JPH04166085A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ポリペプチドのアミノ酸配列中のグルタミン
酸残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する新規プロ
テアーゼ、該プロテアーゼの、バシラス属菌からの製造
方法、該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮ
Ａ配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入し
て得られる形質転換体、および該形質転換体を用いたプ
ロテアーゼの製造方法に関する。

（従来の技術） タンパク　（ポリペプチド）に作用して、グルタミン酸
（Ｇｌｕ）残基のカルボキシル基側を特異的に開裂する
酵素として、スタフィロコッカス　アウレウス（Ｓｔａ
ｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ）　Ｖ８株由来
のｖ８プロテアーゼが知られている（Ｇａｂｒｉｅｌ　
Ｒ，Ｄｒａｐｅａｕら、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅ
ｍ、　　２４７．　２０．　６７２０−６７２６（１９
７２））。

この酵素はセリンプロテアーゼに分類される。Ｃ１Ｃａ
ｒｍｏｎａら（Ｎ　ｕ　ｃ　ｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、
、　１５．６７５７（１９８７））は、この酵素をコー
ドするＤＮＡ配列をクローン化している。

同様の酵素としては、放射菌であるストレプ）ヘマイセ
ス　クリセウス　（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉ
ｓｅｕｓ）由来の酸性アミノ酸特異的エンドペプチダー
ゼが知られている　（Ｎｏｒｉｏ　Ｙｏｓｈｉｄａら、
　Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１０４、３．４５１−４５６（１９８８））。さらに、
バシラスン酸特異的エンドペプチダーゼも知られている
　（新留意琢部ら、生化学６１．９．８３３　（１９８
９）、第６２同日本生化学会大会抄録号）。

上記酵素は、タンパク質構造解析などの目的のためにタ
ンパクを上記位置で特異的に切断したい場合；遺伝子組
換え技術により目的タンパクを融合タンパクとして生産
させた場合に、該融合タンパクを切断して目的のタンパ
クを得る場合などに有用である。後者の場合では１例え
ば、目的タンパクをＧｌｕ残基を介して他のタンパクと
結合させて生産した後、この酵素で切断処理することに
より目的タンパクを分離することができる。そのため、
上記以外にもこのような酵素活性を有するプロテアーゼ
がさらに求められている。

（発明の目的） 本発明の目的は、　Ｇｌｕ残基のカルボキシル基側を特
異的に開裂する酵素活性を有する新規のプロテアーゼ、
該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列。

該ＤＮＡ配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを
導入して得られる形質転換体、および該形質転換体を用
いたプロテアーゼの製造方法を提供することにある。

（発明の構成） 発明者らは１上記微生物以外の微生物菌株からｖ８プロ
テアーゼなどの酵素と同様の活性を有するプロテアーゼ
を得ようと種々の検討を行った。その結果、、バシラス
　リケニホルミス　ＡＴＣＣ１４５８０株由来の上記性
質を有する新規プロテアーゼを見出した。さらに、この
プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列を
有する発現ベクター、該発現ベクターを導入して得られ
る形質転換体、および該形質転換体を用いたプロテアー
ゼの製造方法を見出し１本発明を完成するに至った。

本発明のプロテアーゼは、、バシラス　リケニホテアー
ゼであって、ペプチドのグルタミン酸残基のα位のカル
ボキシル基を含むペプチド結合を切断する性質を有する
。

本発明のプロテアーゼは、第１図の＋１位のＳｅｒから
＋２２２位のＧ１ｎまでのアミノ酸配列を有し、ペプチ
ドのグルタミン酸残基のα位のカルボキシル基を含むペ
プチド結合を切断する性質を有する。

本発明のＤＮＡ配列は、上記プロテアーゼをコードする
。

本発明の発現ベクターは、上記ＤＮＡ配列を有する。

本発明の形質転換体は、上記発現ベクターを宿主に導入
して得られる。

本発明のプロテアーゼの製造方法は、上記プロテアーゼ
を産生じ得るバシラス　リケニホルミスを培地中で培養
する工程、および生産されたプロテアーゼを該培地から
採取する工程を包含する。

本発明のプロテアーゼの製造方法は、上記形質転換体を
培養する工程、および生産されたプロテアーゼを該培地
から採取する工程を包含する。

本発明のプロテアーゼ（以下、　ＢＬａｓ’ｅと略称す
る）は、バシラス属菌、特にバシラス　リケニホルミス
　ＡＴＣＣ１４５８０株により生産される。本菌株はア
メリカンタイプ　カルチャー　コレクション（ＡＴＣＣ
）から人手できる。

■、培養条件 上記菌株の培地は格別である必要はなく１通常の培地が
用いられる。例えば、グルコース、大豆粉、肉エキス、
コーンステイープカー、各種塩類などを含有する培地が
用いられる。培養ｐ＋（は５〜９、好ましくはｐ＋１約
７゜０．培養温度は１５〜５０℃。

好ましくは約２８℃であり１例えば、好気的に攪拌また
は振盪しながら約３６時間培養を行う。本発明のＢＬａ
ｓｅは、主として細胞外に分泌される。

上記培養物から本酵素を採取・精製するには１既知の製
造法が単独で、もしくは併用して利用され得る。例えば
、培養物をフィルタープレスし。

限外濾過および遠心分離を行い、ａ縮除菌液を得る。こ
れを適当な手段で精製することにより本発明の酵素が得
られる。例えば、上記濃縮液をイオン交換クロマトグラ
フィーで粗分離した後、Ｓ〜セファロースを用いたクロ
マトクラフィーを行い。

次いで、アフィニティークロマトクラフィーを行うこと
により１本酵素が得られる。後述の実施例１においては
、このような方法により、　　１．９Ｘ１０’〜２．４
ｘ　１０３Ｕ／ｍｇ　（後述の活性測定法により測定）
の酵素標品が得られた。後述の酵素の性質は、この酵素
標品を用いて測定された。

１−Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ−ｐＨ八（Ｚはカルボベン
ゾキシ基。

そしてρＮ八はｐ−ニトロアニリン残基を示す）を基質
とし、該基質を、最終濃度が０．２ｍＭとなるように、
　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　　（ｐＨ７，５，２ｍ
ＭＣａＣ］２および２％ＤＭＦを含有する）に溶解させ
る。これに酵素液を加え、３７℃にて１０分間反応させ
る。酵素反応により遊離する反応液中のｐ−ニトロアニ
リンの吸光度を’１．１０ｎｎ＋にて測定する。吸光度
が１．０となるような酵素量を１単位（ＩＪ）とする。

