JPH04506073A - ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのレセプターの優性の負のメンバー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ステロイド　サイロイドスーパーファミリーのレセプターの　の　のメンバー 關ｉ１孤 本願は、１９８９年Ｓ月２６日出願の、米国特許出願東ｏ７／３５ｇ、　６９６ 号であり、これはまた、１９８８年１２月２３日出願の、米国特許出願第０７７ ２８９．５６１号の係属出願であり、両出願の全ての内容は本明細書に参考とし て援用されている。

ｌ豆ユ立互 本発明は、ステロイド／サイロイドのスーパーファミリーの、トランス抑制アナ ログレセプターに関する。特定の局面では、本発明は、転写トランス活性化リプ レッサーとして機能するタンパク質の同定および特徴づけ、並びに該タンパク質 をフードする新規ＤＮＡの単離物を含む、該タンパク質の調製および使用；該Ｄ ＮＡ配列を作動可能に含む発現ベクター；および該ベクターでトランスフェクト された宿主に関する。

他の局面においては、本発明は、種々のア・ツセイおよびスクリーニング法にお ける、前記の転写トランス活性化リプレッサーの使用に関する。

１豆！！ｌ グルココルチコイド、ミネラルフルチコイド、サイロイド、エストロゲン関連、 およびレチノイドクラスによりて代表されるようなステロイド、サイロイドおよ びレチノイドレセプターを含む、種々のホルモンおよびホルモン関連レセプター の、特徴づけおよび調製が、重要な研究課題になってきた。

例えば、グルココルチコイドレセプターが、恒常性、生長および発育に様々な役 割を果たす、リガンド依存性の転写因子の大きなスーパーファミリーに属するこ とは知られている。

これらのレセプターをフードする相補的ＤＮＡの比較、およびそれらのコーディ ング配列の変異分析で、分子内でそれぞれＤＮＡ結合、ホルモン結合および核局 在性を担うと考えられる、ある橿の機能性ドメインが確認された。［：ｖａｎｓ ら、凪ｅｎｃｅ　２４０．８８９　（１９８８）の、この課題の総説を参照のこ と。

グルココルチコイドレセプターの場合、いわゆるＤＮＡ結合ドメインは、約６６ 個のアミノ酸のにわたっており、様々な種間で高度に保存されている。さらに、 このドメインは、転写を活性化するのに必須であることが見い出されている。

Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅｒｇら、Ｃｅｌユ４９．　３９　（１９８７）、Ｍｉｅｓｆ ｅｌｄら、５ｃｉｅｎｃｅ２３６．４２３　（１９８７）、Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ ら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏ　Ｌ　８１６　（１９８７）、Ｋｕｌａｒら、Ｃｅ１ｌ　 ５１．　９４１　（１９８７）、Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ、ヒｌ虹ユ、６．　３９ ８５　（１９８））およびＷａｔｅｒｖａｎら、Ｍｏ１．Ｅｎｄｏ　２．１４　 （１９８ｇ）を参照のこと。このドメインは、不変の９個のシスティン残基を含 有することが見い出された。全体の機能に対する各々のシスティン残基の寄およ びこのドメインによって形成される実際の構造は知られていないが、これらのシ スティン残基が、２個の亜鉛イオン配位し、フィンガードメインと呼ばれる２個 のＤＮＡ結合を形成し、そのことにより、グルココルチコイドレセプターが目的 のＤＮＡ部位へ配置し、そして結合する原因となると考えられている三重構造が できるのではないかと提案されている。Ｋｌｕｇら、Ｔｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｓｃｉ　１２．４６４　（１９８７）、　Ｂｅｎ５ら、Ｃｅ１ｌ　５２．１　（ １９８８）、および前記のＥｖａｎｓを参照。

ＤＮＡ結合領域よりカルボキシル末端側の位置に、いわゆるリガンド結合ドメイ ンがあって、このドメインは、ホルモンのない状態でレセプター活性をブロック する能力を示す。

それ故に、必要なホルモンの存在がレセプターの活性に対する阻害を取り除く。

この領域を削除するとホルモン非依存性の転写アクチベーターが生産されること が見いだされた。Ｇ。

ｄｏｗｓｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ　３２５．３６５　＜１９８７）、前記のＨｏｌ 　ｌｅｎｂｅｒｇら、前記のＫｕｍａｒら、前記のＤａｎｉｅｌｓｅｎら、およ び前記のＡｄｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　５２．６８５　（１９８８）を参照。

この２つのドメインとは対照的に、ＤＮＡ結合ドメインからアミノ末端側にある 配列は、構造および特に機能はあまり理解されていない。この領域は、種々のレ セプター間でサイズおよび組成の両方について非常に異なっており（前記のＥｙ ａｎｓらを参照）、そして、レセプター機能の異質性に寄与している。前記Ｋｕ ｍａｒら、および前記Ｔｏｒａら、３３３．１８５　（１９８８）を参照。

科学文献に報告されているいくつかの、さらなる分析にもかかわらず、転写開始 のトランス活性化を決める領域は、依然はとんど特徴づけられていない。トラン ス活性化ドメインは、機能性ＤＮＡ結合ドメインに結合された場合、ＲＮＡポリ メラーゼによる生産的な転写開始を増大するようなポリペプチド領域として定義 され得る。５１ｇ１ｅｒ、　’Ｎａｔｕｒｅ　３３３．２１０（１９８８）、Ｂ ｒｅｎｔら、Ｃｅ１１　４３．　７２９　（１９８５）、Ｈｏｐｅら、９已止り 、。

８８５、　（１９８６）、Ｍａら、Ｃｅ１ｌ　４８．　８４７　＜１９８７）、 Ｍａら、二■、ｌＬ３　（１９８７）、　Ｌｅｃｈら、Ｃｅ１ｌ　５２．　１７ ９　（１９８８）、およびＨｏｐｅら、Ｎａｔｕｒｅ　３３３．６３５　（１９ ８８）を参照。

リンカ−スキャニング変異による、ヒトのグルココルチコイドレセプターの以前 の研究で、転写活性化に役割を有するＤＮＡ結合領域以外の２つの領域が確認さ れた。この領域は、τ、およびτ２と定義された。Ｇｉｇｕｅｒｅら、Ｃｅ１ｌ ｊ６．６４５　（１９８６）を参照。これら研究所のさらなる研究で、さらにト ランス活性化機能およびＤＮＡ結合機能がともに位置することが報告された。前 記Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、前記Ｍｉｅｓｆｅｌｄら、前記Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ ら、および前記Ｗａｔｅｒｍａｎらを参照。結果として、この研究から、それぞ れリガンド結合、ＤＮＡ結合および転写のトランス活性化の確認された特性に寄 与する別々のドメインのモジニラ−分子が、ますますイメージ図面となって浮か び上がった。最近まで、トランス活性化の活性を決定する領域は、全（理解され ていなかつた。それ故に、現存の文献に基づ（像は、ステロイドレセプターの機 能的性質の全般的な認識、およびリガンド結合により開始され、プロモーター特 異的なトランス活性化により完了する事象のカスケードを、種々のドメインがど のように決定するのか、明かにしていないＯさらに、以前の研究は、機能性の「 ドメイン」を確認しているにも関わらず、分子自身の特異的な活性に寄与するア ミノ酸を同定するための系統的な努力がなかった。従って、ステロイドレセプタ ーのトランス活性化領域の以前の同定は、欠損あるいは挿入の変異誘発による活 性の消失の結果のみによっていて、領域自身の性質が、機能の優性な増加を反映 するアッセイで立証されることは、いずれの場合においてもなかった。Ｐｔａｓ ｈｎｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　３３５．　６８３　＜１９８８）を参照。

従って、Ｇｏｄｏｗｓｋｉら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４ユ、８１２　（１９８ｇ） では、グルココルチコイドレセプターが、少なくとも１つの「促進ドメイン」を 含有し、このドメインは、グルココルチコイド応答エレメント結合領域（すな、 わち、ＤＮＡ結合ドメイン）に重複しておらず、そして第２のドメインが、レセ プターのアミノ末端近くの領域前古めていることが報告されている。同様に、Ｗ ｅｂｓｔｅｒら、Ｃｅ１ｌ　５４．　１９９　（Ｌ９８８）には、エストロゲン およびグルココルチコイドレセプターの誘導性の転写活性化機能が報告されてい て、かれらは、ホルモン領域（すなわち、リガンドおよびＤＮＡ結合ドメイン） の相対的な位置は、レセプターの転写誘導性活には重要でないと推測している。

未だに、かれらは、いわゆるホルモンの誘導性活性化ドメインの正確な位置およ び性質の定義がないこと、そしてその特徴づけ、およびトランス活性化の能力の 役割の定義がないことを認めている。

前記Ｇｉｇｕｅｒｅらの研究では、分子の数カ所でのランダム部位変異誘発を行 った結果として、転写活性を測定するアブセイに基づく、グルココルチコイドレ セプターの活性の消失が示された。引き続いて、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇらは、分 子中の領域を欠損させて、再度、そのようなアミノ酸の除去によって誘導される 全体的な転写活性の消失を示した。

ヒトグルコフルチコイドレセプター（ｈＧＲ）は、遺伝子調節の原型のモデルレ セプターとして利用されてきた。前記のように、ＤＮＡ結合およびリガンド結合 機能ドメインは、以前に定義されている。同様に、ｈＧＲレセプターあるいは他 のレセプターのこのようなモジュラ−ドメインは、レセプターの他の位置に移動 させ得るし、あるいは異種のＤＮＡ結合ドメインに結合させられ得て、そしてま だ機能を保持し得る。

これに反して、ｈＧＲによる負の調節はほとんど知られていない。このことは、 ステロイドが、発育および負のフィードバック調節に重要な役割を果している点 から言って驚くべきことである。グルココルチコイドは、一部は神経特異的遺伝 子の誘導を抑制することによって、発育中の交感神経副腎系での神経堤細胞の結 末の決定を助ける［５ｔｅｉｎら、Ｄｅｖ　Ｂｉ。

１２７、　３１６　＜１９８８）およびＡｎｄｅｒｓｏｎら、Ｃｅ１ｌ　４７． 　１０７９　（１９８６）を嘗照コ。グルココルチコイドは、さらに第２のメツ センジャー誘発されたペプチドホルモン誘発の阻害によって、視床下部−下垂体 −副腎系を調節する。最近、Ａｋｅｒｂｌｏｍら（江ｎ匹免工、３５０　（１９ ８８））は、ｈＧＲが、ステロイドおよびＤＮＡ結合に依存的な様式で、サイク リックＡＭＰ−誘導可能なα糖タンパク質ホルモンプロモーターを負の調節をす ることを示した。野生型の発現が、ちょうど１６８の塩基対（α１６８と称する ）のブローモーターにより示された。胎盤細胞での基本的な発現は、２５塩基対 の組織特異的エレメント（ＴｓＥ）に結合するタンパク質と共に働く、３６塩基 対のパリンドロームサイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）に結合された 因子によって媒介される。発現は、さらに細胞内のサイクリックＡＭＰレベルの 上昇によって、ＣＲＥを介して促進され得る。ｈＧＲは、グルコフルチコイド依 存的様式で、基本的およびサイクリ・ツクＡＭＰ促進された転写の両者を抑制す る。ｈＧＲが結合するトランス作用エレメントがあきらかにされ、そしてこれは 活性化のためのコンセンサスＧＲＥ配列に関係する。同様の研究が、５ａｋａｉ ら、Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌ吐肚■ｉ、　１１４４　（１９ｇ＋１）に よって報告されている。

λ豆ユ！１ 本発明は、抑制のためにホルモンレセプタ゛−に要求すれる構造の分析による結 果である。この分析は１．Ｄ　Ｎ　Ａ結合ドメインに絶対に必要もの、および抑 制のためのカルボキシル末端の役割を明かにした。ＤＮＡ結合ドメインだけでは 、最大の抑制には十分ではないが、カルボキシル末端へのポリペプチドの付加、 あるいはここに記載されているようなカルボキシル末端への他の改変によって、 優性な負の抑制活性を有する新規な融合タンパク質が製造される。

