JP7621979B2 - ウイルスベクターおよびその養子細胞療法における使用 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
これは、その内容全体が参照により本明細書に援用される、２０１９年５月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／８５３，１２３号明細書の優先権を主張する、特許協力条約に基づく国際出願である。

提出された配列表への言及
配列表の正式なコピーは、２０２０年５月２６日に作成され、３１３，４２６バイトのサイズを有する「３００００１１－０１３９７７＿ＳＥＱＬＩＳＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というファイル名のＡＳＣＩＩ形式の配列表として、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出され、本明細書と同時に提出されている。このＡＳＣＩＩ形式のドキュメントに含まれている配列表は明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に援用される。

１．分野
本開示は、Ｔ細胞の製造に関する。一態様では、本開示は、単一ベクターで複数のタンパク質を発現させるための、マルチシストロン性カセットを使用するＴ細胞製造に関する。より具体的には、本開示は、ＴＣＲαβおよびＣＤ８αβを共発現するＴ細胞のＴ細胞製造、および養子細胞療法におけるそれらの使用に関する。

２．背景
遺伝性、後天性、または感染性疾患の潜在的な治療法としてのヒトリンパ球の遺伝子操作には、導入遺伝子の効率的な伝達と発現が必要である。がんの養子免疫療法の場合、天然および／または組換え抗腫瘍Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して、正常なＴ細胞または腫瘍浸潤リンパ球に抗腫瘍反応性を付与する。

非特許文献１は、バイシストロン性ＲＮＡによって発現される抗ｇｐ１００ ＴＣＲを開示し、その中ではＴＣＲβ鎖をコード化する第１の遺伝子の発現が、長い末端反復（ＬＴＲ）によって制御され、ＴＣＲα鎖をコード化する第２の遺伝子が、内部リボソーム侵入部位によって支配される（ＩＲＥＳ）。この抗ｇｐ１００ ＴＣＲ遺伝子によって操作されたＣＤ４Ｔ細胞は、抗原反応性であった。

非特許文献２は、ｐ５３エピトープに結合するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の双方の同時発現のためのバイシストロン性レトロウイルスベクターを開示する。ＴＣＲα鎖をコード化する第１の遺伝子の発現はＬＴＲによって制御され、ＴＣＲβ鎖をコード化する第２の遺伝子はＩＲＥＳによって制御される。ｐ５３ ＴＣＲで形質導入されたリンパ球は、ペプチドをパルス投与されたＡＰＣ、ならびに野生型または変異型ｐ５３タンパク質で形質移入されたＨＬＡ－Ａ２．１＋細胞を高い結合力で特異的に認識できた。

非特許文献３は、抗ＭＡＲＴ－１ ＴＣＲの同時発現のための様々なバイシストロン性レトロウイルスベクターを開示する。ＴＣＲα鎖をコード化する第１の遺伝子の発現はＬＴＲによって制御され、ＴＣＲβ鎖をコード化する第２の遺伝子はＩＲＥＳによって制御され、逆もまた同様である。さらに、ＴＣＲα鎖をコード化する第１の遺伝子の発現はＬＴＲによって制御され、ＴＣＲβ鎖をコード化する第２の遺伝子はＰＧＫプロモーターによって制御され、逆もまた同様である。これらのベクターで形質導入されたＴ細胞は、高活性Ｔ細胞エフェクター機能を示した。

非特許文献４は、ＮＹ－ＥＳＯ－１ ＴＣＲの同時発現のためのバイシストロン性レトロウイルスベクターを開示する。ＴＣＲα鎖をコード化する第１の遺伝子の発現はＬＴＲによって制御され、ＴＣＲβ鎖をコード化する第２の遺伝子はＩＲＥＳによって制御され、またはＴＣＲα鎖をコード化する第１の遺伝子の発現はＬＴＲによって制御され、ＴＣＲβ鎖をコード化する第２の遺伝子はＰＧＫプロモーターによって制御される。形質導入されたリンパ球は、ＨＬＡ－Ａ２およびＮＹ－ＥＳＯ－１陽性黒色腫細胞株を効率的に認識して殺滅し得る。

非特許文献５は、フューリン切断部位とアミノ酸スペーサー（ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８））とを組み合わせた後に、２Ａリボソームスキップペプチドを導入して、抗ｇｐ１００ＴＣＲまたは抗ベクタバイシストロニック・レンチウイルス・ベクターを開示する。スペーサー配列が合成Ｖ５ペプチドタグ配列の付加によって増強された場合、タンパク質プロセシングが増強され、形質導入されたリンパ球における高レベルのＴＣＲ発現を媒介できるレンチウイルスベクターをもたらしした。

Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １５；１７１（６）：３２８７－３２ｐｅｒｃｅｎｔ Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １；１７５（９）：５７９９－５８０８ Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ． Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００５ Ａｐｒｉｌ；１６（４）：４５７－４７２ Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ａｐｒｉｌ １；１７４（７）：４４１５－４４２３ Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２００８ １５，１４１１－１４２３

養子細胞療法における安全で効率的な導入遺伝子発現のための、遺伝子送達システムの必要性が依然として存在する。

一態様では、本開示は、タンパク質Ｚ１をコード化する第１のヌクレオチド配列Ｓ１、タンパク質Ｚ２をコード化する第２のヌクレオチド配列Ｓ２、タンパク質Ｙ１をコード化する第３のヌクレオチド配列Ｓ３、およびタンパク質Ｙ２をコード化する第４のヌクレオチド配列Ｓ４を含んでなるベクターを含む、遺伝子送達システムを提供し、その中ではＺ１とＺ２が第１の二量体を形成し、Ｙ１とＹ２が第２の二量体を形成し、その中では第１の二量体Ｚ１Ｚ２は、第２の二量体Ｙ１Ｙ２とは異なり、ここで遺伝子送達システムは、適応細胞療法に使用される。

別の態様では、Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３－Ｓ４、Ｓ１－Ｓ２－Ｓ４－Ｓ３、Ｓ１－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ４、Ｓ１－Ｓ３－Ｓ４－Ｓ２、Ｓ１－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２、Ｓ１－Ｓ４－Ｓ２－Ｓ３、Ｓ２－Ｓ１－Ｓ３－Ｓ４、Ｓ２－Ｓ１－Ｓ４－Ｓ３、Ｓ２－Ｓ３－Ｓ１－Ｓ４、Ｓ２－Ｓ３－Ｓ４－Ｓ１、Ｓ２－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ１、Ｓ２－Ｓ４－Ｓ１－Ｓ３、Ｓ３－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ４、Ｓ３－Ｓ１－Ｓ４－Ｓ２、Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ４、Ｓ３－Ｓ２－Ｓ４－Ｓ１、Ｓ３－Ｓ４－Ｓ１－Ｓ２、Ｓ３－Ｓ４－Ｓ２－Ｓ１、Ｓ４－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３、Ｓ４－Ｓ１－Ｓ３－Ｓ２、Ｓ４－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ３、Ｓ４－Ｓ２－Ｓ３－Ｓ１、Ｓ４－Ｓ３－Ｓ１－Ｓ２、またはＳ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１から選択される、５’から３’方向でタンデムに配列されたＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４であってもよい。

別の態様では、ベクターは、２Ａペプチドをコード化する第５のヌクレオチド配列Ｓ５と、リンカーペプチドをコード化する第６のヌクレオチド配列Ｓ６とをさらに含んでもよく、Ｓ５およびＳ６が、Ｓ１とＳ２、Ｓ１とＳ３、Ｓ１とＳ４、Ｓ２とＳ３、Ｓ２とＳ４、および／またはＳ３とＳ４の間に配置される、ベクター。

別の態様では、２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（配列番号３）、Ｔ２Ａ（配列番号４）、Ｅ２Ａ（配列番号５）、またはＦ２Ａ（配列番号６）から選択されてもよい。

別の態様では、リンカーペプチドは、ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８）であってもよい。

別の態様では、ベクターは、第７のヌクレオチド配列Ｓ７をコード化する、フューリンペプチド（配列番号２）を含んでもよく、ここでＳ７は、Ｓ１とＳ２、Ｓ１とＳ３、Ｓ１とＳ４、Ｓ２とＳ３、Ｓ２とＳ４、および／またはＳ３とＳ４の間に配置される。

別の態様では、ベクターは、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）またはａＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）から選択される、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列をさらに含んでもよい。

別の態様では、ベクターは、Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４、Ｓ５、Ｓ６および／またはＳ７の転写を制御するプロモーター配列をさらに含んでもよく、プロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含有する修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターから選択される。

別の態様では、第１の二量体Ｚ１Ｚ２は、配列番号１３と１４、１５と１６、１７と１８、１９と２０、２１と２２、２３と２４、２５と２６、２７と２８、２９と３０、３１と３２、３３と３４、３５と３６、３７と３８、３９と４０、４１と４２、４３と４４、４５と４６、４７と４８、４９と５０、５１と５２、５３と５４、５５と５６、５７と５８、５９と６０、６１と６２、６３と６４、６５と６６、６７と６８、６９と７０、７１と７２、７３と７４、７５と７６、７７と７８、７９と８０、８１と８２、８３と８４、８５と８６、８７と８８、または８９と９０から選択されてもよい。

別の態様では、第２の二量体Ｙ１およびＹ２は、配列番号１１および１２で記載される。

別の態様では、配向はＳ２－Ｓ１－Ｓ４－Ｓ３である。

別の態様では、ベクターは、ＰＴＥ ＷＰＲＥ（配列番号９１）、ＴＰＥ ＷＰＲＥ（配列番号９２）、またはＰＴＥ ｆｎ ＷＰＲＥ（配列番号９３）から選択される配列を有する。

別の態様では、配向はＳ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１である。

別の態様では、ベクターは、配列ＰＴＥ ＣＤ８ ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号９４）を有する。

別の態様では、ウイルスベクターは、アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、またはピコルナウイルスから選択される。

別の態様では、ベクターは、天然ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、ＲＤ１１４のキメラバージョン（ＲＤ１１４ＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ＧＡＬＶのキメラバージョン（ＧＡＬＶ－ＴＲ）、両栄養性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ４０７０Ａ）、バキュロウイルス（ＧＰ６４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、エボラウイルス（ＥｂｏＶ）、ヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）、またはリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）から選択されるウイルスのエンベロープタンパク質で偽型化されている。

別の態様では、ベクターは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）のエンベロープタンパク質で偽型化されている。

一態様では、本開示は、Ｔ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、アミノビスホスホネートの存在下で単離Ｔ細胞を活性化するステップと、活性化されたＴ細胞を本明細書に記載のベクターで形質導入するステップと、形質導入されたＴ細胞を増殖させるステップとを含む、免疫療法のためのＴ細胞を調製する方法に関する。

別の態様では、Ｔ細胞は白血球アフェレーシスヒトサンプルから単離されてもよい。

別の態様では、アミノビスホスホネートは、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物から選択されてもよい。

別の態様では、活性化するステップは、ヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ－２）およびヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ－１５）の存在下でさらに行われてもよい。

別の態様では、増殖させるステップは、ＩＬ－２とＩＬ－１５の存在下で行われてもよい。

別の態様では、Ｔ細胞はγδＴ細胞であってもよい。

別の態様では、第１の二量体Ｚ１Ｚ２および第２の二量体Ｙ１Ｙ２は、増殖したＴ細胞の表面上で同時発現される。

別の態様では、本開示は、上記の態様の方法によって調製された増殖したＴ細胞集団に関連している。

一態様では、本開示は、本明細書に記載の増殖したＴ細胞の集団を含んでなる組成物を患者に投与するステップを含んでなる、がんを有する患者を治療する方法に関し、その中でＴ細胞は、表面上にＭＨＣ分子との複合体でペプチドを提示するがん細胞を殺滅し、ここでペプチドが、配列番号９８～２５５のいずれかから選択され、その中ではがんは、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、尿膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、および前立腺がんからなる群から選択される。

別の態様では、組成物は、アジュバントをさらに含む。

別の態様では、アジュバントは、抗ＣＤ４０抗体、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ－（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、ポリ（ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧ）との粒子状製剤、ビロソーム、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３の１つまたは複数から選択される。

一態様では、本開示は、本明細書に記載の増殖したＴ細胞の集団を含んでなる組成物を患者に投与するステップを含んでなる、がんを有する患者における免疫応答を引き起こす方法に関し、その中でＴ細胞は、表面上にＭＨＣ分子との複合体でペプチドを提示するがん細胞を殺滅し、ここでペプチドが、配列番号９８～２５５のいずれかから選択され、その中ではがんは、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、尿膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、および前立腺がんからなる群から選択される。

別の態様では、免疫応答は、細胞傷害性Ｔ細胞応答を含んでなる。

一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法でスタチンを使用することによって、Ｔ細胞を調製する方法を提供する。別の態様では、本開示は、Ｔ細胞をスタチンの存在下で活性化することによって、Ｔ細胞を調製する方法を提供する。

なおも別の態様では、本開示は、Ｔ細胞をスタチンの存在下で活性化するステップと、活性化されたＴ細胞を、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）エンベロープタンパク質で偽型化されていてもよい、本開示のベクターで形質導入するステップと、形質導入されたＴ細胞を増殖させるステップとを含む、免疫療法のためのＴ細胞を調製する方法に関する。

別の態様では、Ｔ細胞としては、αβＴ細胞、γδＴ細胞、および／またはナチュラルキラーＴ細胞が挙げられてもよい。

別の態様では、スタチンアトルバスタチン、セリバスタチン、ダルバスタチン、フルインドスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、シムバスタチン、ベロスタチン、およびロスバスタチンから選択されてもよい。

一態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化するステップと、活性化されたＴ細胞を本開示のベクターで形質導入するステップと、形質導入されたＴ細胞を増殖させるステップとを含む、免疫療法のためのＴ細胞を調製する方法に関する。

別の態様では、活性化するステップは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下でさらに行われてもよい。

