JPH04179485A - 新規ベクターおよび該ベクターを用いて高発現形質転換細胞を選択する方法 - Google Patents
新規ベクターおよび該ベクターを用いて高発現形質転換細胞を選択する方法Info
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- JPH04179485A JPH04179485A JP2305655A JP30565590A JPH04179485A JP H04179485 A JPH04179485 A JP H04179485A JP 2305655 A JP2305655 A JP 2305655A JP 30565590 A JP30565590 A JP 30565590A JP H04179485 A JPH04179485 A JP H04179485A
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Landscapes
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、新規な発現ベクターおよび該ベクターを用い
て、任意の外来遺伝子を高発現する形質転換細胞を効率
良く選択する方法に関する。
て、任意の外来遺伝子を高発現する形質転換細胞を効率
良く選択する方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）遺伝
子組み換え技術の進歩に伴って、遺伝子組み換えを利用
した有用物質の生産は近年急速に進歩して来ている。遺
伝子組み換え技術を利用して外来遺伝子を発現させる場
合には、適当な宿主細胞と、これに応じた外来遺伝子発
現用プロモーターを有する発現ベクターが用いられる。
子組み換え技術の進歩に伴って、遺伝子組み換えを利用
した有用物質の生産は近年急速に進歩して来ている。遺
伝子組み換え技術を利用して外来遺伝子を発現させる場
合には、適当な宿主細胞と、これに応じた外来遺伝子発
現用プロモーターを有する発現ベクターが用いられる。
とれまでは、大腸菌や酵母など、取り扱いが容易な微生
物が発現宿主細胞として広く研究されてきたが、このよ
うな微生物では外来遺伝子の発現において一部に限界が
あることが確認されており、近年では高等動物培養細胞
などを発現宿主細胞とした発現系が盛んに研究されてい
る。これまで、動物細胞を宿主として、外来遺伝子を高
発現させる方法として強いプロモーターを持つ発現ベク
ターを用いること、および細胞に導入され維持される発
現ベクターＤＮＡのコピー数を出来るだけ増加させるこ
とが考慮されて来た。後者の例として、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズ
・・ムスター卵巣細胞に９選択マーカーとしてｄｈｆｒ
遺伝子を持つ発現ベクターを導入し。
物が発現宿主細胞として広く研究されてきたが、このよ
うな微生物では外来遺伝子の発現において一部に限界が
あることが確認されており、近年では高等動物培養細胞
などを発現宿主細胞とした発現系が盛んに研究されてい
る。これまで、動物細胞を宿主として、外来遺伝子を高
発現させる方法として強いプロモーターを持つ発現ベク
ターを用いること、および細胞に導入され維持される発
現ベクターＤＮＡのコピー数を出来るだけ増加させるこ
とが考慮されて来た。後者の例として、ジヒドロ葉酸レ
ダクターゼ遺伝子（ｄｈｆｒ）を欠損したチャイニーズ
・・ムスター卵巣細胞に９選択マーカーとしてｄｈｆｒ
遺伝子を持つ発現ベクターを導入し。
次第に高い濃度のメントレキセートで選択することによ
り２発現ベクターＤＮＡのコピー数の増加した。外来遺
伝子を高発現する形質転換細胞を得る方法がある。しか
しながら、この方法はｄｈｆ ｒ欠損細胞でしか効果的
に使えない点と２選択とクローニングに長期間を要する
点が問題である。別の方法として、ウシパピローマウィ
ルス由来の自己複製配列を導入した発現ベクターを用い
る方法がある。この方法では、細胞に導入されたベクタ
ーはエピゾーム、！：して維持されるが、実際は染色体
に組み込まれることも多く、高発現の形質転換細胞株を
頻回にクローニングする必要がある。
り２発現ベクターＤＮＡのコピー数の増加した。外来遺
伝子を高発現する形質転換細胞を得る方法がある。しか
しながら、この方法はｄｈｆ ｒ欠損細胞でしか効果的
に使えない点と２選択とクローニングに長期間を要する
点が問題である。別の方法として、ウシパピローマウィ
ルス由来の自己複製配列を導入した発現ベクターを用い
る方法がある。この方法では、細胞に導入されたベクタ
ーはエピゾーム、！：して維持されるが、実際は染色体
に組み込まれることも多く、高発現の形質転換細胞株を
頻回にクローニングする必要がある。
このように遺伝子組み換え技術を応用した有用物質の製
造を実用化するためには、様々の細胞株において、外来
遺伝子を高発現する形質転換細胞のみを効率良く選択す
る技術の開発が強く望まれている。
造を実用化するためには、様々の細胞株において、外来
遺伝子を高発現する形質転換細胞のみを効率良く選択す
る技術の開発が強く望まれている。
（発明を解決するための手段）
このような状況において１本発明者らは、従来より選択
マーカーとして一般に用（・られるＧ４１８耐性遺伝子
（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ■遺伝子