本発明に従って、我々は、トランス活性化転写活性を抑制するように改変され得 る、細胞内ホルモンあるいはホルモン様レセプターのドメインを同定し、単離し 、そして特徴づけた。この情報によって、ステロイド／サイロイドのスーパーフ ァミリーの種々のレセプターの、さらなる特徴づけが可能になった。この特徴づ けは、物理的性質、生物学的機能、および種々のドメインの効果、特に抑制され た転写活性を提供するように改変され得るドメインの全てに関している。このこ とにより、次には、抑制された転写活性化特性を有する、新規なアナログレセプ ターの生産が可能になった。

本明細書に提供されている情報に基づいて、ステロイド／サイロイドのスーパー ファミリーのレセプターは、全般的にトランス活性化転写活性に機能するドメイ ンを含有し、これらの３つのドメイン、すなわち、ＤＮＡ結合ドメイン、リガン ド結合ドメイン、およびトランス活性化転写ドメインがおのおの個別に配置され ても機能し、機能は自律的であることが判った。本発明に従って、得られたレセ プターのカルボキシル末端は、このレセプターのトランス活性化転写活性を調節 する役割を担うドメインであることが発見された。さらに、Ｄ　Ｎ　Ａ　結合ド メインは、抑制されたトランス活性化転写活性を有するあらゆるレセプターに必 要な要素であることが見いだされた。

本発明は、トランス活性化転写活性が抑制される、新規な、ホルモンあるいはホ ルモン様アナログレセプターを提供する◎このような新規なアナログレセプター は、ＤＮＡ結合ドメイン、必要に応じてＮ末端ドメイン、および、親のレセプタ ーあるいは野生型レセプターに比べて、抑制されたトランス活性化転写活性を提 供するように改変されたＣ末端ドメインを含有する。この新規なアナログレセプ ターは、ＤＮＡ結合ドメイン、Ｎ末端ドメインおよびＣ末端ドメインが異なる起 源から提供される、ハイブリ・ンドレセブターであり得る。例えば、グルココル チコイドレセプターのＣ末端ドメインは、ここでは、ｖ−ｅｒｂＡタンパク質の Ｃ末端の一部で置換され得る。あるいは、グルココルチコイドレセプターのＣ末 端ドメインは、βガラクトシダーゼのよなポリペプチドの少なくとも一部で置換 され得る。

本発明は、さらに、関連のある全局面の組換えＤＮＡ技術よる、このような新規 なアナログレセプターの調製を目指している。これには、このアナログレセプタ ーあるいはこのレセプターの改変されたＣ末端ドメインからなる、組換えＤＮＡ 分子あるいはｃＤＮＡ分子であるＤＮＡ分子、発現のために選択された組換え宿 主中で作動可能な発現制御エレメントを有するＤＮＡを作動可能に保持する必須 の発現ベクター、およびこのような作動可能な発現ベクターでトランスフェクト された組換え宿主細胞が包含されている。

本発明は、さらに、本明細書に記載されている新規なアナログレセプターを使用 して、「オーファン」レセプターの応答エレメントおよび／または機能を同定す ることを目指している。このオーファンレセプターは、関連の応答エレメントお よび／または機能が知られていないレセプターのことである。

本発明は、さらに、特定の野生型レセプターを決定するための改良された７ノセ イ系で、本明細書に記載されている新規なアナログレセプターを使用することを 目指している。このアッセイ系に、１つ以上の応答エレメントが存在すると野生 型のレセプターと相互作用し得る。

このような抑制されたアナログレセプターのもう一つの使用は、癌治療の領域に 存在する。ある種の細胞では、腫瘍性になるのにはホルモンレベルが増加される 必要がある。１つの例に、乳癌に見られるようなエストロゲン要求の上昇がある 。実際、クモ牛シフインのようなエストロゲンアンタゴニストが、正常の乳細胞 の癌細胞への形質転換が阻害されるように、エストロゲンの量を減少させる治療 に用いられる。あるいは、本発明のアナログレセプターは、このような目的に使 用され得る。

【ｉ恋！！星説里 図１は、ｖ−ｅｒｂＡタンパク質のアミノ酸配列である。

図２は、ｈＧＲ媒介の負の調節の用量応答カーブを示す。

図３は、カルボキシル末端融合タンパク質による抑制を示す。

図４は、数種の発現およびレポーター構築物である。

図５は、ラットのＴＲα／ｖ−ｅｒｂＡキメラタンパク質の構造および活性を示 す。

図６は、サイロイドレセプター、ｖ−ｅｒｂＡｓ　およびハイブリッドＴｒ／ｖ −ｅｒｂＡレセプターによるＴ３誘導のＣＡＴ活性の比較を示す。

図７は、ＴＲαあるいはＶ−ｅｒｂＡの、ＲＡＲａによるＲＡ誘導転写活性との 競合を示す。

図８は、数種のＲＡＲハイブリッドおよび変異体の構造および活性のまとめであ る。

図９は、ＲＡＲａ−ｖｅｒｂＡ融合タン融合タンパ石質Ａ誘導の競合を示す。

図１０は、Ｆ９奇形癌（ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａ）幹細胞での１内在する ＲＡＲのＲＡ誘導トランス活性化の競合を示す。

図１１は、数種のＧＲハイブリッドおよび変異体の構造および活性のまとめであ る。

１更区」」ＩＬ疲五 本発明では、ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのレセプターのトラン ス抑制アナログレセプターが提供され、このアナログには、 （１）ＤＮＡ結合ドメインである第１のアミノ酸配列であって、該アナログが、 この配列を介して野生型レセプターのホルモン応答エレメントに結合し得る、配 列：および（２）ＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端に位置する、第２のア ミノ酸配列であって、該第２の配列は、（ａ）該野生型レセプターのカルボキシ ル末端部分のリガンド結合ドメインのアミノ酸の個数の少なくとも約９０％を有 するポリペプチドであって、該ポリペプチドが、（ｉ）該野生型レセプターのカ ルボキシル末端ドメインより短い場合には、該ポリペプチドの全長；あるいは（ ｉ　ｉ）該野生型レセプターのカルボキシル末端ドメインと同じ長さを有する、 任意の該ポリペプチドセグメント；のいずれかが、野生型レセプターのカルボキ シル末端ドメインに関して約６０％より少ないアミノ酸の同一性を有する：ある いは、 （ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８で定義される、Ｖ−ｅｒｂＡタンパク質のカ ルボキシル末端部分の、少なくとも８４のカルボキシル末端アミノ酸（図１を寥 照；ｅｒｂ−Ａアミノ酸の番号付けは、又エエ配列（アミノ末端の２５５個のア ミノ酸）がｅｒｂ−Ａタンパク質のアミ／酸の番号付けに含まれるかどうかによ って、アミノ酸約２５５個分変わってくることに注意）；から選択される、配列 、が含まれる。

本発明の他の実施態様では、前記のレセプターアナログをコードする組換えＤＮ Ａ分子あるいはｃＤＮＡ分子であるＤＮＡ分子を、作動可能に保持している発現 ベクター：このような発現ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細胞； および、このような細胞を外部の維持培地に含有する細胞培養物が提供される。

本発明のもう一つの実施態様において、ステロイドあるいはサイロイドホルモン に正常に応答し得な（なる疾患症状を有する、ヒト以外のトランスジェニ・７り 哺乳類が提供される。

該哺乳類は、該ホルモンの一つのアナログレセプターを発現し得る細胞の少なく とも１つのサブセットを有し、該アナログレセプターは、対応する野生型のレセ プターよりも大きいトランス抑制活性を有し、そして対応する野生型のレセプタ ーよりも小さいトランス活性化活性を有する。

本発明のもう一つの実施態様において、野生型ホルモンレセプターをトランス抑 制アナログレセプターに変換するための方法が提供される。該方法には、該野生 型レセプターのリガンド結合ドメインを、アミノ酸番号３１３−３９８　（図１ 参照）で定義されるｖｅｒｂＡタンパク質の、カルボキシル末端の少なくとも８ ４個のアミノ酸と置換する工程が包含される。

あるいは、本発明の後者の実施態様は、該野生型レセプターのリガンド結合ドメ インを、該野生型レセプターのカルボキシル末端のリガンド結合ドメインの、少 なくとも９０％のアミノ酸を有するポリペプチドと置換して完成され得る。ここ で該ポリペプチドは、該野生型レセプターのカルボキシル末端に対して、下記（ ｉ）あるいは（ｉｉ）のいずれかにわたって約６０％より少ないアミノ酸の同一 性を有する＝（１）該野生型レセプターより短い場合には、該ポリペプチドの全 長；あるいは（ｉｉ）該野生型レセプターのカルボキシル末端と同じ長さを有す る、該ポリペプチドの任意のセグメント。

さらに、本発明の実施態様では、前記のようなアナログレセブターの効果的な量 を細胞に接触させることによって、細胞内で、野生型レセプターによる、ホルモ ン応答エレメントの転写活性化をブロックする方法が提供される。

さらに、本発明の実施態様では、細胞に存在するホルモン応答エレメントの、野 生型レセプターによる転写活性化を、ブロックする方法が提供される。該方法に は下記の（ａ）、（ｂ）および（Ｃ）の工程が包含される：（ａ）野生型レセプ ターのリガンド結合ドメインを実質的に欠損させる工程；（ｂ）アミノ酸番号３ １３−３９８　（図１を参照）で定義されるｖｅｒｂＡタンパク質の、少なくと も８４個のカルボキシル末端のアミノ酸に、工程（ａ）の改変されたレセプター を、作動可能に結合して、融合タンパク質を生産する工程；そしてその後、（ｃ ）該融合タンパク質の効果的な量を該細胞に接触させる工程。

あるいは、本発明の後者の実施態様は、下記の（ａｏ）、（ｂｏ）および（Ｃ） の工程によって完成され得る：（ａｏ）野生型レセプターのリガンド結合ドメイ ンを実質的に欠損させる工程； （ｂｏ）該野生型レセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸の個数の少な（ とも約９０％を有するポリペプチドに、工程（ａ’　）の改変されたレセプター を、作動可能に結合して、融合タンパク質を生産する工程であって、ここで、該 ポリペプチドは、 （ｉ）該野生型レセプターのリガンド結合ドメインより短い場合には、ポリペプ チドの全長；あるいは、（ｉ　ｉ）野生型レセプターのリガンド結合ドメインと 同じ長さを有する、該ポリペプチドの任意のセグメントにわたって野生型レセプ ターのリガンド結合ドメインに対して約６０％より少ないアミノ酸の同一性を有 する工程；　その後、（ｃ）該細胞を該融合タンパク質の効果的な量に接触させ る工程。

本発明の他の実施態様では、未知の関連応答エレメントおよび／または機能に対 するレセプターの応答エレメントおよび／または機能を同定する方法が提供され る。該方法は、野生型レセプターに対する既知の応答性を有するテスト系の応答 と、トランス抑制アナログレセプターで処理されたときの該テスト系の応答とを 比較する工程を包含する。ここで、該トランス抑制−アナログレセプターは、（ １）　Ｄ　Ｎ　Ａ結合ドメインである第１のアミノ酸配列であって、これを介し て、該アナログが、野生型レセプターのホルモン応答エレメントに結合し得る配 列；および、（２）該ＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端に位置する第２の アミノ酸配列；を含有する。ここで、第２の配列は、下記の（ａ）または（ｂ） から選択される：（ａ）野生型レセプターのカルボキシル末端のリガンド結合ド メインのアミノ酸の個数の少なくとも約９０％を有するポリペプチドであって、 該ポリペプチドは、野生型レセプターのカルボキシル末端ドメインに対して下記 のいずれかにわたって約６０％より少ないアミノ酸の同一性を有する：野生型レ セプターのカルボキシル末端ドメインより短い場合には、ポリペプチドの全長； あるいは、野生型レセプターのカルボキシル末端ドメインと同じ長さを有する、 該ポリペプチドの任意のセグメント；（ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８　（図 １を膠原）で定義されるｖ−ｅｒｂＡタンパク賀のカルボキシル末端部分の、少 なくとも８４個のカルボキシル末端アミノ酸。

例えば、オーファンレセプターが相互作用する特異的な応答エレメントは、それ ぞれ１つの既知応答エレメントを有する種々のテスト系をスクリーニングするこ とによって決定され得る。オーファンレセプターによって活性化され、しかし本 発明のオーファンレセプター由来のアナログレセプターによって抑制される、特 異的なテスト系の応答エレメントは、オーファンレセプターの応答エレメントで ある。

