JP7129912B2 - 慢性疾患の治療及び予防用医薬組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ｓｉＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡを発現し得るＤＮＡベクターを有効成分として含む医薬組成物、具体的には、ヒトＣＨＳＴ１５の発現を阻害するに関し、ｓｉＲＮＡ及び該ｓｉＲＮＡを発現し得るＤＮＡベクターを有効成分として含む医薬組成物と、その用途及び投与方法とに関する。

慢性疾患の多くは自己免疫疾患で、慢性的な炎症を伴う。近年これらの慢性疾患の新しい治療ターゲットとして、炎症に関与する白血球の組織浸潤が注目を集めている。血液循環中の白血球が炎症組織に浸潤するには以下の４つの段階がある。すなわち、（１）炎症部位周辺の血管内皮細胞と白血球との第１の相互作用により白血球の流速が低下し（ローリング）、（２）ローリング中の白血球が活性化し、（３）前記活性化白血球が前記血管内皮細胞との第２の相互作用により前記血管内皮細胞に強固に接着し、（４）最終的に前記活性化白血球は血管内皮細胞の間から血管をすり抜けて組織内に遊走浸潤する。このうち、第１段階のローリングには、白血球表面のＬ－セレクチンと、血管内皮細胞表面のＬ－セレクチンリガンドのシアリル－６－スルフォ・ルイスＸ糖鎖末端との結合が関与することが知られている。このシアリル－６－スルフォ・ルイスＸ糖鎖を炎症部位特異的に合成するのに関与する酵素として、Ｎ－アセチルグルコサミン－６－硫酸転移酵素が知られており、従来、ヒトＣＨＳＴ２及びＣＨＳＴ４遺伝子にコード化される硫酸転移酵素が血液循環中の白血球が炎症組織に浸潤するのに関与すると考えられてきた。しかし、ノックアウトマウスの研究から、ＣＨＳＴ２及びＣＨＳＴ４遺伝子をともに欠失するマウスでも血液循環中の白血球が炎症組織に浸潤するが、その理由は明かではなかった（非特許文献１）。

本発明の発明者らは、これまで、ＣＨＳＴ２及び４とは別の硫酸転移酵素ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いて、潰瘍、炎症及び線維化の抑制を含めた治療効果を報告してきた(特許文献１～３及び非特許文献１及び２)。特に、近年第２a相治験をヒトクローン病患者について行い、患者の大腸粘膜下に前記ｓｉＲＮＡを投与すると、内視鏡的な粘膜治癒又は内視鏡的な潰瘍治癒を達成できることを実証した。
その過程で、従来のクローン病の生物製剤療法と比較してＣＨＳＴ１５のｓｉＲＮＡ療法のほうが治療成績が優れていることから、血液循環中の白血球が炎症組織に浸潤する第１段階をＣＨＳＴ１５のｓｉＲＮＡが阻害することを発見し、本発明を完成するに至った。

国際公開第WO 2009/004995号 国際公開第WO 2009/084232号 国際公開第WO 2014/013535号

Patnode, M.Lら、Glycobiology, 23:381-394 (2013) Kiryu Hら、Bioinformatics. 27: 1788-1797 (2011) Suzuki Kら、Su1078 Gastroenterology 2014: (suppl).

従来療法では不奏効又は効果が低い慢性疾患に対する新規療法を開発する必要がある。

ＣＨＳＴ１５の発現を阻害するｓｉＲＮＡが、炎症部位の血管内皮細胞のＬ－セレクチンリガンドのシアリル－６－スルフォ・ルイスＸの発現を阻害することから、前記ｓｉＲＮＡにより従来療法と併用できる新規の慢性疾患の技術を開発した。

本発明は、白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と併用する、炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列を含むＲＮＡとがハイブリダイズした構造を含む、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、
（ｉｉ）末端において１もしくは複数の核酸がオーバーハングした構造を有する（ｉ）のｓｉＲＮＡ、
または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のｓｉＲＮＡを発現し得るＤＮＡベクターを有効成分として含む。

本発明の医薬組成物において、前記（ｉ）のｓｉＲＮＡは、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズした構造の場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記（ｉｉ）のｓｉＲＮＡは、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：４に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズした構造の場合がある。

本発明の医薬組成物において、白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤は、循環血中のリンパ球表面のインテグリン及び／又はケモカインレセプターと、血管内皮細胞表面の接着分子とからなるグループから選択される少なくとも１つの分子の機能を阻害する場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤は、ＥＴＲＯＬＩＺＵＭＡＢ、ＶＥＤＯＬＩＺＵＭＡＢ、ＮＡＴＡＬＩＺＵＭＡＢ、ＰＦ－００５４７６５９及びＶＥＲＣＩＲＮＯＮからなるグループから選択される少なくとも１つの場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記炎症性サイトカインを阻害する生物製剤は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７及びＩＬ－２３からなるグループから選択される少なくとも１つの分子の機能を阻害する場合がある。

本発明の医薬組成物は、５－アミノサリチル酸製剤と、ステロイド製剤と、チオプリン製剤と、タクロリムス及びシクロスポリンを含む免疫抑制剤とからなるグループから選択される少なくとも１つをさらに併用する場合がある。

本発明は、患者の血管内皮細胞表面にＬ－セレクチンリガンドのシアリル－６－スルフォ・ルイスＸが発現する慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列を含むＲＮＡとがハイブリダイズした構造を含む、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、
（ｉｉ）末端において１もしくは複数の核酸がオーバーハングした構造を有する（ｉ）のｓｉＲＮＡ、
または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のｓｉＲＮＡを発現し得るＤＮＡベクターを有効成分として含む。

本発明の医薬組成物において、前記（ｉ）のｓｉＲＮＡは、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズした構造の場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記（ｉｉ）のｓｉＲＮＡは、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：４に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズした構造の場合がある。

本発明の全ての医薬組成物において、前記慢性疾患は自己免疫疾患の場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記自己免疫疾患は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性膵炎、慢性関節リウマチ、気管支喘息、慢性間質肺炎、バセドウ病、橋本病、慢性甲状腺炎及びアトピー性皮膚炎からなるグループから選択される少なくとも１つの場合がある。

本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所投与される場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記自己免疫疾患は、炎症性腸疾患、クローン病及び潰瘍性大腸炎からなるグループから選択され、前記局所投与は患者の腸管粘膜下への投与の場合がある。

本発明の医薬組成物において、前記全身投与は経口投与及び／又は静脈注射の場合がある。

本発明の医薬組成物において、（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列を含むＲＮＡとがハイブリダイズした構造を含む、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、又は
（ｉｉ）末端において１もしくは複数の核酸がオーバーハングした構造を有する（ｉ）のｓｉＲＮＡであり、
該有効成分とＮ－アセチル化キトサンとを含む複合体が経口投与される場合がある。