別の態様では、増殖させるステップは、ＩＬ－７およびＩＬ－１５の存在下で行われてもよい。

本開示の一実施形態による、γδＴ細胞の製造工程を示す。γδＴ細胞製造は、例えば、白血球アフェレーシス産物などの白血球またはＰＢＭＣを採取または入手するステップと、ＰＢＭＣまたは白血球アフェレーシス産物からαβＴ細胞を枯渇させるステップと、それに続くγδＴ細胞の活性化、形質導入、および増殖を含んでもよい。 本開示のいくつかの実施形態による、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）シャフリングを伴う形質導入ストラテジーを示す。 本開示のいくつかの実施形態による、レンチウイルスコンストラクトを示す。 ゾレドロネート、ＩＬ－２、およびＩＬ－１５による活性化後３日目または６日目に、γδＴ細胞を形質導入するために使用されるＲＤ１１４ＴＲで偽型化されたレンチウイルスを示す。ＴＣＲ（Ｖβ８）およびＣＤ８（ＣＤ８α）に特異的な抗体を使用して、フローサイトメトリーを介して導入効率が評価された。 Ａ 本開示の実施形態よるコンストラクトを示す。 Ｂ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ｃ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ｄ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ａ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ｂ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 本開示のいくつかの実施形態によるコンストラクトの概略図を示す。 Ａ 本開示の実施形態よるコンストラクトを示す。 Ｂ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ｃ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ｄ 本開示の実施形態による別のコンストラクトを示す。 Ａ 本開示のいくつかの実施形態によるコンストラクトの概略図を示す。 Ｂ 本開示のいくつかの実施形態によるコンストラクトの概略図を示す。 ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入された、％ＣＤ８＋ＴＣＲ＋γδＴ細胞を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。 ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入されたγδＴ細胞における、ＣＤ８およびＴＣＲの中央値蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。 Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイによって判定された、例えば、ＵＡＣＣ２５７（上側パネル）などの高抗原発現腫瘍細胞株、または例えば、Ｕ２ＯＳ（下側パネル）などの低抗原発現腫瘍細胞株において、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入された、ドナー３から得られたγδＴ細胞の腫瘍殺滅活性を示している。標的のみおよび非形質導入細胞は、対照として機能する。 Ａ－Ｃ 例えば、ＵＡＣＣ２５７（図１３Ａ）などの高抗原発現腫瘍細胞株、または例えば、Ｕ２ＯＳ（図１３Ｂ）などの低抗原発現腫瘍細胞株、または例えば、ＭＣＦ－７（図１３Ｃ）などの抗原陰性腫瘍細胞株において、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入されたドナー３から得られたγδＴ細胞によるインターフェロン（ＩＦＮ）－γ分泌の量を示す。非形質導入細胞が、対照として機能する。 Ｉｎｃｕｃｙｔｅ細胞傷害性アッセイによって判定された、例えば、ＵＡＣＣ２５７（上側パネル）などの高抗原発現腫瘍細胞株、または例えば、Ｕ２ＯＳ（下側パネル）などの低抗原発現腫瘍細胞株において、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入された、ドナー４から得られたγδＴ細胞の腫瘍殺滅活性を示している。標的のみおよび非形質導入細胞は、対照として機能する。 Ａ－Ｃ 例えば、ＵＡＣＣ２５７（図１５Ａ）などの高抗原発現腫瘍細胞株、または例えば、Ｕ２ＯＳ（図１５Ｂ）などの低抗原発現腫瘍細胞株、または例えば、ＭＣＦ－７（図１５Ｃ）などの抗原陰性腫瘍細胞株において、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入されたドナー４から得られたγδＴ細胞によるＩＦＮ－γ分泌の量を示す。非形質導入細胞が、対照として機能する。 ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入された、γδＴ細胞におけるウイルスベクターのコピー数を示す。非形質導入細胞が、対照として機能する。 Ａ－Ｂ ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入された、ドナー３（図１７Ａ）またはドナー４（図１７Ｂ）から得られたγδＴ細胞の倍数増殖を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。 Ａ 本開示のいくつかの実施形態に従ってフローサイトメトリーによって判定された、γδＴ細胞の記憶表現型を示す。 Ｂ ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．Ｆｎ．ＷＰＲＥ、またはＴＰＥ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターで形質導入された、γδＴ細胞の記憶表現型を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。 例えば、１２０μｌの各Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥとＣＤ８，ＷＰＲＥ（パネルＤ）、２４０μｌの各Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥとＣＤ８，ＷＰＲＥ（パネルＥ）など、ウィルスベクターの量を増加させながら、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する単一のレンチウイルスベクター（ＬＶ）で導入された（パネルＢ（１２０μｌ）およびパネルＣ（２４０μｌ））γδＴ細胞、またはＲ１１ＫＥ．ＷＰＲＥを含有するものとＣＤ８、ＷＰＲＥを含有するものの２つの別々のレンチウイルスベクターで形質導入された（パネルＤおよびＥ）γδＴ細胞間の形質導入効率の比較を示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。 ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有するウイルスベクターの量の増加、例えば、３０μｌ、１２０μｌ、および２４０μｌで形質導入された、γδＴ細胞における増強された形質導入効率を示す。非形質導入細胞が、対照として機能する。 例えば、ＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥなどの本開示の４－ｉｎ－１コンストラクトを発現するレンチウイルスベクター（ＬＶ）の様々な希釈を使用して、ドナー５およびドナー６から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞における強制ＣＤ８発現を示す。 例えば、ＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥなどの本開示の４－ｉｎ－１コンストラクトを発現するＬＶの様々な希釈液を使用した、ＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴＣＲ発現の検出を示す。 例えば、ＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥなどの本開示の４－ｉｎ－１コンストラクトで形質導入されたドナー５（上側パネル）およびドナー６（下側パネル）から得られた、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞における％標的ペプチド／ＭＨＣ複合体デキストラマー２０３（Ｄｅｘ２０３）を示す。 例えば、ＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥなどの本開示の４－ｉｎ－１コンストラクトで形質導入されたドナー５（上側パネル）およびドナー６（下側パネル）から得られた、ＣＤ８＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＤｅｘ２０３ ＭＦＩを示す。 本開示の一実施形態による４－ｉｎ－１コンストラクトまたはＴＣＲのみのコンストラクトで形質導入された、Ｔ細胞の機能性を試験するための実験デザインを示す。 Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥ（ＬＶ－ＴＣＲ）（ＴＣＲ）を含有するレンチウイルスベクター、またはＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ（ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ）（ＴＣＲ＋ＣＤ８）を含有するレンチウイルスベクターで形質導入され、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーナーから得られた、ＣＤ４－ＣＤ８αＴ細胞におけるＩＦＮ－γ陽性細胞の増加（上側パネル）およびＩＦＮ－γ ＭＦＩの増加（下側パネル）を非標的発現ＭＣＦ７との共培養との比較で示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。 ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入され、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーから得られたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞における、グランザイムＢ陽性細胞の増加％（上側パネル）およびグランザイムＢ ＭＦＩの増加（下側パネル）を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝３）。 ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）または非含有形質導入（ＮＴ）で形質導入され、高標的化発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーから得られた、ＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ陽性細胞の増加％（上側パネル）およびＩＦＮ－γ ＭＦＩの増加（下側パネル）を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。 ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）または非含有形質導入（ＮＴ）で形質導入され、高標的化発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーから得られた、ＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞におけるグランザイムＢ陽性細胞の増加％（上側パネル）およびグランザイムＢ ＭＦＩの増加（下側パネル）を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。 ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入され、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞における、ＩＦＮ－γ陽性細胞の増加％（上側パネル）およびＩＦＮ－γ ＭＦＩの増加（下側パネル）を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。 ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入され、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞における、グランザイムＢ陽性細胞の増加％（上側パネル）およびグランザイムＢ ＭＦＩの増加（下側パネル）を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝３）。 ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入され、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、グループ化ドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞における、ＩＦＮ－γ分泌の増加を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す。非形質導入（ＮＴ）細胞、ＵＡＣＣ２５７細胞、およびＭＣＦ７細胞が対照として機能する（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。 ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入され、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養がそれに続いた、個々のドナー５、６、７、および８から得られたＣＤ３＋Ｔ細胞における、ＩＦＮ－γ分泌の増加を非標的化発現ＭＣＦ７との共培養と比較して示す。非形質導入（ＮＴ）細胞、ＵＡＣＣ２５７細胞単独、およびＭＣＦ７細胞単独が対照として機能する（エフェクター対標的細胞比＝２：１）。 アトルバスタチン、プラバスタチン、またはロスバスタチンで処理されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ２５＋細胞（上側パネル）、％ＣＤ６９＋細胞（中央パネル）、および％ヒト低密度リポタンパク質受容体（ｈＬＤＬＲ）＋細胞（下側パネル）を示す。予備活性化細胞、スタチンまたはＤＭＳＯなしで活性化された細胞（対照）、およびＤＭＳＯが対照として機能する。 アトルバスタチン、プラバスタチン、またはロスバスタチンで処理されたＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における、％ＣＤ２５＋細胞（上側パネル）、％ＣＤ６９＋細胞（中央パネル）、および％ｈＬＤＬＲ＋細胞（下側パネル）を示す。予備活性化細胞、スタチンまたはＤＭＳＯなしで活性化された細胞（対照）、およびＤＭＳＯが対照として機能する。 本開示の一実施形態によるレンチウイルスベクターの力価を示す。 本開示の一実施形態によるＴ細胞の製造工程を示す。

本明細書の用法では、「自己切断２Ａペプチド」という用語は、グリシンと最後のプロリンの間の正常なペプチド結合の形成を妨げて、次のコドンへのリボソームスキッピング、およびＧｌｙとＰｒｏの間の新生ペプチド切断をもたらすことによって、共翻訳的に作用する比較的短いペプチド（起源のウイルス次第で２０アミノ酸長程度）を指す。切断後、短い２Ａペプチドは「上流」タンパク質のＣ末端に融合したままである一方で、プロリンは「下流」タンパク質のＮ末端に付加される。自己切断２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス－１（Ｐ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Ｅ２Ａ）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（Ｆ２Ａ）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい（例えば、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＬＯＳ Ｏｎｅ ６：ｅ１８５５６，２０１１を参照されたい；２Ａ核酸およびアミノ酸配列を含むその内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される）。自己切断２Ａ配列の前にリンカー配列（ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８））を付加することによって、これは、例えば、ＴＣＲなどの生物学的に活性なタンパク質の効率的な合成を可能にしてもよい。

本明細書の用法では、「プロモーター」という用語は、遺伝子の転写を可能にする、遺伝子の一般に上流（センス鎖の５’領域に向かって）に位置するＤＮＡの調節領域を指す。プロモーターには、転写因子として知られるタンパク質によって認識される特定のＤＮＡ配列と応答要素が含まれる。これらの因子はプロモーター配列に結合し、遺伝子のコード領域からＲＮＡを合成する酵素であるＲＮＡポリメラーゼを動員する。例えば、本明細書で使用されるプロモーター配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含有する修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターから選択されてもよい。

本明細書の用法では「構成的プロモーター」という用語には、ほとんどの細胞または組織でほとんどの場合に遺伝子の転写を誘導する調節配列が含まれてもよい。いくつかの非限定的実施形態では、構成的プロモーターは、ＭＳＣＶプロモーター、ユビキチンＣ（Ｕｂｃ）プロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、ＰＧＫプロモーター、β－アクチンプロモーター、およびＲＯＳＡ２６プロモーターからなる群から選択されてもよい。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。誘導性プロモーターの活性は、シグナルに応答して増加または減少してもよい。例えば、誘導性プロモーターは、Ｔ細胞活性化またはイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）などのシグナルの存在に応答して転写を促進してもよい。誘導性プロモーターは、リン酸などのシグナルの不在に応答して、転写を促進してもよい。これらのシナリオのいずれにおいても、転写の量は、シグナルの量またはその不足に比例しても比例しなくてもよい。原核生物宿主細胞に適した誘導性プロモーターの例としては、限定されることなく、ＮＦＡＴ、ＣＤ６９、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏ、ｒｅｃＡ、ｔｅｔＡ、ｎａｒ、ファージＰＬ、ｃｓｐＡ、Ｔ７、およびＰＢＡＤプロモーターが挙げられてもよい（その内容全体が参照により援用される、Ｔｅｒｐｅ Ｋ．２００６ Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７２：２１１を参照されたい）。

いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、活性化されたＴ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）／ＡＰ１転写応答エレメント（ＴＲＥ）を含んでもよい。同族ペプチド／ＭＨＣ１複合体が認識されると、ＮＦＡＴは核へのＣａ２＋依存性転座を受けてもよく、そこでＮＦＡＴＴＲＥを保有する遺伝子の転写を促進する。適切なＮＦＡＴ ＴＲＥは当該技術分野で周知であり、ヒトＩＬ２プロモーターＮＦＡＴ ＴＲＥなどが挙げられる（Ｍａｃｉａｎ ｅｔ ａｌ（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００１ Ａｐｒ．３０；２０（１９）：２４７６－８９）。Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（”Ｔｕｍｏｒ－Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｗｉｔｈ ａｎ Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｇｅｎｅ Ｅｎｃｏｄｉｎｇ Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１２ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｍｅｌａｎｏｍａ，”Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２１：２２７８－２２８８，２０１５）は、臨床試験において、その発現が誘導性ＮＦＡＴプロモーターによって駆動される、一本鎖ＩＬ１２を分泌するように遺伝子操作されたヒト腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の使用について記載する。れらの引用文献の内容は、それらの全体が参照により援用される。

いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、例えば、その内容全体が参照により援用される、米国特許第５，７５９，８０５号で開示されるような、ＣＤ６９プロモーターを含んでもよい。ＣＤ６９は、活性化されたＴ細胞に誘導されるこれらの新たに合成された細胞表面活性化分子の中で、最初期のものの１つであってもよい。ＣＤ６９発現は、Ｔ細胞刺激から６０分間以内に観察され得るが、休止細胞では存在しなくてもよい。ＣＤ６９発現はまた、胸腺細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、および好中球上で誘導されてもよい。マウスＣＤ６９プロモーターの５０ｋｂ上流内に位置するＣＮＳ１－４と称される４つの非コード領域は、Ｔ細胞およびＢ細胞における、ＣＤ６９活性化の発生的および時間的制御に寄与してもよい。ＣＮＳ２領域は、強力なエンハンサーとして機能してもよい。その内容全体が参照により援用される、Ｋｕｌｅｍｚｉｎ ｅｔ ａｌ．（”Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔａｂｌｙ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）ＮＫ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，”ＢＭＣ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２０１９，１２（Ｓｕｐｐｌ ２）：４４，８８－９５）は、初代Ｔ細胞の文脈で、活性化誘導性ＣＤ６９プロモーター変異型が、最高の誘導倍率を提供することを記載する。したがって、このプロモーターを使用して、活性化されたヒトＴ細胞またはＣＡＲＴ細胞でタンパク質を発現させ得るが、休眠状態のヒトＴ細胞またはＣＡＲＴ細胞では発現させ得ない。

いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、ＩＰＴＧ－誘導性プロモーターであってもよい。ＩＰＴＧ誘導性プロモーターは、ＩＰＴＧに応答する様式で、またはｌａｃオペロンからの転写を促進することができる任意のその他の乳糖誘導体（例えば、アロラクトース）に応答する様式で、転写を促進する任意のポリヌクレオチド配列を指してもよい。限定されることなく、ｔａｃ（例えば、ｔａｃＩ、ｔａｃＩＩなど）プロモーター、ｌａｃプロモーター、およびそれらの誘導体（例えば、ｌａｃＵＶ５、ｔａｃｌａｃなど）をはじめとする、ＩＰＴＧ誘導性プロモーターの多くの例が、当該技術分野で公知である。

一態様では、ＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列を含有する、例えば、レンチウイルスベクターなどの４－ｉｎ－１ウイルスベクターの発現は、構成的または誘導性プロモーターによって駆動されてもよい。例えば、図５Ａは、例えば、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖（配列番号１３）およびＲ１１ＫＥβ鎖（配列番号１４）などのＴＣＲをコード化する配列から上流に位置する、ＣＤ８α（配列番号１２）およびＣＤ８β（配列番号１３）をコード化するコドン最適化配列を有し、構成的ＭＳＣＶプロモーター（配列番号１）によって駆動される、ＰＴＥ ＣＤ８ ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号９４）を含有する、４－ｉｎ－１ウイルスベクターを示す。上記と同じコード配列はまた、例えば、ＮＦＡＴ、ＣＤ６９、またはＩＰＴＧプロモーターなどの誘導性プロモーターによっても駆動され得る。

別の態様では、融合タンパク質、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列を含有する３－ｉｎ－１ウイルスベクターの発現は、構成的または誘導性プロモーターによって駆動されてもよい。例えば、図５Ｂは、融合タンパク質をコード化するコドン最適化配列を有する、ＣＤ８ａＣＤ４Ｆｕｓｉｏｎ．ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号２５６）を含有するウイルスベクターを示し、その中ではＣＤ８α細胞外ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインおよびＣＤ４細胞内ドメインと融合し、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖（配列番号１３）およびＲ１１ＫＥβ鎖（配列番号１４）をコード化する配列は、ＭＳＣＶプロモーター（配列番号１）によって駆動される。図５Ｃは、融合タンパク質をコード化するコドン最適化配列を有する、ＣＤ８ｂＣＤ４Ｆｕｓｉｏｎ．ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号２５７）を含有するウイルスベクターを示し、その中ではＣＤ８β細胞外ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインおよびＣＤ４細胞内ドメインと融合し、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖（配列番号１３）およびＲ１１ＫＥβ鎖（配列番号１４）をコード化する配列は、ＭＳＣＶプロモーター（配列番号１）によって駆動される。図５Ｄは、融合タンパク質をコード化する配列を有するＣＤ８ｂＣＤ８ａＦｕｓｉｏｎ．ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号２５８）を含有するウイルスベクターを示し、その中ではＣＤ８β細胞外ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインおよびＣＤ８α細胞内ドメインと融合し、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖（配列番号１３）およびＲ１１ＫＥβ鎖（配列番号１４）をコード化する配列は、ＭＳＣＶプロモーター（配列番号１）によって駆動される。上記と同じコード配列はまた、例えば、ＮＦＡＴ、ＣＤ６９、またはＩＰＴＧプロモーターなどの誘導性プロモーターによっても駆動され得る。

一態様では、本開示の４－ｉｎ－１ウイルスベクターの発現は、双方向性の構成的および／または誘導性プロモーターによって駆動されてもよい。例えば、図６Ａは、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖をコード化する配列から上流に位置する、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖をコード化するコドン最適化された配列を有する、ＰＧＫ．ＣＤ８．ＥＦ１ａ．ＴＣＲ（配列番号２５９）を含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターを示し、その中ではＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖をコード化する配列、およびＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖をコード化する配列は、例えば、ＰＧＫプロモーターおよびＥＦ－１αプロモーターなどの双方向性プロモーターによって隔てられてもよい。ＰＧＫプロモーターは、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖をコード化するコドン最適化された配列の３’末端に配置して、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖の発現を駆動してもよい。ＥＦ－１αプロモーターは、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖をコード化する配列の５’末端に配置されて、ＴＣ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖の発現を駆動してもよい。

図６Ｂは、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖をコード化するコドン最適化された配列から上流に位置するＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖をコード化する配列を有する、ＰＧＫ．ＴＣＲ．ＥＦ１ａ．ＣＤ８（配列番号２６０）を含有する別の４－ｉｎ－１ウイルスベクターを示し、その中ではＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖をコード化する配列、およびＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖をコード化する配列は、例えば、ＰＧＫプロモーターおよびＥＦ－１αプロモーターなどの双方向性プロモーターによって隔てられてもよい。ＰＧＫプロモーターは、ＴＣＲ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖をコード化する配列の３’末端に配置されて、ＴＣ Ｒ１１ＫＥα鎖およびＲ１１ＫＥβ鎖の発現を駆動してもよい。ＥＦ－１αプロモーターは、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖をコード化するコドン最適化された配列の５’末端に配置して、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖の発現を駆動してもよい。

本開示のいくつかの実施形態は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列、およびサイトカイン（、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、およびＩＬ－２１をはじめとするが、これらに限定されるものではない）、ＩＬ－１５／ＩＬ－１５受容体（ＩＬ－１５Ｒ）融合タンパク質、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体（ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩ）、および／または形質転換成長因子β受容体の細胞外ドメインなどのその他のタンパク質をコード化する配列を含有する、ウイルスベクターを含んでもよい。いくつかの実施形態では、これらのコード配列は、プロモーターまたは双方向性プロモーターによって駆動されてもよい。

