濁液、リポソーム、及び坐剤等の、液体、半固体、及び固体剤の形態を含む。適切な形態は意図した投与の様式及び治療用途によって異なる。典型的な適切な組成物は注射可能溶液又は注入用溶液の形態である。１つの適切な投与様式は非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。いくつかの実施形態において、抗体は静脈内注入又は注射によって投与される。特定の実施形態において、抗体は筋肉内注射又は皮下注射によって投与される。

本明細書において、用語「治療的に有効な量」は、疾病又は疾患若しくは障害の臨床症状の少なくとも１つを治療するために被験者に投与する場合に、そのような疾患、障害、又は症状に対する治療を行うのに十分である抗体の量を意味する。「治療的に有効な量」は、抗体、疾患、障害、及び／又は疾患若しくは障害の症状、疾患、障害、及び／又は疾患若しくは障害の症状の重症度、治療を受ける被験者の年齢、及び／又は治療を受ける被験者の体重によって変えられてもよい。任意の例における適切な量は当業者に明白であるか、又はありきたりの実験によって決定されてもよい。併用療法の場合、「治療的に有効な量」は疾患、障害、又は状態の効果的な治療のための目的の組み合わせに対する総量を意味する。

「被験者」は霊長類等の哺乳類、好ましくはヒト等のより高等な霊長類（例えば、本明細書に記載の疾患を有する、又は疾患を有する可能性のある患者）である。

実施例１抗Ｔｉｍ－３モノクローナル抗体の作製
従来のハイブリドーマ技術（ｄe StGroth and Sheidegger、1980、J Immunol Methods 35: 1；Mechetner、2007、Methods Mol Biol 378: 1）に基づいて、複数のマウス抗Ｔｉｍ－３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を作製した。さらなる特徴付けのために、酵素結合免疫吸着分析（ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay））及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ（Fluorescence-Activated Cell Sorting））分析において高い結合活性を有するｍＡｂを選択した。

免疫化及び結合分析のためのＴｉｍ－３組換え型タンパク質
全長を有するヒトＴｉｍ－３をコーディングするｃＤＮＡ（配列ＩＤ番号１）をＧｅｎＢａｎｋ配列（受入れ番号：ＡＦ４５０２４２．１）に基づいて合成した。Ｔｉｍ－３（配列ＩＤ番号２）のアミノ酸（ＡＡ）１～２０２から成る細胞外ドメイン（ＥＣＤ（Extracellular Domain））のコーディング領域をＰＣＲ増幅し、それぞれ２つの組換え型融合タンパク質発現プラスミドＴｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａ及びＴｉｍ－３－ｈｕＩｇＧ１となる、マウスＩｇＧ２ａ（ＧｅｎＢａｎｋ受入れ番号：ＣＡＣ２０７０２）のＦｃ領域又はヒトＩｇＧ１重鎖（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受入れ番号：Ｐ０１８５７）のＦｃ領域のいずれかにＣ末端が融合した状態の、ｐｃＤＮＡ３．１ベースの発現ベクター（Invitrogen、Carlsbad、CA、USA）にクローン化した。図１はＴｉｍ－３融合タンパク質の概略図を示している。組換え型融合タンパク質の製造のために、Ｔｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａ及びＴｉｍ－３－ｈｕＩｇＧ１プラスミドをＨＥＫ２９３ベースの（自作の）哺乳類細胞発現系に一時的にトランスフェクションし、回転式震盪器を備えたＣＯ_２培養器で５～７日間培養した。組換え型タンパク質を含む上清を回収し、遠心分離により清澄化した。Ｔｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａ及びＴｉｍ－３－ｈｕＩｇＧ１は、Protein G Sepharose Fast Flowコラム（Cat. No.: 17061805, GE Life Sciences）を用いて精製した。Ｔｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａ及びＴｉｍ－３－ｈｕＩｇＧ１タンパク質の両方をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline））で透析し、少な目のアリコートを－８０℃の冷凍庫に保存した。

安定した発現細胞株
全長を有するヒトＴｉｍ－３（ｈｕＴｉｍ－３）又はサルＴｉｍ－３（ｍｋＴｉｍ－３、ZYAGEから入手可能な遺伝子、Cat. No.: KD-702）を発現する安定な細胞株を確立するために、Ｔｉｍ－３遺伝子をレトロウイルスベクターｐＦＢ－Ｎｅｏ（Cat. No.: 217561, Agilent, USA）にクローン化した。従来のプロトコル（Zhang T, et al.、2005、Blood 106: 1544-51）に従って、デュアルトロピックレトロウイルスベクターを作製した。ｈｕＴｉｍ－３及びｍｋＴｉｍ－３を含むベクターをそれぞれ、ＨｕＴ７８及びＮＫ９２ＭＩ細胞（ATCC、Manassas、VA、USA)に形質導入し、細胞株ＨｕＴ７８／ｈｕＴｉｍ－３及びＮＫ９２ＭＩ／ｍｋＴｉｍ－３を作製した。Ｇ４１８を含む１０％ＦＢＳを含む完全なＲＰＭＩ１６４０培地での培養及びＦＡＣＳ結合分析により高発現細胞株を選択した。

免疫化、ハイブリドーマ融合、及びクローニング
８～１２週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（HFK BIOSCIENCE CO.、LTD、Beijing、China）を１０μｇのＴｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａ及び水溶性佐剤（Cat. No.: KX0210041、KangBiQuan、Beijing、China）を含む、１００μｌの抗原溶液で腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫処置した。３週間後に、上述の処置を繰り返した。２回目の免疫処置の２週間後、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳによってマウス血清のＴｉｍ－３結合を評価した。血清スクリーニングの１０日後に、最大の抗Ｔｉｍ－３抗体血清力価を有するマウスを５０μｇのＴｉｍ－３－ｍＩｇＧ２ａで腹腔内追加免疫処置した。追加免疫処置の３日後、脾細胞を単離し、標準的な技術（Colligan JE, et al.、CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY、1993）を用いてマウス骨髄腫細胞株、ＳＰ２／０細胞（ＡＴＣＣ）に融合させた。

ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳによる抗体のＴｉｍ－３結合活性の評価
ハイブリドーマクローンの上清を、最初に、改良を加えた、「Methods in Molecular Biology (2007) 378: 33-52」に記載されたＥＬＩＳＡによって選別した。簡単に言うと、Ｔｉｍ－３－ｈｕＩｇＧ１タンパク質を９６ウェルプレートに塗布した。進展のためにＨＲＰ結合抗マウスＩｇＧ抗体（Cat. No.: 7076S、Cell Signaling Technology、USA）と基板（Cat. No.: 00-4201-56、eBioscience、USA)を使用し、プレート読取り装置（SpectraMax Paradigm、Molecular Devices、USA）を用いて４５０ｎｍの波長の吸光度信号を測定した。ＥＬＩＳＡが陽性のクローンを、ＦＡＣＳにより、上記のＨｕＴ７８／ｈｕＴｉｍ－３又はＮＫ９２ｍｉ／ｍｋＴｉｍ－３細胞のいずれかを用いてさらに検証した。Ｔｉｍ－３発現細胞（１０^５細胞／ウェル）をＥＬＩＳＡ陽性ハイブリドーマ上清と共に培養し、その後にＡｌｅｘａＦｌｕｒｏ－６４７で標識付けされたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Cat. No.:A0473、Beyotime Biotechnology、China）と結合させた。フローサイトメーター（Guava easyCyte 8HT、Merck-Millipore、USA）を用いて細胞の蛍光を定量した。

ヒト免疫細胞ベースの分析において良好な機能的活性を有する抗体を同定するために、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ選別の両方で陽性シグナルを示したハイブリドーマからの馴化培地に対して機能性分析を実施した（以下を参照）。所望の機能的活性を有する抗体をさらにサブクローン化し、特徴付けを行った。

無血清又は低血清培地へのハイブリドーマのサブクローニング及び適合
ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、及び（実施例７及び８に記載されている）機能性分析によって選別した後、陽性のハイブリドーマクローンを限界希釈法によりサブクローン化した。機能性分析によって確認された最良の抗体サブクローンを、３％ＦＢＳを含むＣＤＭ４ＭＡｂ培地（Cat. No.: SH30801.02、Hyclone、USA）での増殖に適合させた。

モノクローナル抗体の発現及び精製
ハイブリドーマ細胞をＣＤＭ４ＭＡｂ培地（Cat. No.: SH30801.02、Hyclone）で培養し、３７℃で５～７日間、ＣＯ_２培養器で培養した。馴化培地を遠心分離によって回収し、精製の前に０．２２μｍの膜を通過させることによって濾過した。マウス抗体含有上清を、製造元の説明書に従って、ＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Cat. No.: 17127901、GE Life Sciences）に適用及び結合させた。上述の処置により、通常、９０％を超える純度の抗体を産出した。凝集物を除去するために、ＰｒｏｔｅｉｎＡ親和性精製抗体をＰＢＳで透析するか、又はＨｉＬｏａｄ１６／６０Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラム（Cat. No.: 17531801、GE Life Sciences）を用いてさらに精製した。タンパク質の濃度は、２８０ｎｍで吸光度を測定することによって決定した。最終的な抗体調製物をアリコートに分けて－８０℃の冷凍庫で保存した。

実施例２Ｔｉｍ－３抗体のクローニング及び配列分析
製造元の説明書に基づいて、ＵｌｔｒａｐｕｒｅＲＮＡキット（Cat. No.: 74104、QIAGEN、Germany）を用いて全ＲＮＡを調製するためにマウスハイブリドーマ細胞を回収した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｃＤＮＡ合成キット（Cat. No.: 18080-051）を用いて、第１鎖ｃＤＮＡを合成し、ＰＣＲキット（Cat. No.: CW0686、CWBio、Beijing, China）を用いてマウスｍＡｂのＶｈ及びＶｋ遺伝子のＰＣＲ増幅を実施した。過去に報告された配列（Brocks et al.、2001 Mol Med 7: 461）に基づいて、重鎖可変領域（Ｖｈ）及びカッパ軽鎖可変領域（Ｖｋ）の抗体ｃＤＮＡクローニングに使用するためのオリゴプライマーを合成した。そして、ＰＣＲ産物をｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔクローニングベクター（Cat. No.: CB101-02、TransGen、China）にサブクローニングし、配列決定した。Ｖｈ及びＶｋ領域のアミノ酸配列はＤＮＡ配列の結果から推定した。

配列同一性を比較することによってマウスｍＡｂを分析し、配列類似性に基づいて分類した（図２）。カバット（WuとKabat、1970、J. Exp. Med. 132: 211-250）及びＩＭＧＴ（Lefranc、1999、Nucleic Acids Research 27: 209-212）システムに基づいて、配列の注釈及びインターネットベースの配列分析（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html）により、相補的決定基領域（ＣＤＲ）を規定した。表１に、代表的な最良のクローンｍｕ４２５（Ｖｈ及びＶＫ）のアミノ酸配列を列挙する（配列ＩＤ番号９及び１１）。表２に、ｍｕ４２５のＣＤＲ配列を列挙する（配列ＩＤ番号３～８）。

表１ｍｕ４２５のＶＨ及びＶＫ領域のアミノ酸配列

表２ｍｕ４２５のＶＨ及びＶＫ領域のＣＤＲ配列（アミノ酸）

実施例３ＳＰＲによる精製されたマウス抗Ｔｉｍ－３抗体の親和性の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭＴ－２００（GE Life Sciences）を用いて、ＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳにおいて高い結合活性を有するＴｉｍ－３抗体、並びに（実施例７及び８に記載されている）細胞ベースの分析における有力な機能性活性を有するＴｉｍ－３抗体をＳＰＲ分析により、それらの結合の反応速度論について特徴付けた。簡単に言うと、抗ヒトＩｇＧ抗体を活性化ＣＭ５バイオセンサーチップ（Cat. No.: BR100530、GE Life Sciences）に固定化した。ヒトＦｃでタグ付けされたＴｉｍ－３ＩｇＶドメインをチップ表面上に流し、抗ヒトＩｇＧ抗体によって捕捉した。そして、精製されたマウス抗体の段階希釈溶液（０．３６ｎＭ～９０ｎＭ）をチップ表面上に流し、一対一ラングミュア（Langmuir）結合モデル（BIA Evaluation Software、GE Life Sciences）を使用して会合速度（Ｋ_ｏｎ）と解離速度（Ｋ_ｏｆｆ）を計算するために表面プラズモン共振信号の変化を分析した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を比Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎとして計算した。表３に、ｍｕ４２５、ｍｕ４４、ｍｕ２２５、及びｍｕ４１１を含む最良のｍＡｂの結合親和性の特性を示す。