本発明は、本発明の医薬組成物を白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と併用することを含む、炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。ここで本発明の医薬組成物は、
（ｉ）配列番号：１に記載の塩基配列を含むＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列を含むＲＮＡとがハイブリダイズした構造を含む、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ、
（ｉｉ）末端において１もしくは複数の核酸がオーバーハングした構造を有する（ｉ）のｓｉＲＮＡ、
または
（ｉｉｉ）（ｉ）もしくは（ｉｉ）のｓｉＲＮＡを発現し得るＤＮＡベクターを有効成分として含む。

本発明の炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法において、前記（ｉ）のｓｉＲＮＡは、配列番号：１に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：２に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズした構造の場合がある。

本発明の炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法において、前記（ｉｉ）のｓｉＲＮＡは、配列番号：３に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：４に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズした構造の場合がある。

本発明の炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法において、白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤は、循環血中のリンパ球表面のインテグリン及び／又はケモカインレセプターと、血管内皮細胞表面の接着分子とからなるグループから選択される少なくとも１つの分子の機能を阻害する場合がある。

本発明の炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法において、前記白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤は、ＥＴＲＯＬＩＺＵＭＡＢ、ＶＥＤＯＬＩＺＵＭＡＢ、ＮＡＴＡＬＩＺＵＭＡＢ、ＰＦ－００５４７６５９及びＶＥＲＣＩＲＮＯＮからなるグループから選択される少なくとも１つの場合がある。

本発明の炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法において、前記炎症性サイトカインを阻害する生物製剤は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７及びＩＬ－２３からなるグループから選択される少なくとも１つの分子の機能を阻害する場合がある。

本発明の炎症性慢性疾患の治療及び／又は予防方法は、５－アミノサリチル酸製剤、ステロイド製剤、チオプリン製剤及びタクロリムスからなるグループから選択される少なくとも１つの抗炎症剤、免疫調整薬又は免疫抑制剤をさらに併用することを含む場合がある。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

本発明の医薬組成物の潰瘍性大腸炎第２ａ相治験デザインの模式図。 本発明の医薬組成物の潰瘍性大腸炎第２ａ相治験の一次評価項目（粘膜治癒）の結果を表すデータ。 本発明の医薬組成物の潰瘍性大腸炎第２ａ相治験で得られたＬ－セレクチンリガンドの硫酸化低下を示すデータ。 本発明の医薬組成物の潰瘍性大腸炎第２ａ相治験で得られたリンパ球の浸潤の減少を示すデータ。 本発明の医薬組成物と既存の慢性炎症疾患の治療薬との白血球の組織内浸潤における作用点を示す模式図。 本発明の医薬組成物の作用点が既存の慢性炎症疾患の治療薬の作用点の上流であることを示す模式図。 本発明の医薬組成物の複数回反復投与の医師主導臨床研究の試験デザインを説明する模式図。 本発明の医薬組成物の複数回反復投与の医師主導臨床研究の一次評価項目（粘膜治癒）及び二次評価項目（全身臨床応答）の結果を表すデータ。

本発明において、ＲＮＡｉ分子は、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制することができる。本明細書において「ＲＮＡｉ分子」とは、生体内においてＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉； ＲＮＡ ｉｎｔｅｆｅｒｅｎｃｅ）を誘導し、標的遺伝子（本発明ではＣＨＳＴ１５）の転写産物の分解などを介してその遺伝子の発現を抑制（サイレンシング）することができるＲＮＡ分子をいう（Ｆｉｒｅ Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ３９１， ８０６-８１１ （１９９８））。ＲＮＡｉ分子の具体例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどが挙げられる。「ｓｉＲＮＡ」は、標的遺伝子のｍＲＮＡ配列の一部に相補的な配列を含むアンチセンス鎖と、該アンチセンス鎖に相補的（標的遺伝子の配列の一部と相同）な配列を含むセンス鎖とがハイブリダイズして形成される二本鎖ＲＮＡである。「ｓｈＲＮＡ」は、適当な配列を有する短いスペーサー配列によって前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖が連結された一本鎖ＲＮＡをいう。つまり、ｓｈＲＮＡは、一分子内でセンス領域とアンチセンス領域が互いに塩基対合してステム構造を形成し、同時に前記スペーサー配列がループ構造を形成ことによって、分子全体としてヘアピン型のステム－ループ構造を形成している。

本明細書において、標的遺伝子発現の抑制は、標的遺伝子の発現をその遺伝子のｍＲＮＡ又はタンパク質の発現量を指標に判定した場合に、ＲＮＡｉ分子を導入しない場合又は無関係な対照ＲＮＡｉ分子を導入した場合に対して、１００％抑制される場合のみならず、７５％以上、５０％以上又は２０％以上抑制されることも意味する。ｍＲＮＡ発現量は、例えばノザンハイブリダイゼーション又はリアルタイムＰＣＲにより測定することができ、タンパク質発現量は、例えばウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ又はタンパク質の活性測定により、当業者であれば適宜測定することができる。遺伝子発現量の具体的な測定方法は、Ｇｒｅｅｎ， ＭＲ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｊ， （２０１２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにも記載されている。

本明細書において「相補的」とは、２つの塩基間で（例えばワトソン・クリック型の）塩基対合をし得る関係を意味し、例えば、アデニンとチミン又はウラシルとの関係、並びにシトシンとグアニンとの関係をいう。本明細書において相補的とは、完全に相補的であることが好ましいが、完全に相補的である必要はなく、ｓｉＲＮＡ分子が標的遺伝子発現を抑制する能力を保持する限り、１個以上（例えば１～５個又は１～３個）のミスマッチを含んでいてもよい。ミスマッチとは、アデニンとチミン又はウラシルとの関係並びにシトシンとグアニンとの関係以外の関係を指す。

ｓｉＲＮＡなどのＲＮＡｉ分子は、末端に数個（例えば、２～５個）のヌクレオチドの一本鎖部分（オーバーハング）を有する場合にＲＮＡｉ活性が高いことが一般に知られている。そのため、本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子は、末端に数個のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのオーバーハングを有することが好ましい。例えば、本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子は、２ヌクレオチドの３'オーバーハングを有し得る。具体的には、本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子は、２個のリボヌクレオチド（例えばＡＵ（アデニン－ウラシル・ジリボヌクレオチド）又はＡＧ（アデニン－グアニン・ジリボヌクレオチド））からなる３'オーバーハングを有していてもよい。

本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ、例えば２０～５０個、２０～４０個又は２０～３０個の塩基長であってよいが、特に限定されず、互いに同じ長さでも異なる長さでもよい。本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子は、好ましくは、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ２５～２９個、例えば２７個の塩基長であってよい。

より具体的には、本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、配列番号３に示される塩基配列からなってよく、これは、配列番号１に示される塩基配列の３'末端にリボヌクレオチドＡＵ（アデニン－ウラシル・ジリボヌクレオチド）が付加した配列である。本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖は、配列番号４に示される塩基配列からなってよく、これは、配列番号２に示される塩基配列の３'末端にリボヌクレオチドＡＧ（アデニン－グアニン・ジリボヌクレオチド）が付加した配列である。

