JPH04346786A - ストレプトミセス・アウレオフアシエンスからのクロロテトラサイクリンおよびテトラサイクリンの形成の生合成経路のクローニングおよびストレプトミセス・リビダンス中のその発現 - Google Patents
ストレプトミセス・アウレオフアシエンスからのクロロテトラサイクリンおよびテトラサイクリンの形成の生合成経路のクローニングおよびストレプトミセス・リビダンス中のその発現Info
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- JPH04346786A JPH04346786A JP3206176A JP20617691A JPH04346786A JP H04346786 A JPH04346786 A JP H04346786A JP 3206176 A JP3206176 A JP 3206176A JP 20617691 A JP20617691 A JP 20617691A JP H04346786 A JPH04346786 A JP H04346786A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【０００１】本発明は、ストレプトミセス・アウレオフ
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からのク
ロロテトラサイクリン、およびこうしてまた、テトラサ
イクリンの生合成の全経路をエンコードする、遺伝子ク
ラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）（ＤＮＡ）のクローニング
および異種宿主のストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のその発現のための分子の遺伝学
的技術の応用に関する。分離された遺伝子クラスター（
ＤＮＡ）は、増強した発酵の収率を生物操作するための
基質として、ならびに新規な抗生物質構造体として働く
。
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からのク
ロロテトラサイクリン、およびこうしてまた、テトラサ
イクリンの生合成の全経路をエンコードする、遺伝子ク
ラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）（ＤＮＡ）のクローニング
および異種宿主のストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のその発現のための分子の遺伝学
的技術の応用に関する。分離された遺伝子クラスター（
ＤＮＡ）は、増強した発酵の収率を生物操作するための
基質として、ならびに新規な抗生物質構造体として働く
。
【０００２】抗生物質のクロロテトラサイクリンおよび
その誘導体化合物（例えば、テトラサイクリン、デメチ
ルクロロテトラサイクリン、デメチルテトラサイクリン
）は、商業的に深部発酵においてストレプトミセス・ア
ウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）により産生される［ズガー（
Ｄｕｇａｒ）、１９４８］。この微生物の工業的操作の
３０年以上の間に、発酵の収率の有意の改良を可能とし
た、複雑な発酵技術および培地配合物が開発された［グ
ッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、１９８５］。収率の改良
のこれらの進歩は、また、抗生物質の産生能力が増加し
たストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の突然変異の分離により促進さ
れた［ベセロバ（Ｖｅｓｅｌｏｖａ）、１９６９］。こ
れらの高い産生性の菌株は、突然変異誘発法および引き
続く改良された収率についてランダムにスクリーニング
することによって、大部分分離された。同一の技術は抗
生物質の生合成においてブロッキングされた突然変異の
分離を可能とし、これらの突然変異はクロロテトラサイ
クリンの形成の生合成の配列の説明のために重要な道具
であった［マクコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）、１
９８６］。これらの達成にかかわらず、クロロテトラサ
イクリンの生合成の遺伝子の調節の理解は完全には実現
されなかった。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）の遺伝学の分野における最近の開発は、工業
的に重要な代謝物質を産生する有機体の分子遺伝学を研
究するための機会をつくった。
その誘導体化合物（例えば、テトラサイクリン、デメチ
ルクロロテトラサイクリン、デメチルテトラサイクリン
）は、商業的に深部発酵においてストレプトミセス・ア
ウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）により産生される［ズガー（
Ｄｕｇａｒ）、１９４８］。この微生物の工業的操作の
３０年以上の間に、発酵の収率の有意の改良を可能とし
た、複雑な発酵技術および培地配合物が開発された［グ
ッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）、１９８５］。収率の改良
のこれらの進歩は、また、抗生物質の産生能力が増加し
たストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の突然変異の分離により促進さ
れた［ベセロバ（Ｖｅｓｅｌｏｖａ）、１９６９］。こ
れらの高い産生性の菌株は、突然変異誘発法および引き
続く改良された収率についてランダムにスクリーニング
することによって、大部分分離された。同一の技術は抗
生物質の生合成においてブロッキングされた突然変異の
分離を可能とし、これらの突然変異はクロロテトラサイ
クリンの形成の生合成の配列の説明のために重要な道具
であった［マクコーミック（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ）、１
９８６］。これらの達成にかかわらず、クロロテトラサ
イクリンの生合成の遺伝子の調節の理解は完全には実現
されなかった。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ）の遺伝学の分野における最近の開発は、工業
的に重要な代謝物質を産生する有機体の分子遺伝学を研
究するための機会をつくった。
【０００３】ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ）の原形質体の融合および引き続く再生により染
色体のマーカーの組み換えの実証［ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）ら、１９７８およびバルツ（Ｂａｌｔｚ）
ら、１９８１］は、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）の遺伝学における重要な事象であった
。原形質体の融合の技術の開発の前に、遺伝子の交差は
実証された接合系をもつわずかの種において信頼性をも
って実施することができたのみであり［ホップウッド（
Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９６７］、今回の遺伝学的分析は
原形質体化および再生することができる任意の種におい
て実施することができる。より重要なことには、原形質
体層はプラスミドによる形質転換のために理想的なサブ
セットであることが証明され、こうしてこれらの有機体
において組み換えＤＮＡ実験を実施する機会をつくった
。いくつかの抗生物質抵抗性、例えば、チオストレプト
ファン、ビオマイシンおよびネオマイシン抵抗性の遺伝
子の分離は、生来のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ）プラスミドから容易に選択することがで
きるクローニングベクターの構成を可能とした［トンプ
ソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、１９８２］。
ｃｅｓ）の原形質体の融合および引き続く再生により染
色体のマーカーの組み換えの実証［ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）ら、１９７８およびバルツ（Ｂａｌｔｚ）
ら、１９８１］は、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）の遺伝学における重要な事象であった
。原形質体の融合の技術の開発の前に、遺伝子の交差は
実証された接合系をもつわずかの種において信頼性をも
って実施することができたのみであり［ホップウッド（
Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９６７］、今回の遺伝学的分析は
原形質体化および再生することができる任意の種におい
て実施することができる。より重要なことには、原形質
体層はプラスミドによる形質転換のために理想的なサブ
セットであることが証明され、こうしてこれらの有機体
において組み換えＤＮＡ実験を実施する機会をつくった
。いくつかの抗生物質抵抗性、例えば、チオストレプト
ファン、ビオマイシンおよびネオマイシン抵抗性の遺伝
子の分離は、生来のストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ）プラスミドから容易に選択することがで
きるクローニングベクターの構成を可能とした［トンプ
ソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）ら、１９８２］。
【０００４】クローニングすべき最初の抗生物質の生合
成遺伝子の１つは、抗生物質の色素のウンデシルプロジ
ギオシン（ＵＤＰ）の形成にに関係するＯ−メチルトラ
ンスフェラーゼであった［フェイテルソン（Ｆｅｉｔｅ
ｌｓｏｎ）ら、１９８０］。遺伝子はＵＤＰの生合成の
経路における既知の突然変異を補足するその能力により
同定された。生合成遺伝子を分離するこれらの初期の努
力において使用された他の技術は、メチレノマイシンの
ためのファージＯＣ３１を使用して突然変異のクローニ
ング［チェイター（Ｃｈａｔｅｒ）ら、１９８３］、ア
クチノマシンフェノキサジンシンセターゼについての生
体外の酵素のアッセイを使用して組み換えクローンのｓ
ｉｂ選択［ジョンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８４］およ
びカンジシンの産生に関係するｐ−アミノ安息香酸シン
セターゼにより与えられるスルホンアミドの抵抗性［ギ
ル（Ｇｉｌ）ら、１９８３］を包含した。バイアラフォ
ス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）の生合成遺伝子は、ブロッキ
ングされた突然変異の相補性を経て同定された［ムラカ
ミら、１９８６］。
成遺伝子の１つは、抗生物質の色素のウンデシルプロジ
ギオシン（ＵＤＰ）の形成にに関係するＯ−メチルトラ
ンスフェラーゼであった［フェイテルソン（Ｆｅｉｔｅ
ｌｓｏｎ）ら、１９８０］。遺伝子はＵＤＰの生合成の
経路における既知の突然変異を補足するその能力により
同定された。生合成遺伝子を分離するこれらの初期の努
力において使用された他の技術は、メチレノマイシンの
ためのファージＯＣ３１を使用して突然変異のクローニ
ング［チェイター（Ｃｈａｔｅｒ）ら、１９８３］、ア
クチノマシンフェノキサジンシンセターゼについての生
体外の酵素のアッセイを使用して組み換えクローンのｓ
ｉｂ選択［ジョンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、１９８４］およ
びカンジシンの産生に関係するｐ−アミノ安息香酸シン
セターゼにより与えられるスルホンアミドの抵抗性［ギ
ル（Ｇｉｌ）ら、１９８３］を包含した。バイアラフォ
ス（ｂｉａｌａｐｈｏｓ）の生合成遺伝子は、ブロッキ
ングされた突然変異の相補性を経て同定された［ムラカ
ミら、１９８６］。
【０００５】アクチノルホジンの生合成に関係する遺伝
子を、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の生合成的にブ
ロッキングされた突然変異の相補性によりクローニング
された［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１
９８４］。この最後の場合において、異種ストレプトミ
セス・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａ
ｒｖｕｌｕｓ）の宿主の中に導入したとき、アクチノル
ホジンを合成する能力を与えることが示された単一のプ
ラスミド上で、突然変異の２つのオーバーラッピングす
るクローンの相補的な明確なクラスを組み合わせた。
子を、ストレプトミセス・ケリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）の生合成的にブ
ロッキングされた突然変異の相補性によりクローニング
された［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１
９８４］。この最後の場合において、異種ストレプトミ
セス・パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａ
ｒｖｕｌｕｓ）の宿主の中に導入したとき、アクチノル
ホジンを合成する能力を与えることが示された単一のプ
ラスミド上で、突然変異の２つのオーバーラッピングす
るクローンの相補的な明確なクラスを組み合わせた。
【０００６】観測の他の重要な系列は、抗生物質の生合
成のための遺伝子が産生性有機体中の同一の抗生物質に
ついて抵抗性の抗原決定基に連鎖されていることであっ
た。こうして、ストレプトマイシン抵抗性を与えるスト
レプトミセス・グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）からのＤＮＡ断
片は、生合成のブロックを補足するＤＮＡと隣接するこ
とが示された［ディストラー（Ｄｉｓｔｌｅｒ）ら、１
９８５］。同一の場合はストレプトミセス・フラジアエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）にお
いて見られ、ここでチロシンび生合成の経路において最
終の酵素のアミノ末端のためのＤＮＡ配列を表すように
構成した、混合塩基のオリゴヌクレオチドに対する相同
性について、コスミドのライブラリーをプロービングす
ることによって、生合成遺伝子を同定した［フィッシュ
マン（Ｆｉｓｈｍａｎ）ら、１９８９］。前にクローニ
ングされたチロシン抵抗性遺伝子（ｔｌｒＢ）は、９つ
のクラスのブロッキングされた突然変異を補足するＤＮ
Ａのこの領域内に含有されることが示された［バルツ（
Ｂａｌｔｚ）ら、１９８８］。プロマイシン［バル（Ｖ
ａｒ）２ら、１９８８］およびテトラセノマイシン［モ
タメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら、１９８７］の場合にお
いて、異種宿主のストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中の抗生
物質抵抗性遺伝子の発現についての第１選択は、同一の
クローニングしたＤＮＡ断片上に位置する抗生物質の生
合成遺伝子の引き続く同定を可能とした。
成のための遺伝子が産生性有機体中の同一の抗生物質に
ついて抵抗性の抗原決定基に連鎖されていることであっ
た。こうして、ストレプトマイシン抵抗性を与えるスト
レプトミセス・グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）からのＤＮＡ断
片は、生合成のブロックを補足するＤＮＡと隣接するこ
とが示された［ディストラー（Ｄｉｓｔｌｅｒ）ら、１
９８５］。同一の場合はストレプトミセス・フラジアエ
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｆｒａｄｉａｅ）にお
いて見られ、ここでチロシンび生合成の経路において最
終の酵素のアミノ末端のためのＤＮＡ配列を表すように
構成した、混合塩基のオリゴヌクレオチドに対する相同
性について、コスミドのライブラリーをプロービングす
ることによって、生合成遺伝子を同定した［フィッシュ
マン（Ｆｉｓｈｍａｎ）ら、１９８９］。前にクローニ
ングされたチロシン抵抗性遺伝子（ｔｌｒＢ）は、９つ
のクラスのブロッキングされた突然変異を補足するＤＮ
Ａのこの領域内に含有されることが示された［バルツ（
Ｂａｌｔｚ）ら、１９８８］。プロマイシン［バル（Ｖ
ａｒ）２ら、１９８８］およびテトラセノマイシン［モ
タメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら、１９８７］の場合にお
いて、異種宿主のストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔ
ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中の抗生
物質抵抗性遺伝子の発現についての第１選択は、同一の
クローニングしたＤＮＡ断片上に位置する抗生物質の生
合成遺伝子の引き続く同定を可能とした。
【０００７】核酸プローブの使用は、生合成遺伝子の分
離を促進した。このアプローチは、実施した経路または
前のクローニングに関する情報の前に存在する内容の存
在に依存する。こうして、上のチロシンの場合において
、生合成酵素の部分的アミノ酸配列からの情報を使用し
てプローブを構成した［フィッシュマン（Ｆｉｓｈｍａ
ｎ）ら、１９８７］。同様に、イソペニシリンＮシンセ
ターゼのための遺伝子は、酵素のＮ末端のアミノ酸配列
の知識を使用して構成したオリゴヌクレオチドのプロー
ブに対してハイブリダイゼーションするクローンを同定
することによって、ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
）からクローニングした［レスキウ（Ｌｅｓｋｉｗ）、
１９８８］。エリスロマイシンの生合成に関係する遺伝
子は、コスミドのライブラリーを前にクローニングした
エリスロマイシン抵抗性遺伝子でプロービングすること
によって同定された［スタンザク（Ｓｔａｎｚａｋ）、
１９８６］。同様に、オキシテトラサイクリンの生合成
に関係する遺伝子は、前にクローニングされた抵抗性抗
原決定基［バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、１９８９］お
よび生合成酵素のアンヒドロテトラサイクリンオキシゲ
ナーゼの部分的に説明されたアミノ酸配列に相当するＤ
ＮＡ配列を表すように合成されたオリゴヌクレオチド［
ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）ら、１９８９］の両者に対し
てハイブリダイゼーションすることによって同定された
。異種ａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプローブの使用は、
ストレプトミセス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）中のアントラサイクリ
ン生合成に関係する遺伝子の同定を可能とした［スツッ
ツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗ
ａｌｌ）ら、１９８９］。
離を促進した。このアプローチは、実施した経路または
前のクローニングに関する情報の前に存在する内容の存
在に依存する。こうして、上のチロシンの場合において
、生合成酵素の部分的アミノ酸配列からの情報を使用し
てプローブを構成した［フィッシュマン（Ｆｉｓｈｍａ
ｎ）ら、１９８７］。同様に、イソペニシリンＮシンセ
ターゼのための遺伝子は、酵素のＮ末端のアミノ酸配列
の知識を使用して構成したオリゴヌクレオチドのプロー
ブに対してハイブリダイゼーションするクローンを同定
することによって、ストレプトミセス・クラブリゲルス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｌａｖｕｌｉｇｅｒｕｓ
）からクローニングした［レスキウ（Ｌｅｓｋｉｗ）、
１９８８］。エリスロマイシンの生合成に関係する遺伝
子は、コスミドのライブラリーを前にクローニングした
エリスロマイシン抵抗性遺伝子でプロービングすること
によって同定された［スタンザク（Ｓｔａｎｚａｋ）、
１９８６］。同様に、オキシテトラサイクリンの生合成
に関係する遺伝子は、前にクローニングされた抵抗性抗
原決定基［バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）ら、１９８９］お
よび生合成酵素のアンヒドロテトラサイクリンオキシゲ
ナーゼの部分的に説明されたアミノ酸配列に相当するＤ
ＮＡ配列を表すように合成されたオリゴヌクレオチド［
ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）ら、１９８９］の両者に対し
てハイブリダイゼーションすることによって同定された
。異種ａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプローブの使用は、
ストレプトミセス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ ｐｅｕｃｅｔｉｕｓ）中のアントラサイクリ
ン生合成に関係する遺伝子の同定を可能とした［スツッ
ツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔｚｍａｎ−Ｅｎｇｗ
ａｌｌ）ら、１９８９］。
【０００８】これらの技術を個々にまたは組み合わせて
使用すると、全体の生合成の経路の分離またはアセング
リングを可能となり、そしてある場合において、異種宿
主中のそれらの発現が可能となった。ビアラフォスのた
めの全生合成クラスターは、相補的活性についての選択
およびビアラフォス抵抗性の異種発現の組み合わせによ
りクローニングされた（ムラカミら、１９８６］。ビア
ラフォス抵抗性について選択することによって、ストレ
プトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中で単一工程で全経路を首尾よく
分離することについて記載されたが、生合成遺伝子の発
現に関して述べられていない。相補的クローンからのア
クチノルホジンのクラスターおよびストレプトミセス・
パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕ
ｌｕｓ）中のその発現のアセンブリーは、上で論じられ
た［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１９８
４］。相同的に誘導されたエリスロマイシン抵抗性抗原
決定基に対してハイブリダイゼーションした２機能性コ
スミドのクローンは、サッカロポリスポラ・エリスレア
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈ
ｒｅａ）のライブラリーから分離され、そしてストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）に移したとき、エリスロマイシンの
合成を指令することが示された［スタンザク（Ｓｔａｎ
ｚａｋ）ら、１９８６］。オキシテトラサイクリン抵抗
性遺伝子のプローブおよび生合成遺伝子のプローブ（ア
ンヒドロテトラサイクリンオキシゲナーゼのための）の
両者に対するハイブリダイゼーションを示したＥ．ｃｏ
ｌｉコスミドは、ストレプトミセス・リモスス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）からオキシテ
トラサイクリンの生合成クラスターの分離を可能とした
［ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）ら、１９８９］。ストレプ
トミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプラスミド
のベクターの中への引き続くサブクローニングは、スト
レプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のオキシテトラサイクリンの
産生を可能とした。
使用すると、全体の生合成の経路の分離またはアセング
リングを可能となり、そしてある場合において、異種宿
主中のそれらの発現が可能となった。ビアラフォスのた
めの全生合成クラスターは、相補的活性についての選択
およびビアラフォス抵抗性の異種発現の組み合わせによ
りクローニングされた（ムラカミら、１９８６］。ビア
ラフォス抵抗性について選択することによって、ストレ
プトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中で単一工程で全経路を首尾よく
分離することについて記載されたが、生合成遺伝子の発
現に関して述べられていない。相補的クローンからのア
クチノルホジンのクラスターおよびストレプトミセス・
パルブルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐａｒｖｕ
ｌｕｓ）中のその発現のアセンブリーは、上で論じられ
た［マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）ら、１９８
４］。相同的に誘導されたエリスロマイシン抵抗性抗原
決定基に対してハイブリダイゼーションした２機能性コ
スミドのクローンは、サッカロポリスポラ・エリスレア
（Ｓａｃｃｈａｒｏｐｏｌｙｓｐｏｒａ ｅｒｙｔｈ
ｒｅａ）のライブラリーから分離され、そしてストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）に移したとき、エリスロマイシンの
合成を指令することが示された［スタンザク（Ｓｔａｎ
ｚａｋ）ら、１９８６］。オキシテトラサイクリン抵抗
性遺伝子のプローブおよび生合成遺伝子のプローブ（ア
ンヒドロテトラサイクリンオキシゲナーゼのための）の
両者に対するハイブリダイゼーションを示したＥ．ｃｏ
ｌｉコスミドは、ストレプトミセス・リモスス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ）からオキシテ