）を用いて、高濃度の０４１８で選択することにより、
高いコピー数で発現ベクターが組み込まれた形質転換細
胞を効果的に選択する方法を考案し、それが実際に応用
可能であることを確認し１本発明を完成させるに至った
。この方法は、非常に弱い活性を示すように改造した０
４１８耐性遺伝子を発現ベクターに組み込み、これで形
質転換細胞を作る。
マーカーとして一般に用（・られるＧ４１８耐性遺伝子
（ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ■遺伝子
）を用いて、高濃度の０４１８で選択することにより、
高いコピー数で発現ベクターが組み込まれた形質転換細
胞を効果的に選択する方法を考案し、それが実際に応用
可能であることを確認し１本発明を完成させるに至った
。この方法は、非常に弱い活性を示すように改造した０
４１８耐性遺伝子を発現ベクターに組み込み、これで形
質転換細胞を作る。
さらに高濃度６４１８で選択することにより、多コピー
の発現ベクターを組み込んだ細胞のみを効果的に残すと
いうものである。選択マーカーとして＋ ｐＳＶ２−
ｎｅｏが知られている（ ＪｏＭｏｌ、Ａｐｐｌ。
の発現ベクターを組み込んだ細胞のみを効果的に残すと
いうものである。選択マーカーとして＋ ｐＳＶ２−
ｎｅｏが知られている（ ＪｏＭｏｌ、Ａｐｐｌ。
Ｇｅｎｅｔ、、 １．３２７ ３４１．１９８２）が、
これが非常に強いＧ４１８耐性を形質転換細胞に与える
ので木目的ニ適サナい。ネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼ■遺伝子で、変異のために活性が非常に低
い酵素を作るものが報告されている（ Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、ＵＳＡ、、 ８７ ； ３
４３５−３４３９＋１９９０）。この変異を持つ遺伝子
を組み込んだプラスミドとしてｐ ＭＣｌ ｎｅｏが報
告されている（ Ｃｅ１ｌ 。
これが非常に強いＧ４１８耐性を形質転換細胞に与える
ので木目的ニ適サナい。ネオマイシンフォスフォトラン
スフェラーゼ■遺伝子で、変異のために活性が非常に低
い酵素を作るものが報告されている（ Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、 Ｓｅｔ、ＵＳＡ、、 ８７ ； ３
４３５−３４３９＋１９９０）。この変異を持つ遺伝子
を組み込んだプラスミドとしてｐ ＭＣｌ ｎｅｏが報
告されている（ Ｃｅ１ｌ 。
５１、５０３−５１２．１９８７ ）。このプラスミド
においてネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ■
遺伝子はポリオーマ由来のエンハンサ−に結合した単純
ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼプロモーターの下
流に組み込まれ、またその３′側にはＳＶ ４０ウイル
ス由来のポＩＪ Ａシグナルが結合されている。本発明
ではプロモーター活性が弱いことが必要なのでポリオー
マ由来のフタ−に組み込むためのＮｅｏカセットとして
用いている（第１図）。なお、 Ｎｅｏカセットに用
いるプロモーターは活性の弱いものであれば他のもので
よい。例として、 ＳＶ４０ウィルス初期遺伝子プロ
モーターからエンハンサ−を除いたものなどが挙げられ
る。また、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ
■遺伝子につ（・ても活性が野生型の遺伝子より弱くな
るような変異を持つものであれば他のものでもよい。
においてネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ■
遺伝子はポリオーマ由来のエンハンサ−に結合した単純
ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼプロモーターの下
流に組み込まれ、またその３′側にはＳＶ ４０ウイル
ス由来のポＩＪ Ａシグナルが結合されている。本発明
ではプロモーター活性が弱いことが必要なのでポリオー
マ由来のフタ−に組み込むためのＮｅｏカセットとして
用いている（第１図）。なお、 Ｎｅｏカセットに用
いるプロモーターは活性の弱いものであれば他のもので
よい。例として、 ＳＶ４０ウィルス初期遺伝子プロ
モーターからエンハンサ−を除いたものなどが挙げられ
る。また、ネオマイシンフォスフォトランスフェラーゼ
■遺伝子につ（・ても活性が野生型の遺伝子より弱くな
るような変異を持つものであれば他のものでもよい。
本発明の外来遺伝子発現用ベクターの基本的な構造とし
ては、既に報告されている強力な発現ベクター、例えば
ｐＡＧＳ−３（Ｇｅｎｅ、 ７９．２６９−２７７、１
９８９）に上述のＮｅｏカセットを組み込んだものであ
る。実施例１に示すｐＡＧｎｅｏ ３− ＩＬ ２プラ
スミドはこれにさらにＩ Ｌ −２ｃＤＮＡを組み込ん
だものである（第２図）。
ては、既に報告されている強力な発現ベクター、例えば
ｐＡＧＳ−３（Ｇｅｎｅ、 ７９．２６９−２７７、１
９８９）に上述のＮｅｏカセットを組み込んだものであ
る。実施例１に示すｐＡＧｎｅｏ ３− ＩＬ ２プラ
スミドはこれにさらにＩ Ｌ −２ｃＤＮＡを組み込ん
だものである（第２図）。
また、このような本発明の発現ベクターは。
大腸菌でのクローニングを行い易くするために大腸菌プ