本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチドは、全てがリボヌクレオチドである場合の他に、数個（例えば１～５個、１～３個又は１～２個）がデオキシリボヌクレオチドの場合もある。本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子のヌクレオチドはまた、天然のヌクレオチドに加えて、例えばｓｉＲＮＡ分子の安定性を向上させるために、ハロゲン（フッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、メチル、カルボキシメチル又はチオ基などの基を有する修飾ヌクレオチドであってもよい。

本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子を構成するセンス鎖及びアンチセンス鎖は、市販の核酸合成機を用いて適宜製造することができる。製造されたセンス鎖及びアンチセンス鎖は、好ましくは等モル比で混合して、互いにハイブリダイズさせ、本発明で用いるｓｉＲＮＡ分子を製造する場合がある。また、メーカー（例えば、ＢｉｏＳｐｒｉｎｇ、タカラバイオ、Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈなど）の受託製造サービスを利用してｓｉＲＮＡ分子を製造することもできる。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物に含まれる、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖と、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖ととがハイブリダイズした構造を含む、又は、該構造からなる。配列番号１に示されるヌクレオチド配列は、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と相補性がある。本願明細書の実施例においてＳＴＮＭ０１と命名されるｓｉＲＮＡは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するアンチセンスＲＮＡ鎖と、配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するセンスＲＮＡ鎖とがハイブリダイズした構造からなる。配列番号３に示されるヌクレオチド配列は、配列番号４に示されるヌクレオチド配列と相補性がある。配列番号３に示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列を有するリボヌクレオチドの３’末端にジリボヌクレオチドＡＵが結合する。配列番号４に示されるヌクレオチド配列を有するＲＮＡは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列を有するリボヌクレオチドの３’末端にジリボヌクレオチドＡＧが結合する。配列番号２のヌクレオチド配列は、配列番号５に示されるヒトＣＨＳＴ１５のｃＤＮＡセンス鎖デオキシリボヌクレオチド配列の部分配列である。配列番号５は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５８９２（バージョン：ＮＭ＿０１５８９２．４）として入手可能である。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物は、製剤分野において通常使用される任意の製剤補助剤を含む場合がある。製剤補助剤としては、製薬上許容される、担体(固体又は液体担体)、賦形剤、安定化剤、乳化剤、界面活性剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤、着色剤、矯味剤、保存剤、緩衝剤などの、様々な薬物担体又は添加剤を用いる場合がある。具体的には、製剤補助剤としては、水、生理食塩水、他の水性溶媒、製薬上許容される有機溶媒、マンニトール、微結晶セルロース、デンプン、ブドウ糖、カルシウム、ポリビニルアルコール、コラーゲン、ポリビニルピロリドン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、水溶性デキストラン、水溶性デキストリン、カルボキシメチルスターチナトリウム、アラビアゴム、ペクチン、キサンタンガム、カゼイン、ゼラチン、寒天、プロピレングリコール、グリセリン、ポリエチレングリコール、ワセリン、パラフィン、ステアリルアルコール、ステアリン酸、ソルビトール、ラクトースなどが挙げられる。製剤補助剤は、製剤の剤形に応じて適宜又は組み合わせて選択される場合がある。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物は、経口投与又は非経口投与(例えば、経直腸投与、経粘膜投与、静脈内投与、動脈内投与、若しくは経皮投与)の場合があるが、特に経口投与及び経直腸投与の場合がある。

経口投与に適した剤形としては、例えば、固形剤(錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、トローチ剤、ドロップ剤を含む)、顆粒剤、散剤、粉剤、液剤などを挙げることができる。固形剤は、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠又は多層錠としてもよい。このような剤皮は、例えば、身体における目的の場所で有効成分を放出させること又は有効成分の吸収性を高めることを目的とする場合がある。

非経口投与では、それぞれの投与方法に適した剤形を適宜用いることができるが、非経口投与に適した剤形としては、例えば、坐剤、注射剤、点滴剤、塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、懸濁剤、乳剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤などを挙げることができる。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物は、目的とする疾患の治療又は予防のために製薬上有効な量で生体に投与することができる。本明細書において「製薬上有効な量」とは、本発明の医薬組成物に含まれるｓｉＲＮＡ分子が、対象とする疾患を治療又は予防する上で必要な用量であって、かつ投与する生体に対して有害な副作用がほとんどないか又は全くない用量をいう。具体的な投与量は、個々の被験体に応じて、病気の進行度若しくは重症度、全身の健康状態、年齢、性別、体重及び処置に対する耐性などに基づき、例えば医師の判断により決定される。例えば、本発明の医薬組成物を経口的に投与する場合、ＣＨＳＴ１５遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ分子の重量で、通常は０．００１～１０００ｍｇ／体重ｋｇ／日、例えば０．０１～１００ｍｇ／体重ｋｇ／日又は０．１～１０ｍｇ／体重ｋｇ／日となる量で投与してもよい。本発明の医薬組成物は、例えば医師が決定した治療計画に基づいて、単回投与することができるが、一定の時間間隔、例えば、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月又は１年などの間隔で、被験体に対して、数回又は数十回に分けて投与することもできる。

本発明において「治療」とは疾患若しくは症状を治癒、軽減、又は改善することを意味し、「予防」とは疾患若しくは症状の発症を阻止、抑制、又は遅延することを意味する。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物の作用機序が、白血球の血行性組織内浸潤の第１段階であるローリングの阻害であることから、第１段階より下流の段階を阻害する作用機序、又は、白血球血行性組織内浸潤とは独立の作用機序で慢性疾患に有効な医薬と本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物とを併用することでより高い薬効が得られる。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物と併用が可能な、白血球の血行性組織浸潤を阻害する生物製剤は、白血球血行性組織内浸潤の第１段階より下流の段階の阻害を作用機序とすることを条件として、いかなるものでも構わない。前記生物製剤は、例えば、白血球血行性組織内浸潤の第２段階であるケモカイン刺激、第３段階のインテグリンによる強固な接着及び／又は第４段階の血管外遊走の少なくとも１つの段階を阻害することを作用機序とする場合がある。白血球血行性組織内浸潤の第２段階であるケモカイン刺激を阻害する生物製剤は、例えば、ＣＣＲ９を含むが、これに限定されない、ケモカインレセプターの機能を阻害することにより白血球の血行性組織浸潤を低減又は抑制する。白血球血行性組織内浸潤の第３段階であるインテグリンによる強固な接着を阻害する生物製剤は、例えば、α４β７及びαＥβ７インテグリンのβ７サブユニット、α４β７インテグリン（ＬＰＡＭ-１）及び／又はインテグリンα４サブユニットを含むが、これらに限定されない、循環血中のリンパ球表面のインテグリンの機能を阻害することにより白血球の血行性組織浸潤を低減又は抑制する。血球血行性組織内浸潤の第４段階である血管外遊走を阻害する生物製剤は、例えば、ＭＡｄＣＡＭを含むが、これに限定されない血管内皮細胞表面の接着分子の機能を阻害することにより白血球の血行性組織浸潤を低減又は抑制する。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物と併用が可能な、炎症性サイトカインを阻害する生物製剤は、慢性疾患に関与する少なくとも１つの炎症性サイトカインの機能を阻害する場合がある。前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－１７、ＩＬ－１８、ＩＬ－２３及びＧＭ－ＣＳＦを含むが、これらに限定されない。前記炎症性サイトカインは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７及びＩＬ－２３の少なくとも１つの場合がある。前記炎症性サイトカインを阻害する生物製剤は、前記炎症性サイトカインを阻害する抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体等の前記炎症性サイトカインに対する特異的結合パートナーの場合がある。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物が併用される抗炎症剤、免疫調整薬又は免疫抑制剤は、ペンタサ、サラゾピリン、アサコール及びリアルダのような５－アミノサリチル酸製剤、リンデロン及びプレドネマのようなステロイド製剤、アザチオプリン及び６－ＭＰのようなチオプリン製剤、タクロリムス及びシクロスポリンのような免疫抑制剤を含むが、これらに限定されない。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分のｓｉＲＮＡと、Ｎ－アセチル化キトサンとを含む複合体を経口投与すると、該複合体が、消化管に効率的に送達され、ＣＨＳＴ１５遺伝子発現を抑制すること、また、消化管の炎症、特に、慢性炎症に対して治療効果を奏することは、本願の発明者によるＷＯ２０１７／０７８０５４に開示される。前記複合体の調製方法もＷＯ２０１７／０７８０５４に開示される。

