JPH04504199A

JPH04504199A - 単クローン性抗体およびその用途

Info

Publication number: JPH04504199A
Application number: JP2503143A
Authority: JP
Inventors: スティーリ，ジョン　ジュラード; アンダーウッド，パトリシア　アン
Original assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Current assignee: Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization CSIRO
Priority date: 1989-02-03
Filing date: 1990-02-05
Publication date: 1992-07-30
Also published as: WO1990008834A1; US5389518A; EP0456727A4; EP0456727A1; AU649949B2; AU5090890A; CA2046661A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】単クローン性抗体およびその用途本発明は、広くは、プラスチック、金属、セラミックスなどのような非生物表面において、動物細胞が付着および成長する際の、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンのような接着性糖蛋白質の関連技術に関する。　より詳細には、本発明は、ビトロネクチンおよびフィブロネクチンに対する単クローン性抗体、生体材料の製造におけるそのような単クローン性抗体の使用およびイン　ビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　の細胞培養に用いる装置に関する。　本発明はまた、生体試料中における接着性糖蛋白質またはそのフラグメントの存在を分析する方法、牛（ｂｏｖｉｎｅ）血清または血漿からのビトロネクチンの抽出方法、そのように製造されたビトロネクチン、および該抽出方法で使用する装置に関する。ある用途（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）のために生体材料を調製する際に目下遭遇する大きな困難のひとつは、生体材料に対する細胞付着を確実にするという困難さにある。　テフロンのような、生体材料（を扱う際）に使用される重合物質の多くに対する細胞付着は、細胞に接着する血清または細胞の糖蛋白質の吸着によるが、しかし、これらの表面への吸着性は低く、かつ、非特異的である。　糖蛋白質が生体材料表面に特異的に結合でき、かつ、高い親和力で保持され得るのならば、生体材料表面の設計は、有利であろうと信じられる。　生体材料表面に吸着した糖蛋白質が、患者の血漿または血清に由来し、そして、該血漿または血清１よ、血漿または血清から接着性糖蛋白質を予め精製しておく必要なしに使用され得ることも有利であろう。フィブロネクチンまたはビトロネクチンのような接着性糖蛋白質は、多領域蛋白質であり、各領域が生理活性を有しているので、糖蛋白質のようなものを吸着させるある表面の生理活性は、糖蛋白質の（接着性の）領域または領域群が現われる方法に依存する。　接着性糖蛋白質が結合する方位を選ぶことによって、接着性糖蛋白質が吸着するように、表面の生理活性を修飾することができることもまた、有利であろうと信じられる。前述の如（、本発明はまた、ビトロネクチンを抽出する方法と、そのような方法に使用する装置に関する。　ビトロネクチンを製造する方法には、多くの先行技術があり、これらの方法は、これらの方法によって遭遇する欠点と共に、欧州特許出願Ｎｏ、０２９２６６３で議論されている。　欧州特許出願Ｎｏ、０２９２６６３で述べられているように、抗ヒトビトロネクチン単クローン性抗体を用い、ヒト血漿または血清からビトロネクチンを抽出することは知られている。　しかしながら、そのような方法では、一般に、約１０〜２０％のオーダーの低い回収率しか達成されない。　本発明は、牛血漿または血清から、９０％のオーダーの回収率でのビトロネクチンの抽出を可能にする。本願発明者等は、牛ビトロネクチンの異なるエピトープに各々反応する単クローン性抗体を産生ずる２つの融合細胞株を樹立した。　それ故、本発明第一の態様は、ビトロネクチンに反応する単クローン性抗体であって、該単クローン性抗体がビトロネクチンに結合した際に、ビトロネクチンにその細胞結合活性が保持されるものにある。　さらに、本発明は、そのような単クローン性抗体を産生する融合細胞株にある。この単クローン性抗体は、Ａ２７と呼ばれ、単クローン性抗体Ａ２７を産生ずる融合細胞株は、ＣＭ　３０／２３Ｄ２／Ｇ４と呼ばれる。　この融合細胞株は、欧州動物培養細胞収蔵機関（ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ））　、ワクチン調査生産研究所（ＶａｃｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、公衆衛生研究部門（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔ、ｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ）　、応用微生物学および調査センター（Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ）　、住所は、イギリス連合王国、ウィルトシェア　ニス・ビー４　オー・ジエー・ジー、ソールズベリー、ボートンダウン（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ。Ｌｌｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　）に、１９８９年１月１２日付で寄託され、受託番号８９０１１１０２が与えられている。本発明第二の態様は、牛ビトロネクチンに反応する単クローン性抗体であって、該単クローン性抗体がビトロネクチンに結合した際に、ビトロネクチンの細胞結合能が失われるものにある。　さらに、本発明のこの態様は、そのような単クローン性抗体を産生ずる融合細胞株にある。この単クローン性抗体は、Ａ１８と呼ばれ、単クローン性抗体Ａ１Ｂを産生ずる融合細胞株は、ＣＭ２６／１２３Ｄ１１と呼ばれる。　この融合細胞株は、欧州動物培養細胞収蔵機関（ｔｈｅ　Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ））　、ワクチン調査生産研究所（ＶａｃｃｉｎｅＲｅｓｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、公衆衛生研究部門（Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　５ｅｒｖｉｃｅ）　、応用微生物学および調査センター（Ｃｅｎｔｒｅ　ｆｏｒ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈ）　、住所は、イギリス連合王国、ウィルトシェア　ニス・ビー４　オー・ジェー・ジー、ソールズベリー、ボートンダウン（Ｐｏｒｔｏｎ　Ｄｏｗｎ、　５ａｌｉｓｂｕｒｙ、　Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ　ＳＦ３０ＪＧ。Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ　）に、１９８９年１月１２日付で寄託され、受託番号８９０１１１０３が与えられている。本願発明者等は、また、フィブロネクチンに反応する多（の単クローン性抗体を製造した。　これらの単クローン性抗体の多（は、フィブロネクチンと反応するものであり、その際、フィブロネクチンの細胞結合能は失われる。　一方、（これらの単クローン性抗体の）他のものは、フィブロネクチンと反応し、その際、フィブロネクチンの細胞結合活性は保持される。詳細に述べると、Ａ９およびＡ３５と呼ばれる単クローン性抗体が単離された。　これらの単クローン性抗体は、牛フィブロネクチンと反応し、ヒトフィブロネクチンと交差反応することで特徴づけられる。　双方の単クローン性抗体は、フィブロネクチンと反応し、該単クローン性抗体がフィブロネクチンと結合した際、該フィブロネクチンは、その細胞結合活性を保持する。　これらの単クローン性抗体の双方は、カルボキシ末端において、フィブロネクチン分子のヘパリン結合領域に結合する。本発明第三の態様は、担体を含む生体材料にあり、該生体材料は、担体の少なくとも一方の表面が、単クローン性抗体Ａ９、単クローン性抗体Ａ１８、単クローン性抗体Ａ２７、単クローン性抗体Ａ３５およびこれらの組合せからなる群から選ばれた単クローン性抗体で覆われていることで特徴づけられる。本発明のこの態様の好適例は、前記単クローン性抗体が、単クローン性抗体Ａ９、単クローン性抗体Ａ３５または単クローン性抗体Ａ２７である場合であり、最も好適な、のは、単クローン性抗体Ａ２７である場合である。本発明のこの態様の好適例は、担体が、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、発泡したポリテトラフルオロエチレン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリウレタン、シリコンゴムおよびポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）からなる群から選ばれたポリマーである場合である。　該ポリマーは、遊離水酸基、遊離アミノ基、遊離カルボキシル基または遊離メルカプト基を有しているものが好ましい。本発明のさらに好適な例は、担体が、セラミック、ガラス、金属、金属−ガラス、前もって形成されたメンブレン、多孔性材料、玉状の材料、スポンジまたはチューブである場合である。ここに記載された単クローン性抗体のひとつの適切な選択によって、生体材料の製造が可能であり、その生体材料の表面は、特定の細胞の付着および増殖を高めるか、またはそれに抵抗するように、フィブロネクチンまたはビトロネクチンと特異的に結合するであろう。　当業者によって認められているように、生体分子に対する単クローン性抗体で被覆された生体材料表面を作るというこの概念は、フィブロネクチンまたはビトロネクチンのような接着性糖蛋白質以外の分子に適用可能である。　例えば、内皮細胞のような細胞が、細胞増殖および細胞集落化のために要求するあるいは好むかもしれない成長因子の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）のような、表面の細胞集落化のために要求される他の生物学的分子の提示（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）には、一般的に、特異釣車クローン性抗体の使用が適切であろうと考えられている。当業者によって容易に理解されるように、それに対する単クローン性抗体が作られる生体因子は、生体適合性材料が埋め込まれる組織に依存するであろう。　例えば、フィブロネクチンまたはビトロネクチンは、大部分の細胞に付着性を示すであろうが、フィブロネクチンまたはビトロネクチンと知覚神経細胞との間には、付着性は殆どみられない。　それ故、生体材料が埋め込まれ、知覚神経細胞の付着が助長される箇所では、単クローン性抗体は、神経促進因子のようなラミニン系物質に対して作られるべきであろう。本発明第三の態様の生体材料の製造において、単クローン性抗体は、当業者に公知の技術を用いて、いかなる表面にも連結され得る。　この公知技術は、容易に理解されるように、材料に応じて明らかに変わるであろう。　しかしながら、本発明の一般概念は、生体材料の製造のために、単クローン性抗体が連結できるどんな材料でも、用いることが可能である。担体への単クローン性抗体の付着は、吸着作用、共有結合、放射線グラフト結合または接着性結合によって達成され得る。　加えて、担体への単クローン性抗体の付着は、抗マウス免疫グリプリンマトリクスまたはプロティンＡのような適切な親和性マトリクスに対する親和性結合の使用によって達成され得る。加えて、容易に理解されるように、単クローン性抗体の製造に用いる動物の種は、生体材料が埋め込まれる動物の種に対して適合させるべきである。　例えば、生体材料がヒトに埋め込まれるのであれば、ヒト由来単りローン性抗体またはそのフラグメントであって、抗原結合活性のあるものが使用されるべきである。本発明第三の態様のさらなる好適例においては、−タイプ以上の単クローン性抗体が、生体材料の少なくともひとつの表面を被覆するために使用される。　例えば、フィブロネクチンに対して作られた単クローン性抗体およびビトロネクチンに対して作られた単クローン性抗体が、連携して使用されるであろう。　加えて、付着された細胞の伸展および増殖を促進するに際して要求されるあるいは有用な、付着している成長因子を伴なった他の単クローン性抗体が、接着性糖蛋白質に対して作られる単クローン性抗体と連携して使用され得る。第四の態様において、本発明は、イン　ビトロの細胞培養で使用する装置にある。　その装置は、細胞培養（液）と接触するのに適合した表面を有しており、その装置は、その細胞培養（液）と接触するのに適合した表面が、単クローン性抗体Ａ１８またはＡ２７で被覆されており、その際、単クローン性抗体は、そのビトロネクチン結合性領域がその表面から離れるような向きとなっていることで特徴づけられている。本発明のこの態様の好適例においては、単クローン性抗体はＡ２７である。第五の態様において、本発明は、牛血漿または血清からビトロネクチンを分離する方法にある。　その方法は、（次の）１〜４の工程を含む。１、単クローン性抗体Ａ１８またはＡ２７を、該単クローン性抗体のビトロネクチン結合性領域が固相担体から離れるように、固相担体上に供給する。２、ビトロネクチンを含有する牛血漿または血清に、該固相担体を接触させる。３、該固相担体に結合しなかった牛血漿または血清中の成分を取り除（ために、該固相担体を洗浄する。