JPH04218379A - 新規ポリペプチドとその発現を可能にするｄｎａ配列，調製法およびその利用 - Google Patents
新規ポリペプチドとその発現を可能にするｄｎａ配列，調製法およびその利用Info
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- JPH04218379A JPH04218379A JP2310159A JP31015990A JPH04218379A JP H04218379 A JPH04218379 A JP H04218379A JP 2310159 A JP2310159 A JP 2310159A JP 31015990 A JP31015990 A JP 31015990A JP H04218379 A JPH04218379 A JP H04218379A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、鏡像選択的アミダーゼ活性を有するポリペプ
チドに関する。また本発明は、これらのポリペプチドの
発現に必要な遺伝子材料及びその微生物学的調製方法に
関する。
チドに関する。また本発明は、これらのポリペプチドの
発現に必要な遺伝子材料及びその微生物学的調製方法に
関する。
さらに本発明は、これらポリペプチドの利用及びラセミ
アミドから酸の鏡像選択的合成のための形質転換微生物
の利用に関する。上記酸としては、特にプロピオン酸が
挙げられるが、その中でも、とりわけ（Ｓ）−２−アリ
ール−プロピオン酸及び（Ｒ）−２−アリールオキシ−
プロピオン酸が挙げられる。
アミドから酸の鏡像選択的合成のための形質転換微生物
の利用に関する。上記酸としては、特にプロピオン酸が
挙げられるが、その中でも、とりわけ（Ｓ）−２−アリ
ール−プロピオン酸及び（Ｒ）−２−アリールオキシ−
プロピオン酸が挙げられる。
不斉炭素原子が存在すると、多くの分子は２つの別個の
立体異性体（Ｒ及びＳ形）を有する。その内の１つは、
他の１つに対して鏡像体を構成する。これは、２−アリ
ール−プロピオン酸の場合に該当する。これらの分子は
、大抵の場合、約当量で存在する２つの異性体のラセミ
混合物として存在する。１つの特異的異性体のみが要求
される場合があり、２つの異性体を分離するか又は所望
の異性体の立体特異的合成により実行される。
立体異性体（Ｒ及びＳ形）を有する。その内の１つは、
他の１つに対して鏡像体を構成する。これは、２−アリ
ール−プロピオン酸の場合に該当する。これらの分子は
、大抵の場合、約当量で存在する２つの異性体のラセミ
混合物として存在する。１つの特異的異性体のみが要求
される場合があり、２つの異性体を分離するか又は所望
の異性体の立体特異的合成により実行される。
本発明は、鏡像選択的手法において、アミドを加水分解
できるポリペプチドの分野に関する。特に、ラセミ２−
アリール−プロピオン酸アミドの（Ｓ）−２−アリール
−プロピオン酸への加水分解及びラセミ２−アリールオ
キシ−プロピオン酸アミドの（Ｒ）−２−アリールオキ
シ−プロピオン酸への加水分解が挙げられる。
できるポリペプチドの分野に関する。特に、ラセミ２−
アリール−プロピオン酸アミドの（Ｓ）−２−アリール
−プロピオン酸への加水分解及びラセミ２−アリールオ
キシ−プロピオン酸アミドの（Ｒ）−２−アリールオキ
シ−プロピオン酸への加水分解が挙げられる。
上記酵素活性が実証されている微生物の内、ブレビバク
テリウム、（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びコリ
ネバクテリウム属の菌株（ヨーロッパ特許第８９４００
１９７、３号に記載）が目立つ存在である。特に、ブレ
ビバクテリウム株Ｒ３１２（ＣＢＳ７１７、７３）が挙
げられている。加えて、ロドコッカスのごとき株も上記
酵素活性を有する。
テリウム、（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）及びコリ
ネバクテリウム属の菌株（ヨーロッパ特許第８９４００
１９７、３号に記載）が目立つ存在である。特に、ブレ
ビバクテリウム株Ｒ３１２（ＣＢＳ７１７、７３）が挙
げられている。加えて、ロドコッカスのごとき株も上記
酵素活性を有する。
本発明は、鏡像選択的アミダーゼ活性物の特性化及び精
製、さらには、上記ペプチドの発現のための遺伝子物質
のクローニング及び配列決定をも包含するものである。
製、さらには、上記ペプチドの発現のための遺伝子物質
のクローニング及び配列決定をも包含するものである。
以下、用語「Ａｍｄ」は、すべての鏡像選択的アミダー
ゼ活性体を意味するものとする。用語「Ａｍｄ配列」は
、該アミダーゼ活性体をコードするすべてのヌクレオチ
ド配列を意味するものとする。
ゼ活性体を意味するものとする。用語「Ａｍｄ配列」は
、該アミダーゼ活性体をコードするすべてのヌクレオチ
ド配列を意味するものとする。
特に、本発明の目的は、組換えＤＮＡ技術により異なる
宿主微生物における上記鏡像選択的アミダーゼの高水準
な発現を達成することにある。
宿主微生物における上記鏡像選択的アミダーゼの高水準
な発現を達成することにある。
本発明の目的の一つは、鏡像選択的アミダーゼ活性を有
するポリペプチド（特にラセミ２−アリール−プロピオ
ン酸アミドに対して）をコードするＤＮＡ配列に関する
。好ましい態様として、本発明は、ブレビバクテリウム
Ｒ３１２の鏡像選択的アミダーゼをコードするヌクレオ
チド配列（第８図に示す。）又はロドコッカスの鏡像選
択的アミダーゼをコードするヌクレオチド配列（第１３
図に示す。）、さらには、同じポリペプチドをコードす
るいずれの縮重配列にも関するものである。本発明は又
、これらのＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズす
る配列に関し、及び鏡像選択的アミダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする配列に関する。さらに本発明
は、上記ＤＮＡ配列を含む遺伝子に関する。
するポリペプチド（特にラセミ２−アリール−プロピオ
ン酸アミドに対して）をコードするＤＮＡ配列に関する
。好ましい態様として、本発明は、ブレビバクテリウム
Ｒ３１２の鏡像選択的アミダーゼをコードするヌクレオ
チド配列（第８図に示す。）又はロドコッカスの鏡像選
択的アミダーゼをコードするヌクレオチド配列（第１３
図に示す。）、さらには、同じポリペプチドをコードす
るいずれの縮重配列にも関するものである。本発明は又
、これらのＤＮＡ配列又はその断片とハイブリダイズす
る配列に関し、及び鏡像選択的アミダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードする配列に関する。さらに本発明
は、上記ＤＮＡ配列を含む遺伝子に関する。
アミダーゼのペプチド配列間の相同関係についての研究
により、上記活性をもたらす保存領域が明らかになる。
により、上記活性をもたらす保存領域が明らかになる。
この領域は、第１３図に示されるペプチド配列のアミノ
酸１３７〜１９３（ヌクレオチド６１８〜７８８）に対
応し、上記ブレビバクテリウムＲ３１２のアミダーゼの
ペプチド配列のアミノ酸１５９〜２１５に対応し、厳密
な相同性（６７％）を共有する。
酸１３７〜１９３（ヌクレオチド６１８〜７８８）に対
応し、上記ブレビバクテリウムＲ３１２のアミダーゼの
ペプチド配列のアミノ酸１５９〜２１５に対応し、厳密
な相同性（６７％）を共有する。
本発明の目的の一つは、従って、上記のごときＤＮＡ配
列に関し、それが第１３図におけるアミノ酸１３７〜１
９３、第８図における１５９〜２１５、又はそれらと少
なくとも５０％の相同性を有するペプチド配列をコード
する配列を少なくとも含んでいることにより特徴づけら
れる。
列に関し、それが第１３図におけるアミノ酸１３７〜１
９３、第８図における１５９〜２１５、又はそれらと少
なくとも５０％の相同性を有するペプチド配列をコード
する配列を少なくとも含んでいることにより特徴づけら
れる。
特に、本発明の目的の一つは、第８図及び第１３図に示
されるＡｍｄ配列の全部又は一部、又はそれらの変異体
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列に関する。本発明の
意図するところにおいては、変異体とは、初期配列の特
性を保つ全ての配列を表わすことを意味し、そしてそれ
らの配列が、例えば突然変異、欠失、挿入又は遺伝子コ
ードの縮重に起因する変質を含む場合も言えることであ
る。
されるＡｍｄ配列の全部又は一部、又はそれらの変異体
を含むことを特徴とするＤＮＡ配列に関する。本発明の
意図するところにおいては、変異体とは、初期配列の特
性を保つ全ての配列を表わすことを意味し、そしてそれ
らの配列が、例えば突然変異、欠失、挿入又は遺伝子コ
ードの縮重に起因する変質を含む場合も言えることであ
る。
より正確には、ＤＮＡ配列は、第８図又は第１３図に示
される配列を含む。
される配列を含む。
これらの配列は、さまざまな方法により得ることができ
る。一般的な方法は、精製ポリペプチドから導き出され
たヌクレオチドプローブの助けを借りて、所望のポリペ
プチドをコードするゲノムＤＮＡ断片をクローン化する
ことによる。プライマー伸長、制限酵素、アダプターの
挿入、又はリンカーオリゴヌクレオチドの連結を包含す
る種々の方法を用いることにより、所望のＤＮＡ配列を
含むヌクレオチド挿入物を作ることができる。次いでそ
れを文献記載の技術によりマッピングし、配列決定する
ことができる。
る。一般的な方法は、精製ポリペプチドから導き出され
たヌクレオチドプローブの助けを借りて、所望のポリペ
プチドをコードするゲノムＤＮＡ断片をクローン化する
ことによる。プライマー伸長、制限酵素、アダプターの
挿入、又はリンカーオリゴヌクレオチドの連結を包含す
る種々の方法を用いることにより、所望のＤＮＡ配列を
含むヌクレオチド挿入物を作ることができる。次いでそ
れを文献記載の技術によりマッピングし、配列決定する
ことができる。
他の技術、すなわち、ＤＮＡ及び／又は部分的又は全体
的化学合成物を利用する技術も同様に使用できる。これ
らの技術は良く知られており、第８図および第１３図に
示される構造物は、従来の技術を用いて他の微生物にお
ける相当する配列を分離することができる。
的化学合成物を利用する技術も同様に使用できる。これ
らの技術は良く知られており、第８図および第１３図に
示される構造物は、従来の技術を用いて他の微生物にお
ける相当する配列を分離することができる。
事実上、鏡像選択的アミダーゼ間の相同性を実証したこ
とにより、本発明は、どのゲノムバンクにおいてもハイ
ブリダイズできる遺伝子（十分な相同性を有する遺伝子
）を同定するのに役立つプローブの製造を可能にする。
とにより、本発明は、どのゲノムバンクにおいてもハイ
ブリダイズできる遺伝子（十分な相同性を有する遺伝子
）を同定するのに役立つプローブの製造を可能にする。
そういった遺伝子が、鏡像選択的アミダーゼをコードす
ることを実証することは容易である。この方法でどの微
生物中でも多量のアミダーゼを得ることが可能である。
ることを実証することは容易である。この方法でどの微
生物中でも多量のアミダーゼを得ることが可能である。
又、新規鏡像選択的アミダーゼ活性を明らかにすること
も可能である。
も可能である。
さらに本発明は、鏡像選択的アミダーゼ活性を有する、
以下のペプチド配列の内の少なくとも１つを含むポリペ
プチドに関する。
以下のペプチド配列の内の少なくとも１つを含むポリペ
プチドに関する。
１、第１３図におけるアミノ酸１３７〜１９３に対応す
る配列、 ２、第８図におけるアミノ酸１５９〜 ２１５に対応する配列。
る配列、 ２、第８図におけるアミノ酸１５９〜 ２１５に対応する配列。
３、これらの配列と少なくとも５０％の相同性を有する
配列。
配列。
本発明のさらに他の目的は、上記ＤＮＡ配列から誘導さ
れる構造を有し、鏡像選択的アミダーゼ活性を有する新
規ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、天
然の又は、組換え微生物の培養物からの抽出及び精製に
より得られる。この精製は、一連の工程、すなわち、培
養物からの粗抽出物の調製、該抽出物の硫酸アンモニウ
ム分画、及びクロマトグラフィー及びゲルロ過による精
製の工程により行われる。詳細は、実施例により明らか
にされる。
れる構造を有し、鏡像選択的アミダーゼ活性を有する新
規ポリペプチドに関する。これらのポリペプチドは、天
然の又は、組換え微生物の培養物からの抽出及び精製に
より得られる。この精製は、一連の工程、すなわち、培
養物からの粗抽出物の調製、該抽出物の硫酸アンモニウ
ム分画、及びクロマトグラフィー及びゲルロ過による精
製の工程により行われる。詳細は、実施例により明らか
にされる。
より正確には、本発明は、ブレビバクテリウムＲ３１２
及びロドコッカスの鏡像選択的アミダーゼに関する。
及びロドコッカスの鏡像選択的アミダーゼに関する。
本発明は、また、上記に挙げられたＤＮＡ配列の少なく
とも１つの発現カセットを含む形質転換微生物に関する
。これらのカセットは、所望の宿主中での発現を保証す
る調節ＤＮＡ配列の制御の下に置かれた、本発明に係る
ＤＮＡ配列よりなることが好ましい。このカセットは、
宿主ゲノムに組み入れられるか、選択マーカー及び宿主
中で機能する複製の開始点を運ぶプラスミドへ挿入され
る。
とも１つの発現カセットを含む形質転換微生物に関する
。これらのカセットは、所望の宿主中での発現を保証す