簡潔には、キトサンは、グルコサミンと少量のＮ－アセチルグルコサミンとが重合した構造を有する高分子多糖類である。キトサンは、カニ、エビなど甲殻類の殻から得ることができるキチンを、濃アルカリ溶液と加熱して脱アセチル化することによって得ることができる。キトサンは、様々なアセチル化度及び分子量で、例えばＣａｒｂｏｓｙｎｔｈ社又はフナコシ社などで市販されている。本明細書においてキトサンのアセチル化度は、通常０～３０％、例えば２０％以下、１０％以下又は５％以下であり得る。本明細書においてキトサンの分子量は、特に限定されず、低分子量キトサン（例えば、分子量２０００Ｄａ～１００ｋＤａ）であっても、高分子量キトサン（例えば、分子量１００ｋＤａ～１０，０００ｋＤａ又はそれ以上）であっても、又は様々な分子量の混合物であってもよい。

Ｎ－アセチル化キトサンは、上記キトサンのアミノ基の一部又は全部がアセチル化された高分子多糖類である。本明細書においてＮ－アセチル化キトサンのアセチル化度は、通常７０～１００％、例えば８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上であってよい。キトサン及びＮ－アセチル化キトサンのアセチル化度は、コロイド滴定、赤外吸収スペクトル、核磁気共鳴スペクトル（ＮＭＲ）、元素分析などによって決定することができる。

本発明の慢性疾患の治療及び／又は予防用医薬組成物の有効成分のｓｉＲＮＡと、Ｎ－アセチル化キトサンとを含む複合体中のｓｉＲＮＡ分子とＮ－アセチル化キトサンとの結合の様式は特に限定しないが、ＲＮＡｉ分子はアニオン性ポリマーであり、Ｎ－アセチル化キトサンはカチオン性ポリマーであるため、両者は静電的相互作用で複合体を形成することが想定される。上記複合体において、ＲＮＡｉ分子と、Ｎ－アセチル化キトサンを構成しているグルコサミン単位との比（モル比）は、１：２００～１：５、１：１００～１：５、又は１：５０～１：１０であってよい。前記複合体は、特別なドラッグデリバリーシステムを必要とせずに、低侵襲的な投与方法、例えば経口投与によって、RNAi分子を細胞に送達することができる。

本発明において、「併用して投与する」とは、白血球の血行性組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と、場合により、抗炎症剤、免疫調整薬又は免疫抑制剤である、５－アミノサリチル酸製剤と、ステロイド製剤と、チオプリン製剤と、タクロリムス及びシクロスポリンを含む免疫抑制剤とからなるグループから選択される少なくとも１つと、本発明の医薬組成物とを同時に、連続して、あるいは、一方を先に投与した後、時間をおいて投与してもよい。白血球の血行性組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と、場合により、抗炎症剤、免疫調整薬又は免疫抑制剤である、５－アミノサリチル酸製剤と、ステロイド製剤と、チオプリン製剤と、タクロリムス及びシクロスポリンを含む免疫抑制剤とからなるグループから選択される少なくとも１つと、本発明の医薬組成物とを投与する場合、本発明の医薬組成物の投与期間と前記生物製剤のいずれかの投与期間とが重複するか、前記生物製剤の投与期間の終了後、該生物製剤の投与間隔の少なくとも２０％の期間内に本発明の医薬組成物の投与を開始することは、「併用して投与する」ことに含まれる。本発明の医薬組成物の投与量は、投与対象の体重、年齢、症状等により適宜調整することが可能であるが、例えば生物製剤が抗体である場合の投与量は、例えば、０．１～１００ｍｇ／ｋｇ／週又はこれと同等の血中濃度を示す投与量であり、好ましくは１～５０ｍｇ／ｋｇ／週又はこれと同等の血中濃度を示す投与量であり、更に好ましくは５～１０ｍｇ／ｋｇ／週又はこれと同等の血中濃度を示す投与量である。また、例えば前記抗炎症剤、免疫調整薬又は免疫抑制剤の投与量は、例えば、１０～１００００ｍｇ／ｍ２／週又はこれと同等の血中濃度を示す投与量であり、好ましくは１００～５０００ｍｇ／ｍ２／週又はこれと同等の血中濃度を示す投与量であり、更に好ましくは５００～１５００ｍｇ／ｍ２／週又はこれと同等の血中濃度を示す投与量である。

上記投与方法、投与間隔、投与量は、本発明の効果同様の治療効果を示す投与方法、投与間隔、投与量を適宜選択することができる。たとえば白血球の血行性組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と、場合により、抗炎症剤、免疫調整薬又は免疫抑制剤である、５－アミノサリチル酸製剤と、ステロイド製剤と、チオプリン製剤と、タクロリムス及びシクロスポリンを含む免疫抑制剤とからなるグループから選択される少なくとも１つと、本発明の医薬組成物との血中濃度を測定することにより上記好ましい例と同様の効果を示す投与方法、投与間隔、投与量を選択することが可能であり、上記例と同等の血中濃度を達成する投与方法、投与間隔、投与量も本発明に含まれる。

本明細書において、本発明の医薬組成物が治療又は予防に用いられる疾患は、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、慢性胃炎、慢性萎縮性胃炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性胆管炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、自己免疫性膵炎、高安動脈炎、グッドパスチャー症候群、急速進行性糸球体腎炎、バセドウ病、橋本病、原発性甲状腺機能低下症、特発性アジソン病、1型糖尿病、慢性円板状エリテマトーデス、限局性強皮症、天疱瘡、膿疱性乾癬、尋常性乾癬、天性表皮水疱症、自己免疫性視神経症、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、血管炎症候群、混合性結合組織病、気管支喘息、慢性甲状腺炎及びアトピー性皮膚炎を含むが、これらに限定されない。

