JP7681886B2 - Polymers, water-insoluble resin particles, medical materials, materials for biochemical experiments, and immobilized biologically active substances - Google Patents
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Description
本発明は、重合体、水不溶性樹脂粒子、医療用素材、生化学実験用素材及び固定化生理活性物質に関する。 The present invention relates to polymers, water-insoluble resin particles, medical materials, materials for biochemical experiments, and immobilized physiologically active substances.
バイオマテリアルとは，一般に医療やバイオテクノロジー分野に用いられる材料の総称であり，生体の構成要素である生体物質，細胞，組織などと接触させ，診断や治療あるいは生体の損傷部の補助や置換を行うために用いられる材料や、酵素等の生体物質を検査での使用において使用しやすいように固定するための担体、生体物質に対して蛍光を付与するための蛍光物質など、多岐にわたるものが公知であり、種々の目的で使用されている。さらに、これらの物質においては、生化学分野における研究開発において使用することもある。 Biomaterials is a general term for materials generally used in the fields of medicine and biotechnology. A wide variety of biomaterials are known and used for a variety of purposes, including materials that are brought into contact with biological substances, cells, tissues, and other components of living organisms, and are used for diagnosis, treatment, or to assist or replace damaged areas of the organism, carriers for immobilizing biological substances such as enzymes so that they can be easily used in testing, and fluorescent substances for imparting fluorescence to biological substances. Furthermore, these substances are also used in research and development in the field of biochemistry.
このような用途において、有機合成によって得られた素材は多く存在する。このようなバイオマテリアルは、通常の樹脂等とは異なり、物理的性質や化学的性質のみではなく、生体との相互作用や生体適合性等の生物学的な性質が要求されている。したがって、一般的な樹脂分野とは異なる分子設計が必要となる。 For such applications, there are many materials obtained through organic synthesis. Unlike ordinary resins, these biomaterials are required to have not only physical and chemical properties, but also biological properties such as interaction with living organisms and biocompatibility. Therefore, molecular design different from that used in the general resin field is required.
例えば、人工臓器や医療器具などは、本来生体を構成する物質と適合し、かつ汚損しにくい材料で作製されることが望ましい。生体系は、人工材料など外的なものと接触した場合、当該人工材料を異物として認識するため、時間の経過に伴い血栓形成、免疫反応、炎症反応など様々な異物反応が引き起こされる。そのため、人工臓器などの医療用器具を用いる場合、ヘパリンなどの抗血液凝固剤、免疫抑制剤のような薬剤を併用しなければならない。ところが、上記抗血液凝固剤等を使用した場合には、肝臓障害、アレルギー反応などの様々な副反応を生じるおそれがある。 For example, it is desirable for artificial organs and medical devices to be made from materials that are compatible with the substances that make up the living body and that are not easily stained. When a living system comes into contact with an external object such as an artificial material, it recognizes the artificial material as a foreign body, and various foreign body reactions such as blood clot formation, immune reactions, and inflammatory reactions are induced over time. For this reason, when using medical devices such as artificial organs, drugs such as anticoagulants such as heparin and immunosuppressants must be used in combination. However, the use of the above-mentioned anticoagulants and the like can cause various side effects such as liver damage and allergic reactions.
検査用の素材においては、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等と結合する官能基を有する化合物がしばしば使用されている。バイオマテリアルをこれらの生活性化合物と結合させることで、検査・研究等の種々の目的で使用される。このような結合を生じさせる官能基として具体的には、エポキシ基を有する化合物等が使用されることが多いが、カーボナート基を有する重合体に酵素を固定化することも検討されている（非特許文献１，２）。 In materials for testing, compounds with functional groups that bind to proteins, peptides, amino acids, etc. are often used. Biomaterials can be used for various purposes such as testing and research by binding to these bioactive compounds. Specifically, compounds with epoxy groups are often used as functional groups that create such bonds, but immobilizing enzymes on polymers with carbonate groups has also been considered (Non-Patent Documents 1 and 2).
一方、グリセリンカーボネート（メタ）アクリレートは、樹脂原料として開発され、検討されている（特許文献１、２等）。しかし上述したような医療用素材としては検討されていない。 On the other hand, glycerin carbonate (meth)acrylate has been developed and studied as a resin raw material (Patent Documents 1 and 2, etc.). However, it has not been studied as a medical material as mentioned above.
本発明は、上記に鑑み、医療用素材及び生化学実験用素材等のバイオマテリアルとして使用できる新規な重合体を得ることを目的とするものである。 In view of the above, the present invention aims to obtain a novel polymer that can be used as a biomaterial, such as a medical material or a material for biochemical experiments.
本発明は、
グリセリンカーボネート（メタ）アクリレートに由来する構造（Ａ）並びに
スルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基からなる群より選択される少なくとも１の官能基（Ｂ－１）及び（メタ）アクリロイル基及び／又はＮ－（メタ）アクリロイルアミド基（Ｂ－２）
を有する化合物に由来する構造（Ｂ）
を必須の構成単位とすることを特徴とする重合体である。
The present invention relates to
A structure (A) derived from glycerin carbonate (meth)acrylate, and at least one functional group (B-1) selected from the group consisting of a sulfobetaine group, a carbobetaine group, and a phosphobetaine group, and a (meth)acryloyl group and/or an N-(meth)acryloylamide group (B-2).
Structure (B) derived from a compound having the formula
The polymer is characterized in that it contains the following as an essential structural unit.
構造（Ｂ）は、スルホプロピルベタイン（メタ）アクリレートに由来する構造であることが好ましい。
上記重合体は、水不溶性の樹脂粒子であることが好ましい。
本発明は、水不溶性の樹脂粒子からなる基材粒子及び当該基材粒子上に形成された上記重合体を含有する被覆層からなることを特徴とする水不溶性樹脂粒子でもある。
The structure (B) is preferably a structure derived from sulfopropyl betaine (meth)acrylate.
The polymer is preferably in the form of water-insoluble resin particles.
The present invention also relates to water-insoluble resin particles comprising a base particle made of a water-insoluble resin particle and a coating layer containing the above-mentioned polymer formed on the base particle.
本発明は、上記重合体及び／又は上記水不溶性樹脂粒子からなることを特徴とする医療用素材でもある。
本発明は、上記重合体及び／又は上記水不溶性樹脂粒子からなることを特徴とする生化学実験用素材でもある。
本発明は、上記重合体及び／又は上記水不溶性樹脂粒子に生理活性物質を固定化したものであることを特徴とする固定化生理活性物質でもある。
The present invention also relates to a medical material comprising the above polymer and/or the above water-insoluble resin particles.
The present invention also relates to a material for biochemical experiments, which comprises the above polymer and/or the above water-insoluble resin particles.
The present invention also relates to an immobilized physiologically active substance characterized in that the immobilized physiologically active substance is obtained by immobilizing the above-mentioned polymer and/or the above-mentioned water-insoluble resin particles.