表３ＳＰＲによるハイブリドーマ抗体結合親和性の比較

実施例４マウス抗ヒトＴｉｍ－３ｍＡｂ、ｍｕ４２５のヒト化
ｍＡｂのヒト化及び工学的操作
ｍｕ４２５のヒト化のために、ＩＭＧＴのウェッブサイト（http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/index.html）及びＮＣＢＩのウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）のヒト免疫グロブリン遺伝子データベースをブラストすることによって、ｍｕ４２５可変領域のｃＤＮＡ配列との高い相同性を共有する配列を探すためにヒト生殖系列のＩｇＧ遺伝子を調べた。高頻度でヒト抗体レパートリに存在し（Glanville, 2009, PNAS 106: 20216-20221）、ｍｕ４２５と高い相同性を有するヒトＩＧＶＨ及びＩＧＶＫ遺伝子をヒト化のための鋳型として選択した。ヒト化の前に、ｍｕ４２５の重鎖及び軽鎖の可変領域を、ヒトＩｇＧ１ｍｆ（配列ＩＤ番号２１）と名付けられた変更されたヒトＩｇＧ１定常領域及びヒカッパ定常領域に、それぞれ融合した。ＩｇＧ１ｍｆ（配列ＩＤ番号２１）は、野生型ヒトＩｇＧ１と比較して、突然変異Ｅ_２３３Ｐ、Ｌ_２３４Ａ、Ｌ_２３５Ａ、Ｌ_２３６Ａ及びＰ_３２９Ａ（アミノ酸の番号付けはＥＵシステムに基づく）の組み合わせを含むＩｇＧ１突然変異体である。

ヒト化をＣＤＲグラフティング（Methods in Molecular Biology、Vol 248: Antibody Engineering、Methods and Protocols、Humana Press）により実施し、ヒト化抗体（ｈｕ４２５ｓ）をヒトＩｇＧ１フォーマットで工学的操作した。ヒト化の最初の回では、フレームワーク領域のマウスからヒトアミノ酸残基への突然変異を疑似３Ｄ構造によって誘導し、ＣＤＲの極限構造を維持するために構造的に重要なマウスフレームワーク残基はヒト化抗体４２５、ｈｕ４２５－１－１の第１バージョンにおいて保持された（重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号２２及び２４に設定）。詳細には、ｍｕ４２５のＶｋのＣＤＲを、４つのマウスフレームワーク残基（Ｄ１、Ｌ４、Ｖ６２及びＤ７４）を保持した状態で、ヒト生殖系列可変遺伝子ＩＧＶＫ３－１５のフレームワークにグラフティングした（軽鎖可変領域のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号１９に設定）。ｍｕ４２５のＶｈのＣＤＲを、１つのマウスフレームワーク（Ｃ_７８）残基を保持した状態で、ヒト生殖系列可変遺伝子ＩＧＶＨ３－７のフレームワークにグラフティングした（重鎖可変領域のアミノ酸配列を配列ＩＤ番号１７に設定）。

適合が容易なサブクローニング部位を有する、ＩｇＧ１ｍｆ（配列ＩＤ番号２１）と名付けられたヒトＩｇＧ１変異体及びカッパ鎖の定常領域をそれぞれ含む、自作の発現ベクターを用いて、全長を有するヒト抗体のフォーマットとしてＨｕ４２５－１－１を構築した。２９３Ｇ細胞への上記２つの構築物の共トランスフェクション及びＰｒｏｔｅｉｎＡカラム（Cat. No.: 17543802、GE Life Sciences）を用いた精製によって、ｈｕ４２５－１－１抗体の発現及び調製を成し遂げた。精製された抗体をＰＢＳ中で０．５～５ｍｇ／ｍＬに濃縮し、アリコートに分けて－８０℃の冷凍庫で保存した。

ｈｕ４２５－１－１の鋳型に基づき、Ｖｋのフレームワーク領域の残留マウス残基を、ＶｋにＤ１Ｅ、Ｌ４Ｍ、Ｖ６２Ｉ及びＤ７４Ｅを含む、対応するヒト生殖系列残基に変換する、複数の単一突然変異体を作製した。得られたｈｕ４２５－１－２ａ（Ｄ１Ｅ）、ｈｕ４２５－１－２ｂ（Ｌ４Ｍ）、ｈｕ４２５－１－２ｃ（Ｖ６２Ｉ）及びｈｕ４２５－１－２ｄ（Ｄ７４Ｅ）は全て、ｈｕ４２５－１－１と同様の結合活性及び機能性活性を有した。重鎖のヒト化のレベルをさらに改善するために、残留残基Ｃ７８及びＨ－ＣＤＲ２のＣ末端部（Ｋａｂａｔの定義）をマウス配列から対応するヒト生殖系列残基に変更した。３つのヒト化抗体の詳細は、ｈｕ４２５－２Ａ－１（ＶｈのＦ５９Ｙ）、ｈｕ４２５－２Ｂ－１（ＶｈのＰ６０Ｖ）及びｈｕ４２５－２Ｃ－１（ＶｈのＣ７８Ｌ）であった。ヒト化した突然変異は全て、特定の位置に突然変異を含むプライマー及び部位指定突然変異誘発キット（Cat. No. FM111-02、TransGen、Beijing, China）を用いて作製した。所望の突然変異は配列分析により確認した。これらのｈｕ４２５変異抗体を、上述した結合分析及び機能性分析により試験した。ｈｕ４２５－１－１と比較すると、ｈｕ４２５－２Ｂ－１は大幅に減少した結合親和性及び機能性を有した（データは省略）のに対し、ｈｕ４２５ヒト化変異体の残りのバージョンはｈｕ４２５－１－１と同様の結合活性及び機能性活性を有した。

ヒトにおける治療的使用のための分子レベルの生化学的及び生物物理学的特性を改善するために、ＣＤＲとフレームワーク領域に突然変異を導入することによってＨｕ４２５抗体をさらに工学的操作した。機能性活性を維持しながら、アミノ酸組成、熱安定性（Ｔ_ｍ）、表面疎水性、及び等電子点（ｐＩｓ）を検討事項とした。

これらをまとめると、上述の突然変異処理により、ヒト化モノクローナル抗体の２つの適切に工学的操作されたバージョン、すなわち、ｈｕ４２５－２－２（重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号２８及び３０に設定）とｈｕ４２５－２－３ｂ（重鎖及び軽鎖可変領域のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号２８及び３６に設定）が得られ、詳細に特徴付けられた。ｈｕ４２５－２－２及びｈｕ４２５－２－３ｂは両方とも、Ｈ－ＣＤＲ２（配列ＩＤ番号２６）及びＬ－ＣＤＲ３（配列ＩＤ番号２７）に突然変異を含む。以下の表４及び表５に、重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列及びｈｕ４２５－２－２及びｈｕ４２５－２－３ｂの６つのＣＤＲを列挙する。これらの結果は、ｈｕ４２５－２－３ｂ及びｈｕ４２５－２－２の両方が結合親和性及びＴｉｍ－３によって媒介される下流のシグナル伝達の阻害等の機能的活性において非常に類似していることを示している。