本発明の詳しい説明と、その実施例とは、本願の提出書類に含まれる以下の資料と、これらに引用される文献とによっても説明される。

とくに、Ｓｕｚａｗａ， Ｋ．ら、Ａｍ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２００７；１０２：１４９９-１５０９、Ｙｅｈ， Ｊ．-Ｃ．ら、Ｃｅｌｌ， ２００１； １０５：９５７-９６９、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ， Ｍ．ら、Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ． ２００９； ３２： ７７４-７７９、Ａ． ｖａｎ Ｚａｎｔｅ及びＳ．Ｄ． Ｒｏｓｅｎ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ ２００３； ３１： ３１３-３１７の文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。

以下では、生物製剤休薬中の潰瘍性大腸炎患者に本発明の医薬組成物を粘膜下注射で単回投与する第２ａ相試験の結果を実施例１で説明し、生物製剤投与中の潰瘍性大腸炎患者に本発明の医薬組成物を粘膜下注射で複数回投与する医師主導臨床研究の結果を実施例２で説明する。

以下に、ＳＴＮＭ０１の第２ａ相試験計画書の第８章及び第９章に基づいて、本発明の医薬組成物の治験について説明する。なお下記では、試験計画については「だろう」などの未来形の記載で説明されるが、実際には本願優先日までに治験は終了している。

治験計画書第８章 治験デザイン及び計画されたサンプルサイズ
８．１ 治験デザイン
これは、１回量の粘膜下注射によるＳＴＮＭ０１の無作為化二重盲検プラセボ対照並行群間試験である。

凍結乾燥させたＳＴＮＭ０１は生理食塩水を用いて希釈されるだろう。試験薬は、内視鏡を使用して直腸Ｓ状部の粘膜下に投与されるだろう。患者は、ＳＴＮＭ０１（２５ｎＭ及び２５０ｎＭの濃度で）又はプラセボのいずれかを受けるように無作為化されるだろう。適格被験者は治験施設に入院し、そして１回量の試験薬を１日目に受けるだろう。２日目に安全性の懸念が全くないと確認された後に被験者は退院するだろう。被験者は、投与から１４日後及び２８日後に経過観察の検査のために治験施設に戻るだろう。表１は、用量（濃度）、投薬計画、及び被験者数を示す。

＜理論的根拠＞
完全無作為化二重盲検プラセボ対照第１相臨床試験におけるＳＴＮＭ０１（２５ｎＭ及び２５０ｎＭを含む）の局所投与は、一般的に良好な耐容性を示した。それ故、この時点で提案された並行群間第２ａ相臨床試験の実施を妨げるであろう安全性の懸念は全くない。第１相試験の主な目的は安全性を評価することであったので、第１相試験で観察された粘膜治癒効力は意外であった。したがって、計画された第２ａ相試験は、第１相試験において観察された効力を確認すること、並びに効力パラメーター及び実施される予定のより大きな次の対照試験に使用される用量に関するより多くの情報を得ることを目的とする。これは並行群間比較デザインであるが、患者の安全性は緻密にモニタリングされ、そして第２評価項目として評価されるだろう。

８．２ 試験の中止又は中断
現在の工程において１人以上の被験者に、試験薬以外の要因、例えば試験手順によって引き起こされたと考えられる深刻な又は重篤な有害事象が起こった場合、又は、現在の工程において被験者の半分以上に、試験薬以外の要因によって引き起こされたと考えられる医学的介入を必要とする中程度の有害事象が起こった場合、スポンサーは一時的に試験を中止し、そして主任治験者の意見を参考にして試験の継続を審査する。

８．３ 計画されたサンプルサイズ
０．０５０の両側有意水準を有する２つの群のカイ二乗検定は、各群におけるサンブルサイズが８である場合（離脱率は１５％であると想定）、有効な処置とプラセボの間の差（８９％対１１％）を検出するのに８０％の検出力を有するだろう。それ故、１群あたり８人の被験者（ＳＴＭ０１ ２５ｎＭに８人、ＳＴＮＭ０１ ２５０ｎＭに８人、プラセボに８人）、すなわち合計して２４人の被験者が包含されるだろう。

８．４ 計画された試験期間
２０１３年５月から２０１６年５月

８．５ 治験デザインの考察及び対照群の選択
これは、１回量のＳＴＮＭ０１の安全性及び効力を調べるための第２ａ相試験である。治験デザインはこの種類の試験にとって適切であると思われる。

９．被験者の選択及び中止／離脱
治験への参加は、選択基準及び除外基準に従って適格であり、かつ参加施設の患者であるかは又は参加施設に照会され、かつ治験担当者に提示された、全ての患者に勧められる。

９．１ 適応症
内視鏡的活動性病変（群）を有する潰瘍性大腸炎の患者。

９．２ 選択基準及び除外基準
９．２．１ 選択基準
被験者の適格性は、以下の基準に従って決定される：
１）男性／女性
２）被験者は、活動性病変（群）を有する潰瘍性大腸炎患者である。
３）被験者は、スクリーニング試験の２カ月以上前に、潰瘍性大腸炎を処置するために一般的に使用される慣用的な薬物（群）［例えば、５－アミノサリチル酸剤、ステロイド、免疫調節剤、生物製剤（例えば抗ＴＮＦ抗体又はベドリズマブは、４週間の休薬期間を必要とする）］により処置されている。主治医の意見では被験者に、現在の慣用的な処置選択肢の１つに対して不十分な応答又は耐性が起こった。現在の処置に対する被験者の不十分な応答又は耐性はまた、内視鏡検査、診察、及び臨床検査をはじめとするスクリーニング検査に基づいて、この試験の主任治験担当者によって確認される。被験者の経験する「不十分な応答又は耐性」は、主治医及び主任治験担当者の判断で評価され得るが；しかしながら、１つの処方された薬物療法の使用及び現在の薬物療法（群）による不十分な治療効果は、被験者のカルテに記録されるべきである。
４）被験者は、内視鏡の挿入にほとんど困難は生じない、例えば、被験者はほとんど狭窄がないか、又はあるとしても、狭窄した病変の直径は１４ｍｍ以下である。
５）スクリーニング時のＭａｙｏ内視鏡スコアは１であるか又は１を超えなければならない。
６）被験者の年齢は、インフォームドコンセント時に１８歳以上かつ６５歳以下である。
７）被験者は試験に参加するために書面によるインフォームドコンセントに署名し日付を記載する。

＜理論的根拠＞
２）潰瘍性大腸炎の内視鏡的重症度は中程度から重度であるべきである。なぜなら、試験は、試験薬を用いての入院患者の処置及び外来患者の来診を必要とするからである。
３）これは、慣用的な処置と併用投与された場合の試験薬の効力及び安全性を調べるためのものである。
４、５）これは、プロトコールを遵守して治験を実施するためのものである。
６）これはＧＣＰを遵守するためである。