る調節ＤＮＡ配列の制御の下に置かれた、本発明に係る
ＤＮＡ配列よりなることが好ましい。このカセットは、
宿主ゲノムに組み入れられるか、選択マーカー及び宿主
中で機能する複製の開始点を運ぶプラスミドへ挿入され
る。
本発明の関心の１つは、人工的条件下でのポリペプチド
の発現にある。すなわち、その培養条件が特に有利であ
るある種の細胞における異種性配列の発現及び／又は、
生産を高め及び／又は培養条件を改善するために少なく
とも部分的異種性調節シグナルの制御の下での、相同性
配列の発現にある。
の発現にある。すなわち、その培養条件が特に有利であ
るある種の細胞における異種性配列の発現及び／又は、
生産を高め及び／又は培養条件を改善するために少なく
とも部分的異種性調節シグナルの制御の下での、相同性
配列の発現にある。
本発明の対象であるＤＮＡ配列の発現を制御するＤＮＡ
配列は、好ましくは、転写及び翻訳開始領域を有する。
配列は、好ましくは、転写及び翻訳開始領域を有する。
この領域は、プロモーター及びリボゾーム結合部位を含
み、生産されるペプチドと同種（由来）あるいは異種（
由来）でもよい。
み、生産されるペプチドと同種（由来）あるいは異種（
由来）でもよい。
調節領域の選択は、使用される宿主に依存する。特に、
原核宿主については、異種性プロモーターを多くの強力
な細菌プロモーターの内から選択できる。このプロモー
ターは、例えば、トリプトファンオペロンのプロモータ
ーＰｔｒｐ、ラクトースオペロンのプロモーターＰｌａ
ｃ、ラムダバクテリオファージの右又は左プロモーター
ＰＲ及びＰＬ、コリネバクテリウムファージの強力プロ
モーター各種、又はコリネバクテリウムの同種プロモー
ターが挙げられる。より正確には、ラムダの右プロモー
ターの場合、湿度感受性ＰＲｃＩｔｓが好ましい。酵母
のごとき真核生物については、酵母解糖遺伝子のプロモ
ーターが使用できる。例えば、ホスホグリセレートキナ
ーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４
）及びエノラーゼ（ＥＮＯ）等の遺伝子のプロモーター
が挙げられる。
原核宿主については、異種性プロモーターを多くの強力
な細菌プロモーターの内から選択できる。このプロモー
ターは、例えば、トリプトファンオペロンのプロモータ
ーＰｔｒｐ、ラクトースオペロンのプロモーターＰｌａ
ｃ、ラムダバクテリオファージの右又は左プロモーター
ＰＲ及びＰＬ、コリネバクテリウムファージの強力プロ
モーター各種、又はコリネバクテリウムの同種プロモー
ターが挙げられる。より正確には、ラムダの右プロモー
ターの場合、湿度感受性ＰＲｃＩｔｓが好ましい。酵母
のごとき真核生物については、酵母解糖遺伝子のプロモ
ーターが使用できる。例えば、ホスホグリセレートキナ
ーゼ（ＰＧＫ）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェー
トデヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）、ラクターゼ（ＬＡＣ４
）及びエノラーゼ（ＥＮＯ）等の遺伝子のプロモーター
が挙げられる。
宿主微生物が、原核である場合、リボソーム結合部位は
、ラムダのｃＩＩ遺伝子かあるいはコリネバクテリアの
相同遺伝子に由来するのが望ましい。
、ラムダのｃＩＩ遺伝子かあるいはコリネバクテリアの
相同遺伝子に由来するのが望ましい。
宿主において機能する転写及び翻訳終結領域は、コード
配列の３′側（下流）に置かれる。プラスミドはまた、
組換え宿主の選択を可能にするための、１つ又は数種の
マーカーを運ぶ。アンピシリン、ストレプトマイシンの
ごとき杭生物質又は他の毒素に対する耐性のような優性
マーカーが好ましい。
配列の３′側（下流）に置かれる。プラスミドはまた、
組換え宿主の選択を可能にするための、１つ又は数種の
マーカーを運ぶ。アンピシリン、ストレプトマイシンの
ごとき杭生物質又は他の毒素に対する耐性のような優性
マーカーが好ましい。
使用される宿主微生物としては、特に、Ｅ．ｃｏｌｉの
ごとき腸内細菌及びコリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属又はロドコッカス属のコリネバクテリウムが
挙げられる。
ごとき腸内細菌及びコリネバクテリウム属、ブレビバク
テリウム属又はロドコッカス属のコリネバクテリウムが
挙げられる。
もちろん、同様の原理に基づき、他の細胞型を使用する
こともできる。
こともできる。
本発明の目的の１つは、少なくとも転写及び翻訳開始領
域、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及び選
択マーカーを含む、上記プラスミドに関する。
域、所望のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列及び選
択マーカーを含む、上記プラスミドに関する。
本発明はまた、上記形質転換微生物の鏡像選択的アミダ
ーゼの調製における応用、及びラセミアミドから酸の鏡
像体選択的合成における使用に関する。
ーゼの調製における応用、及びラセミアミドから酸の鏡
像体選択的合成における使用に関する。
鏡像選択的アミダーゼの調製法は、鏡像体選択的アミダ
ーゼをコードする配列の発現を許容する条件下で、上記
微生物を培養し、次いで生成されたアミダーゼを微生物
から分離することよりなる。
ーゼをコードする配列の発現を許容する条件下で、上記
微生物を培養し、次いで生成されたアミダーゼを微生物
から分離することよりなる。
より正確には、本発明は、対応するラセミ２−アリール
−プロピオン酸アミドから２−アリール−プロピオン酸
の鏡像体選択的合成のための、上記組換え微生物又はポ
リペプチドの利用に関する。
−プロピオン酸アミドから２−アリール−プロピオン酸
の鏡像体選択的合成のための、上記組換え微生物又はポ
リペプチドの利用に関する。
本発明の好ましい態様の１つによれば、対応するラセミ
アミドから有機酸の立体異性体の調製方法において、ラ
セミアミドが上記形質転換微生物の存在下、又は、上記
のごとく得られたポリペプチドの存在下に置かれ、得ら
れた立体異性体が回収されることを特徴とする調製方法
が推薦される。
アミドから有機酸の立体異性体の調製方法において、ラ
セミアミドが上記形質転換微生物の存在下、又は、上記
のごとく得られたポリペプチドの存在下に置かれ、得ら
れた立体異性体が回収されることを特徴とする調製方法
が推薦される。
この方法が適用できるアミドとしては、製薬業界におい
て有用なＳ（＋）ケトプロフェンを得ることのできるケ
トプロフニンのラセミアミドが挙げられる。
て有用なＳ（＋）ケトプロフェンを得ることのできるケ
トプロフニンのラセミアミドが挙げられる。
以下の実施例及び図は、本発明の他の特性及び優位性を
示すものである。これらは、例証として挙げられるので
あって、限定されるものではない。
示すものである。これらは、例証として挙げられるので
あって、限定されるものではない。
出発材料としてのプラスミド
プラスミドｐＸＬ１０２９は、ヤング等（Ｊｕｎｇ ｅ
ｔａｌ）（１９８８）、アン．インスト．パスツール／
マイクロバイオル．（Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕ
ｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３９、１２９−１４６に
記載されている。該プラスミドは、ＰＲｃＩｔｓ−ＲＢ
ＳｃＩＩΔｔＲＩを含むＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片を運
ぶ。
ｔａｌ）（１９８８）、アン．インスト．パスツール／
マイクロバイオル．（Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕ
ｒ／Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３９、１２９−１４６に
記載されている。該プラスミドは、ＰＲｃＩｔｓ−ＲＢ
ＳｃＩＩΔｔＲＩを含むＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片を運
ぶ。
実施例１
ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
の同定および精製 １．１同定 ２−アリルオキシプロピオンアミドの誘導体である（Ｒ
、Ｓ）−２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオン
アミド（ＨＰＰＡｍｉｄｅ）は鏡像体選択的アミダーゼ
の基質としては２−アリールプロピオンアミド誘導体、
すなわち２−フェニルプロピオンアミドや２−（３−ベ
ンゾイルフェニル）プロピオンアミドよりも優れた基質
である。さらにＨＰＰアミドのＲ異性体に対する選択性
は２−アリルプロピオンアミド誘導体のＳ−異性体に対
する選択性を表わす。
の同定および精製 １．１同定 ２−アリルオキシプロピオンアミドの誘導体である（Ｒ
、Ｓ）−２−（４−ヒドロキシフェノキシ）プロピオン
アミド（ＨＰＰＡｍｉｄｅ）は鏡像体選択的アミダーゼ
の基質としては２−アリールプロピオンアミド誘導体、
すなわち２−フェニルプロピオンアミドや２−（３−ベ
ンゾイルフェニル）プロピオンアミドよりも優れた基質
である。さらにＨＰＰアミドのＲ異性体に対する選択性
は２−アリルプロピオンアミド誘導体のＳ−異性体に対
する選択性を表わす。
したがって、鏡像体選択的酵素活性は２−（４−ヒドロ
キシフェノキシ）−プロピオンアミドを基質として検出
した。反応は２５℃、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
．０の緩衝液中、ブレビバクテリウムＲ３１２の存在下
で撹拌しながら行なった。反応は、０．０５Ｍリン酸、
アセトニトリル、ＩＮＨＣｌの混合物（５５：４０：５
ｖ／ｖ）を添加して終了させた。反応液を遠心したのち
上清を逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Ｈ
ｉｂａｒ−Ｍｅｒｋ）により分析した。溶出は０．００
５Ｍリン酸／アセトニトリル（８５／１５）（ｖ／ｖ）
で行なった。ＨＰＰＡｍｉｄｅとＨＰＰＡｃｉｄのそれ
ぞれの濃度は溶出ピークをスタンダードと比較して測定
した。この基質に対する鏡像体過剰度は（Ｒ−Ｓ）／（
Ｒ＋Ｓ）（ＲとＳはＨＰＰＡｃｉｄのＲとＳ異性体のそ
れぞれの濃度を表わす）として表わされる。鎖像体過剰
度は５８９ｎｍにおけるナトリウムの吸収を用いた偏光
分析法あるいはキラルカラムを用いたＨＰＬＣによって
も推測された。
キシフェノキシ）−プロピオンアミドを基質として検出
した。反応は２５℃、５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７
．０の緩衝液中、ブレビバクテリウムＲ３１２の存在下
で撹拌しながら行なった。反応は、０．０５Ｍリン酸、
アセトニトリル、ＩＮＨＣｌの混合物（５５：４０：５
ｖ／ｖ）を添加して終了させた。反応液を遠心したのち
上清を逆相高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）（Ｈ
ｉｂａｒ−Ｍｅｒｋ）により分析した。溶出は０．００
５Ｍリン酸／アセトニトリル（８５／１５）（ｖ／ｖ）
で行なった。ＨＰＰＡｍｉｄｅとＨＰＰＡｃｉｄのそれ
ぞれの濃度は溶出ピークをスタンダードと比較して測定
した。この基質に対する鏡像体過剰度は（Ｒ−Ｓ）／（
Ｒ＋Ｓ）（ＲとＳはＨＰＰＡｃｉｄのＲとＳ異性体のそ
れぞれの濃度を表わす）として表わされる。鎖像体過剰
度は５８９ｎｍにおけるナトリウムの吸収を用いた偏光
分析法あるいはキラルカラムを用いたＨＰＬＣによって
も推測された。
全菌体あるいは水溶性抽出液を用いて得られた活性はそ
れぞれ１５Ｕ／ｍｇと２４Ｕ／ｍｇ蛋白質であった（１
Ｕ＝１μｍｏｌ生成ＨＰＰＡｃｉｄ／ｈｏｕｒ）。
れぞれ１５Ｕ／ｍｇと２４Ｕ／ｍｇ蛋白質であった（１
Ｕ＝１μｍｏｌ生成ＨＰＰＡｃｉｄ／ｈｏｕｒ）。
（Ｒ）−ＨＰＰＡｃｉｄの対称体過剰度は９５％であっ
た、これらの結果はブレビバクテリウムＲ３１２が鏡像
体過剰度９３％より高い率でラセミ体の２−（３−ベン
ゾイルフェニル）−プロピオンアミドとラセミ体の２−
フェニルプロピオンアミドを対応するＳ酸に加水分解で
きることを示すものである。
た、これらの結果はブレビバクテリウムＲ３１２が鏡像
体過剰度９３％より高い率でラセミ体の２−（３−ベン
ゾイルフェニル）−プロピオンアミドとラセミ体の２−
フェニルプロピオンアミドを対応するＳ酸に加水分解で
きることを示すものである。
１．２精製
精製は４℃で行なった。凍結菌体（ブレビバクテリウム
の乾燥重量４０ｇ）は融解して３００ｍｌのバッフアー
Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５ｍＭ
βメルカプトエタノール）に懸濁した。菌株は超音波で
破砕し膜破片は２００００ｒｐｍ、３０分の遠心で除い
た。３０ｍｌの上清に対し、２５ｍｌの１０％硫酸スト
レプトマイシンの溶液を撹拌しながら徐々に加えた。４
５分後、清澄化された溶液の上清の硫安処理を行なった
。硫安飽和３０．８％と５６．６％の間で沈殿してくる
蛋白区分を遠心で集め３５ｍｌのバッファーＡに溶解し
、同じバッファーに対してゆっくりと透析した。こうし
て得られた溶液を硫安飽和２０％に調節し、遠心して得
られた上清を２０％飽和硫酸アンモニウムを含むバッフ