そして、４、ビトロネクチンを含まない牛血漿または血清を得るために、工程３の洗浄液を回収する、および／または、（固相担体に）結合したビトロネクチンを放出させるために、該固相担体を処理し、放出されたビトロネクチンを回収す本発明のこの悪態の好適例においては、単クローン性抗体は、単クローン性抗体Ａ２７である。現在、固相担体がカラム形状であり、ビトロネクチンを含有する牛血清をそのカラムに通すのが好ましい。第六の態様において、本発明は、牛血漿または血清からビトロネクチンを分離するのに使用する装置にある。　その装置は、単クローン性抗体のビトロネクチン結合性領域が固相担体から離れる形で、単クローン性抗体Ａ１８またはＡ２７で被覆された固相担体を含むものである。本発明のこの態様の好適例においては、単クローン性抗体は、単クローン性抗体Ａ２７である。本発明のこの態様のさらなる好適例においては、固相担体はカラム形状である。第七の態様において、本発明は、次の工程を含む、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合活性を妨害するために、ある単クローン性抗体のフィブロネクチンまたはビトロネクチンと反応する能力を決定する方法にある。］、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを、試験がなされる単クローン性抗体で被覆された固相担体と接触させる。２、工程１を行った固相担体を、試験がなされる単クローン性抗体と接触させる。３、工程２を行った固相担体を、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質と接触４、固相担体に結合した生体物質の量を測定する。本発明のこれらの態様の好適例においては、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質は細胞である。第への態様において、本発明は、次の工程を含む、試料中のフィブロネクチンまたはビトロネクチンまたはそれらのフラグメントの接着活性を測定する方法にある。１、試料な固相担体に接触させる。　ただし、その固相担体は、フィブロネクチンまたはビトロネクチンに対する単クローン性抗体または単クローン性抗体群によって被覆されており、その単クローン性抗体は、フィブロネクチン分子又はビトロネクチン分子の、細胞結合性領域から離れた抗原性部位に反応するものである。２、工程１を行った固相担体を、（ａ）フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質、または、（ｂ）フィブロネクチンまたはビトロネクチンに対して作られた標識単クローン性抗体であって、フィブロネクチン分子またはビトロネクチン分子の細胞結合性領域またはその付近の部位と反応するもの、と接触させる。そして、３、結合した標識単クローン性抗体の量または結合した生体物質の量を測定する。本発明のこの態様の好適例においては、固相担体上の単クローン性抗体は、単クローン性抗体Ａ９、単クローン性抗体Ａ２７および単クローン性抗体Ａ３５からなる群から選択される。本発明のこの態様のさらなる好適例においては、標識単クローン性抗体は、単クローン性抗体Ａ７、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２４およびＡ３２からなる群から選択される。・フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質が細胞であるのもまた、好ましい。活性の知られている単クローン性抗体の利用により、そのような測定における標準よりも、より感度が高く、かつ、より終点の遠い、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの接着活性の生化学測定法が提供される。　特異釣車クローン性抗体面相領域の利用は、ここで述べた細胞接着の場合と同様の手段で、特定の抗原の機能的状態のための高感度な特異的測定手段を、定量法と同時に提供する。特異性と親和性で、ある表面に接着性糖蛋白質を吸着させるという、および、糖蛋白質の方位を正確に調整するという、本発明で使用されているような方法は、糖蛋白質と、そのような糖蛋白質を含む複合的な生体試料の生理活性の免疫測定に、適用性を有する。　本発明に記載された特異釣車クローン性抗体のひとつの直接的適用には、牛血漿または血清からのビトロネクチンの精製、研究またはイン　ビトロ細胞培養笠における使用がある。　精製されたビトロネクチンまたはビトロネクチン不含血清の特別の使用には、本発明の実施例３に例示されているように、細胞の接着反応の研究がある。　そこには、−１／　ｅ上！の細胞培養の際の重合プラスチック表面への細胞付着における血清ビトロネクチンの重要性についての記載がある。　そのような固定他車クローン性抗体のさらなる適用には、複合的な生体試料、特に臨床関連の試料中における改良された特異的接着性糖蛋白質またはそれらのフラグメントの含有量の生化学測定がある。本発明筒への態様の方法は、多（の臨床場面において、殊に適切であろうと信じられる。　この方法は、試料中のフィブロネクチンまたはビトロネクチンの接着活性の正確な評価を提供するであろうし、また、不純物を含む試料の分析を可能とするであろう。　この方法は、循環血漿中における健全なフィブロネクチンまたはそのフラグメントの水準の変化、または、循環血漿フィブロネクチンの生理活性が正常値から変化することが予測される何らかの疾患状態、あるいは、フィブロネクチンの循環血漿貯留に影響を与える器官の損傷が生じたことが予測される際のその部位の診断に適用できよう。　そのような例には、ガン、殊に、転移ガンの蔓延が生じた場所や、糖尿病や肝臓または腎臓の機能不全もある。一般に、その方法は、存在するフィブロネクチンまたはビトロネクチンの量が知られている試料について行なわれるであろう。　試料中のフィブロネクチンまたはビトロネクチンの接着活性は、その後、標準と比較される。この方法によって提示される他の有利な点は、工程２において標識単クローン性抗体が使用されると、これは細胞培養の必要性をなくすことになる点にある。重合プラスチックに対する細胞付着における接着性糖蛋白質の役割についての実施例３の結果は、生体材料の設計との直接の関連を示すものであり、かつ、発明の他の適用を指し示すものである。　その適用は、生体材料表面の生体適合性を改良するもの、あるいは、生体材料表面の細胞集落化を増すものである。　この目的のために、本発明は、表面に固定された形態での、この発明の実施例中に記載されたあるいはその他の単クローン性抗体の使用について述べるが、その単クローン性抗体は、特定の方法で、かつ、高い親和力で、接着性糖蛋白質に結合し、そのため、他の生体分子によって、および／または、特定の細胞の付着と増殖を高めまたはそれに抵抗するということによって検出される生化学的信号を、表面で呈する。　この方法による、生体材料の表面への細胞付着性を調整する能力は、現在の技術のいくつかの不利な点に打ち勝つあるいはそれを緩和するものであろう。糖蛋白質の吸着が、生体材料表面によって、特異的に結合され、かつ高い親和性で保持されるのであれば、そして、これが、結合部位としての単クローン性抗体の使用によって可能であるならば、生体材料表面の設計に好適であろう。　この本発明の設計は、吸着された糖蛋白質が患者の血漿または血清に起源を有するものであり、かつ、血漿または血清から接着性糖蛋白質を精製する必要性なしに、血漿または血清が使用され得るという付加的な有利性を有する。本発明の性質をより明瞭に理解させるために、ここでは、本発明の好適な形態を、添付図面および以下の実施例を参照して記載する。区皿Ω翌ヨ還元条件下、９％アクリルアミドに１２μｇの抗原を泳動させた。分子量標準の位置は、キロダルトンで示す。Ａ、クーマシー・ブリリアント・ブルー染色ゲルＢ、Ａ２７でプローブしたゲルのウェスタン　プロット第２図、クローン　および　クローン　でプローブしトラック１および５　牛角膜内皮細胞からの細胞外マトリクス物質（ＥＣＭ）トラック２および６２μβの牛胎児血清（ＦＣＳ）トラック３および７　Ａ２７ −アフィゲル　１０カラムを通した後の２μｉの牛胎児血清（ＦＣＳ）トラック４および８１μｇの親和性で精製された抗原トラック１〜４は、ブロッキング緩衝液で１／１００濃度に希釈されたウサギ抗生ビトロネクチン抗血清を用いてプローブした。トラック５〜８は、Ａ２７を用いてプローブした（腹水のブロッキング緩衝液による１１５００希釈液）。第３図、　ビトロネクチンへの　ビトロネクチン　の　Ａ２５０ｎｇ／ｍβ濃度で被覆された精製中ビトロネクチン抗原上での精製単クローン性抗体Ａ２７（）およびＡ１８（）の力価検定第４図、　Ａ２７−アフ　ゲル　１０を　いた、　７、のく圭ゑ１１吸光度は２８０ｎｍ。抗原は、Ａ２７又はＡ１８によって検出した。　分画試料は、ＰＢＳで１１５０に希釈し、ＥＬＩＳＡ　プレートの２つのウェルを被覆するために使用した。　酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、材料と方法の欄に記載した方法で行った。第５図、９％アクリルアミドを　いたドデシルＩ　ナトリウムポリアクリルアミドゲル　゛”　ＳＤＳ　ＰＡＧＥ　によって　され、Ａ２７でプローブされた　７、のウェスタン　プロットトラック１．　非還元条件下、７５０ｎｇの抗原を泳動させた。トラック３．　還元条件下、７５０ｎｇの抗原を泳動させた。トラック４．　還元条件下での電気泳動を行う前に、７５０ｎｇの抗原を、９ユニツトのトロンビン（シグマ社）と共に、３７℃にて１時間インキュベートした。トラック５．　７５０ｎｇの抗原を、９ユニツトのトロンビンと共に、３７℃にて２４時間、予めインキュベートした。標準物質の分子量は、キロダルトンで示す。第６図、　ヘパリン　セファロースへの　、の±Ａ吸光度は２８０ｎｍ。画分は、抗原について、第４図のように滴定した。　吸光度は４５０ｎｍ　（オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ））。Ａ２７による未変性抗原の検出プロフィール。Ａ２７による変性抗原の検出プロフィール。矢印は高塩濃度緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣβ含有０．０５Ｍトリス塩酸緩衝液、ｐＨ７，５）の開始を示す。第７図、ｌ’ＦＣＳ　のビトロネクチン　と、ビトロネクチン　か　なる　カラム　パさせた′の石じ　ｌ　’　ＦＣＳ　のビトロネクチン第８図、　精製されたビトロネクチン（ローロ）と新鮮血清（−ｍ−）の滴定曲線。第９図、　抗生フィブロネクチン抗体のヒトフィブロネクチンに対する交差反応性第１０図、　抗生フィブロネクチン抗体のヒトフィブロネクチンフラグメントに対する交差反応性第１１図、　抗生フィブロネクチン抗体のヒトフィブロネクチンフラグメントに対する交差反応性第１２図、　はプラスチック　に　されたフィブロネクチン　ビトロネクチンに・する　の条件は、試験ｌのための記載と同様にした（実施例３の材料および方法を見よ）。接着は１時間。横軸：抗体（−）又はプラスチック←−一）上におけるフィブロネクチン（・○ ）またはビトロネクチン（ム△）の被覆濃度。抗体はＡ２２（・）およびＡ２７（ム）であった。第１３図、　Ａ２２およびＡ２７と比較した、Ａ３５によってヒト血漿から特異的に吸収させたフィブロネクチンに対するＢＨＫ−２１細胞の接着および第１４図、　ビオチン結合重クローン性抗体Ａ９（◆）、Ａ　ｌ　４　（−））およびＡ３２（＋）を用いる酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）による、Ａ３５に対する新鮮血漿から得たフィブロネクチンの結合の滴定（実施例１）ビトロネクチンおよびフ　プロネクチンに・する　クローンビトロネクチンおよびフ　プロネクチンに・　る　り三ニヱユ五盗工培養液中の細胞の細胞外マトリクスは、フィブロネクチン（ＦＮ）およびビトロネクチン（ＶＮ）、双方を多く含む（ゴスボダロウィックズ等、１９８０年；ネイファク等、１９８３年；ベラチャー等、１９８６年）。　牛肉皮細胞からの細胞外マトリクス物質（ＥＣＭ）が、免疫原としてのフィブロネクチンおよびビトロネクチンを、生体内に存在する形で供するのに使用された。　細胞を含まないＥＣＭは、０．０２ＮＮａＯＨ中で、内皮細胞の培養皿を５分間ずつ２回インキュベーションを行うことによって調製した（ゴスボダロウィックズおよびルーイ、１９８１年）。　そのＥＣＭを、リン酸緩衝液ですすぎ、１０７細胞個につき０．５〜１．０ｍｇの、ダルベツコのリン酸緩衝液Ａ　（ＰＢＳ）中に移した。　雌Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウスを、１マウスにつき、１０’個細胞からのＥＣＭを腹腔内に投与することで免疫した。　３〜６ケ月後、動物に同様の追加免疫の注射を行った。　酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡＳ）でＥＣＭ（９６ウエルの組織培養プレート中で増殖せられた内皮細胞から調製したもの）と反応する抗体を産生じているマウスを、６週間そのままにし、追加免疫を与え、３日後、細胞融合に使用した。　牌臓細胞をＳ　ｐ　２１０ミエローマ細胞と融合させた後、その融合細胞株を前述（アンダーウッド、１９８２年）のように増やした。　融合した（細胞の）ウェルからの上澄み液を、前述（アンダーウッド、１９８５年）したように、ＥＬＩＺＡにより、下記のように条件を変えて、ＥＣＭに対してスクリーニングした。　インキュベーションは、１ウェル当り５０μρで行った。　全ての洗浄時間は５分間から３分間に短縮した。　ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＲＡＭ、ダコ（Ｄａｋｏ）社）とともにインキュベーションしたのち、ＰＢＳで４回、プレートを洗浄して、１ウェル当り１ｏｏＩＬＩ２の。−フ二二レンジアミン基質（ＯＰＤ、シグマ（Ｓｉ　ｇｍａ）社）を添加した。　ドロッパーを用いて、０．４％のアジ化ナトリウム溶液を１ウェル当り２５μβを添加して３〜３０分間後、発色が終了した。　グイナテック　ＭＲ６００プレート　リーダーを用いて、４５０ｎｍ　（ｒｅｆ、６３０ｎｍ）の吸光度を測定した。　