トラサイクリンの生合成クラスターの分離を可能とした
［ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）ら、１９８９］。ストレプ
トミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のプラスミド
のベクターの中への引き続くサブクローニングは、スト
レプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ
ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のオキシテトラサイクリンの
産生を可能とした。
【０００９】テトラセノマイシンの産生体からの２つの
オーバーラッピングするクローンは、ストレプトミセス
・グラウセセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌ
ａｕｃｅｓｃｅｎｓ）のブロッキングした突然変異の相
補性およびストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）中のテトラセノマイシン抵抗性を与える能
力により同定された［モタメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら
、１９８７］。両者がストレプトミセス・リビダンス（
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の中に別々に存在し、そして同
時に発酵するときか、あるいはそれらが同一のストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主の
中に同時に存在するとき、テトラセノマイシンは産生さ
れた。ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒ）のａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプローブ
に対するハイブリダイゼーションにより、ストレプトミ
セス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｅｕ
ｃｅｔｉｕｓ）のＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉライブラリーか
ら分離された２機能性クローンは、ストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の中に導入すると
き、色素を添加された抗生物質の合成を指令することが
示された［スツッツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔｚ
ｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）、１９８９］。
オーバーラッピングするクローンは、ストレプトミセス
・グラウセセンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｌ
ａｕｃｅｓｃｅｎｓ）のブロッキングした突然変異の相
補性およびストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）中のテトラセノマイシン抵抗性を与える能
力により同定された［モタメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）ら
、１９８７］。両者がストレプトミセス・リビダンス（
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の中に別々に存在し、そして同
時に発酵するときか、あるいはそれらが同一のストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主の
中に同時に存在するとき、テトラセノマイシンは産生さ
れた。ストレプトミセス・コエリコロル（Ｓ．ｃｏｅｌ
ｉｃｏｌｏｒ）のａｃｔＩおよびａｃｔＩＩＩプローブ
に対するハイブリダイゼーションにより、ストレプトミ
セス・ペウセチウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｐｅｕ
ｃｅｔｉｕｓ）のＤＮＡのＥ．ｃｏｌｉライブラリーか
ら分離された２機能性クローンは、ストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の中に導入すると
き、色素を添加された抗生物質の合成を指令することが
示された［スツッツマン−エングウォール（Ｓｔｕｔｚ
ｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）、１９８９］。
【００１０】さらに、セプタマイシンＣの産生のための
生合成の経路の分離は起こった［チェン（Ｃｈｅｎ）ら
、１９８８］。この場合において、ストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のランダムクロ
ーンは、寒天プラグ発酵法を使用してセファマイシンＣ
の産生について個々にスクリーニングされた。スクリー
ニングされた３０，０００のうちのストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の１つの形質転換
体は、セファマイシンＣを産生することが示された。
生合成の経路の分離は起こった［チェン（Ｃｈｅｎ）ら
、１９８８］。この場合において、ストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のランダムクロ
ーンは、寒天プラグ発酵法を使用してセファマイシンＣ
の産生について個々にスクリーニングされた。スクリー
ニングされた３０，０００のうちのストレプトミセス・
リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の１つの形質転換
体は、セファマイシンＣを産生することが示された。
【００１１】本発明は、テトラサイクリンおよびクロロ
テトラサイクリンを産生するための生合成の経路に関係
するＤＮＡ遺伝子を分離しそして利用する最初の場合で
ある。
テトラサイクリンを産生するための生合成の経路に関係
するＤＮＡ遺伝子を分離しそして利用する最初の場合で
ある。
【００１２】本発明は、ストレプトミセス・アウレオフ
ァシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏ
ｆａｃｉｅｎｓ）からのテトラサイクリンおよびクロロ
テトラサイクリンの形成のための全生合成経路のクロー
ニングおよび異種宿主のストレプトミセス・リビダンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中
のその発現に関する。したがって、本発明は、これらの
抗生物質、すなわち、クロロテトラサイクリンおよびテ
トラサイクリンを産生する生合成経路の遺伝情報を指定
する、分離されたＤＮＡ遺伝子（クラスター）に関し、
そしてこの分野において知られている厳格なハイブリダ
イゼーション条件下に、クロロテトラサイクリンおよび
テトラサイクリンの形成のための経路をエンコードする
ＤＮＡの分離した遺伝子クラスターにハイブリダイゼー
ションするＤＮＡに関する。さらに、本発明は、これら
の抗生物質の収率を増加するためにこれらの遺伝子を使
用すること、そしてテトラサイクリンおよびクロロテト
ラサイクリンに対する新規な類似体の産生についてスク
リーニングする方法において使用することに関する。
ァシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏ
ｆａｃｉｅｎｓ）からのテトラサイクリンおよびクロロ
テトラサイクリンの形成のための全生合成経路のクロー
ニングおよび異種宿主のストレプトミセス・リビダンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中
のその発現に関する。したがって、本発明は、これらの
抗生物質、すなわち、クロロテトラサイクリンおよびテ
トラサイクリンを産生する生合成経路の遺伝情報を指定
する、分離されたＤＮＡ遺伝子（クラスター）に関し、
そしてこの分野において知られている厳格なハイブリダ
イゼーション条件下に、クロロテトラサイクリンおよび
テトラサイクリンの形成のための経路をエンコードする
ＤＮＡの分離した遺伝子クラスターにハイブリダイゼー
ションするＤＮＡに関する。さらに、本発明は、これら
の抗生物質の収率を増加するためにこれらの遺伝子を使
用すること、そしてテトラサイクリンおよびクロロテト
ラサイクリンに対する新規な類似体の産生についてスク
リーニングする方法において使用することに関する。
【００１３】生合成遺伝子の分離を進行させるために、
テトラサイクリン抵抗性を発現するクローンのための組
み換えストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）のスクリーンを使用する。ライブラリーからな
る組み換えコスミドにおけるストレプトミセス・アウレ
オファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮ
Ａインサートは必然的に大きい。なぜなら、使用する試
験管内のラムダのパッケージング系の拘束は、生存能力
のある形質導入性ファージ粒子を生ずるために、２５〜
４０ＫｂのＤＮＡインサートをもつコスミド分子を必要
とするからである。テトラサイクリン抵抗性のクローン
をストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ゲノムのクローンのこの集団か
ら選択するとき、制限されたサブセットのコスミドのク
ローンが選択される。これらの多くまたはすべては、選
択したテトラサイクリン抵抗性遺伝子に連鎖した抗生物
質生合成遺伝子を含有することが期待される。十分に大
きくかつ正しく位置するものには、全生合成経路を包含
するサブセットが存在する。こうして、テトラサイクリ
ンおよびクロロテトラサイクリンの形成のための遺伝子
、および事実遺伝子のすべてのクローニングは、領域の
構造または配列の前以て存在する知識なしに可能である
。ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）から
のテトラサイクリン抵抗性の抗原決定基［レイネス（Ｒ
ｅｙｎｅｓ）ら、１９８８］およびブロモペルオキシダ
ーゼ［バム・ピー（Ｖａｍ Ｐｅｅ）、１９８８］の
クローニングに関する報告は発表されたが、これらの研
究はクロロテトラサイクリン生合成遺伝子または全遺伝
子クラスターの分離にまったく拡張されていない。
テトラサイクリン抵抗性を発現するクローンのための組
み換えストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）のスクリーンを使用する。ライブラリーからな
る組み換えコスミドにおけるストレプトミセス・アウレ
オファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮ
Ａインサートは必然的に大きい。なぜなら、使用する試
験管内のラムダのパッケージング系の拘束は、生存能力
のある形質導入性ファージ粒子を生ずるために、２５〜
４０ＫｂのＤＮＡインサートをもつコスミド分子を必要
とするからである。テトラサイクリン抵抗性のクローン
をストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕ
ｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ゲノムのクローンのこの集団か
ら選択するとき、制限されたサブセットのコスミドのク
ローンが選択される。これらの多くまたはすべては、選
択したテトラサイクリン抵抗性遺伝子に連鎖した抗生物
質生合成遺伝子を含有することが期待される。十分に大
きくかつ正しく位置するものには、全生合成経路を包含
するサブセットが存在する。こうして、テトラサイクリ
ンおよびクロロテトラサイクリンの形成のための遺伝子
、および事実遺伝子のすべてのクローニングは、領域の
構造または配列の前以て存在する知識なしに可能である
。ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅ
ｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）から
のテトラサイクリン抵抗性の抗原決定基［レイネス（Ｒ
ｅｙｎｅｓ）ら、１９８８］およびブロモペルオキシダ
ーゼ［バム・ピー（Ｖａｍ Ｐｅｅ）、１９８８］の
クローニングに関する報告は発表されたが、これらの研
究はクロロテトラサイクリン生合成遺伝子または全遺伝
子クラスターの分離にまったく拡張されていない。
【００１４】本発明のより詳細な説明を実施例を通して
下に記載する。これらの実施例は本発明の例示であり、
そして本発明を限定しない。
下に記載する。これらの実施例は本発明の例示であり、
そして本発明を限定しない。
【００１５】ＤＮＡの分離に使用する方法は、浸透緩衝
液中の細胞のリゾチーム消化、引き続くおだやかな溶菌
、タンパク質の抽出および高分子量のＤＮＡの濃縮を包
含する。記載する方法は効率よいが、当業者は認識する
ように、種々の別の手順、例えば、ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）ら、１９８５により記載されている手順を
使用してことができる。
液中の細胞のリゾチーム消化、引き続くおだやかな溶菌
、タンパク質の抽出および高分子量のＤＮＡの濃縮を包
含する。記載する方法は効率よいが、当業者は認識する
ように、種々の別の手順、例えば、ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）ら、１９８５により記載されている手順を
使用してことができる。
【００１６】実施例において使用する全体のＤＮＡ源は
ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１３８９９であるが、本発明はこの特定の源にまった
く限定ない。テトラサイクリンのクラスの抗生物質を産
生する種々の他のストレプトミセス・アウレオファシエ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃ
ｉｅｎｓ）株を本発明において等しく首尾よく使用する
ことができる。これらのストレプトミセス・アウレオフ
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）株は、次
のものを包含する：クロロテトラサイクリン、テトラサ
イクリン、６−デメチルクロロテトラサイクリン、６−
デメチルテトラサイクリン、７−クロロ−５ａ，１１ａ
−デヒドロテトラサイクリン、２−デカルボキシアミド
−２−アセチルテトラサイクリンおよびテトラサイクリ
ン族の化合物の他の構成員を産生する突然変異株および
別の野生型分離物。本発明は、また、このような化合物
を産生する他の有機体からクロロテトラサイクリン、テ
トラサイクリンおよびテトラサイクリン関係化合物のク
ローニングに関し、このような有機体は次のものを包含
するが、これらに限定されない：ストレプトミセス・リ
モスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ
）、ストレプトミセス・アベラネウス（Ｓ．ａｖｅｌｌ
ａｎｅｕｓ）、ストレプトミセス・ルシタヌス（Ｓ．ｌ
ｕｓｉｔａｎｕｓ）、ストレプトミセス・ビリジファシ
エンス（Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプ
トミセス・プサモチクス（Ｓ．ｐｓａｍｍｏｔｉｃｕｓ
）、アクチノマヅラ・ブルンネア（Ａｃｔｉｎｏｍａｄ
ｕｒａ ｂｒｕｎｎｅａ）、およびダクチロスポラン
ギウム・ベスカ（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
ｖｅｓｃａ）。
ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１３８９９であるが、本発明はこの特定の源にまった
く限定ない。テトラサイクリンのクラスの抗生物質を産
生する種々の他のストレプトミセス・アウレオファシエ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃ
ｉｅｎｓ）株を本発明において等しく首尾よく使用する
ことができる。これらのストレプトミセス・アウレオフ
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）株は、次
のものを包含する：クロロテトラサイクリン、テトラサ
イクリン、６−デメチルクロロテトラサイクリン、６−
デメチルテトラサイクリン、７−クロロ−５ａ，１１ａ
−デヒドロテトラサイクリン、２−デカルボキシアミド
−２−アセチルテトラサイクリンおよびテトラサイクリ
ン族の化合物の他の構成員を産生する突然変異株および
別の野生型分離物。本発明は、また、このような化合物
を産生する他の有機体からクロロテトラサイクリン、テ
トラサイクリンおよびテトラサイクリン関係化合物のク
ローニングに関し、このような有機体は次のものを包含
するが、これらに限定されない：ストレプトミセス・リ
モスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｒｉｍｏｓｕｓ
）、ストレプトミセス・アベラネウス（Ｓ．ａｖｅｌｌ
ａｎｅｕｓ）、ストレプトミセス・ルシタヌス（Ｓ．ｌ
ｕｓｉｔａｎｕｓ）、ストレプトミセス・ビリジファシ
エンス（Ｓ．ｖｉｒｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、ストレプ
トミセス・プサモチクス（Ｓ．ｐｓａｍｍｏｔｉｃｕｓ
）、アクチノマヅラ・ブルンネア（Ａｃｔｉｎｏｍａｄ
ｕｒａ ｂｒｕｎｎｅａ）、およびダクチロスポラン
ギウム・ベスカ（Ｄａｃｔｙｌｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ
ｖｅｓｃａ）。
【００１７】２機能性コスミドベクターのアームのそれ
らに対して相同性の末端をもつ、所望の３５キロ塩基の
大きさの領域の大きいＤＮＡ断片を発生する、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを使用してストレプトミセス
・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ
ｓ）ＤＮＡの部分的消化を使用する。この場合において
、最適な消化の条件の実験的決定は、１系列の消化を実
施し、そしてアガロースゲルの電気泳動により最終産生
物の試料を分析することによって実施される。当業者は
、別のライブラリーの構成および問題のクローニングし
たＤＮＡの回収法を認識している。Ｅ．ｃｏｌｉの使用
、ならびに試料のラムダパッケージングにより付与され
た大きさの選択は、他のベクターの使用は同様によく有
用であるので、本発明を限定しない。当業者は認識する
ように、１機能性ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）ベクター、例えば、ｐＩＪ９２２［リジエ
イト（Ｌｙｄｉａｔｅ）ら、１９８５］を本発明におい
て使用することができるが、ただしライブラリーの構成
および組み換えプラスミドの回収はアクチノミセテス（
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中で実施する。
らに対して相同性の末端をもつ、所望の３５キロ塩基の
大きさの領域の大きいＤＮＡ断片を発生する、制限エン
ドヌクレアーゼＳａｕ３Ａを使用してストレプトミセス
・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎ
ｓ）ＤＮＡの部分的消化を使用する。この場合において
、最適な消化の条件の実験的決定は、１系列の消化を実
施し、そしてアガロースゲルの電気泳動により最終産生
物の試料を分析することによって実施される。当業者は
、別のライブラリーの構成および問題のクローニングし
たＤＮＡの回収法を認識している。Ｅ．ｃｏｌｉの使用
、ならびに試料のラムダパッケージングにより付与され
た大きさの選択は、他のベクターの使用は同様によく有
用であるので、本発明を限定しない。当業者は認識する
ように、１機能性ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）ベクター、例えば、ｐＩＪ９２２［リジエ
イト（Ｌｙｄｉａｔｅ）ら、１９８５］を本発明におい
て使用することができるが、ただしライブラリーの構成
および組み換えプラスミドの回収はアクチノミセテス（
ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中で実施する。
【００１８】実施例において用いる工程は、コスミドの
アームおよび大きさで分画したＤＮＡの結合産生物の試
験管内パッケージング、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔ
への形質導入、形質導入体の集団の収集およびそれらか
らＤＮＡを分離してコスミドのライブラリーを形成する
ことを包含する。使用する方法を記載するが、本発明は
実施例に記載するものにより限定されない。別法を同一
の目的に使用することができ、不都合な結果は得られな
い。こうして、結合および試験管内パッケージングのた
めに別のプロトコルを使用することができ、ならびに別
の組み換え欠損（ｒｅｃＡ）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主、ライブ
ラリー増幅手順（例えば、選択的ブロスの生長）および
プラスミド調製手順を使用することができ、それらのす
べては特定の文献に発表されている［マニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］。
アームおよび大きさで分画したＤＮＡの結合産生物の試
験管内パッケージング、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔ
への形質導入、形質導入体の集団の収集およびそれらか
らＤＮＡを分離してコスミドのライブラリーを形成する
ことを包含する。使用する方法を記載するが、本発明は
実施例に記載するものにより限定されない。別法を同一
の目的に使用することができ、不都合な結果は得られな
い。こうして、結合および試験管内パッケージングのた
めに別のプロトコルを使用することができ、ならびに別
の組み換え欠損（ｒｅｃＡ）Ｅ．ｃｏｌｉ宿主、ライブ
ラリー増幅手順（例えば、選択的ブロスの生長）および
プラスミド調製手順を使用することができ、それらのす
べては特定の文献に発表されている［マニアチス（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ）ら、１９８２］。
【００１９】実施例における引き続く工程は、プールし
たコスミドＤＮＡ調製物のストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）
の中への導入、細胞ライブラリーの発生および１００μ
ｇのテトラサイクリン／ｍｌに対する抵抗性を示すスト
レプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の
形質転換体についてのこのようなライブラリーの引き続
くスクリーニングを記載する。より労力を要するが、形
質転換体をレプリカのプレイティングによりテトラサイ
クリン抵抗性について直接スクリーニングすることがで
きるであろう。別のレベルのテトラサイクリンを、宿主
または源の有機体が示す生来の抵抗性により指図される
ように、スクリーニングのために使用することができる
であろう。他のテトラサイクリン感受性の、非制限的宿
主、例えば、ストレプトミセス・グリセオフスクス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
）をストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）の代わりに使用することができるであろう。
たコスミドＤＮＡ調製物のストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）
の中への導入、細胞ライブラリーの発生および１００μ
ｇのテトラサイクリン／ｍｌに対する抵抗性を示すスト
レプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の
形質転換体についてのこのようなライブラリーの引き続
くスクリーニングを記載する。より労力を要するが、形
質転換体をレプリカのプレイティングによりテトラサイ
クリン抵抗性について直接スクリーニングすることがで
きるであろう。別のレベルのテトラサイクリンを、宿主
または源の有機体が示す生来の抵抗性により指図される
ように、スクリーニングのために使用することができる
であろう。他のテトラサイクリン感受性の、非制限的宿
主、例えば、ストレプトミセス・グリセオフスクス（Ｓ
ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ
）をストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）の代わりに使用することができるであろう。
【００２０】次に、テトラサイクリン抵抗性ストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）からプラ
スミドＤＮＡを分離し、次いで前記ＤＮＡを試験管内パ
ッケージングし、そしてＥ．ｃｏｌｉの中に形質導入す
ることによって、組み換えプラスミドが得られる。この
ような形質導入体から分離されたプラスミドＤＮＡを、
制限酵素のマッピングの分析により特性決定する；そし
て実施例において分離された２つのプラスミド、ＬＰ２
１２７およびＬＰ２１２８、は、同等の構造を有するこ
とが示された。当業者は認識するように、別の有機体か
らクローニングした同様なＤＮＡ領域は制限部位の配置
において多形性を示すが、テトラサイクリン抵抗性を与
える十分に大きいＤＮＡ断片は後述する性質を与えるこ