本発明の重合体は、グリセリンカーボネート（メタ）アクリレートに由来する構造（Ａ）並びにスルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基からなる群より選択される少なくとも１の官能基（Ｂ－１）、及び、（メタ）アクリロイル基及び／又はＮ－（メタ）アクリロイルアミド基（Ｂ－２）を有する化合物（ｂ）に由来する構造（Ｂ）
を必須の構成単位とするものである。
The polymer of the present invention comprises a structure (A) derived from glycerin carbonate (meth)acrylate, and a structure (B) derived from a compound (b) having at least one functional group (B-1) selected from the group consisting of a sulfobetaine group, a carbobetaine group, and a phosphobetaine group, and a (meth)acryloyl group and/or an N-(meth)acryloylamide group (B-2).
is an essential constituent unit.
グリセリンカーボネート（メタ）アクリレートは、塗料やパターン形成用組成物等の用途における検討が行われているが、医療用素材や生化学実験用素材等のバイオマテリアルとしての検討は行われていない。一方、非特許文献１，２にも開示されているように、環状カーボネート基は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸中のアミノ基との反応を生じる。そして、酵素・抗体のアミノ基とカーボネート基との反応性は、対エポキシ基よりも高く、高い固定化量を得ることができる。さらに、生理活性物質を固定化した場合、固定化された生理活性物質の活性を高く維持することができる。この点で、バイオマテリアルとして優れた性能を有する。 Glycerol carbonate (meth)acrylate has been studied for applications such as paints and pattern-forming compositions, but has not been studied as a biomaterial such as a medical material or a material for biochemical experiments. On the other hand, as disclosed in Non-Patent Documents 1 and 2, cyclic carbonate groups react with amino groups in proteins, peptides, and amino acids. The reactivity of amino groups in enzymes and antibodies with carbonate groups is higher than that with epoxy groups, and a high immobilization amount can be obtained. Furthermore, when a physiologically active substance is immobilized, the activity of the immobilized physiologically active substance can be maintained at a high level. In this respect, it has excellent performance as a biomaterial.
さらに、環状カーボネート基を有する重合体を使用する場合、生体適合性を有する素材を使用することが望まれる。このため、本発明者らは、生体適合性を向上させることができる成分である、スルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基からなる群より選択される少なくとも１の官能基及び（メタ）アクリロイル基を有する化合物（ｂ）に由来する構造単位も必須単位とするものである。これによって、幅広い用途において使用することができる、医療用素材及び生化学実験用素材を得ることができる。 Furthermore, when using a polymer having a cyclic carbonate group, it is desirable to use a material having biocompatibility. For this reason, the present inventors have also included, as an essential unit, a structural unit derived from compound (b) having at least one functional group selected from the group consisting of a sulfobetaine group, a carbobetaine group, and a phosphobetaine group, and a (meth)acryloyl group, which is a component capable of improving biocompatibility. This makes it possible to obtain medical materials and materials for biochemical experiments that can be used in a wide range of applications.
上記グリセリンカーボネート（メタ）アクリレートは、下記一般式（１）で表される化学構造を有するものである。 The glycerin carbonate (meth)acrylate has a chemical structure represented by the following general formula (1):
当該化合物は、従来は、塗料組成物やパターン形成に使用される樹脂の変性等の分野で使用が検討されている化合物であり、医療分野や生化学実験における使用については検討がなされていない。
本発明者らは、このような化合物に由来する構造を一部に有する重合体が医療分野において好適に使用できることを見出すことによって、本発明を完成した。
This compound has previously been considered for use in fields such as coating compositions and modification of resins used in pattern formation, but its use in the medical field or biochemical experiments has not been considered.
The present inventors have found that polymers partially having a structure derived from such compounds can be suitably used in the medical field, and have thus completed the present invention.
上記一般式（１）で表される化合物は、容易にその他の単量体との重合反応を行うことができるため、配合を調整することで、使用目的に応じて樹脂物性を調整することが容易である。このため、上述した医療用素材や生化学実験用素材の構成単位として好適に使用することができる。 The compound represented by the above general formula (1) can easily undergo a polymerization reaction with other monomers, so by adjusting the composition, it is easy to adjust the resin properties according to the intended use. For this reason, it can be suitably used as a building block for the above-mentioned medical materials and biochemical experimental materials.
グリセリンカーボネート（メタ）アクリレートは、公知の化合物であり、公知の製造方法に従って製造することができる。また市販のものを使用することもできる。 Glycerol carbonate (meth)acrylate is a known compound and can be produced according to known production methods. Commercially available products can also be used.
本発明において使用される上記重合体は、グリセリンカーボネート（メタ）アクリレート由来の構造を全体の１～６５重量％の割合で含有するものであることが好ましい。上記割合で含有することによって、上述した目的を好適に達成できる点で特に好ましい。
上記下限は、１０重量％であることがより好ましく、２０重量％であることが更に好ましい。
The polymer used in the present invention preferably contains a structure derived from glycerin carbonate (meth)acrylate in a proportion of 1 to 65% by weight based on the total weight of the polymer, which is particularly preferred in that the above-mentioned object can be suitably achieved by containing the structure in the above proportion.
The lower limit is more preferably 10% by weight, and further preferably 20% by weight.
本発明で使用する重合体は、更に、スルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基からなる群より選択される少なくとも１の官能基（Ｂ－１）、及び、（メタ）アクリロイル基及び／又はＮ－（メタ）アクリロイルアミド基（Ｂ－２）を有する化合物（ｂ）に由来する構造（Ｂ）を有するものである。
このような構造を有することによって、樹脂とタンパク質との間での物理的吸着を抑制することができる点で好ましい。
The polymer used in the present invention further has a structure (B) derived from a compound (b) having at least one functional group (B-1) selected from the group consisting of a sulfobetaine group, a carbobetaine group, and a phosphobetaine group, and a (meth)acryloyl group and/or an N-(meth)acryloylamide group (B-2).
Such a structure is preferable in that physical adsorption between the resin and the protein can be suppressed.
このような構造は以下の一般式で表すことができる。
Ｒ１，Ｒ２基中に、以下で詳述するスルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基からなる群から選択される少なくとも１の構造を有する。）
Such a structure can be represented by the following general formula:
Each of R 1 and R 2 groups has at least one structure selected from the group consisting of a sulfobetaine group, a carbobetaine group, and a phosphobetaine group, which will be described in detail below.
上記スルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基は、それぞれ、スルホン酸基、カルボン酸基及びリン酸基及び４級アミノ基の両方を有する官能基である。これらのなかでも、スルホベタイン基であることが最も好ましい。さらに、スルホベタイン基としては、スルホアルキルベタイン（メタ）アクリレートであることが好ましい。 The above sulfobetaine group, carbobetaine group, and phosphobetaine group are functional groups each having both a sulfonic acid group, a carboxylic acid group, a phosphoric acid group, and a quaternary amino group. Among these, the sulfobetaine group is most preferred. Furthermore, the sulfobetaine group is preferably a sulfoalkylbetaine (meth)acrylate.
スルホアルキルベタイン（メタ）アクリレートは、下記一般式（２）で表されるスルホアルキルベタイン構造 Sulfoalkyl betaine (meth)acrylate has a sulfoalkyl betaine structure represented by the following general formula (2):
ＮＲ３は、同一または相違する、水素、アルキル基、エステル基、アミド基であり、Ｒ基のうち少なくとも１は（メタ）アクリル酸エステル基及び／又は（メタ）アクリルアミド基を有するものである）
NR3 is the same or different and is a hydrogen atom, an alkyl group, an ester group, or an amide group, and at least one of the R groups has a (meth)acrylic acid ester group and/or a (meth)acrylamide group.