本発明のＢＬａｓｅの酵素的並びにタンパク化学的性質
を以下に示す。

（１）作用および基質特異性 ■表１に示す合成基質を調製し、各合成基質を。

表１に示す濃度となるように、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−
ＨＣＩ　〔２ｍＭＣａＣ］２および表１に示す割合でジ
メチルホルムアミド（ＤＭＦ）またはジメチルスルホキ
シド（ＤＭＳＯ）を含有する；　ｐｆ１７．５］に溶解
させた。これに本酵素を加えて、２５℃にて反応させた
。酵素反応により遊離する反応液中のｐ−ニトロアニリ
ンの吸光度（４１０ｎｍ）を測定することにより、１ｍ
ｇの基質から１分間に遊離されるｐ−ニトロアニリンの
量（ｎｍｏｌ）を算出した。その結果を表１に示す。

（以下余白） Ｃ ■タンパク性基質として、酸化インシュリンＢを選択し
、該基質に対する本酵素およびスフフィロコツカス　ア
ウレウス由来のｖ８プロテアーセ゛の作用を次のように
して比較した。まず、酸化インシュリンＢを５０ｍＭ　
ＮＨ４８ＣＯ３，ｐＨ７，８，に溶解させ。

酵素／基質−１，／　］、　ＯＯ（Ｗ／ｌ１ｌ）となる
ように本酵素または上記ｖ８プロテアーゼを加えて、所
定時間反応させた。反応混合物を、　Ｖｙｄａｃ　Ｐｒ
ｏｔｅ１ｎ　Ｃ＜３００人。

４、６　Ｘ　２５０ｍｍカラムを用いたＩＩＰＬＣにか
け、０，１％ＴＦＡ中Ｏ％から５０％の了セトニトリル
を用いるリニアグラジェントで溶出を行った（アセトニ
トリルは１分間当り１．６７％上昇させた）。このよう
にして。

ペプチドマツピングを行なった結果、いずれの酵素を用
いた場合にもＧｌｕ残基のカルボキシル基を含むペプチ
ド結合が切断されており、酵素分解による生成物は一致
した。

上記■および■の結果から１本酵素は、ペプチドのグル
タミン酸残基のカルホキシル基を含むペプチド結合を切
断する。クルクミン酸特異的エンドペプチダーゼ゛であ
ることが明らかである。

（２）至適ρＩ］および安定ｐＨ範囲 基質としてｚ−Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ−ｐＮＡを用い
、該基質を１０％ＤＭＦおよび２ｍＭＣａＣｌ２を含む
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ溶液に溶解させた。これに
本酵素を加え、３７℃にて１５分間反応させた。酵素反
応により遊離する反応液中のｐ−ニトロアニリンを吸光
度４１０ｎｍにて測定した。上記反応液のｐＨを変化さ
せて反応を行なったところ９反応の至適ｐ＋＋は８．０
であることがわかった。

次に、各種ｐＨ条件下で１本酵素を２５℃にて２４時間
保持した後、活性測定法に準じて反応を行ない。

残存活性を測定した。その結果、安定ｐｔ（範囲は６．
５〜８５であることがわかった。

（３）温度安定性 本酵素を２ｍＭのＣａＣｌ。を含む緩衝液中、　ｐＨ７
，８にて各種温度条件下で１５分間保持した後、活性測
定法に準じて反応を行なった。その結果９本酵素は」１
記条件において６０℃まで安定であることがわかった。

ＣａＣｌ２を含有しない緩衝液中で保持した場合には、
５０℃まで安定であった。

（４）阻害剤の影響 本酵素はジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ
）により完全に阻害される。このことから本酵素はセリ
ンプロテアーゼに分類されることがわかる。

本酵素はＺ−Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　ＣＬＣＩにより
完全に阻害される。このことからも本酵素はクルクミン
酸特異的エンドペプチダーゼであることがわかる。

本酵素は、　ＥＤＴＡにより部分的に阻害される（最大
阻害率約７２％）。このＥＤＴＡによる阻害は、金属イ
オンを低濃度で添加することにより　（１０−３〜１０
−４ＭのＯａ２＋、　Ｍｇ２＋などを添加）完全に回復
した。

上記の結果から２本酵素は典型的なセリンプロテアーゼ
であり、その安定性に金属イオンが関与していると考え
られる。

（５）分子量 ５Ｏ３−ＰＡＧＢ　（１，５％ゲル、　　１．　Ｏｍｍ
　；分子量マーカー：Ａｍｅｒｓｈａｍ製　ＲＡＩＮＢ
ＯＩＩＩ”　　Ｐｒｏｔｅ１ｎ　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　　ＷｅｉｇｈｔＭａｒｋｅｒ）により分子量の測定を
行った結果１本酵素の分子量は２６．０００と算出され
た。後述する木酵累の遺伝子配列分析から明らかとなっ
たアミノ酸配列をもとにしてその分子量を計算すると２
３．５６７となり、　　５Ｏ３−ＰへＧＢの値とはやや
異なる。しかし。

後述のタンパク化学的各種分析（アミノ酸組成。

Ｎ末端配列、Ｃ末端近傍のアミノ酸組成）の結果は、遺
伝子配列から明かとなった性状と良く一致する。従って
、　５Ｏ８−ＰへＧ［Ｅにより得られた分子量は本来の
分子量より少し高く現れていると考えられる。

（６）等電点 ファルマシア社製ＦＡＳＴ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｈａｒ
ｍａｌｉｔｅ　；ｐＨ３，０−１０，０）を用いて調べ
た結果１本酵素の等電点はｐＨ９，０以上となり、正常
な値は得られなかった。

（７）アミノ酸組成 本酵素を４Ｍメタンスルホン酸〔０，２％の３−（２−
アミノエチル）インドールを含む〕を用いて１１０℃で
所定の時間（２４，４８および７２時間）加水分解した
。それぞれの加水分解産物を日立アミノ酸分析機（Ｍｏ
ｄｅｌ　８３５）にかけてアミノ酸分析を行った。

その結果を表２に示す。表２には、加水分解によるアミ
ノ酸の破壊を補正した値を示した。本酵素のＤＮＡ配列
（後述）から明らかとなったアミノ酸配列をもとにし＝
ご算出したアミノ酸組成もあわせて表２に示す。これら
の結果はよく一致することが明らかである。

表２　　　アミノ酸組成 測定値（％）　計算値（％） 合計　　　　１００．０１　　　９９．９７（８）アミ
ノ酸部分配列 ■アミノ酸Ｎ末端配列 アプライド　バイオシステムズ社４７７Ａ　Ｐｒｏｔｅ
１ｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてＮ末端付近のアミノ酸
配列分析を行った。分析にあたっては、予めＤＦＰで阻
害された本酵素を用いた。Ｎ末端から２３残基までのア
ミノ酸配列を表３に示す。