ァーＡで平衝化したフェニルセフアロースＣＬ−４Ｂの
カラム（ファルマシア）にかけた。同じバッファーで活
性区分を溶出しアミコンダイアフローＰＭ１０を用いた
限外瀘過により１８ｍｌにまで濃縮した。ついでグリセ
ロール１０％を濃縮液に加えその液をあらかじめ５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭＮａＣ
ｌで平衡化したウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）Ａｃ
Ａ４４カラム（ＩＢＦ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、フラ
ンス）にかけた。もっとも高い比活性を有する画分（カ
ラムにかけた全活性の約３２％）を集め同じゲルを用い
て再度ゲル瀘過をおこなった。平行して、最も高い比活
性を有する画分（カラムに掛けた全蛋白質の約３０％に
相当）をＳＤＳゲル電気泳動にかけて分析し、保存した
。精製蛋白質の鏡像体過剰度も測定した。
の乾燥重量４０ｇ）は融解して３００ｍｌのバッフアー
Ａ（５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、５ｍＭ
βメルカプトエタノール）に懸濁した。菌株は超音波で
破砕し膜破片は２００００ｒｐｍ、３０分の遠心で除い
た。３０ｍｌの上清に対し、２５ｍｌの１０％硫酸スト
レプトマイシンの溶液を撹拌しながら徐々に加えた。４
５分後、清澄化された溶液の上清の硫安処理を行なった
。硫安飽和３０．８％と５６．６％の間で沈殿してくる
蛋白区分を遠心で集め３５ｍｌのバッファーＡに溶解し
、同じバッファーに対してゆっくりと透析した。こうし
て得られた溶液を硫安飽和２０％に調節し、遠心して得
られた上清を２０％飽和硫酸アンモニウムを含むバッフ
ァーＡで平衝化したフェニルセフアロースＣＬ−４Ｂの
カラム（ファルマシア）にかけた。同じバッファーで活
性区分を溶出しアミコンダイアフローＰＭ１０を用いた
限外瀘過により１８ｍｌにまで濃縮した。ついでグリセ
ロール１０％を濃縮液に加えその液をあらかじめ５０ｍ
ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１００ｍＭＮａＣ
ｌで平衡化したウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）Ａｃ
Ａ４４カラム（ＩＢＦ−Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃｓ、フラ
ンス）にかけた。もっとも高い比活性を有する画分（カ
ラムにかけた全活性の約３２％）を集め同じゲルを用い
て再度ゲル瀘過をおこなった。平行して、最も高い比活
性を有する画分（カラムに掛けた全蛋白質の約３０％に
相当）をＳＤＳゲル電気泳動にかけて分析し、保存した
。精製蛋白質の鏡像体過剰度も測定した。
この精製方法により８０％以上純粋で比活性８１５Ｕ／
ｍｇである酵素が得られた。この段階で見掛けの分子量
５９±５ＫＤの主要バンド（全蛋白質の８０％に相当）
がＳＤＳ−ゲル電気泳動上肉眼で認められた。さらに、
ＨＰＬＣＴＳＫ３０００のカラムから溶出されたアミダ
ーゼ活性は分子量１２２ＫＤに相当し、この酵素が２量
体であることが示された。
ｍｇである酵素が得られた。この段階で見掛けの分子量
５９±５ＫＤの主要バンド（全蛋白質の８０％に相当）
がＳＤＳ−ゲル電気泳動上肉眼で認められた。さらに、
ＨＰＬＣＴＳＫ３０００のカラムから溶出されたアミダ
ーゼ活性は分子量１２２ＫＤに相当し、この酵素が２量
体であることが示された。
表１は異なる画分の特徴を示す。本表はブレビバクテリ
ウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼの別の精製工程
を示す。すなわち４０ｇの湿菌体から出発し、硫酸スト
レプトマイシン沈殿後である。
ウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼの別の精製工程
を示す。すなわち４０ｇの湿菌体から出発し、硫酸スト
レプトマイシン沈殿後である。
１ユニット（Ｕ）は１μｍｏｌ生成ＨＰＰＡｃｉｄ／ｈ
ｏｕｒ 実施例２ ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
のクローニング ２．１蛋白質配列の由来 ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
のＮ−末端（２７残基）及びトリプシン分解内部断片（
２１残基）に夫々相当するペプチド配列は精製した酵素
を用いて決定された。
ｏｕｒ 実施例２ ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
のクローニング ２．１蛋白質配列の由来 ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
のＮ−末端（２７残基）及びトリプシン分解内部断片（
２１残基）に夫々相当するペプチド配列は精製した酵素
を用いて決定された。
この決定は３ナノモルのアミダーゼ調製品を還元及びカ
ルボキシメチル化せしめることにより行なった。主な蛋
白質成分を次に脱塩し、逆相ＨＰＬＣにより均質にまで
精製した。
ルボキシメチル化せしめることにより行なった。主な蛋
白質成分を次に脱塩し、逆相ＨＰＬＣにより均質にまで
精製した。
Ｎ−末端配列は、アプライドバイオシステムモデル（Ａ
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ）４
７０Ａ装置を用いた自動連続エドマン（Ｅｄｍａｎ）分
解法により決定した。第１Ａ図で表わされている配列は
この手法により得た。付加的な内部配列を得るために、
同量の蛋白質をトリプシンで消化した。還元及びカルボ
キシメチル化された断片を次に逆相ＨＰＬＣ（２．１×
１０ｍｍ、流量０．２ｍｌ／分）により分離した。使用
した溶出緩衝剤は、０．０７％トリフルオロ酢酸中の０
〜５０％勾配のアセトニトリルである。良く分離したピ
ーク（４０．８％アセトニトリル時）として溶出された
ペプチドを配列決定した（第１Ａ図）。
ｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｏｄｅｌ）４
７０Ａ装置を用いた自動連続エドマン（Ｅｄｍａｎ）分
解法により決定した。第１Ａ図で表わされている配列は
この手法により得た。付加的な内部配列を得るために、
同量の蛋白質をトリプシンで消化した。還元及びカルボ
キシメチル化された断片を次に逆相ＨＰＬＣ（２．１×
１０ｍｍ、流量０．２ｍｌ／分）により分離した。使用
した溶出緩衝剤は、０．０７％トリフルオロ酢酸中の０
〜５０％勾配のアセトニトリルである。良く分離したピ
ーク（４０．８％アセトニトリル時）として溶出された
ペプチドを配列決定した（第１Ａ図）。
２．２ヌクレオチドプローブの構築
２つの方法を遂行した。
第１の方法においては、２９−マ−２５ヌクレオチドか
らなるプローブ（５９％最小相同性）の構築にあたり、
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（
６シストロンを含む７．７ｋｂ配列：松井ら、モレキュ
ラーアンドジェネラルジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ）、第２０９巻、２９９頁、１９８７年
）のトリプトファンオペロン中のコドンを使用すること
を念頭において、内部断片（より小さい平均縮重度に対
応する）のＩＤＧＡＬＧＳＹＤＶ配列を使用した。比較
的熱力学的に中性なＧ：Ｔペアリングを考慮し、考慮し
たコドンの平均理論頻度を最大にするために（選択され
たコドンの利用に関して８８％）、数個の縮重を導入す
ることにより非コード鎖を製造した。上記の考慮により
プローブ中のＧＣ量約６９％を導いた。このプローブの
配列（Ｓｑ７６２）を第１Ｂ図に示した。
らなるプローブ（５９％最小相同性）の構築にあたり、
ブレビバクテリウムラクトフェルメンタム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（
６シストロンを含む７．７ｋｂ配列：松井ら、モレキュ
ラーアンドジェネラルジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ）、第２０９巻、２９９頁、１９８７年
）のトリプトファンオペロン中のコドンを使用すること
を念頭において、内部断片（より小さい平均縮重度に対
応する）のＩＤＧＡＬＧＳＹＤＶ配列を使用した。比較
的熱力学的に中性なＧ：Ｔペアリングを考慮し、考慮し
たコドンの平均理論頻度を最大にするために（選択され
たコドンの利用に関して８８％）、数個の縮重を導入す
ることにより非コード鎖を製造した。上記の考慮により
プローブ中のＧＣ量約６９％を導いた。このプローブの
配列（Ｓｑ７６２）を第１Ｂ図に示した。
第２の方法においては、ジルゲス（Ｇｉｒｇｅｓ）等（
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１６巻、１０
３７１頁、１９８８年）により記載されたＰＣＲ法を、
高度に縮重したコドンに相当するペプチドから正確なヌ
クレオチドプローブを得るために用いた。上記を達成す
るために、２５−マ−（２５ヌクレオチドからなる）オ
リゴヌクレオチド（第２Ａ図下線の配列参照）を製造し
た。このヌクレオチドはＮ−末端ペプチド配列の最初又
は最後の５つのコドンをコードするすべての可能性に対
応し、また５′−末端上に、夫々ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位を有するものである。これらの２５−マ−
はブレビバクテリウムＲ３１２ゲノムＤＮＡの酵素的増
幅を開始するために用いた。増幅の３０周期後に候補と
なる断片をゲルで精製し、次にバクテリオファージＭ１
３ｍｐ１９のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿
入した。実際に、プライマーの２つの異ったハイブリダ
イゼーション温度（４５℃及び４８℃）を使用し、結果
として候補となる断片を２つ得た。この様に断片のクロ
ーン化後、夫々の温度からの数個のクローンの配列を比
較した。結果を第２Ａ図に示す。プライマーにより導入
された縮退を除いて、アミダーゼのＮ−末端をコードす
るＤＮＡ断片は良く増幅されたと考えられる。それ故こ
の内部断片に相当する４０−マ−合成オリゴヌクレオチ
ド（９１８配列）はアミダーゼのＮ−末端に対する正確
なプローブとしてクローン化の試験に使用した。第２Ｂ
図には特定プローブ９１８配列のヌクレオチド配列を示
す。
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．第１６巻、１０
３７１頁、１９８８年）により記載されたＰＣＲ法を、
高度に縮重したコドンに相当するペプチドから正確なヌ
クレオチドプローブを得るために用いた。上記を達成す
るために、２５−マ−（２５ヌクレオチドからなる）オ
リゴヌクレオチド（第２Ａ図下線の配列参照）を製造し
た。このヌクレオチドはＮ−末端ペプチド配列の最初又
は最後の５つのコドンをコードするすべての可能性に対
応し、また５′−末端上に、夫々ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位を有するものである。これらの２５−マ−
はブレビバクテリウムＲ３１２ゲノムＤＮＡの酵素的増
幅を開始するために用いた。増幅の３０周期後に候補と
なる断片をゲルで精製し、次にバクテリオファージＭ１
３ｍｐ１９のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位の間に挿
入した。実際に、プライマーの２つの異ったハイブリダ
イゼーション温度（４５℃及び４８℃）を使用し、結果
として候補となる断片を２つ得た。この様に断片のクロ
ーン化後、夫々の温度からの数個のクローンの配列を比
較した。結果を第２Ａ図に示す。プライマーにより導入
された縮退を除いて、アミダーゼのＮ−末端をコードす
るＤＮＡ断片は良く増幅されたと考えられる。それ故こ
の内部断片に相当する４０−マ−合成オリゴヌクレオチ
ド（９１８配列）はアミダーゼのＮ−末端に対する正確
なプローブとしてクローン化の試験に使用した。第２Ｂ
図には特定プローブ９１８配列のヌクレオチド配列を示
す。
この方法によって得られた２つのプローブ７６２配列及
び９１８配列は１２Ｐを用いた５’リン酸化により標識
された。
び９１８配列は１２Ｐを用いた５’リン酸化により標識
された。
２．３ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択アミダ
ーゼをコードする遺伝子のクローニング 本法はまずプローブの特異性を確かめること及びサザン
ブロットによりクローン化されるべきゲノムＤＮＡ断片
の性質を決定することから成る。ブレビバクテリウムＲ
３１２ゲノムＤＮＡは、可能なクローニング部位、特に
ｐＵＣプラスミドの多部位クローニング領域に存在する
部位に対応する数個の制限酵素により切断された。特に
、ＰｓｔＩを用いた。アガロースゲルを用いた電気泳動
後ナイロン膜に転写し、種々な切断物をプローブ７６２
配列及び９１８配列とハイブリダイズさせた。第３図に
示した結果は、２つのプローブがハイブリダイゼーショ
ン条件下で十分な特異性を現わしている（最大１つの断
片が各々の切断物に対してハイブリダイズする）ことを