及び（メタ）アクリル酸又は（メタ）アクリルアミドに由来する構造の両方を分子中に有する化合物又はその分子内塩である。このような化合物として具体的には、下記一般式（３）又は（４）で表される化合物等を挙げることができる。 and a structure derived from (meth)acrylic acid or (meth)acrylamide in the molecule, or an inner salt thereof. Specific examples of such compounds include compounds represented by the following general formula (3) or (4).
Ｒｂは、炭素数２～９のアルキレン基を表す。
Ｒｃは、水素又はメチル基を表す
Ｒｄは、それぞれ同一または異なってもよい炭素数１～２のアルキル基を表す。）
R b represents an alkylene group having 2 to 9 carbon atoms.
R c represents a hydrogen atom or a methyl group, and R d represents an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, which may be the same or different.
Ｒｂは、炭素数２～９のアルキレン基を表す。
Ｒｃは、水素又はメチル基を表す
Ｒｄは、それぞれ同一または異なってもよい炭素数１～２のアルキル基を表す。）
Ｒｅは、水素又は炭素数１～９のアルキル基を表す。
R b represents an alkylene group having 2 to 9 carbon atoms.
R c represents a hydrogen atom or a methyl group, and R d represents an alkyl group having 1 to 2 carbon atoms, which may be the same or different.
R e represents hydrogen or an alkyl group having 1 to 9 carbon atoms.
更に好ましくは下記一般式（５）で表される化合物を挙げることができる。 More preferably, the compound is represented by the following general formula (5):
上記構造（Ｂ）の含有量は、重合体全量に対して１～２５重量％であることが好ましい。このような範囲で配合することで、良好な生体適合性を得ることができる。上記下限は、５重量％であることがより好ましく、１０重量％であることが更に好ましい。 The content of the above structure (B) is preferably 1 to 25% by weight based on the total amount of the polymer. By blending within this range, good biocompatibility can be obtained. The lower limit is more preferably 5% by weight, and even more preferably 10% by weight.
本発明の重合体は、更にその他の単量体に基づく構成単位を共重合成分として含有するものであってもよい。このようなその他の単量体は、本発明の用途において好ましい機能性を有するものであってもよいし、特段の機能性を有さないものであってもよい。 The polymer of the present invention may further contain a structural unit based on another monomer as a copolymerization component. Such another monomer may have a preferred functionality for the application of the present invention, or may not have any particular functionality.
上記共重合成分としては、例えば、テトラフェニルエチレン系メタクリレート等を挙げることができる。
上記テトラフェニルエチレン系メタクリレートは、テトラフェニルエチレン骨格及びアクリル基を有する化合物である。テトラフェニルエチレン基は、凝集誘起蛍光特性(AIE)を有する骨格である。医療や生化学の分野においては、蛍光物質を使用することによる検査や分析等が広く一般的に行われている。したがって、このような医療用素材において、テトラフェニルエチレン基を有する重合体とし、これを使用することで、蛍光付与を行うことができる。
The copolymerization component may, for example, be tetraphenylethylene methacrylate.
The tetraphenylethylene-based methacrylate is a compound having a tetraphenylethylene skeleton and an acrylic group. The tetraphenylethylene group is a skeleton having aggregation-induced fluorescence (AIE). In the fields of medicine and biochemistry, fluorescent substances are widely used in tests and analyses. Therefore, in such medical materials, a polymer having a tetraphenylethylene group is used to impart fluorescence.
このような単量体としては特に限定されず、診断薬用蛍光粒子を構成する凝集発光性材料としては特に限定はないが、例えば、ケトイミンホウ素錯体誘導体、ジイミンホウ素錯体誘導体、テトラフェニルエチレン誘導体、アミノマレイミド誘導体、アミノベンゾピロキサンテン誘導体、トリフェニルアミン誘導体、ヘキサフェニルベンゼン誘導体、ヘキサフェニルシロール誘導体等が挙げられる。 Such monomers are not particularly limited, and the aggregated luminescent materials constituting the fluorescent particles for diagnostic drugs are not particularly limited, but examples include ketoimine boron complex derivatives, diimine boron complex derivatives, tetraphenylethylene derivatives, aminomaleimide derivatives, aminobenzopyroxanthene derivatives, triphenylamine derivatives, hexaphenylbenzene derivatives, hexaphenylsilole derivatives, etc.
本発明の重合体は、更に、不飽和基を有するその他の単量体を共重合成分として有するものであってもよい。このようなその他の単量体としては、特に限定されず、例えば、以下のものを例示することができる。
（その他の単量体の例）
スチレン、クロルスチレン、α－メチルスチレン、ジビニルベンゼン、ビニルトルエン、ビニルナフタレン、ジビニルナフタレン、（メタ）アクリル酸α－ナフチル、（メタ）アクリル酸β－ナフチルなどの重合性不飽和芳香族類；（メタ）アクリル酸、イタコン酸、マレイン酸、フマル酸などの重合性不飽和カルボン酸類；スチレンスルホン酸ソーダなどの重合性不飽和スルホン酸もしくはその塩；（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸－ｎ－ブチル、（メタ）アクリル酸－２－ヒドロキシエチル、（メタ）アクリル酸グリシジル、エチレングリコール－ジ－（メタ）アクリル酸エステル、（メタ）アクリル酸トリブロモフェニルなどの重合性カルボン酸エステル類；（メタ）アクリロニトリル、（メタ）アクロレイン、（メタ）アクリルアミド、Ｎ－メチロール（メタ）アクリルアミド、メチレンビス（メタ）アクリルアミド、ブタジエン、イソプレン、酢酸ビニル、ビニルピリジン、Ｎ－ビニルピロリドン、塩化ビニル、塩化ビニリデン、臭化ビニルなどの不飽和カルボン酸アミド類、重合性不飽和ニトリル類、ハロゲン化ビニル類、共役ジエン類等。
The polymer of the present invention may further contain other monomers having an unsaturated group as copolymerization components. Such other monomers are not particularly limited, and examples thereof include the following.
(Other examples of monomers)
Polymerizable unsaturated aromatic compounds such as styrene, chlorostyrene, α-methylstyrene, divinylbenzene, vinyltoluene, vinylnaphthalene, divinylnaphthalene, α-naphthyl (meth)acrylate, and β-naphthyl (meth)acrylate; polymerizable unsaturated carboxylic acids such as (meth)acrylic acid, itaconic acid, maleic acid, and fumaric acid; polymerizable unsaturated sulfonic acids or salts thereof such as sodium styrenesulfonate; methyl (meth)acrylate, ethyl (meth)acrylate, n-butyl (meth)acrylate, 2-hydroxyethyl (meth)acrylate, and (meth) Polymerizable carboxylic acid esters such as glycidyl acrylate, ethylene glycol-di-(meth)acrylic acid ester, and tribromophenyl (meth)acrylate; unsaturated carboxylic acid amides such as (meth)acrylonitrile, (meth)acrolein, (meth)acrylamide, N-methylol (meth)acrylamide, methylene bis (meth)acrylamide, butadiene, isoprene, vinyl acetate, vinylpyridine, N-vinylpyrrolidone, vinyl chloride, vinylidene chloride, and vinyl bromide, polymerizable unsaturated nitriles, vinyl halides, and conjugated dienes.