ラスミド由来の遺伝子を有する。そのような大腸菌プラ
スミド由来の遺伝子としては。
ラスミド由来の遺伝子を有する。そのような大腸菌プラ
スミド由来の遺伝子としては。
大腸菌体内で複製するためのｏｒｉ 、並びにクローニ
ングの際に選択マーカーとなりうる適当な遺伝子９例え
ばアンピシリンや、テトラサイクリン等に対する薬剤耐
性遺伝子が挙げられる。また、このような遺伝子として
プラスミドｐＢＲ３２２由来の遺伝子がよく用いられる
が、この場合には、 ｐＢＲ３２２複製開始点（ｏｒ
ｉ ）の近くにある。宿主細胞での複製を阻害する毒性
配例（Ｎａｔｕｒｅ ＋２９３、７９−８１．１９８１
）を除去することが望ましく・。後述の実施例に用℃・
た発現ベクターは、この配列を除去している。
ングの際に選択マーカーとなりうる適当な遺伝子９例え
ばアンピシリンや、テトラサイクリン等に対する薬剤耐
性遺伝子が挙げられる。また、このような遺伝子として
プラスミドｐＢＲ３２２由来の遺伝子がよく用いられる
が、この場合には、 ｐＢＲ３２２複製開始点（ｏｒ
ｉ ）の近くにある。宿主細胞での複製を阻害する毒性
配例（Ｎａｔｕｒｅ ＋２９３、７９−８１．１９８１
）を除去することが望ましく・。後述の実施例に用℃・
た発現ベクターは、この配列を除去している。
さらに、上記の発現ベクターにウシパピローマウィルス
由来の自己複製配列を組み込むことにより、高濃度０４
１８選択後に高発現形質転換細胞をさらに効率良く得る
ことを可能にする。
由来の自己複製配列を組み込むことにより、高濃度０４
１８選択後に高発現形質転換細胞をさらに効率良く得る
ことを可能にする。
上記のようなりＮＡ配列から構成される本発明の好まし
い発現ベクターの一例として、 ｐＡＢｎｅｏ３が挙
げられる。これは実施例に示すｐＡＢｎｅ。
い発現ベクターの一例として、 ｐＡＢｎｅｏ３が挙
げられる。これは実施例に示すｐＡＢｎｅ。
３− ＩＬ ２プラスミド（第３図）から、ＩＬ−２ｃ
ＤＮＡを除いたものに相当する。
ＤＮＡを除いたものに相当する。
このような発現ベクターを用いて、それの持つ外来遺伝
子発現用プロモーターの下流に外来遺伝子を導入したも
のを構築する。このような発現させたい外来遺伝子を組
み込んだ発現ベクターを導入する宿主細胞は、外来遺伝
子発現用プロモーターがよく働くものであれば何でもよ
い。例として、マウスＬ細胞、チャイニーズノ゛ムスタ
ー卵巣細胞、ヒトＨｅ１ａ細胞などが挙げられる。
子発現用プロモーターの下流に外来遺伝子を導入したも
のを構築する。このような発現させたい外来遺伝子を組
み込んだ発現ベクターを導入する宿主細胞は、外来遺伝
子発現用プロモーターがよく働くものであれば何でもよ
い。例として、マウスＬ細胞、チャイニーズノ゛ムスタ
ー卵巣細胞、ヒトＨｅ１ａ細胞などが挙げられる。
発現ベクター宿主細胞への導入は既知の方法。
例えばリン酸カルシウム法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、、 ７６、１３７３ １３７６、１９７９）、
ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｖｏｌ、ｎ、 ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ、 ０ｘｆｏｒ
ｄ、 １４３−１９０．１９８５）、 エレクトロポ
レーション法（Ｐｒｏｃ。
ＤＥＡＥ−Ｄｅｘｔｒａｎ法（ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎ
ｇ ｖｏｌ、ｎ、 ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ、 ０ｘｆｏｒ
ｄ、 １４３−１９０．１９８５）、 エレクトロポ
レーション法（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、 ８１．７
１６１−７１６５．１９８４ ）。
１６１−７１６５．１９８４ ）。
リポフェクション法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ
、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、。
、Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、。
８４、７４１３−７４１７．１９８７）等により行うこ
とが出来る。その後、 Ｃ４１８を２００１１ｇ／ｍ
７（力価）含む培地中で培養を続け、 Ｇ４１８耐性
形質転換細胞を得る。これらの細胞を高濃度の０４１８
（８００μｇ ／ ｍＺ ）を含む培地中で、さらに約
１カ月間培養を続ける。この過程で発現ベクターを多コ
ピー安定に導入された形質転換細胞のみが残る。これは
９発現ベクターに組み込まれたＮｅ。
とが出来る。その後、 Ｃ４１８を２００１１ｇ／ｍ
７（力価）含む培地中で培養を続け、 Ｇ４１８耐性
形質転換細胞を得る。これらの細胞を高濃度の０４１８
（８００μｇ ／ ｍＺ ）を含む培地中で、さらに約
１カ月間培養を続ける。この過程で発現ベクターを多コ
ピー安定に導入された形質転換細胞のみが残る。これは
９発現ベクターに組み込まれたＮｅ。
カセットの活性が著しく弱いため、多コピーのベクター
ＤＮＡを持つ形質転換細胞のみが、高濃度０４１８下で
増殖しうるためと考えられた。実際、 Ｇ４１８を２
