JP7494122B2

JP7494122B2 - 変形性関節症の治療におけるｐｅｄｆ由来短鎖ペプチドの使用

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Publication number: JP7494122B2
Application number: JP2020554895A
Authority: JP
Inventors: ユァン－ミンリー; ヨウ－ピンツァオ; ツォン‐チュアンホ; フランクウェン－チーリー
Original assignee: Brim Biotechnology Inc
Current assignee: Brim Biotechnology Inc
Priority date: 2018-04-08
Filing date: 2019-04-08
Publication date: 2024-06-03
Anticipated expiration: 2039-04-08
Also published as: US20210221862A1; CN112672731A; JP2021521115A; JP2024054274A; AU2019253456A1; AU2025201575A1; EP3761958A1; EA202092366A1; TW202010514A; KR20200140843A; WO2019199679A1; IL277734A; EP3761958A4

Description

本発明は、ＰＥＤＦ由来ペプチド、および損傷後の腱治癒に対するそれらの使用に関する。

最も一般的な種類の関節疾患である変形性関節症（ＯＡ）は、滑膜関節の関節軟骨の破壊に起因する変性疾患である。年齢とともに、関節軟骨は細胞レベル（すなわち、軟骨細胞）で変性する。軟骨細胞およびプロテオグリカンの数が減少し、軟骨の厚さが全体的に失われる。関節軟骨細胞（ＡＣ）の構造および機能の破壊は、世界中の何百万もの人々に発症する変形性関節症を引き起こす。もっとも、さらに大きな外傷では、関節軟骨細胞の無血管性および静止性のために、ＡＣの自己治癒能力は限られている（Ｋｈａｎｅｔａｌ．，２００８，“Ｃａｒｔｉｌａｇｅｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｒｅａｓｏｎｓｆｏｒｆａｉｌｕｒｅｏｆｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｄｕｒｉｎｇｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ，” Ｅｕｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍａｔｅｒ．，２００８Ｓｅｐ．３；１６：２６－３９）。さらに、軟骨は、スポーツに関連する外傷などでは頻繁に損傷する。したがって、軟骨欠損と初期の変形性関節症とは、整形外科医にとって大きな課題である。

変形性関節症は、進行性で不均一な変性関節疾患であり、特に高齢者に最もよく見られる形態の関節炎である。変形性関節症は、関節の軟骨の破壊に関連しており、体内のほぼあらゆる関節で発生する可能性がある。変形性関節症は通常、股関節、膝および脊椎の重量を支える関節で発生するが、指、首および足の親指にも発症する可能性がある。ただし、変形性関節症は、事前の損傷または過度のストレスが伴わない限り、他の関節に発症することはめったにない。損傷または疾患による関節軟骨の喪失は、大きな臨床的課題を提示する。

軟骨の軟骨細胞は、胚発生中に間葉系細胞から分化する。正常な成熟軟骨に見られる唯一の細胞型である分化した軟骨細胞は、マトリックスの完全性を維持するのに十分な量の軟骨特異的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を合成する。ＥＣＭの主成分は、水、アグリカン、および下にある骨の移動によって生成される加えられた圧縮力に抵抗するＩＩ型コラーゲンである。

ＯＡの治療選択肢は非常に限られている。ＯＡの治療選択肢には、鎮痛薬、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、およびステロイドまたはヒアルロナン（ＨＡ；関節の潤滑を改善するため）の関節内注射が含まれる。理学療法は１つの選択肢である。外科的選択肢は、関節鏡手技から人工関節置換術まで多岐にわたる。さらに、外科的処置による同種移植片移植が発展しつつある。これらの限られた治療選択肢により、ある程度の緩和が得られる可能性がある。しかし、変形性関節症のさらに優れた治療法が依然として必要とされている。

本発明の実施形態は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）由来短鎖ペプチドを使用して変形性関節症を治療および／または予防するための方法に関する。本発明のいくつかの実施形態は、軟骨形成を促進するための方法に関する。

本発明の一態様は、変形性関節症を治療および／または予防するための医薬組成物または方法に関する。本発明の実施形態による方法は、それを必要とする対象に、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む医薬組成物を投与する工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３～１０６を含み、ＰＤＳＰの変異体は、ＰＤＳＰのセリン－９３、アラニン－９６、グルタミン－９８、イソロイシン－１０３、イソロイシン－１０４およびアルギニン－１０６を含み、他の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、残基位置番号は、ヒトＰＥＤＦでの残基位置番号に基づく。ＰＤＳＰは、配列番号１～７５のいずれか１つの配列の配列を含む。

本発明の一態様は、軟骨形成を促進するための医薬組成物または方法に関する。本発明の実施形態による方法は、多能性間葉系幹細胞と、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、またはＰＤＳＰの変異体を含む組成物とを接触させる工程を含み、ＰＤＳＰは、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）の残基９３～１０６を含み、ＰＤＳＰの変異体は、ＰＤＳＰのセリン－９３、アラニン－９６、グルタミン－９８、イソロイシン－１０３、イソロイシン－１０４およびアルギニン－１０６を含み、他の位置に１つ以上のアミノ酸置換を含み、残基位置番号は、ヒトＰＥＤＦでの残基位置番号に基づく。ＰＤＳＰは、配列番号１～７５のいずれか１つの配列の配列を含む。