とが期待されるであろう。
ミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）からプラ
スミドＤＮＡを分離し、次いで前記ＤＮＡを試験管内パ
ッケージングし、そしてＥ．ｃｏｌｉの中に形質導入す
ることによって、組み換えプラスミドが得られる。この
ような形質導入体から分離されたプラスミドＤＮＡを、
制限酵素のマッピングの分析により特性決定する；そし
て実施例において分離された２つのプラスミド、ＬＰ２
１２７およびＬＰ２１２８、は、同等の構造を有するこ
とが示された。当業者は認識するように、別の有機体か
らクローニングした同様なＤＮＡ領域は制限部位の配置
において多形性を示すが、テトラサイクリン抵抗性を与
える十分に大きいＤＮＡ断片は後述する性質を与えるこ
とが期待されるであろう。
【００２１】テトラサイクリン抵抗性のプラスミドを有
する性質は、ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８を使用し
て得られたストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）のチオストレプトン抵抗性の形質転換体が
またテトラサイクリン抵抗性であることを実証すること
によって確証される。テトラサイクリン様抗生物質の緻
密さは、Ｅ．ｃｏｌｉに対して有効であるが、テトラサ
イクリン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉに対してそれほど有効では
ない抗生物質活性をもつ、前述のチオストレプトンおよ
びテトラサイクリン抵抗性ストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）による寒天上の産生により
実証される。
する性質は、ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８を使用し
て得られたストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖ
ｉｄａｎｓ）のチオストレプトン抵抗性の形質転換体が
またテトラサイクリン抵抗性であることを実証すること
によって確証される。テトラサイクリン様抗生物質の緻
密さは、Ｅ．ｃｏｌｉに対して有効であるが、テトラサ
イクリン抵抗性Ｅ．ｃｏｌｉに対してそれほど有効では
ない抗生物質活性をもつ、前述のチオストレプトンおよ
びテトラサイクリン抵抗性ストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）による寒天上の産生により
実証される。
【００２２】最後に、テトラサイクリンの合成は、異種
宿主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のＬＰ２１２７によ
り指令されることが実証された。これは寒天およびブロ
スの両者の発酵において達成される。本来分離されたテ
トラサイクリン抵抗性ストレプトミセス・リビダンス（
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）およびストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＬＰ２１２７形質転
換体の両者は、同一産生物がＤＮＡ源の有機体のストレ
プトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３
８９９から分離される条件下に、テトラサイクリンおよ
びクロロテトラサイクリンを産生する。他方において、
挿入されたＤＮＡをもたず、プラスミドベクターのみを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）形質転換体は、抗生物質の産生を示さない。
宿主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中のＬＰ２１２７によ
り指令されることが実証された。これは寒天およびブロ
スの両者の発酵において達成される。本来分離されたテ
トラサイクリン抵抗性ストレプトミセス・リビダンス（
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）およびストレプトミセス・リビ
ダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＬＰ２１２７形質転
換体の両者は、同一産生物がＤＮＡ源の有機体のストレ
プトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣＣ１３
８９９から分離される条件下に、テトラサイクリンおよ
びクロロテトラサイクリンを産生する。他方において、
挿入されたＤＮＡをもたず、プラスミドベクターのみを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）形質転換体は、抗生物質の産生を示さない。
【００２３】異種宿主によるテトラサイクリンの産生の
実証は、実施例に記載する発酵条件またはＨＰＬＣ分析
系に限定されず、これらは明瞭に効率よい分析を可能と
する。テトラサイクリンの発酵および分析の多数の手順
を記載されてきており、そしてここにおいて代わりに使
用することができる。また、ストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
）を実施例において異種宿主として使用するが、抗生物
質生合成遺伝子の異種発現はある数のアクチノミセテス
（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）および他のバクテリア
群において期待され、これらは次のものを包含するが、
これらに限定されない：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）、コルネバクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ
）、サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ）、ただしそれらはここに記載する比較的
大きいプラスミド構成体で形質転換されることを条件と
する。形質転換されるものは、例えば、比較的非制限的
であることが知られている、ストレプトミセス・グリセ
オフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ）およびストレプトミセス・アンボフチ
スス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃｈ
ｓｕｓ）を包含する。
実証は、実施例に記載する発酵条件またはＨＰＬＣ分析
系に限定されず、これらは明瞭に効率よい分析を可能と
する。テトラサイクリンの発酵および分析の多数の手順
を記載されてきており、そしてここにおいて代わりに使
用することができる。また、ストレプトミセス・リビダ
ンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ
）を実施例において異種宿主として使用するが、抗生物
質生合成遺伝子の異種発現はある数のアクチノミセテス
（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）および他のバクテリア
群において期待され、これらは次のものを包含するが、
これらに限定されない：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
）、コルネバクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ
）、サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎ
ｏｍｙｃｅｓ）、ただしそれらはここに記載する比較的
大きいプラスミド構成体で形質転換されることを条件と
する。形質転換されるものは、例えば、比較的非制限的
であることが知られている、ストレプトミセス・グリセ
オフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅ
ｏｆｕｓｃｕｓ）およびストレプトミセス・アンボフチ
スス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃｈ
ｓｕｓ）を包含する。
【００２４】
【実施例】実施例１：ストレプトミセス・アウレオファ
シエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆ
ａｃｉｅｎｓ）の全体のＤＮＡの調製 ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１３８９９の凍結乾燥した調製物を、０．８ｍｌの１
×合成塩溶液（６ｇのＮａ２ＨＰＯ４／、３ｇのＫＨ２
ＰＯ４／ｌ、０．５７ｇのクエン酸ナトリウム／ｌ）の
中に懸濁し、そしてベネット寒天（１ｇの酵母エキス／
ｌ、２ｇのＮＺ−アミンＡ／ｌ、１ｇのビーフエキス／
ｌ、２０ｇのＤ−グルコース／ｌ、２０ｇのバクト寒天
／ｌ）上のプレイティングした。２８℃において２日間
インキュベーションした後、単一のプレートからの細胞
を５ｍｌのトリプシン大豆ブロス［ディフコ（Ｄｉｆｃ
ｏ）］の中にこすり落とし、そしてマイクロチップをを
装備したヒート・システムス・ウルトラソニクス（Ｈｅ
ａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）
Ｗ２００Ｐ超音波処理装置で短時間（約１０秒間）超音
波処理した。種培養物を２ｍｌの超音波処理した懸濁液
を５０ｍｌのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）の中に接
種し、次いで２０℃、２００ｒｐｍにおいて２日間イン
キュベーションすることによって生長させた。次いで、
種培養物を２％のグリシンを補充した１００ｍｌのＴＳ
Ｂに接種し、そして２８℃、２００ｒｐｍにおいて４８
インキュベーションした。
シエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆ
ａｃｉｅｎｓ）の全体のＤＮＡの調製 ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐ
ｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１３８９９の凍結乾燥した調製物を、０．８ｍｌの１
×合成塩溶液（６ｇのＮａ２ＨＰＯ４／、３ｇのＫＨ２
ＰＯ４／ｌ、０．５７ｇのクエン酸ナトリウム／ｌ）の
中に懸濁し、そしてベネット寒天（１ｇの酵母エキス／
ｌ、２ｇのＮＺ−アミンＡ／ｌ、１ｇのビーフエキス／
ｌ、２０ｇのＤ−グルコース／ｌ、２０ｇのバクト寒天
／ｌ）上のプレイティングした。２８℃において２日間
インキュベーションした後、単一のプレートからの細胞
を５ｍｌのトリプシン大豆ブロス［ディフコ（Ｄｉｆｃ
ｏ）］の中にこすり落とし、そしてマイクロチップをを
装備したヒート・システムス・ウルトラソニクス（Ｈｅ
ａｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）
Ｗ２００Ｐ超音波処理装置で短時間（約１０秒間）超音
波処理した。種培養物を２ｍｌの超音波処理した懸濁液
を５０ｍｌのトリプシン大豆ブロス（ＴＳＢ）の中に接
種し、次いで２０℃、２００ｒｐｍにおいて２日間イン
キュベーションすることによって生長させた。次いで、
種培養物を２％のグリシンを補充した１００ｍｌのＴＳ
Ｂに接種し、そして２８℃、２００ｒｐｍにおいて４８
インキュベーションした。
【００２５】細胞を９８００×ｇで３０分間遠心するこ
とによって収穫する。細胞の沈澱を２００ｍｌのＰ培地
（１００ｇのスクロース／ｌ、０．２ｇのＫ２ＳＯ４／
ｌ、２ｍｌの微量元素の溶液／ｌ、これは次の成分から
成る：４０ｍｇのＺｎＣｌ２／ｌおよび１０ｍｇ／ｌの
各ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｍｎ
Ｃｌ２・４Ｈ２Ｏ、Ｎａ４Ｂ２Ｏ７・１０Ｈ２Ｏおよび
（ＮＨ４）６ＭＯ７２４・４Ｈ２Ｏ）で洗浄する。細胞
の沈澱を−２０℃において凍結し、次いで解凍し、そし
て１２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム［シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）、３×再結晶化した）を含有するＰ＋（２５
ミリモルのＴＥＳ、２５ミリモルのＣａＣｌ２、１０ミ
リモルのＭｇＣｌ２、０．３７ミリモルのＫＨ２ＰＯ４
を含有するように補充したＰ培地）細胞を室温において
２時間インキュベーションし、その時間間でに原形質体
の形成が明らかになる。２．５ｍｇのプロイテイナーゼ
Ｋ［ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］を添加し、そしてこの混合物
を３７℃で１５分間インキュベーションする。１０ｍｌ
の０．２モルのＥＤＴＡｐＨ８、０．１モルのトリスｐ
Ｈ８を添加し、直ちに２．４ｍｌの１０％のラウリウ硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加することによって、溶菌
を達成する。粘性混合物を５０℃において６０分間イン
キュベーションし、時々おだやかな混合を行う。
とによって収穫する。細胞の沈澱を２００ｍｌのＰ培地
（１００ｇのスクロース／ｌ、０．２ｇのＫ２ＳＯ４／
ｌ、２ｍｌの微量元素の溶液／ｌ、これは次の成分から
成る：４０ｍｇのＺｎＣｌ２／ｌおよび１０ｍｇ／ｌの
各ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、Ｍｎ
Ｃｌ２・４Ｈ２Ｏ、Ｎａ４Ｂ２Ｏ７・１０Ｈ２Ｏおよび
（ＮＨ４）６ＭＯ７２４・４Ｈ２Ｏ）で洗浄する。細胞
の沈澱を−２０℃において凍結し、次いで解凍し、そし
て１２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌのリゾチーム［シグマ（Ｓ
ｉｇｍａ）、３×再結晶化した）を含有するＰ＋（２５
ミリモルのＴＥＳ、２５ミリモルのＣａＣｌ２、１０ミ
リモルのＭｇＣｌ２、０．３７ミリモルのＫＨ２ＰＯ４
を含有するように補充したＰ培地）細胞を室温において
２時間インキュベーションし、その時間間でに原形質体
の形成が明らかになる。２．５ｍｇのプロイテイナーゼ
Ｋ［ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ）］を添加し、そしてこの混合物
を３７℃で１５分間インキュベーションする。１０ｍｌ
の０．２モルのＥＤＴＡｐＨ８、０．１モルのトリスｐ
Ｈ８を添加し、直ちに２．４ｍｌの１０％のラウリウ硫
酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加することによって、溶菌
を達成する。粘性混合物を５０℃において６０分間イン
キュベーションし、時々おだやかな混合を行う。
【００２６】いったん溶菌が完結すると、２０ｍｌの平
衡化フェノール（５０ｇのフェノール＋６．５ｍｌの１
００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリスｐＨ８
、１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８＋０．０５ｇの８−ヒド
ロキシキノリン）を添加し、この調製物をおだやかな震
盪し、次いでテーブルトップの遠心機で１５００×ｇに
おいて３０分間遠心する。水性上部層を集め、そして前
述したように再抽出しつる；最初の抽出からの使用済み
のフェノールを２０ｍｌの１０ミリモルのトリスｐＨ７
．４、１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８（ＴＥ）で逆抽出す
る。次いで、集めた水性相を等しい体積のクロロホルム
で抽出し、前述したように遠心し、そして１０ｍｌの部
分を別々の試験管に分配する。１ｍｌの３モルの酢酸ア
ンモニウムｐＨ５を各々に添加し、１０ｍｌの冷エタノ
ールを粘性溶液の上部層状にした。ＤＮＡをガラス棒上
におだやかに巻き付け、冷エタノールで２回すすぎ、そ
して８ｍｌのＴＥの中に一夜４℃において溶解する。 Ａ２６０の分光光度計の読みを存在する合計の核酸（主
としてＤＮＡ）の推定として取る。
衡化フェノール（５０ｇのフェノール＋６．５ｍｌの１
００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリスｐＨ８
、１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８＋０．０５ｇの８−ヒド
ロキシキノリン）を添加し、この調製物をおだやかな震
盪し、次いでテーブルトップの遠心機で１５００×ｇに
おいて３０分間遠心する。水性上部層を集め、そして前
述したように再抽出しつる；最初の抽出からの使用済み
のフェノールを２０ｍｌの１０ミリモルのトリスｐＨ７
．４、１ミリモルのＥＤＴＡｐＨ８（ＴＥ）で逆抽出す
る。次いで、集めた水性相を等しい体積のクロロホルム
で抽出し、前述したように遠心し、そして１０ｍｌの部
分を別々の試験管に分配する。１ｍｌの３モルの酢酸ア
ンモニウムｐＨ５を各々に添加し、１０ｍｌの冷エタノ
ールを粘性溶液の上部層状にした。ＤＮＡをガラス棒上
におだやかに巻き付け、冷エタノールで２回すすぎ、そ
して８ｍｌのＴＥの中に一夜４℃において溶解する。 Ａ２６０の分光光度計の読みを存在する合計の核酸（主
としてＤＮＡ）の推定として取る。
【００２７】実施例２：ストレプトミセス・アウレオフ
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の部分的
消化および大きさの濃縮 ３５キロ塩基（Ｋｂ）の領域のストレプトミセス・アウ
レオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｄ
ＮＡのＳａｕ３Ａ産生物を生ずる部分的消化条件を、実
験的に決定する。１００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリ
モルのトリスｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＣｌ２か
ら成る３００μｌの反応緩衝液を含有する１系列の反応
管を準備し、そして制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ
［ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］を添加して最終濃
度を０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５
酵素ユニット／μｇのＤＮＡとする。反応を３７℃にお
いて６０分間インキュベーションし、次いで６５℃にお
いて２０分間配置し、最後に氷へ取り出す。１２μｌを
取り出し、そして０．５％のアガロースゲルに負荷して
既知の長さの断片と大きさを比較する（ＨｉｎｄＩＩＩ
、ＸｈｏＩで消化したラムダＤＮおよび消化しないもの
）。 残りの体積のＤＮＡを５０ｍｌの３モルの酢酸アンモニ
ウムおよび１ｍｌのエタノールの順次の添加および引き
続く−２０℃への冷却により沈澱させる。次いで、沈澱
したＤＮＡを８８００×ｇにおける遠心により沈澱させ
、次いで３００μｌの０．３モルの酢酸アンモニウムの
中に溶解し、同様に沈澱させ、沈降させ、エタノールで
すすぎ、真空乾燥し、そして乾燥した沈澱を最後に１０
０μｌのＴＥ中に溶解する。１ボルト／ｃｍにおいて一
夜電気泳動した臭化エチジウムで染色したアガロースゲ
ルを検査すると、０．０５ユニットのＳａｕ３Ａ／μｇ
ＤＮＡを使用する消化は、大部分が所望の３５Ｋｂの大
きさの範囲にある生成物を与えることが明らかになる。
ァシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）の部分的
消化および大きさの濃縮 ３５キロ塩基（Ｋｂ）の領域のストレプトミセス・アウ
レオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｄ
ＮＡのＳａｕ３Ａ産生物を生ずる部分的消化条件を、実
験的に決定する。１００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリ
モルのトリスｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＣｌ２か
ら成る３００μｌの反応緩衝液を含有する１系列の反応
管を準備し、そして制限エンドヌクレアーゼＳａｕ３Ａ
［ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］を添加して最終濃
度を０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５
酵素ユニット／μｇのＤＮＡとする。反応を３７℃にお
いて６０分間インキュベーションし、次いで６５℃にお
いて２０分間配置し、最後に氷へ取り出す。１２μｌを
取り出し、そして０．５％のアガロースゲルに負荷して
既知の長さの断片と大きさを比較する（ＨｉｎｄＩＩＩ
、ＸｈｏＩで消化したラムダＤＮおよび消化しないもの
）。 残りの体積のＤＮＡを５０ｍｌの３モルの酢酸アンモニ
ウムおよび１ｍｌのエタノールの順次の添加および引き
続く−２０℃への冷却により沈澱させる。次いで、沈澱
したＤＮＡを８８００×ｇにおける遠心により沈澱させ
、次いで３００μｌの０．３モルの酢酸アンモニウムの
中に溶解し、同様に沈澱させ、沈降させ、エタノールで
すすぎ、真空乾燥し、そして乾燥した沈澱を最後に１０
０μｌのＴＥ中に溶解する。１ボルト／ｃｍにおいて一
夜電気泳動した臭化エチジウムで染色したアガロースゲ
ルを検査すると、０．０５ユニットのＳａｕ３Ａ／μｇ
ＤＮＡを使用する消化は、大部分が所望の３５Ｋｂの大
きさの範囲にある生成物を与えることが明らかになる。
【００２８】実施例３：コスミドのアームの調製２機能
性コスミドベクターの成分を、図１に示すプラスミドＡ
およびＢから解放する。プラスミドＡはｐＩＢＩ２４を
含有し、これはＥ．ｃｏｌｉ中の複製および選択のため
の複製の由来およびアンピシリン抵抗性遺伝子を提供す
る。このプラスミドは、また、アクチノミセテス（ａｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中のプラスミドの選択のため
のチオストレプトン抵抗性遺伝子、ならびに試験管内パ
ッケージングのための基質として働くバクテリオファー
ジラムダからの多数の粘着末端部位（ｃｏｓ）を提供す
る。プラスミドＢは、アクチノミセテス（ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）中のプラスミドの維持のための複製の
ＳＣＰ２＊由来、および多数のｃｏｓ部位を提供するよ
うに設計する。
性コスミドベクターの成分を、図１に示すプラスミドＡ
およびＢから解放する。プラスミドＡはｐＩＢＩ２４を
含有し、これはＥ．ｃｏｌｉ中の複製および選択のため
の複製の由来およびアンピシリン抵抗性遺伝子を提供す
る。このプラスミドは、また、アクチノミセテス（ａｃ
ｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）中のプラスミドの選択のため
のチオストレプトン抵抗性遺伝子、ならびに試験管内パ
ッケージングのための基質として働くバクテリオファー
ジラムダからの多数の粘着末端部位（ｃｏｓ）を提供す
る。プラスミドＢは、アクチノミセテス（ａｃｔｉｎｏ
ｍｙｃｅｔｅｓ）中のプラスミドの維持のための複製の
ＳＣＰ２＊由来、および多数のｃｏｓ部位を提供するよ
うに設計する。
【００２９】プラスミドＡは、Ａｓｐ７１８で設計し、
次いで子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）
で脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡをクロルパンおよび
クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、そして
真空乾燥する。次いで、ＤＮＡを再懸濁し、そしてＢｇ
ｌＩＩで消化する。プラスミドＢをＳａｌＩで消化し、
引き続いてＣＩＡＰで処理する。クロルパンの抽出、エ
タノール沈澱および真空乾燥後、ＤＮＡを再懸濁し、そ
してＢｇｌＩＩで消化する。
次いで子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＡＰ）
で脱リン酸化する。次いで、ＤＮＡをクロルパンおよび
クロロホルムで抽出し、エタノールで沈澱させ、そして
真空乾燥する。次いで、ＤＮＡを再懸濁し、そしてＢｇ
ｌＩＩで消化する。プラスミドＢをＳａｌＩで消化し、
引き続いてＣＩＡＰで処理する。クロルパンの抽出、エ
タノール沈澱および真空乾燥後、ＤＮＡを再懸濁し、そ
してＢｇｌＩＩで消化する。
【００３０】前述の消化反応をアガロースゲルに適用し
、そして一夜電気泳動する。前述の機能的領域を含有す
る、プラスミドＡからの６Ｋｂの断片およびプラスミド
Ｂからの８．０Ｋｂの断片を、アガロースゲルから電気
溶離により分離する。
、そして一夜電気泳動する。前述の機能的領域を含有す
る、プラスミドＡからの６Ｋｂの断片およびプラスミド
Ｂからの８．０Ｋｂの断片を、アガロースゲルから電気
溶離により分離する。
【００３１】実施例４：Ｓａｕ３Ａ消化したゲノムＤＮ
Ａへのコスミドのアームの結合および試験管内パッケー
ジング ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒ
ｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡのＳａｕ３Ａ消化しそして
大きさを「検査した」ゲノムの断片を、試験管内結合を
経てコスミドのアームに接合する。約８μｇに相当する
、４μｌのＳａｕ３Ａ消化したストレプトミセス・アウ
レオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｄ
ＮＡを、６６ミリモルのトリスｐＨ７．４、１０ミリモ
ルのＭｂｏＩＩ、１ミリモルのＡＴＰ、１０ミリモルの
ジチオスレイトールおよび４０ユニット（粘着末端のユ