表３ ■Ｃ末端アミノ酸配列 予めＤＥＰで阻害した本酵素に、カルボキシペプチダー
ゼ゛Ａ　（ＣＰａｓｅ八）また（まカルボキシペプチダ
ーゼ立アミノ酸分析ａ　（Ｍｏｄｅｌ　８３５）で定量
した。その結果，いずれのＣＰａｓｅを用いた場合にも
Ｃ末端を決定することができなかった。しかし、Ｃ末端
付近にＧ１ｎ，　Ｓｅｒ，　Ａｈａ，　Ａｓｎなどが存
在することが確言点された。

（以下余白） Ｖ、　　ＢＬａｓｅをコードするＤＮへの配列の決定以
下に１本発明を説明するうえで用いられる用語を説明す
る。

゛オリゴヌクレオチドパとは、短い一本鎖ＤＮへを意味
する。オリゴヌクレオチドは、既知の方法により化学合
成することができる。本発明に用いるオリゴヌクレオチ
ドは、特に明示しない限り、化学合成され、セファデッ
クスＧ５０を用いたゲルクロマトグラフィーおよび逆相
シリカゲルカラムを用いた高速液体クロマトグラフィ＝
（ＨＰＬＣ）により精製して得られる。

”ＰＣＲ”とは、ポリメラーゼチェインリアクション（
Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａ１ｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ
）の略であり、　ＤＮＡ上の一定の領域を酵素的に増幅
させる方法を意味する　（Ｓａｉｋｉら、　　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　　２３９．　４８７−４９７（１９８Ｂ））
。

まず、増幅したいＤＮＡを熱変性させて一本鎖とし。

この−本川の鋳型ＤＮＡのそれぞれの３゛末端領域に相
補的なオリゴヌクレオチドプライマー（センス釦および
アンチセンス鎖の２種類）をアニーリングさせる。次に
、Ｄｊ轄ポリメラーゼの作用によってそれぞれのプライ
マーからＤ　Ｎ　Ａ　鎖の伸長反応を行わせる。この一
連の反応を繰り返すことにより、目的のＤＮＡを１０万
倍〜１００万倍に増幅することができる。

゛サブ２分析パとは、ある制限酵素によって切断して得
たＤＮＡ断片に目的の遺伝子が含まれているかどうかを
検定するだめの方法である。ザザン分析を行うには、ま
ず一本鎖ＤＮＡ上の特異的な塩基配列を認識してＤＮＡ
を切断する制限酵素でＤＮＡを消化する。得られた消化
物の１％アガロースゲル電気泳動を行い、アルカリ処理
より変性させて１本川とし、ナイロンフィルターに移す
。一方１問題とする遺伝子の一部であるオリゴヌクレオ
チドもしくはＤＮＡ断片を卆備し、標識を施してプロー
ブとする。このプローブとナイロンフィルター上の１本
川ＤＮＡとのハイブリッド形成により分析がなされる。

゛ライゲーション（結合）パとは、２個の二本鎖ＤＮＡ
断片の間にホスホジエステル結合を形成させることを意
味する。その際、二本鎖ＤＮＡ断片自身の自己結合を防
止するため、一方の１祈片の脱リン酸処理を常法（Ｔ、
　Ｍａｎｉａｔｉｓら、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ
ｎ１ｎｇ。

１３３−１３４　（１９８２）　）により行っておく。

ライゲーションは、既知の緩衝液および反応条件を用い
、　　Ｔ４ＤＮ八リガーゼ（こより行うことができる。

゛形質転換″とは、外来性の遺伝子（ＤＮＡ）を細胞（
宿主細胞）内に導入することにより、該細胞の遺伝形質
が変化する現象を指す。形質転換後の細胞は形質転換体
と呼ばれ、外来ＤＮＡを該細胞の染色体外成分として、
または染色体に組み込まれて。

複製され得る状態で有する。

次に１本発明のＢＬａｓｅをコードするＤＮＡ配列の決
定方法を、工程の順に説明する。このＤＮＡ配列は。

バシラス　リケニホルミス　ＡＴＣ口１４５８０株のゲ
ノムＤＮＡを、　ＰＣＲ解析、サザン分析、直接シーク
エンス法などを組み合わせて分析することにより決定さ
れた。

（１）ゲノムＤＮ△内部配列のＰＣＲ解析Ｂ１、ａｓｅ
をコートするＤＮＡ配列は９例えば、ゲノムＤＮＡから
得ることができる。それには、まずノ＼シラス　リケニ
ホルミス　へＴＣ口１４．５８０株のゲノムＩＩＮＡを
、該菌株の培養細胞から既知の方法（Ｍ、Ｓｔａ旧ら、
　　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、１５４，４０６−４１２（１９８３））　＋こ従って
ε男前する。このゲノムＤＮＡを。

ＰＣＲ解析の鋳型ＤＮＡとして用いる。ＰＣＲに用いる
オリゴヌクレオチドプライマーは、上記■項（８）で得
られる精製酵素のＮ末端付近のアミノ酸配列：および該
酵素を部分分解して得られるペプチドのアミノ酸配列に
基づいて、常法により合成することができる。例えば、
　ＢＬａｓｅのアミノ酸配列のＮ末端側第１２位から１
９位に相当するアミノ酸配列Ｔｈｒ　ＡｓｎＴｈｒ　Ｔ
ｈｒ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｔｙｒをコードするオ
リゴヌクレオチド　（但し、Ｃ末端のＴｙｒのコードす
るトリプレットの２番目の塩基まで：　２３ｍｅｒ）を
センスプライマーＢＬ８とする。

これとは別に、上記精製酵素をリジルエンドペプチダー
ゼで部分分解して得られたペプチドを配列決定したなか
で、最も信頼度の高いペプチドを選び、これをもとにオ
リゴヌクレオチドを合成する。

後述の実施例２に述べられているようにＧｌｙ　Ｔｙｒ
Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　ＡＳＩＩ　Ｌｙｓの配列が得られたの
で、このアミノ酸配列をコードするオリコヌクレオチド
に相補的な１８ｍｅｒをアンチセンスプライマーＢシ８
３とする。

上記ゲノムＯＮへ、センスプライマーＢＬ８．およびア
ンチセンスプライマーＢに８３を用いてＰＣＲを行うこ
とにより、ゲノムＤＮＡ中の目的ＤＮＡＩが伸長され、
増幅される。得られたＰＣＲ産物をアガロースゲル電気
泳動により解析すると、約３７０ｂｐ長のＤＮＡ断片が
得られる。このＤＮＡ断片を適当なベクターに組み込み
、サブクローニングを行なった後、サンガー法によりＤ
ＮＡ配列が決定される。上記アンチセンスプライマーＢ
シ８３の作成の基本となったアミノ酸配列Ｇｌｙ　Ｔｙ
ｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓは１３１〜１３６
位に位置するアミノ酸であることがわかる。