証明している。さらに、２つのプローブはほとんど同じ
ハイブリダイゼーシヨンパターンを与えるので、必要と
される遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルはかな
り特異的であり、またトリプシン消化後に得られる内部
ペプチドはＮ−末端に非常に近接しているものと信じら
れるであろう。特にハイブリダイゼーシヨンのフットプ
リントは、２つのプローブと強力にハイブリダズする独
特な５．４ｋｂＰｓｔＩ断片の存在を示している。それ
故この断片をクローン化することを決めた。
ーゼをコードする遺伝子のクローニング 本法はまずプローブの特異性を確かめること及びサザン
ブロットによりクローン化されるべきゲノムＤＮＡ断片
の性質を決定することから成る。ブレビバクテリウムＲ
３１２ゲノムＤＮＡは、可能なクローニング部位、特に
ｐＵＣプラスミドの多部位クローニング領域に存在する
部位に対応する数個の制限酵素により切断された。特に
、ＰｓｔＩを用いた。アガロースゲルを用いた電気泳動
後ナイロン膜に転写し、種々な切断物をプローブ７６２
配列及び９１８配列とハイブリダイズさせた。第３図に
示した結果は、２つのプローブがハイブリダイゼーショ
ン条件下で十分な特異性を現わしている（最大１つの断
片が各々の切断物に対してハイブリダイズする）ことを
証明している。さらに、２つのプローブはほとんど同じ
ハイブリダイゼーシヨンパターンを与えるので、必要と
される遺伝子のハイブリダイゼーションシグナルはかな
り特異的であり、またトリプシン消化後に得られる内部
ペプチドはＮ−末端に非常に近接しているものと信じら
れるであろう。特にハイブリダイゼーシヨンのフットプ
リントは、２つのプローブと強力にハイブリダズする独
特な５．４ｋｂＰｓｔＩ断片の存在を示している。それ
故この断片をクローン化することを決めた。
クローニングに関して、ブレビバクテリウムＲ３１２全
ＤＮＡのＰｓｔＩ切断で得られる４．６と５．５ｋｂと
の間及び５．５〜６．５ｋｂの近辺のサイズの全断片を
、アガロースで精製し、電解溶離し、ＰｓｔＩで切断し
たｐＵＣ１９切片に結合した。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）
株ＤＨ５αを形質転換した後、５００個の白いコロニー
をＸ−ガル（ｇａｌ）培地上で得た。これは理論的には
組換体微生物に相当する。各々のコロニーを別々に単離
し、アイロン膜に転写し、次に３２Ｐで標識した９１８
配列プローブでハイブリダイゼーションすることにより
分析した。２つのクローンが非常に強力にハイブリダイ
ズしたので、こけらを単離し次の工程に使用した。
ＤＮＡのＰｓｔＩ切断で得られる４．６と５．５ｋｂと
の間及び５．５〜６．５ｋｂの近辺のサイズの全断片を
、アガロースで精製し、電解溶離し、ＰｓｔＩで切断し
たｐＵＣ１９切片に結合した。大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）
株ＤＨ５αを形質転換した後、５００個の白いコロニー
をＸ−ガル（ｇａｌ）培地上で得た。これは理論的には
組換体微生物に相当する。各々のコロニーを別々に単離
し、アイロン膜に転写し、次に３２Ｐで標識した９１８
配列プローブでハイブリダイゼーションすることにより
分析した。２つのクローンが非常に強力にハイブリダイ
ズしたので、こけらを単離し次の工程に使用した。
この２つのクローンから単離した２つの組換体プラスミ
ドｐＸＬ１６５０及びｐＸＬ１６５１は、制限地図作成
、プローブを配列決定のプライマーとして用いる部分的
配列決定、及びサザンブロットを含む種々な手法により
分析した。第４図は、２つのプラスミドが２配向性で同
一な５．４ｋｂＰｓｔＩ挿入片を含むことを示す。第５
図はこの断片の制限地図を示す。この２つのプラスミド
は特徴的なペプチド（Ｎ末端に隣接するトリプシン断片
）をコードする配列を事実含んでいる（第８図）。さら
に、これらの結果は、ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡
像体選択的アミダーゼをコードする遺伝子は２．３ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片上に位置し、センス方向はＢ
ａｍＨＩからＰｓｔＩの方へ向いていることを示す。コ
ード配列の５’末端が判明し、また酵素がせいぜい２ｋ
ｂ（我々の評価に従うと５７〜６３ＫＤ）によりコード
されるという知見から、完全な遺伝子がＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片中に含まれていることは確かであることから
我々は配列決定に進んだ。
ドｐＸＬ１６５０及びｐＸＬ１６５１は、制限地図作成
、プローブを配列決定のプライマーとして用いる部分的
配列決定、及びサザンブロットを含む種々な手法により
分析した。第４図は、２つのプラスミドが２配向性で同
一な５．４ｋｂＰｓｔＩ挿入片を含むことを示す。第５
図はこの断片の制限地図を示す。この２つのプラスミド
は特徴的なペプチド（Ｎ末端に隣接するトリプシン断片
）をコードする配列を事実含んでいる（第８図）。さら
に、これらの結果は、ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡
像体選択的アミダーゼをコードする遺伝子は２．３ｋｂ
ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片上に位置し、センス方向はＢ
ａｍＨＩからＰｓｔＩの方へ向いていることを示す。コ
ード配列の５’末端が判明し、また酵素がせいぜい２ｋ
ｂ（我々の評価に従うと５７〜６３ＫＤ）によりコード
されるという知見から、完全な遺伝子がＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩ断片中に含まれていることは確かであることから
我々は配列決定に進んだ。
実施例３
ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
をコード化する遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ
フラグメントの配列 ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの配列決定を図６に
示す。種々の配列は全て、サブフラグメントを有する一
本鎖Ｍ１３基質について、または直接プラスミドｐＸＬ
１６５０について読み終わり法（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）（７−デアザ−ｄＧＴＰ
；（３５Ｓ）−ｄＡＴＰ存在下のシークエナーゼキット
）を用いて得られた。この目的のため、いくつかの特定
のプライマーも合成した。得られた配列の平均ＧＣ含量
は６１．５％である。図７はオープン読み取りわくの分
析を示すものであり、アミダーゼに対応するオープン読
み取りわくが、計算分子量５４６７１の５２１アミノ酸
の遺伝暗号を指定することがわかる。
をコード化する遺伝子を含有するＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ
フラグメントの配列 ＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの配列決定を図６に
示す。種々の配列は全て、サブフラグメントを有する一
本鎖Ｍ１３基質について、または直接プラスミドｐＸＬ
１６５０について読み終わり法（ｃｈａｉｎ ｔｅｒｍ
ｉｎａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄ）（７−デアザ−ｄＧＴＰ
；（３５Ｓ）−ｄＡＴＰ存在下のシークエナーゼキット
）を用いて得られた。この目的のため、いくつかの特定
のプライマーも合成した。得られた配列の平均ＧＣ含量
は６１．５％である。図７はオープン読み取りわくの分
析を示すものであり、アミダーゼに対応するオープン読
み取りわくが、計算分子量５４６７１の５２１アミノ酸
の遺伝暗号を指定することがわかる。
このオープン読み取りわくのＧＣ含量は、第１、第２お
よび第３コドン部位に対し、それぞれ６５．８％、５２
．５％および７０％であり、これはＧＣ含量の多い微生
物のコード配列に典型的な分布である。図８は、Ｂａｍ
ＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの完全な配列を示す。
よび第３コドン部位に対し、それぞれ６５．８％、５２
．５％および７０％であり、これはＧＣ含量の多い微生
物のコード配列に典型的な分布である。図８は、Ｂａｍ
ＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントの完全な配列を示す。
実施例４
ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
をコードする遺伝子の大腸菌における発現 ４．１プラスミドの構造 いくつかのプラスミドを構築した。ここでは、同種リボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）またはラムダファージのｃＩ
Ｉ遺伝子からのＲＢＳを含むアミダーゼの構造遺伝子を
、それ自身のプロモーター、トリプトファンオペロンの
プロモーターまたはラムダファージの温度感受性右側プ
ロモーターのコントロール下にあるよう配置した。ブレ
ビバクテリウムＲ３１２全ゲノムＤＮＡのＰｓｔＩ消化
物から得られた５．４ｋｂフラグメントをプラスミドｐ
ＵＣ１９の単一のＰｓｔＩ部位に挿入することにより、
プラスミドｐＸＬ１６５０（図４）を得た。従って、こ
のプラスミドは、ラクトースオペロンＰｌａｃのプロモ
ーター次いでリボソーム結合部位およびブレビバクテリ
ウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼをコードする構
造遺伝子、ならびにアンピシリン耐性をコードするマー
カーを有している。
をコードする遺伝子の大腸菌における発現 ４．１プラスミドの構造 いくつかのプラスミドを構築した。ここでは、同種リボ
ソーム結合部位（ＲＢＳ）またはラムダファージのｃＩ
Ｉ遺伝子からのＲＢＳを含むアミダーゼの構造遺伝子を
、それ自身のプロモーター、トリプトファンオペロンの
プロモーターまたはラムダファージの温度感受性右側プ
ロモーターのコントロール下にあるよう配置した。ブレ
ビバクテリウムＲ３１２全ゲノムＤＮＡのＰｓｔＩ消化
物から得られた５．４ｋｂフラグメントをプラスミドｐ
ＵＣ１９の単一のＰｓｔＩ部位に挿入することにより、
プラスミドｐＸＬ１６５０（図４）を得た。従って、こ
のプラスミドは、ラクトースオペロンＰｌａｃのプロモ
ーター次いでリボソーム結合部位およびブレビバクテリ
ウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼをコードする構
造遺伝子、ならびにアンピシリン耐性をコードするマー
カーを有している。
プラスミドｐＸＬ１７２４（図９）は、大腸菌のトリプ
トファンオペロンのプロモーターのコントロール下にあ
る、５．４ｋｂＰｓｔＩフラグメントから切り出された
２．３ｋｂＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを含有し
ている。従ってこの構成において、ブレビバクテリウム
Ｒ３１２のアミダーゼ遺伝子は、リボソーム結合部位を
含むＡＴＧコドンの上流５８塩基対の後に付随している
（図８）。
トファンオペロンのプロモーターのコントロール下にあ
る、５．４ｋｂＰｓｔＩフラグメントから切り出された
２．３ｋｂＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩフラグメントを含有し
ている。従ってこの構成において、ブレビバクテリウム
Ｒ３１２のアミダーゼ遺伝子は、リボソーム結合部位を
含むＡＴＧコドンの上流５８塩基対の後に付随している
（図８）。
ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
をコードする構造遺伝子が異種リボソーム結合部位とと
もに、異種プロモーターのコントロール下におかれた他
の２種類の構造を作成した。これらプラスミド（ｐＸＬ
１７５１およびｐＸＬ１７５２）を下記のようにして得
た。
をコードする構造遺伝子が異種リボソーム結合部位とと
もに、異種プロモーターのコントロール下におかれた他
の２種類の構造を作成した。これらプラスミド（ｐＸＬ
１７５１およびｐＸＬ１７５２）を下記のようにして得
た。
アミダーゼ構造遺伝子の上流に位置するＡＴＧコドンを
ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）に置換するため、プラス
ミドｐＸＬ１７２４をＰＣＲにより突然変異を起こさせ
た。増幅は、開始コドンとハイブリッド形成する、Ｎｄ
ｅＩ部位に対応するプライマー、およびＡＴＧコドンの
下流に位置するＸｈｏＩに対応するプライマーを用いて
行なった。増幅されたフラグメントはＮｄｅＩおよびＸ
ｈｏＩを用いた消化によって切り出した。
ＮｄｅＩ部位（ＣＡＴＡＴＧ）に置換するため、プラス
ミドｐＸＬ１７２４をＰＣＲにより突然変異を起こさせ
た。増幅は、開始コドンとハイブリッド形成する、Ｎｄ
ｅＩ部位に対応するプライマー、およびＡＴＧコドンの
下流に位置するＸｈｏＩに対応するプライマーを用いて