本発明の他の態様は、以下の詳細な説明および添付の特許請求の範囲によって明らかになるであろう。

後肢重量負荷分布のＭＩＡ誘発性変化のラットモデルに対する２９量体およびヒアルロン酸の効果を示す。ラットの右（変形性関節症）膝に１ｍｇのモノヨードアセテート（ＭＩＡ）を注射し、左（対側対照）膝に生理食塩水を注射した。ＭＩＡ注射後８日目に、さらに２週間にわたり、２９量体および１％ＨＡ処置を行った。小動物用鎮痛評価装置（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅｔｅｓｔｅｒ）を使用して、後肢重量分布（重量負荷）の変化を評価した。示された値は、各処置群からの少なくとも３匹のラットからの平均±ＳＥを表す。＊Ｐ＜０．０５対未処置群。

ＭＩＡにより損傷した関節軟骨に対する２９量体ＰＤＳＰ（ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド）の効果の組織学的分析の結果を示す。ラットの膝関節にＭＩＡを１回注射した。ＭＩＡ注射後８日目に、さらに２週間にわたり、ビヒクル／ＨＡおよび２９量体／ＨＡ処置を行った。３つの独立した実験からの関節軟骨のＨ＆Ｅ染色切片の代表的な顕微鏡写真。Ｆ：大腿顆、Ｔ：脛骨顆、Ｍ：半月板。＊右パネルに、大腿脛骨関節、および外側脛骨軟骨の拡大図を示す。矢印は壊死した軟骨細胞を示す。

３週間にわたるラットＭＳＣの軟骨形成分化後のアルシアンブルー染色による、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）に富む細胞外マトリックスの半定量分析の結果を示す。１４日間にわたり様々な２９量体変異体（１０μＭ）を補充した軟骨形成分化培地中のＭＳＣ。微量質量の総ＤＮＡ含有量と比較して、塩化グアニジウムによって抽出されたアルシアンブルーのＯＤ値を示す。データは平均±ＳＥとして表す。ＯＤ値≦０．１６および０．２５をそれぞれ表す黒および灰色の列は、２９量体の軟骨形成促進活性を完全および部分的に損なう変異を示す。

後肢重量負荷分布のＭＩＡ誘発性変化のラットモデルに対する２９量体変異体の効果を示す。右（変形性関節症）膝に１ｍｇのＭＩＡが注射され、左（対側対照）膝に生理食塩水が注射されたラット。ＭＩＡ注射後８日目に、さらに２週間にわたり、２９量体／ＨＡ、２９量体変異体／ＨＡ、およびビヒクル／ＨＡ処置を行った。小動物用鎮痛評価装置を使用して、後肢重量負荷の変化を評価した。示された値は、各処置群からの少なくとも３匹のラットからの平均±ＳＥを表す。

損傷した関節軟骨における用量依存的なＰＤＳＰ誘発軟骨形成細胞増殖の結果を示す。（Ａ）上部パネル：２９量体処置後１４日目の細胞複製の組織学的分析。ＢｒｄＵにより標本を染色して、ＤＮＡ複製を示した（濃い茶色）。元の倍率、２００倍。下部パネル：二重免疫染色（ｄｕａｌ－ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｉｎｇ）によってアッセイされた関節軟骨内のＳｏｘ９（緑；軟骨細胞のマーカー）およびＢｒｄＵ（赤）の発現を示す代表的な写真。元の倍率、１０００倍。（Ｂ）評価された軟骨領域の視野当たりのＢｒｄＵ陽性細胞の数。＊Ｐ＜０．００１対ビヒクル／ＨＡ群。

ＭＩＡ誘発性ＯＡのラットモデルにおける損傷した関節軟骨に対する２９量体変異体の細胞分裂促進効果を示す。右（変形性関節症）膝に１ｍｇのＭＩＡが注射され、左（対側対照）膝に生理食塩水が注射されたラット。ＭＩＡ注射後８日目に、さらに２週間にわたり、２９量体／ＨＡ、２９量体変異体／ＨＡ、およびビヒクル／ＨＡ処置を行った。ＢｒｄＵにより膝関節を染色して、増殖細胞を同定した。膝関節切片の軟骨領域上の視野当たりのＢｒｄＵ陽性細胞を計数した（元の倍率１００倍）。各群のラット３匹を用いて、６つの切片／膝関節標本から総ＢｒｄＵ^＋細胞を評価した。

本発明の実施形態は、ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）を使用して変形性関節症を予防および／または治療するための方法に関する。本発明は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）に由来する特定の短鎖ペプチドが、間葉系細胞の分化を誘導して軟骨細胞を形成することにより、変形性関節症の疼痛を緩和し、関節軟骨の修復をもたらすことができるという予想外の発見に基づく。

変形性関節症は、滑膜関節の関節軟骨（ＡＣ）の破壊に起因する変性疾患である。もっとも、関節軟骨細胞の無血管性および静止性のために、ＡＣの自己治癒能力は限られている。正常な成熟軟骨は、胚発生中に間葉系細胞から分化する軟骨細胞を含む。正常な成熟軟骨に見られる唯一の細胞型である分化した軟骨細胞は、マトリックスの完全性を維持するのに十分な量の軟骨特異的細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を合成する。

ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）は、４１８個のアミノ酸を含み、分子量が約５０ｋＤａの分泌タンパク質である。ＰＥＤＦは、多くの生物学的機能を有する多機能タンパク質である（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００４７２１２号明細書を参照）。ＰＥＤＦの様々なペプチド領域が様々な機能に関与していることが見出されている。例えば、３４量体断片（ＰＥＤＦの残基４４～７７）は抗血管新生活性を有することが特定されており、４４量体断片（ＰＥＤＦの７８～１２１残基）は神経栄養特性を有することが特定されている。

本発明の発明者らは、ＰＥＤＦの特定の短鎖ペプチドが変形性関節症の疼痛を緩和することができることを発見した。さらに、これらのＰＤＳＰが軟骨再生を誘発する能力から疼痛軽減が生じることが発見された。本発明者らは、ＰＤＳＰが、軟骨細胞に分化するように、軟骨内または軟骨の周囲に存在する多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を誘導することができることを示した。すなわち、これらのＰＤＳＰは軟骨形成を促進することができる。これにより、軟骨の再生と疼痛の軽減とを誘発するＰＤＳＰの能力が説明される可能性がある。

上記のように、軟骨細胞への間葉系細胞の分化は、通常、胚発生で生じる。軟骨では、間葉系幹細胞はそれらの多能性を失い、増殖して軟骨形成細胞の密集した凝集体を形成し、次いで、軟骨形成細胞が軟骨芽細胞に分化し、軟骨芽細胞が軟骨細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を合成する。軟骨芽細胞は、通常は不活性であるが、条件によってはマトリックスをさらに分泌および分解することができる成熟した軟骨細胞になる。したがって、ＰＤＳＰが、軟骨内に軟骨細胞を産生するように（軟骨内または軟骨の周囲で）間葉系細胞を誘導することができるという発見は、全く予想外である。

本発明のＰＤＳＰは、ヒトＰＥＤＦ残基９３～１２１（^９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＳＳＰＤＩＨＧＴ^１２１；配列番号１）に対応するペプチド領域に基づく。本発明者らは、この２９量体に基づいて、セリン－９３、アラニン－９６、グルタミン－９８、イソロイシン－１０３、イソロイシン－１０４およびアルギニン－１０６が、これらの残基をアラニンにより（またはアラニン－９６をグリシンに）個別に置換した場合に活性が顕著に失われることから証明されるように、活性にとって重要であることを特定した。対照的に、２９量体内の他の残基のアラニン（またはグリシン）置換は活性を目に見えて変化させなかったことから、これらの他の残基（すなわち、残基９４、９５、９７、９９～１０２、１０５および１０７～１２１）にアミノ酸置換（特に、相同なアミノ酸置換）を有するＰＤＳＰ変異体も、変形性関節症を予防および／または治療するため、または軟骨形成を誘導するために使用することができることが示唆された。

これらの結果は、抗侵害受容効果を含むコアペプチドが、残基９３～１０６（^９３ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ^１０６；配列番号２）を含む領域にあることを示している。したがって、抗侵害受容活性を有する最短のＰＤＳＰペプチドは、１４量体であり得る。当業者であれば、Ｃ末端および／またはＮ末端でのこのコアペプチドに対する追加のアミノ酸の付加が、この活性に影響を与えないことを理解するであろう。すなわち、本発明のＰＤＳＰは、ヒトＰＥＤＦの残基９３～１０６を含む任意のペプチドであり得る。したがって、本発明のＰＤＳＰペプチドは、実験で使用された２９量体を含めて、１４量体、１５量体、１６量体などであり得る。

さらに、上記のように、これらの短鎖ペプチド内の置換は、重要な残基（セリン－９３、アラニン－９６、グルタミン－９８、イソロイシン－１０３、イソロイシン－１０４およびアルギニン－１０６）が保存されている限り、活性を保持することができる。さらに、マウス変異体（ヒトの配列と比較して、ヒスチジン－９８およびバリン－１０３の２つの置換を有する）も活性である。対応するマウス配列は、ｍｏ－２９量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲＡＬＹＹＤＬＩＴＮＰＤＩＨＳＴ、配列番号３）およびｍｏ－１４量体（ＳＬＧＡＥＨＲＴＥＳＶＩＨＲ、配列番号４）である。したがって、活性コアの一般的な配列は（^９３Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ^１０６（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）；配列番号５）である。

本発明のＰＤＳＰペプチドは、タンパク質／ペプチド発現系を使用して化学的に合成または発現され得る。これらのＰＤＳＰペプチドは、変形性関節症の予防および／または治療のための医薬組成物に使用され得る。医薬組成物は、任意の薬学的に許容される賦形剤を含み得、医薬組成物は、局所投与、経口投与、注射などの投与に適した形態で製剤化され得る。そのような用途のための様々な製剤は、当技術分野で知られており、本発明の実施形態とともに使用することができる。

本発明のいくつかの実施形態は、対象（例えば、ヒト、ペットまたは他の対象）の変形性関節症を治療および／または予防するための方法に関する。本明細書で使用される場合、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」または「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、状態の部分的または全体的な改善を含み、これは、全体的な治癒を含む場合も含まない場合もある。方法は、対象に医薬組成物を投与する工程を含み得、医薬組成物は、本発明のＰＤＳＰ（ＰＤＳＰの活性変異体を含む）の有効量を含む。当業者であれば、有効量が対象の状態（例えば、体重、年齢など）、投与経路、および他の因子に依存することを理解するであろう。そのような有効量を見出すことは、常用的な技術のみを伴い、当業者であれば、有効量を見出すために発明の努力または過度の実験を必要としないであろう。