同様に、オーファンレセプターの機能は、オーファンレセプターに接触させられ たときのテスト系の応答を、本発明のオーファンレセプターのトランス抑制アナ ログに接触させられたときの同じテスト系の応答と比較することによって決定さ れ得る。この２つを並べて比較した上での、応答の相違は、オーファンレセプタ ーの機能的役割の指標を提供する。

本発明の他の実施態様では、特異的な野生型レセプターの存在に応答するアッセ イ系での使用に、改良が提供される。

ここで、１つより多い応答エレメントが、該野生型レセプターに相互作用し得、 該改良には、このアッセイに関して、該特異的レセプター以外に野生型レセプタ ーにも応答する、応答エレメントを不活性化する工程を含有する。ここで、該応 答エレメントは、該アッセイ系に、各々のレセプターに対して、効果的な量のト ランス抑制アナログレセプターを添加することによって、不活性化される。ここ で、各々のトランス抑制アナログレセプターは、下記の（１）および（２）を含 有する：　（１）ＤＮＡ結合ドメインである、第１のアミノ酸配列であって、こ の配列を介して、該ア、ナログが、特異的野生型レセプター以外のレセプターの ホルモン応答エレメントに結合し得る配列；および （２）ＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端に位置する第２のアミノ酸配列で あって、下記の（ａ）または（ｂ）から選択される、配列。

（ａ）該特異的野生型レセプター以外のレセプターのカルボキシル末端部分のリ ガンド結合ドメインのアミノ酸の個数と、少なくとも約９０％のアミノ酸を有す るポリペプチドであって、該ポリペプチドは、該特異的、野生型レセプター以外 のカルボキシル末端ドメインに対して、下記のいずれかが約６０％より少ないの アミノ酸の同一性を有する：該特異的野生型レセプター以外の該レセプターのカ ルボキシル末端ドメインより短い場合には、ポリペプチドの全長；あるいは、該 特異的野生型レセプター以外のレセプターのカルボキシル末端ドメインと同じ長 さを有する、該ポリペプチドの任意のセグメント： （ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８　（図１を参照）で定義されるｖ−ｅｒｂＡ タンパク質のカルボキシル末端部分の、少なくとも８４個のカルボキシル末端ア ミノ酸。

本明細書に用いられるように、本発明のアナログレセプターに関して用いられる 場合、用語「優性の負」とは、野生型レセプターおよびその関連リガンドが存在 いる場合でも、関連ｇ：釜エレメントの転写活性化活性に負の効果を宵する種類 のことである。

本開示に用いられているアミノ酸の省略記号は、標準の１文字および３文字表示 を用いている。すなわち、入ｓｐ　Ｄ　ア人ｌぐう千°゛ン畝　工１ｅ　エ　イ ンロイシシＴｈｒ　Ｔ　％ｖ７＞ン　Ｌａｕ　Ｌ　ロイ・〉ンＰτロ　Ｐ　１° ログン　ＨｌｓＨｌ：／入テ）７Ｇｌｙ　Ｇ　グ°ソジ７　ＬＹＳ　Ｘ：　ソン ンλ１ａ　入　アラニン　入ｒｑＲフル↑°巨ンＭａｔ　Ｍ　７−テ；ｒｓン　 入ｓｎ　Ｎ　アスハラグン（しχ下ネｂ） 本発明の実施に用いられるレセプターは、組換え技術、合成化学などによって調 製され得る。このように、種々の型に生産されたレセプターは、回収され、そし て意図される使用に適したレベル精製される。

リガンド誘導し得るトランス作用する因子のスーパーファミリーの存在は、いま や認められている。これには、ステロイドホルモンレセプター、レチノイン酸お よびビタミンＤ３レセプター、２つのサブタイプ（異性体）のサイロイドホルモ ンレセプター（αおよびβと呼ばれる）などが含まれる。

これらのホルモンレセプターの変異分析および構造の比較によって、ホルモン結 合、ＤＮＡ結合、および遺伝子発現のトランス活性化を担うドメインの同定が可 能になった。Ｓａｐら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４．　６３５　（１９８６）、Ｗｅ ｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４．　６４１（１９８６＞およびＥｖ ａｎｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４０．８８９　（１９８ｇ）を参照。

本発明のレセプターは、ホルモンおよびホルモン様のレセプターのトランス抑制 アナログであり、ステロイド／サイロイドのスーパーファミリーレセプターのメ ンバー、例えば、グルココルチコイドレセプター、ミネラルコルチコイドレセプ ター、プロゲステロンレセプター、エストｏｆｆンレセプター、エストロゲン関 連レセプター、ビタミンＤ３レセプター、サイロイドホルモンレセプー、レチノ イン酸レセプター、アルドステロンレセプター、アンドロゲンレセプターなどを 広く示す。本発明のレセプターには、対応する親型に対して、１つあるいはそれ 以上のアミノ酸の相違、あるいは糖化および／またはリン酸化の様式での相違、 あるいは制限された立体構造の相違があるレセプターを含む、前記のものと機能 的に同等なものが含まれる。用語「それらの機能的な同等物」とは、１つあるい はそれ以上のアミノ酸に関して、以前に記載されたアナログレセプターと異なる 、トランス抑制アナログレセプターである。ここでの相違は、基本的な抑制レセ プター活性あるいは生物学的機能性の破壊に至らない。

従って、当分野に公知であるレセプターは、野生型、ハイブリッド、あるいは、 ここに記載したような機能的な同等物のいずれであっても、本発明の開始物質と して適している。

本明細書の、用語「発現ベクター」には、ベクターに含まれるＤＮＡ配列を発現 し得るベクターが含まれる。ここで、このような配列は、その発現に効果を示し 得る他の配列に、作動可能に結合されている。いつも明かに言えるわけではない が、これらの発現ベクターは、宿主生物中で、エビソームとして、あるいは染色 体ＤＮＡに組み込まれる部分として複製され得る。本明細書の、用語「作動可能 な」、あるいは文法的に等価のものは、各々のＤＮＡ配列が作動し得る状態にあ る、すなわち、それらが意図される目的のために働くことを意味する。要するに 、「発現ベクター」は機能上の定義が与えられていて、そこに配置されている特 定のＤＮＡ配列の発現に影響し得る、いかなるＤＮＡ配列もこの用語に含まれ、 特定の配列に適用される。一般に、組換えＤＮＡ技術に用いられる発現ベクター は、「プラスミド」の形態であって、これは、そのベクターの形態においては、 染色体に結合されない環状の２本鎖のＤＮＡループを指す。本明細書において、 用語「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドは一般的にベクターの形 で使用され得るので、相互変換的に用いられる。しかし、本発明には、等価の機 能を与える発現ベクター、および、次ぎに当分野に知られる発現ベクターの他の 形態も含むことを意図する。

本明細書の、用語「組換え宿主細胞」は、組換えＤＮＡ技術を用いて構築された ベクターによってトランスフェクトされた細胞のことである。

本明細書の、用語「外部の維持培地」には、公知の、または、工夫された培地で あって増殖期の細胞を維持し得る、あるいは組換えに役だてる機能を行え得るよ うな、生存し得る状態に維持し得る培地が含まれる。例えば、ＡＴＣＣＭｅｄｉ ａ　Ｒａｎｄｂｏｏｋ、Ｅｄ、Ｃｏｔｅら、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、Ｒ。

ｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ　（１９８４）を参照。例えば、哺乳類細胞用の増殖維 持培地には、好ましくは、胎児ウシ血清などの血清補充物、あるいは、動物の肉 あるいは乳汁の加水分解物、組織あるいは臓器抽出物、解離血べいあるいはその 抽出物などのような、細胞増殖および分化を促進するのに通常用いられる補充成 分が含まれる。例えば、池の適切な培地成分には、トランスフェリン、インシ１ リンおよび種々の金属が含まれる。

本明細書に記載されているベクターおよび方法は、広範囲の原核生物および真核 生物の宿主細胞の使用に適切である。

前記の議論および存在する論文の技術の種々の引例に加えて、本発明に取り入れ られている定義および方法、および基本技術を行う手段を含む、分子生物学の標 準教科書が引用されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、眩ｎ」山エユ包ム」 二基１珪ｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏ ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８２および、ここに記載 されている種々の引例、特に、Ｃｏｌｏｗｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅ ｎｚ　ｍｏｌｏ　Ｖｏｌ　１５２．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、 　（１９８７）を参照。本明細書に掲載されている全ての出版物は、特に、本明 細書に援用されている。

本発明が意図する、ヒト以外のトランスジェニ、り生物には、げっ書類（例えば 、マウス、ラット）、ブタ、ヒツジ、下等真核動物（例えば、ショウジヨウバエ 、ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）　）などが含まれる。

ステロイドレセプターおよびサイロイドホルモンレセプターによる転写活性化は 、各々のリガンドの存在および結合に依存していることが見いだされた。しかし 、欠損分析では、ホルモン結合ドメインを欠く、グルココルチコイド、エストロ ゲン、およびプロゲストロンのレセプターは、特異的な応答エレメントを認識し 、本質的な活性因子として機能し得ることが開示された。従って、リガンドそれ 自身あるいは、その結合ドメインのいずれも、ＤＮＡの認識に直接関与する必要 はない。

ｖ−ｅｒｂＡタンパク質は、見かけ上完全なりＮＡ結合ドメインを含むことが見 いだされた。しかし、カルボキシル末端ドメイン（その起源のサイロイドホルモ ンレセプターに関して）のアミノ酸の変化および欠損の結果、サイロイドホルモ ンに結合する能力が欠如している。変異サイロイドホルモンのアナログレセプタ ーによって、これらの変異は、高し”Ｃ／ｌ／の発現をともなって、サイロイド ホルモンレセプターを、ホルモンに依存しない転写因子であるｖ−ｅｒｂＡに変 換することを提案した。

電気泳動遅延実験（ｇｅｔ　ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ）を用いて、 Ｖ−ｅｒｂＡおよびサイロイドホルモンレセプターの両者が、同系の応答エレメ ントを認識し、それに結合することが確認された。この結合の結果、リガンドが 結合されていないレセプターによって、サイロイドホルモン応答性のレポーター 遺伝子が抑制された。サイロイドホルモンの添加によって、抑制されたレベルの １０−１００倍の転写促進が得られた。驚くことに、ｖ−ｅｒｂＡは、期待され るほどには、活性因子としては機能しないが、むしろＴ３応答遺伝子の本質的な リプレッサーとして機能する。サイロイドホルモンレセプターとともに発現され 、そしてさらにサイロイドホルモンが存在すると、ｖ−ｅｒｂＡ抑制は、優性で あって、ホルモン刺激性の調節をブロックして、それによって、Ｖ−ｅｒｂＡが 強力なレセプターアンタゴニストとして機能し得ることが示される。

従って、本発明は、結合するプロモーターあるいは外部の作動可能なプロモータ ーの、トランス活性化転写活性を抑制する能力を有するホルモンあるいはホルモ ン様レセプターを包含する。このような抑制は、例えば、プロモーターのＤＮＡ 応答エレメントに競合的に結合する、アナログレセプターの本質的な能力による か、あるいは、このＤＮＡ応答エレメントあるいは類似のＤＮＡ応答エレメント に結合する他のポリペプチドを競合的に配置するアナログレセプターの能力によ る。従って、対応する親あるいは野生型レセプターの抑制と比較して全体的に増 加したトランス活性化転写の抑制がなされる。

（以下余白） Ｋ亘五 以下の実験内容には、特定の新規アナログレセプターの同定、特徴づけおよび調 製に用いられる方法が明記されている。

所定のレセプターのトランス作用転写抑制ドメインの構成および位置、そしてこ のようなレセプターを操作して、トランス作用転写抑制活性を有する新規アナロ グレセプターを生産し得る方法を含む、本発明の情報を供給することによって、 この仕事を再現するのには本明細書に記載の内容を繰り返しする必要がない、あ るいは繰り返さないことはおそらく科学的な得策であろうということを、当業者 は認知する。その代わり、彼らは代わりの、信頼できるそして公知の方法を選択 し得る。例えば、彼らは同様のあるいは池の適切な作動可能な発現ベークターお よび培養系において活用するため、本明細書に記載の特定の新規レセプターをコ ードする基本的なりＮＡ配列を合成し得る。すなわち、本明細書の開示によって 、実際に隋いられている内容を供給することに加えて、本明細書の開示の恩恵を 受ける当該分野の手段を用いて、開示される特定のレセプター、および他のレセ プター、およびそれらの断片の作製が可能になる。このような手段のすべては本 発明の範囲および可能性に含まれる。