図７は、サイトカインをコード化する配列から上流に位置するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列を含有するウイルスベクターを示し、その中ではＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖 をコード化する配列、およびサイトカインをコード化する配列は、双方向性プロモーターによって隔てられてもよい。双方向性プロモーターは、５’から３’方向に、構成的－構成的、構成的－誘導性、誘導性－構成的、または誘導性－誘導性の方向に配置されてもよい。例えば、例えば、ＭＳＣＶ、ＰＧＫ、またはＥＦ１αプロモーターなどの構成的プロモーターは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列の３’末端に配置されて、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の発現を駆動してもよい。例えば、ＮＦＡＴ、ＣＤ６９、またはＩＰＴＧプロモーターなどの誘導性プロモーターは、サイトカインをコード化する配列の５’末端に配置されて、サイトカインの発現を駆動してもよい。図８Ａは、図７に示されるウイルスベクターにおいて、例えば、ＩＬ－１２α（ｐ３５）／ＩＬ－１２β（ｐ４０）融合タンパク質（配列番号２６１）などのＩＬ－１２をコード化する配列の５’末端に配置されて、１２α（ｐ３５）／ＩＬ－１２β（ｐ４０）融合タンパク質の発現を駆動する、最小ＩＬ－２プロモーターを有する誘導性ＮＦＡＴプロモーターを示す。図８Ｂは、図７に示されるウイルスベクターにおいて、例えば、ＩＬ－１２α（ｐ３５）／ＩＬ－１２β（ｐ４０）融合タンパク質（配列番号２６２）などのＩＬ－１２をコード化する配列の５’末端に配置されて、１２α（ｐ３５）／ＩＬ－１２β（ｐ４０）融合タンパク質の発現を駆動する、ＣＮＳ１およびＣＮＳ２エンハンサーエレメントを有する誘導性ＣＤ６９プロモーターを示す。図８Ｃは、図７に示されるウイルスベクターにおいて、例えば、ＩＬ－１８変異型１（配列番号２６３）などのＩＬ－１８をコード化する配列の５’末端に配置されて、ＩＬ－１８変異型１の発現を駆動する、最小ＩＬ－２プロモーターを有する誘導性ＮＦＡＴプロモーターを示す。図８Ｃは、図７に示されるウイルスベクターにおいて、例えば、ＩＬ－１８変異型１（配列番号２６４）などのＩＬ－１８をコード化する配列の５’末端に配置されて、ＩＬ－１８変異型１の発現を駆動する、ＣＮＳ１およびＣＮＳ２エンハンサーエレメントを有する誘導性ＣＤ６９プロモーターを示す。

一態様では、本開示は、ＣＤ８β－ＣＤ８α－ＴＣＲβ－ＴＣＲαの５’末端から３’末端方向の配向を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。別の態様では、本開示は、ＣＤ８β－ＣＤ８α－ＴＣＲα－ＴＣＲβの５’末端から３’末端方向の配向を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。別の態様では、本開示は、ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＴＣＲβ－ＴＣＲαの５’末端から３’末端方向の配向を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。別の態様では、本開示は、ＣＤ８α－ＣＤ８β－ＴＣＲα－ＴＣＲβの５’末端から３’末端方向の配向を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。

一態様では、本開示は、ＴＣＲβ－ＴＣＲα－ＣＤ８α－ＣＤ８βを含まない５’末端から３’末端の配向を有する、４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。別の態様では、本開示は、ＴＣＲβ－ＴＣＲα－ＣＤ８β－ＣＤ８αを含まない５’末端から３’末端の配向を有する、４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。別の態様では、本開示は、ＴＣＲα－ＴＣＲβ－ＣＤ８α－ＣＤ８βを含まない５’末端から３’末端の配向を有する、４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。別の態様ではでは、本開示は、ＴＣＲα－ＴＣＲβ－ＣＤ８β－ＣＤ８αを含まない５’末端から３’末端の配向を有する、４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。

一態様では、本開示は、ＣＤ８β－ＣＤ８α－ＴＣＲβ－ＴＣＲαの５’末端から３’末端方向の配向を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。非限定的な一態様では、本開示は、ＴＣＲβ－ＴＣＲα－ＣＤ８α－ＣＤ８βを含まない５’末端から３’末端の配向を有する、４－ｉｎ－１コンストラクトを提供する。

いくつかの実施形態では、本開示のウイルスベクターは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列と、例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体（ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩ）などのＴＧＦ－β阻害剤と、および／または形質転換成長因子－β受容体の細胞外ドメインをコード化する配列とを含有してもよい。図９Ａは、ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩ、をコード化する配列から上流に位置するＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列を含有するウイルスベクターを示し、その中ではＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖 をコード化する配列、およびＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩをコード化する配列は、双方向性プロモーターによって隔てられてもよい。例えば、図９Ａは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列の３’末端に配置されて、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖の発現を駆動してもよい、例えば、ＭＳＣＶ、Ｕｂｃ、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、およびＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーターを示し；別の構成的プロモーターは、ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩをコード化する配列の５’末端に配置されて、ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩの発現を駆動してもよい。

代案としては、図９Ｂは、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖をコード化する配列から上流に位置して、ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩ、ＴＣＲα鎖、およびＴＣＲβ鎖の発現を駆動する、ＤＮ ＴＧＦｂＲＩＩをコード化する配列の５’末端に配置された、例えば、ＭＳＣＶ、Ｕｂｃ、ＣＭＶ、ＥＦ－１α、およびＰＧＫプロモーターなどの構成的プロモーターを含有するウイルスベクターを示す。上記と同じコード配列はまた、例えば、ＮＦＡＴ、ＣＤ６９、またはＩＰＴＧプロモーターなどの誘導性プロモーターによっても駆動され得る。

本明細書の用法では、「シストロン」という用語は、１つのポリペプチド鎖の形成を指定する、すなわち１つのポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ分子の一部分を指す。例えば、「バイシストロン」は、２つのポリペプチド鎖の形成を特定する、すなわち２つのポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ分子の２つのセクションを指す；「トリシストロン」は、３つのポリペプチド鎖の形成を特定する、すなわち３つのポリペプチド鎖をコード化するＤＮＡ分子の３つのセクションを指す。

本明細書の用法では、「マルチシストロン性ＲＮＡ」または「マルチシストロン性ＲＮＡ」という用語は、いくつかのタンパク質に翻訳するための遺伝情報を含有するＲＮＡを指す。対照的に、単シストロン性ＲＮＡは、単一タンパク質のみを変換するための遺伝情報を含有する。本開示の文脈で、実施例２～４においてレンチウイルスから転写されたマルチシストロン性ＲＮＡは、４つのタンパク質（４－ｉｎ－１）：ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ８α鎖、およびＣＤ８β鎖に翻訳されてもよく；または２つのタンパク質（２－ｉｎ－１）：ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖またはＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖に翻訳されてもよい。

本明細書の用法では、「タンデムに配置される」という用語は、核酸配列上の１つのファイル中で遺伝子が隣接し、一方が他方に続き、または後ろに配置されていることを指す。遺伝子は、核酸配列上で隣接してライゲートされ、各遺伝子のコード鎖（センス鎖）は、核酸配列上で一緒にライゲートされている。

本明細書の用法では、「センス鎖」という用語は、タンパク質に翻訳されるまたは翻訳可能な遺伝子のＤＮＡ鎖を指す。遺伝子が核酸配列のプロモーターに対して「センス方向」に配向している場合、「センス鎖」はプロモーターの５’末端に位置し、ここで、タンパク質をコード化する核酸の最初のコドンはプロモーターの近位にあり、最後のコドンはプロモーターから遠位にある。

本明細書の用法では、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも１つの要素を含み、ウイルスベクター粒子にパッケージ化される能力を有し、少なくとも外因性核酸をコード化する、核酸ベクターコンストラクトを指す。ベクターおよび／または粒子は、生体外または生体内のどちらかで、任意の核酸を細胞に移し入れる目的で利用され得る。多数の形態のウイルスベクターが、当該技術分野で公知である。「ビリオン」という用語は、単一の感染性ウイルス粒子を指すために使用される。「ウイルスベクター」、「ウイルスベクター粒子」、および「ウイルス粒子」はまた、細胞の外側に存在するように、そのＤＮＡまたはＲＮＡコアおよびタンパク質コートを有する完全なウイルス粒子を指す。例えば、ウイルスベクターは、アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、またはピコルナウイルスから選択されてもよい。

「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」という用語は技術分野で認識されており、胸腺細胞、ナイーブＴリンパ球、未成熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、または活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。特定の実施形態で使用するのに適した例示的なＴ細胞集団としては、ヘルパーＴ細胞（ＨＴＬ；ＣＤ４＋Ｔ細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ；ＣＤ８＋Ｔ細胞）、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、αβＴＣＲを発現するＴ細胞（αβＴ細胞）、γδＴＣを発現するＴ細胞Ｒ（γδＴ細胞）、または任意のその他のＴ細胞サブセットが挙げられるが、これらに限定されるものではない。特定の実施形態で使用するのに適したその他の例示的なＴ細胞集団としては、マーカー：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１２７、ＣＤ１９７、およびＨＬＡ－ＤＲの１つまたは複数を発現するＴ細胞が挙げられるが、これらに限定されず、所望ならば、正または負の選択技術によってさらに単離され得る。

「スタチン」、「バスタチン」、または本明細書で同義的に使用される「３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ阻害剤」という用語は、酵素３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼを阻害する医薬品を指す。この酵素は、ＨＭＧ－ＣｏＡのメバロン酸への変換に関与しており、これはコレステロール生合成のステップの１つである。このような阻害は、当業者に周知の標準的なアッセイに従って容易に判定される。

本開示に従って使用されてもよい好ましいスタチンとしては、米国特許第４，６８１，８９３号明細書で開示されたアトルバスタチン；米国特許第５，２７３，９９５号明細書で開示されたアトルバスタチンカルシウム，；米国特許第５，５０２，１９９号明細書で開示されたセリバスタチン；米国特許第５，３１６，７６５号明細書で開示されたダルバスタチン；米国特許第４，９１５，９５４号明細書で開示されたフルインドスタチン；米国特許第４，７３９，０７３号明細書で開示されたフルバスタチン；米国特許第４，２３１，９３８号明細書で開示されたロバスタチン；米国特許第３，９８３，１４０号明細書で開示されたメバスタチン；米国特許第４，３４６，２２７号明細書で開示されたプラバスタチン；米国特許第４，４４４，７８４号明細書で開示されたシムバスタチン；米国特許第４，４４８，７８４号明細書および米国特許第４，４５０，１７１号明細書で開示されたベロスタチン；および米国特許第６，８５８，６１８明細書および米国特許第７，５１１，１４０号明細書で開示されたロスバスタチンが挙げられる。これらの各参考文献の内容は、それらの全体が参照により本明細書に援用される。代表的な３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル補酵素Ａレダクターゼ阻害剤としては、アトルバスタチン、Ｌｉｐｔｏｒ（登録商標）としても知られているアトルバスタチンカルシウム、Ｍｅｖａｃｏｒ（登録商標）としても知られているロバスタチン、Ｐｒａｖａｃｈｏｌ（登録商標）としても知られているプラバスタチン、Ｚｏｃｏｒ（登録商標）としても知られているシムバスタチン、およびロスバスタチンが挙げられてもよい。

一態様では、本開示は、導入遺伝子発現に使用されてもよい、例えば、腫瘍浸潤リンパ球、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびγδＴ細胞などのＴ細胞の活性化、形質導入、および／または増殖に関する。別の態様では、本開示は、α－および／またはβ－ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させる一方で、γδＴ細胞活性化、形質導入、および増殖させることに関する。

一態様では、γδＴ細胞は、生体外で培養された複合サンプルから単離されてもよい。別の態様では、ＰＢＭＣ集団全体は、単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞などの特定の細胞集団の事前の枯渇なしに、活性化および増殖され得る。別の態様では、富化されたγδＴ細胞集団は、それらの特定の活性化および増殖に先立って生成され得る。別の態様では、γδＴ細胞の活性化および増殖は、ナイーブまたは操作されたＡＰＣの存在なしに実施されてもよい。その他の態様では、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離および増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体をはじめとする固定化γδＴ細胞マイトジェン、およびレクチンをはじめとするその他のγδＴＣＲ活性化剤を使用して実施され得る。別の態様では、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離および増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体をはじめとする固定化γδＴ細胞マイトジェン、およびレクチンをはじめとするその他のγδＴＣＲ活性化剤の非存在下で実施され得る。

一態様では、γδＴ細胞は、例えば、ヒト対象などの対象の白血球アフェレーシスから単離される。別の態様では、γδＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されない。

一態様では、単離されたγδＴ細胞は、１つまたは複数の抗原との接触に応答して急速に増殖し得る。Ｖγ９Ｖδ２＋Ｔ細胞などのいくつかのγδＴ細胞は、組織培養中に、プレニルピロリン酸塩、アルキルアミン、および代謝産物または微生物抽出物のようないくつかの抗原との接触に応答して生体外で急速に増殖し得る。刺激されたγδＴ細胞は、複合サンプルからのγδＴ細胞の単離を容易にし得る、多数の抗原提示、刺共激、および接着分子を示し得る。複合サンプル内のγδＴ細胞は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、または別の適当な期間にわたり、少なくとも１つの抗原によって生体外で刺激され得る。適切な抗原によるγδＴ細胞の刺激は、生体外でγδＴ細胞集団を増殖させ得る。

生体外における複合体試料からのγδＴ細胞の増殖を刺激するために使用されてもよい抗原の非限定的な例としては、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）などのプレニルピロリン酸塩、アルキルアミン、ヒト微生物病原体の代謝産物、常在細菌の代謝産物、メチル－３－ブテニル－１－ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（Ｅ）－４－ヒドロキシ－３－メチル－ブト－２－エニルピロリン酸（ＨＭＢ－ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ）、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸塩（ＤＭＡＰ）、ピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）、エチル－アデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ピロリン酸ゲラニル（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル－アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、モノエチルピロリン酸（ＭＥＰＰ）、３－ホルミル－１－ブチル－ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ－ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３－ホルミル－１－ブチル－ウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３－ホルミル－１－ブチル－デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイルピロリン酸、ジメチルアリル－γ－ウリジン三リン酸、クロトイル－γ－ウリジン三リン酸、アリル－γ－ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ－ブチルアミン、イソ－アミルアミン、および窒素含有ビスホスホネートが挙げられてもよい。

γδＴ細胞の活性化および増殖は、本明細書に記載の活性化剤および共刺激剤を使用して実施され、特定のγδＴ細胞増殖および持続集団を始動し得る。一態様では、異なる培養からのγδＴ細胞の活性化および増殖は、異なるクローナル集団サブセットまたは混合ポリクローナル集団サブセットを達成し得る。別の態様では、異なる作動薬を使用して、特定のγδ活性化シグナルを提供する作用物質が同定され得る。別の態様では、特定のγδ活性化シグナルを提供する作用物質は、γδＴＣＲに対する異なるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり得る。別の態様では、細胞エネルギーおよびアポトーシスの誘導なしに、特定のγδＴ細胞増殖を始動させるのを助ける、コンパニオン共刺激剤が使用され得る。これらの共刺激剤としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸ副分子－１（ＤＮＡＭ－１）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、およびＣＤ２８などのγδ細胞上で発現される受容体に結合するリガンドが挙げら得る。別の態様では、共刺激剤は、ＣＤ２およびＣＤ３分子上の独特のエピトープに特異的な抗体であり得る。ＣＤ２およびＣＤ３は、αβまたはγδＴ細胞上で発現されたときに、異なる立体構造を有し得る。別の態様では、ＣＤ３およびＣＤ２に対する特異的抗体は、γδＴ細胞の明瞭な活性化をもたらし得る。

γδＴ細胞の操作に先立って、γδＴ細胞の集団が生体外で増殖されてもよい。生体外におけるγδＴ細胞集団の増殖を促進するのに使用され得る試薬の非限定的例としては、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０抗体；ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－９、ＩＬ－３３、ＩＬ－１８、またはＩＬ－２１、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、ヨウシュヤマゴボウ（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、リンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）、またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。

広域スペクトルの抗原を認識するγδＴ細胞の能力は、γδＴ細胞の遺伝子操作によって増強され得る。一態様では、γδＴ細胞は操作され、生体内で選択された抗原を認識する普遍的な同種異系療法が提供され得る。γδＴ細胞の遺伝子操作は、抗原結合およびＴ細胞活性化機能の双方を単一受容体に組み合わせる、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの腫瘍認識部分を発現するコンストラクト、その抗原結合断片、またはリンパ球活性化ドメインを、単離γδＴ細胞、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２．ＩＬ－７．ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－１９、ＩＬ－３３、ＩＬ－４、ＩＬ－９、ＩＬ－２３、またはＩＬ１β）のゲノムに安定的に組み込んで、Ｔ細胞の増殖、生存期間、および機能を生体外および生体内で増強することを含んでもよい。単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作はまた、例えば、ＭＨＣ遺伝子座などの単離されたγδＴ細胞のゲノム中の１つまたは複数の内因性遺伝子からの遺伝子発現を欠失させ、または破壊することを含んでもよい。