９．２．２．除外基準
以下のいずれかの基準を満たす任意の被験者は、試験に参加する資格がないだろう：
１）被験者が、重篤な心疾患、血液学的疾患、又は肺疾患を有するか又はその病歴を有し、そして治験担当者が試験への参加は不適切との見解を示す。
２）被験者が、潰瘍性大腸炎のための大腸完全切除術の病歴を有する。
３）被験者が、重度の出血又は他の臓器への腸管癒着などの潰瘍性大腸炎の合併症を有し、そして治験担当者が試験への参加は不適切との見解を示す。
４）被験者が、排便頻度に影響を及ぼす肛門狭窄症、又は発熱を伴う肛門周囲膿瘍を有する。しかしながら、被験者は、腸の運動がシートン法によって改善される場合、適格である。
５）被験者の全身状態が明らかに低下している。
６）大腸の大部分が罹患している被験者（全大腸炎）。
７）試験参加中に結腸切除術を要する症状を呈することが予想される被験者。
８）被験者が、現在、完全非経口栄養を受けている。
９）被験者が肝障害又は腎障害を有し、そして治験担当者が試験への参加は不適切との見解を示す。
１０）被験者が、過去５年間以内に悪性腫瘍を有するか又はその病歴を有する。
１１）被験者が腸結核を有するか又はその病歴を有する。
１２）被験者が、入院を必要とする深刻な感染の合併症を有する。
１３）被験者が生物製剤（例えば抗ＴＮＦ－α抗体又はベドリズマブ）を用いて現在処置されているならば除外されるべきである。
１４）被験者が局所投与による併用薬物療法［例えば５－アミノサリチル酸剤、ステロイド、免疫調節剤］を用いて処置されているならば除外されるべきである。
１５）被験者が、臨床的に深刻なアレルギー症状の病歴を有する。「深刻な」は、特定の抗原又は薬物に曝された場合の、全身蕁麻疹、アナフィラキシー、又は入院を必要とするショックを引き起こすアレルギー症状を意味する。
１６）被験者が、ＨＢＶ、ＨＣＶ、及び／又はＨＩＶ感染の病歴を有する。
１７）被験者が、アルコール又は薬物依存である。
１８）潰瘍性大腸炎に対する被験者の慣用的な処置は、治療計画のその「質」（薬物のクラス）が変更されるか、又は新規な処置が追加される：事前の３か月にはチオプリンは全く導入されず、試験薬の投与前の１４日間は５－ＡＳＡ又は副腎皮質ステロイドの投薬の変更はない。
１９）被験者はが、この試験の経過中に別の臨床試験に現在参加しているか、あるいは参加する計画がある。
２０）被験者が、この試験のインフォームドコンセント前の６カ月間以内に任意の他の治験薬製剤の投与を受けた。
２１）被験者が、任意の精神障害又は神経障害を有し、そして治験担当者が試験への参加は不適切との見解を示す。
２２）被験者が、プロトコールにより指令される検査又は手順を行えないか、あるいは制限されている。
２３）被験者が、任意の他の理由から、治験担当者によって、この試験への参加は不適切であると判断される。
２４）確実で許容可能な避妊法を使用したくない及び使用できない（パール指数が１未満）。被験者又はその性的パートナーは、それぞれ、試験薬の投与の６週間前から３週間後までこれらの確実な方法の少なくとも１つを使用しなければならない。
２５）女性について：妊娠又は授乳。
２６）治験担当者の同僚、学生、親戚、又は配偶者。

＜理論的根拠＞
１）から２０）これらは被験者の安全を確保し、そして試験薬の安全性及び効力の評価に対する影響を排除するためである。
２１）これらの疾患状態は除外される。なぜなら、薬効の評価は、精神障害又は神経系障害によって妨害され得る被験者の主観的な症状の報告を必要とするからである。
２２）これは、プロトコールを遵守して試験を実施するためである。
２３）これは、１）ないし２１）に記載のもの以外の理由のために試験への参加が医学的に又は倫理的に不適切であると判断された個体を除外するものである。

９．３ 事前及び併用の薬物療法及び治療法
１）全身併用薬物療法のみが許可される。局所投与されるバックグラウンド療法の使用は禁止される（例えば５－ＡＳＡ、ステロイド、免疫調節剤、生物製剤（例えば抗ＴＮＦ－α抗体又はベドリズマブは、４週間の休薬期間を必要とする）。
２）試験薬以外の、試験薬の投与の２か月前から試験の終了時までの間に使用された全ての薬物療法を症例報告書に記録すべきである（薬物の名称、目的、１日量、投薬計画、投与経路、及び開始／停止日を含む）。
３）潰瘍性大腸炎を処置するための薬物療法については、上記の１）に記載の期間より前に使用された薬物療法は、可能であれば同じように記録されるだろう。
４）薬物療法以外の全ての療法が、可能であれば、症例報告書に記録されるだろう（療法、目的、開始／停止日を含む）。
５）この試験の最後の観察／検査の終了前に使用された有害事象を処置するための全ての薬物療法及び治療法が症例報告書に記録されるべきである。緊急のための薬物療法及び治療法の使用はプロトコールの逸脱として取り扱われるだろう。

＜理論的根拠＞
この試験においてＳＴＮＭ０１を用いての事前薬物療法及び治療法の併用は正当化され得る。なぜなら、非常に僅かな毒性所見しか認められず、そして薬物はＳＴＮＭ０１の非臨床試験での投与後急速に血液から消失し、したがって、我々は、未知の有害薬物反応の発生、又は事前の薬物療法の有害な薬物反応の重症度の上昇は起こらないだろうと推測するからである。

９．４ 試験中の制約
被験者は、以下の指示に従うように指導されなければならない。被験者は入院中に治験担当者の医学的監督下に留まるだろう。

９．４．１ 食物、飲料、喫煙、及び運動
被験者は、０日目の夕食後から１日目の試験薬投与の４時間後までの断食するだろう。被験者はまた、経過観察の検査の前日の夕食後からその完了日まで断食するだろう。

アルコール及びカフェインを含有している食物及び飲料は入院中禁止されるだろう。退院後、過剰な飲水は、最終検査／観察の終了まで禁止されるだろう。アルコール飲料は、経過観察検査の前日からその完了日まで許可されないだろう。

治験施設で提供されるもの以外の食物及び飲料は、入院中は許可されないだろう。被験者は、退院後から最終検査／観察終了時まで過剰な食事及び飲水を控えるように指導されなければならない。

喫煙は入院中は禁止されるだろう。喫煙は、経過観察の検査の前日の就寝時からその完了日まで許可されないだろう。

身体運動は、被験者が試験施設にいる間、並びに、経過観察の検査の前日からその完了日まで禁止されるだろう。

９．４．２ 退院後の被験者との接触
施設管理組織は、経過観察する必要のある治験手順に関して（例えば退院後の過剰な摂食及び飲水に関する制限）計画された来診の前に適時に被験者に接触するだろう。