Ｘ施例１：）ランスフェクシ１ン Ｊ　ＥＧ−３ヒト胎盤細胞のトランスフェクシ１ンは、Ｄａｌｅｇｅａｎｅら、 Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、ｔｌｏｌ、７．　ｐｐ、３９９４−４００ ２　（１９Ｊ１７）に記載のリン酸カルシウム沈澱法によって行われる。ダルベ ッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）　、ｌ　Ｏ％調調整中ウシウシ血清（ＣＢ　 Ｓ）、および０．４％グルコースに維持されたＪＥ　Ｇ　−３ｍｆ＆を、トラン スフェクションのｚ４時ｆｓ’［に、５％の活性炭処理された血／ｌ１ｌＣＢＳ ＋グルコース（Ａｋｅｒｂｌｏｍら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１．１）ｌ）、　３ ５０−３５３　（１９８８））中に分配する。典型的には、２μｇのレポーター プラスミドおよび４μｇのレセプタープラスミドが、トランスフエフシラン効率 の内部コントロールとしてのラウス肉騰ウィルス（ＲＳＶ）−β−ガラクトシダ ーゼ構築物（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、Ｃｅ１ｌ　４９．　ｐｐ、　３９−４６ 　（１９ｇ？））２μｇと一緒に用いられた。リン酸カルシウム処理後、デキサ メタシンおよびアルドステロン（ｔｏ−７Ｍ）を加えた。

β−ガラクト７ダーゼ融合実験では、ＲＳＶ−ルシフェラーゼを内部コントロー ルとして用いた。

ＣＶ−１細胞のトランスフェクションもリン酸カルシウム沈澱法によって行われ る。ＣＶ−を細胞は、５％仔ウシのウシ血清添加ＤＭＥＭで保持され、３０％〜 ５０％のニンフルエンシーで、合計２０μｇＤＮＡでトランスフェクトされる。

１０ｃｍのディシニ当たり、５μｇの発現プラスミドおよび２．５μｇのレポー タープラスミドＤＮＡ、およびトランスフェクション効率の内部フントロールと してのＲＳＶ−β−ｇａ１２．５μｇが同時にトランスフェクトされる。１０” Ｍの３．　５．　３’三ヨードサイロニン（Ｔ３）を含むあるいは含まない１０ ％の樹脂処理胎児仔ウシ血清［５Ｈｕｅｌｓら、ム」罰ｄｏｃｒｉｎｏｌｏ　、 　Ｖｏｌ、１０５．　ｐｐ、　８０−８５　（１９７９）コに、トランスフェク トした細胞を増殖させる。Ｔ３を添加して、４０時間後、細胞を回収し、次いで 、実施例２に記載の方法でβ−ガラクトシダーゼおよびＣＡＴア・１セイが行わ れる。

実施例２：レボーターアノセイ クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーセ（ＣＡＴ）アッセイは、３時 間以下で、２５μｇの総細胞抽出タンパク質で行われること以外、Ｈｏｌ　ｌｅ ｎｂｅｒｇら、Ｃｅ１１．　Ｖｏｌ、　４９゜ｐｐ、　３９−４６　（１９８？ ）に記載の方法に従って行われる。薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）プレート を切り、５％ジメチルスルフォキサイド（ＤＭＳＯ）含有Ｅｃｏｎｏ　ｆ　ｌ　 ｕｏｒ中でカウントする。

β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａ　ｌ）ア・７セイは、Ｈｅｒｂｏｍｅｌら、Ｃ ｅ１１．Ｖｏｌ、　２９．　ｐｐ、　６５３−６６２　（１９８４）に記載の方 法に従って行われる。

実施例１　ｈＧＲ媒介の負の調節 アルファ１６８プロモーター（ＧＲによって抑制される絨毛性性腺刺激ホルモン をコードするアルファサブユニット遺伝子のプロモーターである）に対するｈＧ Ｒ媒介抑制を説明するのに、ヒト胎盤Ｊ　ＥＧ−３細胞内においてｈＧＲ発現プ ラスミドによるアルファ１６８−ＣＡＴレポータープラスミドの負の調節に関す る用量応答の研究が行われる。リン酸カルシウム沈澱法によって、種々の量のｈ ＧＲ発現プラスミド（Ｒ３Ｖプロモーターによって制御される）およびアルファ １６８−ＣＡＴ（レポーター）発現プラスミドが同時にトランスフェクトされる 。レセプター対プロモーターの比を増加させる条件下で、同時トランスフェクシ ョンを実行する。次いで、デキサメタシンのステロイドホルモンの存在あるいは 不在下で、結果として得られる一過的ＣＡＴ活性を測定する。

この研究を通して、ＲＳＶコントロールプラスミド量を調節することによってト ランスフェクトしたＲ５ＶプロモーターＤＮＡの総量が一定に保たれる。つまり 、ＲＳＶ　ＤＮＡにより転写因子が取り除かれる可能性をコントロールする。こ のレポーター構築物のＣＡＴ活性は上記の方法に従って測定される。

アルファ１６８−ＣＡＴレポータープラスミドは、Ｄｅｌｅｇｅａｎｅら、前出 、に記載の方法で構築される。

ＲＳＶプロモーターに制御されるｈＧＲ発現プラスミドは、Ｈｏｌ　ｌｅｎｂｅ ｒｇら、Ｃｅ１１．　Ｖｏｌ、　４９．　ｐｐ、　３９−４６　（１９８７）に 記載の方法に従って構築される。

コントロールプラスミドＲＳＶには、ラットサイロイドホルモンレセプターをフ ードする領域がアンチセンス方向で含まれている。これは、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら 、５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２３７．　ｐｐ。

１６１０−１６１４　＜１９８７）に記載されている。

図２は、デキサメタシンの存在下および非存在下においての、ｈＧＲｃＤＮＡの トランスフェクションの、レポーター遺伝子発現に対する影響を示す。図のＯは デキサメタシン無添加の培地を表し、・はデキサメタシン（１０”Ｍ）添加培地 を表す。図２に示されている特定の実験では、２μｇのプロモータープラスミド が用いられる。矢印は、この後の実験に用いられるプロモーターに対するレセプ ターの比を示す。

図２には、レセプター発現プラスミド量の増加に伴い、ステロイド依存性抑制が 高くなることが示されている。レセプターｃ　ＤＮＡが存在しないときには、１ ０％より低い最大抑制が測定される。プロモーターに対するレセプターの比が１ から５まで、より多くのレセプタープラスミドがそれ以上のステロイド依存性抑 制を与えないところで、抑制活性の平坦域が現れる。ＲＳＶプロモーター量が一 定に保たれているため、この平坦域はレセプターの活動部位がおそらく飽和状態 であることを示す。このあとの実験では、レセプター：プロモーターの比は２： ｌである。ステロイド依存性抑制は６倍およｑ２０倍までの範囲で変動し、その 平均は図２に代表されているように９倍である。このアッセイは野生型ｈＧＲ抑 制の１０％のような低い抑制まで信頼性をもって測定できる。

図゛３は、野生型ｈＧＲ１部分的欠失ｈＧＲ融合タンパク質およ、び種々のｈＧ Ｒ融合タンパク質のＣＡＴ活性の比較を示す。ｈＧＲ融合タンパク質を上記の方 法でアッセイする。ｌ５８２＊、野生型ｈＧＲ（ｈｇｒｗｔ）、Ｉ５３：）ｓお よびｌ５３２＊−β−ガラクトシダーゼ融合物に対し、用いたホルモンはデキサ メタシンであり、融合タンパク質ＧＧＭに対し、用いたホルモンはアルドステロ ンである。

図３Ｂにおいて、種々のｈＧＲ由来のタンパク質の作製の概略図が示されている 。すなわち、ｌ５８２＊は５８２個のアミノ酸のみを有する部分欠失ｈＧＲであ り；　ｌ５３２＊は５３２個のアミノ酸のみを有する部分欠失ｈＧＲであり：　 ｌ５３２＊−β−ガラクトシダーゼはｈＧＲ白来のｌ−５３２アミノ酸、および β−ガラクトシダーゼ由来の８−１０２５アミノ酸を含有する融合タンパク質で あって、ｐｓＫ１０５の誘導体であるｐＢＧ−１の３０３０ｂｐ　ＢａｍＨＩ　 ＬａｃＺ断片を■５３２のＢａｍＨ１部位に読み枠が合うように挿入して作製し た（　Ｃａ５ａｄａｂａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ。

Ｖｏｌ、ｔｏｏ、２９３．　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８３））　 ：およびＧＧＭは、融合タンパク質であって、先ず、付加的なＸｈｏ　Ｉ部位を 、ｈＧＲのヌクレオチド位置Ｉ　５９６　（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇら、■辿■３ １８、６３５　（１９８５））およびヒトミネラルコルチコイドレセプター（ｈ ＭＲ）のヌクレオチド位置２２３３　（Ａｒｒｉｚａら、江１ｅｎｃｅ　２３７ ．２６８　（１９８７））の両者に導入して、次いで、ｈＭＲの適切なＸｈｏｌ 断片をｈＧＲに挿入して構築された、ｈＧＲの１−４８９アミノ酸およびｈＭＲ の６７１−９８４アミノ酸を有するレセプターである。

図３Ｂには、カルボキシル末端融合タンパク質の、アルファ１６８プロモーター に対する抑制活性、およびマウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＴＶ）プロモーターに対 する活性化が比較されている。野生型活性の百分率が、ＲＳＶコントロールプラ スミドの活性を０％とし、野生型ｈＧＲの活性を１００％として、各実験で計算 され、平均値上標準誤差が表されている。コントロール１およびコントロール２ はＲＳＶコントロールプラスミドを用いたトランスフェクシヨンを示す。コント ロール１および次の４つの構築物はステロイドとしてデキサメタシンを用い、フ ントロール２およびＧＧＭはステロイドとしてアルドステロンを用いた。ｌ５３ ２１に一β−ガラクトシダーゼ構築物の番号はＣａ５ａｄａｂａｎら、穎已工、 上工泣１（社）１．ｖｏｌ、　１００．　ｐｐ、　２９８−３０８　（１９８３ ）が番号付けしたβ−ガラクトシダーゼのアミノ酸番号を示し、そしてＧＧＭの 番号はＡｒｒｉｚａら、前出（１９８７）、が付けたｈＭＲアミノ酸の番号を示 す。「＊」は野生型抑制活性の１０％より低い活性を示し、「＊＊」は野生型活 性化活性の１％より低い活性を示す。

ｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端側に異種のタンパク配列を連結 して、新規の配列特異的リプレッサーを作製し得る。ある場合において、大腸菌 のβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａ　Ｉ）が、読み枠が合うようにｈＧＲのＤＮ Ａ結合ドメインのカルボキシル末端側に融合され、調節性質がアッセイされ得る 。マウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＴＶ）プロモーターに対し、このハイブリッドタ ンパク質は、組型部分欠失レセプターの性質と変わらない性質を有する構成的な アクチベーターとして機能する。アルファ１６８プロモーターに対しては、融合 タンパク質は構成的なリプレッサーであり、その活性が部分欠失レセプター、ｌ ５３２＊と比べ著しく増加している。すなわち、機能的な転写リプレッサーを作 成するには、異種である大腸菌タンパク配列をｈＧＲのＤＮＡ結合ドメインに付 加することで充分である。

この研究の結果は、ｈＧＲの正および負の調節効果を識別するための様々な手段 を提供する。先ず、強力なアクチベーター配列、τ１、を含有するアミノ末端ド メインはトランスの抑制には必要ではない。実際には、τ１の削除によって、よ り強力なりプレノサーが生じることが見出された。この事実より、リプレッサー として機能するときでも、ｈＧＲのアミノ末端領域にはいくらかの正の活性が残 っていると考えられる。