発色を呈した融合細胞を、牛フィブロネクチン（シグマ社）または血清希釈液に対する、ＥＬＩＺＡおよびウェスタンブロッティングにより、フィブロネクチンあるいはビトロネクチンに対する活性でさらにスクリーニングした。　融合細胞を、単一の細胞として顕微鏡下で取り出し、クローン化した（アンダーウッドおよびビーン、１９８８年）。　抗体サブクラスは、サブクラス特異的抗血清（リドン　バイオネティックス（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ）社）を用いた免疫二重拡散法により、あるいは、サブクラス特異的ペルオキシダーゼ標識第２抗体（リドン　バイオネティックス社）を使ったＥＣＭのＥＬＩＺＡにより決定した。　７〜１４日前に０．５ｍ１２ブリスタン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｔｃｈ）社）で処理されたＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ／Ｃマウスの腹水のように、増殖している培養細胞により、多量の抗体が調製された。　抗体は、前述（アンダーウッド等、１９８３年）したように、プロティン　Ａ　セファロース（ファルマシア（ｐｈａｒｍａｃｉａ）社）を用いたアフィニティー　りロマトグラフィーによって、腹水液から精製された。　種々のサブクラスの非特異的マウス抗体が、プロティン　Ａ　セファロースによる正常マウス血清の分画化により、あるいは、抗−インフルエンザ単クローン性抗体のプールから調製された。　フィブロネクチンおよびビトロネクチンに対する多クローン性抗体は、ニューシーラント白ウサギから調製された。　血清の免疫グロブリン画分が、ニューシーラント白ウサギについて調製された。　血清の免疫グロブリン画分は、プロティン　Ａ　セファロースのクロマトグラフィーにより調製された。　さらに、ウサギ抗−牛ビトロネクチン抗血清は、ルオスラーティ（Ｅ。Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ）氏から、御好意により頂いた。Ｕ±”　Ａｄｄｉｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎ　と　ブロッキング・単クローン性抗体（ＭＡｂＳ）の付加的結合の程度は、固相ＲＩＡ　（主にスティール等、１９８５年）にて決定された。抗体Ａ１８およびＡ２７は、クロラミンＴ方法（スターリ等、１９８３年）により、＋２ｓ■でヨウ素化した。　試験は、各工１１１１標識単クローン性抗体あるいは１＋ｚｓ標識ＩｇＧコントロール抗体を、２５０　ｎｇ／ｍ℃で２時間、室温でインキニーベートし、プレートを４回洗浄した後、結合した工１２＠の量を決めることによって行った。゛　とウェスタン　プロティングレムリ（１９７０年）のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミトゲ）Ｉ、　（Ｓ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅ　ｉ系に、終始０．５Ｍ尿素を添加して行った。　試料は次の様に調製した。　牛角膜内皮細胞を１０ｃｍ径皿容器に入れ、１：２に分け、７日間、触れずに保った。　単層状のものを無血清培地１９９　（ＳＦ１９９）で洗浄し、１０ｍβの５Ｆ１９９を加え、３７℃にて１時間、インキュベートを行った。　新しい５Ｆ１９９と置き変え、プレートをさらに２４時間インキュベートした。　順化培地を取り、結晶蔗糖に対して透析を行い、１０倍に濃縮した。　（透析チューブは、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）水溶液中で、室温にて１時間インキュベーションすることによって、予めブロックし、完全に水ですすいでおく。）　濃縮順化培地は、分割して−２０”Ｃで保存し、一部は、電気泳動に供するため、ＳＤＳ試料用緩衝液と１：１で混合した。　細胞層を、０．０２Ｎ　ＮＨ，ＯＨ，０，５ｍＩ２で、５分間ずつ、２回インキュベーションし、収集した。　この物質を、−２０℃で保存し、順化培地について述べたように使用した。　０．０２Ｎ　ＮＨ，ＯＨですすぎ、ＰＢＳで２回洗浄をして、１％ＳＤＳ／トリス塩素緩衝液ｐＨ７，６，１ｍ℃を加え、回転振盪機で３７℃−晩インキュベーションを行って、ＥＣＭを抽出した。　その後、５０℃ にて３０分間、インキュベートゴンを行った。　マトリクス物質を容器皿よりかき取り、ＳＤＳ試料用緩衝液と１：１で混合した。　分割して、−２０℃で凍結して保存した。　ゲルにアプライする前に、試料を沸騰水浴中で３分間熱した。　分解能をもたせたゲルにおいて、アクリルアミド濃度は７．５〜１０％とし、そのゲルを、バイオラッド　ブロティーン（Ｂｉｏｒａｄ　Ｐｒｏｔｅａｎ）　１６　ｃｍ電気泳動装置にて、４０Ｖにて一晩泳動させた。　蛋白質バンドを、ニトロセルロース紙（ＢＭ８５、シュレイヒャーおよびシュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌ）社）へ、エリツクマン等（１９８２年）の方法によってトランスファーした。　ハウファー（Ｈｏｅｆｆｅｒ）　トランスファー装置を用いて、トランスファーは、７Ｖ／ｃｍで３時間行った。　トランスファーした後、メンブレンを洗浄し、３％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）のトリス緩衝食塩水溶液で、４℃にて一晩、ブロッキングを行った。１５Ｍ　ＮａＣＪ２．０．０５Ｍ）−リス−塩化物　ｐＨ７，５（ＴＢＳ）。　免疫活性は、単クローン性抗体あるいはウサギ抗血清と１，５〜２時間インキュベーションを行い、ＴＢＳにてＳ分間、４回洗浄をくり返すことで検出し、ペルオキシダーゼは、０．０５Ｍ）−リス塩化物　ｐＨ７，６の４−クロロ−１−ナフトール（ホーリス等、１９８２年）を用いて検出した。 ■ 監２コニ≦ヨ１区体ＥＬＩＺＡｓにおいて、フィブロネクチン特異性を示した２０の融合細胞株は、うまくクローン化され、腹水の場合と同じように増殖した。　さらに２つの融合細胞は、高希釈度（１１５０００）で被覆された血清を伴なうＥＬＩＺＡｓにおいて、牛血溝に対して活性を示した。　これら２２の抗体の特徴を表１に示す。　ウェスタン　プロットで単クローン性抗体Ａ２７と反応する血清成分の分子量は、牛ビトロネクチンに関して報告（ヘイマン等、１９８５年ｂ）されているものとよく一致した。　新鮮中血漿あるいは血清から抗原を調製するのに、単クローン性抗体Ａ２７のアフィニティー　カラムを使用した（方法とアフィニティー　りロマトグラフィー結果に関しては実施例２を参照）。　親和性で精製された抗原の蛋白染色とウェスタン　プロットを第１図に示す。　Ａ２７で検出されなかったバンドが、蛋白染色でも検出されなかったことは、高純度の抗原であったことを示している。（さらに詳細は実施例２を参照）。　牛ビトロネクチンを使った同定は、牛ビトロネクチン（ルオスラーティ（１：、　）ｉｕ（＋５ｌａｈｔｉ）氏の寄贈による）に対するウサギ抗血清を用いたウェスタン　プロットでプローブすることによって行った。　第２図が示すように、この抗血清は、精製した抗原（トラック４）と反応し、単クローン性抗体Ａ２７（トラック５．６．８）に対するＥＣＭ（トラック１）および胎児ウシ血清（Ｆｅ２）（）−ラック２）の反応性と類似したプロフィールを示した。　単クローン性抗体Ａ１８は、ウェスタン　プロットにおいては反応性は示さなかったが、ＥＬＩＺＡｓにおいて、精製した抗原に対して単クローン性抗体Ａ２７と同様の活性レベルを示した（第３図）。　２つの抗体は、ＥＬＩＺＡｓにおいて同時に添加すると付加的結合を起こした。　付加的結合実験結果は表２に示す通りである（２回目の実験結果も表２とかなり類似した）。　付加的結合（８５％以上）が観察されたが、これは、２つの抗体結合部位が十分離れており、Ａ１８とＡ２７間での立体障害がないことを意味している。　もう一つの実験で明らかなように、２つの単クローン性抗体は、同一の抗原に結合した。　標識していないＡ１８でトレイ状容器を被覆し、このＡ１８に結合させてビトロネクチンを固定させた時、１１２％で標識されたＡ２７はかなりの量がビトロネクチンに結合した（１２，８７３ｃｐｍ結合／ウェル）が、ｌ１ｌｌｌで標識したＡ１８は結合しなかった（わずかに１２５１　ｃｐｍ結合／ウェル）。　逆に、標識していないＡ２７でトレイ状容器を被覆し、このＡ２７に結合させてビトロネクチンを固定させた時、つづいて” ’Ｉ　−Ａ　１８とインキュベーションすると、かなりの結合（２２，６４０ｃｐｍ結合／ウェル）を示したが、　”’ｌ−Ａ２７ではほとんど結合しなかった（２７５４ｃｐｍ結合／ウェル）。　これらの結果は、Ａ１８がＡ２７とは異なった蛋白質に結合している可能性を打ち消しており、Ａ１８とＡ２７は、互いにかなり離れた抗原決定基を認識していることを示している。　固定化されたＡ２７に結合したビトロネクチンは、細胞付着を補助する領域を提供しているが、一方、固定化されたＡ１８に結合したビトロネクチンは、細胞付着に対して不活性であることに注目しなさい（実施例３参照）。　それゆえ、この結合に関するデータは、また、表面上に吸着されたビトロネクチンが、接近しやすい細胞結合性領域すなわち活性立体配置を提供するコンフォメーションをしているかどうか決定するのに、Ａ１８は免疫的プローブとして使用できることを表している。　抗 −フィブロネクチン単クローン性抗体は、ＥＬＩＺＡプレート上に被覆された精製フィブロネクチンに対して、種々の結合プロフィールを示した。これは抗体親和性が広範囲であることを示している。１、反応したバンドのおよその分子量、キロダルトン２、酵素免疫測定法、４５０ｎｍにおける極大吸収（ｂ）５ｕｇ／ｍＡの精製ビトロネクチンで予め被覆されたトレイ（実施例２）（ａ　−工　でビトロネクチン　Ｒ゛束かっ　・に　′　るため、およびｍ　は　からビトロネクチンを　・に′させるための、アフィニティー　りロマトグラフ　−におしる　−ビトロネクチン　の社五ｔ１．ｕ友珠クローン　アフィニテ　−カラム精製された抗体を、０．１Ｍへペス緩衝液ｐ）４７．５に対して透析し、スタンダードとしてＢＳＡを用いて２　ｍ　ｇ　／　ｍβに調節した（ローリ−等、１９５１年）。　メイエス（１９８４年）の方法により、２ｍｊ２の充填されたゲル当り１ｍ℃の抗体の割合で、抗体をアフィゲル　１０（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）社）に結合させた。　結合させたものをシリンジ内へ充填した。　ビトロネクチンは、この方法により、単クローン性抗体Ａ２７を使って牛血漿または血清より調製した。　抗原を含む溶液を０．１ｍｊ２／分でカラムにアプライし、数倍量の高塩濃度緩衝液（０，５Ｍ　ＮａＣｎ１０．０５Ｍトリス塩化物　ｐＨ７，５）で洗浄し、３Ｍ　ＭｇＣ２，１０，１Ｍ　トリス　ｐＨ７，０で溶出した。　溶出後、高濃度食塩を含んだ０．１Ｍトリス　ｐＨ８，５とＯ，１Ｍ酢酸　ｐＨ４，０で交互にカラムを洗浄し、防腐剤として０．０８％アジ化ナトリウムを加えたＰＢＳ中で４℃で保存した。　分画試料の希釈液で被覆したプレートを用いて、ＥＬＩＺＡにより、溶出画分中の抗原を検出した。　抗原を含む画分を集め、ＴＢＳに対して透析し、ツレセンおよびプロットベック（１９８７年）の方法によって蛋白量を計算した。Ａ２７　アフ　ニテ　−カラム　ゞ　って　たビトロ主之土ヱΩ双１バイオラッド　ＢＣＡ試薬とスタンダードとしての牛血清アルブミンとを用いて、精製されたビトロネクチンの蛋白量を測定した。新鮮中血清の希釈液および同じ血清から精製したビトロネクチンで、グイナテック　フレキシブル（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　ｆｌｅｘｉｂｌｅ　）ＥＬＩＺＡプレートを、同時に４枚、２日間４℃で被覆した。（１／１００以上の希釈率で血清からのビトロネクチンの被覆は定量的に行う。　アンダーウッドおよびベネット、１９８９年参照）ウェルを被覆したビトロネクチンは、精製された単クローン性抗体Ａ２７、Ｉμ ｇ／ｍ９を使って、ＥＬＩＺＡにより検出され、精製マウスＩｇＧ１．１Ｍｇ　／　ｍ　Ｉ２との非特異的結合のために集められた。　滴定曲線を、吸光度から描き、新鮮血清中のビトロネクチン濃度は、曲線の変位から計算した。 ■ 牛血清４０ｍｊ２試料から精製されたビトロネクチンの濃度は、３５５μｇ／ｍ ℃であることがわかった。　精製物質の全量は６．０ｍ℃であり、収量は２．１３ｍｇであった。　始めの４０ｍρ血清試料においては、これは、５３．２５μ ｇ／ｍ℃に値する。　第８図の滴定曲線の横軸におきかえたものにおいては、１．５βＯｇ２であった。　測定において、精製されたビトロネクチンの出発濃度は１．５５μｇ　／　ｍ　１２であり、新鮮血清の初めの希釈は１／１００であった。　それゆえ、新鮮血清中のビトロネクチン濃度は、１．５５÷２”　Ｘ１００＝５５μｇ　／　ｍ　Ｉ２と計算できる。　それゆえ、新鮮血清から精製されたビトロネクチンの収率（百分率）＝５３．２５÷５５Ｘ１００＝９６．８％である。置皿１１ユ旦１１時間、加湿された３７℃インキュベーターでインキュベーションすることにより、ＰＢＳによる接着性分子の希釈液で、３５ｍｍ径プラスチック微生物用容器皿（バンズル（Ｂｕｎｚｌ）、オーストラリア）を被覆した。　被覆用溶液を取り去り、ブロック用緩衝液（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）に置き換えた。　さらに１時間、３７℃でインキュベーションした後、このプレートを無血清イスコツ（Ｉｓｃｏｖｅ）の培地（ＳＦＩ）（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）で３回すすいだ。　ＢＨＫ−２１線維芽細胞を、０．０５％トリプシン１０．０２％Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　（ｔｒｙｐｓｉｎ／ＥＤＴＡ）に最小限さらすことで、単層より分散させた。　０．０２％ダイズトリブシンインヒビター（シグマ社）を含む１０倍量のＳＦＩを加え、これを中和した。　細胞を遠心分離した後、ＳＦＩ＋１％ＢＳＡ液中に再懸濁した。　