操作されたγδＴ細胞は、様々な方法によって作製されてもよい。例えば、腫瘍認識部分、または別のタイプの認識部分を含んでなる、発現カセットをコード化するポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザーゼシステム；またはレンチウイルスまたはレトロウイルスシステムなどのウイルスベースの遺伝子移入システム；または形質移入、電気穿孔、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）、オルモシルなどのナノ工学物質などの別の適切な方法；アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスをはじめとするウイルス送達方法、または別の適切な方法によって、γδＴ細胞に安定に導入され得る。ヒト遺伝子治療には、その内容全体が本明細書に援用される、国際公開第１９９３０２０２２１号パンフレットに記載される方法などのいくつかのウイルス法が用いられている。γδＴ細胞を操作するために用られ得るウイルス法の非限定的例としては、γレトロウイルス法、アデノウイルス法、レンチウイルス法、単純ヘルペスウイルス法、ワクシニアウイルス法、ポックスウイルス法、またはアデノウイルス関連ウイルス法が挙げられてもよい。

一態様では、本明細書に記載のコンストラクトおよびベクターは、その内容全体が参照により援用される、２０１８年１１月２６日に出願された米国特許第１６／２００，３０８号明細書に記載の方法論で使用される。

一態様では、ウイルスとは、天然に存在するウイルスならびに人工ウイルスを指す。本開示のいくつかの実施形態によるウイルスは、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのどちらであってもよい。パルボウイルス（ＡＡＶなど）は、非エンベロープウイルスの例である。好ましい実施形態では、ウイルスは、エンベロープウイルスであってもよい。好ましい実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであってもよい。真核細胞のウイルス感染を促進し得るウイルス外被タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、改変ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）（配列番号９７）、および修飾テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）からのエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）で偽型化されたＨＩＶ－１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）を含んでもよい。これらのエンベロープタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をはじめとするパルボウイルスなどのその他のウイルスの侵入を効率的に促進し得て、それによってそれらの広範な効率を実証する。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）４０７０ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５に記載されているような）、ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏまたはＲＤｐｒｏ（ＲＤ１１４のＲペプチド切断配列をＨＩＶ－１マトリックス／カプシド（ＭＡ／ＣＡ）切断配列で置換することによって構築されたＲＤ１１４－ＨＩＶキメラ、その内容が参照により本明細書に援用される、Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１０；２３５：１２６９－１２７６に記載されているような）バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０８６９－１０８７８，２００７に記載されているような）、またはＧＡＬＶ ｅｎｖ（その内容が参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４－８４０，２００５に記載されているような）またはそれらの誘導体をはじめとする、その他のウイルスエンベロープタンパク質が使用されてもよい。

本開示の実施形態は、単一レンチウイルスカセットを使用して単一レンチウイルスベクターを作製し、単一マルチシストロン性ｍＲＮＡから２つの異なる二量体の少なくとも４つの個別のモノマータンパク質を発現させ、細胞表面上に二量体を同時発現させ得るという発見に基づいている。例えば、レンチウイルスベクターの単一コピーの組み込みは、γδＴ細胞を形質転換してＴＣＲαβとＣＤ８αβを同時発現させるのに十分であった。

一態様では、本開示は、１を超える、２つを超える、３つを超える、４つを超える遺伝子、５つを超える遺伝子、または６つを超える遺伝子を発現するできる、単一のベクター内にマルチシストロン性カセットを含有するベクターに関し、その中ではこれらの遺伝子によってコード化されたポリペプチドが、相互に作用するか、または二量体を形成してもよい。二量体は、ホモ二量体、すなわち、二量体を形成する２つの同一のタンパク質であっても、またはヘテロ二量体、すなわち、二量体を形成する２つの構造的に異なるタンパク質であってもよい。

一態様では、レンチウイルスベクターは、タンパク質Ｚ１をコード化する第１のヌクレオチド配列Ｓ１、タンパク質Ｚ２をコード化する第２のヌクレオチド配列Ｓ２、タンパク質Ｙ１をコード化する第３のヌクレオチド配列Ｓ３、およびタンパク質Ｙ２をコード化する第４のヌクレオチド配列Ｓ４を含有してもよく、その中ではＺ１とＺ２が第１の二量体を形成し、Ｙ１とＹ２が第２の二量体を形成し、その中では第１の二量体Ｚ１Ｚ２が、第２の二量体Ｙ１Ｙ２とは異なる。

一態様では、第１のレンチウイルスベクターは、二量体Ｚ１Ｚ２をコード化するバイシストロン性カセット（２－ｉｎ－１）を含有してもよく、第２のレンチウイルスベクターは、二量体Ｙ１Ｙ２をコード化するバイシストロン性カセット（２－イン－１）を含有してもよい。２－ｉｎ－１ベクター中では、Ｓ１とＳ２は、Ｓ１－Ｓ２またはＳ２－Ｓ１の５’から３’の方向にタンデムに配置されてもよい。同様に、２－ｉｎ－１ベクター中では、Ｓ３とＳ４は、Ｓ３－Ｓ４またはＳ４－Ｓ３の５’から３’の方向にタンデムに配置されてもよい。Ｚ１とＺ２またはＹ１とＹ２は、１つまたは複数の自己切断２Ａペプチドによって隔てられてもよい。

別の態様では、単一レンチウイルスベクター（４－ｉｎ－１）は、別個の二量体Ｚ１Ｚ２およびＹ１Ｙ２の双方をコード化してもよく、その中ではＺ１、Ｚ２、Ｙ１、およびＹ２は、１つまたは複数の自己切断２Ａペプチドによって隔てられてもよい。例えば、Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３－Ｓ４、Ｓ１－Ｓ２－Ｓ４－Ｓ３、Ｓ１－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ４、Ｓ１－Ｓ３－Ｓ４－Ｓ２、Ｓ１－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ２、Ｓ１－Ｓ４－Ｓ２－Ｓ３、Ｓ２－Ｓ１－Ｓ３－Ｓ４、Ｓ２－Ｓ１－Ｓ４－Ｓ３、Ｓ２－Ｓ３－Ｓ１－Ｓ４、Ｓ２－Ｓ３－Ｓ４－Ｓ１、Ｓ２－Ｓ４－Ｓ３－Ｓ１、Ｓ２－Ｓ４－Ｓ１－Ｓ３、Ｓ３－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ４、Ｓ３－Ｓ１－Ｓ４－Ｓ２、Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ４、Ｓ３－Ｓ２－Ｓ４－Ｓ１、Ｓ３－Ｓ４－Ｓ１－Ｓ２、Ｓ３－Ｓ４－Ｓ２－Ｓ１、Ｓ４－Ｓ１－Ｓ２－Ｓ３、Ｓ４－Ｓ１－Ｓ３－Ｓ２、Ｓ４－Ｓ２－Ｓ１－Ｓ３、Ｓ４－Ｓ２－Ｓ３－Ｓ１、Ｓ４－Ｓ３－Ｓ１－Ｓ２、またはＳ４－Ｓ３－Ｓ２－Ｓ１から選択される、５’から３’方向でタンデムに配列されたＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４であってもよい。

一態様では、二量体Ｚ１Ｚ２は、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖を有するＴＣＲであってもよい。

一態様では、本明細書に記載されるコンストラクト、方法、および実施形態と共に使用できるＴＣＲおよび抗原結合タンパク質としては、例えば、表２に記載されるもの（配列番号１３～９０）、および米国特許出願公開第２０１７０２６７７３８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０３１２３５０号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６１３９６号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６２９２２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２７３６０２号明細書、米国特許出願公開第２０１９００１６８０１号明細書、米国特許出願公開第２０１９０００２５５６号明細書、米国特許出願公開第２０１９０１３５９１４号明細書、米国特許第１０，５３８，５７３号明細書、米国特許第１０，６２６，１６０号明細書、米国特許出願公開第２０１９０３２１４７８号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２５６５７２号明細書、米国特許第１０，５５０，１８２号明細書、米国特許第１０，５２６，４０７号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２８４２７６号明細書、米国特許出願公開第２０１９００１６８０２号明細書、および米国特許第１０，５８３，５７３号明細書に記載されるＴＣＲおよび抗原結合タンパク質が挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

別の態様では、二量体Ｚ１Ｚ２は、Ｒ１１ＫＥＡ（配列番号１３および１４）、Ｒ２０Ｐ１Ｈ７（配列番号１５および１６）、Ｒ７Ｐ１Ｄ５（配列番号１７および１８）、Ｒ１０Ｐ２Ｇ１２（配列番号１９および２０）、Ｒ１０Ｐ１Ａ７（配列番号２１および２２）、Ｒ４Ｐ１Ｄ１０（配列番号２３および２４）、Ｒ４Ｐ３Ｆ９（配列番号２５および２６）、Ｒ４Ｐ３Ｈ３（配列番号２７および２８）、Ｒ３６Ｐ３Ｆ９（配列番号２９および３０）、Ｒ５２Ｐ２Ｇ１１（配列番号３１および３２）、Ｒ５３Ｐ２Ａ９（配列番号３３および３４）、Ｒ２６Ｐ１Ａ９（配列番号３５および３６）、Ｒ２６Ｐ２Ａ６（配列番号３７および３８）、Ｒ２６Ｐ３Ｈ１（配列番号３９および４０）、Ｒ３５Ｐ３Ａ４（配列番号４１および４２）、Ｒ３７Ｐ１Ｃ９（配列番号４３および４４）、Ｒ３７Ｐ１Ｈ１（配列番号４５および４６）、Ｒ４２Ｐ３Ａ９（配列番号４７および４８）、Ｒ４３Ｐ３Ｆ２（配列番号４９および５０）、Ｒ４３Ｐ３Ｇ５（配列番号５１および５２）、Ｒ５９Ｐ２Ｅ７（配列番号５３および５４）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３（配列番号５５および５６）、Ｒ１６Ｐ１Ｃ１０（配列番号５７および５８）、Ｒ１６Ｐ１Ｅ８（配列番号５９および６０）、Ｒ１７Ｐ１Ａ９（配列番号６１および６２）、Ｒ１７Ｐ１Ｄ７（配列番号６３および６４）、Ｒ１７Ｐ１Ｇ３（配列番号６５および６６）、Ｒ１７Ｐ２Ｂ６（配列番号６７および６８）、Ｒ１１Ｐ３Ｄ３ＫＥ（配列番号６９および７０）、Ｒ３９Ｐ１Ｃ１２（配列番号７１および７２）、Ｒ３９Ｐ１Ｆ５（配列番号７３および７４）、Ｒ４０Ｐ１Ｃ２（配列番号７５および７６）、Ｒ４１Ｐ３Ｅ６（配列番号７７および７８）、Ｒ４３Ｐ３Ｇ４（配列番号７９および８０）、Ｒ４４Ｐ３Ｂ３（配列番号８１および８２）、Ｒ４４Ｐ３Ｅ７（配列番号８３および８４）、Ｒ４９Ｐ２Ｂ７（配列番号８５および８６）、Ｒ５５Ｐ１Ｇ７（配列番号８７および８８）、またはＲ５９Ｐ２Ａ７（配列番号８９および９０）から選択されるＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖であってもよい。一態様では、配列は、配列番号１３～９０のいずれかと、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％を示す。

表１は、ペプチドがＭＨＣ分子と複合体を形成しているときに、ＴＣＲが結合するペプチドの例を示す。

一態様では、腫瘍関連抗原、本明細書に記載される方法および実施形態で使用できる、ＴＡＡペプチドとしては、例えば、表３に列挙されるもの、および例えば、米国特許出願公開第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許出願公開第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許出願公開第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許出願公開第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許出願公開第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許出願公開第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許出願公開第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２５３６３３号明細書、米国特許出願公開第２０１７０２６０２４９号明細書、米国特許出願公開第２０１８００５１０８０号明細書、米国特許出願公開第２０１８０１６４３１５号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２９１０８２号明細書、米国特許出願公開第２０１８０２９１０８３号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２５５１１０号明細書、米国特許第９，７１７，７７４号明細書、米国特許第９，８９５，４１５号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２４７４３３号明細書、米国特許出願公開第２０１９０２９２５２０号明細書、米国特許出願公開第２０２０００８５９３０号明細書、米国特許第１０，３３６，８０９号明細書、米国特許第１０，１３１，７０３号明細書、米国特許第１０，０８１，６６４号明細書、米国特許第１０，０８１，６６４号明細書、米国特許第１０，０９３，７１５号明細書、米国特許第１０，５８３，５７３号明細書、および米国特許第２０２０００８５９３０号明細書に記載される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）ペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容、配列、およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。

別の態様では、二量体Ｚ１Ｚ２は、ＣＤ３δ／ε、ＣＤ３γ／ε、およびＣＤ２４７ζ／ζまたはζ／ηなどのＴ細胞二量体シグナル伝達モジュール；ＴＣＲα可変領域（Ｖα）とＴＣＲβ可変領域（Ｖβ）の二量体；免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）と免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）の二量体；ＶαとＶＨの二量体；ＶαとＶＬの二量体；ＶβとＶＨの二量体；またはＶβとＶＬの二量体であってもよい。

別の態様では、Ｙ１Ｙ２は、ＣＤ８α鎖およびＣＤ８β鎖、または他の任意の適切な二量体膜受容体であってもよく、好ましくは、ＣＤ８＋Ｔ細胞および／またはＣＤ４＋Ｔ細胞で発現するものである。

フューリンは、遍在性のサブチリシン様プロタンパク質転換酵素であり、その天然基としては、特定の血清タンパク質、およびインスリン様成長因子受容体などの成長因子受容体が挙げられる。フューリン切断のコンセンサス配列はＲＸＸＲ（配列番号７）であるが、実際の切断の可能性は、基質の三次構造と認識部位のすぐ周囲のアミノ酸に依存する。フューリン切断部位とリンカー配列（ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８））の付加は、高効率の遺伝子発現を可能にしてもよい。

一態様では、タンデムに配置されたフューリンリンカーと２Ａペプチドのヌクレオチド配列は、Ｚ１とＺ２の間、Ｚ１とＹ１の間、Ｚ１とＹ２の間、Ｚ２とＹ１の間、Ｚ２とＹ２の間、および／またはＹ１とＹ２の間に配置されてもよい。フューリンは、例えば、ＲＡＫＲ（配列番号２）などのＲＸＸＲ（配列番号７）のコンセンサス配列を有してもよい。リンカー配列は、ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８）であってもよい。２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（配列番号３）、Ｔ２Ａ（配列番号４）、Ｅ２Ａ（配列番号５）、Ｆ２Ａ（配列番号６）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。

別の態様では、タンデムに配置されたリンカーと２Ａペプチドのヌクレオチド配列は、Ｚ１とＺ２の間、Ｚ１とＹ１の間、Ｚ１とＹ２の間、Ｚ２とＹ１の間、Ｚ２とＹ２の間、および／またはＹ１とＹ２の間に配置されてもよい。リンカー配列は、ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８）であってもよい。２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（配列番号３）、Ｔ２Ａ（配列番号４）、Ｅ２Ａ（配列番号５）、Ｆ２Ａ（配列番号６）、またはそれらの任意の組み合わせから選択されてもよい。

一態様では、操作された（または形質導入された）γδＴ細胞は、抗原提示細胞またはアミノビスホスホネートによる刺激なしに、生体外で増殖され得る。本開示の抗原反応性の操作されたＴ細胞は、生体外および生体内で増殖されてもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の活性集団は、抗原提示細胞、抗原性ペプチド、非ペプチド分子、または小分子化合物などのアミノビスホスホネートによる抗原刺激なしで、特定の抗体、サイトカイン、マイトジェン、またはＩＬ－１７Ｆｃ融合タンパク質、ＭＩＣＡＦｃ融合タンパク質、およびＣＤ７０Ｆｃ融合タンパク質などの融合タンパク質を使用して、生体外で増殖されてもよい。γδＴ細胞集団の増殖に使用され得る抗体の例としては、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０、抗ＮＫＧ２Ｄ、または抗ＣＤ２抗体が挙げられ、サイトカインの例としては、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＩＬ－１８、ＩＬ－９、ＩＬ－７、および／またはＩＬ－３３が挙げられてもよく、マイトジェンの例としては、ヒトＣＤ２７に対するリガンドであるＣＤ７０、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、リンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の集団は、６０日間未満、４８日間未満、３６日間未満、２４日間未満、１２日間未満、または６日間未満増殖され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の集団は、約７日間～約４９日間、約７日間～約４２日間、約７日間～約３５日間、約７日間～約２８日間、約７日間～約２１日間、または約７日間～約１４日間増殖され得る。

別の態様では、本開示は、養子免疫伝達療法のために、操作されたγδＴ細胞集団を生体外で増殖させる方法を提供する。本開示の操作されたγδＴ細胞は、生体外で増殖されてもよい。本開示の操作されたγδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化なしで、またはＡＰＣおよびアミノリン酸塩との共培養なしで、生体外で増殖され得る。