（２）ゲノムＤＮＡのサザン分析 上記（１）項で調製したバシラス　リケニホルミスＡＴ
諏１４５８０株由来のゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓａｌ
■で消化し、これをアガロースゲル電気泳動にかけて分
離した後、該ＤＮＡ断片をナイロンメンブランフィルタ
−にプロッティングし、ザザン分析を行う。ハイブリダ
イゼーション用プローブは、（１）項で得られるＢＬ８
−ＢＬ８３のＰＣＲ産物を３２Ｐ−ｃｌｃＴＰを常法に
より標識して用いる。この８１８−ＢＬ８３とハイブリ
ダイズした陽性ＤＮＡ断片は、約３．１ｋｂのハンドと
して認められる。

（３）　Ｐ　ＣＲ法によるゲノム［］ＮＡの塩基配列の
決定（１）項で得られたバシラス　リケニホルミスへＴ
ＣＣ１４５８０株のゲノムＤＮＡを５ａｌＩで消化し、
これを適当なベクター、例えばｐｌＪｃ１１９ベクター
に組み込み、既知のＤＮＡ配列の一部分をプライマーと
して用いＰＣＲ反応を行う。例えば、上記ゲノムＤＮへ
の上流側に位置するｐＵｃ１１９のＤＮＡ配列の一部を
センスプライマーＲＶとし、上記（２）項で解析された
３７５ｂｐのＤＮＡ断片の３′末端付近の配列に相補的
なｌ］ＮＡ配列をアンチセンスプライマー旧２５とする
。

ＲＶ：５”−ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＢ１
２５　：　　５’　−ＴＧＴＣ［：ＣＡΔ［１：ＡＡＧ
ＴＧＡＴＧ八上記ＰＣへ反応を行なうことにより約１０
５０ｂｐのＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片の配
列は、直接ＤＮＡ塩基配列決定法［Ｇｉｂｂｓら、　Ｐ
ｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

８６、　１９１９−１９２３（１９８９））により決定
される。このようにしてＢＬａｓｅをコードするＤＮＡ
配列のＮ末端から中途部分までの配列が決定される。

次に、下記の方法により、ゲノムＤＮＡの３゛末端側の
配列の決定が行われる。まず、上記と同様に、バシラス
　リケニホルミス八ＴＣＣ１４５８０株のゲノ１．ＤＮ
Ａを５ａｌｌで消化し、約３．１ｋｂの断片を単離する
。これをＭ１３ｍｐＨに組み込み、　ＰＣＲ反応を行う
。プライマー、＝しては、（２）項で解析された３７５
ｂｐのＤＮＡ断片の一部　（上記アンセンスプライマー
Ｂ１２５よりも上流側）の配列がセンスプライマー３４
０として、そして、ゲノムＤＮＡの下流側に位置する旧
３ｍｐＨのＤＮＡ配列の一部に相補的なりＮＡ配列がア
ンチセンスプライマーＭ４として用いられる。

８４０　　：　　５’−ＡＡＡＡＣＣＧＴＣＧロ八八ロ
ＡＧＣＣＭ４へへ　：　　５’−ＧＴＴＴＴＣＣＣ八Ｇ
ＴＣ八［１へＧＡＣへ記ＰＣＲ反応を行なうことにより
約２．２ｋｂのＤＮＡ断片が得られる。このＤＮＡ断片
の配列は、直接ＤＮＡ塩基配列決定法により決定される
。このようにして。

ゲノムＤＮＡの３”末端から中途部分までの配列が決定
される。

このようにして決定されたＢ　Ｌ　ａ　ｓ　ｅの全ＤＮ
Ａ配列およびそれにより決定されるアミノ酸配列を第１
図に示す。第１図から４本発明のバシラス　リケニホル
ミス由来の成熟タンパクをコードする遺伝子は、−９４
位のｆＭ吋から−１位のＬｙｓまでの９４個のアミノ酸
でなるシクプールペプテドをコードするＤＮＡ配列；お
よび→−１位のセリンから＋２２２位のＳｅｒまでの２
２２個のアミノ酸でなる成熟タンパクをコードするＤＮ
Ａ配列を有することがわかる。通常はＡＴＧがｆＭｅｔ
をコードするが、ここではＴＴＧ′ｈ（ＩＪＪ訳開始コ
ドンであると考えられる。５゛非翻訳領域のＳａｌ■部
位から３３２ｂｐの範囲には、−３５領域およびプリブ
ナウ配列を含むプロモーター領域およびＳＤ配列が存在
（上記推定翻訳開始コドンＴＴＧの９塩基上流に存在）
する。３″非翻訳領域には、終止コドンＴＡＡから８塩
基下流に、１３塩基対からなる逆向き反復配列が存在す
る。

■６発現ベクターの構築 本発明の発現ベクターの一例であるｐＨＹ３００Ｂ＋、
１１は、第３図に示すように、、バシラス　ザチリスＡ
ＴＣＣ６０５１株由来のアルカリ性プロテアーゼノ９−
ミネーターを有するシャトルベクターであるｐ　ＩＩＹ
　３００　Ｐ　Ｌ　Ｋ　ｔ　ｔに、第１図で示される本
発明のＢＬａｓｅをコードするＤＮΔ断片　（プロモー
ター、シフはルペプチドをコードするＤＮＡ配列、　　
ＢＬａｓｅ成熟タンパクをコードする配列、およびクー
ミネークーを含む）を組み込むことにより得られる。上
記ｐ　ＨＹ　３００ＰＬＫｔｔは、第４図に示すように
５大腸菌と枯草菌のシャトルベクターであるｐＨＹ　３
００　Ｐ　ｌ、Ｋに、、バシラス　ザチリス　ＡＴＣＣ
６０５１株由来のアルカリ性プロテアーゼのターミネー
タ−を組み込むことにより得られる。

上記工程を順に説明すると、まず、第４図に示すよう（
ご、ハ゛シラス　ザチリス　八ＴＣＣ６０５１株がらＭ
、５ｅａｌらの方法（前出）によりゲノムＤＮΔを単離
し、これを鋳型ＤＮＡとする。次にプライマーとして、
、バシラス　ザチリス　ｌ−１６８株由来のアルカリプ
ロテアーゼの遺伝子のターミネータ部分の５”末端付近
に相当し、ＸｂａＴ部位が付加されたＤＮＡ配列でなる
断片および３゛末端側近に相当し。