００μｇ／ｒｎｌとして培養を続けた場合に比べ、８０
０μｇ／ｍｌで培養を続けた場合、形質転換細胞歯たり
の発現ベクターのコピー数が５倍以上増加し、２００〜
３００コピーに達することが、サザーンプロノト法によ
り確認されている。また、この解析により、導入された
発現ベクターは、同方向に多数が連なって染色体に組み
込まれていることが確認された。導入された発現ベクタ
ーの大幅なりＮＡ構造の変化は起こっていない。パピロ
ーマウィルス由来の自己複製配列を持つベクターでは細
胞に導入された発現ベクターはエピゾームとして細胞の
核内で維持されると考えられるが、１力月以上の０４１
８選択の後では多コピーが連なった形で最終的には染色
体に組み込まれていることが、サザーン法による解析で
示された。
ＤＮＡを持つ形質転換細胞のみが、高濃度０４１８下で
増殖しうるためと考えられた。実際、 Ｇ４１８を２
００μｇ／ｒｎｌとして培養を続けた場合に比べ、８０
０μｇ／ｍｌで培養を続けた場合、形質転換細胞歯たり
の発現ベクターのコピー数が５倍以上増加し、２００〜
３００コピーに達することが、サザーンプロノト法によ
り確認されている。また、この解析により、導入された
発現ベクターは、同方向に多数が連なって染色体に組み
込まれていることが確認された。導入された発現ベクタ
ーの大幅なりＮＡ構造の変化は起こっていない。パピロ
ーマウィルス由来の自己複製配列を持つベクターでは細
胞に導入された発現ベクターはエピゾームとして細胞の
核内で維持されると考えられるが、１力月以上の０４１
８選択の後では多コピーが連なった形で最終的には染色
体に組み込まれていることが、サザーン法による解析で
示された。
なお、ポリオーマエンノ・ンサーを含み、活性の強いＮ
ｅｏ力セントを持つ発現ベクターを用も・て上述と同様
の操作を行った場合には高濃度０４１８下での培養によ
る。多コピーの発現ベクターを組み込んだ形質転換細胞
の選択は認められない。
ｅｏ力セントを持つ発現ベクターを用も・て上述と同様
の操作を行った場合には高濃度０４１８下での培養によ
る。多コピーの発現ベクターを組み込んだ形質転換細胞
の選択は認められない。
（発明の効果）
本発明のＮｅｏカセットを持つ新規な動物細胞用の外来
遺伝子発現ベクター及びそれを用（・た高発現形質転換
細胞の効率的選択法により、工業的レベルの生産におい
ても十分利用可能な形質転換細胞が長期間にわたる細胞
のクローニングなしに任意の細胞株を用いて容易に得る
ことが可能となった。また２本発明を用いて得られた形
質転換細胞は長期にわたり安定に外来遺伝子の高発現を
維持する。このような発現系は本発明により初めて確立
されたので９本発明が産業界にもたらす技術的利益は非
常に大きなものであると評価される。
遺伝子発現ベクター及びそれを用（・た高発現形質転換
細胞の効率的選択法により、工業的レベルの生産におい
ても十分利用可能な形質転換細胞が長期間にわたる細胞
のクローニングなしに任意の細胞株を用いて容易に得る
ことが可能となった。また２本発明を用いて得られた形
質転換細胞は長期にわたり安定に外来遺伝子の高発現を
維持する。このような発現系は本発明により初めて確立
されたので９本発明が産業界にもたらす技術的利益は非
常に大きなものであると評価される。
（実施例）
本発明により効率的に、多コピーの発現ベクターを組み
込んだ形質転換細胞が得られるが、実際に得られた形質
転換細胞で外来遺伝子が高（・発現を示すことが、外来
遺伝子として、ヒ）ＩＬ−２ｃＤＮＡをいて確認されて
いる。これらを実施例として本発明の詳細な説明する。
込んだ形質転換細胞が得られるが、実際に得られた形質
転換細胞で外来遺伝子が高（・発現を示すことが、外来
遺伝子として、ヒ）ＩＬ−２ｃＤＮＡをいて確認されて
いる。これらを実施例として本発明の詳細な説明する。
実施例中のプラスミド、ＤＮＡ、種々の酵素、大腸菌、
培養細胞などを扱う諸操作は以下にあげる雑誌、放置を
参考とした。
培養細胞などを扱う諸操作は以下にあげる雑誌、放置を
参考とした。
（１）遺伝子操作実験法、高木東歌１編者（１９８０）
。
。
講談社
（２）遺伝子操作マニーアル、高木東歌１編者（１９８
２）、講談社 ＋３） ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ Ａ Ｌ
ＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ、 ＴｌＭＡＮＩＡＴ
ＩＳら編、 （１９８２）、 Ｃ０ＬＤＳＰＲＩＮＧ
ＨＡＲＢＯＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ。
２）、講談社 ＋３） ＭＯＬＥＣＵＬＡＲＣＬＯＮＩＮＧ Ａ Ｌ
ＡＢＯＲＡＴＯＲＹＭＡＮＵＡＬ、 ＴｌＭＡＮＩＡＴ
ＩＳら編、 （１９８２）、 Ｃ０ＬＤＳＰＲＩＮＧ
ＨＡＲＢＯＲＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ。
（４） ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧ
Ｙ、 ６５巻、Ｌ。
Ｙ、 ６５巻、Ｌ。
ＧＲＯ８ＳＭＡＮら編、 （１９８０）、 ＡＣＡＤＥ
ＭＩＣＰＲＥＳＳなお、実施中には次の略号を用いた。
ＭＩＣＰＲＥＳＳなお、実施中には次の略号を用いた。
ｎｅｏ ： ネオマイシンフォスフォトランスフェラー