本発明の実施形態は、以下の特定の実施例により説明される。特定の実施例では、２９量体（配列番号１）が使用される。ただし、他のＰＤＳＰ（例えば、１４量体、配列番号２または配列番号３など）もまた、同じ結果を達成するために使用することができる。当業者であれば、これらの実施例は例示のみを目的としており、本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正が可能であることを理解するであろう。

材料および方法
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２５％トリプシンおよび抗生物質をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ヒアルロン酸（ＨＡ）、モノヨードアセテート（ＭＩＡ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｐｅｒｃｏｌｌ、インスリン、ヒドロコルチゾン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、ヘキスト３３２５８色素およびアルシアンブルー８－ＧＸはいずれもＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。抗ＢｒｄＵ抗体および抗ＳＯＸ９抗体をＧｅｎｅＴｅｘ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から入手した。蛍光色素コンジュゲート二次抗体はいずれも、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）色素をＭｅｒｃｋ（Ｒａｙｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）から購入した。合成ＰＥＤＦペプチドを合成し、安定性のためにＮＨ_２末端でのアセチル化および／またはＣＯＯＨ末端でのアミド化により修飾した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）での質量分析（＞９５％純度）により、合成ＰＥＤＦペプチドを特性評価した。ＤＭＳＯ中でストック（５ｍＭ）として、各ＰＥＤＦ由来合成ペプチドを再構成した。

温度制御（２４～２５℃）および１２：１２の明暗サイクルの下で、本試験に使用した全動物を動物室に収容した。標準的な飼料および水道水を自由に摂取させた。実験手順は、ＭａｃｋａｙＭｅｍｏｒｉａｌＨｏｓｐｉｔａｌＲｅｖｉｅｗＢｏａｒｄ（ＮｅｗＴａｉｐｅｉＣｉｔｙ，Ｔａｉｗａｎ，Ｒ．Ｏ．Ｃ．）によって承認され、台湾の国家動物福祉規制に準拠して実施した。

変形性関節症動物モデルおよび処置
キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、成体の１０週齢のオスのスプラーグドーリーラット（初期体重＝３１２±１１ｇ）を麻酔した。その後、２５μｌの滅菌生理食塩水中の１ｍｇのＭＩＡを単回関節内注射して、それぞれ右膝を処置した。膝で９０°の角度で脚を曲げた状態で２７Ｇ針を使用して、膝蓋靭帯から溶液を注射した。ＭＩＡ注射の７日後、マウスを異なる実験群に無作為に割り当てた（ｎ≧３、各群）。ＭＩＡ誘発性ＯＡのラットモデルの処置では、２５μｌの１％ＨＡにＰＤＳＰペプチドを溶解し、ビヒクル／ＨＡ対照としてペプチド溶媒ＤＭＳＯを使用した。

後肢重量分布の変化の評価
変形性関節症の膝の関節不快感の指標として、右（変形性関節症）肢と左（対側対照）肢との間の後肢重量分布の変化を使用した。以前に記載されたように（Ｂｏｖｅｅｔａｌ．，Ｗｅｉｇｈｔｂｅａｒｉｎｇａｓａｍｅａｓｕｒｅｏｆｄｉｓｅａｓｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎａｍｏｄｅｌｏｆｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ．ＯｓｔｅｏａｒｔｈＣａｒｔ．，２００３；１１：８２１－８３０）、後肢重量分布を決定するために、小動物用鎮痛評価装置を使用した。各後肢が別個のフォースプレート上に置かれるように配置された角度の付いたプレキシガラスチャンバーにラットを置いた。各後肢によって加えられる力（グラム単位で測定）を５秒間にわたり平均する。各データポイントは、５秒の読み取り値３つの平均である。評価装置に加えられた重量（ｇ）の量の左肢と右肢との間の差を決定することによって、後肢重量分布の変化を計算した。結果は、以下の式を使用して計算されるように、左（対側対照）肢と右（変形性関節症）肢との間の重量負荷の差として、またはベースライン読み取り値と処置後の読み取り値との間のパーセント差として表される。
（１－（処置群の平均Δ重量／ビヒクル群の平均Δ重量））×（１００）

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の単離および培養
キシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射によって、成体の８週齢のオスのスプラーグドーリーラットを麻酔した。その後、大腿骨を無菌的に採取し、ＰＢＳと抗生物質との混合物で５分間洗浄した後、全軟組織からそれらを解剖し、骨端で切除し、ヘパリン（ＡＧＧＬＵＴＥＸＩＮＪ５０００Ｕ／ＭＬ５ＭＬ；作業濃度１００Ｕ／ｍｌ）とＤＭＥＭとの混合物を用いて、骨髄腔を繰り返しすすいだ。採取した細胞を収集し、ピペッティングにより分散し、１０００×ｇで５分間室温で遠心分離した。ＤＭＥＭにより細胞ペレットを再懸濁し、次いで、５ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ（１．０７３ｇ／ｍｌ）を含む１５ｍｌの遠心分離管に細胞懸濁液を移した。１５００×ｇで３０分間遠心分離した後、中間層内の単核細胞を得、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで、１０％熱不活化ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含む低グルコースＤＭＥＭ中に懸濁した。次いで、７５ｃｍ^２フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＭＡ，ＵＳＡ）に細胞を入れ、９５％空気および５％ＣＯ_２とともに３７℃でインキュベートした。培地は４日ごとに交換した。未付着細胞を廃棄し、付着細胞を保持した。初代ＭＳＣは、１週間の培養後に約８０％～約９０％のコンフルエンスまで増殖した。