Ｈ１ｎｄ１１１部位が付加されたＤＮＡ配列に相補的な
りＮＡ配列でなる断片を化学合成し、これを用いてＰＣ
Ｒ反■で分解し、第４図に示す断片■を得る。次に。

ｐＨＹ３００ＰＬＫをＸｂａ　ＩおよびＨ１ｎ＋ｊ■で
分解し、大きい方の断片■を得る。これらの断片■およ
び■を連結することにより、、バシラス　ザチリス　Ａ
ＴＣＣ６０５１株由来のアルカリ性プロテアーゼのター
ミネータを有するシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ
ｔｔが構築される。

次に、、バシラス　リケニホルミス　ＡＴＣＣ１４５８
０株由来の培養細胞からゲノムＤＮＡを単離し、これを
鋳型ＤＮＡとする。このＤＮＡ配列の５゛末端付近に相
当し、　［ＥｃｏＲＩ部位が付加されたＤＮＡ配列でな
る断片および３゛末錨；付近に相当し、Ｘｂａ１部位が
イス１加されたＤＮＡ配列に相補的なＯ贋配列でなる断
片を合成し、これらをセンスプライマーおよびアンチセ
ンスプライマーとする。上記鋳型ＤＮＡ、およびセンス
プライマーおよびアンチセンスプライマーを用いてＰＣ
Ｒ反応を行なう。得られた断片をＢｃｏＲＩおよびＸｂ
ａ　Ｉで切断し、　ＢＬａｓｅをコードするＤＮＡ断片
断片帯られる　（第３図）。この断片■は、プロモータ
ー、シグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列、成熟Ｂ
　Ｌ　ａ　ｓ　ｅをコードするＤＮＡ配列、およびター
ミネータを有する。次に、上記１）ＨＹ　３００　ｐ　
Ｌ　Ｋ　ｔ　ｔをＥｃｏＲとＸｂａ　Ｉとで分解し、大
きいほうの断片■が得られる。上記断片■および■を連
結することにより。

本発明の発現ベクターであるｐＨＹ３００ＢＬｔｔが得
られる　（第３図）。

この発現ベクターｐ　Ｉｔ　Ｙ　３００　Ｂ　Ｌ　ｔ　
ｔは、　ＢＬａｓｅのプロモーター支配下に、　　Ｂｌ
、ａｓｅの一９４位のｆＭＢＴから一１イ立のＬｙｓで
なるシグナルペプチドド配列，＋１位のＳｅｒから＋２
２２位のＧ１ｎでなる成熟タンパクをコードするＤＮＡ
配列，その下流に存在するターミネータ−を有する３”
非翻訳領域を有し，さらにその下流には、バシラス　ザ
チリス　八ＴＣＣ　６０５１株由来のアルカリ性プロテ
アーゼのターミ不一クーを有する。

■，形質転換体の調製およびＢＬａｓｅの製造■項で得
られた発現ベクターは，常法により適当な宿主細胞に導
入される。例えば、上記ｐＨＹ３００ＢＬｔｔは枯草菌
ＩＳＷ　１２１４株　（宝酒造）に、　　Ｊ，Ｓｐｉｚ
ｉｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ，　Ｎａｔｌ，八ｃａｄ，　
Ｓｃｉ．４４．　１０７２（１９５８）：］により導入
される。得られた形質転換体（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　　ｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ　ｐＨＹ３００ＢＬｔｔ／ＩｓＩＩＩ　
１２１４）は、宿主に適した培地で培養することにより
，本発明のＢＬａｓｅを産生する。この形質転換体の培
養物から，前述の■項に記した方法によりＢＬａｓｅが
単離，精製される。

（以下余白） （実施例） 以下に本発明を実施例につき説明する。

実施例１ 、バシラス　リケニホルミス　ＡＴＣＣ１４５８０株を
。

２０％グルコース、２．０％ソイビーンミール、０．２
５％コーンステイープリカー、０．５％（Ｎ）Ｉ、）２
Ｓｏ４．　０．０５％に２８Ｐ口、、　　０．０５％　
ＭｇＳＯ４−７１１２０，０，０１％　Ｆｅ５０．　　
・　７Ｈ２［］。

および０３％ＣａＣＯ３を含むｐＨ７，０の培地で２８
℃にて３６時間培養した。培養液９５Ｌをフィルタープ
レスし、限外濾過モジュールにットー限外濾過モジュー
ルＮＴＩＩ　２０２０Ｔ　Ｐ１８Ｂ（ＩＩＦ）、　ＭＷ
　２０，０００　Ｃｕｔ）および遠心分離機（４２００
ｒｐｍ、　３０分）を用いて約１４１゜に濃縮した。こ
の濃縮除菌液を２　ｍＭ　ＣａＣｌ２水溶液で希釈して
約２８Ｌ、　１．９０ｍ５／ｃｍとし１次いで１３Ｃ１
を加えてｐＨ６，０とした。これに２　ｍＭ　ＣａＣｌ
２を含む１０ｍＭアセテートバッファー、　ｐＨ６，０
で平衡化したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＣＧ−５０約４Ｌを
加え、４時間室温にて攪拌した。」１清にＢＬａｓｅ活
性のないことを確認してからデカンテーションにより上
清を捨て、　Ａｍｂｅｒｌｉｌ：ｅＣＧ−５０をガラス
カラム（１４Ｘ　３２ｃｍ）に充填した。

約１ＯＬの１０ｍＭアセデートバッファ　−（ｐＨ６、
０，２ｍＭＣａＣ］＋を含む）で洗浄後、０．５Ｍ酢酸
す）　ＩＪウムバッフｙ　−（ｐＨ８，５，２ｍＭ　［
ａＣＩ２を含む）で溶出した。

Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＣＧ−５０より溶出したＢＬａｓ
ｅ活性分画を集め（２，７１）、　　これを水に対して
２昼夜透析した。

透析白物を２ｍＭ　ＣａＣ）２で８１、に希釈しく２．
２３ｍ５／ｃｍ）　。

ｐＨ６，０に調整後、カラム（５Ｘ　４０ｃｍ）に充填
した約８００ｍ１のＳ−セファＤ−ス　（２ｍＭの口ａ
Ｃｔ２を含有する５ｍＭアセテートバッファー、ｐＨ６
，０であらかじめ平衡化）に吸着させた。次いで、この
カラムを」１記平衡化に用いた緩衝成約５１、で洗浄後
、Ｏ〜０．２Ｍ　ＮａＣｌを含む緩衝液７［７で直線濃
度勾配により溶出した。