９．５ 被験者の中止又は離脱の基準
以下の状況のいずれかが発生する場合、治験担当者は、被験者への試験薬投与を直ちに中止し、被験者に適切な処置を提供し、そしてできるだけ多く退院時に計画された検査／観察を実施しなければならない。試験から中途で離脱した被験者は交替してもよい。治験担当者は、中止の日付及び理由、中止後に投与された処置、並びにその後の臨床経過を症例報告書（これは遅れずにスポンサーに提出しなければならない）に記録するだろう。計画された検査／観察が中止時に実施されなかった場合、理由を症例報告書に記録しなければならない。
１）被験者が同意を撤回した。
２）被験者がプロトコールの参加基準を満たさなかった。
３）主任治験担当者が、被験者が試験への参加を継続すれば損失を被るだろうと判断した。（例えば、試験の終了を必要とする有害事象の発生、基礎疾患の悪化。）
４）プロトコールからの大きな逸脱があった。
５）スポンサーが試験を中途で終了した。
６）主任治験担当者が、上記以外の理由から試験から被験者を除外する必要があることが分かった。

＜理論的根拠＞
１）これは、インフォームドコンセントを得るための必要条件の１つである。
２）適切な評価がなされ得ない被験者は、試験から除外されるべきである。
３）これは、安全性及び倫理を考慮するためである。
４）プロトコールからの大きな逸脱は優良臨床試験基準の違反である。
５）これは、スポンサーが全研究を中途で終了又は中断すると決定した場合に適用されるだろう。
６）これは、主任治験担当者が上記以外の理由から必要であると判断した場合に試験から被験者を除外するためである。

１．内視鏡的及び組織病理的な治療効果の評価
第２ａ相試験計画書の第８章及び第９章に基づいてスクリーニングされた被験者に、２５０ｎＭ又は２５ｎＭのＳＴＮＭ０１か、プラセボかを表１のとおり腸管粘膜下に内視鏡穿刺針で注射することにより単回投与した。投与時と、その２週目及び４週目に病変部分を内視鏡で検討を行った。内視鏡検討の結果はＭａｙｏ内視鏡サブスコア（Ｃｏｌｏｍｂｅｌ ＪＦ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１１；１４１：１１９４－２０１）により評価した。各投与群の被験者の数は表１に示すとおりいずれも８名であった。また、また投与直前と、投与４週目とに被験者の病変部分の生検組織片サンプルを採取し、ヘマトキシリン・エオジン染色組織標本を調製し、組織病理学的な検査を行った。これらの結果を図２の内視鏡写真及び組織標本の光学顕微鏡写真に示す。さらに、各群の被験者のＭａｙｏ内視鏡サブスコアの変化を図２右側のグラフに示す。

図２上の内視鏡写真及び図２下の組織標本の光学顕微鏡写真に示す被験者は、生物製剤を投薬されているにもかかわらず、投与時には抗体製剤抵抗性の深い潰瘍が内視鏡で観察され、組織病理学的な検査でも、びまん性白血球浸潤及び繊維症が観察された。しかし、２週目の内視鏡観察では潰瘍が消失し、４週目の組織病理学検査でも、炎症像は消失していた。図２右側のグラフに示すとおり、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１投与群は、２５ｎＭのＳＴＮＭ０１又はプラセボ投与群よりＭａｙｏ内視鏡サブスコアが有意に低下した。以上の図２の結果から、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１の投与は治療効果が高いことが証明された。

２．Ｌ－セレクチンリガンドの硫酸化への影響の評価
硫酸化したＬ－セレクチンリガンドを特異的に検出するＭＥＣＡ－７９抗体による免疫組織化学染色は以下のとおり実施された（Ｙｅｈ，Ｊ．－Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｃｅｌｌ． ２００１， １０５； ９５７ － ９６９）。各投与群の被験者の数は表１に示すとおりいずれも８名であった。全員から回収した腸生検組織サンプルをパラフィン包埋して薄切し、切片を脱パラ後０．０３％Ｈ_２Ｏ_２に５分間浸漬して内在性ペロキシダーゼ活性を阻害した。その後、免疫実験用ブロッキング剤ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル株式会社）に１０分間インキュベーションした。切片は、その後ＭＥＣＡ－７９抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、米国）の２００倍希釈液と終夜４°Ｃでインキュベーションした。２次抗体（ＨＲＰ標識抗ヤギＩｇＧ）とインキュベーション後、３，３’－ジアミノベンジジン／Ｈ_２Ｏ_２溶液を用いて酵素発色反応を行った。定量的な解析には、ＭＥＣＡ－７９染色切片の明視野像が２００倍の倍率でデジタルカメラで撮影された。切片あたり４個の視野の陽性部分の面積がＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて測定された。各投与群の腸生検組織標本の陽性部分の面積の百分率の平均及び標準偏差を図３右のグラフに示す。

図３左のＭＥＣＡ－７９抗体による免疫組織化学染色の光学顕微鏡写真に示す被験者は、生物製剤を投薬されているにもかかわらず、ＳＴＮＭ０１投与時（０週目）にはＭＥＣＡ－７９陽性血管が検出された。しかし、ＳＴＮＭ０１投与後４週目にはＭＥＣＡ－７９陽性血管は検出されなかった。図３右のグラフに示すとおり、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１投与群は、プラセボ投与群より陽性部分の面積の百分率が有意に低下した。以上の図３の結果から、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１投与はＬ－セレクチンリガンドの硫酸化を低下させることが証明された。

３．リンパ球の組織浸潤への影響の評価
リンパ球の組織浸潤への影響を評価するために、各投与群の被験者の数８名全員から回収した腸生検組織サンプルをパラフィン包埋して薄切し、切片を脱パラ後、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。この明視野像を前節のＭＥＣＡ－７９染色切片の明視野像と同様に、２００倍の倍率でデジタルカメラで撮影された。切片あたり４個の視野の陽性部分の面積がＩｍａｇｅ Ｊソフトウェア（ＮＩＨ、米国）を用いて測定された。１００μｍ^２あたりの基底膜リンパ球の数の平均及び標準偏差を図４のグラフに示す。

図４のグラフに示すとおり、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１投与群は、プラセボ投与群より基底膜リンパ球の数が有意に低下した。以上の図４の結果から、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１投与はリンパ球の組織浸潤を低下させることが証明された。