ゼ■遺伝子 ｔｋ：単Ｍヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子Ｂ
ＰＶ ：ウシパピローマウィルス ｋｂ ： １０００塩基対 ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞実施例１：発
現ベクターｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２の構築プラスミドｐ
Ｍｃ１ｎｅｏ （Ｃｅｌｌ、 ５１．５０３５１２゜１
９８７）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ＃１０１）、
ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ＃１３６）で消化しＤＮＡポリメラ
ーゼＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＮＥＢ＃２１０）で末
端を修復したのち。
ゼ■遺伝子 ｔｋ：単Ｍヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子Ｂ
ＰＶ ：ウシパピローマウィルス ｋｂ ： １０００塩基対 ＣＨＯ：チャイニーズハムスター卵巣細胞実施例１：発
現ベクターｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２の構築プラスミドｐ
Ｍｃ１ｎｅｏ （Ｃｅｌｌ、 ５１．５０３５１２゜１
９８７）を制限酵素ＥｃｏＲＩ（ＮＥＢ＃１０１）、
ＢａｍＨＩ（ＮＥＢ＃１３６）で消化しＤＮＡポリメラ
ーゼＫｌｅｎｏｗフラグメント（ＮＥＢ＃２１０）で末
端を修復したのち。
ｔｋプロモーター、ｎｅｏ、ＳＶ４０ポリＡシグナルよ
り成る約１ｋｂのＮｅｏカセッ）ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動により分離した。この断片をＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮ（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ、）によりゲルから回収
、精製した。このＮｅｏカセットの構造を第１図に示す
。
り成る約１ｋｂのＮｅｏカセッ）ＤＮＡ断片をアガロー
スゲル電気泳動により分離した。この断片をＧＥＮＥＣ
ＬＥＡＮ（ＢＩＯ１０１Ｉｎｃ、）によりゲルから回収
、精製した。このＮｅｏカセットの構造を第１図に示す
。
ニワトリβ−アクチンプロモーターを用いた強力な発現
ベクターであるｐＡＧＳ−３（Ｇｅｎｅ、 ７９．２６
９−２７７、１９８９）を制限酵素Ｎｄｅｌ （ＮＥＢ
＃１１１ ）で消化し、仔牛小腸由来のアルカリフォス
ファターゼの作用により脱リン酸化し、さらにＤＮＡポ
リメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントにより末端を修復
した。
ベクターであるｐＡＧＳ−３（Ｇｅｎｅ、 ７９．２６
９−２７７、１９８９）を制限酵素Ｎｄｅｌ （ＮＥＢ
＃１１１ ）で消化し、仔牛小腸由来のアルカリフォス
ファターゼの作用により脱リン酸化し、さらにＤＮＡポ
リメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントにより末端を修復
した。
これを前述のＮｅｏカ七ノ）ＤＮＡ断片と７４ＤＮＡリ
ガーゼを用いて、連結環状化することにより。
ガーゼを用いて、連結環状化することにより。
発現ベクターｐＡＧｎｅｏ ３を作製した。大阪大学細
胞工学センター・谷口維紹教授より供与されたｐＺｉｐ
ＳＶＩＬ２プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ （ＮＥＢ
＃１３６）で消化し、アガロースゲル電気泳動し、ゲル
から約０．５ｋｂのヒトＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ
断片を得た。このＤＮＡ断片はヒ）ＩＬ−２ｃＤＮＡ（
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．３０５−３１０．１９８３）
の第４１塩基対から第５４２塩基対を含む。このＤＮＡ
断片をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントで
処理し、 これにＢｉｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎＮ４０８−１８）をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合
させた。
胞工学センター・谷口維紹教授より供与されたｐＺｉｐ
ＳＶＩＬ２プラスミドを制限酵素ＢａｍＨＩ （ＮＥＢ
＃１３６）で消化し、アガロースゲル電気泳動し、ゲル
から約０．５ｋｂのヒトＩＬ−２ｃＤＮＡを含むＤＮＡ
断片を得た。このＤＮＡ断片はヒ）ＩＬ−２ｃＤＮＡ（
Ｎａｔｕｒｅ、 ３０２．３０５−３１０．１９８３）
の第４１塩基対から第５４２塩基対を含む。このＤＮＡ
断片をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントで
処理し、 これにＢｉｔＸＩアダプター（Ｉｎｖｉｔｒ
ｏｇｅｎＮ４０８−１８）をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合