行なった。増幅されたフラグメントはＮｄｅＩおよびＸ
ｈｏＩを用いた消化によって切り出した。
−プロモーターＰｔｒｐの利用：
ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩにより切断されたプラスミド
ｐＸＬ１７２４中に、転写終了配列ｔＲ１を除去したラ
ムダファージｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位および
Ｐｔｒｐプロモーターならびにアミダーゼ構造遺伝子の
５’領域（フラグメントＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）を有する
ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメントを挿入した。これに
よりプラスミドｐＸＬ１７５１が構築された（図１０）
。
ｐＸＬ１７２４中に、転写終了配列ｔＲ１を除去したラ
ムダファージｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位および
Ｐｔｒｐプロモーターならびにアミダーゼ構造遺伝子の
５’領域（フラグメントＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ）を有する
ＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩフラグメントを挿入した。これに
よりプラスミドｐＸＬ１７５１が構築された（図１０）
。
−プロモーターＰＲｃＩｔｓの利用：
同じ手法を用いたが、今度はＰＲｃＩｔｓプロモーター
および転写終了配列ｔＲ１の欠損したラムダファージｃ
ＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位を含むプラスミドｐＸ
Ｌ１０２９からのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩを用いた。これ
により、プラスミドｐＸＬ１７５２が構築された（図１
１）。
および転写終了配列ｔＲ１の欠損したラムダファージｃ
ＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位を含むプラスミドｐＸ
Ｌ１０２９からのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩを用いた。これ
により、プラスミドｐＸＬ１７５２が構築された（図１
１）。
４．２大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｋ１２Ｅ１０３Ｓにおける
ブレビバクテリウムＲ３１２のアミダーゼ遺伝子発現 プラスミドｐＸＬ１７５１およびｐＸＬ１７５２を用い
て大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｋ１２Ｅ１０３Ｓ各々の菌株を
塩化カルシウム法で形質転換した。組換え型微生物の選
択を、アンピシリン培地中で実施した。
ブレビバクテリウムＲ３１２のアミダーゼ遺伝子発現 プラスミドｐＸＬ１７５１およびｐＸＬ１７５２を用い
て大腸菌Ｂおよび大腸菌Ｋ１２Ｅ１０３Ｓ各々の菌株を
塩化カルシウム法で形質転換した。組換え型微生物の選
択を、アンピシリン培地中で実施した。
細胞の音波処理の後粗分画について、または遠心分離の
後にペレットおよび上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用
いてブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダ
ーゼの発現を測定した。図１２中の結果は、全タンパク
質の２０％に及ぶ高いレベルのアミダーゼ発現を示す。
後にペレットおよび上清についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを用
いてブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダ
ーゼの発現を測定した。図１２中の結果は、全タンパク
質の２０％に及ぶ高いレベルのアミダーゼ発現を示す。
実施例５
２−アリール−プロピオン酸の鏡像体選択的合成のため
のブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダー
ゼの利用 以下の菌株を使用して以下の操作を行なった： Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ１７５１）−アミダーゼコード配
列をトリプトファンオペロンのプロモーターの制御下に
配している。
のブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダー
ゼの利用 以下の菌株を使用して以下の操作を行なった： Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ１７５１）−アミダーゼコード配
列をトリプトファンオペロンのプロモーターの制御下に
配している。
Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ１７５２）−指数増殖期の終りに
温度３０℃から４２℃に上げることによりアミダーゼが
生産される（ラムダＰＲプロモーターは温度感受性リプ
レッサーｃＩｔｓの制御下にある）。
温度３０℃から４２℃に上げることによりアミダーゼが
生産される（ラムダＰＲプロモーターは温度感受性リプ
レッサーｃＩｔｓの制御下にある）。
２種の対照株も用いた：
Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ９０６）−アミダーゼ遺伝子が遺
伝子ＩＬ１βにより置換されたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ１
７５１）に相当する。
伝子ＩＬ１βにより置換されたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ１
７５１）に相当する。
Ｅ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ１０２９）−アミダーゼ遺伝子が
遺伝子ＩＬ１βにより置換されたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ
１７５２）に相当する。
遺伝子ＩＬ１βにより置換されたＥ．ｃｏｌｉ（ｐＸＬ
１７５２）に相当する。
以下の操作を用いてこれら微生物の活性を試験した：
適当な誘導条件下で成長させた細胞懸濁液を、例えば
−ヒドロキシ−４−フェノキシ−２−プロピオンアミド
（ＨＰＰＡｍ）、又は −フェニル−２−プロピオンアミド（ＰＰＡｍ）、又は −ケトプロフェンのアミド（ＫＡｍ）を含む溶液に添加
した。
（ＨＰＰＡｍ）、又は −フェニル−２−プロピオンアミド（ＰＰＡｍ）、又は −ケトプロフェンのアミド（ＫＡｍ）を含む溶液に添加
した。
次いで反応混合物をアセトニトリル：Ｎ塩酸（９０：１
０）（ｖ／ｖ）を含む緩衝液に希釈し、細胞を遠心分離
により除去した。反応混合物をＨＰＬＣで分析しアミダ
ーゼ活性を産出した。表２に示す結果はこの方式の効率
を示している。
０）（ｖ／ｖ）を含む緩衝液に希釈し、細胞を遠心分離
により除去した。反応混合物をＨＰＬＣで分析しアミダ
ーゼ活性を産出した。表２に示す結果はこの方式の効率
を示している。
表２は誘導条件下のＥ．ｃｏｌｉ中で生産されたブレビ
バクテリウムＲ３１２のアミダーゼのラセミ基質ＨＰＰ
Ａｍ、ＰＰＡｍおよびＫＡｍに対する比活性、並びに生
産されるキラル酸の鏡像体過剰度を示している。本実験
においてはプラスミドｐＸＬ１７５１（アミダーゼ）ま
たはｐＸＬ９０６（対照）を宿しているＥ．ｃｏｌｉ株
は３７℃で成長させた。
バクテリウムＲ３１２のアミダーゼのラセミ基質ＨＰＰ
Ａｍ、ＰＰＡｍおよびＫＡｍに対する比活性、並びに生
産されるキラル酸の鏡像体過剰度を示している。本実験
においてはプラスミドｐＸＬ１７５１（アミダーゼ）ま
たはｐＸＬ９０６（対照）を宿しているＥ．ｃｏｌｉ株
は３７℃で成長させた。
表３は誘導または抑制条件下２８℃において成長させた
Ｅ．ｃｏｌｉ中で生産されたブレビバクテリウムＲ３１
２（発現プラスミドｐＸＬ１７５１）のアミダーゼのラ
セミ基質ＫＡｍに対する比活性、並びに生産されるキラ
ル酸の鏡像体過剰度を示している。
Ｅ．ｃｏｌｉ中で生産されたブレビバクテリウムＲ３１
２（発現プラスミドｐＸＬ１７５１）のアミダーゼのラ
セミ基質ＫＡｍに対する比活性、並びに生産されるキラ
ル酸の鏡像体過剰度を示している。
従って、ブレビバクテリウムＲ３１２（遺伝子型Ａｍｄ
＋）のアミダーゼ遺伝子を宿しているＥ．ｃｏｌｉ株は
以下の３種のアミド類を効率的に加水分解することがで
きる（表現型ＡＭＤ＋）。
＋）のアミダーゼ遺伝子を宿しているＥ．ｃｏｌｉ株は
以下の３種のアミド類を効率的に加水分解することがで
きる（表現型ＡＭＤ＋）。
−２−（４−ヒドロキシ−フェノキシ）−プロピオンア
ミド（ＨＰＰＡｍ） −２−フェニル−プロピオンアミド（ＰＰＡｍ）−ケト
プロフェンのアミド（ＫＡｍ） 得られた鏡像体過剰度は常に９３％より大きかった。
ミド（ＨＰＰＡｍ） −２−フェニル−プロピオンアミド（ＰＰＡｍ）−ケト
プロフェンのアミド（ＫＡｍ） 得られた鏡像体過剰度は常に９３％より大きかった。
実施例６
ロドコッカスの鏡像体選択的アミダーゼの精製
Ｉ、酵素活性のアッセイ
活性画分を３０℃で３０ｍｉｎ、緩衝液（０．１Ｍトリ
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＤＴＴ、１８ｍＭ２−
フェニルプロピオンアミド）５００μｌ中でインキュベ
ートした。インキュベート後、アセトニトリル／ＨＣｌ
ＩＮ（９０／１０）の混合物２ｍｌ及びそれから５０ｍ
ＭＨ３ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ（７５／２５）の混合物２ｍ
ｌを反応混合物に加えた。５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ
の遠心の後、上清の一部を高速液体クロマトグラフィに
付し、反応生成物を測定した。
スＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭＤＴＴ、１８ｍＭ２−
フェニルプロピオンアミド）５００μｌ中でインキュベ
ートした。インキュベート後、アセトニトリル／ＨＣｌ
ＩＮ（９０／１０）の混合物２ｍｌ及びそれから５０ｍ
ＭＨ３ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ（７５／２５）の混合物２ｍ
ｌを反応混合物に加えた。５０００ｒｐｍで１０ｍｉｎ
の遠心の後、上清の一部を高速液体クロマトグラフィに
付し、反応生成物を測定した。
カラム：ヌクレオシル５−Ｃ１８（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ
５−Ｃ１８）２５ｃｍ 溶離剤：５０ｍＭＨ３ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ（７５／２５
） 注入量：１０μｌ 流量：１ｍｌ／ｍｉｎ 活性の単位は、時間当り２−フェニループロピオンアミ
ド１μｍｏｌの加水分解に必要な酵素の量として定義さ
れる。
５−Ｃ１８）２５ｃｍ 溶離剤：５０ｍＭＨ３ＰＯ４／ＣＨ３ＣＮ（７５／２５
） 注入量：１０μｌ 流量：１ｍｌ／ｍｉｎ 活性の単位は、時間当り２−フェニループロピオンアミ
ド１μｍｏｌの加水分解に必要な酵素の量として定義さ
れる。
ＩＩ、精製のプロトコール
６．１ 酵素抽出物の調製
細胞７ｇを０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍ
ＭＤＴＴの１５ｍｌ中に懸濁させ、４℃で１５ｍｉｎ超
音波処理した。５００００ｒｐｍで１ｈ遠心して粗酵素
抽出物を集めた。
ＭＤＴＴの１５ｍｌ中に懸濁させ、４℃で１５ｍｉｎ超
音波処理した。５００００ｒｐｍで１ｈ遠心して粗酵素
抽出物を集めた。
６．２ 第１回イオン交換クロマトグラフィ粗抽出物２
０ｍｌに、緩衝液Ａ（２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５ｍＭＤＴＴ）２０ｍｌを加えた。その試料を、
緩衝液Ａ中に平衡させたモノＱＨＲ１０／１０（Ｍｏｎ
ｏＱＨＲ１０／１０）カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）製）上に３ｍｌ／ｍｉｎの流量で注入した
。カラムの洗浄の後、蛋白質は、０．１乃至１ＭＫＣｌ
の線形濃度勾配により、３ｍｌ／ｍｉｎの流量で溶出さ
れた。画分サイズは６ｍｌであった。アミダーゼは、約
０．３ＭＫＣｌ１８ｍｌ中に溶出した。
０ｍｌに、緩衝液Ａ（２５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、５ｍＭＤＴＴ）２０ｍｌを加えた。その試料を、
緩衝液Ａ中に平衡させたモノＱＨＲ１０／１０（Ｍｏｎ
ｏＱＨＲ１０／１０）カラム（ファーマシア（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ）製）上に３ｍｌ／ｍｉｎの流量で注入した
。カラムの洗浄の後、蛋白質は、０．１乃至１ＭＫＣｌ
の線形濃度勾配により、３ｍｌ／ｍｉｎの流量で溶出さ