治療法
本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞を含有する組成物は、予防的および／または治療的治療のために投与されてもよい。治療用途では、医薬組成物は、疾患または病状の症状を治癒しまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、疾患または病状に既に苦しんでいる対象に投与され得る。操作されたγδＴ細胞は、発症、罹患、または病状の悪化の可能性を軽減するためにも投与され得る。治療的使用のための操作されたγδＴ細胞の集団の有効量は、疾患または病状の重症度および経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、および／または薬物に対する応答、および／または治療医の判断に基づいて変動し得る。

本開示の組成物はまた、１つ以上のアジュバントもまた含んでもよい。アジュバントは、免疫応答（例えば、ＣＤ８陽性Ｔ細胞およびヘルパーＴ（ＴＨ）細胞によって媒介される抗原に対する免疫応答を非特異的に促進または増強する物質であり、したがって本発明の薬剤中で有用であると見なされる。適切なアジュバントとしては、１０１８ ＩＳＳ、アルミニウム塩、ＡＭＰＬＩＶＡＸ（登録商標）、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ－８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、フラジェリンまたはフラジェリン由来のＴＬＲ５リガンド、ＦＬＴ３リガンド、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド（ＡＬＤＡＲＡ（登録商標））、レシキモド、ＩｍｕＦａｃｔ ＩＭＰ３２１；ＩＬ－２、ＩＬ－１３、ＩＬ－２１、インターフェロン－αまたは－βなどのインターロイキン、またはそれらのＰＥＧ化誘導体；ＩＳパッチ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＩＳＣＯＭｓ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ（登録商標）、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＡＬＰ２、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、モンタニドＩＭＳ １３１２、モンタニドＩＳＡ ２０６、モンタニドＩＳＡ ５０Ｖ、モンタニドＩＳＡ－５１、油中水型および水中油型エマルション、ＯＫ－４３２、ＯＭ－１７４、ＯＭ－１９７－ＭＰ－ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＯｓｐＡ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクターシステム、ポリ（ラクチドコグリコリド）［ＰＬＧ］－ベースおよびデキストラン微粒子、タラクトフェリンＳＲＬ１７２、ビロソームおよびその他のウイルス様粒子、ＹＦ－１７Ｄ、ＶＥＧＦトラップ、Ｒ８４８、β－グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、サポニン由来のＡｑｕｉｌａ'ｓ ＱＳ２１スティミュロン、マイコバクテリア抽出物および合成細菌細胞壁模倣体；およびＲｉｂｉ'ｓ Ｄｅｔｏｘ、Ｑｕｉｌ、またはＳｕｐｅｒｆｏｓなどのその他の独自仕様のアジュバントが挙げられるが、これに限定されるものではない。フロイントまたはＧＭ－ＣＳＦなどのアジュバントが好ましい。樹状細胞およびそれらの調製物に対して特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）が、以前記載されている（Ａｌｌｉｓｏｎ ａｎｄ Ｋｒｕｍｍｅｌ，１９９５）。サイトカインもまた使用されてもよい。数種のサイトカインは、樹状細胞のリンパ組織（例えば、ＴＮＦ－）への遊走に影響を与えること、Ｔリンパ球（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１、およびＩＬ－４）のための効率的な抗原提示細胞への樹状細胞の成熟を加速すること（その内容全体が参照により本明細書に具体的に援用される、米国特許第５，８４９，５８９号明細書）、および免疫増強剤（例えば、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２３、ＩＬ－７、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）として作用することと、直接関連付けられている（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。

ＣｐＧ免疫賦活性オリゴヌクレオチドもまた、ワクチン環境において、アジュバント効果を増強することが報告されている。理論により拘束されることなく、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主にＴＬＲ９を通じた、内在的（非適応性）免疫系の活性化によって作用する。ＣｐＧ誘導性ＴＬＲ９活性化は、ペプチドまたはタンパク質抗原、生きたまたは死滅ウイルス、樹状細胞ワクチン、自己細胞ワクチン、そして予防的および治療的ワクチンの双方における多糖コンジュゲートをはじめとする多種多様な抗原に対する、抗原特異的体液性および細胞性応答を増強する。より重要なことには、それは樹状細胞の成熟と分化を増強し、ＣＤ４ Ｔ細胞援助の不在下であってさえも、ＴＨ１細胞の活性化の促進、および強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）生成をもたらす。ＴＬＲ９刺激によって誘導されるＴＨ１バイアスは、通常はＴＨ２バイアスを促進するミョウバンまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのワクチンアジュバント存在下であってさえも、維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、その他のアジュバントと調合されまたは同時投与された際に、または微粒子、ナノ粒子、脂質エマルションなどの配合物または類似配合物中で、なおもより高いアジュバント活性を示し、それは、抗原が比較的弱い場合、強力な応答を誘導するのに特に必要である。それらは免疫応答もまた加速し、いくつかの実験では、ＣｐＧなしのワクチン総量と同等の抗体応答で、抗原用量のほぼ２桁分の低減を可能にする（Ｋｒｉｅｇ，２００６）。米国特許第６，４０６，７０５Ｂ１号明細書は、抗原特異的免疫応答を誘導するためのＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、および抗原の併用を記載する。ＣｐＧ ＴＬＲ９拮抗薬は、本発明の医薬組成物の好ましい構成要素である、Ｍｏｌｏｇｅｎ（独国ベルリン）製のｄＳＬＩＭ（二重ステムループ免疫調節剤）である。ＲＮＡ結合ＴＬＲ７、ＴＬＲ８および／またはＴＬＲ９などのその他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されてもよい。

有用なアジュバントのその他の例としては、化学修飾されたＣｐＧｓ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ポリ（Ｉ：Ｃ）などのｄｓＲＮＡ類似体およびそれらの誘導体（例えば、ＡｍｐｌｉＧｅｎ（登録商標）、Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標）、ポリ－（ＩＣＬＣ）、ポリ（ＩＣ－Ｒ）、ポリ（Ｉ：Ｃ１２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌性ＤＮＡまたはＲＮＡ；並びにシクロホスファミド、スニチニブなどの免疫活性小分子および抗体；イピリムマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびセミプリマブ、ベバシズマブ（登録商標）、セレブレックス、ＮＣＸ－４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、テモゾロマイド、テムシロリムス、ＸＬ－９９９、ＣＰ－５４７６３２、パゾパニブ、ＶＥＧＦトラップ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、抗ＣＴＬＡ４をはじめとする免疫チェックポイント阻害剤；免疫系の主要構造を標的化するその他の抗体（例えば、抗ＣＤ４０、抗ＴＧＦβ、抗ＴＮＦα受容体）；およびＳＣ５８１７５が挙げられるが、これに限定されるものではなく、これらは治療的におよび／またはアジュバントとして作用してもよい。本発明の文脈で有用なアジュバントおよび添加剤の量と濃度は、過度の実験を実施することなく、当業者によって容易に判定され得る。

好ましいアジュバントは、抗ＣＤ４０、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ－（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、およびポリ（ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧ）との粒子状製剤、ビロソーム、および／またはインターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３である。

本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、レシキモド、およびインターフェロンαなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。

本発明による医薬組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ、サルグラモスチム）、シクロホスファミド、イミキモド、およびレシキモドなどのコロニー刺激因子からなる群から選択される。本発明による薬剤組成物の好ましい実施形態では、アジュバントは、シクロホスファミド、イミキモドまたはレシキモドである。なおもより好ましいアジュバントは、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＭＳ １３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ－５１、ｐｏｌｙ－ＩＣＬＣ（Ｈｉｌｔｏｎｏｌ（登録商標））、および抗ＣＤ４０ｍＡＢまたはそれらの組み合わせである。

本明細書の操作されたγδＴ細胞を使用して、例えば、本明細書に記載のがんなどの病状に対する治療を必要とする対象が、治療され得る。

対象における病状（例えば、病気）をγδＴ細胞で治療する方法は、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞を対象に投与することを含んでもよい。本開示のγδＴ細胞は、様々なレジメン（例えば、タイミング、濃度、投与量、治療間隔、および／または製剤）で投与されてもよい。対象はまた、本開示の操作されたγδＴ細胞を与られる前に、例えば、化学療法、放射線、または双方の組み合わせで、事前調節され得る。また、操作されたγδＴ細胞の集団は、対象に投与する前に冷凍または凍結保存されてもよい。操作されたγδＴ細胞の集団は、同じ腫瘍認識部分、異なる腫瘍認識部分、または同じ腫瘍認識部分と異なる腫瘍認識部分との組み合わせを発現する、２種以上の細胞を含み得る。例えば、操作されたγδＴ細胞の集団は、異なる抗原を認識し、または同じ抗原の異なるエピトープを認識するように設計された、いくつかの異なる操作されたγδＴ細胞を含み得る。

本開示のγδＴ細胞を使用して、様々な病状が治療されてもよい。一態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、固形腫瘍および血液学的悪性疾患をはじめとする、がんが治療されてもよい。がんの非限定的例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん腫、胆管がん、膀胱がん、骨がん、小脳星細胞腫などの脳腫瘍、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸がん、小児期がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚芽細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞がん腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞および小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭のがん腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、口腔がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、一次中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん腫、腎盂および尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、皮膚がんメルケル細胞、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明がん、尿道がん、子宮の肉腫、膣がん、外陰がん、ワルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。

一態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、感染性疾患が治療されてもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、感染性疾患が治療されてもよく、感染性疾患はウイルスによって引き起こされてもよい。なおも別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、自己免疫疾患などの免疫疾患が治療されてもよい。

本開示のγδＴ細胞による治療は、病状の臨床的発症前、発症中、および発症後に、対象に提供されてもよい。治療は、臨床的発症の１日後、１週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２年後に、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間以上を超えて、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、または２年間未満にわたり対象に提供されてもよい。治療は、臨床試験においてヒトを治療することもまた含んでもよい。治療は、本開示の操作されたγδＴ細胞を含んでなる医薬組成物を対象に投与することを含み得る。

別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、対象の体内の内因性リンパ球の活性を調節してもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、内因性Ｔ細胞に抗原を提供してもよく、免疫応答を高めてもよい。別の態様では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、別の免疫細胞の細胞毒性を活性化してもよい。別の態様では、別の免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、別の免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞であってもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、調節Ｔ細胞を抑制してもよい。別の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸ３＋Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。別の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸ３－Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。本開示の操作されたγδＴ細胞によってその活性が調節され得る細胞の非限定的例としては、造血幹細胞；Ｂ細胞；ＣＤ４；ＣＤ８；赤血球；白色血液細胞；樹状抗原提示細胞をはじめとする樹状細胞；白血球；マクロファージ；記憶Ｂ細胞；記憶Ｔ細胞；単球；ナチュラルキラー細胞；好中球顆粒球；Ｔヘルパー細胞；およびＴキラー細胞が挙げられてもよい。

ほとんどの骨髄移植中に、シクロホスファミドと全身照射の組み合わせが慣習的に用いられて、対象の免疫系による移植中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶が予防されてもよい。一態様では、ドナー骨髄とインターロイキン－２（ＩＬ－２）との生体外インキュベーションが実施されて、ドナー骨髄中のキラーリンパ球の生成が増強されてもよい。インターロイキン－２（ＩＬ－２）は、野生型リンパ球の成長、増殖、分化に必要であってもよいサイトカインである。γδＴ細胞のヒトへの養子免疫伝達に関する現在の研究では、γδＴ細胞とインターロイキン－２との同時投与が必要であってもよい。しかし、低用量および高用量のＩＬ－２は、どちらも高度に毒性の副作用を有し得る。ＩＬ－２毒性は、複数の臓器／システム、最も顕著には心臓、肺、腎臓、および中枢神経系で顕在化し得る。別の態様では、本開示は、ナイーブサイトカイン、またはＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１などのその修飾バージョンの同時投与なしに、操作されたγδＴ細胞を対象に投与する方法を提供する。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、ＩＬ－２との同時投与なしに、対象に投与され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、ＩＬ－２との同時投与なしに、骨髄移植などの処置中に対象に投与されてもよい。

投与方法
１つまたは複数の操作されたγδＴ細胞集団は、任意の順序でまたは同時に、対象に投与されてもよい。同時である場合、複数の操作されたγδＴ細胞は、静脈内注射などの単一の一体化形態で、または、例えば、複数の静脈内輸液、皮下注射、注射または丸薬として、複数の形態で提供され得る。操作されたγδＴ細胞は、単一のパッケージで、または複数のパッケージで、一緒にまたは別々に包装され得る。操作されたγδＴ細胞の１つまたは全ては、複数回用量で投与され得る。同時ではない場合、複数回用量のタイミングは、約１週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または約１年間程度変動してもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、対象への投与後に、対象の体内で、生体内増殖され得る。操作されたγδＴ細胞は凍結されて、同一の細胞調製物での複数の治療のための細胞が提供され得る。本開示の操作されたγδＴ細胞、および該細胞を含んでなる医薬組成物は、キットとして包装され得る。キットは、操作されたγδＴ細胞、および該細胞を含んでなる医薬組成物の使用に関する指示（例えば、書面による指示）を含んでもよい。

別の態様では、がんを治療する方法は、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞を被験者に投与することを含んでなり、投与はがんを治療する。別の実施形態では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０秒間、３０秒間、１分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または１年間にわたり投与されてもよい。別の態様では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも１週間にわたり投与されてもよい。別の態様では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも２週間にわたり投与されてもよい。

本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞は、疾患または病状の発生前、発生中、または発生後に投与され得て、操作されたγδＴ細胞を含有する医薬組成物を投与するタイミングは変動し得る。例えば、操作されたγδＴ細胞は予防的に使用され得て、疾患または病状の発生の可能性を軽減するために、病状または疾患の傾向を有する対象に連続的に投与され得る。操作されたγδＴ細胞は、症状の発生中にまたは発生後にできる限り速やかに、対象に投与され得る。操作されたγδＴ細胞の投与は、症状の発生後即座に、症状の発生から最初の３時間以内に、症状の発生から最初の６時間以内に、症状の発生から最初の２４時間以内に、症状の発生から４８時間以内に、または症状の発生から任意の期間内に開始され得る。最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用して、本明細書に記載の任意の経路などの実用的な任意の経路を介し得る。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の投与は、静脈内投与であってもよい。操作されたγδＴ細胞の１回または複数回の投与は、がん、感染性疾患、免疫疾患、敗血症の発症後実行可能な限り早く、または骨髄移植と共に、例えば、約２４時間～約４８時間、約４８時間～約１週間、約１週間～約２週間、約２週間～約１ヶ月間、約１ヶ月間～約３ヶ月間などの免疫疾患を治療するのに必要な期間にわたり、投与され得る。がんの治療のために、操作されたγδＴ細胞の１つまたは複数用量は、がんの発症から数年後に、その他の治療の前または後に、投与され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間にわたり投与され得る。治療期間は、対象によって変動し得る。

保存
一態様では、γδＴ細胞は凍結媒体中で調合され、少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、または少なくとも５年間にわたる長期保存のために、液体窒素冷凍庫（－１９６℃）または極低温冷凍庫（－６５℃、－８０℃、－１２０℃、または－１５０℃）などの極低温保存ユニットに入れられてもよい。凍結媒体は、ｐＨを約６．０～約６．５、約６．５～約７．０、約７．０～約７．５、約７．５～約８．０、または約６．５～約７．５の間に維持するための生理学的ｐＨ緩衝剤を有する、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および／またはデキストロース、および／または硫酸デキストランおよび／またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有し得る。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、本明細書に記載されるような、抗体、タンパク質、ペプチド、および／またはサイトカインでの刺激によって、さらに処理され得る。凍結保存されたγδＴ細胞は解凍され、本明細書に記載されるような、ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＡＶ）、およびレンチウイルスベクターをはじめとする）または非ウイルス手段（ＲＮＡ、例えば、トランスポゾンなどのＤＮＡ、およびタンパク質をはじめとする）で、遺伝子改変され得る。修飾γδＴ細胞はさらに凍結保存され、凍結媒体１ｍＬあたり少なくとも１０^１、１０^２、１０^３、１０^４、１０^５、１０^６、１０^７、１０^８、１０^９、または少なくとも約１０^１０個の細胞で、少なくとも約１、５、１０、１００、１５０、２００、５００本のバイアルの量で、細胞バンクが作製され得る。凍結保存細胞バンクは、それらの機能を保持していてもよく、解凍されさらに刺激されて増殖され得る。別の態様では、解凍された細胞は、細胞培養バッグおよび／またはバイオリアクターなどの適切な閉鎖容器内で刺激および増殖され、同種異系細胞産物として一定量の細胞が生成され得る。凍結保存γδＴ細胞は、極低温保存条件下で、少なくとも約６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２０ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、４０ヶ月間、５０ヶ月間、または少なくとも約６０ヶ月間にわたり、それらの生物学的機能を保持し得る。別の態様では、製剤中に保存料を使用することはできない。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、同種異系の既製細胞製品として複数の患者に輸液され得る。

一態様では、本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも１×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０^３個の細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０^４個の細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０^５個の細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０^６個の細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０^７個の細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０^８個の細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０^９個の細胞／ｍｌ以上、約１×１０^３個の細胞／ｍｌ～少なくとも約１×１０^８個の細胞／ｍｌ、約１×１０^５個の細胞／ｍｌ～少なくとも約１×１０^８個の細胞／ｍｌ、または約１×１０^６個の細胞／ｍｌ～少なくとも約１×１０^８個の細胞／ｍｌの量で組成物中に存在してもよい。