また、各種多官能アクリレート化合物を共重合成分として使用するものであってもよい。以下で詳述するように、本発明の重合体は、水不溶性樹脂粒子とすることもできる。このような樹脂粒子は、架橋構造を有する重合体であることが好ましい。このような観点から、公知の各種多官能アクリレート化合物を使用することができる。 In addition, various polyfunctional acrylate compounds may be used as copolymerization components. As described in detail below, the polymer of the present invention can also be made into water-insoluble resin particles. Such resin particles are preferably polymers having a crosslinked structure. From this viewpoint, various known polyfunctional acrylate compounds can be used.
官能基数２の（メタ）アクリレートの例は、１，４－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，３－ブタンジオールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、エチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート、ジプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、トリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールジ（メタ）アクリレート、ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、ヒドロキシピバリン酸ネオペンチルグリコールジ（メタ）アクリレート、１，６－ヘキサンジオールジ（メタ）アクリレート、１，９－ノナンジオールジ（メタ）アクリレート、１，１０－デカンジオールジ（メタ）アクリレート、グリセリンジ（メタ）アクリレート、ジメチロールートリシクロデカンジ（メタ）アクリレート（ＤＣＰ－Ａ）、ビスフェノールAのEO付加物ジアクリレート（共栄社化学社製；ライトアクリレートＢＰ－４ＥＡ、ＢＰ－１０ＥＡ）ビスフェノールAのPO付加物ジアクリレート（共栄社化学社製；ＢＰ－４ＰＡ、ＢＰ－１０ＰＡ等）を含む。なかでも、ビスフェノールＡのＰＯ付加物ジアクリレート（共栄社化学社製；ＢＰ－４ＰＡ）、ジメチロールートリシクロデカンジ（メタ）アクリレート（ＤＣＰ－Ａ）等を好ましく用いることができる。 Examples of (meth)acrylates with two functional groups are 1,4-butanediol di(meth)acrylate, 1,3-butanediol di(meth)acrylate, 1,6-hexanediol di(meth)acrylate, ethylene glycol di(meth)acrylate, diethylene glycol di(meth)acrylate, triethylene glycol di(meth)acrylate, polyethylene glycol di(meth)acrylate, dipropylene glycol di(meth)acrylate, tripropylene glycol di(meth)acrylate, polypropylene glycol di(meth)acrylate, neopentyl glycol di(meth)acrylate. Acrylate, hydroxypivalic acid neopentyl glycol di(meth)acrylate, 1,6-hexanediol di(meth)acrylate, 1,9-nonanediol di(meth)acrylate, 1,10-decanediol di(meth)acrylate, glycerin di(meth)acrylate, dimethylol tricyclodecane di(meth)acrylate (DCP-A), EO adduct diacrylate of bisphenol A (Kyoeisha Chemical Co., Ltd.; Light Acrylate BP-4EA, BP-10EA), PO adduct diacrylate of bisphenol A (Kyoeisha Chemical Co., Ltd.; BP-4PA, BP-10PA, etc.). Among them, PO adduct diacrylate of bisphenol A (Kyoeisha Chemical Co., Ltd.; BP-4PA), dimethylol tricyclodecane di(meth)acrylate (DCP-A), etc. can be preferably used.
官能基数３の（メタ）アクリレートの例は、トリメチロールメタントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパントリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンエチレンオキサイド変性トリ（メタ）アクリレート、トリメチロールプロパンプロピレンオキサイド変性トリ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールトリ（メタ）アクリレート、グリセリンプロポキシトリ（メタ）アクリレート、トリス（２－（メタ）アクリロイルオキシエチル）イソシアヌレート等を含む。なかでも、トリメチロールプロパントリメタクリレート、ペンタエリスリトールトリメタクリレート等を好ましく用いることができる。 Examples of (meth)acrylates having three functional groups include trimethylolmethane tri(meth)acrylate, trimethylolpropane tri(meth)acrylate, trimethylolpropane ethylene oxide modified tri(meth)acrylate, trimethylolpropane propylene oxide modified tri(meth)acrylate, pentaerythritol tri(meth)acrylate, glycerin propoxy tri(meth)acrylate, tris(2-(meth)acryloyloxyethyl)isocyanurate, etc. Among these, trimethylolpropane trimethacrylate, pentaerythritol trimethacrylate, etc. can be preferably used.
官能基数４の（メタ）アクリレートの例は、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールエチレンオキサイド変性テトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールプロピレンオキサイド変性テトラ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート等を含む。なかでも、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート等を好ましく用いることができる。 Examples of (meth)acrylates having four functional groups include dipentaerythritol tetra(meth)acrylate, pentaerythritol tetra(meth)acrylate, pentaerythritol ethylene oxide modified tetra(meth)acrylate, pentaerythritol propylene oxide modified tetra(meth)acrylate, ditrimethylolpropane tetra(meth)acrylate, etc. Among these, ditrimethylolpropane tetra(meth)acrylate, pentaerythritol tetra(meth)acrylate, etc. can be preferably used.
官能基数４以上の（メタ）アクリレートの例は、ペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ペンタエリスリトールエチレンオキサイド変性テトラ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールテトラ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンペンタ（メタ）アクリレート、プロピオン酸変性ジペンタエリスリトールペンタ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールヘキサ（メタ）アクリレート、ジトリメチロールプロパンヘキサ（メタ）アクリレート、ジペンタエリスリトールのカプロラクトン変性物のヘキサ（メタ）アクリレートなど多官能性（メタ）アクリレートが挙げられる。 Examples of (meth)acrylates having 4 or more functional groups include polyfunctional (meth)acrylates such as pentaerythritol tetra(meth)acrylate, pentaerythritol ethylene oxide modified tetra(meth)acrylate, ditrimethylolpropane tetra(meth)acrylate, dipentaerythritol tetra(meth)acrylate, dipentaerythritol penta(meth)acrylate, ditrimethylolpropane penta(meth)acrylate, propionic acid modified dipentaerythritol penta(meth)acrylate, dipentaerythritol hexa(meth)acrylate, ditrimethylolpropane hexa(meth)acrylate, and hexa(meth)acrylate of caprolactone modified dipentaerythritol.
本発明の重合体は、溶媒溶解性重合体であってもよいし、水不溶性の粒子であってもよい。不溶性の粒子は、グリセリンカーボネート（メタ）アクリレート及びスルホプロピルベタイン（メタ）アクリレートの共重合によって得られるものであってもよいし、不溶性の粒子、グリセリンカーボネート（メタ）アクリレート並びにスルホプロピルベタイン（メタ）アクリレートを含有する組成物を調製し、この組成物の重合を行うことによって、粒子表面に環状カーボネート基及びスルホプロピルベタイン基を有する樹脂粒子を製造する方法によるものであってもよい。 The polymer of the present invention may be a solvent-soluble polymer or a water-insoluble particle. The insoluble particle may be obtained by copolymerization of glycerin carbonate (meth)acrylate and sulfopropyl betaine (meth)acrylate, or may be obtained by a method of producing resin particles having cyclic carbonate groups and sulfopropyl betaine groups on the particle surface by preparing a composition containing insoluble particles, glycerin carbonate (meth)acrylate, and sulfopropyl betaine (meth)acrylate, and polymerizing the composition.