させた。
前述のｐＡＧｎｅｏ ３プラスミドをＢｓｔＸＩ （Ｎ
ＥＢ＃１１３）で消化し、仔牛小腸由来アルカリフォス
ファターゼで脱リン酸化した後、前述のヒ）ＩＬ−２ｃ
ＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡＩＪガーゼにより連結環状化し
た。
ＥＢ＃１１３）で消化し、仔牛小腸由来アルカリフォス
ファターゼで脱リン酸化した後、前述のヒ）ＩＬ−２ｃ
ＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡＩＪガーゼにより連結環状化し
た。
このようにして、ヒトＩＬ−２発現プラスミドｐＡＧｎ
ｅｏ３−ＩＬ２を作製した。この構造を第２図に示す。
ｅｏ３−ＩＬ２を作製した。この構造を第２図に示す。
実施例２ ： ｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２の作製ｐｄＢＰ
Ｖ−１プラスミド（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
Ｖ−１プラスミド（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。
ＵＳＡ、、 ７９．７１４７−７１５１．１９８２）を
制限酵素Ｈｉｎｄｍ（ＮＥＢ＃］０４）で消化し、これ
をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｍＨＩリンカ−（
ＮＥＢ＃１０２１）を結合した。
制限酵素Ｈｉｎｄｍ（ＮＥＢ＃］０４）で消化し、これ
をＤＮＡポリメラーゼＫｌｅｎｏｗフラグメントで処理
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いてＢａｍＨＩリンカ−（
ＮＥＢ＃１０２１）を結合した。
これをＢａｍ旧で消化し、アガロースゲル電気泳動法に
より、長さ５．４ｋｂのＢＰＶのいわゆる６９％断片を
回収した。
より、長さ５．４ｋｂのＢＰＶのいわゆる６９％断片を
回収した。
実施例１で構築したｐＡＧｎｅｏ ３−Ｉ Ｌ ２をＢ
ａｍＨＩ で消化し、仔牛小腸由来アルカリフォスファ
ターゼで処理し、これと前述のＢＰＶ ６９％断片とＴ
４ＤＮＡ・ノガーゼで連結環状化した。このようにして
。
ａｍＨＩ で消化し、仔牛小腸由来アルカリフォスファ
ターゼで処理し、これと前述のＢＰＶ ６９％断片とＴ
４ＤＮＡ・ノガーゼで連結環状化した。このようにして
。
ｐＡＢｎｅｏ ３−Ｉ Ｌ２を構築した。この構造を第
３図に示す。
３図に示す。
実施例３：マウスＬ細胞におけるヒ）ＩＬ−２の産生
ファルコン６ｃｍデイツシュにＩ Ｘ １０’のマウス
Ｌ細胞を撤き、翌日リボフエクチン試薬（ＢＲＬ）を用
い添付のプロトコールに従い、５μｇのＩＬ−２発現プ
ラスミドｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２． ｐＡＢｎｅｏ３
−ＩＬ２をトランスフェクトした。２日後より、力価２
００μｇ／ａｎｌのＧ４１８を含む培地で１８日間培養
を続けた。
Ｌ細胞を撤き、翌日リボフエクチン試薬（ＢＲＬ）を用
い添付のプロトコールに従い、５μｇのＩＬ−２発現プ
ラスミドｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２． ｐＡＢｎｅｏ３
−ＩＬ２をトランスフェクトした。２日後より、力価２
００μｇ／ａｎｌのＧ４１８を含む培地で１８日間培養
を続けた。
その結果、 ｐＡＧｎｅｏ ３−Ｉ Ｌ２． ｐＡＢ
ｎｅｏ ３−Ｉ Ｌ２をトランスフェクトしたデインタ
ーでともに約２００個のコロニーが認められた。これら
のコロニーをトリプシンＥＤＴＡ液でデ１ソシュより剥
がし＋２５ｃｍ”フラスコ４本に分割し、各々のフラス
コを２００゜４００、６００．８００４ｇ／ｍＺ （力
価）の０４１８を含む培地中で１力月間継代培養を続げ
た。各濃度で維持されたＬ細胞をファルコン細胞培養用
６穴プレートにｌＸＩＯ３細胞／穴ずつ撤き、 Ｇ４１
８を含まない培地中で培養した。４８時間後、培養上清
を分取し。
ｎｅｏ ３−Ｉ Ｌ２をトランスフェクトしたデインタ
ーでともに約２００個のコロニーが認められた。これら
のコロニーをトリプシンＥＤＴＡ液でデ１ソシュより剥
がし＋２５ｃｍ”フラスコ４本に分割し、各々のフラス
コを２００゜４００、６００．８００４ｇ／ｍＺ （力
価）の０４１８を含む培地中で１力月間継代培養を続げ
た。各濃度で維持されたＬ細胞をファルコン細胞培養用
６穴プレートにｌＸＩＯ３細胞／穴ずつ撤き、 Ｇ４１
８を含まない培地中で培養した。４８時間後、培養上清
を分取し。
ヒトＩＬ−２測定キットＱｕａｎｔｉｋｉｎ＠（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ。
Ｓｙｓｔｅｍｓ。
＃Ｄ２０００）を用いてＩＬ−２活性を測定した。その
結果、第４図に示すようにｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２で形
質転換したし細胞は６００．８００μｇ／ｍｔで選択す
ることにより、４００μｇ／ｍｌで選択した場合に比し
、各々６倍。
結果、第４図に示すようにｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２で形
質転換したし細胞は６００．８００μｇ／ｍｔで選択す