表４ｈｕ４２５－２－２及びｈｕ４２５－２－３ｂのＶＨ及びＶＫ領域のアミノ酸配列

表５ｈｕ４２５－２－２及びｈｕ４２５－２－３ｂのＶＨ及びＶＫ領域のＣＤＲ配列
（アミノ酸）

親和性の決定のために、ＰｉｅｒｃｅＦａｂ準備キット（Cat. No. 44985、ThermoFisher Scientific）を使用して、ｈｕ４２５のｍＡｂの系列に由来のＦａｂを準備し、表面プラズモン共振（SPR（Surface Plasmon Resonance））技術に基づく親和性分析に使用した。表６は、抗Ｔｉｍ－３Ｆａｂ抗体のＳＰＲ決定結合特性の結果をまとめたものである。ｈｕ４２５－２－２とｈｕ４２５－２－３ｂのＦａｂは非常に類似した結合特性有し、平均解離定数はそれぞれ、０．４１９ｎＭと０．３６１ｎＭであり、それらはｈｕ４２５－１－１のものに近い。

表６ＳＰＲによるｈｕ４２５のＦａｂ結合親和性の比較

＊ｃｈ４２５はヒトＩｇＧ１ｍｆ／マウスカッパ定常領域に融合したｍｕ４２５可変領域から構成されている（重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は配列ＩＤ番号１３及び１５に設定）。
＊＊ＮＡ：利用不可
上記に示したヒト化抗体の全てはまた、健康なドナーから単離した一次ヒト免疫細胞の
機能的活性に対して確認を行った（実施例８に記載）。

実施例５ＳＰＲによる抗Ｔｉｍ－３抗体の親和性の比較
Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するヒトＩｇＧ４のフォーマットで、Ｈｕ４２５－２－３ｂ及び２つの既知のＴｉｍ－３抗体、Ａｂ１（配列ＩＤ番号：４０の重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号：４１の軽鎖可変領域）及びＡｂ２（配列ＩＤ番号：４２の重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号：４３の軽鎖可変領域）を生成し、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭＴ－２００（GE Life Sciences）を使用して、ＳＰＲ分析により、それらの結合の反応速度論について特性付けを行った。

簡単に言うと、抗ヒトＦａｂ抗体を、活性化ＣＭ５バイオセンサーチップ（Cat.: BR100530、GE Life Sciences）上に固定化した。抗Ｔｉｍ－３をチップ表面上に流し、抗ヒトＦａｂ抗体によって捕捉した。そして、Ｔｉｍ－３の段階希釈溶液（０．１２ｎＭ～３０ｎＭ）Ｔｉｍ－３をチップ表面上に流し、一対一ラングミュア結合モデル（BIA Evaluation Software、GE Life Sciences）を使用して会合速度（Ｋ_ｏｎ）と解離速度（Ｋ_ｏｆｆ）を計算するために表面プラズモン共振信号の変化を分析した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を比Ｋ_ｏｆｆ／Ｋ_ｏｎとして計算した。Ｈｕ４２５－２－３ｂ、Ａｂ１、及びＡｂ２は同
等の結合親和性を示した。抗体、特に、ｈｕ４２５－２－３ｂは、ナノモラーＫＤと用量
依存的にＴｉｍ－３に結合する。

表７ＳＰＲによる抗Ｔｉｍ－３の結合親和性の比較

実施例６ｍｕ４２５／ｈｕ４２５のＣＤＲのＴｉｍ－３結合への寄与
ヒト化の処理中、ｈｕ４２５－１－１からの単一のアミノ酸の突然変異を有する複数の変異体が作製された。図３からわかるように、そのような突然変異の変異体のうちの２つはＴｉｍ－３への結合をほぼ完全に無効化したが、各々は重鎖のＣＤＲ３に、中立の（化学的に類似の）アミノ酸置換、Ｄ１０２Ｅ（該ｍＡｂをｈｕ４２５－２Ｅ－１は名付けられた）及びＧ１０３Ａ（ｈｕ４２５－２Ｆ－１と名付けられた）のみを有する。これらの研究結果は、ｍｕ４２５ヒト化抗体中の重鎖のＣＤＲ３がＴｉｍ－３結合機能性に大きく寄与しているという考えを裏付けた。

一方、ｍｕ４２５／ｈｕ４２５の軽鎖のＣＤＲ１及びＣＤＲ２は、マウス生殖系列遺伝子ＩＧＫＶ３－１と同一であった。いくつかのマウス抗体もまた、Ａｂ２０００（米国特許第７９８９５９７号）及びｍＡｂ１Ｇ５（米国特許第７５６３８７４号）等の、それらの軽鎖可変領域に同一のマウス生殖系列ＣＤＲ１及びＣＤＲ２配列を含むことがわかった。これらの抗体がＴｉｍ－３にも結合できるかどうかを調べた。この目的のために、Ａｂ２０００及び１Ｇ５をヒトＩｇＧ１ｍｆのフォーマットで作製し、ＥＬＩＳＡによりＴｉｍ－３－ｍＩｇ結合について評価した。図４に示すように、ｈｕ４２５－２－３ｂとは対照的に、Ａｂ２０００及び１Ｇ５のいずれも、Ｔｉｍ－３結合シグナルを生成することができなかった。それゆえ、マウス生殖細胞系遺伝子ＩＧＫＶ３－１のＣＤＲ１及びＣＤＲ２はＴｉｍ－３結合に対して十分ではない。

Ｔｉｍ－３結合に対するＣＤＲの寄与をさらに評価するために、抗体ｈｕ４２５－２－３ｂ及び抗体Ａｂ１の重鎖及び軽鎖を互いに交換することにより、２つのハイブリッド抗体を作製した。ｈｕ４２５－２－３ｂ及びＡｂ１は両方ともマウス由来の抗Ｔｉｍ－３であり、それらはマウス生殖細胞系ＩＧＫＶ３－１のものと同一のＬ－ＣＤＲ１及びＬ－ＣＤＲ２を共有する。ハイブリッド抗体４２５ＨＣ／Ａｂ１ＬＣを作製するためにｈｕ４２５－２－３ｂの重鎖及びＡｂ１の軽鎖を同時発現させるとともに、Ａｂ１の重鎖及びｈｕ４２５－２－３ｂの軽鎖の同時発現によってハイブリッド抗体Ａｂ１ＨＣ／４２５ＬＣを調製した。ハイブリッド抗体の結合活性は、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉計（ForteBio Octet）によって分析した。ハイブリッド抗体をタンパク質Ａのチップで捕捉した後、ＢＬＩ結合信号分析のためにＴｉｍ－３－ｈｉｓ溶液に浸した。Ａｂ１ＨＣ／４２５ＬＣがＴｉｍ－３結合能力を保持していたのに対し、捕捉された４２５ＨＣ／Ａｂ１ＬＣは有意な結合シグナルを生成しなかったことが観察された。これは、ｈｕ４２５－２－３ｂのＬＣ－ＣＤＲ３がそれのＴｉｍ３への結合に必要であるが、それのＬ－ＣＤＲ１及びＬ－ＣＤＲ２はＴｉｍ３結合に対して十分ではないか、又はＴｉｍ３への結合には必要でないことを示唆した。