ＢＬａｓｅ活性を持つ分画を集め（９００ｍｌ）　、　
　２　ｍＭＣａＣＬ水溶液に対して一晩透析した（約９
５０ｍ１゜０、８６ｍ５／ｃｍ）。この透析白物をｐＨ
７，５に調整後、速やかにアフィニティータロマドクラ
フィーを行った。上記アフィニティータロマドグラフィ
ーにおいて、担体としては口（セファロース４Ｂ　（Ｐ
ｈｅ　Ｌｅｕ−Ｄ−Ｇ　Ｉ　ｕＯＭｅ）約３４０ｍ１を
用い、これを３Ｘ４８ｃｍのカラムに充填して、２ｍＭ
のＣａＣｌ２を含む５　ｍ！、ｌ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、
　ｐＨ７，５，で平衡化したものを用いた。上記透析白
物をカラムに吸着させた後、平衡化に使用したものと同
様の緩衝成約５Ｌで洗浄後、　ＮａＣｌをＯ〜０．７Ｍ
の割合で含む同緩衝液３．５Ｌを用いて直線濃度勾配に
より溶出を行なった。

採取した各フラクションのＢＬａｓｅ活性を、活性測定
法に準じて測定した。その結果を第５図に示す。別に、
各フラクションの２８０ｎｍにおける吸光度を測定して
、タンパク濃度の目安とした。その結果をあわせて第５
図に示す。第５図から明らかなように、　ＮａＣｌ濃度
が０．５Ｍ例近で溶出される。得られたＢ　Ｌ　ａ　ｓ
　ｅは５ＤＳ−ＰＡＧＥで単一なバンドを示した。

このようにして、培養液９５シより比活性１．９Ｘ　１
０３〜２　Ｘ　１０３Ｕ／ｍｇの酵素標品８３３．１ｍ
ｇ　（Ｂｉｏ　Ｒａｄ　Ｐｒｏｔｅ１ｎａｓｓａｙ　ｋ
ｉｔで定量）が得られ、酵素活性の収率は２７．５％で
あった。

（以下余白） 実施例２ 〔１）ゲノムＤＮＡの内部配列のＰ［”Ｒ解析実施例１
で得られた精製ＢＬａｓｅ　（ＤＥＰ処理済）１００μ
ｇを、　１Ｍ尿素を含む０．０５Ｍ　）リス−塩酸（ｐ
Ｈ９，０）１５０μｍ中において、１μｇのりジルエン
ドペプチダーゼ（和光純薬）で３７℃で５時間消化した
。

酵素消化物を、　ＴＳＫｇｅｌ　０ＤＳ−１２０Ｔのカ
ラム（ＴＯ３Ｏ１１゜４、６　Ｘ’　２５０ｍｍ）を用
いた高速液体クロマトクラフィーで分解精製した。得ら
れた消化断片の−ｒアミノ酸配列、アプライド　ハイオ
システムダ社製４’？？Ａ型プロティンシーケンサ−で
調べた。５種類の断片のアミノ酸配列が決定され、その
うちの３種を下記に記す。

Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ　　
　　　　　（−１）Ａｌａ−Ｊ　Ｉｅ−Ｖａｌ−月１ｓ
−Ｉｃｅ　　　　　　　　　　　　　　　　　　（ＪＴ
　）Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｉｃｅ
−Ｐｒｏ−３ｅｒ　　　（Ｉｎ　）次に、、バシラス　
リケニホルミス　八ＴＣＣ１４５８０株の培養細胞から
、　Ｍ、　５ｔａｌら（前出）の方法に従ってゲノムＤ
ＮΔを調製し、該ＤＮＡをＰＣＲ解析に用いる鋳型ＤＮ
Ａとした。ＰＣＲに用いるオリゴヌクレオチドプライマ
ーは、、バシラス　リケニホルミスＡＴＣＣ１４５８０
株が生産するＢＬａｓｅの既知部分のアミノ酸配列に基
づいて作成した。まず、　Ｂ　Ｌ　ａ　ｓ　ｅのアミノ
酸配列のＮ末端から第１２位〜第１９位のアミノ酸配列
（表３参照）　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　八ｌ
ａ　Ｔｙｒ　Ｐｒ。

Ｔｙｒをコードするオリゴヌクレオチド　（但し、Ｃ末
端のＴｙｒをコードするトリプレットの２番目の塩基ま
で：　２３ｍａｒ）を化学合成し、これをセンスプライ
マーＢＬ８とした。

次に、上記リジルエンドペプチダーゼの消化産物のうち
最も信頼度が高いと考えられるアミノ酸配列（Ｉ　）Ｇ
ａｙ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇａｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓをコー
ドするオリゴヌクレオチドに相補的な１８ｍｅｒを化学
合成し。

アンチセンスプライマーＢ　Ｌ　８３とした。

上記鋳型ＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプライマーを
用いて、　ＰＣＲ法［５ａｉｋｉら、　５ｃｉｅｎｃｅ
　２３９．４８７−４９１　（１９８９）　〕によりＤ
Ｎ八を増幅させた。増幅産物の一部を１％アガロースゲ
ル電気泳動で分析したところ、約３７０ｂｐのＤＮＡ断
片が確認された。この断片を単離し、クレノー断片で処
理することにより平滑末端とした後、ＳｍａＩで消化さ
れたＭ　１．３　ｍ　ｐ　１１にザブクローニンクし、
サンガー法［Ｓａｎｇｅｒら、　　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７４．５４６３−
５４６７（１９７７）　］によりＤＮＡ配列を決定した
。その結果、　３７５ｂｐのＤＮＡ配列が決定され、　
Ｂ１２５に相当するアミノ酸配列は１．３１〜１３６位
に位置することがわかった。さらに」−記（ＩＩ）およ
び（ＩＩＴ）のアミノ酸配列は２１〜２５位、および７
９〜８６位にそれぞれ存在することがわかった。

（２）ゲノムＤＮへのサザン分析 上記（１）項で調製した、バシラス　リケニホルミスＡ
ＴＣＣ１４５８０株由来のゲノムＤＮＡを、制限酵素Ｓ
ａｌ■で消化し、これを１％アガロースゲル電気泳動に
かけて分離した後、該ＤＮＡ断片をナイロンメンブラン
フィルタ−にプロッティングし、ザザン分析を行なった
。ハイブリダイセーション用プローブとしては、（１）
項で得られるＢＬ８−ＢＬ８３のＰＣＲ産物を３２１”
ｄｃＴＰを常法により標識したものを用いた。