ることにより、４００μｇ／ｍｌで選択した場合に比し
、各々６倍。
８倍の高いＩＬ−２の発現を示した。このような高濃度
０４１８選択による効果は、ＢＰＶ由来の配列を含まな
い場合にも明らかに認められるが、効果は少なかった。
０４１８選択による効果は、ＢＰＶ由来の配列を含まな
い場合にも明らかに認められるが、効果は少なかった。
なお、エンノ・ンサーを含む活性の強（・Ｎｅｏカセッ
トを用いて、同様の選択を行った場合には、高濃度Ｇ４
１８選択の効果はほとんど認められなかった。
トを用いて、同様の選択を行った場合には、高濃度Ｇ４
１８選択の効果はほとんど認められなかった。
実施例４：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞
におけるヒトｌ−２の産生 ファルコン６ｃｍデインシュに２Ｘ１０５のＣＨＯ細胞
を撤き、その後実施例３と同じようにトランスフェクシ
ョンとＧ４１８による選択を行い、さらに。
におけるヒトｌ−２の産生 ファルコン６ｃｍデインシュに２Ｘ１０５のＣＨＯ細胞
を撤き、その後実施例３と同じようにトランスフェクシ
ョンとＧ４１８による選択を行い、さらに。
実施例３と同様に産生されるヒ）ＩＬ−２の活性を測定
した。ｐＡＢｎｅｏ ＩＬ２で形質転換したＣＨＯ細
胞はやはりＬ細胞の場合と同様、８００μｇ／ｍ！のＧ
４１８選択により、２００μｇ／ｒｎｌの選択による場
合に比し。
した。ｐＡＢｎｅｏ ＩＬ２で形質転換したＣＨＯ細
胞はやはりＬ細胞の場合と同様、８００μｇ／ｍ！のＧ
４１８選択により、２００μｇ／ｒｎｌの選択による場
合に比し。
約６倍のＩＬ−２の産生が得られた。この高い産生は、
さらに３力月間８００μｇ／ｒｎｌのＧ４１８の存在下
で培養した後も全く変わらなかった。ｐＡＧｎｅｏ３−
ＩＬ２で形質転換したＣＨＯ細胞の場合も、やはり８０
０μｇ／ｆｆ１ｔで選択した形質転換細胞の方が２００
μｇ／ｍｌで選択したものより高℃・ＩＬ−２の発現を
示したが、その効果はｐＡＢｎｅｏ ３− Ｉ Ｌ ２
の場合より少なかった。
さらに３力月間８００μｇ／ｒｎｌのＧ４１８の存在下
で培養した後も全く変わらなかった。ｐＡＧｎｅｏ３−
ＩＬ２で形質転換したＣＨＯ細胞の場合も、やはり８０
０μｇ／ｆｆ１ｔで選択した形質転換細胞の方が２００
μｇ／ｍｌで選択したものより高℃・ＩＬ−２の発現を
示したが、その効果はｐＡＢｎｅｏ ３− Ｉ Ｌ ２
の場合より少なかった。
第１図は、実施例１で構築したＮｅｏカセットの構造を
示す。変異のため１８５番目のアミノ酸残基が野生型の
ＧｌｕからＡｓｐに変わっている。 第２図は、実施例１で構築した発現ベクターｐＡＧｎｅ
ｏ３−ＩＬ２の構造を示す。 第３図は、実施例２で構築した発現ベクターｐＡＢｎｅ
ｏ ３−Ｉ Ｌ２の構造を示す。 第４図は、 ｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２およびｐＡＢｎ
ｅｏ ３−ＩＬ２をマウスＬ細胞にトランスフェクトし
、２００μｇ／ｍ、１のＧ４１８で１８日間、形質転換
細胞を選択後、さらに２００．４００．６００； ８０
０／ｊｇ／ｍ１１７）Ｇ４１８存在下で１力面選択を禮
けて得られた形質転換細胞１０’個当たり、３４８・時
間に培養液中に分泌されるヒトＩＬ−２活性を”：ｍ１
ｒｖｉした結果を示す。−４−、ｐＡＢｎｅｏ３−ＬＬ
２； −■−，ｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２第５図は、
ｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２およびｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２
をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトラン
スフェクトし、 ２００μｇ／ｍｔの０４１８で２０
日間。 形質転換細胞を選択後、さらに２００．４００．８００
μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で１力月間選択を続けて得
られた形質転換細胞１０６個当たり、４８時間に培養液
中に分ｌされるヒ）ＩＬ−２活性を測定した結果を示す
。−・−、ｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２ ニー■−，ｐＡＧ
ｎｅｏ３−Ｌ２
示す。変異のため１８５番目のアミノ酸残基が野生型の
ＧｌｕからＡｓｐに変わっている。 第２図は、実施例１で構築した発現ベクターｐＡＧｎｅ
ｏ３−ＩＬ２の構造を示す。 第３図は、実施例２で構築した発現ベクターｐＡＢｎｅ
ｏ ３−Ｉ Ｌ２の構造を示す。 第４図は、 ｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２およびｐＡＢｎ
ｅｏ ３−ＩＬ２をマウスＬ細胞にトランスフェクトし
、２００μｇ／ｍ、１のＧ４１８で１８日間、形質転換
細胞を選択後、さらに２００．４００．６００； ８０
０／ｊｇ／ｍ１１７）Ｇ４１８存在下で１力面選択を禮
けて得られた形質転換細胞１０’個当たり、３４８・時
間に培養液中に分泌されるヒトＩＬ−２活性を”：ｍ１
ｒｖｉした結果を示す。−４−、ｐＡＢｎｅｏ３−ＬＬ
２； −■−，ｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２第５図は、