実施例７抗Ｔｉｍ－３抗体によるＴｉｍ－３媒介食作用の遮断
Ｔｉｍ－３は、それのＩｇＶドメインを介してホスファチジルセリン（ＰｔｄＳｅｒ）に結合し、アポトーシス細胞の食作用を媒介することが示されている（DeKruyff et al.、J. Immunol、2010、184:1918-1930；Nakayama et al.、Blood、2009、113: 3821-3830）。ＰｔｄＳｅｒは、正常な哺乳類細胞において原形質膜の内側の小葉に閉じ込められているが、アポトーシス細胞の外側の表面に露出するリン脂質である。ＰｔｄＳｅｒは、免疫反応を妨げることによって腫瘍の微小環境における免疫抑制に関与している（Fadok et al., J Clin Invest, 1998, 101: 890-898；Frey et al., Semin Immunopathol., 2011, 33: 497-516）。抗Ｔｉｍ－３抗体の生体内投与は、アポトーシス細胞のクリアランスの減少、局所的な炎症の増加、及び免疫寛容の中断をもたらし、ＰｔｄＳｅｒ－Ｔｉｍ－３軸が生体内での免疫抑制に関与していることを示唆している（Chabtini et al.、J. Immunol 190: 88-96、2013；Nakayama et al.、Blood 113: 3821-30、2009）。

抗Ｔｉｍ－３抗体がＴｉｍ－３によって媒介される食作用を遮断することができるかどうかを判定するために、センサ及び機能的読出し細胞株、ＴＨＰ－１／Ｔｉｍ－３、すなわち、全長を有するＴｉｍ－３遺伝子に安定的にトランスフェクションしたＴＨＰ－１（ＡＴＣＣ、ヒト単球細胞株）を使用して、細胞ベースの分析を確立した。この分析において、ＨｕＴ７８（ＡＴＣＣ）を、２％エタノールで一晩処理し、続いて製造元の指示に従ってＣＦＳＥ色素（Invitrogen、１μＭ）で標識付けすることによって限定的なアポトーシスを起こさせた。そして、ＴＨＰ－１／Ｔｉｍ－３細胞を、抗Ｔｉｍ－３ヒト化抗体の存在下で６時間、ＣＦＳＥ標識アポトーシスＨｕＴ７８細胞と共培養した。Ｔｉｍ－３媒介食作用は、（ＣＤ３^－集団にゲートされた）全ＴＨＰ－１／Ｔｉｍ－３細胞に対するＣＦＳＥ^＋ＴＨＰ－１／Ｔｉｍ－３の割合として決定した。図５に示すように、ｈｕ４２５－２－３ｂは、ＴＨＰ－１／Ｔｉｍ－３細胞によるアポトーシスＨｕＴ７８細胞の食作用を用量依存的に阻害した。

実施例８Ｔ細胞エンゲージャー発現腫瘍細胞と共培養した一次ヒトＰＢＭＣにおける抗Ｔｉｍ－３抗体によるＩＦＮ－γ分泌の活性化
Ｔｉｍ－３及びＰＤ－１の両方が、Ｔ細胞の消耗を誘発するために機能する活性化Ｔ細胞に発現した阻害性受容体であることが報告されている（Anderson AC. et al.、2016、Immunity 44:989-1004）。癌患者からのＴｉｍ－３^＋ＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞は、実際には、Ｔｉｍ－３^－Ｔ細胞に比べ、はるかに少ないＴｈ１サイトカイン、ＩＦＮ－γを分泌する（Arai Y. et al.、2012、Yonago Acta medica 55: 1-9；Xu B, et al.、2015、Oncotarget 6: 20592-603）。

ヒトＰＢＭＣにおける抗ＣＤ３ｍＡｂのＯＫＴ３活性化Ｔ細胞を用いて、Ｔｉｍ－３及び抗Ｔｉｍ－３抗体の機能を調べた。Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７（Cat. No.: 10771、Sigma）を用いた密度勾配遠心分離プロトコルを用いて、健康なドナーから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ（Peripheral Blood Mononuclear Cells））を単離した。分析の三日前に、ＰＢＭＣを４０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３ｍＡｂ、ＯＫＴ３（Cat. No.: 16-0037、eBioscience、USA）で刺激し、効果器細胞として使用されるＣＤ３^＋Ｔ細胞を増幅した。Ａ５４９／ＯＳ８と名付けられた標的細胞は、米国特許第８７３５５５３号に記載されている方法に基づいて、Ｔ細胞エンゲージャー（ＯＳ８）で安定にトランスフェクションされた肺癌細胞株Ａ５４９（ＡＴＣＣ）であった。ＯＳ８は、Ｎ末端ドメインに抗ヒトＣＤ３ｍＡｂ、ＯＫＴ３のｓｃＦｖを含み、それはＴＣＲ／ＣＤ３複合体と直接相互作用し、Ｔ細胞を活性化する。効果器細胞であるＰＢＭＣを、マイトマイシン－Ｃで簡易的に処理したＡ５４９／ＯＳ８標的細胞と共培養して、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体との接触で起こる、活性化Ｔ細胞の腫瘍細胞に対する応答を模倣した。分析は、９６ウェルの平底プレートで抗Ｔｉｍ－３抗体の存在下又は非存在下で実施した。１５～１８時間の共培養の後、培養物の上清を、Ｒｅａｄｙ－Ｓｅｔ－Ｇｏ！ＥＬＩＳＡキット（Cat. No.: 88-7316、eBiosciences）を用いたＥＬＩＳＡによって、ＩＦＮ－γのレベルについて分析した。図６に示すように、Ａ５４９／ＯＳ８標的細胞を効果器細胞と共培養した場合、抗Ｔｉｍ－３抗体（ｃｈ４２５及びｈｕ４２５－１－１）は効果器細胞におけるＩＦＮ－γ分泌の増加を誘発した。