このＢＬ８−ＢＬ８３　ＰＣＲ産物とハイブリダイズし
た陽性ＤＮＡ断片は、約３．　ｌｋｂのバンドとして詔
狛られた。

（３）ＰＣＲ法によるゲノムＤＮへの塩基配列の決定（
］）項で得られた、バシラス　リケニホルミスＡＴＣＣ
１４５８０株のゲノムＤＮＡを５ａｌＩで消化し、　Ｔ
４ＯＮ八ポリメラーゼで平滑末端とした。これを脱リン
酸化されたｐＵｃ１１９　Ｓｍａ　Ｔ消化ベクターに連
結した。この連結反応は、市販のキット（宝酒造）を用
いて行なった。

次に下記のセンスプライマーＲＶおよびアンデセンスプ
ライマー８１２５を化学合成し、上記連結反応の反応液
の一部に加えてＰＣＲ反応を行なった。

センスプライマーＲＶは、上記ゲノムＤＮへの上流側に
位置するｐ［Ｉｃ１１９のＤＮＡ配列の一部であり、ア
ンチセンスプライマー８１２５は、上記（２）項で解析
された３７５ｂｐのＤＮＡ断片のＣ末端付近の配列に相
補的なりＮＡ配列である。

ＲＶ　　　：　　５’−ＣへＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴ
ＧＡＣＢ１２５　：　　５“−ＴＧＴＣＣＣＡＡＣＡＡ
ＧＴＧ八ＴＧへ上記ＰＣＲ反応を行へうことにより約１
０５０ｂｐのＤＮＡ断片が得られた。このＤＮＡ断片の
配列を、直接ＤＮＡ塩基配列決定法［Ｇｉｂｂｓら、　
Ｐｒｏ、　Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

８６、１９１９−１９２３（１９８９）］により決定し
た。このようにして本酵素をコードするＤＮＡ配列のＮ
末端から中途部分までの配列が決定された。

（１）項で得られた、バシラス　リケニホルミス　ΔＴ
ＣＣ１４５８０株のゲノムＤＮＡを３ａｌＩで消化し、
１％アガロースゲル電気泳動にかけて、約３．１ｋｂの
ＤＮＡ断片を単離した。これをクレノー断片により平滑
末端とし２次いで脱リン酸化されたＭ１３ｍｐＨ，Ｓｍ
ａ　Ｉ消化断片と連結された。これを鋳型としてＰＣＲ
反応を行なった。プライマーとしては、（２）項で解析
された３７５ｂｐのＤＮＡ断片の配列の一部　（プライ
マーＢ１２５よりも上流側）をセンスプライマー８４０
として、そして、ゲノムＤＮへの下流側に位置するＭ１
３ｍｐＨのＤＮＡ配列の一部に相補的なりＮＡ配列をア
ンチセンスプライマーＭ４として用いた。

Ｍ４　・　５’　−ＧＴＴＴＴＣ［：ＣＡＧＴＣＡＣＧ
八口日４０　　：　　５’　−ＡＡＡＡＣＣＧＴＣＧＣ
ＡＡＣＡＧＣＣ上記ＰＣＲ反応を行なうことにより約２
．２ｋｂのＤＮＡＩ祈片が得られた。このＤＮＡ断片の
配列は、直接ＤＮＡ塩基配列決定法により決定された。

このようにして。

ゲノムＤＮＡの３′末端から中途部分までの配列が決定
された。

このようにして決定されたＢＬａｓｅの全ＤＮＡ配列お
よびそれにより決定されるアミノ酸配列を第１図に示す
。

（４）発現ベクターの構築 ■シャトルベクターｐ　ｉｆ　Ｙ　３００　Ｐ　Ｌ　Ｋ
　ｔ　ｔの構築、バシラス　ナチリス　ＡＴＣＣ６０５
１株からＭ、　５ｔａｈｌらの方法（前出）によりゲノ
ムＤＮＡを単離し、これを鋳型ＤＮＡとする。次に、プ
ライマーとして。

、バシラス　サチリスｌ−１６８株由来のアルカリプロ
テアーゼの遺伝子のターミネータ一部分の５“末端付近
の配列に相当し、　Ｘｂａ１部位が付加されたＤＮＡ配
列の断片（センスプライマーＡ）および３”末端付近の
配列に相当し１ｌ１ｎｄＩｆｆ部位が付加されたＤＮＡ
配列に相補的なりＮＡ配列の断片（アンチセンスプライ
マーＢ）を化学合成した。

センスプライママー（八） ５°−ＧへＧＴＣＴＡＧＡＧＣへＧＣＴＧＣＡＣＡへＴ
ＡへＴＡＧ−３’アンチセンスプライマー（Ｂ） ５”−ＧＡＧ八八へへＴＴＧ八ＣへＧへＧ八Ａへ八Ｇへ
Ｇ八八へへ３゛上記鋳型ＤＮ八と、これらプライマーと
を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片を、
ＸｂａＩおよびＨ１ｎｄｌＩＩで分解し、第４図に示す
断片■を得た（第４図参照）。次に、シャトルベクター
ｐｉＹ３００ＰＬＫ　　（宝酒造）をＸｂａ　Ｉおよび
旧ｎｄｌＨで分解し、大きい方の断片■を得た（第４図
参照）。これらの断片■および■を連結することにより
、バシラスザチリスＡＴＣＣ６０５１株由来のアルカリ
性ターミネータ−を有するシャトルベクター　ｐ）ＩＹ
３００ＰＬＫｔｔが得られた。

■発現ベクターｐｔ（Ｙ３００ＢＬｔｔの構築、バシラ
ス　リケニホルミス八ＴＣＣ１４５８０株の培養細胞か
らＭ、　３ｔａｈｌ　らの方法（前出）によりゲノムＤ
ＮＡを単離し、これを鋳型ＤＮＡとした。このＤＮＡ断
片の５゛末端付近に相当し、　ＢｃｏＲ１部位が付加さ
れた１本用ＤＮＡ断片および３′末端例近に相当しＸｂ
ａ１部位が伺加されたＤＮＡ配列に相補的な１本ｇｌＤ
ＮＡ断片を合成し、これらをセンスプライマー口および
アンチセンスプライマー口とした。

センスプライマ＝Ｃ ５′−口へへＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＴＣＣＣＧＴＧＣＧ
ＣＣＴＣＣ−３’アンチセンスプライマー〇 ５’　−ＴＴＧＴＣＴＡＧ八ＡＴＴＴＧＣへＧＡＴＣ八
ＧＣＧＧＴＣへ３’」１記鋳型ＤＮＡおよびセンスプラ
イマー口およびアンチセンスプライマーＤを用いてＰＣ
Ｒ反応を行った。