れた。画分サイズは６ｍｌであった。アミダーゼは、約
０．３ＭＫＣｌ１８ｍｌ中に溶出した。
６．３ 第２回イオン交換クロマトグラフィ活性画分を
あわせ、セントリプレプ限界濾過システム（Ｃｅｎｔｒ
ｉｐｒｅｐ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｓｙｓｔ
ｅｍ）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて２ｍｌ
に濃縮した。緩衝液Ａ６ｍｌで希釈した後、その試料４
ｍｌを緩衝液Ａ中に平衡させたモノＱＨＲ５／５（Ｍｏ
ｎｏＱＨＲ５／５）カラム上に１ｍｌ／ｍｉｎで注入し
た。蛋白質は、緩衝液Ａ中ＫＣｌ０〜０．５Ｍの線形勾
配により溶出された。活性画分を合わせ、１５％になる
ようグリセロール（ｖ／ｖ）を加え、それから上述のよ
うに１ｍｌに濃縮した。
あわせ、セントリプレプ限界濾過システム（Ｃｅｎｔｒ
ｉｐｒｅｐ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｓｙｓｔ
ｅｍ）（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）製）を用いて２ｍｌ
に濃縮した。緩衝液Ａ６ｍｌで希釈した後、その試料４
ｍｌを緩衝液Ａ中に平衡させたモノＱＨＲ５／５（Ｍｏ
ｎｏＱＨＲ５／５）カラム上に１ｍｌ／ｍｉｎで注入し
た。蛋白質は、緩衝液Ａ中ＫＣｌ０〜０．５Ｍの線形勾
配により溶出された。活性画分を合わせ、１５％になる
ようグリセロール（ｖ／ｖ）を加え、それから上述のよ
うに１ｍｌに濃縮した。
６．４ 疎水性クロマトグラフィ
緩衝液Ｂ（０．１ＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．
５ｍＭＤＴＴ、１．７Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）１ｍｌを
試料に加え、それからフェニルースパロースＨＲ５／５
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｕｐｅｒｏｓｅＨＲ５／５）カラム
（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）上に０．２
５ｍｌ／ｍｉｎの流量で（２回の注入で）注入した。蛋
白質は、２５ｍｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４の減少線形勾配
（１．７ＭからＯＭ）により０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出
された。画分サイズは０．５ｍｌであった。
５ｍＭＤＴＴ、１．７Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４）１ｍｌを
試料に加え、それからフェニルースパロースＨＲ５／５
（Ｐｈｅｎｙｌ−ＳｕｐｅｒｏｓｅＨＲ５／５）カラム
（ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製）上に０．２
５ｍｌ／ｍｉｎの流量で（２回の注入で）注入した。蛋
白質は、２５ｍｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４の減少線形勾配
（１．７ＭからＯＭ）により０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出
された。画分サイズは０．５ｍｌであった。
活性画分に１５％になるようグリセロールを加え、それ
から緩衝液Ａで１ｍｌに希釈した。
から緩衝液Ａで１ｍｌに希釈した。
６．５ ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィ
試料を、緩衝液Ｃ（８５ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５
）、０．５ｍＭＤＴＴ、１０μＭＣａＣｌ２、１５％グ
リセロール）で平衡化させたバイオ−ゲルＨＰＨＴ（Ｂ
ｉｏ−ＧｅｌＨＰＨＴ）カラム（バイオ−ラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）製）上に０．５ｍｌ／ｍｉｎで注入した。ア
ミダーゼは、緩衝液Ｃに対するｐＨ７．５の０．３５Ｍ
リン酸カルシウム、０．５ｍＭＤＴＴ、１０μＭＣａＣ
ｌ２、１５％グリセロールの緩衝液の０から１００％の
線形勾配により０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で２０分間で
溶出された。
）、０．５ｍＭＤＴＴ、１０μＭＣａＣｌ２、１５％グ
リセロール）で平衡化させたバイオ−ゲルＨＰＨＴ（Ｂ
ｉｏ−ＧｅｌＨＰＨＴ）カラム（バイオ−ラド（Ｂｉｏ
−Ｒａｄ）製）上に０．５ｍｌ／ｍｉｎで注入した。ア
ミダーゼは、緩衝液Ｃに対するｐＨ７．５の０．３５Ｍ
リン酸カルシウム、０．５ｍＭＤＴＴ、１０μＭＣａＣ
ｌ２、１５％グリセロールの緩衝液の０から１００％の
線形勾配により０．５ｍｌ／ｍｉｎの流量で２０分間で
溶出された。
これらの工程により９８８Ｕ／ｍｇという比活性を有す
る均一の精製酵素が得られる。
る均一の精製酵素が得られる。
それによって得られた酵素は、見かけの分子量５３±２
ＫＤの同一のサブユニットのダイマーの形で存在する。
ＫＤの同一のサブユニットのダイマーの形で存在する。
実施例７
本アミダーゼをコードする遺伝子のクローニング
ＴＳＫ−Ｇ３０００ＳＷによる補足的精製工程の後、こ
の酵素の配列決定を行なった。
の酵素の配列決定を行なった。
Ｎ末端がエドマン型の反応を受けないため、全トリプシ
ン加水分解を行なったところ、加水分解生成物の３つの
ＨＰＬＣ画分−１２３、１２４および１６２−から明確
な配列を与えるペプチドが得られた。画分１２３から得
られた配列より、３２マーのヌクレオチドプローブを合
成した。これは８種類のオリゴヌクレオチドの混合体で
あり、３回以上縮重している位置７箇所にはイノシンを
含むものである。
ン加水分解を行なったところ、加水分解生成物の３つの
ＨＰＬＣ画分−１２３、１２４および１６２−から明確
な配列を与えるペプチドが得られた。画分１２３から得
られた配列より、３２マーのヌクレオチドプローブを合
成した。これは８種類のオリゴヌクレオチドの混合体で
あり、３回以上縮重している位置７箇所にはイノシンを
含むものである。
プローブＡ（ペプチド１２３より）
５’末端を３２Ｐでラベルしたこのプローブの効率を、
予めＳｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩのいずれか
の制限酵素で消化したロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ）由来のゲノムＤＮＡ上へのサザーン転写によ
って調べた。実験条件は次のとおりである：ハイブリダ
イゼーションバッフアー、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハール
ト、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭＮａＰＯ４ｐＨ６．５、
サケ精子ＤＮＡ；ハイブリダイゼーション温度は５０℃
又は５５℃（２つの実験）；洗浄条件は６ｘＳＳＣ中室
温にて１時間そして２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０
℃にて５分である。
予めＳｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＳｍａＩ、ＰｓｔＩ、Ｋｐｎ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩおよびＢａｍＨＩのいずれか
の制限酵素で消化したロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏ
ｃｃｕｓ）由来のゲノムＤＮＡ上へのサザーン転写によ
って調べた。実験条件は次のとおりである：ハイブリダ
イゼーションバッフアー、５ｘＳＳＣ、５ｘデンハール
ト、０．１％ＳＤＳ、５０ｍＭＮａＰＯ４ｐＨ６．５、
サケ精子ＤＮＡ；ハイブリダイゼーション温度は５０℃
又は５５℃（２つの実験）；洗浄条件は６ｘＳＳＣ中室
温にて１時間そして２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中５０
℃にて５分である。
この条件下で、プローブＡは強い明確なシグナルをもた
らした；特にＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｓｔ
Ｉ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩによる消化では
、プローブＡに強くハイブリダィズする一つのゲノム帯
域が見つかった。ＰｓｔＩ消化の場合、プローブＡへの
ハイブリダイゼーシヨンシグナルの大きさは、約３．２
ｋｂのゲノム断片に相当する。
らした；特にＢａｍＨＩ、ＫｐｎＩ、ＳｐｈＩ、Ｓｓｔ
Ｉ、ＳｍａＩ、ＳａｌＩおよびＰｓｔＩによる消化では
、プローブＡに強くハイブリダィズする一つのゲノム帯
域が見つかった。ＰｓｔＩ消化の場合、プローブＡへの
ハイブリダイゼーシヨンシグナルの大きさは、約３．２
ｋｂのゲノム断片に相当する。
かくして、ゲノムＤＮＡの３乃至４ｋｂのＰｓｔＩ消化
断片をアガロースを通す調製電気泳動およびそれに続く
電気溶出で精製し、ＰｓｔＩで切っておいたプラスミド
ｐＵＣ１９に結合した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの形質
転換の後、ＬＢＡｍｐ−Ｘ−ｇａｌ上の６００の白色ク
ローンを個々に再採取し、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンによりサザーン法と同様の厳しい条件でプローブＡ
を用いて探査した。そして、特に強いハイブリダイゼー
ションシグナルを有する９つのクローンをプラスミドＤ
ＮＡの制限切断により分析した。同じ３．２ｋｂ断片を
２つの向きで明らかに挿入しているこれらのクローンの
６つのうち、それぞれの向きを代表する２つのクローン
（ｐＸＬ１８３５およびｐＸＬ１８３６）をより詳しく
分析し（詳細なマッピング、サザーン分析）、これによ
り所望の断片が得られることを確認した。
断片をアガロースを通す調製電気泳動およびそれに続く
電気溶出で精製し、ＰｓｔＩで切っておいたプラスミド
ｐＵＣ１９に結合した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αの形質
転換の後、ＬＢＡｍｐ−Ｘ−ｇａｌ上の６００の白色ク
ローンを個々に再採取し、コロニーハイブリダイゼーシ
ョンによりサザーン法と同様の厳しい条件でプローブＡ
を用いて探査した。そして、特に強いハイブリダイゼー
ションシグナルを有する９つのクローンをプラスミドＤ
ＮＡの制限切断により分析した。同じ３．２ｋｂ断片を
２つの向きで明らかに挿入しているこれらのクローンの
６つのうち、それぞれの向きを代表する２つのクローン
（ｐＸＬ１８３５およびｐＸＬ１８３６）をより詳しく
分析し（詳細なマッピング、サザーン分析）、これによ
り所望の断片が得られることを確認した。
実施例８
３．２ｋｂＰｓｔＩ断片の配列
上記３．２ｋｂＰｓｔＩ断片の完全なヌクレオチド配列
を、その２本の鎖について決定した。この断片のＧＣ含
量は６２．４％であり、Ｒ３１２のＧＣ含量（約６２％
）と同等であった。分析の結果、この配列は１３８６ヌ
クレオチドのオープン読取り枠を含み（位置２１０乃至
１５９５）、これは４６２個のアミノ酸から成るポリペ
プチド（分子量計算値４８５５４）をコードし、前記ト
リプシン断片の配列決定により予め得られた３つのペプ
チドを含んでいることがわかった。このオープン読取り
枠はＢａｍＨＩでサブクローニングした断片に含まれて
おり、そのヌクレオチド配列は第１３図に示される。
を、その２本の鎖について決定した。この断片のＧＣ含
量は６２．４％であり、Ｒ３１２のＧＣ含量（約６２％
）と同等であった。分析の結果、この配列は１３８６ヌ
クレオチドのオープン読取り枠を含み（位置２１０乃至
１５９５）、これは４６２個のアミノ酸から成るポリペ
プチド（分子量計算値４８５５４）をコードし、前記ト
リプシン断片の配列決定により予め得られた３つのペプ
チドを含んでいることがわかった。このオープン読取り
枠はＢａｍＨＩでサブクローニングした断片に含まれて
おり、そのヌクレオチド配列は第１３図に示される。
３つのアンダーラインしたペプチド配列は、精製酵素の
トリプシン断片について直接決定されたペプチド断片に
対応する（ペプチド１２３、１２４および１６２）。ア
ンダーラインしたヌクレオチド配列は、遺伝子をクロー
ニングするのに用いた（縮重）プローブに対応する。イ
タリック体で書かれたペプチド配列は、ブレビバクテリ
ウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｒ３１２およ
びロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の株の
鏡像体選択的アミダーゼの間に高度に保持されている残
基１３７乃至１９３に対応する（下記参照）。
トリプシン断片について直接決定されたペプチド断片に
対応する（ペプチド１２３、１２４および１６２）。ア
ンダーラインしたヌクレオチド配列は、遺伝子をクロー