ＳＦＩ＋ＢＳＡ液１＋ｎｊＺ中に細胞が３Ｘ１０’　〜１０６　個となる様にし、それを各国へ加えた。　加湿インキニベーターで３７℃で３０分間〜１時間、インキュベーションした後、非−接着性細胞を懸濁するために、各国の培地を静かにピペットで移し、ヘモサイトメーターにてカウントするために、試料を取り除いた。電気泳動とＥＬＩＳＡ試験の方法：実施例１参照。 ■ ビトロネクチンを　るためのアフィニテ　−　りロマトグラフ　−におしる　− ビトロネクチン　のＡ２７−アフィゲル　１０へ２ｍＪ２のＦＣＳをアプライした場合の溶出プロフィールを第４図に示す。　血漿でも類似したプロフィールが得られた。　この単一工程で、３Ｍ　ＭｇＣｇ２で、ビトロネクチン抗原の単一ピークが溶出された（第４図のフラクション１８−２２）ことがわかる。　得られたものを、（ＴＢＳを）３回取り替えながらＴＢＳに対して２４時間透析し、シリコン被覆チューブ中で、０．０８％アジドとともに４℃で保存した。されたビトロ　チンの１、　′　と　ニス　ンブロテ　ング抗原の純度試験のため、親和性で精製した物質１２μｇを、還元条件下、９％アクリルアミドＳＤＳゲル上の溝で泳動した。　蛋白染色ゲルと相応するＡ２７でプローブしたウェスタン　プロットを第１図に示す。　蛋白染色により、各々の分子量が約８３と７２ＫＤの２つのバンドが現われた（第１Ａ図）。両方のバンドは、Ａ２７によるウェスタン　プロット上でも検出されたが、この蛋白泳動時に、泳動させすぎたので、染色が拡散した（第１Ｂ図）。　第３のバンドは、分子量６０ＫＤでプロット上に検出され、さらに２つのわずかな（ｍｉｎｏｒ）バンドが１８０ＫＤ周辺に検出され得た。　Ａ２７によって検出されなかったバンドで、蛋白染色では検出されたバンドはなかった。　これは、抗原が高い純度であることを示している。　牛ビトロネクチンの作用を、ヒト分子に関して報告されたものと比べるため、精製された抗原を、還元条件下あるいは非還元条件下に、第ニゲルで泳動させ、１または２４時間、トロンビン処理を行った。　結果を第５図に示す。　非還元条件下で泳動させた時、約８０ＫＤの単一の大きなバンドと１８０ＫＤのこれより小さなバンドが観察された（トラック１）。抗原の還元により、前に見られた、７２ＫＤと８３ＫＤのバンドが生じた（トラック３）。　これらの分子量は、ヒトおよび牛ビトロネクチンに関して他者により報告されているものとよく一致する（ヘイマン等、１９８３年：ハーネス等、１９８３年；ヘイマン等、１９８５年ａ；アカマ等、１９８．６年；ダールバッグおよびボダック、１９８５年；ブレイスナー等。　抗原を保存すると、８３ＫＤ成分の相対量は減少し、７２ＫＤ成分の相対量は増加した。　トロンビン処理の結果、大きな方の分子の成分は比較的早い分解をし、小さい方の分子の成分はより遅い分解を行い、６０ＫＤの主生成物を生成した（第５図、トラック４と５）。　還元条件下のＳＤＳ電気泳動をする前に、ヒトビトロネクチンをトロンビンで処理すると、分子量５７〜６０ＫＤの主なフラグメントが生ずることは既に報告されている（ジルヌッツアーおよびハーネス、１９８４年；トマシニおよびモッシャー、１９８６年。　我々の結果は、高分子量バンドが相対的に早く消失し、低分子量成分が遅く消失することにおいて、後者の著者等の結果とかなり類似した。２、アンチトロンビン■に・する、Ａプラスチック上に被覆されたアンチトロンビン■へのヒトビトロネクチンの結合は既に述べられている（イウおよびルオスラーティ、１９８５年）。　プラスチック上に被覆されたアンチトロンビン■への牛抗原の付着能力は、次の様に試験した。　アンチトロンビン■で被覆し、ＢＳＡでブロックした後、１ウェル当り５０μβの抗原を、ブロッキング緩衝液中２００ｎｇ／ｍＩ２濃度で加えた。　これを室温で２時間インキュベートし、続いて、３分間ずつ３回、ブロッキング緩衝液中で洗浄した。　それから、実施例１の材料と方法の欄に記載されているように、ＥＬＩＺＡを続けた。　コントロールは、（ａ）アンチトロンビン■非存圧、（ｂ）抗原非存在、および（ｃ）非特異的ＩｇＧ１存在とした。　結果を表３に記す。アンチトロンビン■の被覆時の濃度１０μｇ　／　ｍ　１２以上において、抗体Ａ２７とＡ１８は、抗原存在下、特異的に結合し、抗原非存在下では、結合しなかったことが明らかである。　これは、抗原がアンチトロンビン■に結合することを示すばかりでなく、片方の抗体結合部位の近（にもう一つの結合部位がないことを示す。Ａｌ１　０．０１　０．０１　ＮＤＡＩ８　０．０５　０．３５　０．４３ａ　正常Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス血清から精製されたコントールＩｇＧｌｂ　オルトフェニレンジアミンの４５０ｎｍにおける吸光度、緩衝液のみで被覆されたものに対して修正された数値。２回の平均、　ＮＤ：測定せず。Ｃ牛血清アルブミンでプレートを被覆してブロッキングした後、２００ｎｇ／ｍｇ濃度の抗原を付与し、２時間反応させ、その後、未結合の抗原を流し去り、そして、１μｇ／ｍρ濃度の精製抗体を付与した。３、ヘパリンに・　る±Ａヘパリンへのヒトビトロネクチンの結合はすでに述べられており（ハヤシ等、１９８５年；ハーネス等、１９８５年、これらの著者等は、熱、尿素または塩酸グアニジンで変性されたビトロネクチンの結合の増加を報告した。　ヘパリンへの牛抗原の結合は、ヘパリン−セファロース（ファルマシア社）のアフィニティー　りロマトグラフィーにより試験した。　非特異的結合部位をふさぐため、ＥＬＩＺＡ用ブロッギブロッキング緩衝液ｉカラムをブレインキュベートした。　０．５ｍ℃ＴＢＳ中の抗原約２０ｕｇを、カラムにのせる前に、沸騰水浴水に５分間保持するか、あるいはそのまま直接、０．１ｍｊ２／分の流速でカラムにのせた。　そのカラムを３倍量のＴＢＳで洗浄し、高塩濃度緩衝液を用いて溶出させ、２００１．Ｌβずつ画分を集めた。（のせられた蛋白量は、カラムに付けたＵ ■モニターの検出限界以下だったので、結合しなかった物質の溶出をマークするために、試料にフェノールレッドを少量加えた。）。　ＰＢＳで１１５０に希釈された画分の５０μ忍試料で、ＥＬＩＺＡプレートを４℃にて一晩被覆し、それから、５０　ｎ　ｇ　／　ｍ　ＱのＡ２７を用いて、ＥＬＩ　ＺＡにて抗原を検出した。　結果を第６図に示す。　非変性抗原のうちの少量がへバリンカラムに結合しなかったが、一方、変性した抗原は全て結合した。　結合した抗原は、高塩濃度緩衝液で溶出した。土−豊皿ユ１上ヒトおよび牛ビトロネクチンの双方が、細胞接着を促進させると報告されている（ヘイマン等、１９８５年ａ；ヘイマン、１９８５年ｂ；ジりヌッツアー等、１９８５年）。　細胞接着研究の結果を表４に示す。　明らかに、ビトロネクチン抗原は、ＢＨＫ−２１細胞の抗原非存在下には反応しない表面への接着を促進した。　はとんどの細胞は、３０分以内に接着し、１〜２時間で伸展して平になった。表　４ビトロネクチン抗原に対する細胞接着と、抗体およびＲＧＤＳによる阻害処　理　非接着性細胞の数１　接　看５（％）抗原なし　２８．７５　００ｕ　ｇ／　ｍ　Ａ　ＲＧＤＳ’　６．０　７９．１２００μｇ　／　ｍ　！！、ＲＧＤＳ　１１．２５　６０．９４００μｇ／　ｍ　１２　ＲＧＤＳ　２２．２５　２２．６’６００μｇ　／　ｍ　１２　ＲＧＤＳ　２３．０　２０．０゜８００μｇ／ｍＪ２　ＲＧＤＳ　２５．０　１３．０”８４〜９回の実験の平均Ｃ抗原は一４μｇ／ｍ℃濃度で被覆した。特定濃度のＲＧＤＳを細胞と共に加えた。＊　接着の有意の阻害（ｐｒｏ、０１）。（偏差およびスチューデント・ニューマン・ケウルス試験の解析）ビトロネクチン　に、　る″とのヒトビトロネクチンは、固定比重クローン性抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによって精製されていた（ヘイマン等、１９８３）が、この方法は、中分子の精製に対しては、以前は適用できなかった。　これは、従来の研究者が使用していた単クローン性抗体が、牛ビトロネクチンと結合しないためである。牛ビトロネクチン精製の従来方法は、ビトロネクチンはあるガラスピーズに結合するという知見に基づいており、アフイーゲル　ブルー　カラムのクロマトグラフィーを使って血清アルブミンを取り除き、その後、血清からＩｇＧを取り除くため、プロティンＡ−セファロースカラムで、クロマトグラフィーを行うという予備工程が含まれていた。　これに続くガラスピーズのクロマトグラフィーは、ｐＨ依存性の溶出シーフェンスを含み、細胞付着活性のあるビトロネクチンの調製法を与えるが、これは、生化学または免疫学研究のために十分な純度をもたなかった。　ガラスピーズクロマトグラフィ一方法により調製されたビトロネクチンからの不純物を除去するために、イオン交換クロマトグラフィーあるいは他の（非免疫学的）アフィニティークロマトグラフィー技術による、さらなる精製が必要である。　従って、牛ビトロネクチンの精製のための従来技術は、この実施例で述べた、−回のアフィニティーカラム手順よりかなり長い手順である。ハヤシとクラウス（ＥＰ０２９２６６３、“生体材料からのビトロネクチンの単離”）は、牛血漿または血清へ応用できるであろうビトロネクチンの精製方法を述べている。　この方法は、部分的にビトロネクチンを変性するための、４〜８Ｍ尿素による試料の処理を含んでおり、それにより、単一工程手順でビトロネクチンを回収するために使用されている固定化グリコサミノグリカンへの親和性吸着を可能としている。　その回収率は１０〜４０％であったと述べられている。本出願における牛ビトロネクチンの精製方法と、牛血漿または血清からのビトロネクチンの除去方法は、先行技術に対して優れた点をもつ。　Ａ２７の使用は、ビトロネクチンを、１回の工程で定量的に、牛血漿または血清から選択的に取り去ることを可能にした（試料中には、ＥＬ　Ｉ　ＺＡによる場合と同様に、Ａ２７−マトリクスと接触して検出され得るビトロネクチンはなかった）。　さらに、本手順は、ハヤシの方法のように、完全な生体材料を変性試薬にさらす必要がなく、Ａ２７のカラムでビトロネクチンが個渇された血清または血漿は、他の、および、変性−感受性因子または蛋白質の精製に、あるいは、組織培養培地の成分に、そのまま使用することができる。　Ａ２７は、牛ビトロネクチンとの相互作用を示し、生物学的調製物から定量的にビトロネクチンを取り除けるだけの十分に高い親和性をもつ新規なアフィニティーマトリクスであって、しかし、精製されたビトロネクチンの９０％超の回収を達成するために、３　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｆ２２によってＡ２７−ビトロネクチン複合体の処理がなされた時にはビトロネクチンとの相互作用の親和性はかなり低（なるものを提供する。　さらに、Ａ２７アフイニテイーマトリクスは、幸運にも、複数回のサイクルにて再使用され得る。Ａ２７で調製されたビトロネクチンの特徴を調べたところ、その生化学的および生物学的活性は完全なままであることが明らかである。ゞからのビトロネクチンの８７、のための、−ビトロネクチン　の抗−ビトロネクチンアフィニティーカラムから溶出された牛血漿または血清は、完全にビトロネクチン成分が個渇されていた。　第７図は、Ａ２７−アフィゲルを通過した血清では、完全にビトロネクチンが検出されず、一方、塩化マグネシウム溶出液中には、かなりの活性が検出され得ることを示している。　牛血溝からビトロネクチンを精製するガラスピーズ方法では、この方法のように、血清からビトロネクチンを完全に選択的に除去する見込みはない。精製されたビトロネクチンの回収率と牛血溝からビトロネクチンを除去する効率は、次のように決定した。牛血溝４０ｍβ試料から精製されたビトロネクチン濃度は３５５μｇ　／　ｍ　Ａであることがわかった。　精製物質の全量は６．０ｍＩ２であり、収量２．１３ｍｇであった。　初めの４０ｍ℃試料にあてはめると、これは、５３．２５μ ｇ／ｍρの収量に値する。　第８図の滴定曲線の横軸は１．５εＯｇｚであった。　測定において、精製されたビトロネクチンの出発濃度は１．５５μｇ　／　ｍ　Ａであり、新鮮血清のはじめの希釈は１／１００であった。　それゆえ、新鮮血清中のビトロネクチン濃度は、１．５５÷２”　Ｘ１００＝５５μｇ／ｍｊ２と計算され得る。　それゆえ、新鮮血清から精製されたビトロネクチンの収率（百分率）＝５３．２５÷５５Ｘ１００＝９６．８％である。　このビトロネクチン−涸渇血清が、組織培養ポリスチレン上での細胞付着や増殖を維持する能力をもたないことについては、実施例３にて述べる。（実施例３）閏　のための　−ビトロネクチンおよび　−フブロネクチン　の　、およびこの　ゞによ　、のが　准されるか　されるかをゞ　る、におしる二進１０１１ユ１旦哨乳動物血清は、２つの主なる細胞接着性蛋白質、すなわちフィブロネクチン（別名、寒冷不溶性グロブリンおよびレッツ蛋白質）とビトロネクチン（別名、− １糖蛋白質、血清中伸展因子、エビボリンおよびＳ−蛋白質）とを含有する。　細胞接着と細胞伸展の程度を、血清含有培地からのフィブロネクチンの培養基体への吸着と関連づけている初期の実験は、血清中の接着／細胞伸展のほとんどは、フィブロネクチンに帰することを示唆した（グリフネルおよびフェルト、１９８２年）。　これは、抗−フィブロネクチン抗体による、血漿含有培地中の細胞伸展性の阻害（グリフネルおよびファン、１９８３年）と、フィブロネクチンのない血清含有培地中におけるいくつかの腫瘍細胞セルラインの伸展性の欠如（ラシャラマン等、１９８３年）によって支持されていた。　これらの研究と対をなし、状況証拠が、最も一般的な組織培養条件下において、細胞接着と伸展に有効な分子はビトロネクチンであることを示唆する。組織培養用に調製された牛胎児血清バッチは、しばしば４℃で凝集し、フィブロネクチンの無視できない個渇を生じさせる（ノックスおよびグリフイス、１９８０年）。　ヘイマン等（１９８５年ｂ）は、組織培養グレードの牛血溝の異なるロット間において、フィブロネクチンと比べて５〜５０倍の範囲でビトロネクチンが過剰であることを報告した。　ノックスおよびグリフイス（１９８０年）は、多くの異なった晴乳類種から血清を分画し、試験した全ての種に関し、フィブロネクチンピークに比べてビトロネクチンビークに、より高い細胞付着活性があることを示した。　フィーダーグリーンおよびステン（１９８０年）とミクル等（１９８３年）は、フィブロネクチ二／個渇血清を含む培地中での好結果の細胞伸展を報告した。　