実施例９抗Ｔｉｍ－３抗体によるＣＭＶ特異性ヒトＴ細胞の活性化
ヒトＣＭＶのＰＰ６５ペプチド（NLVPMVATV、495-503、HLA-A2.1-制限）（Boeckh M、Boeckh M and Geballe AP、2011、J Clin Invest. 121: 1673-80）を認識する天然由来のＴ細胞を用いて、Ｔｉｍ－３抗体の機能性活性をさらに評価した。簡単に言うと、最初に、抗ＨＬＡ－Ａ２ｍＡｂを用いて、ＦＡＣＳにより、健康なドナーからのＰＢＭＣを選別した。そして、１０％ＦＢＳを含む完全なＲＰＭＩ中でＰＰ６５ペプチド（純度９８％超、GL Biochem（Shanghai）により合成）を用いて、ＨＬＡ－Ａ２^＋ＰＢＭＣを１週間擬態した。

標的細胞株Ａ５４９／Ａ２．１は、ＨＬＡ－Ａ２．１の安定なトランスフェクションにより確立された。マイトマイシン－ｃ（１００μｇ／ｍｌ）処理及びｐｐ６５ペプチド（５μｇ／ｍｌ）パルスの３０分後に、Ａ５４９／Ａ２．１細胞（１０^４）を、抗Ｔｉｍ－３抗体又は対照抗体の存在下又は非存在下で、９６ウェルプレートで、ｐｐ６５で感作した同数のＰＢＭＣと一晩、共培養した。培養物の上清のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにより決定した。全ての条件に対して、３回ずつ行った。図７に示すように、ｈｕ４２５－２－３ｂはｐｐ６５に特異的なＴ細胞が細胞培養物の上清中にＩＦＮ－γを分泌するのを促進する。

実施例１０抗Ｔｉｍ－３抗体はＮＫ細胞媒介細胞傷害性を増強した
Ｔｉｍ－３は、比較的高いレベルでナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上に構成的に発現されることが知られている（Ndhlovu LC, et al.、2012、Blood 119: 3734-43; da Silva IP, et al.、2014、Cancer Immunol Res. 2: 410-22）。黒色腫では、ＮＫ細胞でのＴｉｍ－３の発現の高さは、腫瘍の進行した病期及び予後不良と関連していることがわかっている。加えて、ＮＫ細胞の機能は、Ｔｉｍ－３活性によって影響されると考えられている（da Silva IP, et al.、2014、Cancer Immunol Res. 2: 410-22）。

ヒト化抗Ｔｉｍ－３抗体がＮＫ細胞によって媒介される細胞傷害性を促進するかどうかを確認するために、ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ（Germany）から入手可能なＮＫ細胞単離キットを使用して、製造元の指示に従って、健康なドナーのＰＢＭＣから一次ＮＫ細胞を単離した。ヒトＩＬ－２（１０００Ｕ／ｍｌ）で１日刺激した後、抗Ｔｉｍ－３抗体、ブレフェルジンＡ、及び抗ＣＤ１０７ａ－ＡＰＣ（ｅBioscience）の存在下、３７℃で、ＮＫ細胞を５時間、Ｋ５６２細胞と共培養した。ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋ＮＫ細胞上のＣＤ１０７ａの発現をフローサイトメトリーにより定量した。その結果、抗Ｔｉｍ－３抗体ｈｕ４２５－２－３ｂが、平均蛍光強度（ＭＦＩ（Mean Fluorescence Intensity））及び細胞数の割合によって測定されるＣＤ１０７ａの発現を増大させることが示された（図８）。

実施例１１抗Ｔｉｍ－３抗体はＴｉｍ－３受容体の表面発現を減少させた
ｈｕ４２５－２－３ｂ含有Ｔｉｍ－３の内在化の可能性に取り組むために、最初に、健康なドナーからのＮＫ細胞を完全ＲＰＭＩ１６４０培地中で、ｈｕ４２５－２－３ｂ（１０μｇ／ｍＬ）と共に、３７℃又は４℃で１時間、培養した。Ｔｉｍ－３受容体の表面発現は、非競合Ｔｉｍ－３Ａｂ、ｍｕ４２０（自作）で染色し、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ－ＡＰＣ（Biolegend）で染色することによって決定した。図９に示すように、３７℃で、ｈｕ４２５－２－３ｂは、陰性対照のヒトＩｇＧ処理細胞と比較して、Ｔｉｍ－３表面発現の大幅な減少を引き起こした。これは短期間における明らかな温度依存性を示したので、上述の減少は抗Ｔｉｍ－３抗体誘発受容体の内在化によるものであった可能性が高い。これらの結果は、おそらくＴｉｍ－３の内在化により、ｈｕ４－２５－２－３ｂがＴｉｍ－３受容体のダウンレギュレーションを誘発したことを明白に実証している。Ｔｉｍ－３の内在化を誘発することによって、ｈｕ４２５－２－３ｂがＴｉｍ－３と（ガレクチン－９及びＰｔｄＳｅｒ等の）それの複数のリガンドとの相互作用を減少させると予想される。

実施例１２抗Ｔｉｍ－３抗体は内在化率の上昇を呈した
抗体の内在化をさらに調べるために、Ｔｉｍ－３発現ＮＫ細胞株（ＮＫ９２ＭＩ／ｈｕＴｉｍ－３）を用いて、異なる時点（１、３、５及び１８時間）において抗Ｔｉｍ－３抗体によって誘発される内在化を判定した。簡単に言うと、３７℃又は４℃で、ｈｕ４２５－２－３ｂ、Ａｂ１、及びＡｂ２を含む抗Ｔｉｍ－３抗体（１０μｇ／ｍｌ）をＮＫ９２ＭＩ／ｈｕＴｉｍ－３（５×１０^４）と共に１８時間、培養した。Ｔｉｍ－３受容体の表面発現は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＦＩＴＣで染色することによって決定した。内在化の割合％は、４℃での発現レベルと比較した、３７℃でのＴｉｍ－３の表面発現の減少（％）として計算した。図１０に示されるように、短い培養（１～５時間）中に、ｈｕ４２５－２－３ｂは、Ａｂ１及びＡｂ２と同程度のＴｉｍ－３の内在化を誘発した。これは、１８時間の培養後にＡｂ１及びＡｂ２の両方よりも大幅に持続的な内在化を実証し、ｈｕ４２５－２－３ｂによるＴｉｍ－３の内在化の持続的な活性を示唆した。