ｈＧＲにある種の改変を施すことによって、正常のりブレ２サ一機能を保持して いるにも関わらず、正の活性化能力を実質的に全て欠損するレセプターを生じる 。この事実は、活性化のプロセスが抑制のプロセスとは機構的に異なり得ること を示唆する。この観察はさらに、ＤＮＡ結合ドメインの機能が単に適切な調節配 列を配置するのに留まらないことを示す。その上、この結果は、ＤＮＡの結合に 引き続いて起こる、負の調節には明かに重要でないもうひとつ事象が、活性化に は必要であることを示す。

活性化と抑制との別の差異は、β−ガラクトシダーゼ分子が抑制においてのみ、 ｈＧＲのカルボキシル末端と機能的に置き換わることである。カルボキシル末端 の削除により、最小の抑制活性を有する変異レセプターが生ずる結果となる。

実施例４：サイロイドレセプター媒介の負の調節結合リガンドが存在しなくても 、サイロイドレセプター（ＴＲ）は、本来の応答エレメントに結合し得るという 点で、グルココルチコイドレセプター（ＧＲ）とは異なる。これらの差異を考慮 して、ＧＲについて研究された改変と似た改変をＴＲに対し行えば、同様なトラ ンスの抑制誘導体を与えるかどうかを決定することは興味深いことである。

これらの研究に用いられるベクターは以下の通り調製される： 発現ベクターＲＳ−ｒＴＲａは、Ｔｈｏａ＋ｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、　ｏｆ　ｔ ｈｅ　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　ｏｆ　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　８６．　ｐｐ、 　３４９４−３４９８　（１９８９）に記載のとおり構築される。

発現プラスミドＲＳ−ｖ−ｅｒｂＡは、クローン化したｇａｇ−ｖ−ｅｒｂＡ遺 伝子［Ｖｅｎｎｓｔｒｉｉｍら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｖｏｌ。

３６、ｐｐ、　５７５−５８５　（１９８０）］からコーディング配列を切り出 し、次いで５′末端および３°末端を適当に修飾して、ベクターＫｐｎ　Ｉおよ びＢａｍＨ１部位の間に挿入して、作製される。

Ｈｉｎｄ　Ｉ　Ｉ　Ｉアダプター配列にフランキングされたノくリントロームの 応答エレメント［ＴＲＥ、；　ＴＣＡＧＧＴＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡ；Ｇｌａｓｓ ら、Ｃｅ１ｌ　Ｖｏｌ、５４．　Ｐｐ、３１３−３２３　（１９８ｇ）コをコー ドする合成オリゴヌクレオチドを、ｐＢＬ−ＣＡＴ２［Ｌｕｃｋｏｗら、Ｎｕｃ 、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５．５４９０　（Ｌ９８７）］の唯一のＨｆｎｄ ＩＩＩクローニング部位に挿入する。単数あるいは複数のコピーのＴＲＥを有す るプラスミドを制限酵素マ・ラビングおよび配列分析によって同定する。ｒＴＲ α遺伝子［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら−，５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２３７．　ｐ ｐ、　１６１Ｇ−１６１４（１９ｇ？）］およびｖ−ｅｒｂＡ遺伝子［Ｄａｍｓ ら、ＥＭＢＯＪ、　Ｖａｔ、　６．３７５　（１９８７）およびＩ／ｅｎｎｓｔ ｒ５＋＊ら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　３６．５７５　（１９８０）］の両者に共通 する制限酵素切断部位を利用して、ハイブリッド遺伝子を構築する。ｒＴＲａお よびｖ−ｅｒｂＡのタンパク配列構成の概略は図３Ａに挙げられている。これら のタンパク質をコードするｃＤＮＡをＲ３Ｖ発現ベクターにクローン化する。

図の中の［ＤＮＡＪおよびｒ　Ｔ　ｓ／　Ｔ　ａ］は、それぞれＤＮＡ結合ドメ インおよびサイロイドホルモン結合ドメインを指す。

ニワトリのｃ−ｅｒｂＡ／ＴＲαの７ミノ末端の１２個のアミノ酸をし）Ｏウィ ルスのｇａｇ遺伝子で一部置換し、ＰＩ３　ｇｍｇ−ｖ−０ｒｂＡハイブリツド タンパク質を合成する。それに加え、ｖ−ｅｒｂＡがニワトリのｃ−ｅｒｂＡ／ ＴＲａと興なル点は、ＤＮＡ結合ドメインの２個のアミノ酸およびホルモン結合 ドメインの９個のアミノ酸が異なっていること、そしてホルモン結合ドメインの 中の９個のアミノ酸が除去されているという点である。図３Ａに示されているラ ットＴＲαと′の比較により、さらに１７個のアミノ酸の差異が明らかにな・う ている。これらのアミノ酸の差異が種特異的であり、そしてニワトリとラットの ＴＲαのアミノ酸配列との比較にモ見比されている。図３Ａの構築物の上に表さ れている番号はアミノ酸の位置を示す。

ｒＴＲａのリガンド結合ドメインのＰｓｔＩ断片を除去して、ＴＲ（△１５４／ ３１７）を作製する。ｒＴＲａのカルボキシル末端をｖ−ｅ　ｒ　ｂＡ−ｎ　ｅ 　ｏ構築物［Ｓａｐら、Ｎａｔｕｒｅ　３２４．６３５　（１９８６）コのＰｓ ｔＩ−ＸｂａＩ断片で置換して、ＴＲ（△１５４／３１７）ｅｒｂＡを作製する 。ｒＴＲａあるいはｖ−ｅｒｂＡのいずれかのＰｓｔ１１断片をそれぞれのプラ スミドの唯一のＰｓｔ１部位に再び挿入して、プラスミドＴＲ（３１７）ｅｒｂ Ａ％　ＴＲ（１５４ｅｒｂＡ）およびＴＲ（１５４／３　ｔ　７）を作製する。

全ての修飾はｒＴＲａのリガンド結合ドメイン由来のサブクローン化された断片 に行われ、ＲＳ−ｒＴＲａのＸｂａ断片を、対応するキメラ断片で置換して、ハ イブリッド発現構築物を作製する。

ＣＯ８細胞を、５％Ｔ３フリーウシ血清を含むＤＭＥＭで培養し、ＤＥＡＥデキ ストランを用いてトランスフェクトするＪＧｉｇｕｅｒｅら、Ｃｅ１ｌ　４６． ６４５　（１９８６）］　ｏ　３６時間後、細胞を回収し、バッファーが２０ｍ Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，８）、０．４Ｍ　ＫＣＩ、２ｍＭジチオトレイトー ル（ＤＴＴ）および２０％グリセロールである以外、Ｋｕｍａｒら、Ｃｅ１１． 　Ｖｏｌ、　５５、１４５　（１９８Ｂ）に記述されているとおりに、抽出物を 調製する。

ＤＮＡ結合反応およびゲル電気泳動を実質的に、Ｇｌａｓｓら、Ｃｅ１１．Ｖａ ｔ、　５４．３１３　（１９８８＞の記載に従って行なう。６〜１０μｇの全タ ンパク質を含有する試料液を、最終ＫＣＩ濃度が８０ｍＭになるように希釈し、 ２μｇポリデオキシシチジル酸（ｐｏ　ｉ　ｙ　［ａｃｌ　）と、２０分、室温 でインキ１ベートする。このとき、２５〜５０　ｆｍｏ　ｌの、パリンドローム ＴＲＥをコードする、３２Ｐラベルしたオリゴヌクレオチドを加えた。反応混合 物を２２℃で３０分インキ１ベートし、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　（ｐＨ７，８） を含有する５％ポリアクリルアミドゲルに乗せた。ラベルしたオリゴヌクレオチ ドを加える前に、コンペティターＤＮＡを加えた。

読み取り枠を保持するように、ｒＴＲａをＰｖｕＩＩで部分消化して、ＢａｍＨ Ｉリンカ−（１２ｍｅ　ｒ）を付加して、ＤＮＡ結合変異体１９５ＴＲを構築し た。制限酵素マツピングおよび配列分析で、リンカ−の位置を確認した。

読み取り枠を保持するように、ＴＲ（１５４）ｅｒｂＡをＰｖｕＩＩで部分消化 して、Ｂ　ａ　ｍ　Ｈｒリンカ−（１２ｍｅｒ）を付加して、ＤＮＡ結合変異体 、ｉ９５　（１５４）ｅｒｂＡを構築した。制限酵素７ノピングおよび配列分析 で、リンカ−の位置を確認した。

先ず、う１トサイロイドホルモンαレセプター（ｒＴＲａ）［：　Ｔｈｏｍｐｓ ｏｎら、５ｃｉｅｎｃｅ　２３７．１６１０　（１９８７）］およびｖ−ｅｒｔ ）Ａ腫瘍遺伝子生成物の両者の転写活性を評価する。その方法は、サイロイドホ ルモン応答レポーター遺伝子（図４Ａ参照）の発現を調節するこれらの能力を測 定することによって行われる。この図に示される構築物には、以前に同定された サイロイドホルモン応答エレメント［ＧＩａｓｓら、Ｎａｔｕｒｅ■ユ。

７３８　（１９８７）およびＧｌａｓｓら、Ｃｅ１ｌ　５４．３１３　（１９８ ８）］に相当するオリゴスクレオチドが、チミジンキナーゼ−クロラムフェニコ ールアセチルトランスフェラーゼ（ｔ　ｋ　−ＣＡＴ）　融合遺伝子［Ｌｕｃｋ ｏｗら、Ｎｕｃ、　Ａｃ’ｄｓ　ｅｓ、　Ｌｉ、　５４９０　（１９８７）］　 （図４Ｂ参照）に連結している。用いたレポーター遺伝子は、図４Ｂに示され、 それぞれのＴ３応答エレメント（ＴＨＥ）をコードするオリゴヌクレオチドが、 ｔｋプロモーター−ＣＡＴ構築物の上流のＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　（Ｈ）部位に挿 入されている。

ＲＳＶのＬＴＲによる転写調節下にあるｒＴＲａあるいはＶ−ｅｒｂＡをコード する発現プラスミドおよび１種のレポータープラスミドを、内在性ＴＲレベルが 著しく低いＣｖｌ細胞に、同時にトランスフェクトした。

レポーター構築物ｔｋ−ＣＡＴ、ｔｋ−ＴＲＥ、−ＣＡＴあるいはｔ　ｋ−ＴＲ Ｅ−ＣｌＯ２−ＣＡＴとそれぞれの発現プラスミド（Ｒ９−ｒＴＲａあるいはＲ ３−ｖ−ｅｒｂＡ）および内部レファレンスプラスミドＲ３Ｖ−βＧＡＬを、Ｃ Ｖ−１Ｍ胞に同時にトランスフェクトする。コントロール実験では、ｒＴＲａの コーディング配列を逆方前（ＲＳ−３′−５′）で有する構築物を用いる。

ｔｋ−ＴＲＥ、　−ＣＡＴあるいは成型ベクター、ｔｋ−ＣＡＴｌ　によるトラ ンスフェクシヨンにより、高基礎しベルＣＡＴ活性が見られ、この活性はサイロ イドホルモンの添加によってわずかに上昇する。これに対して、ＴＲ発現ベクタ ー、ＲＳＶ−ｒＴＲａ、を同時トランスフェクトすると、ｔｋ−ＴＲＥｏ−ＣＡ Ｔ発現に対して著しい影響がもたらされる。サイロイドホルモンが存在しないと き、基礎ＣＡＴ活性カ８０％減少する（「低基礎レベル活性」と呼ぶ）ことが観 察される。この現象は、ＴＲ発現が転写に対してリガンド非依存性阻害効果を引 き起こすことを示唆する。サイロイドホルモン、三ヨードサイロニン［Ｔ３］を 、最終濃度がｌ１００ｎになるように添加すると、ｔｋ−ＴＲＥ、−ＣＡＴが２ ０倍促進される。これは、ＴＲ発現がないときに得られた基礎レベル活性の３〜 ５倍の促進に相当する。