他の状況証拠は、ビトロネクチン被覆基体上や血清含有培地中で要求された付着および伸展条件の類似性に帰着するが、それはフィブロネクチン被覆基体上で要求された付着および伸展条件とは異なるものであった。　これらは、シクロへキシミドに対する細胞伸展の感受性（ノックスおよびグリフイス、１９８０年）、細胞表面ヘパラン硫酸上での細胞伸展の独立性（マツクインネス等、１９８７年）、細胞付着に必要なＣａ”の水準（ニドワード等、１９８７年）およびフィブロネクチンのための細胞表面レセプター活性をブロッキングしている抗体に対する感受性の欠如にューメイヤおよびルッター、１９８５年）を含む。　ノックス（１９８４年）は、３％未満の血清濃度では、フィブロネクチン上でその細胞伸展特性が生じ、一方、３％超では、ビトロネクチン上でのそれと相関した細胞伸展が生じたと説明した。　この著者は、血清濃度３％超では、フィブロネクチンの基体上への沈殿は、他の血清蛋白質によって阻害され、一方、ビトロネクチンの基体上への沈殿は影響を受けないことを示唆した。　血清含有培地中での活性付着／伸展因子としてのビトロネクチンのための証拠のこの主要部は、全て状況的性質のものである。　実施例３では、我々は、生体材料表面“組織培養用ポリスチレン”への接着性動物細胞の付着における、ビトロネクチンとフィブロネクチンの役割の研究のために、牛ビトロネクチンの精製のための、および、血清からのビトロネクチンの定量的かつ選択的涸渇のための、実施例２で概説した技術を用いた。　我々は、精製されたビトロネクチンとフィブロネクチンに対する、２種のかなり異なった細胞タイプの接着を比較した。　結論として、我々は以下を証明する。（１）組織培養ポリスチレンのような親水性生体材料表面上への線維芽細胞および内皮細胞の初期の接着／伸展は、ビトロネクチンのような接着性糖蛋白質の重合体の表面上への吸着性に完全に依存している；（２）これらの細胞のうちのい（っかが、固定化フィブロネクチンと付着しつるとしても、細胞が組織培養ポリスチレン上の血清含有培地中に播かれた時、双方のタイプの細胞に対して唯一効果的な細胞接着／伸展分子は、血清ビトロネクチンである；（３）血清ビトロネクチンのこの必要性は、培養培地へ水溶性フィブロネクチンを添加することによっては、たとえ高濃度でも、置換され得ない。これらの結果は、生物材料がイン　ビトロでの生物分野技術の適用（例えば細胞培養）のために使用され得る場合、また、生体材料が、その適用に際し、周囲組織の細胞の好適な付着が要求されるような移植に使用され得る場合に、生体材料表面の設計に関わっている。　従来は、そのような生体材料の設計は、い（らかの経験に基づいて行われていた。　細胞付着のための重合体表面の適応性あるいはその逆は、細胞接着性糖蛋白質を含むであろう蛋白質群による表面上への吸着性に依存しているから、重合体表面の一部としての生体材料の改良された設計は、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンのような、望まれた生物学的に活性な蛋白質と特異的に結合する単クローン性抗体を有するようにされるであろうことを、実施例３は示す。　多クローン性抗体よりはむしろ、単クローン性抗体の方が、そのような目的に好ましいであろう。　なぜなら、使用される抗体は、その抗体が結合する抗原決定基に対して選択され得るからである。　フィブロネクチンまたはビトロネクチンのような蛋白質は、多数の領域を持ち、各々が特異的な生物学的効果をもっている。　そのような目的に適応しつる単クローン性抗体は、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンに適当に高い親和性で結合する蛋白質であり、そして、これらの蛋白質を、細胞によって認識されつる細胞付着領域または細胞付着領域群に関する限り、そのような立体的配置とする抗体である。　実施例３では、我々は、実施例１で述べたヒトフィブロネクチンに結合する単クローン性抗体のあるものは、細胞付着が促進される部位である生体材料表面の一成分として使用することに適さないが、ヒトフィブロネクチンと反応する、他の２つの単クローン性抗体（Ａ３５とＡ９）は、この目的に好適であることを示す。　興味深いことに、フィブロネクチンに対する２つの単クローン性抗体、Ａ３５とＡ９は、フィブロネクチンのカルボキシ末端において、ヘパリン−結合領域で反応するが、この同じ領域でヒトフィブロネクチンと反応する、他の単クローン性抗体（Ａ３２）は、細胞付着および伸展を促進するために、固定比重クローン性抗体として使用するには不適当である。材上］■３Ｌ友迭紐鳳ヱ１牛角膜内皮細胞（ＢＣＥ）または牛角膜内皮細胞（ＢＡＥ）の−次培養は、マツフォースラン等（１９７９年）に述べられているように、去勢牛（雄の子牛）の目または大動脈から調製された。　培養は、マツコイＳＡ培地（サイトシステム、オーストラリア）、またはハンクスサルト（フロー（Ｆ　１　ｏｗ）社）を用いた培地１９９中にて継続された。　培地は、１０〜２０％ＦＣ３（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社）、１０−”Ｍチミジン、１００単位／ｍ℃ペニシリン、１００μ ｇ　／　ｍ　Ｉ２硫酸ストレプトマイシン、５０μｇ　／　ｍ　１２．カナマイシン、および５μｇ／ｍρフンギシン（Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）を含有していた。　細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで分散させた後、１：２〜１：４の分割比で継代を行った。　９〜１０継代を行った後、細胞を捨てた。　ＢＨＫ−２１線維芽細胞は、１０％トリプトースホスフェイトブロス（フロー社）、１０％ＦＣＳ、ベンシリン、およびストレプトマイシンを含む、培地１９９もしくはイーグル　サルトのダルベツコ修飾培地（ＤＥＭＥ、ギブコ社）中に保持した。　組織培養プラスチック容器は、タンク（Ｎｕｎｃ）またはコーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）のものを使用した。ゞからのフ　プロネクチンとビトロネクチンの、フィブロネクチンは、ゼラチン　セファロース（ファルマシマ社）を用いて、ＦＣＳバッチより、次のように除去した。充填されたゼラチン　セファロースを５体積倍のＳＦＭで洗浄し、その後、４体積倍の血清中へ掻き出した。　これを、時折撹拌しながら、室温に１時間放置した。　その混合物をクロマトグラフィーカラムへ注ぎ入れ、血清を抜き去り、− ２０℃で保存した。　ビトロネクチンを、ビトロネクチンを精製するために使用された同一の単クローン性抗体Ａ２７アフイニテイーカラムで、アフィニティー　りロマトグラフィーによって除去した（上記実施例１と２参照）。　アフィニティーカラムは、血清をアプライする前にＳＦＭで洗浄した。　画分な集め、− ２０’Ｃで保存した。　フィブロネクチンまたはビトロネクチンの非存在は、除去された血清の希釈液でＥＬＩＺＡプレートを被覆し、上記実施例２で述べたような単クローン性抗体でビトロネクチンまたはフィブロネクチンを試験することで証明した。　両方の接着因子欠除血清が必要な場合は、ビトロネクチンの前にフィブロネクチンを除去した。　すべての試料は、組織培養に使う前に、０．２２μｍフィルター（ゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ）社）を通して一過し、アフィニティー　クロマトグラフィーでの希釈を補った濃度で使用した。置皿１１試上二試験１．　−　におＧる、フ　プロネクチンまたはビトロネクチンの　に　る、プラスチック　を　た　クローン　の　。微生物用プレートまたは皿を、ＰＢＳ中１０ＬＬｇ／ｍｎ濃度の精製された単クローン性抗体と共に、４℃にて４８時間、インキュベーションすることにより、被覆した。　ネガティブコントロールは、適当なサブクラスの非特異的マウス免疫グロブリンで、ポジティブコントロールは、ＰＢＳのみで被覆した。　それらのプレートを、ＰＢＳ中１％濃度のＢＳＡで、室温で１時間ブロックし、ブロッキング溶液で一度洗浄し、その後、２μｇ　／　ｍ　Ｑのフィブロネクチンまたはビトロネクチンを含むブロッキング溶液と共にインキュベートした（ポジティブコントロールは、ブロックされずに、ＰＢＳ中のフィブロネクチンまたはビトロネクチンを受け入れたので、次に、ブロッキング工程を行った。）。　フィブロネクチンまたはビトロネクチン溶液と室温で２時間インキュベーション後、プレートをＳＦＭで３回洗浄した。　分散されたＢＨＫ−２１細胞（実施例２参照）を、ＳＦＭ＋１％ＢＳＡ溶液中、３〜５Ｘ１０’（個）／ｍｎで添加して、３７℃にて、４５分間あるいはそれ以上インキュベートした。　静かにピペットでとった後、ヘモサイトメーターで細胞数を数えるために、培養上清試料をとった。　細胞接着の割合（百分率）は、１００×［ネガティブコントロールのカウント数−実験カウント数］／ネガティブコントロールカウント数として計算してめた。試験２．　への　・　にお番る　クローンの　の、−：　を　るための、プラスチックに１　されたフ　プロネクチンまたはビトロネクチンの　：および　・　にお番る　クローン　の　の適肘二この試験は、ハーネス等（１９８３年）に述べられたものを応用した。　室温で２時間インキュベーションすることにより、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンのＰＢＳ希釈液で、３５ｍｍ微生物用プラスチック皿（バンゼル（Ｂｕｎｚｅｌ）社、オーストラリア）または２５ウエル微生物用プレート（ステリリン（Ｓｔｅｒｉｌｉｎ１社）（各々２ｍｊ２と１ｍｎ）を被覆した。　ネガティブコントロールは、ＰＢＳのみで被覆したものであった。　すべての覆われていなｊｓ蛋白質結合部位をブロックするため、さらに１時間、被覆溶液を同容量の１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で置きかえた。　プレートを、同容量の無血清培地（ＳＦＭ）で３回すすいだ、ＳＦＭ＋１％ＢＳＡ中の精製された単クローン性抗体を、６２．５μｇ　／　ｍ　１１濃度で加え、室温でさらに２時間（インキュベート）シた。　（ポジティブコントロールには非特異的なＩｇＧを含ませた。）　ＳＦＭ＋１％ＢＳＡ中における細胞懸濁液のこの量の１／４を、最終抗体濃度５０μ ｇ／ｒｒｌ、最終細胞濃度３〜５Ｘ１０’（個）７ｍ１２となるように加えた。　それらのプレートを、加湿ＣＯ□インキュベーター（フォルマ（Ｆｏｒｍａ）　社）で、３７℃にて４５〜７０分間インキュベートし、非接着細胞の数を、前述のセクション１で説明した手順で測定した。試験３．　細　にお番る　クローン　の　をみ（ムめの冬　された　・この試験は、前述の試験１で述べられた試験の延長である。　フィブロネクチンまたはビトロネクチンとインキュベート後、それらのプレートをブロッキング溶液で一度洗浄し、それから、被覆で使用したのと同一の単クローン性抗体であって、ブロッキング溶液中、１０μｇ　／　ｍ　ｇ濃度のものと共に、３７℃で１時間、インキュベートした。　それらのプレートをＳＦＸで３回洗浄した後、上述の試験１で述べたように、細胞と共にインキュベートした。プラスチック　）　プロネクチン　ビトロネクチンと　クローン　フィブロネクチン　ビトロネクチンの細胞接着試験におけると同様に、プレートを単クローン性抗体で被覆した（試験１で上述）。　ブロックした後、ある濃度範囲でフィブロネクチンまたはビトロネクチンを含むブロック溶液を加えた。　同時に、ＰＢＳのみで被覆したプレートを、同一濃度範囲のフィブロネクチン／ビトロネクチンのＰＢＳ溶液と共にインキュベートした。　２時間インキュベートした後、これらのプレートを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液でブロックした。　ここで、全てのプレートをＳＦＭで３回洗浄した。　それから、いくつかを細胞接着用に使用し、他はＥＬＩＺＡ用に使用した。　ＥＬＩＺＡでは、ウサギ抗−フィブロネクチン／ビトロネクチンを使用しくコントロールは、免疫前のウサギ免疫グロブリンを使用）、ペルオキシダーゼ標識ブタ抗−ウサギ第２抗体１／ＩＫ（ダコ（Ｄａｋｏ）社）で検出した。　バックグラウンドを減じるため、複合溶液には、１０％ＦＣＳと１０μｇ　／　ｍ　ＩＩ正常マウスＩｇＧを含有させた。　ＥＬＩＺＡは、融合細胞のスクリーニングについて上述したように行った。最終反応生成物の一部を、プレートリーダーで読むために、９６ウエルプレートに移した。された　クローン　からのフ　プロネクチンの凱含Ω皇互フィブロネクチンは、クロラミンＴ方法（スターり等、１９８３年）を使って、　”’Ｉ　（アマジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）社）で標識した。　これに非放射性のフィブロネクチンを加えて、１分間、１ｍ４２当たり、１００．０００カウントとなるようにした（およそ１：８０００　放射性：非放射性フィブロネクチン）。被覆された抗体とフィブロネクチン（２μｇ／ｍβ）のインキュベーションは、試験１について上述したように行った。同一の単りローン性抗体１０μｇ／ｍβ；細胞３Ｘ１０’（個）／ｍｊ２；両方、または何も含まないＳＦＭ＋１％ＢＳＡを加え、−３７℃でプレートをインキュベートした。　いろいろな時間において、結合したおよび遊離のフィブロネクチン量を測定した。　各処理／時間の組み合わせについて、二重で試験を行った。　１０工は直接上清からカウントした。　表面−結合物質は、Ｃａ”とＭ　ｇ　２　’とを含まないＰＢＳＩｏ、０３％濃度のトリプシン（ギブコ社）とともに、−晩、インキュベーションし、続いて、ＳＤＳを３．３％（ｗ／ｖ）まで添加し。３７℃でさらに２時間インキュベーションすることによって放出させた。　それから、上清を定量的にとり、カウントした。　解離百分率は、１００×遊離のカウント／遊離子結合のカウントとして計算した。血漿か　フィブロネクチンを　する、されクローン　いたヒトフィブロネクチンへの弐社ヌンク　マキシソーブ　ＥＬＩＺＡ　プレート（Ｎｕｎｃｍａｘｉｓｏｒｐ　ＥＬＩＳＡ　ｐｌａｔｅ　）またはフロー微生物グレード−９６ウエル培養プレート（Ｎｏ、７６−２３２−０５）を、精製された単クローン性抗体Ａ３５であって、ＰＢＳ中２０μｇ／ｍβ濃度のものを、１ウェル当り５０μβ使用し、４℃ で３時間被覆した。　