ニット）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ［ニュー・イングラ
ンド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）］を含有する１０μｌの結合混合物中で
、１μｇのコスミドのアーム１および２の各々と組み合
わせる。結合混合物を１１℃において１８時間インキュ
ベーションし、次いで全体の１０μｌの反応混合物をパ
ッカジーン（ＰａｋａｇｅｎｅＲ）ラムダＤＮＡパッケ
ージング系抽出物に添加することによって試験管内パッ
ケージング反応させる。室温において２時間インキュベ
ーション後、５００μｌのファージ希釈緩衝液（ＰＤＢ
）（１００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリス
ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＳＯ４）を添
加し、次いで２５μｌのクロロホルムを添加する。この
混合物を渦形成し、そして４℃において貯蔵する。
Ａへのコスミドのアームの結合および試験管内パッケー
ジング ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒ
ｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡのＳａｕ３Ａ消化しそして
大きさを「検査した」ゲノムの断片を、試験管内結合を
経てコスミドのアームに接合する。約８μｇに相当する
、４μｌのＳａｕ３Ａ消化したストレプトミセス・アウ
レオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）Ｄ
ＮＡを、６６ミリモルのトリスｐＨ７．４、１０ミリモ
ルのＭｂｏＩＩ、１ミリモルのＡＴＰ、１０ミリモルの
ジチオスレイトールおよび４０ユニット（粘着末端のユ
ニット）のＴ４ ＤＮＡリガーゼ［ニュー・イングラ
ンド・バイオラブス（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ
ｉｏｌａｂｓ）］を含有する１０μｌの結合混合物中で
、１μｇのコスミドのアーム１および２の各々と組み合
わせる。結合混合物を１１℃において１８時間インキュ
ベーションし、次いで全体の１０μｌの反応混合物をパ
ッカジーン（ＰａｋａｇｅｎｅＲ）ラムダＤＮＡパッケ
ージング系抽出物に添加することによって試験管内パッ
ケージング反応させる。室温において２時間インキュベ
ーション後、５００μｌのファージ希釈緩衝液（ＰＤＢ
）（１００ミリモルのＮａＣｌ、１０ミリモルのトリス
ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＳＯ４）を添
加し、次いで２５μｌのクロロホルムを添加する。この
混合物を渦形成し、そして４℃において貯蔵する。
【００３２】実施例５：大腸菌の中に形質導入および２
機能性コスミドのライブラリーの調製 プールしたプラスミドＤＮＡ調製物または２機能性コス
ミドのライブラリーを得ることができる数千の形質導入
体を得る目的で、試験管内パッケージング反応から誘導
されたファージ調製物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）Ｘ２８１９Ｔ［Ｒ．カーチス（Ｃｕｒ
ｔｉｓｓ）］の中に形質導入する。この目的で、０．３
ｍｌのＸ２８１９Ｔの一夜の培養物を１０ｍｌの２０−
１０−５（２０ｇのトリプトン／ｌ、１０ｇの酵母エキ
ス／ｌ、５ｇのＮａＣｌ／ｌ、５０ｍｇのチミジン／ｌ
）の中に接種し、そして２８℃において２．５時間イン
キュベーションした。次いで、４つの部分の０．４ｍｌ
のＸ２８１９Ｔ細胞を０．８ｍｌのＰＤＢと組み合わせ
、そしてマイクロフーグで全速度で５分間回転した。沈
澱した細胞を１００ｍｌのＰＤＢの中に懸濁した。次い
で、試験管内パッケージングからの５０μｌのファージ
調製物を各に添加する。ファージを細胞に３７℃におい
て２５分間吸収させる。２ｍｌの２０−１０−５を各混
合物に添加し、そして懸濁液を震盪しながら２８℃にお
いて２時間インキュベーションする。１／１０ｍｌのア
リコートを、１００ｍｇのアンピシリン／ｌ（ナトリウ
ム塩−シグマ）を補充した２０−１０−５（２０−１０
−５ブロスおよび２０ｇのバクト寒天／ｌ）を含有する
合計５０枚のペトリ皿上に配置する。プレートを２８℃
において一夜インキュベーションし、次いで室温におい
て３日間放置する。５つの代表的なプレートのプレート
のカウントは、合計約１２，０００のアンピシリン抵抗
性コロニーが得られることが明らかにする。
機能性コスミドのライブラリーの調製 プールしたプラスミドＤＮＡ調製物または２機能性コス
ミドのライブラリーを得ることができる数千の形質導入
体を得る目的で、試験管内パッケージング反応から誘導
されたファージ調製物を大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ ｃｏｌｉ）Ｘ２８１９Ｔ［Ｒ．カーチス（Ｃｕｒ
ｔｉｓｓ）］の中に形質導入する。この目的で、０．３
ｍｌのＸ２８１９Ｔの一夜の培養物を１０ｍｌの２０−
１０−５（２０ｇのトリプトン／ｌ、１０ｇの酵母エキ
ス／ｌ、５ｇのＮａＣｌ／ｌ、５０ｍｇのチミジン／ｌ
）の中に接種し、そして２８℃において２．５時間イン
キュベーションした。次いで、４つの部分の０．４ｍｌ
のＸ２８１９Ｔ細胞を０．８ｍｌのＰＤＢと組み合わせ
、そしてマイクロフーグで全速度で５分間回転した。沈
澱した細胞を１００ｍｌのＰＤＢの中に懸濁した。次い
で、試験管内パッケージングからの５０μｌのファージ
調製物を各に添加する。ファージを細胞に３７℃におい
て２５分間吸収させる。２ｍｌの２０−１０−５を各混
合物に添加し、そして懸濁液を震盪しながら２８℃にお
いて２時間インキュベーションする。１／１０ｍｌのア
リコートを、１００ｍｇのアンピシリン／ｌ（ナトリウ
ム塩−シグマ）を補充した２０−１０−５（２０−１０
−５ブロスおよび２０ｇのバクト寒天／ｌ）を含有する
合計５０枚のペトリ皿上に配置する。プレートを２８℃
において一夜インキュベーションし、次いで室温におい
て３日間放置する。５つの代表的なプレートのプレート
のカウントは、合計約１２，０００のアンピシリン抵抗
性コロニーが得られることが明らかにする。
【００３３】各プレートを、５０ミリモルのグルコース
、２５ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、１０ミリモル
のＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＧＴＥ）を含有する溶液の５ｍｌ
でフラッディングする。コロニーを無菌のスプレダーで
懸濁し、そしてすべての溶離液をプールして細胞懸濁液
が得られ、これを９８００×ｇで５分間遠心する。沈澱
した細胞を７２ｍｌのＧＴＥの中に再懸濁する。次いで
、８ｍｌの４０ｍｇのリゾチーム／ｌを含有するＧＴＥ
を添加する。リゾチームの消化物を室温において２０分
間インキュベーションする。次いで、１６０ｍｌのアル
カリ性−ＳＤＳ（８ｇのＮａＯＨ／ｌ、１０ｇのＳＤＳ
／ｌ）を添加し、これはおだやかな混合後粘性リゼイト
を生ずる。氷上で２０分間インキュベーションした後、
８０ｍｌの５モルの酢酸カリウムを添加し、混合し、そ
してさらに氷上で２０分間インキュベーションする。次
いで、調製物を９８００×ｇにおいて２０分間遠心し、
上澄み液を集め、２００ｍｌの冷イソプロパノールを添
加し、混合し、そして氷上で１５分間インキュベーショ
ンし、次いで９８００×ｇで２０分間遠心する。 核酸の沈澱を１％のナトリウムサルコシンを補充した２
０ｍｌのＴＥ中に溶解する。２２ｇのＣｓＣｌを添加し
、いったん溶解したとき、２ｍｌの１０ｍｇの臭化エチ
ジウム／ｍｌの溶液を添加する。ＣｓＣｌ−臭化エチジ
ウムの混合物を適当な管の中に適用し、そしてベックマ
ン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７０．１Ｔｉローター中で５５，
０００ｒｐｍで１９時間遠心する。管を取り出し、そし
てプラスミドのバンドを注射器の側面の穿刺により回収
する。臭化エチジウムを、試料から、等しい体積の水で
飽和したブタノールで４回抽出することによって除去す
る。水溶液をＴＥで６ｍｌにする；１ｍｌの３モルの酢
酸アンモニウムを添加し、そしてプラスミドＤＮＡを１
８ｍｌのエタノールで沈澱する。−２０℃に冷却後、Ｄ
ＮＡを３４００×ｇで３０分間遠心することによって沈
澱する。第２沈澱を同様に実施し、次いでＤＮＡをエタ
ノールですすぎ、真空乾燥し、１ｍｌのＴＥ中に溶解し
、そしてＤＮＡ濃度を分光光度測定により決定する。
、２５ミリモルのトリスＨＣｌ、ｐＨ８、１０ミリモル
のＥＤＴＡ、ｐＨ８（ＧＴＥ）を含有する溶液の５ｍｌ
でフラッディングする。コロニーを無菌のスプレダーで
懸濁し、そしてすべての溶離液をプールして細胞懸濁液
が得られ、これを９８００×ｇで５分間遠心する。沈澱
した細胞を７２ｍｌのＧＴＥの中に再懸濁する。次いで
、８ｍｌの４０ｍｇのリゾチーム／ｌを含有するＧＴＥ
を添加する。リゾチームの消化物を室温において２０分
間インキュベーションする。次いで、１６０ｍｌのアル
カリ性−ＳＤＳ（８ｇのＮａＯＨ／ｌ、１０ｇのＳＤＳ
／ｌ）を添加し、これはおだやかな混合後粘性リゼイト
を生ずる。氷上で２０分間インキュベーションした後、
８０ｍｌの５モルの酢酸カリウムを添加し、混合し、そ
してさらに氷上で２０分間インキュベーションする。次
いで、調製物を９８００×ｇにおいて２０分間遠心し、
上澄み液を集め、２００ｍｌの冷イソプロパノールを添
加し、混合し、そして氷上で１５分間インキュベーショ
ンし、次いで９８００×ｇで２０分間遠心する。 核酸の沈澱を１％のナトリウムサルコシンを補充した２
０ｍｌのＴＥ中に溶解する。２２ｇのＣｓＣｌを添加し
、いったん溶解したとき、２ｍｌの１０ｍｇの臭化エチ
ジウム／ｍｌの溶液を添加する。ＣｓＣｌ−臭化エチジ
ウムの混合物を適当な管の中に適用し、そしてベックマ
ン（Ｂｅｃｋｍａｎ）７０．１Ｔｉローター中で５５，
０００ｒｐｍで１９時間遠心する。管を取り出し、そし
てプラスミドのバンドを注射器の側面の穿刺により回収
する。臭化エチジウムを、試料から、等しい体積の水で
飽和したブタノールで４回抽出することによって除去す
る。水溶液をＴＥで６ｍｌにする；１ｍｌの３モルの酢
酸アンモニウムを添加し、そしてプラスミドＤＮＡを１
８ｍｌのエタノールで沈澱する。−２０℃に冷却後、Ｄ
ＮＡを３４００×ｇで３０分間遠心することによって沈
澱する。第２沈澱を同様に実施し、次いでＤＮＡをエタ
ノールですすぎ、真空乾燥し、１ｍｌのＴＥ中に溶解し
、そしてＤＮＡ濃度を分光光度測定により決定する。
【００３４】実施例６：ストレプトミセス・リビダンス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中
のプラスミドのライブラリーの導入およびストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の組み換え
細胞のライブラリーの構成 前の工程において構成した２機能性プラスミドのライブ
ラリーをストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の中に形
質転換し、ここでストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）遺伝子の表現型の発現を達成する。この目
的で、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の原形質体
を本質的に標準の方法により調製する［ホプウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）ら、１９８５］。簡単に述べると、１０
の５０ｍｌのアリコートの完全ＹＥＭＥ培地（３ｇの酵
母エキス／ｌ、５ｇのペプトン／ｌ、３ｇの麦芽エキス
／ｌ、１０ｇのグルコース／ｌ、３４０ｇのスクロース
／ｌ、５ｇのグリシン／ｌ、５ミリモルのＭｇＣｌ２、
４０ｍｇ／ｌの各Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−ロイシン）
の各の中に０．２ｍｌのの胞子懸濁液を接種することに
よって生長させた、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ
．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の４５時間の培養物から
の細胞を、９８００×ｇで１５分間遠心することによっ
て沈澱させた。細胞の沈澱をＰ培地で２回洗浄し、次い
で６０ｍｌのＰ＋の中に懸濁する。１４ｍｇのリゾチー
ム／ｍｌを含有するＰ＋の２０ｍｌを添加し、そして懸
濁液を３０℃において震盪する水浴中で１５０ｒｐｍに
おいて９０分間インキュベーションする。引き続いて、
１００ｍｌのＰ＋を添加し、そして原形質体の懸濁液を
無菌の非吸収性綿を通過させる。濾液を３８００×ｇに
おいて１０分間遠心し、原形質体の沈澱を再懸濁し、そ
して１００ｍｌのＰ＋で洗浄し、そして第２回の遠心後
、１２０ｍｌのＰ＋の中に再懸濁する。タンパク質の調
製物を１．８ｍｌのクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ
）に分布し、そして−７０℃において凍結する。０．３
ｍｌのＴＫ５４原形質体の調製物（約１×１０９の原形
質体を含有する）を５ｍｌのＰ＋を含有する４本の遠心
管の各々に分配することによって、形質転換を分布する
。 原形質体を３４００×ｇで１０分間遠心することによっ
て沈澱させ、次いで残留体積の中に再懸濁する。ほぼ１
０μｇのコスミドのライブラリーＤＮＡを各に添加し、
次いで０．５ｍｌの２５％のＰＥＧ１０００（２５ｇの
スクロース／ｌ、２ｍｌの５００×の微量元素の溶液／
ｌ、０．２５ｇのＫ２ＳＯ４／ｌ、１００ミリモルのＣ
ａＣｌ２、５０ミリモルのトリス−マレエートｐＨ８か
ら成る溶液の３ｍｌ中に溶解した１ｇのＰＥＧ１０００
（シグマ）］を添加する。混合および３０秒間インキュ
ベーション後、５ｍｌのＰ＋を添加する。次いで、原形
質体を沈澱させ、そして１ｍｌのＰ＋の中に再懸濁する
。次いで、１／１０ｍｌの体積を乾燥したＲ２ＹＥ寒天
（１００ｇのスクロース／ｌ、０．２５ｇのＫ２ＳＯ４
／ｌ、２ｍｌの５００×の微量元素の溶液／ｌ、２ｇの
Ｌ−プロリンＩＬ、２０ｇのＤ−グルコース／ｌ、５ｇ
の酵母エキス／ｌ、０．０５ｇのＫＨ２ＰＯ４／ｌ、２
５ミリモルのＣａＣｌ２、５ミリモルのＭｇＣｌ２、２
０ｇのバクト寒天／ｌ）上に広げ、そして２８℃におい
てインキュベーションする。２４時間後、各プレートを
５００μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有する柔Ｒ寒
天（前述したように調製するが、酵母エキス、グルコー
スまたはＫＨ２ＰＯ４を含まず、そして８ｇのバクト−
寒天ＩＬ）の３ｍｌでオーバーレイし、次いでさらに１
２日間インキュベーションする。
（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）中
のプラスミドのライブラリーの導入およびストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）の組み換え
細胞のライブラリーの構成 前の工程において構成した２機能性プラスミドのライブ
ラリーをストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔ
ｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の中に形
質転換し、ここでストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ）遺伝子の表現型の発現を達成する。この目
的で、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏ
ｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の原形質体
を本質的に標準の方法により調製する［ホプウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）ら、１９８５］。簡単に述べると、１０
の５０ｍｌのアリコートの完全ＹＥＭＥ培地（３ｇの酵
母エキス／ｌ、５ｇのペプトン／ｌ、３ｇの麦芽エキス
／ｌ、１０ｇのグルコース／ｌ、３４０ｇのスクロース
／ｌ、５ｇのグリシン／ｌ、５ミリモルのＭｇＣｌ２、
４０ｍｇ／ｌの各Ｌ−ヒスチジンおよびＬ−ロイシン）
の各の中に０．２ｍｌのの胞子懸濁液を接種することに
よって生長させた、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ
．ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ５４の４５時間の培養物から
の細胞を、９８００×ｇで１５分間遠心することによっ
て沈澱させた。細胞の沈澱をＰ培地で２回洗浄し、次い
で６０ｍｌのＰ＋の中に懸濁する。１４ｍｇのリゾチー
ム／ｍｌを含有するＰ＋の２０ｍｌを添加し、そして懸
濁液を３０℃において震盪する水浴中で１５０ｒｐｍに
おいて９０分間インキュベーションする。引き続いて、
１００ｍｌのＰ＋を添加し、そして原形質体の懸濁液を
無菌の非吸収性綿を通過させる。濾液を３８００×ｇに
おいて１０分間遠心し、原形質体の沈澱を再懸濁し、そ
して１００ｍｌのＰ＋で洗浄し、そして第２回の遠心後
、１２０ｍｌのＰ＋の中に再懸濁する。タンパク質の調
製物を１．８ｍｌのクリオチューブ（ｃｒｙｏｔｕｂｅ
）に分布し、そして−７０℃において凍結する。０．３
ｍｌのＴＫ５４原形質体の調製物（約１×１０９の原形
質体を含有する）を５ｍｌのＰ＋を含有する４本の遠心
管の各々に分配することによって、形質転換を分布する
。 原形質体を３４００×ｇで１０分間遠心することによっ
て沈澱させ、次いで残留体積の中に再懸濁する。ほぼ１
０μｇのコスミドのライブラリーＤＮＡを各に添加し、
次いで０．５ｍｌの２５％のＰＥＧ１０００（２５ｇの
スクロース／ｌ、２ｍｌの５００×の微量元素の溶液／
ｌ、０．２５ｇのＫ２ＳＯ４／ｌ、１００ミリモルのＣ
ａＣｌ２、５０ミリモルのトリス−マレエートｐＨ８か
ら成る溶液の３ｍｌ中に溶解した１ｇのＰＥＧ１０００
（シグマ）］を添加する。混合および３０秒間インキュ
ベーション後、５ｍｌのＰ＋を添加する。次いで、原形
質体を沈澱させ、そして１ｍｌのＰ＋の中に再懸濁する
。次いで、１／１０ｍｌの体積を乾燥したＲ２ＹＥ寒天
（１００ｇのスクロース／ｌ、０．２５ｇのＫ２ＳＯ４
／ｌ、２ｍｌの５００×の微量元素の溶液／ｌ、２ｇの
Ｌ−プロリンＩＬ、２０ｇのＤ−グルコース／ｌ、５ｇ
の酵母エキス／ｌ、０．０５ｇのＫＨ２ＰＯ４／ｌ、２
５ミリモルのＣａＣｌ２、５ミリモルのＭｇＣｌ２、２
０ｇのバクト寒天／ｌ）上に広げ、そして２８℃におい
てインキュベーションする。２４時間後、各プレートを
５００μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有する柔Ｒ寒
天（前述したように調製するが、酵母エキス、グルコー
スまたはＫＨ２ＰＯ４を含まず、そして８ｇのバクト−
寒天ＩＬ）の３ｍｌでオーバーレイし、次いでさらに１
２日間インキュベーションする。
【００３５】ほぼ９１００チオストレプトン抵抗性のコ
ロニーが得られた。２５ｍｌの各２０％のグリセロール
を含有する３本の管の中に寒天プレートからコロニーを
こすり落とすことによって、コロニーを集めた。コロニ
ーの懸濁液を９０秒間超音波処理し、プールし、次いで
１．８ｍｌのクリオチューブの中に分配し、そして−７
０℃において凍結した。この凍結した調製物はストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）組み換
え細胞ライブラリーを構成する。
ロニーが得られた。２５ｍｌの各２０％のグリセロール
を含有する３本の管の中に寒天プレートからコロニーを
こすり落とすことによって、コロニーを集めた。コロニ
ーの懸濁液を９０秒間超音波処理し、プールし、次いで
１．８ｍｌのクリオチューブの中に分配し、そして−７
０℃において凍結した。この凍結した調製物はストレプ
トミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）組み換
え細胞ライブラリーを構成する。
【００３６】実施例７：プラスミドＬＰ２１２７を誘導
するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）ＬＬ５３５、テトラサイクリン抵抗性形質転換体
の分離 次に、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）の組み換え細胞のライブラリーを、テトラサイ
クリン抵抗性についてスクリーニングする。断片化した
ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
）の細胞のライブラリーの１／１０ｍｌの部分を、１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌを補充したベンネット
抗原上にプレイティングする。２８℃において５日間イ
ンキュベーションした後、２つのテトラサイクリン抵抗
性コロニーが検出される。これらのうちの１つ、ＬＬ５
３５（最初にＬＬ５２９−２と表示された）をそれ以上
の分析のために選択した。ＬＬ５３５コロニーを、１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌを含有する新鮮なベン
ネット寒天にストリーキングする。生長は２８℃におい
て３日間インキュベーションした後に観察される。得ら
れた生長を、１０ｇのグルコース／ｌ（ＴＳＢＧ）およ
び１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを補充した５０
ｍｌのＴＳＢの中にこすり落とし、そしてこの懸濁液を
３０℃、２００ｒｐｍにおいて３日間インキュベーショ
ンする。ＬＬ５３５培養物を短時間超音波処理し、そし
て一部分を１．８ｍｌのクリオチューブに分配し、そし
て−７０℃において貯蔵する。残りの体積を使用して４
つの２リットルのフラスコを接種し、各フラスコは５０
０ｍｌの１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを含有す
る各変性したＹＥＭＥ培地（前述のものであるが、１６
ｇのグリシン／ｌ、２５ミリモルのＭＯＰＳを含有する
が、ＭｇＣｌ２、Ｌ−ヒスチジンまたはＬ−ロイシンを
含有しない）を含有する。次いで、２日後に得られた生
長物を前述したようにプラスミドＤＮＡの分離のために
処理したが、ただし使用したすべての体積は前の実施例
のそれの４倍である。最終のＤＮＡの沈澱を１ｍｌのＴ
Ｅ中に溶解する。
するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）ＬＬ５３５、テトラサイクリン抵抗性形質転換体
の分離 次に、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）の組み換え細胞のライブラリーを、テトラサイ
クリン抵抗性についてスクリーニングする。断片化した
ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
）の細胞のライブラリーの１／１０ｍｌの部分を、１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌを補充したベンネット
抗原上にプレイティングする。２８℃において５日間イ
ンキュベーションした後、２つのテトラサイクリン抵抗
性コロニーが検出される。これらのうちの１つ、ＬＬ５
３５（最初にＬＬ５２９−２と表示された）をそれ以上
の分析のために選択した。ＬＬ５３５コロニーを、１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌを含有する新鮮なベン
ネット寒天にストリーキングする。生長は２８℃におい
て３日間インキュベーションした後に観察される。得ら
れた生長を、１０ｇのグルコース／ｌ（ＴＳＢＧ）およ
び１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを補充した５０
ｍｌのＴＳＢの中にこすり落とし、そしてこの懸濁液を
３０℃、２００ｒｐｍにおいて３日間インキュベーショ
ンする。ＬＬ５３５培養物を短時間超音波処理し、そし
て一部分を１．８ｍｌのクリオチューブに分配し、そし
て−７０℃において貯蔵する。残りの体積を使用して４
つの２リットルのフラスコを接種し、各フラスコは５０
０ｍｌの１００μｇのテトラサイクリン／ｍｌを含有す
る各変性したＹＥＭＥ培地（前述のものであるが、１６
ｇのグリシン／ｌ、２５ミリモルのＭＯＰＳを含有する
が、ＭｇＣｌ２、Ｌ−ヒスチジンまたはＬ−ロイシンを
含有しない）を含有する。次いで、２日後に得られた生
長物を前述したようにプラスミドＤＮＡの分離のために
処理したが、ただし使用したすべての体積は前の実施例
のそれの４倍である。最終のＤＮＡの沈澱を１ｍｌのＴ
Ｅ中に溶解する。
【００３７】ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）の形質転換体ＬＬ５３５から分離したプ
ラスミドＤＮＡの１０μｌの部分を、前述の方法を使用
して、試験管内パッケージングにかけ、引き続いてＥ．
ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔに形質導入する。アンピシリ
ン抵抗性形質導入体（ＬＬ５３７と表示する）を、１０
０μｇのアンピシリン／ｍｌを含有する２０−１０−５
寒天にストリーキングし、そして３０℃において１日間
インキュベーション後に得られた生長物を使用して、２
つの５００ｍｌの部分の１００μｇのアンピシリン／ｍ
ｌを含有する２０−１０−５ブロスを接種する。３０℃
、２００ｒｐｍにおいて一夜インキュベーション後、プ
ラスミドＤＮＡを再び前述したように分離する。分離し
たプラスミドをＬＰ２１２７と表示する；このプラスミ
ドの推定した大きさは４３キロ塩基対である。
ｖｉｄａｎｓ）の形質転換体ＬＬ５３５から分離したプ