ニングするのに用いた（縮重）プローブに対応する。イ
タリック体で書かれたペプチド配列は、ブレビバクテリ
ウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｒ３１２およ
びロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の株の
鏡像体選択的アミダーゼの間に高度に保持されている残
基１３７乃至１９３に対応する（下記参照）。
このオープン読取り枠は、上記鏡像体選択的アミダーゼ
の構造遺伝子を表わしている。
の構造遺伝子を表わしている。
実施例９
異なるアミダーゼ間の相同性：アミダーゼ活性の配列特
性の同定 Ｒ３１２の鏡像体選択的アミダーゼのペプチド配列（第
８図）と第１３図に示されるアミダーゼとを比較すると
、配列の約三分の二において強い相同性が見られ、これ
はＲ３１２の１５０と３００の間の残基（５０％は全く
同じ）にわたり、１５９乃至２１５の間の残基において
は相同性は６７％に達する。
性の同定 Ｒ３１２の鏡像体選択的アミダーゼのペプチド配列（第
８図）と第１３図に示されるアミダーゼとを比較すると
、配列の約三分の二において強い相同性が見られ、これ
はＲ３１２の１５０と３００の間の残基（５０％は全く
同じ）にわたり、１５９乃至２１５の間の残基において
は相同性は６７％に達する。
相同配列についてのＧＥＮＰＲＯ遺伝子バンクをサーチ
したところ、１５０乃至２００領域の間でいくつかの強
い相同性が見られ、これにはアスペルギルス・ニドゥラ
ンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の
アセトアミダーゼの配列、シュードモナス・シリンジ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびブ
ラジリゾビウム．ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のインドールアセトアミ
ドヒドロラーゼ（ＩＡＨ）、アグロバクテリウム・トゥ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）のｔｍｓ２プロテインおよびフラホ
バクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｋ１
７２およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
株ＮＫ８７の６−アミノヘキサノエート環状ダイマーヒ
ドロリアーゼ（ＡＣＤＨ）があった。
したところ、１５０乃至２００領域の間でいくつかの強
い相同性が見られ、これにはアスペルギルス・ニドゥラ
ンス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の
アセトアミダーゼの配列、シュードモナス・シリンジ（
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ）およびブ
ラジリゾビウム．ジャポニクム（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏ
ｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）のインドールアセトアミ
ドヒドロラーゼ（ＩＡＨ）、アグロバクテリウム・トゥ
メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍ
ｅｆａｃｉｅｎｓ）のｔｍｓ２プロテインおよびフラホ
バクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株Ｋ１
７２およびシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）
株ＮＫ８７の６−アミノヘキサノエート環状ダイマーヒ
ドロリアーゼ（ＡＣＤＨ）があった。
第４表は、上記のアミダーゼのペプチド１３７−１９３
の相同性を、これらの他の酵素のそれぞれの部位ととも
に示すものである（アミノ酸の厳格な同一率％として表
わす）：この強く保存された領域が、おそらくはこれら
の酵素の活性（活性部位）に係わっていると思われる。
の相同性を、これらの他の酵素のそれぞれの部位ととも
に示すものである（アミノ酸の厳格な同一率％として表
わす）：この強く保存された領域が、おそらくはこれら
の酵素の活性（活性部位）に係わっていると思われる。
実施例１０
大腸菌における鏡像体選択的アミダーゼの発現
鏡像体選択的アミダーゼをコードする相（ｐｈａｓｅ）
の同定を確認するため、位置２１０（第１３図）の推定
ＡＴＧコドンにおいてＰＣＲによりＮｄｅＩ部位（ＣＡ
ＴＡＴＧ）を作成し、アミダーゼをコードする領域を特
異に含むこの２１０と１６８３のＳａｌＩ部位間の断片
を大腸菌中で機能できる転写開始（プロモーターＰｔｒ
ＰまたはＰＲ）および翻訳開始（リボゾーム結合部位ｃ
ＩＩ）シグナルの制御下に置いた。そこで得られたベク
ター（ｐＸＬ１８９３、ＰｔｒＰおよびｐＸＬ１８９４
、ＰＲ−ｃＩｔｓ）は、前述したようにＲ３１２アミダ
ーゼを発現するベクターｐＸＬ１７５２およびｐＸＬ１
７５１に類似している。プラスミドｐＸＬ１８９３およ
びｐＸＬ１８９４からの発現はそれぞれＥ．ｃｏｌｉＢ
およびＥ．ｃｏｌｉＫ１２Ｅ１０３Ｓで研究された。精
製アミダーゼと同じ易動度をしめすタンパク質がプラス
ミドｐＸＬ１８９４の存在下４２℃で特異的に生成され
た。
の同定を確認するため、位置２１０（第１３図）の推定
ＡＴＧコドンにおいてＰＣＲによりＮｄｅＩ部位（ＣＡ
ＴＡＴＧ）を作成し、アミダーゼをコードする領域を特
異に含むこの２１０と１６８３のＳａｌＩ部位間の断片
を大腸菌中で機能できる転写開始（プロモーターＰｔｒ
ＰまたはＰＲ）および翻訳開始（リボゾーム結合部位ｃ
ＩＩ）シグナルの制御下に置いた。そこで得られたベク
ター（ｐＸＬ１８９３、ＰｔｒＰおよびｐＸＬ１８９４
、ＰＲ−ｃＩｔｓ）は、前述したようにＲ３１２アミダ
ーゼを発現するベクターｐＸＬ１７５２およびｐＸＬ１
７５１に類似している。プラスミドｐＸＬ１８９３およ
びｐＸＬ１８９４からの発現はそれぞれＥ．ｃｏｌｉＢ
およびＥ．ｃｏｌｉＫ１２Ｅ１０３Ｓで研究された。精
製アミダーゼと同じ易動度をしめすタンパク質がプラス
ミドｐＸＬ１８９４の存在下４２℃で特異的に生成され
た。
実施例１１
コリネバクテリウム中の鏡像体選択的アミダーゼの発現
１． 発現ベクターの構築
これらのベクターはコリネバクテリウムの複製ベクター
から誘導される。これらは大腸菌のレプリコン コリネバクテリウムのレプリコン 選択マーカー Ａｍｄ配列 を含有する。
から誘導される。これらは大腸菌のレプリコン コリネバクテリウムのレプリコン 選択マーカー Ａｍｄ配列 を含有する。
ベクターｐＳＶ７３（図１４）：このプラスミドは、大
腸菌レプリコンおよびトランスポゾンＴｎ９０３上に保
持されるカナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミド
ｐＵＣ８の挿入によってＣ．グルタミクム（ヨシハマ（
ｙｏｓｈｉｈａｍａ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第
１６２巻、第５９１頁、１９８５年）のプラスミドｐＳ
Ｒ１から誘導される。
腸菌レプリコンおよびトランスポゾンＴｎ９０３上に保
持されるカナマイシン耐性遺伝子を含有するプラスミド
ｐＵＣ８の挿入によってＣ．グルタミクム（ヨシハマ（
ｙｏｓｈｉｈａｍａ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．第
１６２巻、第５９１頁、１９８５年）のプラスミドｐＳ
Ｒ１から誘導される。
このプラスミドは図１３に示されるＡｍｄ配列に対して
異なる発現ベクターを構築するのに使用された。即ち： ○ベクターｐＹＧ８１１Ａ及びＢ（図１５）：これらの
発現ベクターは、図１３に表されるＳａｌＩ断片に含有
されＡｍｄ配列をｐＳＶ７３のＳａｌＩ部位に両配向で
クローン化することにより得られる。
異なる発現ベクターを構築するのに使用された。即ち： ○ベクターｐＹＧ８１１Ａ及びＢ（図１５）：これらの
発現ベクターは、図１３に表されるＳａｌＩ断片に含有
されＡｍｄ配列をｐＳＶ７３のＳａｌＩ部位に両配向で
クローン化することにより得られる。
○ベクターｐＹＧ８１７Ａ及びＢ（図１６）：これらの
発現ベクターは、図１３に表されるＢａｍＨＩ断片に含
有されるＡｍｄ配列をｐＳＶ７３のＢｇｌＩＩ部位に両
配向でクローン化することにより得られる。
発現ベクターは、図１３に表されるＢａｍＨＩ断片に含
有されるＡｍｄ配列をｐＳＶ７３のＢｇｌＩＩ部位に両
配向でクローン化することにより得られる。
○ベクターｐＹＧ８２２（図１７）：この発現ベクター
は、大腸菌のトリプトファンオペロンのＰｔｒｐプロモ
ーターの制御下に図１３に表されるＡｍｄ配列を含有す
る発現カセットをＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ部位間に挿入
することによりｐＳＶ７３から誘導される。
は、大腸菌のトリプトファンオペロンのＰｔｒｐプロモ
ーターの制御下に図１３に表されるＡｍｄ配列を含有す
る発現カセットをＳａｌＩ及びＢｇｌＩＩ部位間に挿入
することによりｐＳＶ７３から誘導される。
○他の機能不明のコリネバクテリウムプラスミドは、コ
リネバクテリア中で機能するＡｍｄ配列のための発現ベ
クターの構築に使用できる。例えば、Ｂ．ラクトフェル
メンタム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（イェ
ー（Ｙｅｈ）ら、Ｇｅｎｅ、第４７巻、第３１０〜３６
０頁、１９８６年）から単離したプラスミドｐＸ１８は
、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）Ｒ３１２中で複製できるシャトルベクターｐＹＧ８２
０Ａ及びｐＹＧ８２０Ｂを構築することができた。それ
ゆえに、数種のコリネバクテリウムにおけるクローン化
及び発現実験用受容体として使用できる。
リネバクテリア中で機能するＡｍｄ配列のための発現ベ
クターの構築に使用できる。例えば、Ｂ．ラクトフェル
メンタム（Ｂ．ｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）（イェ
ー（Ｙｅｈ）ら、Ｇｅｎｅ、第４７巻、第３１０〜３６
０頁、１９８６年）から単離したプラスミドｐＸ１８は
、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ
）Ｒ３１２中で複製できるシャトルベクターｐＹＧ８２
０Ａ及びｐＹＧ８２０Ｂを構築することができた。それ
ゆえに、数種のコリネバクテリウムにおけるクローン化
及び発現実験用受容体として使用できる。
２． コリネバクテリウムの形質転換
すべての知られた形質転換技術は使用でき、特に上記に
引用したヨシマ（Ｙｏｓｈｉｍａ）らにより記載された
プロトプラスト再生技術が使用できる。しかし、出願人
はエレクトロポレーシヨン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）が非常に有効であり、形質転換の頻度は１００
０倍になることを示してきている。
引用したヨシマ（Ｙｏｓｈｉｍａ）らにより記載された
プロトプラスト再生技術が使用できる。しかし、出願人
はエレクトロポレーシヨン（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔ
ｉｏｎ）が非常に有効であり、形質転換の頻度は１００
０倍になることを示してきている。
超音波処理された細胞のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、組換
体宿主中の酵素の細胞内発現の研究に使用される。
体宿主中の酵素の細胞内発現の研究に使用される。
実施例１２
酵素の触媒作用
この実施例では、Ａｍｄ−型の蛋白質、又はこれらの蛋
白質を発現する組換体微生物を、ラセミ体アミドの加水
分解による光学的に活性な有機酸の鏡像体選択性合成に
用いる場合について説明する。
白質を発現する組換体微生物を、ラセミ体アミドの加水
分解による光学的に活性な有機酸の鏡像体選択性合成に
用いる場合について説明する。
１． 菌体の調製
２リットルの三角フラスコ内で、６００ｍｌの媒質を用
いて温度２８℃で、適切な培養条件下で１５０回転／分
の撹拌をしながら、異なった菌株を培養した。培養が終
結した後、細胞を採取し、ＮａＣｌ（９ｇ／ｌ）の溶液
で洗浄し、−１８℃で貯蔵した。
いて温度２８℃で、適切な培養条件下で１５０回転／分
の撹拌をしながら、異なった菌株を培養した。培養が終
結した後、細胞を採取し、ＮａＣｌ（９ｇ／ｌ）の溶液
で洗浄し、−１８℃で貯蔵した。
２．基質として２−フェニル−プロピオンアミドを用い
た場合 プロトコールは次のとおりである。
た場合 プロトコールは次のとおりである。
２−フェニル−プロピオンアミド及び細胞懸濁液を、撹
拌機付きのフラスコに加え、その容積を５０ｍＭリン酸
カルシウム緩衝剤ｐＨ７．０で、５ｍｌに調節した。そ
のフラスコを２５℃でサーモスタット付きの結晶化皿に
おき、１時間撹拌した。反応混合物をアセトニトリル／
ＨＣｌ（９／１）、（ｖ／ｖ）の溶液で希釈した。遠心
分離により、バクテリア及び細胞の破片を除去した。酸
とアミドの組成をＨＰＬＣで決定した。
拌機付きのフラスコに加え、その容積を５０ｍＭリン酸
カルシウム緩衝剤ｐＨ７．０で、５ｍｌに調節した。そ