ネガティブコントロールとして、牛フィブロネクチン特異抗体（Ａ２２）と牛ビトロネクチン特異抗体（Ａ２７）で同様に被覆した。　コーティング溶液除去後、新鮮ヒト血漿希釈液をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。　細胞接着は、各ウェルにＢＨＫ−２１ハムスター腎臓細胞を加えて測定した。　３７℃、１時間のインキュベーションの後、細胞接着の程度を、オリバー等（１９８９年）の方法により、接着細胞の固定とメチレンブルーでの染色を行って測定した。同時に、血漿希釈液からＡ３５に結合したフィブロネクチン量を、ビオチン標識単りローン性抗体Ａ９、Ａ３２またはＡ１４と精製されたフィブロネクチンを同時に用いたＥＬＩＺＡの用量依存曲線により見積った。　これらの抗体は、フィブロネクチン上のＡ３５の結合部位から離れた部位と結合する。Ａ９とＡ３２は、フィブロネクチンのヘパリン結合領域と、そして、Ａ１４は細胞結合性領域と結合する（実施例３参照）。ヒトフ　プロネクチンおよびヒトフ　プロネクチンフラグメントに・　る　クローン　の±Ａの゛ＩＥＬＩＺＡトレイを、５μｇ／ｍβヒトフィブロネクチン、または同濃度の牛フィブロネクチンで被覆し、それからトレイをブロックし、単クローン性抗体と共に、室温で２時間インキュベートした。　３種の単クローン性抗体濃度、０．　１μｇ／ｍｇ、Ｉμｇ／ｍｊ２および１０ＬＬｇ／ｍｎを用いた。結合した単クローン性抗体は、１２５Ｉ−標識ヤギ抗−マウスＩｇＧとのインキュベーションによって検出した　（各ウェル当り３００，０００ｃｐｍ／　５０　ｊＬｌ、非標識ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗血清の０．００２希釈を付加的に含んだＥＬＩＺＡ洗浄緩衝液で調節）。ヒトフィブロネクチンからの３つのフラグメントを、ＥＬＩＺＡトレイを被覆するために、次のように使用した。（１）　３０，０００ダルトンの”ゼラチン−結合領域”をトリプシン切断により生成させた（ビールスクバツヒヤー、ヘイマン、およびルオスラーティ（Ｐｉｅｒｓｃｈｂａｃｈｅｒ、ＭＤ、　Ｈａｙｍａｎ、ＥＧ。ａｎｄ　Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ、　Ｅ　）　、１９８１年、セル　２６巻、２５９ −２６７頁）：（２）フィブロネクチンのカルボキシ末端から、４０．０００ダルトンの”ヘパリン−結合領域”を、キモトリプシンによる切断により生成させた；および（３）　１２０，０００ダルトンの細胞付着領域を、キモトリプシンによる切断により生成させた。これらのフラグメントは、２．５μｇ　／　ｍ　！！、と５μｇ／ｍρで２４時間被覆した。　単クローン性抗体（１μｇ　／　ｍ　１２または１０μｇ／ｍｌを、この固定化フラグメントと共に、室温にて２時間インキュベートし、その後、結合した単クローン性抗体を、上述のように検出した。 ■ ヒトフィブロネクチンへの単クローン性抗体の交差反応活性の決定およびヒトフィブロネクチンのフラグメントに対するＡ９、Ａ３５およびＡ３２により認識される抗原決定基の同定。第９図は、ヒトフィブロネクチンとの、抗フィブロネクチン単りローン性抗体（実施例１で述べたもの）のパネル交差反応活性を示す。　抗体Ａ３５、Ａ９、Ａ３２、Ａ１７、Ａ１４およびＡ１０は、ヒトフィブロネクチンと結合し、また、牛フィブロネクチンとも結合することが明らかである。　これらの単クローン性抗体のうち、Ａ１７、Ａ１４およびＡ３２を、抗体として細胞培養基体上へ固定した（さらに詳細にはこの実施例３を参照）。Ａ３５、Ａ９およびＡ３２の、ヒトフィブロネクチンからの３つのフラグメントとの交差反応活性を試験した。　これらのフラグメントは；（１）　３０，０００ダルトンの”ゼラチン−結合領域”を、トリプシン切断により生成させた（ビールスクバッヒヤー、ヘイマン、およびルオスラーティ、１９８１年、セル　２６巻、２５９−２６７頁）；（２）フィブロネクチンのカルボキシ末端から、４０．０００ダルトンの”ヘパリン−結合領域”を、α−キモトリプシンによる切断により生成させた；および（３）　１２０，０００ダルトンの細胞付着領域を、α−キモトリプシンによる切断により生成させた。第１０図と第１１図は、Ａ３５、Ａ９およびＡ３２が各々、フィブロネクチン鎖のカルボキシ末端からのヘパリン−結合フラグメントと特異的に反応したことを示す。フィブロネクチンまたはビトロネクチン゛：Ｆ　での１・血清含有培地中でのフィブロネクチンとビトロネクチンの効果を比べるため、ＢＨＫ−２１線維芽細胞およびＢＣＥ細胞を、これらの分子を選択的に涸渇させた培地中で増殖させた。接着実験をするため、細胞単層を分散させ、ダイズトリブシンインヒビターで処理した。　その後、それらを２０％全ＦＣ３、あるいは、フィブロネクチンまたはビトロネクチンを除去した２ｏ％ＦＣＳ、あるいはＳＦＭを含有する増殖用培地１ｍｊ２中に、１ウェル当り、Ｉ　Ｘ　１０’個のＢＨＫまたは７×１０４　個のＢＣＥで、２４ウ工ル組織培養プレート（コ２ター（Ｃｏｓｔａｒ）社）へ播いた。　処理は３組ずつ行った。　培養は、３．５時間口とそれ以後毎日、試験した。　コントロールウェルは、細胞なしで、種々の培地を含有した。３．５時間口には、双方のタイプの細胞は、全血清またはフィブロネクチン除去血清を含む培地中で、よく伸展していた。　対照的に、ＳＦＭとビトロネクチン除去血清を含んでいる培地中では、双方のタイプの細胞は、接着性に乏しく、かなり丸かった。　２４時時間化細胞の外観を観察すると、双方の細胞タイプは、フィブロネクチン欠如培地中で、正常の接着性と増殖性を示した。　ビトロネクチン欠如培地およびＳＦＸ培地中では、細胞は、特にＢＨＫ−２１細胞は、凝集する傾向があって、接着性に乏しかった。　より長いインキュベーションをしても、細胞の相対的な外観は変化しなかった。　ＢＡＥ細胞は、ＢＣＥ細胞と本質的には同じような様相を示した。　基体上にプレコートされて、あるいは、培地中に含有せられて、正常細胞接着と増殖を維持するのに必要とされるビトロネクチンまたはフィブロネクチンの濃度を確かめるために、第２増殖実験を計画した。　組織培養プレート（２４−ウェル）を、ビトロネクチンまたはフィブロネクチンにて、ＰＢＳ中で０．１．２．５、または５μｇ／ｍＩ２濃度で（１ウェル当り０．５ｒｒｌ）、３７℃、２時間で被覆した。　ＳＦＭでプレートを完全に洗浄した後、フィブロネクチンおよびビトロネクチン双方を除去した２０％血清を含む培地１ｍＪ２に、１ウェル当りｌ×１０１　（個）ＢＨＫ−２１または６Ｘ１０’　（個）ＢＣＥとなるよう、細胞を播いた：　このようにして、存在する外因性の接着因子のみが、基体上を被覆した因子となるようにした。　第２のプレートのセットはプレコートしなかったが、しかし、フィブロネクチンおよびビトロネクチン双方を除去した２０％血清を含む培地中に、同じ細胞濃度で播き、その後、これら物質のいづれかを、１μｇ　／　ｍ　Ｉ！、〜５０μｇ／ｍβ の濃度範囲となるように追加した。　これらの場合、外因性の接着因子は、覆っている培地中に存在した。　コントロールの培養は、２０％全血清を含む培地中で始めた。　培養は、毎日観察を行った。　組織培養ウェルに吸着されたフィブロネクチンとビトロネクチンの相対量は、被覆の前と後に、微生物用プレートに関する材料と方法の項で述べたように、ＥＬＩＺＡにより測定した。　被覆濃度範囲１〜５μｇ　／　ｍ　Ｑでのビトロネクチンの平均吸着率は７４．３％±３．１　（５％信頼区間）であった。　同じ範囲でのフィブロネクチンの平均吸着率は８６．８％＋２．９　（５％信頼区間）であった。　フィブロネクチンはビトロネクチンよりもわずかに高い吸着効率を示したが、これらの値は、微生物用器を被覆する時観察された値と類似している。２４時時間化細胞の外観の観察を行った。　双方の因子が欠如した培地中で、双方のタイプの細胞は、かなり悪い様相を呈した。　５０μｇ　／　ｍ℃までの濃度範囲において、覆っている培地にフィブロネクチンを添加しても、接着、伸展および増殖は改善されなかった。　反対に、２，５μｇ／ｍβ（１，ＬＸｌ　０ −”　Ｍ）以上のフィブロネクチン濃度でプレコートされたウェルにおいては、正常な接着、伸展および増殖が示された。　フィブロネクチンの場合とは対照的に、ビトロネクチンはプレコートしてもあるいは培地中に添加しても、正常な細胞の接着、伸展および増殖の促進において、同等に有効であった。　いずれの場合も、ビトロネクチンは２．５μｇ／ｍρ（３，６Ｘ　１　ｔＩ”　Ｍ）以上の濃度で有効であった。この増殖実験により、これらの二つの細胞タイプに対し、フィブロネクチンは、それが細カ包培養基体上にプレコートされた時のみ、接着性分子として利用され得、それは血清含有培地からは補充され得ないことが、明白に証明された。　この差異の理由は、１０％ＦＣ３（双方の分子を除去したもの）含有のＰＢＳを用いた場合に比較してＰＢＳを用いた場合に、９６ウ工ル組織培養プレート（コーニング社）上に被覆されたビトロネクチンとフィブロネクチンの量を比較することで証明された。　各希釈剤中で１０μｇ　／　ｍ　（ｌから始まる、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの一連の２．２倍希釈液を、９６ウエルプレートの２つのウェルへ添加した。　３７℃に２時間保持後、プレートを１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で、３７℃にて、１時間ブロックした。　吸着されたフィブロネクチンとビトロネクチンを、１μｇ　／　ｍ　Ａ２の単クローン性抗体Ａ１２とＡ２７を用い、ＥＬＩＺＡで検出した。　血清存在下の被覆の相対的有効性は、血清非存在下のＥＬＩＺＡでの吸光度の百分率として評価した。　結果を表５中に示す。　ビトロネクチンは、ＰＢＳ中にて到達した水準の５０％水準まで、血清存在下においてもなお吸着し、一方、フィブロネクチンの結合は、他の血清蛋白質の存在で９７％減少したことが明らかである。　これは、５０μｇ　／　ｍ　２のフィブロネクチン含有培地中において（大部分の培養培地中で期待される値より、十分に高い）、ＰＢＳ中、１．５μｇ／ｍβに相当する最高水準の被覆が期待できることを意味している。　これは、増殖実験から決定された、臨界限界よりも下である。７、が　されている　Ａ、　るいは、が　されている　人の、７、−　日の　Ａの　。これらの結果を表６に示す。　大部分の抗体において、適正な水準の抗原が、各々２μｇ　／　ｍ　Ａ濃度のフィブロネクチンと１μｇ　／　ｍ　Ａ濃度のビトロネクチンから、被覆された抗体に結合した。　例外として、Ａ２５の場合は、被覆された抗体に対するフィブロネクチンの結合が非常に不十分であることが示された。　この理由により、Ａ２５は、いかなる固定化抗体細胞接着試験にも使用されなかった。非特異的マウス抗体および非特異的ウサギ抗体に対して希釈（１０μｇ　／　ｍ βからはじまっている）で、単クローン性抗体の最大結合量はｌμｇ／ｍρである。３、プロツキング工程以前に、コントロールのウェルはリン酸緩衝液で被覆し、　それから、　フィブロネクチン／ビトロネクチンは、　リビトロネクチンまたはフ　プロネクチン　Ａ　るた　の−ビトロネクチンまたは　−フ　プロ、クチン　のと、冬　された　に・し、て　められな　・　およびプラスチック表面上に被覆されたいくつかの抗体は、試験１で述べたように、フィブロネクチンまたはビトロネクチンと結合して、少なくとも２４時間は、安定した細胞接着と伸展を維持した。　細胞に対するこれらの接着性分子の濃度範囲を提供するために、基体としてのそれらの性能を、微生物用プラスチックの性能と比較した。　結果を第１２図に示す。　Ａ２２またはプラスチック上に存在したより高濃度のフィブロネクチンに対する細胞接着に関しては、はとんど差異は認められなかった、　使用された中での最低濃度（０，０６μｇ）の際、Ａ２２上に存在したフィブロネクチンは、プラスチック上での細胞接着よりも、十分に大きな細胞接着を生じた。　同様の傾向が、ビトロネクチンについて観察された。　ビトロネクチン濃度がより高い時、プラスチックはＡ２７よりも、細胞接着のためのビトロネクチンの提供に関し、少しだけより大きい効果を生ずると思われたが、一方、より低い濃度の時は、その結合曲線は交差して、Ａ２７上のビトロネクチンはプラスチック上のビトロネクチンよりもより大きい細胞接着を生じた。　これらの結果は、ＥＬＩＺＡによって測定された、抗体またはプラスチックに結合したフィブロネクチンとビトロネクチンの相対量に影響された（表７）。　抗体反応性に関して、プラスチックに対する抗原の結合の影響は未知であるから、絶対的な値はプラスチックと抗体との間で比較できない。　しかしながら、その相対量は、抗原の異なる希釈間で比較できる。他の単クローン性抗体は、試験１について記載したように、プラスチック表面上へ固定化した時、フィブロネクチンまたはビトロネクチンと結合できたが、その結合されたフィブロネクチンまたはビトロネクチンは、細胞付着および伸展に適した表面を提供しなかった。　この試験では（表８）、５つの抗体が阻害性であると確認された（Ａ２５は含まず）；これらの中で４つは、試験２でもまた、阻害性であったが、その効果は１．５時間のインキュベーションまでしか検出できなかった。　試験１を延長してインキュベーションすると、阻害性効果が強まる傾向があり、３７℃、２４時間後には、これら５つの抗体を被覆したフィブロネクチンまたはビトロネクチンに対する意味のある接着は全くなかった。　また反対に、Ａ１２、Ａ２２、Ａ２３、Ａ３５またはＡ２７上を被覆したフィブロネクチンまたはビトロネクチン上で、２４時間、細胞をインキュベートしたところ、細胞は、およそ１００％が接着し、よく伸展することが示された。　他の一連の実験では、新鮮ヒト血漿からのフィブロネクチンを吸着するために、単クローン性抗体を固定化して使用し、その後、線維芽細胞の付着性に関する表面の適応性を試験した。　第１３図は、マキシソーブとフロープレートの双方で、特異的な細胞接着は、Ａ３５上でヒト血漿希釈液を用いた時のみ認められ、そして、各々牛−特異的抗−フィブロネクチン抗体および抗−ビトロネクチン抗体であるＡ２２およびＡ２７上では、認められなかったことを示す。