ラスミドＤＮＡの１０μｌの部分を、前述の方法を使用
して、試験管内パッケージングにかけ、引き続いてＥ．
ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔに形質導入する。アンピシリ
ン抵抗性形質導入体（ＬＬ５３７と表示する）を、１０
０μｇのアンピシリン／ｍｌを含有する２０−１０−５
寒天にストリーキングし、そして３０℃において１日間
インキュベーション後に得られた生長物を使用して、２
つの５００ｍｌの部分の１００μｇのアンピシリン／ｍ
ｌを含有する２０−１０−５ブロスを接種する。３０℃
、２００ｒｐｍにおいて一夜インキュベーション後、プ
ラスミドＤＮＡを再び前述したように分離する。分離し
たプラスミドをＬＰ２１２７と表示する；このプラスミ
ドの推定した大きさは４３キロ塩基対である。
【００３８】制限エンドヌクレアーゼを使用して単一お
よび二重の消化を実施することによって、制限地図をＬ
Ｐ２１２７についてつくる。ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、Ｂ
ｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩおよびＳ
ｔｕＩ［ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］についての
切断部位の位置を、各酵素を単独で、およびベクター部
分内の既知の位置において切断する既知の酵素、例えば
、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｄＩＩＩと組み
合わせてを使用する消化により決定する。制限エンドヌ
クレアーゼの消化は、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡ、
４μｌの使用する制限エンドヌクレアーゼのために最適
な塩の１０×溶液およびほぼ５〜４０単位の酵素を４０
μｌの合計の体積で組み合わせることによって実施する
。使用する１０×塩溶液は次の通りである：ＢａｍＨＩ
、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩについて、１．５モルのＮ
ａＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ８、０．０６モルの
ＭｇＣｌ２；ＢｇｌＩＩおよびＳｃａＩについて、１．
０モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ７．４、０
．１モルのＭｇＣｌ２；ＢｃｌＩについて、０．７５モ
ルのＫＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ７．４、０．１
モルのＭｇＣｌ２；ＢｓｔＢＩについて、０．６モルの
ＮａＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ７．４、０．０６
モルのＭｇＣｌ２；ＣｌａＩについて、０．５モルのＮ
ａＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ８、０．０６モルの
ＭｇＣｌ２；ＥｃｏＲＩについて、０．５モルのトリス
ｐＨ８、０．１モルのＭｇＣｌ２；ＭｌｕＩについて、
０．５モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ７．４
、０．１モルのＭｇＣｌ２；ＳａｃＩについて、０．１
モルのトリスｐＨ７．４、０．１モルのＭｇＣｌ２；お
よびＳｔｕＩについて、１．０モルのＮａＣｌ、０．１
モルのトリスｐＨ８、０．１モルのトリスｐＨ７．４、
０．１モルのＭｇＣｌ２；およびＳｔｕＩについて、１
．０モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ８、０．
１モルのＭｇＣｌ２。二重消化は、製造業者が推奨する
ように、両者の酵素に適合性の塩の条件を使用して実施
する。すべての消化反応は３７℃において実施するが、
ただしＢｃｌＩは５０℃において実施し、そしてＢｓｔ
ＢＩについて６５℃において実施する。インキュベーシ
ョン時間は６０〜１２０分である。５μｌの体積のトラ
ッキング色素（５０％のグリセロール、０．１モルのＥ
ＤＴＡｐＨ８、０．２５％のブロモフェノールブルー）
を添加して反応を停止し、そしてアガロースゲルの引き
続く負荷を促進する。
よび二重の消化を実施することによって、制限地図をＬ
Ｐ２１２７についてつくる。ＢａｍＨＩ、ＢｃｌＩ、Ｂ
ｇｌＩＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｔＢＩ、ＣｌａＩ、ＥｃｏＲ
Ｉ、ＭｌｕＩ、ＮｃｏＩ、ＳａｃＩ、ＳｐｈＩおよびＳ
ｔｕＩ［ニュー・イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ
Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）］についての
切断部位の位置を、各酵素を単独で、およびベクター部
分内の既知の位置において切断する既知の酵素、例えば
、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶまたはＨｉｎｄＩＩＩと組み
合わせてを使用する消化により決定する。制限エンドヌ
クレアーゼの消化は、１〜２μｇのプラスミドＤＮＡ、
４μｌの使用する制限エンドヌクレアーゼのために最適
な塩の１０×溶液およびほぼ５〜４０単位の酵素を４０
μｌの合計の体積で組み合わせることによって実施する
。使用する１０×塩溶液は次の通りである：ＢａｍＨＩ
、ＥｃｏＲＶおよびＳａｌＩについて、１．５モルのＮ
ａＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ８、０．０６モルの
ＭｇＣｌ２；ＢｇｌＩＩおよびＳｃａＩについて、１．
０モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ７．４、０
．１モルのＭｇＣｌ２；ＢｃｌＩについて、０．７５モ
ルのＫＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ７．４、０．１
モルのＭｇＣｌ２；ＢｓｔＢＩについて、０．６モルの
ＮａＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ７．４、０．０６
モルのＭｇＣｌ２；ＣｌａＩについて、０．５モルのＮ
ａＣｌ、０．０６モルのトリスｐＨ８、０．０６モルの
ＭｇＣｌ２；ＥｃｏＲＩについて、０．５モルのトリス
ｐＨ８、０．１モルのＭｇＣｌ２；ＭｌｕＩについて、
０．５モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ７．４
、０．１モルのＭｇＣｌ２；ＳａｃＩについて、０．１
モルのトリスｐＨ７．４、０．１モルのＭｇＣｌ２；お
よびＳｔｕＩについて、１．０モルのＮａＣｌ、０．１
モルのトリスｐＨ８、０．１モルのトリスｐＨ７．４、
０．１モルのＭｇＣｌ２；およびＳｔｕＩについて、１
．０モルのＮａＣｌ、０．１モルのトリスｐＨ８、０．
１モルのＭｇＣｌ２。二重消化は、製造業者が推奨する
ように、両者の酵素に適合性の塩の条件を使用して実施
する。すべての消化反応は３７℃において実施するが、
ただしＢｃｌＩは５０℃において実施し、そしてＢｓｔ
ＢＩについて６５℃において実施する。インキュベーシ
ョン時間は６０〜１２０分である。５μｌの体積のトラ
ッキング色素（５０％のグリセロール、０．１モルのＥ
ＤＴＡｐＨ８、０．２５％のブロモフェノールブルー）
を添加して反応を停止し、そしてアガロースゲルの引き
続く負荷を促進する。
【００３９】消化の結果は０．８％のアガロースゲルを
通す可視化する。この地図はＬＰ２１２７の直接消化に
より、ならびにサブクローニングした断片の消化により
アセブンリングする。ＢｃｌＩおよびＣｌａＩ部位につ
いてのマッピングは、宿主のメチル化により開始され、
したがって、ＬＰ２１２８の使用により促進される。Ｌ
Ｐ２１２８は、前述の手順により、ＬＰ２１２７の試験
管内パッケージング、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９（ｄ
ａｍ−ｄｃｍ−）への形質導入およびプラスミドの分離
により得られる。ＬＰ２１２７中でクローニングしたス
トレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅ
ｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡにおける３１．９ｋｂについ
てのより詳細な制限エンドヌクレアーゼ地図は、図３に
示す。
通す可視化する。この地図はＬＰ２１２７の直接消化に
より、ならびにサブクローニングした断片の消化により
アセブンリングする。ＢｃｌＩおよびＣｌａＩ部位につ
いてのマッピングは、宿主のメチル化により開始され、
したがって、ＬＰ２１２８の使用により促進される。Ｌ
Ｐ２１２８は、前述の手順により、ＬＰ２１２７の試験
管内パッケージング、Ｅ．ｃｏｌｉ ＧＭ１１９（ｄ
ａｍ−ｄｃｍ−）への形質導入およびプラスミドの分離
により得られる。ＬＰ２１２７中でクローニングしたス
トレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅ
ｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡにおける３１．９ｋｂについ
てのより詳細な制限エンドヌクレアーゼ地図は、図３に
示す。
【００４０】実施例８：プラスミドＬＰ２１２８を誘導
したストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）ＬＬ５２９−ＴＴ２、チオストレプトン抵抗性、
テトラサイクリン抵抗性形質転換体の分離ストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）ＬＬ５２９−ＴＴ２の分離は、ＬＬ５３
５について記載した方法に類似する方法で実施するが、
ただし組み換えストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）の細胞のライブラリーは５０μｇのチ
オストレプトン／ｍｌおよび１００μｇのテトラサイク
リン／ｍｌを含有するベンネット寒天上にプレイティン
グする。２８℃において１１日間インキュベーションし
た後、２つの抵抗性コロニーが観察される。これらのう
ちの１つ、ＬＬ５２９−ＴＴ２を両者の抗生物質を含有
するベンネット寒天にストリーキングする。２８℃にお
いて３日間インキュベーションした後、生ずる生長物を
使用して１０μｇのチオストレプトン／ｍｌおよび１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌチオストレプトン５０
ｍｌのＴＳＢを接種する。２８℃、２００ｒｐｍにおい
て５日間インキュベーション後、プラスミドＤＮＡを、
イソプロパノール沈澱工程まで前述のプラスミドの分離
手順に類似する、ミニ調製手順により調製する。しかし
ながら、この場合において、使用する体積は前述の体積
の約１／４である。イソプロパノールの沈澱後、核酸の
沈澱を１ｍｌのＴＥ中に溶解し、そして等しい体積のク
ロルパン（１００ミリモルのＮａＣｌ、１ミリモルのＥ
ＤＴＡｐＨ８、１０ミリモルの酢酸ナトリウムｐＨ６＋
５００ｍｌのクロロホルムを含有する結合中で平衡化し
た５００ｇのフェノールおよび０．５ｇの８−ヒドロキ
シキノリン）で撹拌および引き続くマイクロフージ（ｍ
ｉｃｏｒｆｕｇｅ）中で全速で３分間回転することによ
って抽出する。次に、水性相をクロルパンで再抽出し、
次いで同様な方法でクロロホルムで抽出する。最終の水
性層を集め、そして１００μｌの３モルの酢酸アンモニ
ウムおよび１．８ｍｌのエタノールを添加して核酸を沈
澱させる。−２０℃に冷却後、沈澱反応物を８８０００
×ｇにおいて３０分間遠心する。生ずる沈澱を３００μ
ｌの０．３モルの酢酸アンモニウム中に溶解し、同様に
１ｍｌのエタノールで沈澱され、そして遠心する。生ず
る沈澱をエタノールですすぎ、真空乾燥し、そして１ｍ
ｌのＴＥ中に溶解する。
したストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａ
ｎｓ）ＬＬ５２９−ＴＴ２、チオストレプトン抵抗性、
テトラサイクリン抵抗性形質転換体の分離ストレプトミ
セス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）ＬＬ５２９−ＴＴ２の分離は、ＬＬ５３
５について記載した方法に類似する方法で実施するが、
ただし組み換えストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）の細胞のライブラリーは５０μｇのチ
オストレプトン／ｍｌおよび１００μｇのテトラサイク
リン／ｍｌを含有するベンネット寒天上にプレイティン
グする。２８℃において１１日間インキュベーションし
た後、２つの抵抗性コロニーが観察される。これらのう
ちの１つ、ＬＬ５２９−ＴＴ２を両者の抗生物質を含有
するベンネット寒天にストリーキングする。２８℃にお
いて３日間インキュベーションした後、生ずる生長物を
使用して１０μｇのチオストレプトン／ｍｌおよび１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌチオストレプトン５０
ｍｌのＴＳＢを接種する。２８℃、２００ｒｐｍにおい
て５日間インキュベーション後、プラスミドＤＮＡを、
イソプロパノール沈澱工程まで前述のプラスミドの分離
手順に類似する、ミニ調製手順により調製する。しかし
ながら、この場合において、使用する体積は前述の体積
の約１／４である。イソプロパノールの沈澱後、核酸の
沈澱を１ｍｌのＴＥ中に溶解し、そして等しい体積のク
ロルパン（１００ミリモルのＮａＣｌ、１ミリモルのＥ
ＤＴＡｐＨ８、１０ミリモルの酢酸ナトリウムｐＨ６＋
５００ｍｌのクロロホルムを含有する結合中で平衡化し
た５００ｇのフェノールおよび０．５ｇの８−ヒドロキ
シキノリン）で撹拌および引き続くマイクロフージ（ｍ
ｉｃｏｒｆｕｇｅ）中で全速で３分間回転することによ
って抽出する。次に、水性相をクロルパンで再抽出し、
次いで同様な方法でクロロホルムで抽出する。最終の水
性層を集め、そして１００μｌの３モルの酢酸アンモニ
ウムおよび１．８ｍｌのエタノールを添加して核酸を沈
澱させる。−２０℃に冷却後、沈澱反応物を８８０００
×ｇにおいて３０分間遠心する。生ずる沈澱を３００μ
ｌの０．３モルの酢酸アンモニウム中に溶解し、同様に
１ｍｌのエタノールで沈澱され、そして遠心する。生ず
る沈澱をエタノールですすぎ、真空乾燥し、そして１ｍ
ｌのＴＥ中に溶解する。
【００４１】ＬＬ５２９−ＴＴ２プラスミドのミニ調製
物を使用して、前に記載したように試験管内パッケージ
ングを実施する。アンピシリン抵抗性形質導入体（ＬＬ
５３８と表示する）を、ＬＬ５３５についての実施例に
おいて概説するように実施するプラスミドの調製のため
に選択する。生ずる精製したプラスミドをＬＰ２１２８
と表示する。ＬＰ２１２８を２０の異なる制限エンドヌ
クレアーゼで消化したとき得られた制限バンドのパター
ンを、ＬＰ２１２７について得られたそれと、同一の電
気泳動したアガロースゲル上の消化産生物を分析するこ
とによって比較する。ＬＰ２１２８について得られたゲ
ルの結合のパターンは、ＬＰ２１２７について得られた
パターンと同一であり、２つのプラスミドは同等である
ことが示される。こうして、図２および図３はＬＰ２１
２８ならびにＬＰ２１２７の構造を記載する。
物を使用して、前に記載したように試験管内パッケージ
ングを実施する。アンピシリン抵抗性形質導入体（ＬＬ
５３８と表示する）を、ＬＬ５３５についての実施例に
おいて概説するように実施するプラスミドの調製のため
に選択する。生ずる精製したプラスミドをＬＰ２１２８
と表示する。ＬＰ２１２８を２０の異なる制限エンドヌ
クレアーゼで消化したとき得られた制限バンドのパター
ンを、ＬＰ２１２７について得られたそれと、同一の電
気泳動したアガロースゲル上の消化産生物を分析するこ
とによって比較する。ＬＰ２１２８について得られたゲ
ルの結合のパターンは、ＬＰ２１２７について得られた
パターンと同一であり、２つのプラスミドは同等である
ことが示される。こうして、図２および図３はＬＰ２１
２８ならびにＬＰ２１２７の構造を記載する。
【００４２】実施例９：プラスミドＬＰ２１２７および
ＬＰ２１２８はプラスミド連鎖テトラサイクリン抵抗性
を与える 直面するテトラサイクリン抵抗性をプラスミドが有する
ことと評価するために、プラスミドＬＰ２１２７および
ＬＰ２１２８をストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の原形質体
中に形質転換し、そして生ずるチオストレプトン抵抗性
形質転換体をテトラサイクリン抵抗性について試験する
。 ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
）の原形質体の調製および形質転換および引き続くチオ
ストレプトン抵抗性形質転換体についての選択は、前に
記載したように実施する。１０μｇの両者のＬＰ２１２
７およびＬＰ２１２８、ならびに５μｇのテトラサイク
リン感受性の対照、ＬＰ２１１１（ｐＩＢＩ２４、ＳＣ
Ｐ２＊複製および安定性領域およびチオストレプトン抵
抗性遺伝子から成るベクター）を形質転換する。試験し
た各プラスミドについての１５０の形質転換体を、１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌまたは２５μｇのチオ
ストレプトン／ｍｌを含有するベンネット寒天プレート
の対に順次に取り上げる。
ＬＰ２１２８はプラスミド連鎖テトラサイクリン抵抗性
を与える 直面するテトラサイクリン抵抗性をプラスミドが有する
ことと評価するために、プラスミドＬＰ２１２７および
ＬＰ２１２８をストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）の原形質体
中に形質転換し、そして生ずるチオストレプトン抵抗性
形質転換体をテトラサイクリン抵抗性について試験する
。 ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ
）の原形質体の調製および形質転換および引き続くチオ
ストレプトン抵抗性形質転換体についての選択は、前に
記載したように実施する。１０μｇの両者のＬＰ２１２
７およびＬＰ２１２８、ならびに５μｇのテトラサイク
リン感受性の対照、ＬＰ２１１１（ｐＩＢＩ２４、ＳＣ
Ｐ２＊複製および安定性領域およびチオストレプトン抵
抗性遺伝子から成るベクター）を形質転換する。試験し
た各プラスミドについての１５０の形質転換体を、１０
０μｇのテトラサイクリン／ｍｌまたは２５μｇのチオ
ストレプトン／ｍｌを含有するベンネット寒天プレート
の対に順次に取り上げる。
【００４３】スタブ（ｓａｔｂ）の生長を２８℃におい
て５日間インキュベーション後に記録する。ＬＰ２１１
１から誘導したすべてのチオストレプトン抵抗性形質転
換体はテトラサイクリン感受性であることが証明される
が、ＬＰ２１２７またはＬＰ２１２８からの試験したチ
オストレプトン抵抗性形質転換体はテトラサイクリン抵
抗性であることが示される。
て５日間インキュベーション後に記録する。ＬＰ２１１
１から誘導したすべてのチオストレプトン抵抗性形質転
換体はテトラサイクリン感受性であることが証明される
が、ＬＰ２１２７またはＬＰ２１２８からの試験したチ
オストレプトン抵抗性形質転換体はテトラサイクリン抵
抗性であることが示される。
【００４４】実施例１０：ＬＰ２１２７およびＬＰ２１
２８を含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）によるクロロテトラサイクリンおよび
テトラサイクリンの産生 １系列の実験を実施して、ＬＰ２１２７およびＬＰ２１
２８が異種宿主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）中のクロロテトラサイクリン（ＣＴＣ
）およびテトラサイクリン（ＴＣ）の生合成を指令する
ことを実証する。もとの分離物ＬＬ５３５、ならびにＬ
Ｐ２１２７で形質転換したストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）は、寒天およびブロスの発
酵においてＣＴＣおよびＴＣを産生するが、挿入された
ＤＮＡをもたないプラスミドのクローニングベクターを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）はテトラサイクリン抗生物質を生じない。ス
トレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）
中に形質転換したＬＰ２１２８は、テトラサイクリンと
して生物学的に特性決定することができる大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に対する活性をもつ抗生
物質の生合成を指令する。このような作用はストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主によ
り産生される。
２８を含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）によるクロロテトラサイクリンおよび
テトラサイクリンの産生 １系列の実験を実施して、ＬＰ２１２７およびＬＰ２１
２８が異種宿主ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）中のクロロテトラサイクリン（ＣＴＣ
）およびテトラサイクリン（ＴＣ）の生合成を指令する
ことを実証する。もとの分離物ＬＬ５３５、ならびにＬ
Ｐ２１２７で形質転換したストレプトミセス・リビダン
ス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）は、寒天およびブロスの発
酵においてＣＴＣおよびＴＣを産生するが、挿入された
ＤＮＡをもたないプラスミドのクローニングベクターを
含有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉ
ｄａｎｓ）はテトラサイクリン抗生物質を生じない。ス
トレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）
中に形質転換したＬＰ２１２８は、テトラサイクリンと
して生物学的に特性決定することができる大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に対する活性をもつ抗生
物質の生合成を指令する。このような作用はストレプト
ミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）宿主によ
り産生される。
【００４５】最初に、ストレプトミセス・リビダンス（
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株ＬＬ５３５、ＬＰ２１２７を
分離したチオストレプトン抵抗性分離物を、ベンネット
寒天（２５μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有する）
上に、ほぼ２００コロニー／プレートを与えるように設
計した細胞希釈でプレイティングする。ストレプトミセ
ス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株ＬＬ５３１
（前述のプラスミドベクターＬＰ２１１１を含有する）
を、約４００コロニー／プレートの標的密度で同様にプ
レイティングする。
Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株ＬＬ５３５、ＬＰ２１２７を
分離したチオストレプトン抵抗性分離物を、ベンネット
寒天（２５μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有する）
上に、ほぼ２００コロニー／プレートを与えるように設
計した細胞希釈でプレイティングする。ストレプトミセ
ス・リビダンス（Ｓ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）株ＬＬ５３１
（前述のプラスミドベクターＬＰ２１１１を含有する）
を、約４００コロニー／プレートの標的密度で同様にプ
レイティングする。
【００４６】３０℃において８日間インキュベーション
した後、ＬＬ５３５のコロニーは、３６６ｎｍＵＶラン
プで照明したとき、黄色のＵＶ蛍光を示す。これはテト
ラサイクリン産生性培養物の特性であるが、ＬＬ５３１
について観測されない。
した後、ＬＬ５３５のコロニーは、３６６ｎｍＵＶラン
プで照明したとき、黄色のＵＶ蛍光を示す。これはテト
ラサイクリン産生性培養物の特性であるが、ＬＬ５３１
について観測されない。
【００４７】次いで、各々のプレートを生物学的活性に
ついて、アッセイ有機体の一夜の生長物の０．１ｍｌを
接種した５ｍｌの軟２０−１０−５寒天（８ｇのバクト
寒天／ｌ）でコロニーをオバーレイイングすることによ
って試験する。使用したアッセイの株は、次の通りであ
る：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
株Ｔ１３２５、レイセスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ）［エリック・クル
ンイッフェ（Ｅｒｉｃ Ｃｌｕｎｄｌｉｆｆｅ）博士
］から入手した、Ｔ１３２５（これはチオストレプトン
抵抗性を与えるプラスミドを含有する）、大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４およびＭ
Ｍ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）、ｐＢＲ３２２（テト
ラサイクリンおよびアンピシリン抵抗性を与える）を含
有する。 一夜の培養物を、Ｔ１３２５について２５μｇのチオス
トレプトン／ｍｌおよびＭＭ２９４／ｐＢＲ３２２につ
いて１００μｇののアンピシリン／ｍｌを補充した、１
０ｍｌの２０−１０−５中で３７℃において生長させる
。いったんオバーレイイングしそして一夜３７℃におい