実施例１３ヒト化抗Ｔｉｍ－３ｍＡｂは、単独で又はＰＤ－１ｍＡｂとの組み合わせで免疫細胞を刺激する。
進行した腫瘍及び慢性的なウイルス感染を有する患者における「機能不全」腫瘍の抗原特異性ＣＤ８^＋Ｔ細胞において、免疫阻害性受容体ＰＤ－１及びＴｉｍ－３がアップレギュレートされたことが報告されている（Fourcade J, et al.、2010、J Exp Med. 207: 2175-86；Thommen DS, et al.、2015、Cancer Immunol Res. 3: 1344-55；Jin HT, et al.、2010、Proc Natl Acad Sci USA. 107: 14733-8）。ＰＤ－１及びＴｉｍ－３受容体の両方の同時遮断は、ワクチンによって誘発されるＮＹ－ＥＳＯ－１特異性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を増大することができる（Fourcade J., et al.、2014、Cancer Res. 74: 1045-55）。抗Ｔｉｍ－３及び抗ＰＤ－１抗体による潜在的な共刺激効果を特徴付けるために、従来のＴ細胞応答分析である混合リンパ球反応（ＭＬＲ（Mixed Lymphocyte Reaction））を設定した。簡単に言うと、「刺激因子ＰＢＭＣ」をマイトマイシン－ｃ（１００μｇ／ｍｌ、Sigma）で前処理し、抗Ｔｉｍ－３を加えた１０％ＡＢ血清（Sigma）及び／又は抗ＰＤ－１ｍＡｂ、３１７－４Ｂ６（ｈｕ３１７－４Ｂ６、３１７－４Ｂ６／ＩｇＧ４ｍｔ１０と名付けられた、米国特許第８７３５５５３号に記載）を含む完全ＲＰＭＩ１６４０培地で、一対一の比率で異なるドナーの「応答ＰＢＭＣ」と共培養した。この反応は、９６ウェル平底プレートで４日間行い、各条件について３通りのデータポイント設定を用いた。細胞培養物の上清中のＩＦＮ－γ分泌を読出しとして分析した。

これらの結果は、ｈｕ４２５－２－３ｂがＭＬＲ用量依存的に、ＩＦＮ－γ製造を大幅に増強することを示した。ｈｕ４２５－２－３ｂと３１７－４Ｂ６（５０ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせは、ｈｕ４２５－２－３ｂ又は抗ＰＤ－１抗体だけの場合に比べて、ＩＦＮ－γ生成のより大きな増加をもたらし、抗Ｔｉｍ－３ｍＡｂの抗ＰＤ－１モノクローナル抗体との共刺激効果を実証している（図１１）。

抗Ｔｉｍ－３ｍＡｂ、ｈｕ４２５－２－３ｂ又は抗ＰＤ－１Ａｂ、ｈｕ３１７－４ｂ６（５０ｎｇ／ｍｌ）を加えたｈｕ４２５－２－３ｂのいずれかの存在下で、９６ウェル平底プレートで、マイトマイシン－Ｃで前処理された「刺激ＰＢＭＣ」を「応答ＰＢＭＣ」と４日間、共培養した。上清中のＩＦＮ－γをＥＬＩＳＡにより決定した。全ての条件に対して、３回ずつ行った。結果は平均＋ＳＤで示した。

実施例１４Ｈｕ４２５－２－３ｂはＡＤＣＣ及びＣＤＣの効果器機能を有さなかった
ＡＤＣＣ及びＣＤＣを誘発するｈｕ４２５－２－３ｂの能力を、以下に記載するように生体内分析を用いて決定した。ＩｇＧ１ｍｆ（配列ＩＤ番号２１）は、突然変異Ｅ_２３３Ｐ、Ｌ_２３４Ａ、Ｌ_２３５Ａ、Ｌ_２３６Ａ及びＰ_３２９Ａ（アミノ酸の番号付けはＥＵシステムに基づく）の組合せを含むＩｇＧ１突然変異体である。これらの突然変異は、Ｃ１ｑと同様に全てのＦｃγＲへのＦｃの結合を排除するように設計されている。

ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）
ｈｕ４２５－２－３ｂがＡＤＣＣを誘発できるかどうかを判定するために、従来のＡＤＣＣ分析を設定した。分析効果器細胞株、ＮＫ９２ＭＩ／ＣＤ１６Ｖ細胞は、ＣＤ１６_Ｖ１５８（Ｖ１５８対立遺伝子）及びＦｃＲγｃＤＮＡを含む発現プラスミドを同時形質導入することによってＮＫ９２ＭＩ細胞（ＡＴＣＣ）から生成した。Ｔｉｍ－３発現Ｔ細胞株、ＨｕＴ７８／Ｔｉｍ－３を標的細胞として使用した。効果器細胞（４×１０^４）を、ｈｕ４２５－２－３ｂ抗体又は対照抗体と、陽性対照抗ＭＨＣ－１Ａ、Ｂ、Ｃ（Biolegend）又は陰性対照のヒトＩｇＧのいずれかの存在下で５時間、同数の標的細胞と共培養した。細胞傷害性は、ＣｙｔｏＴｏｘ９６非放射性細胞傷害性分析キット（Promega、Madison, WI）を用いて乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出分析により決定した。詳細な溶解は以下の式により決定した。

これらの結果は、ｈｕ４２５－２－３ｂが陰性対照と同じ基底レベルのＡＤＣＣを有するのに対して、抗ＭＨＣ－ＩＡ、Ｂ、Ｃが用量依存的にＡＤＣＣを誘発することを立証した（図１２Ａ）。

ＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）
ｈｕ４２５－２－３ｂがＣＤＣを引き起こすかどうかは、予め活性化されたヒトＰＢＭＣ及び健康なドナーからの新鮮な自己血清を用いて判定した。ＣＤＣによる細胞溶解は、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ－ｇｌｏ分析キット（Promega、Beijing, China）によって決定した。簡単に言うと、健康なドナーからのＰＢＭＣをＰＨＡ（１０μｇ／ｍｌ、Sigma）で３日間、予備活性化し、そして自己血清（１５％）を加えたＲＰＭＩ１６４０及びｈｕ４２５－２－３ｂ又は対照抗体（０．０４－３０μｇ／ｍＬ）で、３７℃で一晩培養した。ＣＤＣによる細胞死は、反応終了時の細胞溶解後に生存細胞から放出されるＡＴＰの減少に基づいて分析した。抗ＭＨＣ－ＩＡ、Ｂ、Ｃを陽性対照として使用した。９６ウェル蛍光計（PHERA Star FS、BMG LABTECH）を使用して蛍光読取りを行い、相対蛍光単位（ＲＦＵ（Relative Fluorescence Unit））読取りからＣＤＣ活性を以下のように計算した：％ＣＤＣ活性＝［（ＲＦＵ試験－ＲＦＵバックグラウンド）／（全細胞溶解時のＲＦＵ－ＲＦＵバックグラウンド）］×１００。これらの実験結果は、ｈｕ４２５－２－３ｂが、２人の異なるドナーから単離されたＰＢＭＣを有する検出可能なＣＤＣを有さないことを実証した。一方、陽性対照抗体、抗ＭＨＣ－Ｉは有意なＣＤＣ活性を誘発した（図１２Ｂ）。