ｒＴＲαの調節機能はＴＨＥ、に限られない。例えば、ラット成長ホルモン遺伝 子由来のＴＲＥもホルモン非依存性およびホルモン依存性転写応答を持続し得る 。この機能的アッセイにより、ｖ−ｅｒｂＡ腫瘍遺伝子生成物の推定される転写 活性を直接決定することが可能である。ｖ−ｅｒｂＡはサイロイドホルモンとの 結合能を失っているが、完全なりＮＡｍＡｍノドメイン持しているため、ｖ−ｅ ｒｂＡが構成的に活性なＴＲとして機能すると予想できる。しかし、ｖ−ｅｒｂ Ａをいずれかのレポータープラスミドと同時トランスフェクションすると、転写 は促進されず、むしろホルモンの非存在下での、ｒＴＲαの負の調節に似た効果 を示す。すなわち、Ｖ−ｅｒｂＡを発現する細胞では、ＣＡＴ活性は高基礎レベ ルから８０％減少し、Ｔ３の添加によっ°て回復され得ない。

ｖ−ｅｒｂＡの様々な変異がこのタンパク質の変化した性質（このタンパク質の 原型の、ＴＲと比べて）に対する影響を同定するために、そして活性化および抑 制のプロセスをさらに詳細に解明するために、ｖ−ｅｒｂＡ腫瘍遺伝子のキメラ レセプター［Ｄａｍｍら、ＥＭＢＯＪ、　Ｖｏｌ、　６．　ｐｐ、　３７５−３ ８２　（１９８７）およびＶｅｎｎｓｔｒｉ５ｍら、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　Ｖｏ ｌ、３６．　ｐｐ、５７５−５８５　（１９８０）参照］およびラットＴ　Ｒａ 　［Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、（１９８？）、前出コを構築する。ラットＴＲα／　 ｖ　−ｅ　ｒ　ｂ　Ａキメラタンパクの構造を表す略図は、図５Ａに表示される 。各構築物の上に表されている番号はアミノ酸の位置を指す。黒塗りのバーは、 ｖ−ｅｒｂＡの９個のアミノ酸の削除を示し、その結果、完全なカルボキシル末 端を有する４１０個のアミノ酸のタンパク質と比べ、４０１個のアミノ酸の融合 タンパク質が得られる。図５Ｂには、表示の発現ベクターにおいて、ｔｋ−ＴＲ Ｅｏ　ＣＡＴのＣＡＴ活性に対する正のおよび負の調節が示されている。この棒 グラフは、２〜６回の独立のトランスフェクション実験の平均値を示す。棒グラ フの点刻バーはホルモンなし、斜線バーはｌｏｏｎＭのＴ３が存在するときの値 を示す。

１５４位〜４１０位のアミノ酸では、ｖ−ｅｒｂＡはｒＴＲαと、２６個のアミ ノ酸が興なり、そしてカルボキシル末端付近の９個のアミノ酸が削除されている 点で異なる。ｒＴＲαのこの領域をｖ−ｅｒｂＡで交換することによって、ハイ ブリッドＴＲ（１５４）ｅｒｂＡ　（図５Ａ）を生ずる。その性質は同類のｖ− ｅｒｂＡと実質的に一致している（図５Ｂ）。すなわち、ＤＮＡ結合ドメインお よびフランキングアミノ酸の変異はｖ−ｅｒｂＡ表現型にとって重要ではない。

ｒＴＲαリガンド結合ドメインの内部領域（１５４位〜３１６位のアミノ酸部分 ）の置換は、天然レセプターのように機能するＴ３応答ハイブリッド（ＴＲ（１ ５４／３１６）　ｅ　ｒｂｋ’）を生ずる。これに対して、ｒＴＲαのカルボキ シル末端の９３個のアミノ酸を、ｖ−ｅｒｂＡの対応する配列（この配列は９個 のアミノ酸の削除および他の１１個のアミノ酸がさらに違う）で置換することに より、ウィルス性腫瘍遺伝子生成物と同様の抑制性質を有するハイブリ、ドＴＲ （３１７）ｅｒｂＡを得る。

内在性サイロイドレセプターの機能に対するｖ−ｅｒｂＡの影響を調べるのに、 Ｃｖ１細胞における同時トランスフェクション研究を実施する。ＣＶ−１細胞に 、レポーター遺伝子ｔｋ−ＴＲＥ、−ＣＡＴ　（０，５μｇ）、ｌμｇのｒＴＲ ａ全Ｒａクターおよび内部コントロールプラスミドＲ３Ｖ−β−ＧＡＬを、同時 にトランスフェクトする。さらに、図６に示される発現プラスミドの１０倍過剰 ｊｌ（１０μｇ）ヲ、ｒＴＲαと同時トランスフェクトする。（−）で表示され る実験では、１０μｇのフントロールプラスミドＲ５−３″　−５１を用いた。

２〜６回の独立のトランスフェクション実験の平均値が図６の棒グラフに表され ている。全ての実験は、１１００ｎのＴ３の存在下で行われる。

図６Ａに示されるように、１０倍モル過剰量のｖ−ｅｒｂＡにより、ｒＴＲαに よるレポーター遺伝子のサイロイドホルモン依存性転写誘導が９０％減少する。

ハイブリッド構築物ＴＲ（１５４）ｅｒｂＡおよびＴＲ（３１７）ｅｒｂＡもｖ −ｅｒｂＡ一様活性を示し、その結果、Ｔ３およびｒＴＲαによって誘導される レポーター遺伝子の促進を実質的に完全に抑制する。しかし、この活性は完全な りＮＡ結合領域の存在に依存する、その理由は、ＤＮＡ結合ドメイン変翼１９５ （１５４）ｅｒｂＡが競合を示さないからである。

同様に、ＭＴＶプロモーター内にＴＲＥ、を配置すると、Ｔ３誘導がｖ−ｅｒｂ Ａおよびキメラ構築物によって妨げられる。

これらの結果から、ＴＲ活性とコンペティター生成物の濃度との間に逆関係が存 在することが予想される。この予想を調べるのに、ＴＲ（１５４）ｅｒｂＡとｒ ＴＲａ全Ｒａクターとのモル比を変化させて、同時トランスフェクトし、ホルモ ン応答性を評価した。つまり、ＣＶＩ細胞に、レポーター遺伝子ｔ　ｋ−ＴＲＥ 、−ＣＡＴ　（０，５μｇ）を、ｌμｇの発現ベクターＲＳ−ｒＴＲα、および ホルモン非結合性コンペティターＴＲ（１５４）ｅｒｂｋを増加させて、同時に トランスフェクトする。全てのトランスフェクシ１ンにおいて、フントロールプ ラスミドＲ５−３’　−５’　を添加して、ＲＳＶプロモーター量を一定に保持 する。３回の独立のトランスフェクション実験の平均値が示されている。ｌｏｏ ｎＭのＴ３の存在下で細胞を増殖させた。

予想され−るとおり、ＴＲ（１５４）ｅｒｂＡの増加に伴って、ｒＴＲαの活性 が減少する（図６Ｂ参照）。このアッセイでは、少量のＴＲ（１５４）ｅｒｂＡ でも有効である。３：１のプラスミド比は、ホルモンで誘導される応答を完全に 妨害する。

ホルモンレセプターのＤＮＡ結合能がリガンド依存性である［Ｅｖａｎｓ、　紅 シ瓜姐２４０．８８９　（１９８ｇ）］ことが一般に推測されているにも関わら ず、本明細書に開示されている結果および以前の観察［Ｌａｖｉｎら、Ｊ、　Ｂ ｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６３．９４１８　（１９８８）コはこの推測に反する 。応答プロモーターによる転写のダウンレギュレーションはおそらく、ホルモン の非存在下で、レセプターが本来の応答エレメントを認識し、そのエレメントと 結合する能力の結果である。２つの証拠はこの推定を支持する。その１つの証拠 は、完全なりＮＡ結合ドメインはゲル電気泳動遅延実験および観察される転写効 果の両者にとって必要である。第２の証拠は、応答エレメントが存在しないとき 、充分な抑制が観察されないが、ＴＨＥを縦列に連結すると正のおよび負の転写 作用が可能になることである。グルココルチコイドレセプターおよびエストロゲ ンレセプターおよびそれぞれの応答エレメントに対する正の相乗作用［５ｃｈｉ ｌｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４２．　１４１８　（１９８８）および５ｔｒｉｈ ｌｅら、ＥＭＢＯＪ、　Ｌ　３３８９　（１９＋３８）］が既に観察されている が、本発明に観察された負の相乗作用は明白な先例がない。

実施例５：レチノイン酸レセプター媒介の負の制御ＲＡＲαとＴＲａおよびＶ− ｅｒｂＡとの正および／または負の相互作用を調べるために、ＴＲａあるいはｖ −ｅｒｂＡの存在下で、ＲＡＲαおよびレポータープラスミドでＣｖ−１細胞を 同時にトランスフェクトする（図７）。図の中で、ＴＲａあるいはｖ−ｅｒｂＡ は、ＲＡＲ（！によるＲＡ誘導性の転写活性化と競合する。ＲＡＲαの発現ベク ター（１，０μｇ）を、ＴＲａ　（５，Ｏｔｔｇ＞あるいはｖ−ｅｒｂＡ（５゜ ０μｇ）とともにあるレポータープラスミドΔＭＴＶ−ＴＲＥｐ−ＣＡＴ（１， Ｑμｇ）と同時にトランスフェクトする。

プラスミドは、１０．０ｃｍ皿１つに付き５Ｘ１０５個のＣＶ−１細胞（５％仔 牛ウシ血清を添加したＤＭＥ培地中に保持されている）にカルシウムリン酸沈澱 法で導入する。

先にＤａｍｍらのＮａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ　３３９．５９３　（１９８９）、お よびＵ＋ｍｅｓｏｎＯらのＮａｔｕｒｅＳＶｏｌ　３３５．２６２　（１９８８ ）に述べられているように、発現プラスミドＲＡＲａＴＲαおよびｖ−ｅｒｂＡ は、Ｒ３Ｖプロモーターの制御下にある。細胞を３６時間、活性炭樹脂から溶出 した１０％の子牛血清を含むダルベツコの変法イーグル培地［５ａＩＩＩｕｅｌ ｓら、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ　１０５．８０（１９７９）］で、 示されているように、ホルモンの存在あるいは非存在にて培養した。次にＧｏｒ ｍａｎらＭｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、Ｖｏｌ　２，１０４４（１９８２）に記 載のように、凍結溶解を３サイクル行うことによってＣＡＴ活性のために調製し た。細胞抽出物の一部を、ＣＡＴアッセイを行う前にβ−ｇａｌ活性によって標 準化した。ホルモンは、最終濃度がｉｏｏｎＭになるように加えた。これらのデ ータは、４回の別々の実験の平均である。

５倍モル過剰のＴＲａは、ＣＡＴ活性のＲＡ依存性誘導を９０％減少させた。Ｔ ３およびＲＡの両方が同時に加えられたとき、転写の阻害はみられなかった。従 って、Ｔ３の非存在下では、ＴＲａは、ＲＡＲαにょるＲＡ誘導性の遺伝子発現 の活性化を妨げ、一方Ｔ３の存在下では、おそら＜ＴＲａによる活性化が観察さ れる。同じように、ＲＡＲ活性化のＴＲ阻害が、Ｇｒａｕｐｎｅｒら、Ｎａｔｕ ｒｅ、　１１０１３４０．６５３（１９８９）および１３ｒｅｎｔら、Ｔｈｅ　 Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌｏｇｉｓｔ、Ｖｏｌ　１，３２９　（１９８９）によって、最 近観察されている。ｖ−ｅｒｂＡがＲＡＲαと共にトランスフェクトされたとき 、ＲＡ誘導性遺伝子活性化の同様の競合が観察される。

ＲＡＲαに直接、負の優性な影響を与え得るかどうかを調べるために、一連のＲ ＡＲの部分欠損体およびハイブリッドＲＡＲα−ｅｒｂＡ融合からなる変異ＲＡ Ｒαを作成する。