てインキュベーションした後、プレートをオーバーレイ
有機体の菌叢中の阻害ゾーンについて検査する。株ＬＬ
５３１はＥ．ｃｏｌｉ株をもつゾーンを与えず、そして
ほんのわずかのコロニーはグラム陽性Ｔ１３２５をもつ
小さい局在化したゾーンをを与える。これらの後者のコ
ロニーのすべては、アクチノルホジンの発現に特徴的な
赤色の色素を示す；ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ
．ｌｉｖｉｄａｎｓ）はこの通常未解明の経路を観測可
能な頻度で発現ことが知られている（ホリノウチら、１
９８９）。比較により、株ＬＬ５３５はオーバーレイ中
でＴ１３２５およびＭＭ２９４の生長を完全に阻害する
抗生物質の産生を示す（より少ないコロニー／プレート
を使用する後者の実験において、阻害の小さい、明確な
および非常に大きいゾーンが。これらのアッセイの有機
体を使用して適当な分離した個々のコロニーの回りに見
られる。ＭＭ２９４／ｐＢＲ３２２を使用するこの実験
においてオーバーレイしたＬＬ５３５のコロニーは、コ
ロニーの回りに明確なゾーンを示す。ＭＭ２９４／ｐＢ
Ｒ３２２を使用して見られるこの減少した活性の効果は
、プラスミドｐＢＲ３２２上に存在するテトラサイクリ
ン抵抗性の発現による、感受性の減少を示すために取る
。
ついて、アッセイ有機体の一夜の生長物の０．１ｍｌを
接種した５ｍｌの軟２０−１０−５寒天（８ｇのバクト
寒天／ｌ）でコロニーをオバーレイイングすることによ
って試験する。使用したアッセイの株は、次の通りであ
る：枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
株Ｔ１３２５、レイセスター大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔ
ｙ ｏｆ Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ）［エリック・クル
ンイッフェ（Ｅｒｉｃ Ｃｌｕｎｄｌｉｆｆｅ）博士
］から入手した、Ｔ１３２５（これはチオストレプトン
抵抗性を与えるプラスミドを含有する）、大腸菌（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＭＭ２９４およびＭ
Ｍ２９４（ＡＴＣＣ３３６２５）、ｐＢＲ３２２（テト
ラサイクリンおよびアンピシリン抵抗性を与える）を含
有する。 一夜の培養物を、Ｔ１３２５について２５μｇのチオス
トレプトン／ｍｌおよびＭＭ２９４／ｐＢＲ３２２につ
いて１００μｇののアンピシリン／ｍｌを補充した、１
０ｍｌの２０−１０−５中で３７℃において生長させる
。いったんオバーレイイングしそして一夜３７℃におい
てインキュベーションした後、プレートをオーバーレイ
有機体の菌叢中の阻害ゾーンについて検査する。株ＬＬ
５３１はＥ．ｃｏｌｉ株をもつゾーンを与えず、そして
ほんのわずかのコロニーはグラム陽性Ｔ１３２５をもつ
小さい局在化したゾーンをを与える。これらの後者のコ
ロニーのすべては、アクチノルホジンの発現に特徴的な
赤色の色素を示す；ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ
．ｌｉｖｉｄａｎｓ）はこの通常未解明の経路を観測可
能な頻度で発現ことが知られている（ホリノウチら、１
９８９）。比較により、株ＬＬ５３５はオーバーレイ中
でＴ１３２５およびＭＭ２９４の生長を完全に阻害する
抗生物質の産生を示す（より少ないコロニー／プレート
を使用する後者の実験において、阻害の小さい、明確な
および非常に大きいゾーンが。これらのアッセイの有機
体を使用して適当な分離した個々のコロニーの回りに見
られる。ＭＭ２９４／ｐＢＲ３２２を使用するこの実験
においてオーバーレイしたＬＬ５３５のコロニーは、コ
ロニーの回りに明確なゾーンを示す。ＭＭ２９４／ｐＢ
Ｒ３２２を使用して見られるこの減少した活性の効果は
、プラスミドｐＢＲ３２２上に存在するテトラサイクリ
ン抵抗性の発現による、感受性の減少を示すために取る
。
【００４８】寒天上で作り上げられる抗生物質は、全面
生長のプレート培養物から抗生物質を抽出することによ
って特性決定される。株ＬＬ５３５およびＬＬ５３１を
、２５μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有するベンネ
ット寒天上で生長させる；ストレプトミセス・アウレオ
ファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１３８９９、ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８中でク
ローニングした源は薬物を含まないベンネット寒天上に
プレイティングする。３０℃において５日間生長後、２
．５４ｃｍ（１インチ）の正方形のブロックを切断し、
そして３ｍｌの酸性メタノール（４リットルのメタノー
ル中の１１．５ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４）中で冷浸する。 ５分間渦形成した後、上澄み液をアクロ（ＡｃｒｏＲ）
膜のフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣ分析す
る。
生長のプレート培養物から抗生物質を抽出することによ
って特性決定される。株ＬＬ５３５およびＬＬ５３１を
、２５μｇのチオストレプトン／ｍｌを含有するベンネ
ット寒天上で生長させる；ストレプトミセス・アウレオ
ファシエンス（Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＡＴＣ
Ｃ１３８９９、ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８中でク
ローニングした源は薬物を含まないベンネット寒天上に
プレイティングする。３０℃において５日間生長後、２
．５４ｃｍ（１インチ）の正方形のブロックを切断し、
そして３ｍｌの酸性メタノール（４リットルのメタノー
ル中の１１．５ｍｌの濃Ｈ２ＳＯ４）中で冷浸する。 ５分間渦形成した後、上澄み液をアクロ（ＡｃｒｏＲ）
膜のフィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣ分析す
る。
【００４９】ＨＰＬＣ分析は、Ｃ１８逆相カラム上でア
イソクラクティカリー（ｉｓｏｃｒａｖｔｉｃａｌｌｙ
）に実施し、ここで２２％のＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミドを含有するｐＨ２．９においてオキシレー
トから成る移動相を使用する。流速は１ｍｌ／分であり
、そして溶離液は３６５ｎｍにおいて監視する。真性の
テトラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンを標準
として使用する。
イソクラクティカリー（ｉｓｏｃｒａｖｔｉｃａｌｌｙ
）に実施し、ここで２２％のＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチル
ホルムアミドを含有するｐＨ２．９においてオキシレー
トから成る移動相を使用する。流速は１ｍｌ／分であり
、そして溶離液は３６５ｎｍにおいて監視する。真性の
テトラサイクリンおよびクロロテトラサイクリンを標準
として使用する。
【００５０】ＨＰＬＣクロマトグラムは、ＬＬ５３５お
よびＡＴＣＣ１３８９９がＴＣおよびＣＴＣと同一の保
持時間をもつ物質を産生することを示す。ＬＬ５３１の
抽出物はこれらのピークを示さない。
よびＡＴＣＣ１３８９９がＴＣおよびＣＴＣと同一の保
持時間をもつ物質を産生することを示す。ＬＬ５３１の
抽出物はこれらのピークを示さない。
【００５１】ＬＰ２１２７、ＬＰ２１２８およびＬＰ２
６３（ｐＩＪ９７０２のＳａｃＩ部位中にクローニング
したｐＩＢＩ２４から成るプラスミドベクター）を使用
して得られたストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）のチオストレプトン抵抗性形質転換体を
、アッセイ有機体Ｔ１３２５およびＭＭ２９４を使用す
るオーバーレイにより抗生物質の産生について同様に分
析する。ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８の形質転換体
は両者のアッセイ有機体に対して活性な抗生物質の産生
を示すが、ＬＰ２６３は示さず、これにより抗生物質を
産生する能力はＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８の中に
存在するストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ
．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡに関連することが
示される。
６３（ｐＩＪ９７０２のＳａｃＩ部位中にクローニング
したｐＩＢＩ２４から成るプラスミドベクター）を使用
して得られたストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌｉ
ｖｉｄａｎｓ）のチオストレプトン抵抗性形質転換体を
、アッセイ有機体Ｔ１３２５およびＭＭ２９４を使用す
るオーバーレイにより抗生物質の産生について同様に分
析する。ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８の形質転換体
は両者のアッセイ有機体に対して活性な抗生物質の産生
を示すが、ＬＰ２６３は示さず、これにより抗生物質を
産生する能力はＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８の中に
存在するストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ
．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡに関連することが
示される。
【００５２】ブロスの発酵を、また、実施して、ＬＰ２
１２７を有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）により産生される抗生物質がテトラサ
イクリンおよびクロロテトラサイクリンであることの追
加の確証を得る。ＡＴＣＣ１３８９９、ＬＬ５３１、お
よびＬＬ８７３（ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＬＰ２１２７形質転換体）の５０
ｍｌの種培養物を、５μｇのチオストレプトン／ｍｌを
含有するＳ培地（４ｇの酵母エキス／ｌ、４ｇのペプト
ン／ｌ、１０ｇのグルコース／ｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ／ｌ）を使用して生長させる。ＡＴＣＣ１
３８９９をチオストレプトンの不存在下に生長させる。 ０．５ｍｌの種を１０μｇのチオストレプトン／ｍｌを
含有する２５ｍｌの発酵物（ただしＡＴＣＣ１３８９９
の薬物を含まない）に移す。２８℃において１０インキ
ュベーションした後、最終のマッシュの０．５ｍｌの試
料を４．５ｍｌの酸性メタノールの中に希釈し、前に記
載したように処理し、そしてＨＰＬＣ分析する。また、
少量のＴＣをこれらの３つの株の発酵マッシュにおいて
検出される。
１２７を有するストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．ｌ
ｉｖｉｄａｎｓ）により産生される抗生物質がテトラサ
イクリンおよびクロロテトラサイクリンであることの追
加の確証を得る。ＡＴＣＣ１３８９９、ＬＬ５３１、お
よびＬＬ８７３（ストレプトミセス・リビダンス（Ｓ．
ｌｉｖｉｄａｎｓ）のＬＰ２１２７形質転換体）の５０
ｍｌの種培養物を、５μｇのチオストレプトン／ｍｌを
含有するＳ培地（４ｇの酵母エキス／ｌ、４ｇのペプト
ン／ｌ、１０ｇのグルコース／ｌ、０．５ｇのＭｇＳＯ
４・７Ｈ２Ｏ／ｌ）を使用して生長させる。ＡＴＣＣ１
３８９９をチオストレプトンの不存在下に生長させる。 ０．５ｍｌの種を１０μｇのチオストレプトン／ｍｌを
含有する２５ｍｌの発酵物（ただしＡＴＣＣ１３８９９
の薬物を含まない）に移す。２８℃において１０インキ
ュベーションした後、最終のマッシュの０．５ｍｌの試
料を４．５ｍｌの酸性メタノールの中に希釈し、前に記
載したように処理し、そしてＨＰＬＣ分析する。また、
少量のＴＣをこれらの３つの株の発酵マッシュにおいて
検出される。
【００５３】Ｅ．ｃｏｌｉ株ＬＬ５３７およびＬＬ５３
８は、プラスミドＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８を分
離したＥ．ｃｏｌｉの形質転換体であり、ブダベスト条
約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マ
リイランド州ロックビレ１２３０１に受託され、そして
次のように受け入れ番号を与えられた。ＬＰ２１２７を
含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１８Ｔ（ＬＬ５３７）
は受け入れ番号ＡＴＣＣ６８３５７を有し、そしてＬＰ
２１２８を含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔ（Ｌ
Ｌ５３８）は受け入れ番号６８３５８を有する。両者は
１９９０年６月１０日に提出され、そして法律的に受け
入れられたとき、一般に入手可能となる。
８は、プラスミドＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８を分
離したＥ．ｃｏｌｉの形質転換体であり、ブダベスト条
約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクション（ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）米国マ
リイランド州ロックビレ１２３０１に受託され、そして
次のように受け入れ番号を与えられた。ＬＰ２１２７を
含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１８Ｔ（ＬＬ５３７）
は受け入れ番号ＡＴＣＣ６８３５７を有し、そしてＬＰ
２１２８を含有するＥ．ｃｏｌｉ Ｘ２８１９Ｔ（Ｌ
Ｌ５３８）は受け入れ番号６８３５８を有する。両者は
１９９０年６月１０日に提出され、そして法律的に受け
入れられたとき、一般に入手可能となる。
【００５４】引 用 文 献
１、 バルツ（Ｂａｌｔｚ）、Ｒ．Ｈ．およびＰ．マ
ツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、１９８１、ストレプ
トミセス属における原形質体の融合：効率よい遺伝子組
み換えおよび細胞の再生の条件、ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．）１２７：１３７−１４６。２、 バ
ルツ（Ｂａｌｔｚ）、Ｒ．Ｈ．およびＥ．Ｔ．セノ（Ｓ
ｅｎｏ）、１９８８、ストレプトマイセス・フラジアエ
の遺伝学およびチロシンの生合成、アナルス・オブ・リ
ビュード・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖｅ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４２：５４７−５７４。
ツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、１９８１、ストレプ
トミセス属における原形質体の融合：効率よい遺伝子組
み換えおよび細胞の再生の条件、ジャーナル・オブ・ジ
ェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．）１２７：１３７−１４６。２、 バ
ルツ（Ｂａｌｔｚ）、Ｒ．Ｈ．およびＥ．Ｔ．セノ（Ｓ
ｅｎｏ）、１９８８、ストレプトマイセス・フラジアエ
の遺伝学およびチロシンの生合成、アナルス・オブ・リ
ビュード・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖｅ．
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）４２：５４７−５７４。
【００５５】３、 ビッブ（Ｂｉｂｂ）、Ｍ．Ｊ．、
Ｊ．Ｍ．ワード（Ｗａｒｄ）、およびＤ．Ａ．ホプウッ
ド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９７８、高い頻度のストレプ
トミセス属の原形質体の中へのプラスミドＤＮＡの形質
転換、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２７４
：３９８−４００。
Ｊ．Ｍ．ワード（Ｗａｒｄ）、およびＤ．Ａ．ホプウッ
ド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９７８、高い頻度のストレプ
トミセス属の原形質体の中へのプラスミドＤＮＡの形質
転換、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）２７４
：３９８−４００。
【００５６】４、 ビンニエ（Ｂｉｎｎｉｅ）、Ｃ．
、Ｍ．ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）、およびＭ．Ｊ．バトラ
ー（Ｂｕｔｌｅｒ）、１９８９、オキシテトラサイクリ
ンの生合成に関係するストレプトミセス・リモスス遺伝
子のストレプトミス・リビダンスにおけるクローニング
および異種発現、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）１７１：８８７−８９５。
、Ｍ．ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）、およびＭ．Ｊ．バトラ
ー（Ｂｕｔｌｅｒ）、１９８９、オキシテトラサイクリ
ンの生合成に関係するストレプトミセス・リモスス遺伝
子のストレプトミス・リビダンスにおけるクローニング
および異種発現、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌ．）１７１：８８７−８９５。
【００５７】５、 バトラー（Ｂｕｔｌｅｒ）、Ｍ．
Ｊ．、Ｅ．Ｊ．フレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）、Ｉ．Ｓ．ハ
ンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、Ｆ．Ｓ．カクズマレク（Ｋａ
ｃｚｍａｒｅｋ）、Ｄ．Ａ．スグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）
およびＭ．ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）、１９８９、抵抗性
遺伝子の分子クローニングおよびストレプトマイセス・
リモススによるオキシテトラサイクリンの生合成に関係
する連鎖した遺伝子クラスターの構成、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．）２１５：２３１−２３８。
Ｊ．、Ｅ．Ｊ．フレンド（Ｆｒｉｅｎｄ）、Ｉ．Ｓ．ハ
ンター（Ｈｕｎｔｅｒ）、Ｆ．Ｓ．カクズマレク（Ｋａ
ｃｚｍａｒｅｋ）、Ｄ．Ａ．スグデン（Ｓｕｇｄｅｎ）
およびＭ．ワレン（Ｗａｒｒｅｎ）、１９８９、抵抗性
遺伝子の分子クローニングおよびストレプトマイセス・
リモススによるオキシテトラサイクリンの生合成に関係
する連鎖した遺伝子クラスターの構成、モレキュラー・
アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅ
ｎ．Ｇｅｎｅｔ．）２１５：２３１−２３８。
【００５８】６、 チャスター（Ｃｈａｓｔｅｒ）、
Ｋ．Ｆ．およびＣ．Ｊ．ブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ）、１
９８３、ストレプトマイセス属中の突然変異のクローニ
ングおよび抗生物質産生遺伝子の分離、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）２６：６７−７８。
Ｋ．Ｆ．およびＣ．Ｊ．ブルトン（Ｂｒｕｔｏｎ）、１
９８３、ストレプトマイセス属中の突然変異のクローニ
ングおよび抗生物質産生遺伝子の分離、遺伝子（Ｇｅｎ
ｅ）２６：６７−７８。
【００５９】７、 チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｃ．Ｗ．、
Ｈ．−Ｆ．リン（リン）、Ｃ．Ｌ．クオ（Ｋｕｏ）、Ｈ
．−Ｈ．ツサイ（Ｔｓａｉ）およびＪ．Ｆ．−Ｙ．ツサ
イ（Ｔｓａｉ）、１９８８、フェマイシンＣ産生を与え
るＤＮＡ配列のクローニングおよび発現、バイオ／テク
ノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６：１２２
２−１２２４。
Ｈ．−Ｆ．リン（リン）、Ｃ．Ｌ．クオ（Ｋｕｏ）、Ｈ
．−Ｈ．ツサイ（Ｔｓａｉ）およびＪ．Ｆ．−Ｙ．ツサ
イ（Ｔｓａｉ）、１９８８、フェマイシンＣ産生を与え
るＤＮＡ配列のクローニングおよび発現、バイオ／テク
ノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）６：１２２
２−１２２４。
【００６０】８、 コックス（Ｃｏｘ）、Ｋ．Ｌ．お
よびＲ．Ｈ．バルツ（Ｂａｌｔｚ）、１９８４、ストレ
プトミセス属の種においてバクテリオファージのプラー
クの形成の制限、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）１５９：４９９−５０
４。
よびＲ．Ｈ．バルツ（Ｂａｌｔｚ）、１９８４、ストレ
プトミセス属の種においてバクテリオファージのプラー
クの形成の制限、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー
（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）１５９：４９９−５０
４。
【００６１】９、 ディストラー（Ｄｉｓｔｌｅｒ）
、Ｊ．Ｋ．マンソウリ（Ｍａｎｓｏｕｒｉ）およびＷ．
ピエペルスバーグ（Ｐｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ）、１９８
５、ストレプトミセス・グリセウスＩＩにおいてストレ
プトマイシンの生合成。生合成遺伝子の隣接するゲノム
の位置および２つのストレプトマイシン抵抗性遺伝子の
１つ、ＦＥＭＳ マイクロバイオロジー・レターズ（
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）３０：
１５１−１５４。
、Ｊ．Ｋ．マンソウリ（Ｍａｎｓｏｕｒｉ）およびＷ．
ピエペルスバーグ（Ｐｉｅｐｅｒｓｂｅｒｇ）、１９８
５、ストレプトミセス・グリセウスＩＩにおいてストレ
プトマイシンの生合成。生合成遺伝子の隣接するゲノム
の位置および２つのストレプトマイシン抵抗性遺伝子の
１つ、ＦＥＭＳ マイクロバイオロジー・レターズ（
ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）３０：
１５１−１５４。
【００６２】１０、 ダッガー（Ｄｕｇｇｅｒ）、Ｂ
．Ｍ．１９４８、オーレオマイシン：新規な抗生物質に
ついての連続的研究の産生物、アナル・オブ・ニューヨ
ーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）５１：１７１−１８１。
．Ｍ．１９４８、オーレオマイシン：新規な抗生物質に
ついての連続的研究の産生物、アナル・オブ・ニューヨ
ーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ａｎｎ．Ｎ．
Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）５１：１７１−１８１。
【００６３】１１、 フェイテルソン（Ｆｅｉｔｅｌ
ｓｏｎ）、Ｊ．Ｓ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）、１９８３、抗生物質の生合成に関係する
Ｏ−メチルトランスフェラーゼのためのストレプトミセ
ス属の遺伝子のクローニング、モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）１９０：３９４−３９８。
ｓｏｎ）、Ｊ．Ｓ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏ
ｐｗｏｏｄ）、１９８３、抗生物質の生合成に関係する
Ｏ−メチルトランスフェラーゼのためのストレプトミセ
ス属の遺伝子のクローニング、モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）１９０：３９４−３９８。
【００６４】１２、 フィッシュメン（Ｆｉｓｈｍｅ
ｎ）、Ｓ．Ｅ．、Ｋ．コックス（Ｃｏｘ）、Ｊ．Ｌ．ラ
ーソン（Ｌａｒｓｏｎ）、Ｐ．Ａ．レイノルヅ（Ｒｅｙ
ｎｏｌｄｓ）、Ｅ．Ｔ．セノ（Ｓｅｎｏ）、Ｗ．−Ｋ．
エー（Ｙｅｈ）、Ｒ．バン・フランク（Ｖａｎ Ｆｒ
ａｎｋ）およびＣ．Ｌ．ヘルシュバーガー（Ｈｅｒｓｈ
ｂｅｒｇｅｒ）、１９８７、マクロリド系抗生物質の生
合成のための遺伝子のクローニング、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ
、８４：８２４８−８２５２。
ｎ）、Ｓ．Ｅ．、Ｋ．コックス（Ｃｏｘ）、Ｊ．Ｌ．ラ
ーソン（Ｌａｒｓｏｎ）、Ｐ．Ａ．レイノルヅ（Ｒｅｙ
ｎｏｌｄｓ）、Ｅ．Ｔ．セノ（Ｓｅｎｏ）、Ｗ．−Ｋ．
エー（Ｙｅｈ）、Ｒ．バン・フランク（Ｖａｎ Ｆｒ
ａｎｋ）およびＣ．Ｌ．ヘルシュバーガー（Ｈｅｒｓｈ
ｂｅｒｇｅｒ）、１９８７、マクロリド系抗生物質の生
合成のための遺伝子のクローニング、プロシーディング
ス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシ
ズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ
、８４：８２４８−８２５２。
【００６５】１３、 ギル（Ｇｉｌ）、Ｊ．Ａ．およ
びＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９８３