本発明の重合体は、製造方法を特に限定するものではなく、乳化重合、溶液重合、懸濁重合、塊状重合等の公知の一般的な方法によって行うことができる。重合の際に使用することができる重合開始剤、乳化剤等も特に限定されるものではなく、公知の任意のものを使用することができる。 The method for producing the polymer of the present invention is not particularly limited, and can be carried out by known general methods such as emulsion polymerization, solution polymerization, suspension polymerization, and bulk polymerization. There are also no particular limitations on the polymerization initiator, emulsifier, etc. that can be used during polymerization, and any known ones can be used.
本発明は、上述した重合体からなる医療用素材又は生化学実験用素材でもある。すなわち、上述した本発明の重合体は、主に医療分野又は生化学実験分野において使用することができるものである。 The present invention also relates to a medical material or a biochemical experimental material made of the above-mentioned polymer. In other words, the above-mentioned polymer of the present invention can be used mainly in the medical field or biochemical experimental field.
本発明の重合体の具体的な使用方法は特に限定されるものではなく、各種の検査に使用される医療用素材、更に、人工臓器、人口骨、人工関節等への使用も期待されるものである。また、固定化生理活性物質を固定化するための基材として使用することもできる。本発明の重合体上に生理活性物質を固定化した固定化生理活性物質も本発明の一つである。さらに、これらの素材を研究開発用に使用するものであってもよい。 The specific method of using the polymer of the present invention is not particularly limited, and it is expected to be used as a medical material used in various tests, and further as artificial organs, artificial bones, artificial joints, etc. It can also be used as a substrate for immobilizing immobilized physiologically active substances. Immobilized physiologically active substances in which a physiologically active substance is immobilized on the polymer of the present invention are also one aspect of the present invention. Furthermore, these materials may be used for research and development.
上記固定化生理活性物質としては、固定化酵素、固定化抗原、固定化抗体等を挙げることができる。このように各種生理活性物質を本発明の重合体に固定化することで、酵素反応、抗原抗体反応等を固定相上で行うことができ、各種反応や、生化学的反応を行った後の混合物の分離等を行うことができる。固定化する化合物は、タンパク質、ペプチド、アミノ酸等を挙げることができる。 Examples of the immobilized physiologically active substance include immobilized enzymes, immobilized antigens, immobilized antibodies, etc. By immobilizing various physiologically active substances to the polymer of the present invention in this way, enzyme reactions, antigen-antibody reactions, etc. can be carried out on the stationary phase, and mixtures after various reactions or biochemical reactions can be separated, etc. Examples of the compound to be immobilized include proteins, peptides, amino acids, etc.
更に、抗体医薬品の製造に際して、抗体を含有する培養液から抗体を分取する際に使用する担体粒子としても使用することができる。本発明の重合体に抗体を固定化し、これをカラム中に充填する。そして、抗体医薬品の製造によって得られた反応混合物をカラム中に通過させる。すると、抗体は、担体粒子上に捕捉されて、不純物はカラムを通過する。これによって、不純物を除去することができる。そして、この後に、酸性溶液を通過させるなどして、抗体を担体粒子から解離させ、これによって、純度が高い抗体を得ることができる。
更にイムノクロマト法における免疫測定法における素材としても使用することができる。
Furthermore, the polymer can be used as a carrier particle for separating an antibody from a culture solution containing the antibody during the production of an antibody drug. An antibody is immobilized on the polymer of the present invention and packed in a column. Then, the reaction mixture obtained by the production of the antibody drug is passed through the column. Then, the antibody is captured on the carrier particle, and impurities pass through the column. This makes it possible to remove the impurities. Then, the antibody is dissociated from the carrier particle by passing it through an acidic solution, etc., and thus an antibody with high purity can be obtained.
Furthermore, it can also be used as a material in immunoassay in immunochromatography.
以下、実施例に基づいて本発明を更に詳細に説明するが、これによって本発明が限定されるものではない。 The present invention will be explained in more detail below based on examples, but the present invention is not limited thereto.
（合成例）
（グリセリンカーボネートメタクリレートの合成）
冷却管・撹拌機・温度計・滴下ロートを備えた500mLの四ツ口フラスコに、グリセリンカーボネート（Glycerol 1,2-Carbonate：東京化成工業（株）93g、トルエン65g、トリエチルアミン 11.1gを仕込み30℃にて撹拌した。滴下ロートを用いて無水メタクリル酸 120gを発熱に注意しながら1時間掛けて滴下した。滴下完了後、80℃まで昇温し6時間反応させ合成を完了させた。反応終了後、中和・水洗を実施し目的化合物であるグリセリンカーボネートメタクリレートを淡黄色透明液体で得た。収量は112.5g（収率78.2％）であった。得られた淡黄色透明液体は、1H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) = 6.04 (s, 1 H); 5.73 (s,1 H); 5.09 (m, 1 H); 4.59 (t, 1 H), 4.38 (t, 1 H); 4.29-4.35 (m,2 H), 1.88 (s, 3 H)であった。この結果は目的構造を支持するものであった。
(Synthesis Example)
(Synthesis of glycerin carbonate methacrylate)
In a 500 mL four-neck flask equipped with a condenser, stirrer, thermometer, and dropping funnel, 93 g of glycerol carbonate (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), 65 g of toluene, and 11.1 g of triethylamine were charged and stirred at 30°C. Using the dropping funnel, 120 g of methacrylic anhydride was added dropwise over 1 hour while taking care not to generate heat. After the addition was completed, the temperature was raised to 80°C and the reaction was continued for 6 hours to complete the synthesis. After the reaction was completed, the product was neutralized and washed with water to obtain the target compound, glycerol carbonate methacrylate, as a pale yellow transparent liquid. The yield was 112.5 g (78.2%). The pale yellow transparent liquid obtained had the following properties: 1 H-NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) = 6.04 (s, 1 H); 5.73 (s,1 H); 5.09 (m, 1 H); The molecular weights were 4.59 (t, 1 H), 4.38 (t, 1 H); 4.29-4.35 (m, 2 H), 1.88 (s, 3 H), which supported the proposed structure.
（N,N-ジメチル-N-(2-メタクリロオキシエチル)-N-(3-スルホプロピル)アンモニウム ベタイン（以下：スルホプロピルベタイン(SPB)と略す）の合成）
合成操作は以下の手順に従って実施した。
冷却管・撹拌機・温度計・滴下ロートを備えた1Lの四ツ口フラスコに、ライトエステルDM(ジメチルアミノエチルメタクリレート) 120g、アセトン260gを仕込み室温にて撹拌した。次いでアセトン132gに1,3-プロパンスルトン93.2gを混合し、滴下ロートを用いて2時間滴下し反応した。滴下終了後、さらに室温にて3時間撹拌し合成を完了させた。反応液を氷水にて冷却・静置し、冷却後の反応液を吸引ろ過により析出した沈殿物を回収し、さらに多量のアセトンにて洗浄を行い、白色固体を得た。乾燥後の重量は190g(収率89%)であった。得られた白色固体は、1H-NMR (D2O,400MHz)δ:6.13(s,1H)、5.76(s,1H)、4.83-4.66(t,2H)、3.86-3.84(t,2H)、3.65-3.59(m,2H)、3.24(s,6H)、3.05-2.98(t,2H)、2.33-2.12(m,2H)、1.96(2,3H)であった。これは、目的構造を支持する結果であった。
(Synthesis of N,N-dimethyl-N-(2-methacrylooxyethyl)-N-(3-sulfopropyl)ammonium betaine (hereinafter referred to as sulfopropylbetaine (SPB))
The synthesis was carried out according to the following procedure.