ＲＡＲは、リガンド依存性転写因子として機能するため、リガンド結合ドメイン に改変あるいは欠損を含み、ＤＮＡ結合ドメインは完全である変異体は、優性の 負の表現型を与え得る。実際、実施例４に記載の結果から、ＴＲａのカルボキシ ル末端に位置するリガンド結合ドメインを、ｖ−ｅｒｂＡのカルボキシル末端に 置換すると、ＴＲａの優性な負の変異体として機能する、ハイブリッドＴＲα− ｅｒｂＡ分子ができる。従って、同じ様なＲＡＲαとｖ−ｅｒｂＡとの融合体が 、カルボキシル末端に位置するＲＡＲαのリガンド結合ドメインを、ｖ−ｅｒｂ Ａのカルボキシル末端に置換して、構築される（図８）。ハイブリッドのＲＡＲ α−ｅｒｂＡ融合体は、ＴＲ３１７−ｅ　ｒ　ｂ−ＡのＮ末端およびＤＮＡ結合 ドメインを取り除き（［）ａｉｍら、前出参照）、その部分をＲＡＲαの対応す るＮ末端およびＤＮＡ結合ドメインに置き換えることによって構築したくこのよ うに、ＲＡＲα−ｅｒｂＡハイブリッドタンパク質ができる）。部分欠損変異体 では、ＲＡＲαの最後のアミノ酸を、翻訳停止シグナルの挿入の前の示された位 置におく。ＲＡＲ１８５および２０３の部分欠損変異体は、野生型のレセプター 中に存在する唯一の制限酵素部位を用いて構築し、一方ＲＡＲ１５３は、１５３ ＲＡＲαの位置に、唯一のＸｈｏ部位を作成して停止コドンを挿入することによ って、構築した。レチノイン酸を最終濃度１１００ｎになるように加えた。

トランス活性化の実験では、レチノイン酸の添加によって、正の応答は、ＣＡＴ 活性の２５倍増加に対応する。レチノイン酸の添加によって、トランス活性化に 対する負の応答はない。競合実験では、正の応答は、レチノイン酸誘導性のトラ ンス活性の８０％より多い競合に対応し、一方負の応答は、レチノイン酸の添加 によって、競合することはない。

ＲＡＲα−ｅｒｂＡタンパク質自体は、ホルモンが存在していてもいなくても、 転写のアクチベーターとしては作用しない。しかし、ＲＡＲα−ｅｒｂＡの融合 体がＲＡＲαと同時トランスフェクションされた場合、これはＲＡＲα゛のアン タゴニストとして機能する。図９参照。

ＣＶ−１細胞は、ＲＡＲ発現発現ツクター１．　０　ｕ　ｇ）、ΔＭＴＶ−ＴＲ Ｅｐ−ＣＡＴレポータープラスミド（Ｕｍｅｓｏｎｏら、前出参照）　（５，０ μｇ）、レファレンスプラスミド（５゜０ｍｇ）で、２０．０ｍｇまで漸増する ＲＡＲ（！−ｅｒｂＡおよびキャリアープラスミドとともに同時トランスフェク ションする。Ｒ３Ｖ−プロモーターの添加は、キャリアープラスミドの添加によ る全てのトランスフェクションにおいて、一定に保つ。最大応答％は、ｌ　ＯＯ ｎＭのＲＡの存在下で、ＲＡＲ野生型レセプターで観察されるＣＡＴ誘導を表し ている。この活性化は、２５倍のＲＡ誘導に対応する。すべてのデータは、４回 の別々の実験の平均である。

ＲＡＲａ−ｅｒｂＡは、ＲＡＲβおよびＲＡＲ７のＲＡ誘導活性化を拮抗し得る 。従って、ＲＡＲａのカルボキシル末ｍをＶ−ｅｒｂＡのカルボキシル末端に置 換すると、ＲＡＲａに優性な負の表現型が付与される。これに対して、一連のカ ルボキシル末端欠損体からなるＲＡＲ変異体は、それ自体がトランスフェクショ ンされた場合、転写のアクチベーターとして作用しないし、モしてＲＡＲａと共 にトランスフェクションされた場合、ＲＡＲａのコンペティターとして作用しな い。ＲＡＲ部分欠損体についてのこれらのデータは、Ｅｓｐｅｓｅｔｈら、Ｇｅ ｎｅｓ　ａｎｄ　Ｄｅｖ、、　Ｖｏｌ、　３．１６４７　（１９８９）の最近の 研究と一部食い違う。彼らは、実質的にＲＡＲ−１８５と同じＲＡＲα変異体は 、ＲＡに応答して分化しない安定なＦ９クローンを少ない割合で生じ、従って、 このＲＡＲ部分欠損変異体は、優性の負のＲＡＲとして機能するのではないかと 仮定した。

ｖ−ｅｒｂＡおよびＴＲａと共にあるＲＡＲ（！−ｅｒｂＡ融合体の性質は、さ らにその内生のＲＡＲを抑制／拮抗する能力を調べることによって研究される。

Ｆ９細胞は、ＲＡ依存性分化の細胞モデルとして確立された。この細胞は、ＲＡ Ｒファミリーのα、β、およびγサブタイプのリセブターを含む。ＲＡＲａおよ びＲＡＲγは、分化していない幹細胞中に存在しており、一方ＲＡＲβは、ＲＡ 処理によって誘導される。例えば、５ｔｒｉｃｋｌａｎｄ　ａｎｄ　Ｍａｈｄａ ｖｉのＣｅ１ｌ、　Ｖｏｌ　１５，３９３　（１９７８）：　５ｐｏｒｎらＴｈ ｅ　Ｒｅｔｉｎｏｊｄｓ、Ｖｏｌ　ｌ−２，Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（ Ｏｒｌａｎｄｏ、　ＦＬ、　１９８４）；およびＨｕ　ａｎｄ　Ｇｕｄａｓ　Ｍ ｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ　１０．３９１　（１９９０）を参照。

Ｆ９細胞へのＲＡＲａ−ｅｒｂＡ、ＴＲａあるいはＶ−ｅｒｂＡのいずれかのト ランスフェクションによって、ＲＡ誘導のトランス活性化の強い阻害が起こる（ 図１０）。Ｆ９細胞（１０％ＣＢＳを添加したＤＭＥＭに保持している）は、レ ポーターΔＭＴＶ−ＴＲＥｐ−Ｌｕｃ　（５，０）　μｇ）、５．０ｍｇのコン トロールのプラスミド（ＲＳＶ−ＣＡＴ）、あるＬｌ！Ｒ３Ｖ−ＴＲａ、ＲＳＶ −ｖｅｒｂＡあるいはＲＳＶ　ＲＡＲａ−ｅｒｂＡのいずれかで、カルシウムリ ン酸法によってトランスフェクションする。５．　０Ｍｇのリファレンスプラス ミドおよび５゜０Ｍｇのキャリアープラスミドである。細胞は、２４時間、１１ ００ｎのＲＡの存在あるいは非存在で培養する。レポーター構築物は、ホタルの ルシフェラーゼをコードする遺伝子［：Ｄ＋４ｅｔらの、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂ ｉｏｌ、、Ｖｏｌ　７．７２５　（１９８７）］　が、レレポーター構築物ドの ＣＡＴに置き換わった以外は、ΔＭＴＶ−ＴＲＥρ−ＣＡＴと全く同じである。

細胞は、ホルモンの添加後２４時間培養し、次に回収して、Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒ ｇら、Ｃｅ１ｌ、Ｖｏｌ　５５．８９９　（１９８８）に記載のように、ルシフ ェラーゼのアッセイを行った。データは、４回の別々の測定の平均である。

実施ｆＦｊ１６：　グルコフルチコイドレセプター−ｖ　ｅ　ｒ　ｂＡおよびＧ Ｒ−βＧａｌＧａｌ融合タン バクＲａ−ｅｒｂＡ融合タンパク質が優性な負のＲＡＲとして機能すること、そ してＴＲａ−ｅｒｂＡハイブリ、７ドがＴＲａのインヒビターとして機能する能 力の前記の考察は、ステロイド−ｅｒｂＡハイブリッドレセプターが、特異的な ホルモンレセプターアンタゴニストを作るための一般的なアプローチを提供し得 る。従って、ＧＲとｅｒｂＡとの融合物（ＧＲ−ｅｒｂＡ、図１１）は、Ｖ−ｅ ｒｂＡのカルボキシル末端をＧＲのリガンド結合ドメインに置換することによっ て、作られた。

図では、野生型ＧＲは最初に示されており、アミノ酸の位置を示す番号がつけで ある。ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインもまた示されている。ハイブリッドＧ Ｒ−ｅｒｂＡ融合物は、前記のＲＡＲ−ｅｒｂＡ融合タンパク質と同様に、ＧＲ の変異体は、カルボキシル末端のナンセンスペプチドの前に最後のアミノ酸を与 える。ＧＲ−５３２βｇａｌを得るには、ＯｒＯら、ｉｎ　Ｃｅ１１．　Ｖｏｌ 　５５．１１０９　（１９８８）によって記載されているように、Ｅ、ｃｏｌｉ 　βｇａｌを、ＧＲの５３２位にフレームに合うように融合させる。それは、β ガラクトシダーゼおよび前記Ｏｒｏら前出によって報告されたグルココルチコイ ドレセプターの特性を現すタンパク質をコードする。

トランス活性化の実験には、ＣＶ−１細胞を、発現ベクター（１，ｏμｇ）、リ ポータ−１ＭＴＶ−Ｌｕｃ　（５，０Ｍｇ）、内部コントロールとしてのＲＳＶ −ＣＡＴ　（５，０Ｍｇ）、およびキャリアープラスミドの合計の最大２０．０ Ｍｇまでで、トランスフェクトする。データは、最高応答の％割合で示されてい る。そこで、合成グルココルチコイド、デキサメサゾーンｌＸｌ０−７Ｍの存在 で、ＧＲ野生型によって観察されるルシフェラーゼ誘導を指す。この活性化は、 ３０００倍の誘導に相当する。

競合実験として、ｃｖ−ｉ細胞を、ＧＲ発現ベクター１．　０Ｍｇ、ＭＴＶリポ ーター５．０μｇ１　内部コントロールとしてのＲＳＶ−ＣＡＴ５．Ｏμｇのほ かにコンペティター５．　０Ｍｇ、および牛ヤリアープラスミドの合計の最大２ ０．０Ｍｇまでで、同時にトランスフェクトした。デキサメタシンは、最終濃度 ｔｘｔｏ−７Ｍになるように添加した。この応答は、非特異的なコンペティター の存在下で、野生型レセプターによるルシフェラーゼ活性の競合作用を０％とし た時の％に相当する。図１１のデーターは、４回の別々の実験の平均である。

融合タンパク質は、グルコ；ルチコイドの存在あるいは非存在で、グルココルチ コイド応答性のリポータ−遺伝子を活性化しない。しかし、ＧＲ−ｅｒｂＡがＧ Ｒと同時にトランスフェクトされると、ＧＲのアンタゴニストとして機能スる。

５倍モル過剰のＧＲ−ｅｒｂＡは、リポータ−遺伝子のデキサメタシン誘導を８ ７％減少する。

比較のために、一連のＧＲの部分欠損変異体の性質を、優性の負のコンペティタ ー、および転写活性物質として作用させて調べる。カルボキシル末端での部分欠 損体は、転写（ＧＲ，４８７）を活性化しない変異体レセプター、あるいは本質 的な活性化レセプター（ＧＲ５１５，ＧＲ５３２）になる。

ＧＲの部分欠損体は、野生型ＧＲと同時トランスフェクトされると、デキサメサ ゾーン誘導された転写活性に阻害効果を有さないか、あるいは最高でも、僅かな 抑制効果しか有さないＯ ＧＲのカルボキシル末端を配置することで引き出される特性が、他のポリペプチ ドによって置き換わり得るかどうかを実験するために、β−Ｃａｔを、５３２位 のＧＲのカルボキシル末端にフレームが合うように融合させる。このＧ　Ｒ−５ ３２βＧ　ａ　ｌ　Ｍ合タンパク質は、ＧＲ転写の負の調節因子として機能する ことが、前に示された（実施例３を参照）。しかし、このβ−Ｇａｌ融合タンパ ク質は、本質的に親の部１分欠損体と同様の活性があって、ＧＲ活性化を６０％ しか減少しない。

従って、ＧＲ部分欠損体およびβＧａｌ融合体の優性の負のレセプターとして作 用する能力および有用さは、本質的な活性およびＧＲコンペティターとして作用 す能力が低いにことによって最初に減少される。対照的に、ＧＲ−ｅｒｂＡは、 リガンドなしに、転写活性を有さないただ１つの変異体レセプターであって、デ キサメタシン誘導の転写活性をブロックするように機能する。さらに、ＧＲ−ｅ ｒｂＡは、本質的に活性な、ＧＲ５３２のようなＧＲレセプターに対する非常に 有力なコンペティターとして作用し得、さらに、優性な負の阻害物質として機能 する可能性を維持している。