をコートするＤＮＡ断片■を得た（第３図）。次に。

上記ｐＨＹ３００ＰＬＫｔｔを［ＥｃｏＲｌとＸｂａ　
Ｉとで分解し、大きい方の断片■を得た。上記断片■お
よび■をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼを用いて連結させた。連
結混合物を用いて、　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ−１２（Ｃ６０
０株）を形質転換し。

これをアンピシリン含有平板寒天培地上で培養し。

アンピシリン耐性コロニーを得た。この菌体からプラス
ミドＤＮＡを単離し、上記ＤＮＡ断片■が正しい方向に
挿入されていることを、制限酵素切断パタ一ン（こより
確言忍した。

（５）形質転換体の調製およびＢＬａｓｅの製造上記〔
４〕項で得られた発現ベクターＰ　ｔ（Ｙ　３００　Ｂ
　Ｌ　ｔ　ｔを枯草菌ＩＳｌ’１１２１４株（宝酒造）
に、　Ｊ、５ｐｉｚｉｚｅｎらの方法［Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　４４．１０７２（１９５８
）　〕により導入した。得られた形質転換体を、テトラ
サイクリン含有平板寒天培地上で培養し、テトラサイク
リン耐性菌（、バシラス　サチリスｐ　ＨＹ　３００　
Ｂ　Ｌｔｔ／ＪＳＩＩ１１２１４＞を得た。

この形質転換体（、バシラス　サチリスｐ　ＨＹ　３０
０　Ｂ　Ｌｔｔ／ｌ５Ｗ１２１４＞をｌ、Ｂ培地　（ト
リプトン１０ｇ、　　イーストエクストラフ）５ｇおよ
びＮａＣｌ　５ｇに水を加えてＩＬとする；　ｐＨ７、
２）　５蔵に植菌し、３７℃で１８時間振盪培養した。

この培養液１ｄを１次に示ずＳｃ＋培地（１２０℃にて
２０分間オートクレーブで滅菌済）１０艷に加えて２８
℃で振盪培養を行った。

（以下余白） Ｓｃ＋培地組成 可溶性澱粉　　　　　　　　１０ｇ クリセリン　　　　　　　　５ｇ ハクトソイトーン　　　　　　５ｇ Ｃ３Ｌ　　　　　　　　　　　　　２．５ｇイーストエ
クストラクト　　　１ｇ 炭酸カルシウム　　　　　　　３ｇ 上記培養液を２５００Ｘ　ｇで５分間遠心分離し、」−
清を得た。この上清の８１、ａｓｅ活性を１発明の詳細
な説明の項に記載の活性測定法により測定した。

その結果を表４に示す。培地ＩＬあたりのタンパク量は
、　Ｂ　Ｌ　ａ　ｓ　６の比活性を２５００単位／　ｍ
ｇとして換算した。

（以下余白） 表４ （発明の効果） 本発明によれば、ポリペプチドのアミノ酸配列中のグル
タミン酸残基のＣ末端をも“異的に開裂する新規プロテ
アーゼ、該プロテアーゼの、バシラス属菌からの製造方
法、該プロテアーゼをコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ
配列を有する発現ベクター、該発現ベクターを導入して
得られる形質転換体、および該形質転換体を用いたプロ
テアーゼの製造方法が提供される。このようなプロテア
ーゼは、タンパクの分析、融合タンパクの所望の部位で
のペプチド鎖の切断など１種々の目的に利用され得る。

【図面の簡単な説明】

第１図は１本発明のプロテアーゼのＤＮＡ配列および該
配列から推定されるアミノ酸配列を示す配列図である。 第２図は、、バシラス　ザチリス　Ｉ−１，６８株由来
のアルカリ性プロテアーゼのＤＮＡ配列を示す配列図で
ある。 第３図は１本発明の発現ベクターであるｐＨＹ３００Ｂ
　Ｌ　ｔ　ｔの構築を示す概略図である。 第４図は、」１記ｐ　ｆｌ　Ｙ　３００　Ｂ　Ｌ　ｔ　
ｔの構築に用いるシャトルベクターｐＨＹ３００ＰＬＫ
ｔｔの構築を示す概略図である。 第５図は、、バシラス　リケニホルミスＡＴＣＣ１４５
８０株培養物の精製工程において、アフィニティーカラ
ムからのＢ　Ｌ　ａ　ｓ　ｅの溶出の過程を示すクラ７
である。 以上

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシラス　リケニホルミス（￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥
   ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来のプロテアーゼであ
   って、ペプチドのグルタミン酸残基のカルボキシル基を
   含むペプチド結合を切断する、プロテアーゼ。 ２、バシラス　リケニホルミス　ＡＴＣＣ　１４５８０
   株由来である、請求項１に記載のプロテアーゼ。 ３、次の性質を有する請求項１に記載のプロテアーゼ： （１）至適ｐＨ範囲：約８．０；および （２）安定ｐＨ範囲：２５℃において６．５〜８．５。 ４、第１図の＋１位のＳｅｒから＋２２２位のＧ１ｎま
   でのアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のプロテアー
   ゼ。 ５、第１図の＋１位のＳｅｒから＋２２２位のＧ１ｎま
   でのアミノ酸配列を有し、ペプチドのグルタミン酸残基
   のカルボキシル基を含むペプチド結合を切断する、プロ
   テアーゼ。６、請求項１または５に記載のプロテアーゼ
   をコードするＤＮＡ配列。 ７、第１図の６０５位のＴから１２７０位のＡまでの塩
   基配列を有する請求項６に記載のＤＮＡ配列。 ８、第１図の−９４位のｆＭｅｔから＋２２２位のＧ１
   ｎまでのアミノ酸配列を含むプロテアーゼをコードする
   、請求項６に記載のＤＮＡ配列。 ９、第１図の３２３位のＴから１２７０位のＡまでの塩
   基配列を有する請求項８に記載のＤＮＡ配列。 １０、請求項６に記載のＤＮＡ配列を有する発現ベクタ
   ー。 １１、バシラス属菌において発現可能な、請求項１０に
   記載の発現ベクター。 １２、請求項１０に記載の発現ベクターを宿主に導入し
   て得られる形質転換体。 １３、前記宿主が、バシラス属菌である、請求項１１に
   記載の形質転換体。 １４、請求項１または５に記載のプロテアーゼを産生し
   得るバシラス　リケニホルミスを培地中で培養する工程
   、および生産されたプロテアーゼを該培地から採取する
   工程を包含する、プロテアーゼの製造方法。 １５、請求項１２に記載の形質転換体を培養する工程、
   および生産されたプロテアーゼを該培地から採取する工
   程を包含する、プロテアーゼの製造方法。