ＭＳＣの軟骨形成分化
９６ウェルプレートの各ウェルに５×１０^３の増殖ＭＳＣを入れ、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β３（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）および１０μＭのＰＤＳＰペプチドを補充した１５０μｌの軟骨形成培地（１００ｎＭのデキサメタゾン、０．１７ｍＭのアスコルビン酸－２リン酸、１０μｇ／ｍｌのインスリン、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌのセレン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、２ｍＭのＬ－グルタミンおよび２％ＦＢＳを含む高グルコースＤＭＥＭ）に曝露した。３日ごとに培地を交換し、細胞を２週間培養した。

膝関節の組織学的検査
膝関節を解剖し、周囲の軟組織を除去した。４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）溶液中に標本を固定し、次いで、ＳｈａｎｄｏｎＴＢＤ－２脱灰液（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）により脱灰した。次いで、関節を正中矢状面で切断し、パラフィンブロックに包埋した。切片（厚さ５μｍ）を縦方向に切断し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて染色するか、免疫組織化学的検査に使用した。最も重度に変性した領域を含むように、膝１個当たり２０切片を注意深く調製した。

ＤＮＡ合成のインビボ検出
細胞増殖を検出するために、ＤＭＳＯ中でストック（８０ｍＭ）としてＢｒｄＵを再構成した。７日間にわたるＭＩＡ注射後１、４および８日目に（すなわち、ＭＩＡ注射後７日目を０日目として設定）、３５０μｌのＰＢＳと混合した１５０μｌのＢｒｄＵをラットに腹腔内注射した。抗ＢｒｄＵ抗体を用いて検出されたＢｒｄＵ標識によって、ＤＮＡ合成を評価した。

免疫蛍光法およびＢｒｄＵ染色
インビボでのＤＮＡ合成を検出するために、パラフィン包埋した関節標本をキシレン中で脱パラフィンし、段階的な一連のエタノール中で再水和し、次いで、その後の免疫組織化学的検査のために室温で１ＮＨＣｌに１時間曝露した。次いで、１０％ヤギ血清および５％ＢＳＡを用いて、組織切片を１時間ブロックした。ＳＯＸ９（１：１００希釈）およびＢｒｄＵ（１：１００希釈）に対する一次抗体を使用して免疫染色を３７°Ｃで２時間行い、続いて適切なローダミンコンジュゲートロバＩｇＧまたはＦＩＴＣコンジュゲートロバＩｇＧと室温で１時間インキュベートした。ヘキスト３３２５８を用いて７分間対比染色することによって、核の位置を特定した。画像は、ＣＣＤカメラを備えたＺｅｉｓｓ落射蛍光顕微鏡を使用して取得し、各試料中の無作為に選択された２０の領域から測定し、各切片内を手動で計数することによってブラインド定量を３連で行った。

また、１０％ヤギ血清を用いて、脱パラフィンした膝関節標本を６０分間ブロックし、次いで、ＢｒｄＵに対する抗体とインキュベートした。続いて、スライドを適切なペルオキシダーゼ標識ヤギ免疫グロブリン（１：５００希釈；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）と２０分間インキュベートし、次いで、色素原基質（３，３’－ジアミノベンジジン）と２分間インキュベートした後、ヘマトキシリンを用いて対比染色した。

アルシアンブルー染色および定量
以前に記載されたように（ＪｉＹ．Ｈ．ｅｔａｌ．，ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＣ３Ｈ１０Ｔ１／２ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｂｙｉＴＲＡＱｌａｂｅｌｉｎｇｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｏｎ－ｌｉｎｅｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌＬＣ／ＭＳ／ＭＳ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍ．，２０１０，９（３）：５５０－５６４．）、アルシアンブルー染色では、ＰＢＳを用いて培養物を２回リンスし、４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド中に１５分間固定した後、１％（ｗ／ｖ）アルシアンブルー８－ＧＸ（Ｓｉｇｍａ）の０．１ＮＨＣｌ（ｐＨ１．０）溶液中で一晩インキュベートした。半定量分析のために、６ＭグアニジンＨＣｌを用いて、アルシアンブルー染色培養物を室温で２時間かけて抽出した。マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で６５０ｎｍで、抽出された色素の吸収を測定した。ＤＮＡ含有量を測定するために、抽出物１００μＬと、０．７μｇ／ｍｌのヘキスト３３２５８（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の水溶液１００μＬとを混合した。Ｅｘ／Ｅｍ：３４０ｎｍ／４６５ｎｍで蛍光を読み取り、認定された子牛胸腺超音波処理ＤＮＡ標準（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の蛍光と比較した。

統計
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。統計的比較に一元配置分散分析を使用した。特に指定がない限り、Ｐ＜０．０５が有意であると考えられた。