In a 1L four-neck flask equipped with a condenser, stirrer, thermometer, and dropping funnel, 120g of Light Ester DM (dimethylaminoethyl methacrylate) and 260g of acetone were charged and stirred at room temperature. Next, 132g of acetone was mixed with 93.2g of 1,3-propane sultone, and the mixture was added dropwise using a dropping funnel for 2 hours to react. After the addition was completed, the mixture was stirred at room temperature for another 3 hours to complete the synthesis. The reaction solution was cooled and left to stand in ice water, and the precipitate that had precipitated from the cooled reaction solution was collected by suction filtration and further washed with a large amount of acetone to obtain a white solid. The weight after drying was 190g (yield 89%). The white solid thus obtained had 1H -NMR (D2O, 400MHz) δ: 6.13 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.83-4.66 (t, 2H), 3.86-3.84 (t, 2H), 3.65-3.59 (m, 2H), 3.24 (s, 6H), 3.05-2.98 (t, 2H), 2.33-2.12 (m, 2H), 1.96 (2, 3H), which supported the structure of the product.
（架橋粒子ポリマーの合成）
・比較例1
重合操作は以下の手順に従って実施した。冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水31.75ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.45gを仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、ライトエステルM（メタクリル酸メチル） 14.7g、ジエチレングリコールジメタクリレート（ライトエステル2EG） 0.30gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.30gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、28.5wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=95.0%)であった。
(Synthesis of Crosslinked Particle Polymer)
Comparative Example 1
The polymerization operation was carried out according to the following procedure. 31.75 ml of ion-exchanged water and 0.45 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier were charged into a 100 ml four-neck flask equipped with a cooling tube, a stirrer, and a thermometer, and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that it was completely dissolved, 14.7 g of Light Ester M (methyl methacrylate) and 0.30 g of diethylene glycol dimethacrylate (Light Ester 2EG) were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.30 g of ammonium persulfate as a polymerization initiator was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water and placed in a reaction vessel. The reaction was carried out at 70 ° C for 5 hours to complete the polymerization. After the reaction, the solid content concentration in the system was dried at 105 ° C for 3 hours and then weighed, and it was 28.5 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv. = 95.0%).
・比較例2
冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水31.75ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.45g、スルホプロピルベタイン 0.75gを仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、メタクリル酸メチル 13.95g、ライトエステル2EG 0.30gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.30gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、29.3wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=97.7%)であった。
Comparative Example 2
In a 100 ml four-neck flask equipped with a condenser, stirrer and thermometer, 31.75 ml of ion-exchanged water, 0.45 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier, and 0.75 g of sulfopropyl betaine were charged and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that the mixture was completely dissolved, 13.95 g of methyl methacrylate and 0.30 g of Light Ester 2EG were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.30 g of ammonium persulfate as a polymerization initiator was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water and added to a reaction vessel. The mixture was reacted at 70 ° C for 5 hours to complete the polymerization. After the reaction, the solid content concentration in the system was weighed after drying at 105 ° C for 3 hours, and was found to be 29.3 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv. = 97.7%).
・比較例3
スルホプロピルベタイン1.5g、メタクリル酸メチル13.2gに変更したこと以外は実施例２と同様に重合を実施した。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、29.8wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=99.3%)であった。
Comparative Example 3
Polymerization was carried out in the same manner as in Example 2, except that the amounts of sulfopropyl betaine and methyl methacrylate were changed to 1.5 g and 13.2 g, respectively. After the reaction was completed, the solid content in the system was dried at 105° C. for 3 hours and then weighed, and found to be 29.8 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv.=99.3%).
・実施例1
冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水36.25ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.45g、スルホプロピルベタイン2.1gを仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、メタクリル酸メチル10.5g、GC-MA 2.1g、ライトエステル2EG 0.3gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.30gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、28.5wt.%(理論固形分:26.5wt.%(conv.=95.9%)であった。
Example 1
In a 100 ml four-neck flask equipped with a condenser, stirrer and thermometer, 36.25 ml of ion-exchanged water, 0.45 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier, and 2.1 g of sulfopropyl betaine were charged and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that the mixture was completely dissolved, 10.5 g of methyl methacrylate, 2.1 g of GC-MA and 0.3 g of Light Ester 2EG were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.30 g of ammonium persulfate was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water as a polymerization initiator and placed in a reaction vessel. The mixture was reacted at 70 ° C for 5 hours to complete the polymerization. After the reaction, the solid content concentration in the system was weighed after drying at 105 ° C for 3 hours and was 28.5 wt.% (theoretical solid content: 26.5 wt.% (conv. = 95.9%).
・比較例4
冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水31.75ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.45gを仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、スチレン 14.7g、ライトエステル2EG 0.30gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.30gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、28.5wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=95.0%)であった。
Comparative Example 4
In a 100 ml four-neck flask equipped with a condenser, stirrer, and thermometer, 31.75 ml of ion-exchanged water and 0.45 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier were charged and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that it was completely dissolved, 14.7 g of styrene and 0.30 g of Light Ester 2EG were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.30 g of ammonium persulfate as a polymerization initiator was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water and added to the reaction vessel. The polymerization was completed by reacting at 70 ° C for 5 hours. After the reaction, the solid content concentration in the system was dried at 105 ° C for 3 hours and then weighed, which was 28.5 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv. = 95.0%).
・比較例5
冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水31.75ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.45g、スルホプロピルベタイン0.75g、を仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、スチレン 13.95g、ライトエステル2EG 0.30gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.30gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、29.0wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=96.7%)であった。
Comparative Example 5
In a 100 ml four-neck flask equipped with a condenser, stirrer, and thermometer, 31.75 ml of ion-exchanged water, 0.45 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier, and 0.75 g of sulfopropyl betaine were charged and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that the mixture was completely dissolved, 13.95 g of styrene and 0.30 g of Light Ester 2EG were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.30 g of ammonium persulfate as a polymerization initiator was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water and added to a reaction vessel. The mixture was reacted at 70 ° C for 5 hours to complete the polymerization. After the reaction, the solid content concentration in the system was weighed after drying at 105 ° C for 3 hours, and was found to be 29.0 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv. = 96.7%).
・実施例2
冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水28.0ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.36g、スルホプロピルベタイン3.6g、を仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、スチレン 4.74g、GC-MA 3.6g、ライトエステル2EG 0.06gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.24gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、28.5wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=95.0%)であった。
Example 2
In a 100 ml four-neck flask equipped with a condenser, stirrer, and thermometer, 28.0 ml of ion-exchanged water, 0.36 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier, and 3.6 g of sulfopropyl betaine were charged and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that the mixture was completely dissolved, 4.74 g of styrene, 3.6 g of GC-MA, and 0.06 g of Light Ester 2EG were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.24 g of ammonium persulfate as a polymerization initiator was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water and added to the reaction vessel. The mixture was reacted at 70 ° C for 5 hours to complete the polymerization. After the reaction, the solid content concentration in the system was weighed after drying at 105 ° C for 3 hours, and was found to be 28.5 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv. = 95.0%).