これらの結果は、ｈｕ４２５－２－３ｂが最適な物理化学的特性を維持しながら、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ効果器機能を排除することを示した。

実施例１５抗ＰＤ－１抗体と組み合わせた抗Ｔｉｍ－３抗体はマウス異種移植癌モデル
における腫瘍増殖を阻害する
免疫不全マウスにヒト癌細胞と同種異系のＰＢＭＣを移植した異種移植癌モデルにより、Ｔｉｍ－３抗体の潜在的な抗癌活性を抗ＰＤ－１抗体との組み合わせで評価した。簡単に言うと、腫瘍の植え付けの前に、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスをシクロホスファミド（１５０ｍｇ／ｋｇ）で２日間、前処理した。ヒトＰＢＭＣを健康な有志者の末梢血から単離し、マトリゲル（Matrigel）中のＡ４３１類表皮癌細胞（Cat. No. CRL－1555、ATCC）と混合し、動物に皮下注射した。０日目から開始して、動物（マウス）を無作為に１群あたり５～１０匹のマウスの割合で４群に割り当てた。マウスを週１回（ＱＷ）の割合で４週間、ビヒクル（ＰＢＳ）と共に、５ｍｇ／ｋｇの抗Ｔｉｍ－３ｍＡｂキメラ４２５（ｃｈ４２５）、抗ＰＤ－１抗体３１７－４Ｂ６（１ｍｇ／ｋｇ）、又は併用療法（１ｍｇ／ｋｇの３１７－４Ｂ６を加えた５ｍｇ／ｋｇのｃｈ４２５）を腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。個々のマウスの腫瘍サイズを週２回記録し、マウスを試験期間中、毒性の臨床徴候について毎日、観察した。腫瘍体積は、式：［Ｄ×（ｄ^２）］／２を用いて計算した。ここで、Ｄは腫瘍の長径を表し、ｄは短径を表す。全ての動物実験は、Ｂｅｉｇｅｎｅ動物飼育使用手順（Beigene Animal Care and Use Procedure）に従って実施した。

図１３に示すように、５ｍｇ／ｋｇの用量でｃｈ４２５の単独での処理は腫瘍増殖にほとんど又は全く影響を与えなかった。１ｍｇ／ｋｇの用量の３１７－４Ｂ６は統計的に有意でない（Ｐ＞０．０５）腫瘍成長の遅延の傾向を示した。しかしながら、ｃｈ４２５及び３１７－４Ｂ６との併用治療は有意な相乗効果を示し、ビヒクル治療群と比較して腫瘍増殖を６０％以上抑制した。

これらの結果は、３１７－４Ｂ６とｃｈ４２５との併用療法が実施例１１に記載の生体内データと一致した、生体内癌モデルにおけるマウスの腫瘍増殖を阻害するために、ヒト免疫細胞を活性化できることを示している。

この出願は、２０１６年８月２６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０９６９２４号を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims

癌若しくは腫瘍又は感染症の治療に使用するための医薬の調製のための、ヒトＴｉｍ－３に結合することが可能なヒト化抗体の使用であって、
前記抗体が、配列ＩＤ番号３のＶＨ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号２６のＶＨ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号５のＶＨ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む重鎖可変領域（ＶＨ）、並びに配列ＩＤ番号６のＶＬ－ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列ＩＤ番号７のＶＬ－ＣＤＲ２アミノ酸配列、及び配列ＩＤ番号２７のＶＬ－ＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、使用。
（ｉ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、又は
（ｉｉ）配列ＩＤ番号２８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列ＩＤ番号３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、
請求項１に記載の使用。
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又は単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）である、請求項１に記載の使用。
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４又はそれらの変異体のサブクラスの重鎖定常領域、及びカッパ若しくはラムダ又はそれらの変異体の軽鎖定常領域を含む、請求項１に記載の使用。
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスの変異型重鎖定常領域を含み、該変異型重鎖定常領域が効果器機能の減少又は排除をもたらす、請求項４に記載の使用。
前記効果器機能が抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ（Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity））又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ（Complement-Dependent Cytotoxicity））である、請求項５に記載の使用。
ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域又はその変異体を含む、請求項４に記載の使用。
前記ヒトＩｇＧ１の変異型重鎖定常領域がＥ_２３３Ｐ、Ｌ_２３４Ａ、Ｌ_２３５Ａ、Ｌ_２３６Ａ及びＰ_３２９Ａからなる群より選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項７に記載の使用。
前記変異型ヒトＩｇＧ１重鎖定常領域が配列ＩＤ番号２１のアミノ酸配列、及びヒトＩｇＧ１カッパ軽鎖定常領域を含む、請求項８に記載の使用。
前記癌が肺癌、肝臓癌、胃癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌、乳癌、大腸癌、白血病、リンパ腫、卵巣癌、頭頸部癌、又は癌の転移性病変から選択される、請求項１～９のいずれかに記載の使用。
前記抗体が第２の治療薬又は処置との組み合わせで投与され、該第２の治療薬又は処置が化学療法、標的療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫療法、サイトカイン、外科的処置、放射線処置、共刺激性分子の活性化剤、阻害性分子の阻害剤、ワクチン、又は細胞性免疫療法から選択される、請求項１～９のいずれかに記載の使用。
前記抗体がＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ－３、ＣＥＡＣＡＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ－５、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、又はＴＧＦＲから選択される免疫チェックポイント分子の阻害剤との組み合わせで投与される、請求項１～９のいずれかに記載の使用。
前記抗体が抗ＰＤ－１ｍＡｂ、３１７－４Ｂ６又は３１７－４Ｂ６／ＩｇＧ４ｍｔ１０との組み合わせで投与される、請求項１～９のいずれかに記載の使用。
前記感染症がＨＩＶ感染及びＨＣＶ感染から選択される慢性的なウイルス感染症である、請求項１～９のいずれかに記載の使用。