前記の記載で、本発明を実施するために用い得る特定の方法を述べた。本明細書 のレセプターの同定、単離、特徴づけ、調製および使用のためにはじめに用いら れた特定の方法の詳細、さらに特定の性質およびその配列の開示を行ったことで 、当業者は、同じ情報を得るため、そして、さらに他の槽内、並びに種間関連の レセプターにこの情報を拡張するための、他の確実な方法の工夫の仕方を十分に 知る。従って、前述の本文にどんなに詳細に書かれていようとも、その全体の範 囲を限定するものとして、解釈されるべきではない。むしろ、本発明の範囲は、 添付されている請求項の合法的な解釈によってのみ支配されるべきである。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ステロイド／サイロイドスーパーファミリーのレセプターのトランス抑制ア ナログレセプターであって、該アナログは、下記の（１）および（２）のアミノ 酸配列を含有する：（１）ＤＮＡ結合ドメインである第１のアミノ酸配列であっ て、該アナログが、この配列を介して野生型レセプターのホルモン応答エレメン トに結合し得る、配列；および（２）ＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端に 位置する、第２のアミノ酸配列であって、下記の（ａ）および（ｂ）から選択さ れる、配列； （ａ）該野生型レセプターのカルボキシル末端部分のリガンド結合ドメインのア ミノ酸の個数の少なくとも約９０％を有するポリペプチドであって、該ポリペプ チドが、（ｉ）該野生型レセプターのカルボキシル末端ドメインより短い場合に は、該ポリペプチドの全長、あるいは（ｉｉ）該野生型レセプターのカルボキシ ル末端ドメインと同じ長さを有する、任意の該ポリペプチドセグメント、のいず れかが、野生型レセプターのカルボキシル末端ドメインに関して約６０％より少 ないアミノ酸の同一性を有する、あるいは、 （ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８（図１を参照）で定義されるｖ−ｅｒｂＡタ ンパク質のカルボキシル末端部分の、少なくとも８４個のカルボキシル末端アミ ノ酸；該野生型レセプターが、グルココルチコイドレセプターである場合には、 第２のアミノ酸配列。 ２．前記ホルモン応答エレメントが、トランス抑制に供せられるプロモーターに 、作動可能に結合されている、請求項１に記載のアナログレセプター。 ３．リガンドが存在するか、あるいは存在しない状態で、実質的に転写活性化活 性を有しない、請求項１に記載のアナログレセプター。 ４．前記第１のアミノ酸配列が、前記野生型レセプターのＤＮＡ結合ドメインで ある、請求項１に記載のアナログレセプター。 ５．前記野生型レセプターが、レチノイン酸レセプター、サイロイドホルモンレ セプター、ビタミンＤ３レセプター、グルココルチコイドレセプター、ミネラル コルチコイドレセプター、エストロゲンレセプター、エストロゲン関連レセプタ ー、アルドステロンレセプター、アンドロゲンレセプター、あるいはプロゲスト ロンレセプイクーから選択される、請求項４に記載のアナログレセプター。 ６．前記ＤＮＡ結合ドメインが、（１）グルココルチコイドレセプター；（２） サイロイドレセプター；あるいは（３）レチノイン酸レセプター；由来である、 請求項５に記載のアナログレセプター。 ７．前記ＤＮＡ結合ドメインが、ヒトのグルココルチコイドレセプターである、 請求項６に記載のアナログレセプター。８．前記ＤＮＡ結合ドメインが、サイロ イドレセプター由来である、請求項６に記載のアナログレセプター。 ９．前記ＤＮＡ結合ドメインが、レチノイン酸レセプター由来である、請求項６ に記載のアナログレセプター。 １０．前記第１のアミノ酸配列が、前記野生型レセプター由来であって、前記ア ナログレセプターが、リかンドが存在するか、または存在しない状態で、実質的 に転写活性化活性を有さない、請求項１に記載のアナログレセプター。 １１．前記カルボキシル末端ドメインが、ポリペプチドから得られる、請求項１ ０に記載のアナログレセプター。 １２．前記ポリペプチドが、少なくともβガラクトシダーゼポリペプチドの一部 分である、請求項１１に記載のアナログレセプター。 １３．前記カルボキシル末端ドメインが、ｖ−ｅｒｂＡタンパク質由来の、最大 ８４個のＣ末端アミノ酸であるＣ末端を少なくとも含有する、請求項１０に記載 のアナログレセプター。 １４．請求項１に記載のアナログレセプターを調製する方法であって、該レセプ ターをコードするＤＮＡをトランスフェクションした組換え宿主において発現す る工程を包含する、方法。 １５．請求項１４に記載の方法であって、さらに、前記アナログレセプターを回 収し、そして精製して、該アナログレセプターの外部から誘導された生物学的機 能性を測定するアッセイに用い得るようにする工程を包含する、方法。 １６．請求項１に記載のアナログレセプターをコードする、組換えＤＮＡ分子あ るいはｃＤＮＡ分子である、ＤＮＡ分子。 １７．請求項１６に記載のＤＮＡを作動可能に有する発現ベクター。 １８．請求項１７に記載の発現ベクターでトランスフェクトされた組換え宿主細 胞。 １９．請求項１８に記載の細胞および該細胞の生存を確保する外部の維持培地を 含有する、細胞培養物。 ２０．ステロイドあるいはサイロイドホルモンに正常に応答し得なくなる疾患症 状を有する、ヒト以外のトランスジェニッタ哺乳類であって、該哺乳類の細胞の 少なくとも１つのサブセットが、該ホルモンの１つのアナログレセプターを発現 し得、そして該アナログレセプターが、対応する野生型のレセプターよりも大き いトランス抑制活性を有し、そして対応する野生型のレセプターよりも小さいト ランス活性化活性を有する、哺乳類。 ２１．野生型ホルモンレセプターをトランス抑制アナログレセプターに変換する ための方法であって、該野生型レセプターのリガンド結合ドメインを、アミノ酸 番号３１３−３９８（図１参照）で定義されるｖｅｒｂＡタンパク質の、少なく とも８４個のカルボキシル末端のアミノ酸に置換する工程、 を包含する、方法。 ２２．野生型ホルモンレセプターをトランス抑制アナログレセプターに変換する 方法であって、 該野生型レセプターのリガンド結合ドメインを該野生型レセプターのカルボキシ ル末端のリガンド結合ドメインのアミノ酸の個数の、少なくとも９０％を有する ポリペプチドと置換する工程であって、 ここで該ポリペプチドは、該野生型レセプターのカルボキシル末端に対して、下 記（ｉ）あるいは（ｉｉ）が約６０％より少ないアミノ酸の同一性を有する：（ ｉ）該野生型レセプターのカルボキシル末端より短い場合には、ポリペプチドの 全長；あるいは（ｉｉ）該野生型レセプターのカルボキシル末端と同じ長さを有 する、該ポリペプチドの任意のセグメント：工程を包含する、方法。 ２３．細胞内のホルモン応答エレメントの転写活性をブロックする方法であって 、請求項１に記載のアナログレセプターに該細胞を接触させる工程を包含する、 方法。 ２４．細胞に存在するホルモン応答エレメントの、野生型レセプターによる転写 活性化をブロックする方法であって、（ａ）該野生型レセプターのリガンド結合 ドメインを実質的に欠損させる工程； （ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８（図１を参照）で定義されるｖｅｒｂＡタン パク質の、少なくとも８４個のカルボキシル末端のアミノ酸に、工程（ａ）の改 変されたレセプターを、作動可能に結合して、融合タンパク質を生産する工程； そしてその後、 （ｃ）該融合タンパク質の効果的な量を該細胞に接触させる工程；を包含する、 方法。 ２５．細胞に存在するホルモン応答エレメントである野生型レセプターにより転 写活性化をブロックする方法であって、（ａ）該野生型レセプターのリガンド結 合ドメインを実質的に欠損させる工程； （ｂ）該野生型レセプターのリガンド結合ドメインのアミノ酸の個数の少なくと も９０％を有するポリペプチドに、工程（ａ）の改変されたレセプターを作動可 能に結合して、融合タンパク質を生産する工程であって； ここで、該野生型レセプターのリガンド結合ドンメインに対して、該ポリペプチ ドは、 （ｉ）野生型レセプターのリガンド結合ドメインより短い場合には、ポリペプチ ドの全長、あるいは（ｉｉ）野生型レセプターのリガンド結合ドメインと同じ長 さを有する、該ポリペプチドの任意のセグメント、のいずれかが約６０％より少 ないアミノ酸の同一性を有する工程その後、 （ｏ）該細胞を該触合タンパク質の効果的な量に接触させる工程； を包含する、方法。 ２６．未知の関連応答エレメントおよび／または機能に対するレセプターの応答 エレメントおよび／または機能を同定する方法であって、該方法が、 テスト系が、下記の（Ｉ）あるいは（ＩＩ）で処理されたときの、野生型レセプ ターに応答する該テスト系の応答を比較する工程 を包含する、方法： （Ｉ）野生型レセプター；あるいは （ＩＩ）トランス抑制アナログレセプター；ここで、該トランス抑制アナログレ セプターは、下記の（１）および（２）を含有する： （１）ＤＮＡ結合ドメインである第１のアミノ酸配列であって、該アナログがこ の配列を介して野生型レセプターのホルモン応答エレメントに結合し得る、記列 ；および（２）ＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端に位置する第２のアミノ 酸配列であって、下記の（ａ）または（ｂ）から選択される配列： （ａ）該野生型レセプターのカルボキシル末端部分のリガンド結合ドメインのア ミノ酸の個数の少なくとも約９０％を有するポリペプチドであって、該野生型レ セプターのカルボキシル末端ドメインに対して、該ポリペプチドは、下記の（ｉ ）または（ｉｉ）にわたって約６０％より少ないアミノ酸の同一性を有する； （ｉ）該野生型レセプターのカルボキシル末端より短い場合には、ポリペプチド の全長、あるいは、（ｉｉ）野生型レセプターのカルボキシル末端ドメインと同 じ長さを有する、該ポリペプチドの任意のセグメント；または、 （ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８（図１を参照）で定義されるｖ−ｅｒｂＡタ ンパク質のカルボキシル末端部分の、少なくとも８４個のカルボキシル末端アミ ノ酸。 ２７．特異的な転生型レセプターの存在を測定するアッセイ系において、ここで 、１つより多い応答エレメントが、該野生型レセプターに相互作用し得、該アッ セイに関して、該特異的な野生型レセプター以外の野生型レセプターにも応答す る、応答エレメントを不活性化する工程を包含する改良がなされ、ここで、該応 答エレメントは、該アッセイ系に、各々のレセプターに対して、効果的な量のト ランス抑制アナログレセプターを添加することによって、不活性化され、ここで 、各々のトランス抑制アナログレセプターは、下記の（１）および（２）を含有 する： （１）ＤＮＡ結合ドメインである、第１のアミノ酸配列であって、該アナログが この配列を介して該特異的野生型レセプター以外のレセプターのホルモン応答エ レメントに結合し得る、配列；および （２）ＤＮＡ結合ドメインのカルボキシル末端に位置する第２のアミノ酸配列で あって、下記の（ａ）または（ｂ）から選択される配列； （ａ）該特異的野生型レセプター以外のレセプターのカルボキシル末端部分のリ ガンド結合ドメインのアミノ酸の個数の少なくとも約９０％のアミノ酸を有する ポリペプチドであって、該ポリペプチドは、該特異的野生型レセプター以外のレ セプターのカルボキシル末端ドメインに対して、下記のいずれかが約６０％より 少ないアミノ酸の同一性を有する；（ｉ）該特異的野生型レセプター以外の該レ セプターのカルボキシル末端ドメインより短い場合には、ポリペプチドの全長； あるいは、 （ｉｉ）該特異的好生型レセプター以外の該レセプターのカルボキシル末端ドメ インと同じ長さを有する、該ポリペプチドの任意のセグメント；または （ｂ）アミノ酸番号３１３−３９８（図１を参照）で定義されるｖ−ｅｒｂＡタ ンパク質のカルボルシル末端部分の、少なくとも８４個のカルボキシル末端アミ ノ酸。