・比較例6
冷却管・撹拌機・温度計を備えた100mlの四ツ口フラスコに、イオン交換水28.0ml、乳化剤としてラウリル硫酸ナトリウム(SDS) 0.36gを仕込み、室温にて撹拌により完全に溶解させた。完全溶解したことを確認後、スチレン 8.82g、GC-MA 3.78g、ライトエステル2EG 0.06gを仕込み70℃にて1時間撹拌を行った。その後、重合開始剤として過硫酸アンモニウム 0.24gをイオン交換水 5.0ｇに溶解させ、反応容器に投入した。70℃にて5時間反応させ重合を完了させた。反応終了後、系内の固形分濃度を105℃にて3時間乾燥後に秤量したところ、28.0wt.%(理論固形分:30wt.%(conv.=93.3%)であった。
Comparative Example 6
In a 100 ml four-neck flask equipped with a condenser, stirrer, and thermometer, 28.0 ml of ion-exchanged water and 0.36 g of sodium lauryl sulfate (SDS) as an emulsifier were charged, and completely dissolved by stirring at room temperature. After confirming that the mixture was completely dissolved, 8.82 g of styrene, 3.78 g of GC-MA, and 0.06 g of Light Ester 2EG were charged and stirred at 70 ° C for 1 hour. Then, 0.24 g of ammonium persulfate as a polymerization initiator was dissolved in 5.0 g of ion-exchanged water and added to a reaction vessel. The mixture was reacted at 70 ° C for 5 hours to complete the polymerization. After the reaction, the solid content concentration in the system was weighed after drying at 105 ° C for 3 hours, and was found to be 28.0 wt.% (theoretical solid content: 30 wt.% (conv. = 93.3%).
（架橋ポリマー微粒子の回収）
・粒子の回収
上記にて合成した実施例1～8のエマルションを多量のアセトンまたはメタノール中に滴下し、乳化破壊を起こすことで架橋ポリマー微粒子を沈殿させた。沈殿した粒子をろ過にて回収し、多量のイオン交換水にて粒子表面の乳化剤を洗浄した後に、乾燥させ粒子を回収した。以降の評価には本操作にて回収した粒子を用いた。
(Recovery of crosslinked polymer microparticles)
Recovery of particles The emulsions of Examples 1 to 8 synthesized above were dropped into a large amount of acetone or methanol to cause emulsion destruction and precipitate crosslinked polymer microparticles. The precipitated particles were recovered by filtration, and the emulsifier on the particle surface was washed with a large amount of ion-exchanged water, and then the particles were dried and recovered. The particles recovered by this procedure were used for the subsequent evaluations.
（蛍光タンパク質吸着実験）
蛍光標識されたウシ血清アルブミン（FITC-BSA）を50μg/mlとなる様に、10mMリン酸緩衝液(pH7.2)にて調製した。比較例・実施例で合成した架橋粒子0.05gと調製済みFITC-BSA溶液0.5~1.0mlと10mMリン酸緩衝液(pH7.2)にて計1.4mlに調整し、37℃にて30分間インキュベートした。その後、卓上遠心分離機により粒子を沈降させ上澄みを採取し、沈降した粒子に対して10mMリン酸緩衝液(pH7.2)を0.8ml加えて洗浄した。回収した粒子を目視にて確認した。測定結果は表2に示す。
(Fluorescent protein adsorption experiment)
Fluorescently labeled bovine serum albumin (FITC-BSA) was prepared in 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) to a concentration of 50 μg/ml. 0.05 g of the crosslinked particles synthesized in the comparative examples and examples, 0.5 to 1.0 ml of the prepared FITC-BSA solution, and 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) were added to make a total of 1.4 ml, and incubated at 37 ° C for 30 minutes. After that, the particles were precipitated using a tabletop centrifuge, the supernatant was collected, and 0.8 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) was added to the precipitated particles to wash them. The collected particles were visually confirmed. The measurement results are shown in Table 2.
Styrene:スチレン
2EG:ジエチレングリコールジメタクリレート
SPB: スルホプロピルベタインメタクリレート
GC-MA:グリセリンカーボネートメタクリレート
Styrene:
2EG: Diethylene glycol dimethacrylate
SPB: Sulfopropyl betaine methacrylate
GC-MA: glycerin carbonate methacrylate
蛍光タンパク質吸着試験の結果、比較例1,2の粒子は蛍光タンパク質の粒子への疎水性相互作用によると考えられる非特異的な吸着が見られる結果となった。これに対して、比較例2,3、及び実施例1,2の様に粒子中にスルホプロピルベタイン（SPB)を配合した粒子は、粒子表面上への疎水性相互作用によるタンパク質吸着が抑制されている事が分かった。また、粒子中にスルホプロピルベタイン（SPB）を配合している場合においても、GC-MAを配合することで粒子への蛍光タンパク質の吸着が見られた。これは、GC-MAの骨格であるカーボネート部位と蛍光タンパク質中のアミノ基を介してタンパク質が共有結合的に吸着(結合)している事が示唆される。 The results of the fluorescent protein adsorption test showed that the particles of Comparative Examples 1 and 2 showed nonspecific adsorption, which is thought to be due to hydrophobic interactions between the fluorescent protein and the particles. In contrast, it was found that the particles in which sulfopropyl betaine (SPB) was blended, as in Comparative Examples 2 and 3 and Examples 1 and 2, suppressed protein adsorption due to hydrophobic interactions on the particle surface. Furthermore, even when sulfopropyl betaine (SPB) was blended in the particles, the adsorption of fluorescent protein to the particles was observed by blending GC-MA. This suggests that the protein is covalently adsorbed (bound) via the carbonate moiety, which is the skeleton of GC-MA, and the amino group in the fluorescent protein.
粒子表面へ吸着させたタンパク質を直接的に評価するために、蛍光分光光度計にて評価を実施した。上記に挙げた比較例・実施例にある粒子合成法に準じて、新たに実施例3、比較例7の粒子を調製した。組成については表3に示す。 To directly evaluate the protein adsorbed onto the particle surface, evaluation was performed using a fluorescence spectrophotometer. New particles for Example 3 and Comparative Example 7 were prepared according to the particle synthesis methods described in the Comparative Examples and Examples listed above. The compositions are shown in Table 3.