、カンジジン産生ストレプトミセス・グリセウスのｐ−
アミノ安息香酸シンセターゼ遺伝子のクローニングおよ
び発現、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２５：１１９−１３２。
びＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９８３
、カンジジン産生ストレプトミセス・グリセウスのｐ−
アミノ安息香酸シンセターゼ遺伝子のクローニングおよ
び発現、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２５：１１９−１３２。
【００６６】１４、 グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）
、Ｊ．Ｊ．１９８５、テトラサイクリンの発酵および突
然変異の発生、ｐ．５−５７、Ｊ．Ｊ．フラブカ（Ｈｌ
ａｖｋａ）およびＪ．Ｈ．ブース（Ｂｏｏｔｈｅ）（編
）、実験製剤学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．７８、テトラサイクリン（Ｔｈ
ｅ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）、スプリンガー−
フェルラーグ、ベルリン。
、Ｊ．Ｊ．１９８５、テトラサイクリンの発酵および突
然変異の発生、ｐ．５−５７、Ｊ．Ｊ．フラブカ（Ｈｌ
ａｖｋａ）およびＪ．Ｈ．ブース（Ｂｏｏｔｈｅ）（編
）、実験製剤学のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．７８、テトラサイクリン（Ｔｈ
ｅ Ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅｓ）、スプリンガー−
フェルラーグ、ベルリン。
【００６７】１５、 ホーン（Ｈｏｈｎ）、Ｂ．およ
びＪ．コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、大きいＤＮＡ断片
の効率よいクローニングのための小さいコスミド、遺伝
子（Ｇｅｎｅ）１１：２９１−２９８。
びＪ．コリンス（Ｃｏｌｌｉｎｓ）、大きいＤＮＡ断片
の効率よいクローニングのための小さいコスミド、遺伝
子（Ｇｅｎｅ）１１：２９１−２９８。
【００６８】１６、 ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ
）、Ｄ．Ａ．およびＨ．Ｍ．ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、
１９７８、バクテリアの原形質体の融合：ストレプトミ
セス・ケリコロルの融合タンパク質中の組み換え、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）１６２：３０７−３１７
。
）、Ｄ．Ａ．およびＨ．Ｍ．ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）、
１９７８、バクテリアの原形質体の融合：ストレプトミ
セス・ケリコロルの融合タンパク質中の組み換え、モレ
キュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍ
ｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）１６２：３０７−３１７
。
【００６９】１７、 ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ
）、Ｄ．Ａ．、１９６７、ストレプトミセス・ケリコロ
ル中の遺伝子の分析およびゲノムの構造、バクテリオリ
ジカル・リビュー（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．）３
１：３７３−４０３。
）、Ｄ．Ａ．、１９６７、ストレプトミセス・ケリコロ
ル中の遺伝子の分析およびゲノムの構造、バクテリオリ
ジカル・リビュー（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．）３
１：３７３−４０３。
【００７０】１８、 ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ
）、Ｄ．Ａ．、Ｍ．Ｊ．ビッブ（Ｂｉｂｂ）、Ｋ．Ｆ．
キーゼル（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｄ．Ｊ．リジエイト（Ｌｙ
ｄｉａｔｅ）、Ｃ．Ｐ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊ．Ｍ
．ワード（Ｗａｒｄ）およびＨ．シュレンプフ（Ｓｃｈ
ｒｅｍｐｆ）、１９８５、ストレプトミセス属の遺伝子
操作−実験室のマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｎｉ
ｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、ザ・ジョ
ン・インネス・ファンデイション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ
ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、英国ノーウィ
ッチ。
）、Ｄ．Ａ．、Ｍ．Ｊ．ビッブ（Ｂｉｂｂ）、Ｋ．Ｆ．
キーゼル（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｄ．Ｊ．リジエイト（Ｌｙ
ｄｉａｔｅ）、Ｃ．Ｐ．スミス（Ｓｍｉｔｈ）、Ｊ．Ｍ
．ワード（Ｗａｒｄ）およびＨ．シュレンプフ（Ｓｃｈ
ｒｅｍｐｆ）、１９８５、ストレプトミセス属の遺伝子
操作−実験室のマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉｃ ｍｎｉ
ｐｕｌａｔｉｏｎ Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）、ザ・ジョ
ン・インネス・ファンデイション（Ｔｈｅ Ｊｏｈｎ
ＩｎｎｅｓＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）、英国ノーウィ
ッチ。
【００７１】１９、 ホリノウチ、Ｓ．、マルパルチ
ダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）、Ｄ．Ａ．ホップウッド（
Ｈｏｐｗｏｏｄ）およびＴ．ベップ、１９８９、ａｓｆ
Ｂはストレプトミセス・ケリコロルＡ３（２）およびス
トレプトミス・リビダンスにおけるアクチノノルホジン
生合成経路の転写を刺激する、モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）２１５：３５５−３５７。
ダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ）、Ｄ．Ａ．ホップウッド（
Ｈｏｐｗｏｏｄ）およびＴ．ベップ、１９８９、ａｓｆ
Ｂはストレプトミセス・ケリコロルＡ３（２）およびス
トレプトミス・リビダンスにおけるアクチノノルホジン
生合成経路の転写を刺激する、モレキュラー・アンド・
ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅ
ｎｅｔ．）２１５：３５５−３５７。
【００７２】２０、 ジョーズ（Ｊｏｎｅｓ）、Ｇ．
Ｈ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、
１９８４、ストレプトマイセス・アンチビオチクスから
のフェノキサジンシンターゼ遺伝子の分子クローニング
および発現、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９：１４１
５１−１４１５７。
Ｈ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、
１９８４、ストレプトマイセス・アンチビオチクスから
のフェノキサジンシンターゼ遺伝子の分子クローニング
および発現、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２５９：１４１
５１−１４１５７。
【００７３】２１、 カッツ（Ｋａｔｚ）、Ｅ．、Ｃ
．Ｊ．トンプソン（Ｔｏｍｐｓｏｎ）およびＤ．Ａ．ホ
ップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９８３、ストレプト
ミス・リビダンス中のストレプトマイセス・アンチビオ
チクスからのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび
発現、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオ
ロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１２９：
２７０３−２７１４。
．Ｊ．トンプソン（Ｔｏｍｐｓｏｎ）およびＤ．Ａ．ホ
ップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、１９８３、ストレプト
ミス・リビダンス中のストレプトマイセス・アンチビオ
チクスからのチロシナーゼ遺伝子のクローニングおよび
発現、ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオ
ロジー（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１２９：
２７０３−２７１４。
【００７４】２２、 ラーソン（Ｌａｒｓｏｎ）、Ｊ
．Ｌ．およびＣ．Ｌ．ヘルシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒ）、１９８６、ストレプトミセテのプラスミ
ドの最小複製はプラスミドＤＮＡの超高レベルを産生す
る、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）１５：１９９−２０
９。
．Ｌ．およびＣ．Ｌ．ヘルシュバーガー（Ｈｅｒｓｈｂ
ｅｒｇｅｒ）、１９８６、ストレプトミセテのプラスミ
ドの最小複製はプラスミドＤＮＡの超高レベルを産生す
る、プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）１５：１９９−２０
９。
【００７５】２３、 レスキウ（Ｌｅｓｋｉｗ）、ｂ
．ｋ．、Ｙ．アハロノウィツ（Ａｈａｒｏｎｏｗｉｔｚ
）、Ｍ．メバレチ（Ｍｅｖａｒｅｃｈ）、Ｓ．ウォルフ
ェ（Ｗｏｌｆｅ）、Ｌ．Ｃ．ビニング（Ｖｉｎｉｎｇ）
、Ｄ．Ｗ．Ｓ．ウェストレイク（Ｗｅｓｔｌａｋｅ）お
よびＳ．Ｅ．ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、１９８８、
ストレプトマイセス・カルブリゲルスからのイソペニリ
シンＮシンセターゼ遺伝子のクローニングおよびヌクレ
オチド配列の決定、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６２：１８７−
１９６。
．ｋ．、Ｙ．アハロノウィツ（Ａｈａｒｏｎｏｗｉｔｚ
）、Ｍ．メバレチ（Ｍｅｖａｒｅｃｈ）、Ｓ．ウォルフ
ェ（Ｗｏｌｆｅ）、Ｌ．Ｃ．ビニング（Ｖｉｎｉｎｇ）
、Ｄ．Ｗ．Ｓ．ウェストレイク（Ｗｅｓｔｌａｋｅ）お
よびＳ．Ｅ．ジェンセン（Ｊｅｎｓｅｎ）、１９８８、
ストレプトマイセス・カルブリゲルスからのイソペニリ
シンＮシンセターゼ遺伝子のクローニングおよびヌクレ
オチド配列の決定、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６２：１８７−
１９６。
【００７６】２４、 リディエイト（Ｌｙｄｉａｔｅ
）、Ｄ．Ｊ．、Ｆ．マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄ
ａ）およびＤ．Ｊ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、
１９８５、ストレプトマイセス属のプラスミドＳＣＰ２
＊：その機能的分析および有用なクローニングベクター
の中への発生、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３５：２２３−２３
５。
）、Ｄ．Ｊ．、Ｆ．マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔｉｄ
ａ）およびＤ．Ｊ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）、
１９８５、ストレプトマイセス属のプラスミドＳＣＰ２
＊：その機能的分析および有用なクローニングベクター
の中への発生、遺伝子（Ｇｅｎｅ）３５：２２３−２３
５。
【００７７】２５、 マルパルチダ（Ｍａｌｐａｒｔ
ｉｄａ）Ｆ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏ
ｏｄ）、１９８４、ストレプトマイセス属の抗生物質の
全生合成経路の分子クローニングおよび異種宿主中のそ
の発現、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３０
９：４６２−４６４。
ｉｄａ）Ｆ．およびＤ．Ａ．ホップウッド（Ｈｏｐｗｏ
ｏｄ）、１９８４、ストレプトマイセス属の抗生物質の
全生合成経路の分子クローニングおよび異種宿主中のそ
の発現、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）（ロンドン）３０
９：４６２−４６４。
【００７８】２６、 マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ
）、Ｔ．、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｈ）および
Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８２、分
子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク。
）、Ｔ．、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｈ）および
Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８２、分
子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリ
ング・ハーバー、ニューヨーク。
【００７９】２７、 マクコルミック（ＭｃＣｏｒｍ
ｉｃｋ）、Ｊ．Ｒ．Ｄ．１９６８、テトラサイクリンの
点ブロックド突然変異および生合成、Ｇ．セルモンチ（
Ｓｅｒｍｏｎｔｉ）およびＭ．アレセビク（Ａｌｅｃｅ
ｖｉｃ）（編）、ストレプトマイセスの遺伝学および育
種、Ｙｕｇｓｌａｖ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ａ
ｒｔｓ、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）。
ｉｃｋ）、Ｊ．Ｒ．Ｄ．１９６８、テトラサイクリンの
点ブロックド突然変異および生合成、Ｇ．セルモンチ（
Ｓｅｒｍｏｎｔｉ）およびＭ．アレセビク（Ａｌｅｃｅ
ｖｉｃ）（編）、ストレプトマイセスの遺伝学および育
種、Ｙｕｇｓｌａｖ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ａｎｄ Ａ
ｒｔｓ、ザグレブ（Ｚａｇｒｅｂ）。
【００８０】２８、 モタメジ（Ｍｏｔａｍｅｄｉ）
、Ｈ．およびＣ．Ｒ．フチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏ
ｎ）、１９８７、テトラセオマイシンＣ、ストレプトマ
イセス・グアセセンスのアトラサイクリン抗腫瘍抗生物
質、の生合成のための遺伝子クラスターのクローニング
および異種発現、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４：４４４５−
４４４９。
、Ｈ．およびＣ．Ｒ．フチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏ
ｎ）、１９８７、テトラセオマイシンＣ、ストレプトマ
イセス・グアセセンスのアトラサイクリン抗腫瘍抗生物
質、の生合成のための遺伝子クラスターのクローニング
および異種発現、プロシーディングス・オブ・ナショナ
ル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８４：４４４５−
４４４９。
【００８１】２９、 ムラカミ、Ｔ．、Ｈ．アンザイ
、Ｓ．イマイ、Ａ．サトー、Ｋ．ナガオカおよびＣ．Ｊ
．トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、１９８６、ストレ
プトマイセス・ハイグロスコピクスのバイアラフォス（
ｂｉａｌａｐｈｏｓ）生合成遺伝子：遺伝子クラスター
の分子クローニングおよび特性決定、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ．）２０５：４２−５０。
、Ｓ．イマイ、Ａ．サトー、Ｋ．ナガオカおよびＣ．Ｊ
．トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）、１９８６、ストレ
プトマイセス・ハイグロスコピクスのバイアラフォス（
ｂｉａｌａｐｈｏｓ）生合成遺伝子：遺伝子クラスター
の分子クローニングおよび特性決定、モレキュラー・ア
ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ
．Ｇｅｎｅｔ．）２０５：４２−５０。
【００８２】３０、 レイネス（Ｒｅｙｎｅｓ）、Ｊ
．Ｐ．、Ｔ．カルメルス（Ｃａｌｍｅｌｓ）、Ｄ．ドロ
コウルト（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ）およびＧ．チラビイ（Ｔ
ｉｒａｂｙ）、１９８８、大腸菌中のクローニング、発
現およびストレプトマイセス・リモススからのテトラサ
イクリン抵抗性遺伝子のヌクレオチド配列、ジャーナル
・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３４：５８５−５９８。
．Ｐ．、Ｔ．カルメルス（Ｃａｌｍｅｌｓ）、Ｄ．ドロ
コウルト（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ）およびＧ．チラビイ（Ｔ
ｉｒａｂｙ）、１９８８、大腸菌中のクローニング、発
現およびストレプトマイセス・リモススからのテトラサ
イクリン抵抗性遺伝子のヌクレオチド配列、ジャーナル
・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ．Ｇｅ
ｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１３４：５８５−５９８。
【００８３】３１、 サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）、Ｆ
．、Ａ．Ｒ．コウルソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）、Ｇ．Ｆ．
ホング（Ｈｏｎｇ）、Ｄ．Ｆ．ヒル（Ｈｉｌｌ）および
Ｇ．Ｂ．ペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、１９８２、
バクテリオファージラムダＤＮＡのヌクレオチド配列、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１６２：７２９−７７３。
．、Ａ．Ｒ．コウルソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）、Ｇ．Ｆ．
ホング（Ｈｏｎｇ）、Ｄ．Ｆ．ヒル（Ｈｉｌｌ）および
Ｇ．Ｂ．ペターソン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）、１９８２、
バクテリオファージラムダＤＮＡのヌクレオチド配列、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）１６２：７２９−７７３。
【００８４】３２、 スタンザク（Ｓｔａｎｚａｋ）
、Ｒ．、Ｐ．マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、Ｒ．
Ｈ．バルツ（Ｂａｌｔｚ）およびＲ．Ｎ．ラオ（Ｒａｏ
）、１９８６、ストレプトマイセス・エリスレウスから
のクラスター化エリスロマイシン生合成のストレプトマ
イセス・リビダンス中のクローニングおよび発現、バイ
オ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）４
：２２９−２３２。
、Ｒ．、Ｐ．マツシマ（Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ）、Ｒ．
Ｈ．バルツ（Ｂａｌｔｚ）およびＲ．Ｎ．ラオ（Ｒａｏ
）、１９８６、ストレプトマイセス・エリスレウスから
のクラスター化エリスロマイシン生合成のストレプトマ
イセス・リビダンス中のクローニングおよび発現、バイ
オ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）４
：２２９−２３２。
【００８５】３３、 スツツズマン−エングウォール
（Ｓｔｕｒｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）、Ｋ．Ｊ．およ
びＣ．Ｒ．フチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、１９
８９、ストレプトマイセス・ペウセチウス中のアントラ
サイクリン抗生物質のためのマルチ遺伝子の族、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．）ＵＳＡ、９６：３１３５−３１３９。
（Ｓｔｕｒｚｍａｎ−Ｅｎｇｗａｌｌ）、Ｋ．Ｊ．およ
びＣ．Ｒ．フチンソン（Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ）、１９
８９、ストレプトマイセス・ペウセチウス中のアントラ
サイクリン抗生物質のためのマルチ遺伝子の族、プロシ
ーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．）ＵＳＡ、９６：３１３５−３１３９。
【００８６】３４、 スチクリッフェ（Ｓｕｔｃｌｉ
ｆｆｅ）、Ｊ．Ｇ．１９７９、大腸菌のプラスミドｐＢ
Ｒ３２２の完全なヌクレオチド配列、コールド・スプリ
ング・ハーバー・シンポジウム（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．）、Ｑｕａｎｔ．
Ｂｉｏｌ．４３：７７−９０。
ｆｆｅ）、Ｊ．Ｇ．１９７９、大腸菌のプラスミドｐＢ
Ｒ３２２の完全なヌクレオチド配列、コールド・スプリ
ング・ハーバー・シンポジウム（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．）、Ｑｕａｎｔ．
Ｂｉｏｌ．４３：７７−９０。
【００８７】３５、 トンプソン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ
）、Ｃ．Ｊ．、Ｔ．キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｊ．Ｍ
．ワード（Ｗａｒｄ）、およびＤ．Ａ．ホプウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）、１９８２、ストレプトマイセス属から
の抗生物質抵抗性遺伝子の物理学的分析およびベクター
の構成におけるそれらの使用、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２０
：５１−６２。
）、Ｃ．Ｊ．、Ｔ．キーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｊ．Ｍ
．ワード（Ｗａｒｄ）、およびＤ．Ａ．ホプウッド（Ｈ
ｏｐｗｏｏｄ）、１９８２、ストレプトマイセス属から
の抗生物質抵抗性遺伝子の物理学的分析およびベクター
の構成におけるそれらの使用、遺伝子（Ｇｅｎｅ）２０
：５１−６２。
【００８８】３６、 バン・ピー（ｖａｎ Ｐｅｅ
）、Ｋ．−Ｈ．１９８８、ストレプトマイセス・アウレ
オファシエンスＴｕ２４からのブロモペルオキシダーゼ
遺伝子の分子クローニングおよび高いレベルの発現、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉ
ｏｌｏｇｙ）１７０：５８９０−５８９４。
）、Ｋ．−Ｈ．１９８８、ストレプトマイセス・アウレ
オファシエンスＴｕ２４からのブロモペルオキシダーゼ
遺伝子の分子クローニングおよび高いレベルの発現、ジ
ャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉ
ｏｌｏｇｙ）１７０：５８９０−５８９４。
【００８９】３７、 バラ（Ｖａｒａ）、Ｊ．Ａ．、
Ｄ．プリド（Ｐｕｌｉｄｏ）、Ｒ．Ａ．ラカレ（Ｌａｃ
ａｌｌｅ）およびＡ．ジメネズ（Ｊｉｍｅｎｅｚ）、ス
トレプトマイセス・アルボニゲルのプロマイシンの生合
成の経路における２つの遺伝子は密接に連鎖されている
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６９：１３５−１４０。
Ｄ．プリド（Ｐｕｌｉｄｏ）、Ｒ．Ａ．ラカレ（Ｌａｃ
ａｌｌｅ）およびＡ．ジメネズ（Ｊｉｍｅｎｅｚ）、ス
トレプトマイセス・アルボニゲルのプロマイシンの生合
成の経路における２つの遺伝子は密接に連鎖されている
、遺伝子（Ｇｅｎｅ）６９：１３５−１４０。
【００９０】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
である。
【００９１】１、 テトラサイクリンおよびクロロテ
トラサイクリンの生合成経路の遺伝情報をコードする分
離したＤＮＡ遺伝子クラスター。
トラサイクリンの生合成経路の遺伝情報をコードする分
離したＤＮＡ遺伝子クラスター。
【００９２】２、 前記ＤＮＡは厳格なハイブリダイ