ＰＤＳＰは、ＯＡ動物の関節不快感を改善する抗侵害受容効果を示す
変形性膝関節症（ＯＡ）は、関節軟骨の喪失を特徴とする一般的な慢性変性疾患である。齧歯類の大腿脛骨関節腔に解糖の阻害剤であるＭＩＡを注射すると、ヒトＯＡに認められるのと同様のＡＣの喪失が誘発されることが報告されている（Ｂｏｖｅｅｔａｌ．，２００３）。さらに、ラットの膝関節にＭＩＡを注射すると、ＭＩＡを注射した肢からの後肢重量負荷移動によって定義される関節不快感が用量依存的かつ時間依存的に増加することが確立されている。

ＰＤＳＰ（ＰＥＤＦ短鎖ペプチド）が関節不快感を改善する抗侵害受容効果を有するかどうかを検討するために、１０週齢のオスのスプラーグドーリーラット（ｎ＝１５）の右関節に１ｍｇのＭＩＡ（２５μｌの滅菌生理食塩水に溶解された）を関節内注射して最大の重量移動（右脚から左脚）を誘発し、次いで、２９量体ＰＤＳＰ（配列番号１）の薬理学的反応を検討するためにこれを使用した。７日間にわたるＭＩＡ注射後（０日目として設定）、４つの実験群（ｎ＝３、各群）にマウスを無作為に割り当て、以下のようにさらに１４日間処置した：（Ｉ）ＰＤＳＰビヒクルと混合した２５μｌの１％ヒアルロン酸中に分解させたＰＤＳＰビヒクル、（ＩＩ）ＰＤＳＰ２９量体／ＨＡ（最終濃度０．２ｍＭＰＤＳＰ、１％ＨＡ）、（ＩＩＩ）ＰＤＳＰ２９量体単独（ボーラス）。１、４、８および１２日目に１回（週に２回）、単回の関節内注射によって処置を適用した。処置頻度を減らして治療効果を試験するために、１日目に１回および８日目に１回（すなわち、週に１回）、第ＩＶ群（２９量体／ＨＡ）に関節内注射した。

図１に示すように、結果は、２９量体ＰＤＳＰ処置が、ビヒクル／ＨＡ群と比較して、ＭＩＡ誘発性重量移動を有意に減少させたことを明らかにした（第ＩＩ群および第ＩＶ群対第Ｉ群：６３．３±１２．５％および５８．１±４．６％対７５．９±４．７％；Ｐ＜０．０５）。他方、ボーラス注射群は、後肢重量負荷分布のＭＩＡ誘発性変化を減少させることができなかった（７７．２±１．２％）。これらの結果は、ヒアルロン酸と組み合わせた２９量体ＰＤＳＰが、ラットのＭＩＡ誘発性関節不快感に対して抗侵害受容効果を示すことを示している。２９量体ＰＤＳＰボーラス注射の結果はまた、ヒアルロン酸の非存在下では、２９量体ＰＤＳＰが体循環に急速に漏出し得ることも意味する。

ＭＩＡを注射したラットの膝関節は、ＭＩＡ処置後７日目に迅速かつ再現性のある様式で広範囲な軟骨細胞の変性／壊死を引き起こし得ることが確立されている。したがって、本発明者らはさらに、ビヒクル／ＨＡ処置群および２９量体／ＨＡ処置群のラットにおける大腿脛骨関節の組織病理学的特徴を検討した。

図２に示すように、ビヒクル／ＨＡ処置群では、外側脛骨で軟骨の完全性の喪失と軟骨下骨の崩壊とが示されたが、２９量体／ＨＡ処置群では良好な表面連続性が明らかにされた。顕微鏡的には、ビヒクル／ＨＡ処置群では、軟骨細胞が軟骨の表面領域から失われ、散在する細胞クラスターが移行領域および放射状領域で広範囲に発生したことが示された。対照的に、２９量体／ＨＡ処置群では、新たに生成された多数の軟骨細胞が軟骨全体を占めていることが示された。組織学的データは、軟骨再生を誘導する２９量体ＰＤＳＰの能力が、ＯＡの疼痛の軽減に部分的に関与している可能性があることを示唆している。

２９量体は、インビボでＭＳＣの軟骨形成活性と軟骨形成細胞増殖とを促進する
多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の軟骨形成能により、多能性間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、軟骨欠損の、細胞に基づく治療のための有望な供給源になる（Ｍ．Ｆ．Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒｅｔａｌ．，１９９９，Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｏｆａｄｕｌｔｈｕｍａｎｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８４（５４１１）：１４３－７）。さらに、軟骨損傷に応答する常在性ＭＳＣは、軟骨治癒のために軟骨形成分化を受けるように誘導される可能性がある（Ｔ．Ｂ．Ｋｕｒｔｈｅｔａｌ．，２０１１，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｎｉｃｈｅｓｉｎａｄｕｌｔｍｏｕｓｅｋｎｅｅｊｏｉｎｔｓｙｎｏｖｉｕｍｉｎｖｉｖｏ，ＡｒｔｈｒｉｔｉｓＲｈｅｕｍ．，６３（５）：１２８９－３００）。培養では、本発明者らのデータは、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）由来短鎖ペプチド（２９量体；位置Ｓｅｒ９３～Ｔｈｒ１２１）が、１００ｎＭのデキサメタゾンと１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ－β３とを含有する限定培地の存在下で、ＭＳＣに対してインビトロで軟骨形成促進活性を示すことを示した。