ｐＡＧｎｅｏ３−ＩＬ２およびｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２
をチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞にトラン
スフェクトし、 ２００μｇ／ｍｔの０４１８で２０
日間。 形質転換細胞を選択後、さらに２００．４００．８００
μｇ／ｍｌのＧ４１８存在下で１力月間選択を続けて得
られた形質転換細胞１０６個当たり、４８時間に培養液
中に分ｌされるヒ）ＩＬ−２活性を測定した結果を示す
。−・−、ｐＡＢｎｅｏ３−ＩＬ２ ニー■−，ｐＡＧ
ｎｅｏ３−Ｌ２
Claims (5)
- （１）活性の弱いプロモーターの下流に、変異を持つネ
オマイシンフォスフォトランスフェラーゼ遺伝子を結合
したものを選択マーカーとして持つ外来遺伝子発現用ベ
クター。 - （２）活性の弱いプロモーターが単純ヘルペスウィルス
由来のチミジンキナーゼプロモーターである請求項（１
）記載の外来遺伝子発現用ベクター。 - （３）動物細胞で働く自己複製配列を有する請求項（１
）記載の外来遺伝子発現用ベクター。 - （４）自己複製配列が、パピローマウィルス由来の遺伝
子配列である請求項（３）記載の外来遺伝子発現用ベク
ター。 - （５）請求項（１）、（２）、（３）または（４）項の
いずれかに記載の発現ベクターに外来遺伝子を組み込み
、これにより形質転換された細胞を、４００μｇ／ｍｌ
以上の濃度のＧ４１８を含む培養液中で選択することに
より、外来遺伝子を高発現する形質転換細胞を選択する
方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2305655A JPH04179485A (ja) | 1990-11-09 | 1990-11-09 | 新規ベクターおよび該ベクターを用いて高発現形質転換細胞を選択する方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2305655A JPH04179485A (ja) | 1990-11-09 | 1990-11-09 | 新規ベクターおよび該ベクターを用いて高発現形質転換細胞を選択する方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04179485A true JPH04179485A (ja) | 1992-06-26 |
Family
ID=17947751
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2305655A Pending JPH04179485A (ja) | 1990-11-09 | 1990-11-09 | 新規ベクターおよび該ベクターを用いて高発現形質転換細胞を選択する方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH04179485A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996030528A1 (en) * | 1995-03-28 | 1996-10-03 | Research & Diagnostics Systems, Inc. | Mammalian expression vectors |
| WO2004050884A3 (de) * | 2002-11-29 | 2004-07-15 | Boehringer Ingelheim Pharma | Neue neomycin-phosphotransferase-gene und verfahren zur selektion von hochproduzierenden rekombinanten zellen |
| EP1854891A1 (de) * | 2002-11-29 | 2007-11-14 | Boehringer Ingelheim Pharma GmbH & Co. KG | Neue Neomycin-Phosphotransferase-Gene und Verfahren zur Selektion von hochproduzierenden rekombinanten Zellen |
| US7344886B2 (en) | 2002-11-29 | 2008-03-18 | Boehringer Ingelheim Pharma Gmbh & Co., Kg | Neomycin-phosphotransferase-genes and methods for the selection of recombinant cells producing high levels of a desired gene product |
| JP2018068292A (ja) * | 2016-10-26 | 2018-05-10 | キッコーマン株式会社 | 糸状菌の形質転換方法 |
-
1990
- 1990-11-09 JP JP2305655A patent/JPH04179485A/ja active Pending
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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