一態様では、本明細書に記載の方法を使用して、本開示の態様による自己由来または同種異系産物が生成されてもよい。

一態様では、本明細書に記載のベクター、コンストラクト、または配列は、配列番号１～７および２６５～２６６のいずれかと、約８０％、約８５％、約９０％、約８５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％を含んでなってもよい。「参照配列と少なくとも８５％の同一性を有する」配列とは、その全長において、参照配列の全長と８５％以上、特に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列である。

本出願の文脈では、「同一性の百分率」は、グローバルなペアワイズアラインメントを用いて計算される（すなわち、２つの配列が、それらの全長にわたって比較される）。２つ以上の配列の同一性を比較するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ大域アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を用いて、それらの全長を考慮した場合の２つの配列の最適なアラインメント（ギャップを含む）を見つける「ｎｅｅｄｌｅ」プログラムが、用いられてもよい。Ｎｅｅｄｌｅプログラムは、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ Ｗｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂサイトで利用でき、以下の出版物でさらに説明されている（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．ａｎｄ Ｂｌｅａｓｂｙ，Ａ．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６，（６）ｐｐ．２７６－２７７）。本発明による２つのポリペプチド間の同一性の百分率は、１０．０に等しい「Ｇａｐ Ｏｐｅｎ」パラメーター、０．５に等しい「Ｇａｐ Ｅｘｔｅｎｄ」パラメーター、およびＢｌｏｓｕｍ６２マトリックスで、ＥＭＢＯＳＳ：ｎｅｅｄｌｅ（大域）プログラムを用いて計算される。

参照配列と「少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一」のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列と比較して、欠失、挿入および／または置換などの変異を含んでなってもよい。置換の場合、参照配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一のアミノ酸配列からなるタンパク質は、参照配列とは別の種に由来する相同配列に対応してもよい。

「アミノ酸置換」は、保存的または非保存的であってもよい。好ましくは、置換は保存的置換であり、その中ではあるアミノ酸が類似の構造的および／または化学的特性を有する別のアミノ酸によって置換される。

一実施形態では、保存的置換としては、その内容全体が参照により援用される、Ｄａｙｈｏｆｆによって"Ｔｈｅ Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５"，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載されるものが挙げられてもよい。例えば、一態様では、以下のグループの１つに属するアミノ酸は、互いに交換され得て、したがって、保守的な交換を構成する：グループ１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；グループ２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）；グループ３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；グループ４：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；グループ５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；およびグループ６：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。一態様では、保存的アミノ酸置換は、Ｔ→Ａ、Ｇ→Ａ、Ａ→Ｉ、Ｔ→Ｖ、Ａ→Ｍ、Ｔ→Ｉ、Ａ→Ｖ、Ｔ→Ｇ、および／またはＴ→Ｓから選択されてもよい。

さらなる実施形態では、保存的アミノ酸置換としては、例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；および（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなど、同一クラスの別のアミノ酸によるアミノ酸の置換が挙げられてもよい。その他の保存的アミノ酸置換はまた、以下のように行われ得る：（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；（２）プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ；および（３）プロトン受容体：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ（例えば、その内容全体が参照により援用される、米国特許第１０，１０６，８０５号明細書を参照されたい）。

別の実施形態では、表１に従って保存的置換が行なわれてもよい。タンパク質修飾に対する耐性を予測する方法は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｇｕｏ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５－９２１０（２００４）にある。

表A：保存的アミノ酸置換

一態様では、本明細書に記載の配列は、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、または３０個のアミノ酸またはヌクレオチドの変異、置換、欠失を含んでもよい。一態様では、配列番号１～９７および２６５～２６６のいずれか１つは、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、または３０の変異、置換、または欠失を含んでもよい。なおも別の態様では、変異または置換は、保存的アミノ酸置換である。

別の実施形態では、保存的置換は、「保存的置換」の見出しの下で表Ｂに示されるものであってもよい。このような置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表Ｂで「例示的な置換」と命名される、より実質的な変化が導入され、必要に応じて生成物がスクリーニングされてもよい。

表B：アミノ酸置換

実施例１
DNAおよびタンパク質配列

TAAペプチド 配列

実施例２
γδＴ細胞製造
γδＴ細胞を単離するために、一態様では、γδＴ細胞は、対象から、または対象の複合サンプルから単離されてもよい。一態様では、複合サンプルは、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検、組織、リンパであっても、または外部環境と直接接触する対象の上皮部位からのもの、または幹前駆体細胞に由来するものであってもよい。γδＴ細胞は、例えば、１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞をフローサイトメトリー技術を用いて選別することによって、対象の複合サンプルから直接単離されてもよい。野生型γδＴ細胞は、γδＴ細胞に関連し得る、多数の抗原認識、抗原提示、共刺激、および接着分子を示してもよい。特定のγδＴＣＲ、抗原認識、抗原提示、リガンド、接着分子、または共刺激分子などの１つまたは複数の細胞表面マーカーを使用して、複合サンプルから野生型γδＴ細胞が単離されてもよい。γδＴ細胞に関連する、またはγδＴ細胞によって発現される様々な分子を使用して、例えば、Ｖδ１、Ｖδ２、Ｖδ３細胞またはそれらの任意の組み合わせの混合集団の単離など、複合サンプルからγδＴ細胞が単離されてもよい。

例えば、末梢血単核細胞は、例えば、Ｆｉｃｏｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムをはじめとする、アフェレーシス療法装置、または別の適切な装置／システムを用いて、対象から採取され得る。γδＴ細胞またはγδＴ細胞の所望の亜集団は、採取されたサンプルから、例えば、フローサイトメトリー技術を用いて精製され得る。臍帯血細胞は、対象の出産時に臍帯血からも入手され得る。

採取されたγδＴ細胞上で発現される細胞表面マーカーの陽性および／または陰性選択を使用して、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、腫瘍生検、組織、リンパから、または対象の上皮サンプルから、類似した細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞またはγδＴ細胞集団が直接単離され得る。例えば、γδＴ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲδ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４６）、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＣＲ７、およびその他の適切な細胞表面マーカーの陽性または陰性発現に基づいて、複合サンプルから単離され得る。

図１は、本開示の一実施形態による、γδＴ細胞製造を示す。このプロセスは、白血球またはＰＢＭＣを白血球アフェレーシス産物から採取または入手することを含んでもよい。白血球アフェレーシスは、ドナーから全血を採取し、アフェレーシス療法装置を使用して成分を分離することを含んでもよい。フェレーシス療法装置は、所望の血液成分を分離し、残りはドナーの循環に戻される。例えば、白色血液細胞、血漿、および血小板が、アフェレーシス療法装置を使用して採取され得て、赤血球と好中球はドナーの循環に戻される。このプロセスでは、市販の白血球アフェレーシス産物が使用されてもよい。白血球を入手するための別の方法は、それらをバフィーコートから入手することである。バフィーコートを単離するために、抗凝固全血がドナーから得られ遠心分離される。遠心分離後に、血液は、血漿、赤血球、およびバフィーコートに分離される。バフィーコートは、血漿層と赤血球層の間に位置する層である。白血球アフェレーシスの採取は、バフィーコートの採取によって達成されるものよりも、より高い純度と、単核細胞含有量の大幅な増加をもたらしてもよい。白血球アフェレーシスによって可能な単核細胞含有量は、典型的には、バフィーコートから得られるものの２０倍であってもよい。単核細胞を富化するために、さらなる分離のためのＦｉｃｏｌｌ勾配の使用が必要なこともある。

ＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させるために、例えば、抗αβＴＣＲ抗体で被覆されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）磁気ビーズを使用した磁気分離によって、αβＴＣＲ発現細胞をＰＢＭＣから分離してもよく、αβＴＣＲ－Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣの凍結保存がそれに続く。「既製の」Ｔ細胞製品を製造するために、例えば、２～７日間など１～１０日間にわたり、例えば、ゾレドロネートなどのアミノビスホスホネート；および／またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）；および／または例えば、インターロイキン２（ＩＬ－２）、インターロイキン１５（ＩＬ－１５）、および／またはインターロイキン１８（ＩＬ－１８）などのサイトカイン；および／または例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドなどのその他の活性化剤の存在下で、例えば、２４から４～６ウェルプレートまたはＴ７５／Ｔ１７５フラスコなどの小規模／中規模で、または例えば、５０ｍｌ～１００リットルのバッグなどの大規模で、凍結保存されたαβＴＣＲ－Ｔ細胞が枯渇したＰＢＭＣを解凍し、活性化してもよい。

図１は、特定のがん抗原およびＣＤ８に対するαβＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子を発現する、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターで、単離されたγδＴ細胞を形質導入することによって、活性化Ｔ細胞を操作してもよいことを示す。形質導入は、例えば、１日間などの１／２～５日間にわたり、例えば、２４から４～６ウェルプレートなどの小規模で、または中／大規模で、１回または複数回実行して、安定した導入遺伝子発現を達成してもよい。

図１は、例えば、７～２８日間などの７～３５日間にわたり、例えば、フラスコ／Ｇ－Ｒｅｘなどの小／中規模で、または例えば、５０ｍｌ～１００リットルバッグなどの大規模で、例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８などのサイトカインの存在下で、形質導入または操作されたγδＴ細胞の増殖を実行してもよいことをさらに示す。増殖した形質導入されたＴ細胞産物は、次に、患者への輸液用の「既製」Ｔ細胞製品として凍結保存してもよい。

実施例３
レンチウイルスウイルスベクター
本明細書で使用されるレンチウイルスベクターは、自己複製および核内搬入を改善するための中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）；いくつかの細胞型においてベクターサイレンシングを軽減することが示されている、マウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）（配列番号１）からのプロモーター；転写終止を改善するためのウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答要素（ＷＰＲＥ）（配列番号９）をはじめとする、ベクター機能を増強することが以前に示されたいくつかの要素を含み、主鎖は、安全性、持続的な遺伝子発現、および抗サイレンシング特性の改善を有してもよい、欠失３'－ＬＴＲ自己不活性化（ＳＩＮ）ベクターデザインであった（その内容全体が参照により援用される、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２００８）１５，１４１１－１４２３）。

一態様では、本明細書に記載のベクター、コンストラクト、または配列は、変異形態のＷＰＲＥを含んでなる。別の態様では、本明細書に記載の配列またはベクターは、例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２６５）などのＷＰＲＥバージョン１、または例えば、ＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２６６）などのＷＰＲＥバージョン２、における変異を含んでなる。一態様では、ＷＰＲＥ変異体は、最大で１つの変異、最大で２つの変異、最大で３つの変異、少なくとも４つの変異、または最大で５つの変異を含んでなる。一態様では、本明細書に記載のベクター、コンストラクト、または配列は、ＷＰＲＥを含まない。別の態様では、本開示は、配列番号９１～９６の１つにおける１、２、３、４、５、１０、または２０の置換を提供する。

別の態様では、本明細書に記載のベクター、コンストラクト、または配列は、Ｘタンパク質プロモーターを含まない。

形質導入されたγδＴ細胞におけるＴＣＲαβとＣＤ８αβの最適な同時発現レベルを得るために、様々なデザインのレンチウイルスベクターを生成した。図２は、ＴＣＲαβまたはＣＤ８αβを発現する２つの別個のレンチウイルスベクター（２－ｉｎ－１）、およびＴＣＲαβとＣＤ８αβを同時発現する単一レンチウイルスベクター（４－ｉｎ－１）で、Ｔ細胞を形質導入してもよいことを示す。４－ｉｎ－１ベクターでは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ８α鎖、およびＣＤ８β鎖をコード化するヌクレオチドを様々な順序でシャッフルしてもよい。このように作製された様々な４－ｉｎ－１ベクターを使用してγδＴ細胞を形質導入し、それに続いて、例えば、フローサイトメトリーなどの当該技術分野で公知の技術を用いて、形質導入された細胞のＴＣＲ／ＣＤ８同時発現レベルを測定してもよい。

ＴＣＲαβとＣＤ８αβを同時発現するレンチウイルスベクターを作製するために、フリンリンカー（ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８））－２Ａペプチドをコード化するヌクレオチドを、ＴＣＲα鎖とＴＣＲβ鎖の間、ＣＤ８α鎖とＣＤ８β鎖の間、ＴＣＲ鎖とＣＤ８鎖の間に配置させて、高効率な遺伝子発現を可能にしてもよい。２Ａペプチドは、Ｐ２Ａ（配列番号３）、Ｔ２Ａ（配列番号４）、Ｅ２Ａ（配列番号５）、またはＦ２Ａ（配列番号６）から選択されてもよい。

レンチウイルスベクターはまた、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）（配列番号９）などの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含有し、核および細胞質双方のｍＲＮＡレベルを増加させることによって、導入遺伝子の発現を増強させてもよい。マウスＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、サルレトロウイルス１型（ＳＲＶ－１）の構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）、およびヒト熱ショックタンパク質７０の５'未翻訳領域（Ｈｓｐ７０５'ＵＴＲ）をはじめとする、１つまたは複数の調節要素もまた使用して、および／またはＷＰＲＥと組み合わせて、導入遺伝子発現を増加させてもよい。

レンチウイルスベクターは、マウス白血病ウイルスの細胞質尾部（ＴＲ）に融合したネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）の細胞外および膜貫通ドメインを含有する、キメラ糖タンパク質であるＲＤ１１４ＴＲ（配列番号９７）で偽型化させてもよい。ＶＳＶ－Ｇ ｅｎｖ、ＭＬＶ４０７０Ａ ｅｎｖ、ＲＤ１１４ ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏ、バキュロウイルスＧＰ６４ ｅｎｖ、またはＧＡＬＶ ｅｎｖなどのその他のウイルスエンベロープタンパク質、またはその誘導体もまた使用してもよい。

図３は、ＴＣＲαβ（Ｒ１１ＫＥＡ）とＣＤ８αβを同時発現する４つの異なる４－ｉｎ－１ベクター、すなわち、ＰＴＥ ＷＰＲＥ（配列番号９１）、ＴＰＥ ＷＰＲＥ（配列番号９２）、ＰＴＥ ｆｎ ＷＰＲＥ（配列番号９３）、およびＰＴＥ ＣＤ８ ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号９４）、ならびに２つの２－ｉｎ－１ベクター、すなわち、ＴＣＲαβ（Ｒ１１ＫＥＡ）を発現するＲ１１ＫＥ ＷＰＲＥ（配列番号９５）、およびＣＤ８αβを発現するＣＤ８ ＷＰＲＥ（配列番号９６）を示す。ＴＣＲαβ（Ｒ１１ＫＥＡ）は、ＭＨＣ分子との複合体中でＰＲＡＭＥ－００４（ＳＬＬＱＨＬＩＧＬ）（配列番号１４７）に結合する。

実施例４
ＴＣＲおよびＣＤ８の同時発現
ドナー１とドナー２から得られたγδＴ細胞を図１に示す工程で製造した。ゾレドロネート、ＩＬ２、およびＩＬ１５での活性化後３日目または６日目に、例えば、ＰＴＥ ＷＰＲＥ（配列番号９１）、ＴＰＥ ＷＰＲＥ（配列番号９２）、ＰＴＥ ｆｎ ＷＰＲＥ（配列番号９３）、およびＰＴＥ ＣＤ８ ＴＣＲ ＷＰＲＥ（配列番号９４）などのＲＤ１１４ＴＲで偽型化したレンチウイルスで、γδＴ細胞を形質導入し、それに続いてＲ１１ＫＥＡとＣＤ８の同時発現レベルをフローサイトメトリーを用いて測定した。ＴＣＲ（Ｖβ８）およびＣＤ８（ＣＤ８α）に特異的な抗体（ＣＤ８）を使用して、フローサイトメトリーを介して導入効率を評価した。

図４は、ドナー１からのγδＴ細胞において、ＰＴＥ ＣＤ８ ＴＣＲ ＷＰＲＥでの形質導入によって得られたＲ１１ＫＥＡおよびＣＤ８の同時発現レベル、すなわち、４０．５％（３日目）および１８．５％（６日目）が、ＰＴＥ ＷＰＲＥ（２９．６％（３日目）、１６．２％（日６））、ＴＰＥ ＷＰＲＥ（３０．８％（３日目）、１１．０％（６日目））、およびＰＴＥ ｆｎ ＷＰＲＥ（３３．０％（３日目）、１５．０％（６日目））での形質導入よりも高いことを示す。ドナー２からのγδＴ細胞では、ＰＴＥ ＷＰＲＥによる形質導入によって得られた、活性化後６日目のＲ１１ＫＥＡとＣＤ８の同時発現レベル、すなわち、１８．８％は、ＴＰＥ ＷＰＲＥ（１４．２％）、ＰＴＥ ｆｎ ＷＰＲＥ（１４．７％）、およびＰＴＥ ＣＤ８ ＴＣＲ ＷＰＲＥ（１７．２％）での形質導入よりも高い。対照として、２－ｉｎ－１ベクター、すなわちＴＣＲαβ（Ｒ１１ＫＥＡ）またはＣＤ８ ＷＰＲＥで別々に形質導入されたγδＴ細胞中で、Ｒ１１ＫＥＡおよびＣＤ８のバックグラウンドレベルを検出した。