単一のアラニンまたはグリシンの変化を伴う２９量体ＰＤＳＰのアラニンスキャンデータ
この試験では、２９量体配列に沿ったアラニンまたはグリシンへの単一残基の置換を設計および合成して、軟骨形成促進活性について２９量体内の重要な残基を分析した。９３～１２１に位置するＰＥＤＦのアミノ酸配列に基づいて、そのうち２７個の変異体は単一のアラニン変化を伴い、２個の変異体は単一のグリシン変化を伴う（Ａ９６ＧおよびＡ１０７Ｇ）合計２９個のペプチド変異体を合成した。デキサメタゾン、ＴＧＦ－β３および２９量体変異体により処理された培養物中のラットＭＳＣの軟骨形成を評価するために、アルシアンブルー染色によって、成熟軟骨細胞のマーカーであるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の発現レベルを検出した。

図３に示すように、１０μＭの２９量体変異体に限定培地（デキサメタゾンおよびＴＧＦ－β３を含有する）中のＭＳＣを２１日間曝露した後、アルシアンブルー染色を使用して硫酸化ＧＡＧを分析した。結果は、ＯＤ６５０ｎｍでアルシアンブルー陽性物質を定量することによって証明されるように、ＤＭＳＯ溶媒対照と比較して、２９量体ＰＤＳＰにより処理されたＭＳＣの培養物では、染色強度の明らかな増加を示した（０．３４±０．０１３対０．１５±０．０２４）。また、結果から、Ｓ９３Ａ（０．１２±０．０１５）、Ａ９６Ｇ（０．１４±０．０２３）、Ｑ９８Ａ（０．１４±０．０１７）、Ｉ１０３Ａ（０．１５±０．０１３）、Ｉ１０４Ａ（０．１５±０．０２７％）およびＲ１０６Ａ（０．１６±０．０２９）の変異が、ＭＳＣに対する２９量体ＰＤＳＰの軟骨形成促進活性を著しく損なったことが明らかにされた（０．１２～０．１６対０．３４）。これらの結果は、２９個のアミノ酸のうち６個が２９量体の活性に重要であり得ることを示唆している。

さらに、Ｌ９４Ａ（０．２２±０．０３２）、Ｅ９７Ａ（０．２５±０．０２３）、Ｒ９９Ａ（０．２±０．０２）、Ａ１０７Ｇ（０．２３±０．０３５）およびＰ１１６Ａ（０．２３±０．０２９）の変異により、２９量体ＰＤＳＰの軟骨形成促進活性が部分的に低下した（Ｏ．Ｄ．０．２～０．２５対０．３４）。残りの置換は、２９量体ＰＤＳＰの軟骨形成促進活性に実質的に影響を与えなかった（Ｏ．Ｄ．＞０．２６）。

まとめると、アラニンスキャンデータは、ＭＳＣに対する２９量体（配列番号１）の軟骨形成促進効果がアミノ酸置換によって影響を受け、コアペプチドが１４量体（配列番号２）であることを示している。さらに、ＭＳＣ軟骨形成分化を誘導することに関して、その機能に影響を与えることなく、位置９３、９６、９８、１０３、１０４および１０６の２９量体ＰＤＳＰを置換することはできない。一方、２９量体ＰＤＳＰ配列の残りのアミノ酸残基は、２９量体ＰＤＳＰ機能に影響を与えることなく、単一のアミノ酸置換に関して比較的大きな柔軟性を示した。したがって、最小コアペプチドは、^９３Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ^１０６（Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）（配列番号５）として表され得る。本発明の実施形態とともに使用され得るＰＤＳＰ配列のいくつかの例を以下の表に示す（位置の番号付けは１４量体の位置に基づく）。これらの例は、限定することを意図したものではない。

実験的ＯＡのラットモデルに対する２９量体変異体の効果
ＭＩＡ誘発性後肢重量負荷移動に対する２９量体ＰＤＳＰ変異体の抗侵害受容効果
動物試験では、最終濃度０．２ｍＭになるように、２９量体ＰＤＳＰ変異体を１％ＨＡに配合し、次いで、ＭＩＡ注射後１日目および８日目にそれぞれ単回の関節内注射により適用した。１４日間の２９量体変異体処置後、小動物用鎮痛評価装置を用いて、ＭＩＡ誘発性後肢重量負荷移動に対する２９量体変異体の抗侵害受容効果（１群当たりｎ＝３）を評価した。

図４に示すように、２９量体／ＨＡ処置は、ビヒクル／ＨＡ処置群と比較して、ＭＩＡ誘発性重量負荷移動を有意に減少させた（２２．０±０．６６％対４７．１±３．７％；Ｐ＜０．０００４）。また、Ｈ１０５Ａ変異体も、ＭＩＡ誘発性重量移動を減少させることができた（２１．４±１．４％）。重要なことに、Ｓ９３Ａ、Ａ９６Ｇ、Ｑ９８Ａ、Ｉ１０３Ａ、Ｉ１０４ＡおよびＲ１０６Ａ変異体による処置は、ＭＩＡ誘発性後肢重量負荷移動の減少に影響を与えなかった（４５～５１％の値）。動物試験の結果は、これらの重要な残基が、２９量体ＰＤＳＰの抗侵害受容効果を維持する上で重要な役割を果たし、重要でない部位での置換がＰＤＳＰの活性に影響を与えないことを裏付けている。