のフラスコを２５℃でサーモスタット付きの結晶化皿に
おき、１時間撹拌した。反応混合物をアセトニトリル／
ＨＣｌ（９／１）、（ｖ／ｖ）の溶液で希釈した。遠心
分離により、バクテリア及び細胞の破片を除去した。酸
とアミドの組成をＨＰＬＣで決定した。
ブレビバクテリウムＲ３１２及びブレビバクテリウム・
ラクトファーメンタム（ＡＴＣＣ２１０８６）で得られ
た結果は次の通りである。
ラクトファーメンタム（ＡＴＣＣ２１０８６）で得られ
た結果は次の通りである。
３．基質としてラセミ体ケトプロフェンアミドを用いた
場合 表６に示すように、ロドコッカスからのアミダーゼを発
現する組換体コネバクテリウムは、ｐＳＶ７３で形質転
換した対照標準細胞より、有意により高い活性を与えた
。
場合 表６に示すように、ロドコッカスからのアミダーゼを発
現する組換体コネバクテリウムは、ｐＳＶ７３で形質転
換した対照標準細胞より、有意により高い活性を与えた
。
４．図面の簡単な説明
第１図Ａ．ブレビバクテリウムＲ３１２からの精製され
たアミダーゼから得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び
内部）を示す図、 Ｂ、内部ペプチド断片から導き出され たオリゴヌクレオチドプローブの配列を示す図。
たアミダーゼから得られたペプチド配列（Ｎ−末端及び
内部）を示す図、 Ｂ、内部ペプチド断片から導き出され たオリゴヌクレオチドプローブの配列を示す図。
第２図Ａ．ブレビバクテリウムＲ３１２のアミダーゼに
由来するＮ−末端ペプチド断片からプローブＳｇ９１８
をデザインする方法を示す図、 Ｂ、特異的プローブＳｑ９１８の配列 を示す図。
由来するＮ−末端ペプチド断片からプローブＳｇ９１８
をデザインする方法を示す図、 Ｂ、特異的プローブＳｑ９１８の配列 を示す図。
第３図ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＫｐｎＩ、Ｐｓｔ
Ｉ、ＳｍａＩ及びＳｐｈＩで切断されたブレビバクテリ
ウムＲ３１２の全ゲノムＤＮＡとプローブＳｑ９１８の
ハイブリダイゼーションプロフィール、 および ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、Ｐｓ
ｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｔＩ及びＸ
ｈｏＩで切断されたブレビバクテリムＲ３１２の全ゲノ
ムＤＮＡとプローブＳｑ７６２のバイブリダイゼーショ
ンプロフィールを示す ゲル電気泳動の写真。
Ｉ、ＳｍａＩ及びＳｐｈＩで切断されたブレビバクテリ
ウムＲ３１２の全ゲノムＤＮＡとプローブＳｑ９１８の
ハイブリダイゼーションプロフィール、 および ＢａｍＨＩ、ＢｇｌＩＩ、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、Ｐｓ
ｔＩ、ＳａｌＩ、ＳｍａＩ、ＳｐｈＩ、ＳｓｔＩ及びＸ
ｈｏＩで切断されたブレビバクテリムＲ３１２の全ゲノ
ムＤＮＡとプローブＳｑ７６２のバイブリダイゼーショ
ンプロフィールを示す ゲル電気泳動の写真。
第４図 プラスミドｐＸＬ１６５０及びｐＸＬ１６５１
の制限地図を示す図。
の制限地図を示す図。
第５図 ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的ア
ミダーゼ遺伝子を含むＰｓｔＩ断片（５．４ｋｂ）の制
限地図。
ミダーゼ遺伝子を含むＰｓｔＩ断片（５．４ｋｂ）の制
限地図。
第６図 ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的ア
ミダーゼ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片の配列
決定方法を示す図。
ミダーゼ遺伝子を含むＢａｍＨＩ−ＰｓｔＩ断片の配列
決定方法を示す図。
第７図 配列決定した断片のオープン読取枠の分析法を
示す図。
示す図。
第８図 ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的ア
ミダーゼ遺伝子のヌクレオチド及びペプチド配列を示す
図。
ミダーゼ遺伝子のヌクレオチド及びペプチド配列を示す
図。
第９図 プラスミドｐＸＬ１７２４の制限地図。
第１０図 プラスミドｐＸＬ１７５１の制限地図。
第１１図 プラスミドｐＸＬ１７５２の制限地図。
第１２図 Ｅ．ｃｏｌｉＢ及びＥ．ｃｏｌｉＫ１２Ｅ１
０３Ｓ株におけるブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体
選択的アミダーゼの発現を示すクーマシーブル−染色後
の １２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
写真。
０３Ｓ株におけるブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体
選択的アミダーゼの発現を示すクーマシーブル−染色後
の １２．５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の
写真。
各レーンは、それぞれＯ．Ｄ．２．１（Ｅ１０３Ｓ）又
は０．７（Ｅ．ｃｏｌｉＢ）の培養物６０μｌに相当す
る量のタンパク質に対応する。Ｔ（超音波処理）。ｐＸ
Ｌ１０２９及びｐＸＬ９０６は、それぞれＰＲｃＩｔｓ
又はＰｔｒｐプロモーターの制御下にあるＩＬ１−β遺
伝子を含む。
は０．７（Ｅ．ｃｏｌｉＢ）の培養物６０μｌに相当す
る量のタンパク質に対応する。Ｔ（超音波処理）。ｐＸ
Ｌ１０２９及びｐＸＬ９０６は、それぞれＰＲｃＩｔｓ
又はＰｔｒｐプロモーターの制御下にあるＩＬ１−β遺
伝子を含む。
第１３図 ロドコッカスの鏡像体選択的アミダーゼ遺伝
子のヌクレオチド配列及びペプチド配列（プラスミドｐ
ＸＬ１８３６からのＢａｍＨＩ断片）を示す図。
子のヌクレオチド配列及びペプチド配列（プラスミドｐ
ＸＬ１８３６からのＢａｍＨＩ断片）を示す図。
第１４図 シャトルベクターｐＳＶ７３の制限地図を示
す図。
す図。
第１５図 発現プラスミドｐＹＧ８１１Ｂの制限地図を
示す図。
示す図。
第１６図 発現プラスミドｐＹＧ８１７Ｂの制限地図。
第１７図 発現プラスミドｐＹＧ８２２の制限地図を示
す図。
す図。
Claims (29)
- 【請求項１】鏡像体選択的アミターゼ活性を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ配列 - 【請求項２】下記群： −図８に示されるブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体
選択的 アミダーゼをコードする配列および図 １３に示されるロドコッカスの鏡像体選択的アミダーゼ
をコードする配列 −上記配列と同一の蛋白質をコードするが遺伝暗号の縮
退に基づく類似体 −上記配列の一つまたはその断片とハイブリダイズし、
鏡像体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチドをコ
ードする ＤＮＡ から選ばれる事実を特徴とする請求項１のＤＮＡ配列。 - 【請求項３】少なくとも図１３に示すアミノ酸１３７か
ら１９３までをコードする配列を含むことを特徴とする
請求項１のＤＮＡ配列。 - 【請求項４】少なくとも図８にしめす配列のコード領域
を有するＤＮＡ配列。 - 【請求項５】少なくとも図１３にしめす配列のコード領
域を有するＤＮＡ配列。 - 【請求項６】請求項１から５のいずれかに記載されたＤ
ＮＡ配列を有する遺伝子。 - 【請求項７】請求項１乃至６のいずれかに記載されたＤ
ＮＡ配列の発現によるものであって鏡像体選択的アミダ
ーゼ活性を有する新規なポリペプチド。 - 【請求項８】図８あるいは１３にしめした配列により特
徴付けられる請求項７のポリペプチド。 - 【請求項９】下記群： −図１３のアミノ酸１３７から１９３までに対応する配
列 −図８のアミノ酸１５９から２１５までに対応する配列 −上記配列と少なくとも５０％の相同性を有する配列 から選ばれる配列を最低１つは体現するものであって鏡
像体選択的アミダーゼ活性を有するポリペプチド。 - 【請求項１０】天然由来でないことを特徴とする請求項
７乃至９のいずれか１つのポリペプチド。 - 【請求項１１】請求項１から６のいずれかに記載された
ＤＮＡ配列を含みその配列が宿主細胞で確実に発現され
るためにいくつかのＤＮＡ配列のコントロール下にある
発現カセットを少なくとも１つ有する形質転換微生物。 - 【請求項１２】請求項１から６のいずれかに記載された
ＤＮＡ配列の発現を確実にするためのＤＮＡ配列が転写
および翻訳の開始領域を含むことを特徴とする請求項１
１の微生物。 - 【請求項１３】転写および翻訳の開始領域がプロモータ
ー配列とリボゾーム結合部位を含むことを特徴とする請
求項１１の微生物。 - 【請求項１４】プロモーター配列とリボゾーム結合部位
が生産されるペプチドにとって同種由来あるいは異種由
来であることができることを特徴とする請求項１３の微
生物。 - 【請求項１５】下記群： コリネバクテリウムフアージの強力なプロモーター トリプトファンオペロンのＰｔｒｐプロモーター ｌａｃオペロンのＰｌａｃプロモーターλファージのＰ
Ｌプロモーター λファージのＰＲプロモーター からプロモーター配列を選ぶことができることを特徴と
する請求項１４の微生物。 - 【請求項１６】プロモーターがトリプトファンオペロン
のＰｔｒｐプロモーターとλファージの右側プロモータ
ーＰＲｃＩｔｓから選ばれる請求項１５の微生物。 - 【請求項１７】リボゾーム結合部位がλファージのｃＩ
Ｉ遺伝子に由来するか、あるいはコリネバクテリウムの
同種遺伝子に由来する、請求項１１の微生物。 - 【請求項１８】発現カセットを担うプラスミドが選択の
手段も担っていることを特徴とする、請求項１１乃至１
７のいずれかの微生物。 - 【請求項１９】選択の手段が抗生物質の１つに耐性を与
える選択マーカーであることを特徴とする請求項１８の
微生物。 - 【請求項２０】プラスミドが、トリプトファンオペロン
のＰｔｒｐプロモーター、転写終了配列ｔＲ１を欠損し
たλファージのｃＩＩに遺伝子のリボゾーム結合部位、
ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダーゼ
をコードするＤＮＡ、およびアンピシリン耐性を与える
遺伝子を有することを特徴とする請求項１１の微生物。 - 【請求項２１】プラスミドが、λファージ温度感受性右
側プロモーターＰＲｃＩｔｓ、転写終了配列ｔＲ１を欠
損したλファージのｃＩＩ遺伝子のリボゾーム結合部位
、ブレビバクテリウムＲ３１２の鏡像体選択的アミダー
ゼをコードするＤＮＡ、およびアンピシリン耐性を与え
る遺伝子を有することを特徴とする請求項１１の微生物
。 - 【請求項２２】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ブレビバクテ
リウム、コリネバクテリウム、ロドコッカスの菌株から
選ばれることを特徴とする請求項１１乃至２１の微生物
。 - 【請求項２３】菌株がＥ．ｃｏｌｉＢあるいはＥ．ｃｏ
ｌｉＫ１２Ｅ１０３Ｓであることを特徴とする請求項２
２の微生物。 - 【請求項２４】請求項１１乃至２３の微生物をアミダー
ゼのコード配列が発現されるような条件下で培養し、培
養終了後微生物を分離しアミドーゼを抽出することを特
徴とする鏡像体選択的アミダーゼの調製方法。 - 【請求項２５】培養物を超音波破砕し、硫酸アンモニウ
ムで分画し、フェニルセフアロースで分画し、ゲル瀘過
を２回行なうことを特徴とする請求項２４の方法。 - 【請求項２６】請求項１１乃至２３のいずれかに記載の
微生物あるいは請求項７乃至１０のいずれかに記載のポ
リペプチドの存在下にラセミ体のアミドを置き、反応後
立体異性体を回収することを特徴とする、有機酸の１種
の立体異性体をその対応するラセミ体アミドから調製す
る方法。 - 【請求項２７】アミドがラセミ体の２−アリールプロピ
オンアミドであり、酸が（Ｓ）酸であることを特徴とす
る請求項２６の方法。 - 【請求項２８】ラセミ体２−アリールプロピオンアミド
がケトプロフェンのアミドであり、酸が（ｓ）酸である
ことを特徴とする請求項２７の方法。 - 【請求項２９】アミドがラセミ体２−アリールオキシプ
ロピオンアミドであり、酸が対応するＲ立体異性体であ
ることを特徴とする請求項２６の方法。
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| FR8916332A FR2655660B1 (fr) | 1989-12-11 | 1989-12-11 | Nouveaux polypeptides, sequences d'adn permettant leur expression, procede de preparation et leur utilisation. |
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| DE4244915C2 (de) * | 1992-08-14 | 1998-12-03 | Widmar Prof Dr Tanner | DNA-Moleküle codierend Proteine, die an der O-Glykosylierung von Proteinen beteiligt sind |
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