既存の慢性炎症疾患の治療薬の作用機序は、組織内へのリンパ球の浸潤過程の阻害と、組織内に浸潤したリンパ球によって惹起された炎症反応の阻害とに大別される。第１世代の慢性炎症疾患の治療薬（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ、Ａｄａｌｉｍｕｎａｂ、Ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ、Ｇｏｌｉｍｕｍａｂ、Ｕｓｔｅｋｎｕｍａｂ及びＭＥＤＩ２０７０）の作用機序は、組織内での炎症反応に関与するＴＮＦ及びサイトカインの阻害である。これに対し、図５に示すとおり、第２世代の慢性炎症疾患の治療薬（Ｖｅｒｃｉｒｎｏｎ、Ｖｅｄｏｌｉｚｕｍａｂ、Ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ、Ｅｔｒｏｌｉｚｕｍａｂ及びＰＦ－００５４７６５９）は、組織内へのリンパ球の浸潤の過程のおける、リンパ球の活性化と、活性化リンパ球の血管内皮細胞との強固な接着と、血管内皮細胞の間から組織内への侵入とを阻害する。今回の治験データの解析結果から、本発明の医薬組成物は、Ｌ－セレクチンリガンドの硫酸化を低下させ、かつ、リンパ球の組織浸潤を低下させることが明らかになった。図６に示すとおり、本発明の医薬組成物は、リンパ球の組織内浸潤におけるＬ－セレクチンリガンドの硫酸化を低下させ、リンパ球の血管内でのローリングを阻害する。これは、リンパ球の組織内浸潤の過程で最も上流の段階である。つまり本発明の医薬組成物の作用点は、第１世代及び第２世代の慢性炎症疾患治療薬の作用点より上流である。そこで、本発明の医薬組成物は、第１世代及び第２世代の慢性炎症疾患の治療薬と併用することにより、これらよりも高い薬効を奏することが予想された。

本実施例では、生物製剤（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ及び／又はＡｄａｌｉｍｕｎａｂ）抵抗性の潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者に本発明の医薬組成物（ＳＴＮＭ０１）を反復投与した医師主導臨床研究（ＩＩＴ）の結果を説明する。

図７は本実施例の医師主導臨床研究の試験デザインの模式図である。スクリーニングで生物製剤（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ及び／又はＡｄａｌｉｍｕｎａｂ）抵抗性であると認められた被検者合計５名は、基線（０週目）、２週目及び４週目の合計３回、２５０ｎＭのＳＴＮＭ０１を内視鏡を用いた粘膜下注射で投与される。実施例１の試験では生物製剤を投与されていた被検者は１月間生物製剤を投与しない休薬期間の後にＳＴＮＭ０１が投与された。しかし実施例２の試験では、生物製剤の投与は継続しながらＳＴＮＭ０１が投与された。評価項目は実施例１の試験と同様である。

図８に本実施例の医師主導臨床研究の結果のハイライトを示す。図８左上の内視鏡写真は、完全寛解に達した被検者の基線及び６週目の患部を示す。６週目で粘膜治癒が認められた。図８左下の内視鏡写真は、出血を伴う大潰瘍を有する重症の被検者の基線及び６週目の患部を示す。この患者は潰瘍の完全寛解には至らなかったが、責任医師のコメントでは、外科手術を回避することができた。図８右上は、本実施例の医師主導臨床研究被検者５名のＭａｙｏ内視鏡サブスコア（ＭＥＳ）の経時変化を示すグラフである。最終的に粘膜治癒率は８０％であった。図８右下は、本実施例の医師主導臨床研究被検者５名のＭａｙｏスコア（Ｃｏｌｏｍｂｅｌ ＪＦ ｅｔ ａｌ．、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２０１１；１４１：１１９４－２０１）の経時変化を示すグラフである。図９に示すとおり、生物製剤抵抗性の重症潰瘍性大腸炎患者にＳＴＮＭ０１を複数回投与することにより、全身及び局所症状の改善が見られた。最終的に臨床反応率は１００％、臨床寛解率は４０％であった。

この他の医師主導臨床研究の結果の要約は以下のとおりである。
病理学的には、炎症細胞浸潤の減少、杯細胞の増加の誘導が認められた。被検者５名とも、少なくとも８ヶ月は臨床的再燃を示すことなく、経過は良好であった。被検者のうち１名は９ヶ月目、もう１名は１１ヶ月目に直腸出血を示したが、残り３名は９ヶ月以降も寛解状態である。特に重症の１名は、外科手術直前の最終手段として切迫した状況でＳＴＮＭ０１が投与されたが、２週間以内に臨床効果が現れたため手術を実施せずに経過観察されることになり、結果的に外科手術を回避できた（試験責任医師コメント）。ステロイド依存の難治症例が５名中３名であったが、３名とも、ステロイドフリー寛解を少なくとも６ヶ月以上維持できた。

以上のとおり、本実施例のＳＴＮＭ０１の治療導入期の複数回投与は、生物製剤抵抗性の難治性潰瘍性大腸炎患者に対して、迅速な臨床反応ならびに粘膜治癒導入効果を有し、しかも、その効果は、新たな全身投与薬剤の追加を実施せずとも半年以上（本試験では８ヶ月以上）のスパンで維持されることが示された。

以上の実施例から、本発明の医薬組成物は、白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と併用することにより、より高い薬効を奏することが証明された。

Claims (10)

1. 白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤及び／又は炎症性サイトカインを阻害する生物製剤と併用するための、潰瘍性大腸炎の治療及び／又は予防用医薬組成物であって、
   （ｉ）配列番号：３に記載の塩基配列からなるＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：４に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズし、末端において２個の核酸がオーバーハングした構造を有するｓｉＲＮＡ、
   または
   （ｉｉ）（ｉ）のｓｉＲＮＡを発現し得るＤＮＡベクターを有効成分として含む、医薬組成物。
2. 前記白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤は、循環血中のリンパ球表面のインテグリン及び／又はケモカインレセプターと、血管内皮細胞表面の接着分子とからなるグループから選択される少なくとも１つの分子の機能を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記白血球の組織浸潤を阻害する生物製剤は、ＥＴＲＯＬＩＺＵＭＡＢ、ＶＥＤＯＬＩＺＵＭＡＢ、ＮＡＴＡＬＩＺＵＭＡＢ、ＰＦ-００５４７６５９及びＶＥＲＣＩＲＮＯＮからなるグループから選択される少なくとも１つである、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 前記炎症性サイトカインを阻害する生物製剤は、ＴＮＦ－α、ＩＬ－１７及びＩＬ－２３からなるグループから選択される少なくとも１つの分子の機能を阻害する、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
5. ５－アミノサリチル酸製剤と、ステロイド製剤と、チオプリン製剤と、タクロリムス及びシクロスポリンを含む免疫抑制剤からなるグループから選択される少なくとも１つをさらに併用する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
6. 患者の血管内皮細胞表面にＬ－セレクチンリガンドのシアリル－６－スルフォ・ルイスＸが発現している、請求項１記載の医薬組成物。
7. 全身投与又は局所投与される、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
8. 前記局所投与は患者の腸管粘膜下への投与である、請求項７に記載の医薬組成物。
9. 前記全身投与は経口投与及び／又は静脈注射である、請求項７に記載の医薬組成物。
10. 前記有効成分は、（ｉ）配列番号：３に記載の塩基配列を含むＲＮＡと、該ＲＮＡと相補的な配列番号：４に記載の塩基配列からなるＲＮＡとがハイブリダイズし、末端において２個の核酸がオーバーハングした構造を有するｓｉＲＮＡであり、
    該有効成分とＮ－アセチル化キトサンとを含む複合体が経口投与される、請求項９に記載の医薬組成物。

Images