実施例５
ＣＤ８αβ鎖をコード化する配列とＴＣＲαβ鎖をコード化する配列がベクター内の異なる位置に配置された、例えば、レンチウイルスベクターなどの４－ｉｎ－１ウイルスベクターの導入遺伝子発現および機能性に対する影響。

国際公開第２０１９／２０４６６２号パンフレットは、外因性ＣＤ８αβ共受容体と、例えば、ＴＣＲなどの１つまたは複数の外因性に操作された抗原受容体とを発現する、ＣＤ４＋細胞を記載する。表４は、国際公開第２０１９／２０４６６２号パンフレットに記載される４－ｉｎ－１コンストラクトと、本開示の態様によるものとの比較を示す。

本開示の核酸分子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、少なくとも部分的にコドン最適化されてもよい。コドン最適化は、翻訳効率が細胞内の移転ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）の発生における異なる頻度によって決定されてもよいという発見に基づく。したがって、本開示の核酸分子のオープンリーディングフレームは、細胞内では比較的稀であるｔＲＮＡをコード化する野生型配列の少なくとも１つのコドンが、細胞内で比較的頻度が高く比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を保有してもよいｔＲＮＡをコードするコドンで、交換されてもよいように、対応する野生型コード領域と比較して修飾されてもよい。この修飾によって、本開示の核酸分子のオープンリーディングフレームは、頻度の高いｔＲＮＡが利用できるコドンが、稀なｔＲＮＡに対応するコドンを置き換えてもよいように、修飾されてもよい。換言すれば、本開示によれば、このような修飾によって、稀なｔＲＮＡをコードする野生型オープンリーディングフレームの全てのコドンが、細胞内で比較的頻度が高く比較的稀なｔＲＮＡと同じアミノ酸を保有してもよいｔＲＮＡをコードするコドンで、交換されてもよい。どのｔＲＮＡが細胞内で比較的頻度が高く、対照的にどのｔＲＮＡが比較的稀であるかを当業者は把握している；例えば、その内容が参照により援用される、Ａｋａｓｈｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．２００１，１１（６）：６６０－６６６。いくつかの実施形態では、本開示の核酸分子のオープンリーディングフレームは、好ましくは、その中で本開示の核酸分子が発現されるシステムに関して、好ましくは、その中で本開示の核酸分子が翻訳されるシステムに関して、コドン最適化されてもよい。好ましくは、本開示の核酸分子のオープンリーディングフレームのコドン使用頻度用は、哺乳類のコドン使用頻度に従って、より好ましくは、ヒトコドン使用頻度に従って、コドン最適化されてもよい。好ましくは、オープンリーディングフレームは、コドン最適化され、Ｇ／Ｃ含有量が修正されてもよい。

どの導入遺伝子の配向が、より良い導入遺伝子の発現と機能を提供するかを判定するために、例えば、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ（配列番号９１）、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ（配列番号９２）、およびＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥ（配列番号９３）などの、ＣＤ８αβ鎖をコード化する配列の上流に位置するＴＣＲαβ鎖をコード化する配列をそれぞれ含有する３つの４－ｉｎ－１ウイルスベクターと、例えば、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ（配列番号９４）などの、ＴＣＲαβ鎖をコード化する配列の上流に位置するＣＤ８αβ鎖をコード化する配列を含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターとをγδＴ細胞に形質導入し、蛍光タグ付き抗ＣＤ８抗体および蛍光タグ付き抗ＴＣＲＶβ８（Ｖｂ８）抗体を用いた、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析がそれに続き、細胞表面上のＣＤ８およびＴＣＲの発現をそれぞれ検出した。

図１０および１１は、ＣＤ８＋Ｖｂ８＋二重－陽性細胞の％（図１０）およびＣＤ８のＭＦＩまたはＶｂ８のＭＦＩ（図１１）に基づいて、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたドナー３およびドナー４から得られたγδＴ細胞が、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたものと比較して、製造の１４日目に細胞表面上でＣＤ８とＴＣＲの双方の最高の発現をもたらすことを示す。

ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたγδＴ細胞の細胞表面上のＣＤ８およびＴＣＲの双方の高発現は、それらの生体外殺滅活性と良好に相関する。例えば、図１２は、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたものと比較して、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたドナー３から得られたγδＴ細胞が、高標的ペプチド提示細胞株ＵＡＣＣ２５７（上側パネル）と低標的ペプチド提示細胞株Ｕ２ＯＳ（下側パネル）の双方に対する最良の殺滅活性を提示することを示し、図１３Ａ～１３Ｃは、例えば、ＵＡＣＣ２５７（図１３Ａ）、Ｕ２ＯＳ（図１３Ｂ）、および標的陰性細胞株ＭＣＦ－７（図１３Ｃ）などの標的細胞の存在下で、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入された対応するγδＴ細胞による、ＩＦＮ－γ分泌の量を示す。

図１４は、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたものと比較して、ウイルスベクターＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１で形質導入されたドナー４から得られたγδＴ細胞もまた、ＵＡＣＣ２５７（上側パネル）およびＵ２ＯＳ（下側パネル）の双方に対して、最良の殺滅活性を提示することを示し、図１５Ａ～１５Ｃは、例えば、ＵＡＣＣ２５７（図１５Ａ）、Ｕ２ＯＳ（図１５Ｂ）、およびＭＣＦ－７（図１５Ｃ）などの標的細胞の存在下で、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入された対応するγδＴ細胞による、ＩＦＮ－γ分泌の量を示す。

図１６は、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたドナー３およびドナー４から得られたγδＴ細胞が、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、およびＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥ．で形質導入されたものと同様に、細胞あたり、０．６コピー未満の組み込みベクターをもたらすことを示す。細胞あたりの組み込みベクターのこの低いコピー数は、安全要件の範囲内、すなわち、細胞あたりの組み込みベクター数が５コピー未満内にある。

図１７Ａおよび１７Ｂは、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターでそれぞれ形質導入された、ドナー３およびドナー４から得られたγδＴ細胞が、製造の１４日目に、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたものと同等のレベルの細胞増殖を達成することを示す。

形質導入されたγδＴ細胞の記憶細胞表現型を判定するために、細胞をアロフィコシアニン（ＡＰＣ）－Ｃｙ７タグ付き抗ＣＤ４５ＲＡ抗体およびＢＶ４２１タグ付き抗ＣＣＲ７抗体で染色し、ＦＡＣＳ分析がそれに続き、形質導入されたγδＴ細胞中に存在するＴｃｍ、ナイーブＴ細胞、ＴｅｍＲＡ、およびＴｅｆｆの割合を判定した。図１８Ａは、このような分析の一例を示す。

図１８Ｂは、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入された、ドナー３およびドナー１から得られたγδＴ細胞が、製造の１４日目に、ＰＴＥ．ＷＰＲＥ、ＴＰＥ．ＷＰＲＥ、またはＰＴＥ．ｆｎ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入されたものと同等のレベルの記憶Ｔ細胞の表現型を達成することを示す。

実施例６
１つの４－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入された細胞と２つの２－ｉｎ－１ウイルスベクターで形質導入された細胞における、導入遺伝子発現への影響

図１９は、ＣＤ８．ＷＰＲＥ（１２０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターと、Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥ（１２０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターとの混合物での形質導入によるもの（パネルＤ、１５．５％）よりも多い、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ（１２０μｌ）を含有する４－ｉｎ－１レンチウイルスベクターでの形質導入から得られたＣＤ８＋ＴＣＲ＋γδＴ細胞（パネルＢ、２０．９％）を示す。他方、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１レンチウイルスベクターで形質導入されたもの（パネルＢ、２１．２％）よりも、ＣＤ８．ＷＰＲＥ（１２０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターと、Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥ（１２０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターとの混合物での形質導入からより多くのＣＤ８＋ＴＣＲ－γδＴ細胞（パネルＤ、２８．３％）が得られた。同様に、ＣＤ８．ＷＰＲＥ（２４０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターと、Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥ（２４０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターとの混合物で形質導入されたもの（パネルＥ、２１．１％）よりも、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ（２４０μｌ）を含有する４－ｉｎ－１レンチウイルスベクターでの形質導入からより多くのＣＤ８＋ＴＣＲ＋γδＴ細胞（パネルＣ、２７．７％）が得られた。他方、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１レンチウイルスベクターで形質導入されたもの（パネルＣ、２４．４％）よりも、ＣＤ８．ＷＰＲＥ（２４０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターと、Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥ（２４０μｌ）を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターとの混合物での形質導入からより多くのＣＤ８＋ＴＣＲ－γδＴ細胞（パネルＥ、４０．２％）が得られた。非形質導入（ＮＴ）γδＴ細胞が、対照として機能した（パネルＡ）。２色染色は、ＡＰＣタグ付き抗ＣＤ８β抗体およびフィコエリトリン（ＰＥ）タグ付き標的ペプチド／ＭＨＣ複合体テトラマーを使用して実施した。これらの結果は、例えば、ＣＤ８．ＷＰＲＥなどのＣＤ８αβをコード化する配列を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクタートと、例えば、Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥなどのＴＣＲαβをコード化する配列を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターとの混合物とで形質導入されたものよりも、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥなどのＣＤ８αβおよびＴＣＲαβをコード化する配列を含有する４－ｉｎ－１レンチウイルスベクターでの形質導入が、より多数のＣＤ８＋ＴＣＲ＋Ｔ細胞をもたらしてもよいことを示唆する。他方、例えば、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥ．などのＣＤ８αβおよびＴＣＲαβをコード化する配列を含有する４－ｉｎ－１レンチウイルスベクターで形質導入されたものよりも、例えば、ＣＤ８．ＷＰＲＥなどのＣＤ８αβをコード化する配列を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターと、例えば、Ｒ１１ＫＥ．ＷＰＲＥなどのＴＣＲαβをコード化する配列を含有する２－ｉｎ－１レンチウイルスベクターとの混合物での形質導入は、より多数のＣＤ８＋ＴＣＲ－Ｔ細胞をもたらしてもよい。

図２０は、形質導入のためのＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥを含有する４－ｉｎ－１ウイルスベクターの量を例えば、３０μｌ、１２０μｌ、２４０μｌと増加させると、形質導入効率が向上することを示し、例えば、ＣＤ８＋ＴＣＲ＋γδＴ細胞の％は、例えば、３０μｌで９．６％、１２０μｌで２０．９％、２４０μｌで２７．７％と増加する。非形質導入γδＴ細胞が、対照として機能する。２色染色は、ＡＰＣタグ付き抗ＣＤ８β抗体およびＰＥタグ付き標的ペプチド／ＭＨＣ複合体テトラマーを使用して実施した。

実施例７
αβＴ細胞における４－ｉｎ－１コンストラクトの発現
例えば、ＣＤ８αβおよび／またはＴＣＲαβなどの組換えタンパク質を発現する、操作されたαβＴ細胞をはじめとする操作されたリンパ球は、その内容全体が参照により援用される、米国特許第２０１９／０２４７４３３号明細書で開示される方法に従って製造し得る。例えば、図３７は、以下を含んでもよい、Ｔ細胞製造工程３７０を示す：ＰＢＭＣの単離（３７１）（その中ではＰＢＭＣは、新鮮に使用されてもよく、または使用の準備ができるまで冷凍保存されてもよく、または、例えば、ｌｅｕｋｏｐａｋなどの白血球アフェレーシス製品であってもよく、またはＴ細胞の製造およびリンパ球集団（例えば、αβＴＣＲ＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、または双方）の選択のための出発原料として使用されてもよい）；リンパ球の例えば、約１６時間または約４から６時間などの一晩の解凍および休止（３７２）（これは、アポトーシス細胞を死滅させ、Ｔ細胞の機能を回復させてもよい（新鮮な材料を使用する場合、このステップは必要ないこともある））；リンパ球の活性化（３７３）（これは、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体を使用してもよい（例えば、磁性または生分解性ビーズ、培養容器に固定化された抗体などの可溶性または表面結合型））；例えば、ＣＤ８αβおよび／またはＴＣＲαβなどのポリペプチド組換えタンパク質をコード化する配列を含有するウイルスベクターでの形質導入（３７４）（その中ではウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターであってもよく、または形質移入は非ウイルス法によって実施されてもよい）；リンパ球の増殖、採取、および凍結保存（３７５）（これは、例えば、ＩＬ－７およびＩＬ－１５などのサイトカイン、血清（ＡＢＳまたはＦＢＳ）、および／または凍結保存媒体の存在下で実行されてもよい）。

外因性ＣＤ８発現
ＣＤ８およびＴＣＲをコード化する配列を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを含有するウイルスベクターで形質導入されたαβＴ細胞における外因性ＣＤ８発現を判定するために、ドナー５およびドナー６から得られたＴ細胞をＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥの量を増加させながら形質導入し、リンパ球＜一重項＜生細胞＜ＣＤ３＋集団上のＦＡＣＳゲートがそれに続いて、ＣＤ４＋細胞中の％ＣＤ８α＋細胞を検出した。図２１は、ドナー５からの％ＣＤ８α＋ＣＤ４＋細胞が、２．８７％（非形質導入）から、１４．７％（２．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、１９．５％（５μｌ／１×１０^６個の細胞）、２１．７％（７．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、および２４．１％（１０μｌ／１×１０^６個の細胞）に増加し；ドナー６からの％ＣＤ８α＋ＣＤ４＋細胞が、１．９３％（非形質導入）から、１２．５％（２．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、１７．２％（５μｌ／１×１０^６個の細胞）、１９．６％（７．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、および２０．８％（１０μｌ／１×１０^６個の細胞）に増加したことを示す。

外因性ＴＣＲ発現
ＣＤ８およびＴＣＲをコード化する配列を有する４－ｉｎ－１コンストラクトを含有するウイルスベクターで形質導入されたαβＴ細胞における外因性ＴＣＲ発現を判定するために、ドナー５およびドナー６から得られたＴ細胞をＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥの量を増加させながら形質導入し、リンパ球＜一重項＜生細胞＜ＣＤ３＋＜ＣＤ４＋ＣＤ８＋集団上のＦＡＣＳゲートがそれに続いて、ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞集団中の％標的ペプチド／ＭＨＣ複合体デキストラマー２０３＋（すなわち、ＴＣＲ＋）細胞を検出した。図２２は、ドナー５からの％デキストラマー２０３＋細胞が、０．３２％（非形質導入）から、４１．９％（２．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、４８．３％（５μｌ／１×１０^６個の細胞）、５４．５％（７．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、および４９．５％（１０μｌ／１×１０^６個の細胞）に増加し；ドナー６からの％デキストラマー２０３＋細胞が、０．１９％（非形質導入）から、３５．５％（２．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、４１．２％（５μｌ／１×１０^６個の細胞）、４４．６％（７．５μｌ／１×１０^６個の細胞）、および４４．０％（１０μｌ／１×１０^６個の細胞）に増加したことを示す。

様々なαβＴ細胞集団におけるＴＣＲ発現を検出するために、ＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥで形質導入されたαβＴ細胞を、リンパ球＜一重項＜生細胞＜ＣＤ３＋＜ＣＤ４＋／－ＣＤ８＋／－上でゲートするＦＡＣＳによって分析した。図２３は、ドナー５（上側パネル）およびドナー６（下側パネル）から得られた％デキストラマー２０３（Ｄｅｘ２０３）＋（すなわち、ＴＣＲ＋）細胞が、ＣＤ４－ＣＤ８α＋細胞集団よりもＣＤ４＋ＣＤ８α＋細胞集団で一般により高いことを示す。対照的に、％Ｄｅｘ２０３（すなわち、ＴＣＲ）細胞は、ＣＤ４ＣＤ８α－細胞集団で最小である。同様に、図２４は、ドナー５（上側パネル）およびドナー６（下側パネル）から得られた％デキストラマー２０３（Ｄｅｘ２０３）ＭＦＩ細胞が、ＣＤ４－ＣＤ８α＋細胞集団よりもＣＤ４＋ＣＤ８α＋細胞集団で一般により高いことを示す。対照的に、％Ｄｅｘ２０３ＭＦＩは、ＣＤ４ＣＤ８α－細胞集団で最小である。これらの結果は、ＬＶ－ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥによってコード化される外因性ＴＣＲとＣＤ８が、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ４－Ｔ細胞の双方で同時発現され得ることを示唆する。