（蛍光タンパク質吸着実験２）
蛍光標識されたウシ血清アルブミン（FITC-BSA）を50μg/mlとなるように、10mMリン酸緩衝液（pH 7.2）にて調製した。比較例・実施例で合成した架橋粒子0.05ｇと調製済みFITC-BSA溶液0.5~1.0ｍlと10mMリン酸緩衝液（pH 7.2）にて計1.4mlに調整し、Ａ.37℃にて30分間インキュベート、Ｂ.37℃にて18時間インキュベートした。その後、卓上遠心分離機により粒子を沈降させ上澄みを採取し、沈降した粒子に対して10mMリン酸緩衝液（pH 7.2）を0.8ml加えて洗浄した。この操作を3回繰り返した。洗浄した粒子を用いて蛍光強度測定(日本分光：機種名FP-6200)を実施した。490nmにて励起し、520nmの波長にて蛍光強度(散乱光)を測定した。なお、ブランクには上記実験条件にてFITC-BSAを用いていない粒子をそれぞれに使用した。測定結果は表3に示す。
(Fluorescent protein adsorption experiment 2)
Fluorescently labeled bovine serum albumin (FITC-BSA) was prepared in 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) to a concentration of 50 μg/ml. 0.05 g of crosslinked particles synthesized in the comparative examples and examples, 0.5-1.0 ml of the prepared FITC-BSA solution, and 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) were used to adjust the total volume to 1.4 ml, and A. incubated at 37 ° C for 30 minutes, B. incubated at 37 ° C for 18 hours. After that, the particles were precipitated using a tabletop centrifuge, the supernatant was collected, and 0.8 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) was added to the precipitated particles to wash them. This operation was repeated three times. Fluorescence intensity measurement (JASCO: model name FP-6200) was performed using the washed particles. Excitation was performed at 490 nm, and fluorescence intensity (scattered light) was measured at a wavelength of 520 nm. For the blanks, particles without FITC-BSA were used under the above experimental conditions. The measurement results are shown in Table 3.
結果より短時間のインキュベートにおいては、比較例2、実施例3ともに蛍光タンパク質の粒子への吸着は認められない。また、特異的な結合を促すためにインキュベート時間を長くしたものについては、ある程度非特異的な吸着を抑制しながら、実施例3が示すようにGC-MAの機能により特異的な結合は妨げないことが示唆された。この結果は、特定のタンパク質や抗原等を担持する場合に非常に有効であり、この機能により感度向上・安定性向上などに寄与するものと考えられる。 The results show that in both Comparative Example 2 and Example 3, no adsorption of fluorescent protein to particles was observed in short incubation times. Furthermore, when the incubation time was extended to promote specific binding, it was suggested that while nonspecific adsorption was suppressed to some extent, specific binding was not hindered due to the function of GC-MA, as shown in Example 3. This result is extremely effective when carrying specific proteins, antigens, etc., and this function is thought to contribute to improved sensitivity and stability, etc.
（酵素担持実験）
粒子上への生理活性物質の担持を確認するために、スクロース分解酵素であるインベルターゼを用いて酵素担持(固定化酵素)を実施した。酵素活性については、グルコースCII-テストワコー(富士フィルム和光純薬工業株式会社製)を用いて実施した。
(Enzyme loading experiment)
To confirm the loading of a physiologically active substance onto the particles, enzyme loading (immobilized enzyme) was performed using invertase, a sucrose decomposition enzyme. Enzyme activity was measured using Glucose CII-Test Wako (manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
実施例3の組成の粒子を0.10g秤量し、そこに10mMリン酸緩衝液(pH7.2) 5.0mlとインベルターゼ溶液(酵母由来)1.0mlを添加し、超音波洗浄機にて粒子を分散させた。更に37℃にて18時間インキュベートした。インキュベート後、遠心分離機により粒子を回収し、10mMリン酸緩衝液(pH7.2)にて3回洗浄した後、遠心分離によって回収した粒子を酵素担持粒子とした。 0.10 g of particles having the composition of Example 3 was weighed out, to which 5.0 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.2) and 1.0 ml of invertase solution (derived from yeast) were added, and the particles were dispersed using an ultrasonic cleaner. The mixture was further incubated at 37°C for 18 hours. After incubation, the particles were collected using a centrifuge, washed three times with 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), and then collected by centrifugation to obtain enzyme-carrying particles.
上記の方法にて回収した酵素担持粒子に対して、1wt.%スクロース溶液を5.0ml加え、超音波洗浄機にて粒子を分散し、37℃にて3時間反応させた。反応後、遠心分離によって粒子を沈殿させ、上清を0.05ml採取した。そこに発色試薬1.0mlを混合し、室温で5分間反応させた。遠心分離によって回収した粒子を洗浄後、再度1wt.%スクロース溶液を5.0ml加え、超音波洗浄機にて粒子を分散し37℃にて3時間反応させた。同様に、反応後、遠心分離によって粒子を沈殿させ、上清を0.05ml採取した。そこに発色試薬1.0mlを混合し、室温で5分間反応させた。この操作を繰り返し実施し、酵素担持粒子の繰り返し使用の可否を確認した。 5.0 ml of 1 wt.% sucrose solution was added to the enzyme-loaded particles collected by the above method, the particles were dispersed in an ultrasonic cleaner, and the reaction was allowed to proceed at 37°C for 3 hours. After the reaction, the particles were precipitated by centrifugation, and 0.05 ml of the supernatant was collected. 1.0 ml of a color-developing reagent was mixed thereto, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 5 minutes. After washing the particles collected by centrifugation, 5.0 ml of 1 wt.% sucrose solution was added again, the particles were dispersed in an ultrasonic cleaner, and the reaction was allowed to proceed at 37°C for 3 hours. Similarly, after the reaction, the particles were precipitated by centrifugation, and 0.05 ml of the supernatant was collected. 1.0 ml of a color-developing reagent was mixed thereto, and the reaction was allowed to proceed at room temperature for 5 minutes. This operation was repeated to confirm whether the enzyme-loaded particles could be reused repeatedly.
結果は、下記の表のようになった。粒子上に酵素を担持させたものは酵素反応によって反応が進み、グルコースの産生が認められそれぞれ赤色に呈色した。一方、酵素を担持させない粒子については、発色試薬の呈色は生じなかった。この事から、粒子上のGC-MAを介した酵素担持によって上記反応を示す固定化酵素を作成できた。更には、繰り返しの使用に際しても問題なく酵素反応が進む事が確認できた。 The results are shown in the table below. For those particles with enzymes supported on them, the reaction proceeded through an enzymatic reaction, and glucose was produced, turning red. On the other hand, for particles that did not support enzymes, no coloring of the color reagent occurred. From this, it was possible to create an immobilized enzyme that exhibits the above reaction by supporting the enzyme on the particles via GC-MA. Furthermore, it was confirmed that the enzymatic reaction proceeded without any problems even when used repeatedly.
本発明の重合体は、医療における検査や生化学の研究における実験において使用される各種素材等のバイオマテリアルとして使用することができる。
The polymer of the present invention can be used as a biomaterial such as various materials used in medical examinations and experiments in biochemical research.
Claims (7)
スルホベタイン基、カルボベタイン基及びホスホベタイン基からなる群より選択される少なくとも１の官能基（Ｂ－１）及び（メタ）アクリロイル基及び／又はＮ－（メタ）アクリロイルアミド基（Ｂ－２）
を有する化合物に由来する構造（Ｂ）
を必須の構成単位とし、
前記構造（Ａ）は重合体全体の１０～３０重量％の割合で含有され、前記構造（Ｂ）の含有量は前記重合体全量に対して１０～３０重量％であることを特徴とする重合体。 A structure (A) derived from glycerin carbonate (meth)acrylate, and at least one functional group (B-1) selected from the group consisting of a sulfobetaine group, a carbobetaine group, and a phosphobetaine group, and a (meth)acryloyl group and/or an N-(meth)acryloylamide group (B-2).
Structure (B) derived from a compound having the formula
is the essential building block,
A polymer , characterized in that the content of the structure (A) is 10 to 30% by weight based on the entire polymer, and the content of the structure (B) is 10 to 30% by weight based on the total amount of the polymer .
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