ゼーション条件下に上記第１項記載のＤＮＡにハイブリ
ダイゼーションする、上記第１項記載のＤＮＡ。
ゼーション条件下に上記第１項記載のＤＮＡにハイブリ
ダイゼーションする、上記第１項記載のＤＮＡ。
【００９３】３、 前記ＤＮＡは原核生物の宿主中で
発現される、上記第２項記載のＤＮＡ。
発現される、上記第２項記載のＤＮＡ。
【００９４】４、 前記宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・
グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒ
ｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）、ストレプトミセス・アンボフ
チスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃ
ｈｓｕｓ）、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネ
バクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、または
サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ）である、上記第２項記載のコスミド。
）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・
グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒ
ｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）、ストレプトミセス・アンボフ
チスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃ
ｈｓｕｓ）、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネ
バクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、または
サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ）である、上記第２項記載のコスミド。
【００９５】５、 前記宿主はストレプトミセス・リ
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ
）である、上記第４項記載のＤＮＡ。
ビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｌｉｖｉｄａｎｓ
）である、上記第４項記載のＤＮＡ。
【００９６】６、 前記ＤＮＡはＬＰ２１２７または
ＬＰ２１２８の中に位置するＤＮＡ遺伝子クラスターで
ある、上記第５項記載のＤＮＡ。
ＬＰ２１２８の中に位置するＤＮＡ遺伝子クラスターで
ある、上記第５項記載のＤＮＡ。
【００９７】７、 テトラサイクリン、クロロテトラ
サイクリンまたはその類似体を産生する微生物の生合成
の経路をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを操作
して前記抗生物質の産生を増強することによって、前記
生合成の経路を調節することからなる、テトラサイクリ
ン、クロロテトラサイクリンまたはその類似体の収率を
増強する方法。
サイクリンまたはその類似体を産生する微生物の生合成
の経路をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを操作
して前記抗生物質の産生を増強することによって、前記
生合成の経路を調節することからなる、テトラサイクリ
ン、クロロテトラサイクリンまたはその類似体の収率を
増強する方法。
【００９８】８、 前記前記ＤＮＡは原核生物の宿主
中で発現される、上記第７項記載の方法。
中で発現される、上記第７項記載の方法。
【００９９】９、 前記宿主は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ
）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・
グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒ
ｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）、ストレプトミセス・アンボフ
チスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃ
ｈｓｕｓ）、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネ
バクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、または
サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ）である、上記第８項記載の方法。
）、ストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ
ｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄａｎｓ）、ストレプトミセス・
グリセオフスクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒ
ｉｓｅｏｆｕｓｃｕｓ）、ストレプトミセス・アンボフ
チスス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｍｂｏｆｕｃ
ｈｓｕｓ）、アクチノミセテス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ
ｅｔｅｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コルネ
バクテリア属（Ｃｏｒｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、または
サーモアクチノミセス属（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍ
ｙｃｅｓ）である、上記第８項記載の方法。
【０１００】１０、 前記宿主はストレプトミセス・
リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）である、上記第９項記載の方法。
リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｌｉｖｉｄ
ａｎｓ）である、上記第９項記載の方法。
【０１０１】１１、 前記ＤＮＡはＬＰ２１２７また
はＬＰ２１２８の中に位置するＤＮＡ遺伝子クラスター
である、上記第１０項記載の方法。
はＬＰ２１２８の中に位置するＤＮＡ遺伝子クラスター
である、上記第１０項記載の方法。
【０１０２】１２、 テトラサイクリンまたはクロロ
テトラサイクリンの産生の生合成の経路またはその一部
分をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する
、抵抗性形質転換体についてスクリーニングすることか
らなる、テトラサイクリンまたはクロロテトラサイクリ
ンの類似体についてスクリーニングする方法。
テトラサイクリンの産生の生合成の経路またはその一部
分をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する
、抵抗性形質転換体についてスクリーニングすることか
らなる、テトラサイクリンまたはクロロテトラサイクリ
ンの類似体についてスクリーニングする方法。
【０１０３】１３、 前記ＤＮＡは厳格なハイブリダ
イゼーション条件下に上記第１２項記載のＤＮＡにハイ
ブリダイゼーションする、上記第１２項記載の方法。
イゼーション条件下に上記第１２項記載のＤＮＡにハイ
ブリダイゼーションする、上記第１２項記載の方法。
【０１０４】１４、 前記ＤＮＡは原核生物の宿主中
で発現される、上記第１３項記載の方法。
で発現される、上記第１３項記載の方法。
【０１０５】１５、 前記ＤＮＡはＬＰ２１２７また
はＬＰ２１２８の中に位置するＤＮＡ遺伝子クラスター
である、上記第１４項記載の方法。
はＬＰ２１２８の中に位置するＤＮＡ遺伝子クラスター
である、上記第１４項記載の方法。
【図１】２機能性コスミドベクターの成分の構造および
コスミドのアームを発生する方法。コスミドベクターの
アームＬおよびＲは、図面に示すようにかつ実施例３に
詳細に記載されているように、それぞれ、プラスミドＡ
およびＢから発生される。単一の線は、構成体の大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のレプリコン
部分を表す。プラスミドＡにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ部分
はｐＢＲ３２２の３．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断
片から誘導される［サトクリッフェ（Ｓａｔｃｌｉｆｆ
ｅ）、１９７９］。プラスミドＢは、アクチノミセス属
中の複製機能を提供する、ＳＣＰ２＊［縞模様）からの
５．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を含有する。ｐ
ＨＣ７９の７００ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＥＩＩｃｏ
ｓを含有する断片から誘導した３つの直列の粘着末端部
位［ホーン（Ｈｏｈｎ）ら、１９８０］を、両者のプラ
スミド［白抜き］上に準備する。プラスミドＡの中に存
在するチオストレプトン抵抗性遺伝子［黒塗り］は、ｐ
ＩＪ７０２から回収した１．１ｋｂのＢｃｌＩ断片から
誘導する［カッツ（Ｋａｔｚ）ら、１９８３］。プラス
ミド［縞模様］中の１．１ｋｂのスペーサー領域を、バ
クテリオファージλのＳａｃＩ断片から誘導する［サン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９８２］。
コスミドのアームを発生する方法。コスミドベクターの
アームＬおよびＲは、図面に示すようにかつ実施例３に
詳細に記載されているように、それぞれ、プラスミドＡ
およびＢから発生される。単一の線は、構成体の大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のレプリコン
部分を表す。プラスミドＡにおいて、Ｅ．ｃｏｌｉ部分
はｐＢＲ３２２の３．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断
片から誘導される［サトクリッフェ（Ｓａｔｃｌｉｆｆ
ｅ）、１９７９］。プラスミドＢは、アクチノミセス属
中の複製機能を提供する、ＳＣＰ２＊［縞模様）からの
５．９ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片を含有する。ｐ
ＨＣ７９の７００ｂｐのＢｇｌＩＩ−ＢｓｔＥＩＩｃｏ
ｓを含有する断片から誘導した３つの直列の粘着末端部
位［ホーン（Ｈｏｈｎ）ら、１９８０］を、両者のプラ
スミド［白抜き］上に準備する。プラスミドＡの中に存
在するチオストレプトン抵抗性遺伝子［黒塗り］は、ｐ
ＩＪ７０２から回収した１．１ｋｂのＢｃｌＩ断片から
誘導する［カッツ（Ｋａｔｚ）ら、１９８３］。プラス
ミド［縞模様］中の１．１ｋｂのスペーサー領域を、バ
クテリオファージλのＳａｃＩ断片から誘導する［サン
ガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９８２］。
【図２】ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８のために物理
学的地図。両者のプラスミドは、制限マッピングにより
同等の構造を示す；したがって、両者の代表的な、単一
の構造をここでかつ図３に示す。ベクター部分は二重線
によりを表す；ＴＣ／ＣＴＣ生合成領域は単一の線とし
て示す。ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ
．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からクローニングしたＤ
ＮＡは３１．９ｋｂである；表示するベクター領域はｐ
ＩＢＩ−２４［ハッチング］、チオストレプトン抵抗性
［縞模様］である。（＋）のしるしを付けた２つのＥｃ
ｏＲＩ部位は、ベクター誘導であり、そしてベクターお
よびストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡを境界するＳａｕ３Ａ
−ＢｇｌＩＩ接合部をフランキングする。
学的地図。両者のプラスミドは、制限マッピングにより
同等の構造を示す；したがって、両者の代表的な、単一
の構造をここでかつ図３に示す。ベクター部分は二重線
によりを表す；ＴＣ／ＣＴＣ生合成領域は単一の線とし
て示す。ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ
．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）からクローニングしたＤ
ＮＡは３１．９ｋｂである；表示するベクター領域はｐ
ＩＢＩ−２４［ハッチング］、チオストレプトン抵抗性
［縞模様］である。（＋）のしるしを付けた２つのＥｃ
ｏＲＩ部位は、ベクター誘導であり、そしてベクターお
よびストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ．ａ
ｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）ＤＮＡを境界するＳａｕ３Ａ
−ＢｇｌＩＩ接合部をフランキングする。
【図３】ＬＰ２１２７およびＬＰ２１２８中でクローニ
ングしたストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ
．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡについての制限
エンドヌクレアーゼ地図。ＬＰ２１２７およびＬＰ２１
２８中でクローニングした３１．９ｋｂのＤＮＡは線状
で示されている。この地図は、ベクターから誘導したＥ
ｃｏＲＩ部位を左および右の開始および終了部分として
含むように描かれた。制限断片の大きさはキロ塩基で表
されており、そしてアガロースゲルの電気泳動分析の通
常の分解能の限界（約５００ｂｐ）内まで正確である。
ングしたストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓ
．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）のＤＮＡについての制限
エンドヌクレアーゼ地図。ＬＰ２１２７およびＬＰ２１
２８中でクローニングした３１．９ｋｂのＤＮＡは線状
で示されている。この地図は、ベクターから誘導したＥ
ｃｏＲＩ部位を左および右の開始および終了部分として
含むように描かれた。制限断片の大きさはキロ塩基で表
されており、そしてアガロースゲルの電気泳動分析の通
常の分解能の限界（約５００ｂｐ）内まで正確である。
Claims (3)
- 【請求項１】 テトラサイクリンおよびクロロテトラ
サイクリンの生合成経路の遺伝情報をコードする分離さ
れたＤＮＡ遺伝子クラスター。 - 【請求項２】 テトラサイクリン、クロロテトラサイ
クリンまたはその類似体を産生する微生物の生合成の経
路をエンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを操作して
前記抗生物質の産生を増強することによって、前記生合
成の経路を調節することからなる、テトラサイクリン、
クロロテトラサイクリンまたはその類似体の収率を増強
する方法。 - 【請求項３】 テトラサイクリンまたはクロロテトラ
サイクリンの産生の生合成の経路またはその一部分をエ
ンコードするＤＮＡ遺伝子クラスターを含有する、抵抗
性形質転換体についてスクリーニングすることからなる
、テトラサイクリンまたはクロロテトラサイクリンの類
似体についてスクリーニングする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US55803990A | 1990-07-26 | 1990-07-26 | |
| US558039 | 1990-07-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04346786A true JPH04346786A (ja) | 1992-12-02 |
Family
ID=24227935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3206176A Pending JPH04346786A (ja) | 1990-07-26 | 1991-07-24 | ストレプトミセス・アウレオフアシエンスからのクロロテトラサイクリンおよびテトラサイクリンの形成の生合成経路のクローニングおよびストレプトミセス・リビダンス中のその発現 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0468220A3 (ja) |
| JP (1) | JPH04346786A (ja) |
| KR (1) | KR920002776A (ja) |
| AU (1) | AU652766B2 (ja) |
| CA (1) | CA2047833C (ja) |
| HU (1) | HUT60771A (ja) |
| IE (1) | IE912623A1 (ja) |
| IL (1) | IL98684A0 (ja) |
| NZ (1) | NZ239042A (ja) |
| PT (1) | PT98428B (ja) |
| SG (1) | SG43237A1 (ja) |
| TW (1) | TW218893B (ja) |
| ZA (1) | ZA915863B (ja) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69129429T2 (de) * | 1990-07-26 | 1998-09-24 | American Cyanamid Co | Zur Actinomyceten-DNS-Klonierung nützliches bifunktionelles Cosmid |
| US5639949A (en) * | 1990-08-20 | 1997-06-17 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
| US5662898A (en) * | 1990-08-20 | 1997-09-02 | Ciba-Geigy Corporation | Genes for the synthesis of antipathogenic substances |
| TW318189B (ja) * | 1991-12-06 | 1997-10-21 | American Cyanamid Co | |
| US6524812B1 (en) | 1993-10-07 | 2003-02-25 | Regents Of The University Of Minnesota | Genes encoding resistance to DNA alkylating agents |
| US6495348B1 (en) | 1993-10-07 | 2002-12-17 | Regents Of The University Of Minnesota | Mitomycin biosynthetic gene cluster |
| US6117670A (en) * | 1994-06-08 | 2000-09-12 | Novartis Finance Corporation | Pyrrolnitrin biosynthesis genes and uses thereof |
| US5989903A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-23 | American Cyanamid Company | Strain for the production of 6-dimethyltetracycline, method for producing the strain and vector for use in the method |
| JP2000502256A (ja) | 1995-12-19 | 2000-02-29 | リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミネソタ | ポリヒドロキシアルカノエートモノマーシンターゼの代謝エンジニアリング |
| US6261842B1 (en) * | 1997-10-23 | 2001-07-17 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Microorganism genomics, compositions and methods related thereto |
| WO1999067374A1 (en) * | 1998-06-23 | 1999-12-29 | Biosearch Italia S.P.A. | Methods for transferring the capability to produce a natural product into a suitable production host |
| CN110129244B (zh) * | 2019-01-23 | 2023-09-15 | 河北圣雪大成制药有限责任公司 | 链霉菌底盘菌株及其构建方法、在异源表达研究中的应用 |
| CN109699495B (zh) * | 2019-02-12 | 2022-04-08 | 云南农业大学 | 一种提高金毛狗脊孢子萌发率的方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5098837A (en) * | 1988-06-07 | 1992-03-24 | Eli Lilly And Company | Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms |
| DE69129429T2 (de) * | 1990-07-26 | 1998-09-24 | American Cyanamid Co | Zur Actinomyceten-DNS-Klonierung nützliches bifunktionelles Cosmid |
-
1991
- 1991-06-27 EP EP19910110631 patent/EP0468220A3/en not_active Withdrawn
- 1991-06-29 TW TW080105067A patent/TW218893B/zh active
- 1991-07-01 IL IL98684A patent/IL98684A0/xx unknown
- 1991-07-19 NZ NZ239042A patent/NZ239042A/xx unknown
- 1991-07-24 JP JP3206176A patent/JPH04346786A/ja active Pending
- 1991-07-24 PT PT98428A patent/PT98428B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-07-24 CA CA002047833A patent/CA2047833C/en not_active Expired - Fee Related
- 1991-07-25 AU AU81340/91A patent/AU652766B2/en not_active Ceased
- 1991-07-25 HU HU912500A patent/HUT60771A/hu unknown
- 1991-07-25 ZA ZA915863A patent/ZA915863B/xx unknown
- 1991-07-25 IE IE262391A patent/IE912623A1/en unknown
- 1991-07-26 KR KR1019910013058A patent/KR920002776A/ko not_active Withdrawn
- 1991-07-27 SG SG1996006004A patent/SG43237A1/en unknown
Also Published As
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|---|---|
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| NZ239042A (en) | 1993-09-27 |
| IE912623A1 (en) | 1992-01-29 |
| CA2047833A1 (en) | 1992-01-27 |
| SG43237A1 (en) | 1997-10-17 |
| AU8134091A (en) | 1992-01-30 |
| AU652766B2 (en) | 1994-09-08 |
| CA2047833C (en) | 2002-12-17 |
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| TW218893B (ja) | 1994-01-11 |
| HUT60771A (en) | 1992-10-28 |
| PT98428B (pt) | 1999-01-29 |
| ZA915863B (en) | 1992-04-29 |
| HU912500D0 (en) | 1991-12-30 |
| EP0468220A2 (en) | 1992-01-29 |
| PT98428A (pt) | 1992-06-30 |
| IL98684A0 (en) | 1992-07-15 |
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