実施例８
４－ｉｎ－１コンストラクトまたはＴＣＲのみのコンストラクトを発現するαβＴ細胞の機能解析
図２５は、例えば、ＰＴＥ．ＣＤ８．ＴＣＲ．ＷＰＲＥなどの４－ｉｎ－１コンストラクト（ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ）、またはＲ１１ＫＥ．ＷＰＲＥなどのＴＣＲのみのコンストラクト（ＬＶ－ＴＣＲ）を含有する、レンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入されたαβＴ細胞の機能性を試験するための実験デザインを示す。簡潔に述べると、－１日目に、高抗原発現ＵＡＣＣ２５７＋ＲＦＰ細胞株（陽性対照）および抗原－陰性ＭＣＦ７＋ＧＦＰ細胞株（陰性対照）などの標的細胞を９６ウェルプレートに播種した。ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（５μｌ／１×１０^６個の細胞）またはＬＶ－ＴＣＲ（２．５μｌ／１×１０^６個の細胞）で形質導入された、例えば、ＰＢＭＣ（ドナー５、６、７、８から入手）などのドナー細胞製品を解凍し、２４ウェルのＧ－Ｒｅｘ（登録商標）ガス透過性急速増殖デバイス内で一晩休ませた。０日目に、例えば、２００，０００個のエフェクター細胞：１００，０００個の標的細胞の比率など、２：１のエフェクター細胞対標的細胞（Ｅ／Ｔ）比で、ドナー細胞製品（エフェクター細胞）と、例えば、ＵＡＣＣ２５７＋ＲＦＰおよびＭＣＦ７＋ＧＦＰなどの標的細胞とを共培養した。３７℃で５時間のインキュベート後、例えば、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）などのタンパク質輸送阻害剤を各ウェルに０．５μｌ／ウェルずつ添加し、３７℃で４時間のインキュベートがそれに続いた。次に、細胞を遠心分離し、ＥＬＩＳＡのための上清を収集してＩＦＮ－γ発現を検出し、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＦＮ－γ、グランザイムＢ、および生存／死滅などの、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）パネルを使用して染色するための細胞を収集した。

ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞集団
図２６は、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたグループ化ドナーから得られたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、形質導入のないもの（ＮＴ）よりも、より高い％ＩＦＮ－γ陽性細胞（上側パネル）およびより高いＩＦＮ－γ ＭＦＩ（下側パネル）をもたらしたことを示す。対照的に、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、％ＩＦＮ－γ陽性細胞およびＩＦＮ－γ ＭＦＩに有意差は観察されなかった。ＦＡＣＳは、ＣＤ４－ＣＤ８α＋ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞上でゲートした。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。これらの結果から、ＬＶ－ＴＣＲまたはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にＩＦＮ－γを発現するなど、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。

図２７は、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたグループ化ドナーから得られたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、形質導入のないもの（ＮＴ）よりも、より高い％グランザイムＢ陽性細胞（上側パネル）およびより高いグランザイムＢ ＭＦＩ（下側パネル）をもたらしたことを示す。対照的に、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、％グランザイムＢ陽性細胞およびグランザイムＢ ＭＦＩに有意差は観察されなかった。ＦＡＣＳは、ＣＤ４－ＣＤ８α＋グランザイムＢ＋Ｔ細胞上でゲートした。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝３）。これらの結果から、ＬＶ－ＴＣＲまたはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にグランザイムＢを発現するなど、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさなくてもよいことが示唆された。

ＣＤ４－ＣＤ８＋Ｔ細胞集団
図２８は、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたグループ化ドナーから得られたＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、形質導入のないもの（ＮＴ）よりも、より高い％ＩＦＮ－γ陽性細胞（上側パネル）およびより高いＩＦＮ－γ ＭＦＩ（下側パネル）をもたらしたことを示す。対照的に、ｔｈＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、％ＩＦＮ－γ陽性細胞およびＩＦＮ－γ ＭＦＩに有意差は観察されなかった。ＦＡＣＳは、ＮＴ細胞ではＣＤ４＋ＣＤ８α－ＩＦＮ－γ＋、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ－形質導入細胞ではＣＤ４＋ＣＤ８α＋ＩＦＮ－γ＋上でゲートした。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。これらの結果から、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔｃ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にＩＦＮ－γを発現するなど、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさなくてもよいことが示唆された。

図２９は、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたグループ化ドナーから得られたＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、形質導入のないもの（ＮＴ）よりも、より高い％グランザイムＢ陽性細胞（上側パネル）およびより高いグランザイムＢ ＭＦＩ（下側パネル）をもたらしたことを示す。対照的に、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、％グランザイムＢ陽性細胞およびグランザイムＢ ＭＦＩに有意差は観察されなかった。ＦＡＣＳは、ＮＴ細胞ではＣＤ４＋ＣＤ８α－グランザイムＢ＋、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ形質導入Ｔ細胞ではＣＤ４＋ＣＤ８α＋グランザイムＢ＋上でゲートした。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝３）。これらの結果から、ＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ４＋ＣＤ８α＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にグランザイムＢを発現するなど、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさなくてもよいことが示唆された。

ＣＤ３＋Ｔ細胞
図３０は、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８））で形質導入されたグループ化ドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、形質導入のないもの（ＮＴ）よりも、より高い％ＩＦＮ－γ陽性細胞（上側パネル）およびより高いＩＦＮ－γ ＭＦＩ（下側パネル）をもたらしたことを示す。対照的に、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、％ＩＦＮ－γ陽性細胞およびＩＦＮ－γ ＭＦＩに有意差は観察されなかった。ＦＡＣＳは、ＣＤ３＋Ｔ細胞上でゲートした。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。これらの結果から、ＬＶ－ＴＣＲまたはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にＩＦＮ－γを発現することなどによって、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。

図３１は、ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたグループ化ドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、形質導入のないもの（ＮＴ）よりも、より高い％グランザイムＢ陽性細胞（上側パネル）およびより高いグランザイムＢ ＭＦＩ（下側パネル）をもたらしたことを示す。対照的に、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、％グランザイムＢ陽性細胞およびグランザイムＢ ＭＦＩに有意差は観察されなかった。ＦＡＣＳは、ＣＤ３＋Ｔ細胞上でゲートした。非形質導入（ＮＴ）細胞が、対照として機能する。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝３）。これらの結果から、ＬＶ－ＴＣＲまたはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にグランザイムＢを発現することなどによって、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさなくてもよいことが示唆された。

図３２は、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたグループドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、非合形質導入（ＮＴ）、ＭＣＦ７細胞単独、ＵＡＣＣ２５７細胞単独のものよりも、ＩＦＮ－γの分泌量がより多くなることを示す。対照的に、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、ＩＦＮ－γ分泌のレベルに有意差は観察されなかった。（エフェクター対標的細胞比＝２：１；グループ化ドナーＮ＝４）。これらの結果から、ＬＶ－ＴＣＲまたはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入されたＣＤ３＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にＩＦＮ－γを分泌することなどによって、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。

図３３は、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入された個々のドナー５、６、７、および８から得られたＣＤ３＋Ｔ細胞と、高標的発現ＵＡＣＣ２５７細胞との共培養は、非合形質導入（ＮＴ）、ＭＣＦ７細胞単独、ＵＡＣＣ２５７細胞単独のものよりも、ＩＦＮ－γの分泌量がより多くなることを示す。対照的に、ＬＶ－ＴＣＲ（ＴＣＲ）またはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲ（ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＣＤ４－ＣＤ８α＋Ｔ細胞と、抗原陰性のＭＣＦ７とを共培養した場合、形質導入細胞と非形質導入細胞の間で、ＩＦＮ－γ分泌のレベルに有意差は観察されなかった。（エフェクター対標的細胞比＝２：１）。これらの結果から、ＬＶ－ＴＣＲまたはＬＶ－ＣＤ８．ＴＣＲで形質導入された個々のドナーから得られたＣＤ３＋Ｔ細胞は、例えば、ＵＡＣＣ２５７細胞などの高抗原発現標的細胞と接触した際にＩＦＮ－γを分泌することなどによって、機能的に活性化し、例えば、ＭＣＦ７細胞などの抗原陰性細胞に対しては、形質導入された細胞はほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。

実施例９
Ｔ細胞活性化マーカーの発現に対するスタチンの効果
Ｔ細胞活性化マーカーの発現に対するスタチンの効果を判定するために、例えば、アトルバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチンなどのスタチンでＴ細胞を処理し、ＦＡＣＳ分析がそれに続いて、例えば、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびｈＬＤＬＲなどのＴ細胞活性化マーカーの発現を測定した。

ＣＤ４＋Ｔ細胞集団
図３４は、アトルバスタチン、プラバスタチン、またはロスバスタチンで処理されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞における、ＣＤ２５＋細胞（上側パネル）、％ＣＤ６９＋細胞（中央パネル）、および％ｈＬＤＬＲ＋細胞（下側パネル）を示す。予備活性化細胞、スタチンまたはＤＭＳＯなしで活性化された細胞（対照）、およびＤＭＳＯが対照として機能する。これらの結果は、アトルバスタチン、プラバスタチン、およびロスバスタチンが％ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞および％ＣＤ４＋ＣＤ６９＋細胞にほとんど影響しない一方で、例えば、アトルバスタチンなどのスタチンが％ＣＤ４＋ｈＬＤＬＲ＋細胞を増加させてもよいことを示す。ＦＡＣＳは、リンパ球＞一重項＞生存／死滅＞ＣＤ３＋＞ＣＤ４＋上でゲートした。

ＣＤ８＋Ｔ細胞集団
図３５は、アトルバスタチン、プラバスタチン、またはロスバスタチンで処理されたＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞における、％ＣＤ２５＋細胞（上側パネル）、％ＣＤ６９＋細胞（中央パネル）、および％ｈＬＤＬＲ＋細胞（下側パネル）を示す。予備活性化細胞、スタチンまたはＤＭＳＯなしで活性化された細胞（対照）、およびＤＭＳＯが対照として機能する。これらの結果は、アトルバスタチン、プラバスタチン、およびロスバスタチンが％ＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞および％ＣＤ８＋ＣＤ６９＋細胞にほとんど影響しない一方で、例えば、アトルバスタチンなどのスタチンが％ＣＤ８＋ｈＬＤＬＲ＋細胞を増加させてもよいことを示す。ＦＡＣＳは、リンパ球＞一重項＞生存／死滅＞ＣＤ３＋＞ＣＤ８＋上でゲートした。

実施例１０
レンチウイルス力価に対するＷＰＲＥの影響
レンチウイルス力価に対するＷＰＲＥの影響を判定するために、野性型（ｗｔ）ＷＰＲＥ（配列番号９）（ＬＶ－Ａ）、ＷＰＲＥなし（ＬＶ－Ｂ）、ＷＰＲＥｍｕｔ１（配列番号２６５）（ＬＶ－Ｃ）、またはＷＰＲＥｍｕｔ２（配列番号２６６）（ＬＶ－Ｄ）を含有するレンチウイルスベクター（ＬＶ）を作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＬＶ－Ａ、ＬＶ－Ｂ、ＬＶ－Ｃ、またはＬＶ－Ｄで形質移入し、当該技術分野で公知の方法を使用して力価判定がそれに続いた。図３６は、これらのレンチウイルスベクターの力価が、ＬＶ－Ｃ＞ＬＶ－Ｄ≧ＬＶ－Ａ＞ＬＶ－Ｂの順であることを示す。これらの結果は、ＷＰＲＥｍｕｔ１およびＷＰＲＥｍｕｔ２が、レンチウイルスベクターの生成を改善するのに有用であってもよいことを示唆する。

本開示の利点としては、単一のベクターにおいて、例えば、４つのポリペプチドなどの複数の導入遺伝子を同時発現するウイルスベクターの作製、および養子細胞療法のための安全で標的特異的な「既製の」Ｔ細胞製品として、ＴＣＲαβおよびＣＤ８αβを同時発現するγδＴ細胞の作製が挙げられてもよい。

本明細書で言及される全ての参考文献は、各参考文献が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。あらゆる参考文献の引用は、出願日より前のその開示に対するものであり、本開示が、先行発明の性質上、そのような参照を先取りする権利を有していないことを認めるものとして、解釈されるべきではない。

Claims (23)

1. ＣＤ８αポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列Ｓ１、ＣＤ８βポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列Ｓ２、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）αポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列Ｓ３、およびＴＣＲβポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列Ｓ４を含んでなるベクターであって、前記ヌクレオチド配列が、Ｓ２－Ｓ１－Ｓ４－Ｓ３の５’から３’の方向でタンデムに配置された、ベクター。
2. 前記ＣＤ８αポリペプチドが、配列番号１１と少なくとも９０％同一であり、および前記ＣＤ８βポリペプチドが、配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載のベクター。
3. ２Ａペプチドをコード化する第５のヌクレオチド配列Ｓ５と、リンカーペプチドをコード化する第６のヌクレオチド配列Ｓ６をさらに含んでなる、請求項１または２に記載のベクターであって、Ｓ５およびＳ６が、Ｓ１とＳ２、Ｓ１とＳ４、および／またはＳ３とＳ４の間に配置される、ベクター。
4. 前記２Ａペプチドが、Ｐ２Ａ（配列番号３）、Ｔ２Ａ（配列番号４）、Ｅ２Ａ（配列番号５）、またはＦ２Ａ（配列番号６）から選択される、請求項３に記載のベクター。
5. 前記リンカーペプチドが、ＧＳＧまたはＳＧＳＧ（配列番号８）である、請求項３または４に記載のベクター。
6. フューリンペプチド（配列番号２）をコード化する第７のヌクレオチド配列Ｓ７をさらに含んでなる、請求項１～５のいずれか一項に記載のベクターであって、Ｓ７が、Ｓ１とＳ２、Ｓ１とＳ４、および／またはＳ３とＳ４の間に配置される、ベクター。
7. ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）またはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＰＲＥ（ＨＰＲＥ）から選択される、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）配列をさらに含んでなる、請求項１～６のいずれか一項に記載のベクター。
8. 前記Ｓ２～Ｓ７の転写を制御するプロモーター配列をさらに含んでなる、請求項１～７のいずれか一項に記載のベクターであって、前記プロモーター配列が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーター、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーター、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサー（ＭＮＤＵ３）を含有する修飾ＭｏＭｕＬＶ ＬＴＲ、ユビキチンＣプロモーター、ＥＦ－１αプロモーター、またはマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）プロモーターから選択される、ベクター。
9. アデノウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、アレナウイルス、フラビウイルス、ラブドウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、パラミクソウイルス、またはピコルナウイルスから選択されるウイルスベクターである、請求項１～８のいずれか一項に記載のベクター。
10. 前記ベクターが、天然ネコ内在性ウイルス（ＲＤ１１４）、ＲＤ１１４のキメラバージョン（ＲＤ１１４ＴＲ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）、ＧＡＬＶのキメラバージョン（ＧＡＬＶ－ＴＲ）、両栄養性マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ４０７０Ａ）、バキュロウイルス（ＧＰ６４）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ－Ｇ）、家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）、エボラウイルス（ＥｂｏＶ）、またはヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）から選択されるウイルスのエンベロープタンパク質で偽型化されている、請求項９に記載のベクター。
11. インビトロで行われる方法であって、
    Ｔ細胞を活性化するステップと、
    活性化されたＴ細胞を請求項１～１０のいずれか一項に記載のベクターで形質導入するステップと、および
    形質導入されたＴ細胞を増殖させるステップと、
    を含んでなる、免疫療法のためのＴ細胞を調製するインビトロ方法。
12. 前記Ｔ細胞をヒト対象から得られた血液サンプルから単離することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記Ｔ細胞が、白血球アフェレーシスヒトサンプルから単離される、請求項１２に記載の方法。
14. 前記活性化が、
    ａ）アミノビスホスホネート、および場合によりヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ－２）およびヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ－１５）；
    ｂ）スタチン；または
    ｃ） 抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体：
    の存在下で行われる、請求項１１に記載の方法。
15. 前記アミノビスホスホネートが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、前述のいずれかの塩および／またはその水和物から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、ダルバスタチン、フルインドスタチン、フルバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、シムバスタチン、ベロスタチン、およびロスバスタチンから選択される、請求項１４に記載の方法。
17. 前記増殖させるステップが、ＩＬ－２およびＩＬ－１５の存在下で行われる、請求項１１～１６のいずれか一項に記載の方法。
18. ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＴＣＲα、およびＴＣＲβが、前記増殖したＴ細胞の表面上で同時発現される、請求項１１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 請求項１１～１８のいずれか一項に記載の方法によって調製された、増殖したＴ細胞の集団。
20. 請求項１９に記載の増殖したＴ細胞集団を含んでなる組成物を含む、がんを治療するための医薬であって、
    前記Ｔ細胞が、表面上にＭＨＣ分子との複合体でペプチドを提示するがん細胞を殺滅し、
    前記がんが、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、尿膀胱がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、および前立腺がんからなる群から選択される、医薬。
21. 前記組成物がアジュバントをさらに含んでなる、請求項２０に記載の医薬。
22. 前記アジュバントが、抗ＣＤ４０抗体、イミキモド、レシキモド、ＧＭ－ＣＳＦ、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、アテゾリズマブ、インターフェロン－α、インターフェロン－β、ＣｐＧオリゴヌクレオチドおよび誘導体、ポリ－（Ｉ：Ｃ）および誘導体、ＲＮＡ、シルデナフィル、ポリ（ラクチドコグリコリド）（ＰＬＧ）との粒子状製剤、ビロソーム、インターロイキン（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、およびＩＬ－２３から選択される、請求項２１に記載の医薬。
23. 前記Ｔ細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、および／またはナチュラルキラーＴ細胞を含んでなる、請求項２２に記載の医薬。