特異的な細胞接着は、Ａ９をプレートを被覆するために用い、ヒト血漿と細胞を同じ方法でアプライさせた時にもまた、認められた（データは掲載していない）。１、　添加された細胞中の、４５分後に接着した細胞の百分率。　フィブロネクチン／ビトロネクチンは、２μｇ／ｍ℃濃度で被覆し、抗体は５０μｇ／ｍβ濃度であった。２、　添加された細胞中の、１．５時間後に接着した細胞の百分率。　抗体は１０μｇ／ｍＩ２濃度で被覆し、その後、２μｇ　／　ｍ　１２濃度のフィブロネクチン／ビトロネクチンを使用した。３、　単クローン性抗体のかわりに、非特異的マウス免疫グロブリンＧを用いた。４、　単クローン性抗体のかわりに、リン酸緩衝液を用いてプレートを被覆し、続いて、リン酸緩衝液で２μｇ／ｍβとしたフィブロネクチン／ビトロネクチンを用いた。＊　非特異的マウス免疫グロブリンを用いたコントロール（標準アッセイ）またはリン酸緩衝液コントロール（抗体被覆アッセイ）と比較して、十分に接着が減少した。Ｐ＜０．０５．スチューデント・二ニーマン・ケウルス試験（９回の評価の平均）。ＮＢ　これら二種のアッセイは、異なる日に行なった。第１４図は、３つの異なる単クローン性抗体であるＡ９、Ａ３２またはＡ１４を検出に用いた、第１３図と同じような、同じ血漿試料との単クローン性抗体結合滴定曲線を示す。　記載されていないが、滴定曲線は、精製されたフィブロネクチンスタンダードと比較することによって定量され得る。これらの結果は、細胞接着を促進する、あるいは、それを妨げるために、異なる方位を持った接着性分子を提供するのに、単クローン性抗体が使用され得ることを示している。　本発明で設定した条件で、プラスチック上を被覆しているのに比べて抗体上を被覆している、フィブロネクチンとビトロネクチンとの間で、同様の効果が観察された。　しかしながら、グリンネルおよびフェルト（１９８２年）は、細胞接着活性を犠牲にした微生物用プラスチックに対するフィブロネクチンの被覆について述べており、そして、レワンドウストリア等（１９８８年）は、異なるフィブロネクチンフラグメントの異なるプラスチック結合特性について述べている。　対照的に、被覆された抗体分子は、特異的な方位について相同的な抗原を提供するであろう、　我々は、初めの抗体被覆について、ひとつの濃度と方法のみを調べた。　初めの抗体被覆条件をうま（操作することによって、低濃度のフィブロネクチンまたはビトロネクチンに対する細胞接着の効果を増すことが可能であろう。接着性糖蛋白質を特異的に吸着し、そして、細胞集落化のための活性表面を提供するための、固定化単クローン性抗体を使用するこの方法は、接着性蛋白質の起源である患者と同じ患者からの血清または血漿物質を使用するのが好ましい場合、特に有用であろう。　この理由により、ヒトフィブロネクチンと反応する単クローン性抗体Ａ３５またはＡ９を含有する表面は、移植前に内皮細胞を伴った血管性移植片を予め植え込むような適用に好適かもしれない（ヘーリング等、１９７８年）。　固定化単クローン性抗体からなる表面を提供することによって、接着性糖蛋白質は、血清または血漿からその表面上へ、選択的かつ迅速に吸着されるかもしれない。　他の血清蛋白質とのプラスチック上の結合部位の競合により、フィブロネクチンは血清中からプラスチック表面上へ効果的に吸着されず、そして、細胞接着のための活性フィブロネクチン濃度に達するようするためには、精製されたフィブロネクチンを使用しなければならないことを、我々はここで示す。　固定化単クローン性抗体の使用により、フィブロネクチンを血清または血漿から表面上へと吸着させることが可能となり、それにより、細胞付着に十分な高濃度を与え得る。　臨床的使用においては、精製工程を必要としない迅速な手順で、患者自身の血漿または血清を、接着性蛋白質で表面を被覆するのに使用することができるという明らかな利点がある。その方法は、フィブロネクチンとビトロネクチンの機能を細胞接着機能以外にまで広げられるかもしれない。　フィブロネクチン分子またはビトロネクチン分子上の特定の領域と反応する単クローン性抗体は、コラーゲンまたはプロテオグリカンへの結合のような、特定の機能を均一にブロックしたり高めたりするために、ある方法にこれらの分子を提供するのに使用され得るであろう。　その方法はまた、内皮細胞のような細胞が細胞増殖および集落化に必要あるいは好ましいとする成長因子の提供のような、表面の細胞集落化に要求される他の因子の提供への、特異的な単クローン性抗体の使用に広げられるであろう。　そのような応用は、生体材料分野において、かなり影響を与える結果をもたらすことは明らかである。・　、　のた　の　された　・　・　におしる　の試験３の使用の背後にある原理は、フィブロネクチンのような二価の分子では、分子は、そのひとつの腕で、阻害的抗体基質に繋がることができ、さらに、細胞接着を媒介するための、繋がっていない第二の腕を有することであった。　もし抗体が一番上層にあるならば、多分、分子の両方の腕は、抗体結合されているであろう、　これを試験するために、相対的な効果を直接比較できるよう、全３タイプの接着試験を同日に行った。　ビトロネクチンは一価であり、Ａ１８を用いた試験１では、すでに、０に大して違わないレベル（表８）まで、細胞接着は減少していたので、これはフィブロネクチン抗体を用いてのみ行った。　試験３の結果を表９に示す。　各阻害性抗体は、試験２または試験１のいづれかと比較して試験３で、効果の増強を示した。　その上に、Ａ７は、試験３により、阻害性抗体として同定された。　阻害的活性を示していない抗体（表８中のＡ２２とＡ２３で代表される）は、試験１と３の双方で、優れた接着性を示した。単クローン性抗体　アッセイ２　アッセイ１　アッセイ３試験３でみられた阻害効果の増加は、被覆した抗体からのフィブロネクチンの単なる解離によるものではないことを証明するために、Ａ１７抗体とＡ２３抗体からの１ｉＳ工標識フイブロネクチンの解離度を、擬制的な条件下で、細胞接着試験のそれと比較した。　結果を表１０に示す。　２つの抗体からの１１エフイブロネクチンの解離度は、かなり近かった。　両者の場合において、反応液相中の単クローン性抗体の存在（擬制的な試験３）は、解離度に影響しなかった。　細胞の存在は、フィブロネクチン解離をかなり増加させたが、そのレベルは、両者の抗体について、なお近いものであった。　これは、細胞試験１と細胞試験３でみられる阻害効果は本当のものであり、固定化抗体からのフィブロネクチンの特異な解離によるものではないことを示す。　Ａ１７とＡ２３に初めに結合したフィブロネクチンの量は、かなり近く（表６中のＥＬＩＺＡ結果）、Ａ１４、Ａ２２、Ａ２４およびＡ３２に対する結合量ともまた近かった。　Ａ７に対して結合した量はより少なく（表６）、そして、この初期のより低い結合濃度が、細胞接着の減少を生じさせるかもしれないと主張するかもしれない。　しかじな力Ｓら、細胞は、プラスチック上に被覆されたフィブロネクチンに接着したのと同様に、抗体Ａ７上に被覆されたフィブロネクチンにも接着した（表８と表９、カラムｌと２）。　このように、試験３（表９、カラム３）で観察された阻害は真正であると思われる。　３種の異なった試験を同時に行った際、解離度は各場合で同様となるであろう。記載した結果は、細胞接着を促進するための、または、それを妨げるための、異なる方位での接着性分子を提供するために、固定比重クローン性抗体が使用され得ることを示す。　試験２対試験３で阻害性単クローン性抗体の検出を比較した結果は、この方法が、そのような試験（試験２）の標準型よりも、感度がよりよ（（例として単クローン性抗体Ａ７を用いた結果参照）、そして、より持続的な終点をもつ、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの接着活性の免疫生物試験の基礎を形成するものであることを示す。　フィブロネクチンおよびビトロネクチンのような、細胞外マトリクス分子の、細胞との、あるいは相互の反応性は、重要性が増している。　ある病的な状況において、マトリクス分子の産生と構成の誤り、あるいは、基底部膜と結合性組織の破壊が生ずるであろう（ティンプルおよびドウズイアデク、１９８６年）。　例えば、ある腫瘍患者において、フィブロネクチンの異なる分子量型または凝集状態が生ずるであろう（バーラチ等、１９８６年）；（ヴイルラード等、１９８８年）。　そのような変化の機能的な重要性はほとんど知られていない。　特異釣車クローン性抗体で固相領域は、細胞接着に関して本発明で述べたと同様の方法で、特定の抗原の機能的状態に対する、感度のよい特異的な試験に、定量試験と同時に、使用され得るであろう。文−支アカマ（Ａｋａｍａ、　Ｔ、）等、ジャーナル　オブ　バイオケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１００巻、１３４３〜１３５１頁、１９８６年；ベラチャ−（Ｂａｅｔｓｃｈｅｒ、　Ｍ、）等、ジャーナル　オブ　セル　バイオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）、１０３巻、３６９〜３７８頁、１９８６年；バーラチ（Ｂａｒｌａｔｉ、　Ｓ、）等、フロンティア　マトリクス　バイオロジー（Ｆｒｏｎｔ、　Ｍａｔｒｉｘ　Ｂｉｏｌ、）　、１１巻、１７４〜１８２頁、１９８６年；ハーネス（Ｂａｒｎｅｓ、Ｄ、Ｗ、）　等、ビーーｓヌーｚイーｚス（ＰＮＡＳ）　、アメリカ合衆国、８０巻、１３６２〜１３６６頁、１９８３年；ハーネス（Ｂａｒｎｅｓ、　Ｄ、　Ｗ、）等、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２６０巻、９１１７〜９１２２頁、１９８５年；ダールバックおよびボダック（Ｄａｈｌｂａｃｋ、　Ｂ、　ａｎｄ　Ｐｏｄａｃｋ、　Ｅ。Ｒｏ）、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、２４巻、２３６８〜２３７４頁、１９８５年；ニドワード（Ｅｄｗａｒｄｓ、　Ｊ、　Ｇ、）等、ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、）、８７巻、６５７〜６６５頁、１９８７年；エリックソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ、　Ｐ、　Ｆ、）等、ジャーナル　オブ　イムノロジカル　メソッド（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、　５１巻、２４１〜２４９頁、１９８２年；フィーダーグリーンおよびステン（Ｆｅｄｅｒｇｒｅｅｎ、　Ｗ、　＆　５ｔｅｎｎ。Ｋ、　Ｓ、）、ジャーナル　オブ　インベステイゲイテイブ　ダーマトロジー（Ｊ、Ｉｎｖｅｓｔ、Ｄｅｒｍａｔｏｌ、）、７５巻、２６１〜２６３頁、１９８０年；ゴスボダロウィックズおよびルーイ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、　＆Ｌｕｉ、　Ｇ−Ｍ、）、ジャーナル　オブ　セル　フィジオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１０９巻、６９〜８１頁、１９８１年；ゴスボダロウィックズ（Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚ、　Ｄ、）等、ピー・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）　、アメリカ合衆国、７７巻、４０９４〜４０９８頁、１９８０年；グリンネルおよびフェルト（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、　Ｆ、　＆　Ｆｅ１ｄ、　Ｍ、　Ｋ、）、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ。Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２５７巻、４８８８〜４８９３頁、１９８２年；グリンネルおよびファン（Ｇｒｉｎｎｅｌｌ、　Ｆ、　＆　Ｐｈａｎ）　、ジャーナル　オブ　セル　フィジオロジー（Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１１６　巻、２８９〜２９６頁、１９８３年；ホークス（Ｈａｗｋｅｓ、　Ｒ，）等、アナリティ力ル　バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１１９巻、１４２〜１４７頁、１９８２年：ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ、　Ｍ、）等、ジャーナル　オブ　バイオケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）　、　９８巻、１１３５〜１１３８頁、１９８５年；ヘイマン（Ｈａｙｍａｎ、Ｅ、Ｇ、）　等、ピー・エヌ・エイ・ニス（ＰＮＡＳ）　、アメリカ合衆国、８０巻、４００３〜４００７頁、１９８３年：ヘイマン（Ｈａｙｍａｎ、　Ｅ、　Ｇ、）等、エクスペリメンタル　セル　リサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、１６０巻、２４５〜２５８頁、１９８５年ａ；ヘイマン（Ｈａｙｍａｎ、　Ｅ、　Ｇ、）等、ジャーナル　オブ　セル　バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　、１００巻、１９４８〜１９５４頁、１９８５年ｂ；へりリング（Ｈｅｒｒｉｎｇ）等、サージヤリ−１８４巻、４９８〜５０４頁、１９７８年；イウおよびルオスラーティ（ＩＵ、　Ｃ，Ｒ，ａｎｄ　ＲｕｏｓｌａｈｔＬ、　Ｅ、）、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ。Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２６巻、１５６１０〜１５６１５頁、１９８５年；ノックスおよびグリフイス（Ｋｎｏｘ、Ｐ、＆　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ｓ、）、ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、）、４６巻、９７〜１１２頁、１９８０年；ノックス（Ｋｎｏｘ、　Ｐ、）、ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、）、７１巻、５１〜５９頁、１９８４年；レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、　Ｌｌ、　Ｋ、）、ネイチャー、２２７巻、６８０〜６８５頁、１９７０年；レワンドウストリア（Ｌｅｗａｎｄｏｗｓｔｒｉａ、Ｋ、）　等、フエブスレタース（ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｓ、　）　、２３７巻、３５〜３９頁、１９８８年；ローリ−（Ｌｏｗｒｙ、　Ｏ，Ｈ，）等、ジャーナル　オブ　バイオロジカル　ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、１９３巻、２６５〜２７５頁、１９５１年；マツフォースラン（ＭｃＡｕｓｌａｎ、　Ｂ、　Ｒ，）等、ジャーナル　オブセル　フィジオロジ−（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）、１００巻、８７〜９４頁、１９７９年；マツクインネス（ＭｃＩｎｎｅｓ、　Ｃ，）等、ジャーナル　オブ　セルサイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、）、８８巻、６２３〜６２９頁、１９８７年；メイエス（Ｍａｙｅｓ、　Ｅ、　Ｖ、）、蛋白質抗原の免疫親和精製法、インメソッズ　オブ　モレキュラー　バイオロジー（Ｉｎ　Ｍｅｔｈｏｄｓｏｆ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）　、１　、蛋白質、ワーカ−（Ｊ、　Ｍ。Ｗａｌｋｅｒ）　編、１３〜２０頁、ヒューマナ（Ｈｕｎ＋ａｎａ）出版、ニューシャーシー州りリフトン（Ｃ１ｉｆｔｏｎ　Ｎ、　Ｊ、）　；ミクル（Ｍｉｃｈｌ、　Ｊ、）等、セル　バイオケミストリー　アンドファクション（Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｃｈｅｏ＋、　＆　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、１巻、８７〜９１頁、１９８３年；二ニーメイヤーおよびルッター（Ｎｅｕｍｅｉｅｒ、Ｒ，＆　Ｒｅｕｔｔｅｒ。Ｗ、）、エクスベリメンタル　セル　リサーチＣＥｘｐ−Ｃｅ１ｌＲｅｓ、）　、１６０巻、２８７〜２９６頁、１９８５年；ネイファク（Ｎｅｙｆａｋｈ、　Ａ、　Ａ、）等、エクスペリメンタル　セルリサーチ（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、）、１４９巻、３８７〜３９６頁、１９８３年；オリバー（Ｏｌｉｖｅｒ、　Ｍ、　Ｎ、）等、ジャーナル　オブ　セルサイエンス（Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ、）　、９２巻、５１３〜１８頁、１９８９年；ブレイスナー（Ｐｒｅｉｓｓｎｅｒ、　Ｋ、　Ｔ、）等、バイオケミカル　ジャーナル（ＢＬｏｃｈｅｍ、　Ｊ、）　、２３１巻、２４９〜３５５頁１ラシャラマン（Ｒａｊａｒａｍａｎ、　Ｒ，）等、エクスペリメンタル　セルバイオロジー（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、）　、５１巻、９〜１８頁、１９８３年；ジルヌッツァーおよびハーネス（Ｓｉｌｎｕｔｚｅｒ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｂａｒｎｅｓ。Ｄ、Ｗ、）、バイオケミカル　アンド　バイオフィジカルリサーチ　コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ。Ｃｏｍｍｕｎ、　）、１１８巻、３３９〜３４３頁、１９８４年；ジルヌッツｙ −（ＳＨｎｕｔｚｅｒ、　Ｊ、　Ｅ、）等、イン　ビトロ　セルアンド　デベロップメンタル　バイオロジー（Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１ｌａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、）　、２１巻、７３〜７８頁、１９８５年；ソレンセンおよびプロットベック（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ、　Ｋ、　＆　Ｂｒｏｄｂｅｃｋ。Ｕ、）、エクスベリメンテイア（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ）、４２巻、１６１〜１６３頁、１９８７年；スターリ（Ｓｔａｈｌｉ、　Ｃ，）等、メソッズ　イン　エンザイモロジー（Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、９２巻、２４２〜２５３頁、１９８３年；スティーレ（Ｓｔｅｅｌｅ、　Ｊ、　Ｇ、）等、モレキュラー　イムノロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、２２巻、１０６１〜１０７２頁、１９８５年；ティンプルおよびドウズイアデク（Ｔｉｍｐｌ、　Ｒ，＆　ＤｚＬａｄｅｋ、　Ｍ）、インターナショナル　レビュー　才ブ　エクスペリメンタルバソロジ−（Ｉｎｔ、　Ｒｅｖ、　Ｅｘｐ、　Ｐａｔｈｏｌ、）、２９巻（ｍ２９）、１〜１１２頁、１９８６年；トマシニおよびモッシャ−（Ｔｏｍａｓｉｎｉ、　Ｂ、　Ｒ，ａｎｄ　Ｍｏ５ｈｅｒ、　Ｄ。Ｆ、）、ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）　、６８巻、７３７〜７４２頁、１９８６年；アンダーウッドおよびビーン（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、Ｐ、Ａ、＆　Ｂｅａｎ。Ｐ、）、ジャーナル　オブ　イムノロジカル　メソツズ（Ｊ。Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、１０７巻、１１９〜１２８頁、１９８８年；アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、　Ｐ、　Ａ、）等、ジャーナル　オブ　イムノロジカル　メソッズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、６０巻、３３〜４５頁、１９８３年：アンダーウッド（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、　Ｐ、　Ａ、）、ジャーナル　オブ　ゼネラル　ヴアイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、）、６２巻、１５３〜１６９頁、１９８２年；アンダーウッド（Ｌｌｎｄｅｒｗｏｏｄ、　Ｐ、　Ａ、）、ジャーナル　オブ　イムノロジカル　メソッズ（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、８５巻、３０９〜３２３頁、１９８５年；アンダーウッドおよびベネット（Ｕｎｄｅｒｗｏｏｄ、Ｐ、Ａ、ａｎｄＢｅｎｎｅｔｔ、　Ｆ、　Ａ、）　、ジャーナル　オブ　セル　サイエンス（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ、）　、　９３巻、６４１〜６４９頁、１９８９年；ヴイルラード（Ｖｕｉｌｌａｒｄ、　Ｌ、）等、フェブス　レタース（ＦＥＢＳＬｅｔｔｓ、）　、２３８巻、５〜８頁、１９８８年；第１図狭Ｓ第２図第３図対数抗体濃度　（ｎｇ／ｍｌ）第４図分画番号第５図第６図Ｏｉ　Ｏ２０３０分画番号第７図第８図希釈因子（ｌｏｇ、ｘで示す）第１０図第１１図被覆されたフィブロネクチンフラグメント、μｇ／ｍ（２第１２図被覆濃度（μｇ／ｍ１２）第１３図希釈因子（ｌｏｇ、ｘで示す）第１４図・希釈因子（ｌｏｇ２ｘで示す）国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ａ２７と称される単クローン性抗体であって、該抗体は、該抗体がビトロネクチンに結合しても、ビトロネクチンはその細胞結合活性を保持するように牛ビトロネクチンと反応することで特徴づけられ、また、融合細胞様ＣＭ３０／２３Ｄ２／Ｇ４（欧州動物培養細胞収蔵機関（ＥＣＡＣＣ）８９０１１１０２）によって産生されるもの。
２．Ａ１８と称される単クローン性抗体であって、該抗体は、該抗体がビトロネクチンに結合すると、ビトロネクチンの細胞結合活性は失なわれるように牛ビトロネクチンと反応することで特徴づけられ、また、融合細胞株ＣＭ２６／１２３Ｄ１１（欧州動物培養細胞収蔵機関（ＥＣＡＣＣ）８９０１１１０３）によって産生されるもの。
３．担体を含む生体材料であって、該担体の少なくとも１つの表面は、単クローン性抗体Ａ９、単クローン性抗体Ａ１８、単クローン性抗体Ａ２７、単クローン性抗体Ａ３５およびそれらの組合せからなる群から選択された単クローン性抗体で被覆され、（その際、）該単クローン性抗体は、その抗原結合性領域が前記少なくとも１つの表面から離れる向きとなっていることで特徴づけられるもの。
４．前記単クローン性抗体がＡ９またはＡ３５である請求項３に記載の生体材料。
５．前記単クローン性抗体がＡ２７である請求項３に記載の生体材料。
６．前記担体が、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、ポリエステル、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、発泡したポリテトラフルオロエチレン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ポリウレタン、シリコンゴムおよびポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）からなる群から選択されたポリマーである請求項３〜５のいずれかひとつに記載の生体材料。
７．前記ポリマーが、遊離水酸基、遊離アミノ基、遊離カルボキシル基または遊離メルカプト基を有しているものである請求項６に記載の生体材料。
８．インビトロの細胞培養で使用する装置であって、該装置は、細胞培養（液）と接触するのに適合した表面を有しており、該装置は、その細胞培養（液）と接触するのに適合した表面が、単クローン性抗体Ａ１８またはＡ２７で被覆されており、（その際、）該単クローン性抗体は、そのビトロネクチン結合性領域が前記表面から離れるような向きとされていることで特徴づけられるもの。
９．前記単クローン性抗体がＡ２７である請求項８に記載の装置。
１０．牛血漿または血清からビトロネクチンを移す方法であって、１）単クローン性抗体Ａ１８またはＡ２７を、該単クローン性抗体のビトロネクチン結合性領域が固相担体から離れる向きとなるように、固相担体上に供給する、２）ビトロネクチンを含有する牛血漿または血清に、該固相担体を接触させる、３）該固相担体に結合しなかった牛血漿または血清中の成分を取り除くために、該固相担体を洗浄する、および、４）ビトロネクチンを含まない牛血漿または血清を得るために、工程３の洗浄液を回収する、および／または、（固相担体に）結合したビトロネクチンを放出させるために、該固相担体を処理し、放出されたビトロネクチンを回収する、という工程を含む方法。
１１．前記単クローン性抗体がＡ２７である請求項９に記載の方法。
１２．牛血漿または血清からビトロネクチンを移すのに使用する装置であって、該装置は、単クローン性抗体のビトロネクチン結合性領域が固相担体から離れる形で、単クローン性抗体Ａ１８またはＡ２７で被覆された固相担体を含むもの。
１３．前記単クローン性抗体が単クローン性抗体Ａ２７である請求項１２に記載の装置。
１４．前記固相担体がカラム形状である請求項１１または１２に記載の装置、
１５．次の工程を含む、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合活性を妨害するために、単クローン性抗体のフィブロネクチンまたはビトロネクチンと反応する能力を決定する方法。１）フィブロネクチンまたはビトロネクチンを、試験がなされる単クローン性抗体で被覆された固相担体と接触させる、２）工程１を行なった固相担体を、試験がなされる単クローン性抗体と接触させる、３）工程２を行なった固相担体を、フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質と接触させる、および、４）固相担体に結合した生体物質の量を測定する。
１６．フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質が細胞である請求項１５に記載の方法。
１７．次の工程を含む、試料中のフィブロネクチン、ビトロネクチンまたはそれらのフラグメントの接着活性を測定する方法。１）フィブロネクチンまたはビトロネクチンに対する単クローン性抗体または単クローン性抗体群によって被覆されている、ただし、該単クローン性抗体は、フィブロネクチン分子またはビトロネクチン分子の、細胞結合性領域から離れた抗原性部位に反応するものである、固相担体に試料を接触させる、２）工程１を行なった固相担体を、（ａ）フィブロネクチンまたはビトロネクチンの細胞結合性領域と反応する生体物質、または、（ｂ）フィブロネクチンまたはビトロネクチンに対する標識単クローン性抗体であって、フィブロネクチン分子またはビトロネクチン分子の細胞結合性領域またはその付近の部位と反応するもの、と接触させる、および、３）結合した標識単クローン性抗体の量または結合した生体物質の量を測定する。
１８．前記固相担体上の単クローン性抗体は、Ａ９、Ａ２７およびＡ３５からなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
１９．前記標識単クローン性抗体は、Ａ７、Ａ１４、Ａ１７、Ａ１８、Ａ２４またはＡ３２からなる群から選択される請求項１７または１８に記載の方法。