Ｓｏｘ９陽性軟骨細胞増殖に対する２９量体変異体の効果
０．２ｍＭの２９量体／ＨＡにより処置した直後に細胞増殖をモニタリングするために、７日間にわたるＭＩＡ注射後（０日目として設定）１日目にＢｒｄＵ処置を開始した。図５Ａ（上部パネル）に示すように、２９量体／ＨＡ処置群では、ほぼすべての再生軟骨様組織にＢｒｄＵ陽性細胞が含まれている。しかし、ビヒクル／ＨＡにより処置した膝の軟骨表面にはＢｒｄＵ陽性細胞がほとんどなく、ほぼすべての軟骨細胞がＭＩＡ処置後に壊死性細胞死する運命にあることを示している。

転写因子Ｓｏｘ９は、軟骨細胞特異的遺伝子の発現を誘導することにより、幹細胞／前駆細胞軟骨形成に重要な役割を果たす。Ｓｏｘ９の免疫染色により、ＢｒｄＵ陽性細胞はＳｏｘ９陽性でもあることが見出され、ＢｒｄＵ陽性細胞が軟骨細胞発生に向けて２９量体により潜在的に誘導されることが示された（図５Ａ；下部パネル）。０．２ｍＭの２９量体処置は、再生軟骨では、ビヒクル／ＨＡ処置と比較して、ＢｒｄＵ陽性軟骨細胞の増殖を誘発する有意な能力を示した（図５Ｂ；３４６±５７対７±３；Ｐ＜０．００１）。まとめると、これらの結果は、２９量体が軟骨形成細胞の増殖を誘発して軟骨を治癒させることができることを示している。

次に、１４日間にわたる２９量体処置の後、関節軟骨に対して細胞増殖を誘発する２９量体変異体の能力を検討した。膝関節のＢｒｄＵ免疫染色により、２９量体／ＨＡ処置群およびＨ１０５Ａ／ＨＡ処置群の軟骨領域では多数のＢｒｄＵ陽性細胞が検出可能であったのに対して、ビヒクル／ＨＡ処置の軟骨領域ではＢｒｄＵ陽性細胞が少なかったことが明らかにされた（図６；３４６±５７および２９７±２２対７±３）。一方、Ｓ９３Ａ、Ａ９６Ｇ、Ｑ９８Ａ、Ｉ１０３Ａ、Ｉ１０４ＡおよびＲ１０６Ａによる処置では、軟骨のＢｒｄＵ陽性細胞は増加しなかった（３０～６２の値）。この動物試験により、これらの重要な残基が２９量体ＰＤＳＰの生物学的活性の維持に重要な役割を果たすことが確認された。

まとめると、アラニンスキャンデータは、変形性関節症のラットモデルによって証明されるように、２９量体の治療効果が、選択されたアミノ酸置換によって影響を受けることを示している。さらに、ＯＡ治療では、位置Ｓ９３、Ａ９６、Ｑ９８、Ｉ１０３、Ｉ１０４およびＲ１０６の２９量体残基は、２９量体ＰＤＳＰの活性にとって重要であるが、他の残基は、活性に重大な影響を与えることなく置換することができる。

本発明の実施形態は、限られた数の例を用いて説明されている。当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、変更および修正が可能であることを理解するであろう。したがって、本発明の範囲は、付随する特許請求の範囲によってのみ限定されるべきである。

Claims

ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、または前記ＰＤＳＰの変異体を含む、変形性関節症の治療および／または予防に使用するための医薬組成物であって、
前記ＰＤＳＰ、または前記ＰＤＳＰの変異体が、１４－２９アミノ酸長を有し、Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ（配列番号５）の配列からなるヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）由来コアペプチドフラグメントを有し、前記ＰＥＤＦ由来コアペプチドフラグメントのＣ末端及びＮ末端のいずれか又は両方にはＰＥＤＦに由来しない延長部分が付加してもよい、
医薬組成物。
前記ＰＥＤＦ由来コアペプチドフラグメントが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）の配列からなる
請求項１に記載の医薬組成物。
前記ＰＥＤＦ由来コアペプチドフラグメントが、配列番号６～７５のいずれか１つの配列の配列からなる
請求項１に記載の医薬組成物。
ＰＥＤＦ由来短鎖ペプチド（ＰＤＳＰ）、または前記ＰＤＳＰの変異体を含む、軟骨形成を促進するための医薬組成物であって、
前記ＰＤＳＰ、または前記ＰＤＳＰの変異体が、１４－２９アミノ酸長を有し、Ｓ－Ｘ－Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｑ／Ｈ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｘ－Ｉ／Ｖ－Ｉ－Ｘ－Ｒ（配列番号５）の配列からなるヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）由来コアペプチドフラグメントを有し、前記ＰＥＤＦ由来コアペプチドフラグメントのＣ末端及びＮ末端のいずれか又は両方にはＰＥＤＦに由来しない延長部分が付加してもよい、
医薬組成物。
前記ＰＥＤＦ由来コアペプチドフラグメントが、ＳＬＧＡＥＱＲＴＥＳＩＩＨＲ（配列番号２）の配列からなる
請求項４に記載の医薬組成物。
前記ＰＥＤＦ由来コアペプチドフラグメントが、配列番号６～７５のいずれか１つの配列の配列からなる
請求項４に記載の医薬組成物。