JPH04506976A - 免疫毒素の構築のための改良された毒素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫毒素の構築のための改良された毒素原出願（０８／９１１２２７）は、その ための特定の受容体が細胞上に存在する認識タンパク質をコード化するＤＮＡ配 列と融合した変形シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｙｔ。

ｎａｓ　）外毒素（ＰＥ）遺伝子からの組換えタンパク質の製造を教示している 。この原出願ではＩＬ−２−ＰＥ融合遺伝子の構築および発現が説明されていた 。本出願はより有効な免疫毒素の構築に有用である改良された毒素の製造に関す る。特に、本発明は、標的細胞に対して有効な細胞毒性を有する抗体に容易に結 合し得る改変されたＰＥ分子（本明細書ではＬｙｓ−ＰＥ４０と表記される）を 提供する。

図面の簡単な説明 本発明の種々の目的、態様および付随する多くの利点は添付の図面を参照して以 下の詳細な記載を読めばよりよく理解されるであろう。

図１はＴ７プロモーターと、ＯｍｐＡシグナル配列と、シュードモナス外毒素の ドメインＩＩ（転位ドメイン）およびＤＩ　（ＡＤＰリボシル化ドメイン）の存 在を示すプラスミドｐＶＣ８５Ｌの構造を示す。

図２Ａは精製の種々の段階でのＬｙｓＰＥ４０ブールの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の 結果を示す。１２．５％ゲルはクーマシーブルーで染色された。列１．ＱＭＡ濃 縮培養培地タンパク質：列２．Ｑセファロースプール；列３゜ＭｏｎｏＳからの 流出物質；列４．ＭｏｎｏＳブール；列５．ＴＳＫ２５０ブール。分子量標準の 位置が示されている。図２Ｂはａｎ　ｔ　ｆ　＝ＴＦＲ＝ＬｙｓＰＥ４０の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す。試料は１０％還元性ポリアクリルアミドゲルに 注入された。列１．αＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０　：列２．ＬｙｓＰＥ４０　；列 ３．　ａｎ　ｔ　１−ＴＦＲ，ゲルはクーマシーブルーで染色された。

図３Ａはａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０によるＡ４３１細胞中でのタンパク 質合成の阻害を示す。免疫毒素は過剰のａｎｔ　１−ＴＦＲ（ｔｐ　μｇ／ｍｆ ）の不在中（ネ）および存在中（○）３７℃で１８−２４時間細胞に添加された 。図３ＢはＨＵＴ　１０２細胞へのａｎｔ　ｔ−Ｔａｃ−ＬｙｓＰＥ４０の細胞 毒性活性を示す。

ａｎｔ　１−Ｔａｃ−ＬｙｓＰＥ４０は示された細胞株に種々の濃度で添加され た。競合試験のために、７０μｇ／ｍＩ！ａｎｔｉ−Ｔａｃが免疫毒素の添加前 に添加された。′Ｈレシチン取込みが文献の記載どおりに測定された。

図４はａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０の血液レベルを示す。Ａ４３１１Ｉｉ 瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスまたはヌードマウスにａｎｔｉ−ＴＦＲ−Ｌｙｓ ＰＥ４０１００μｇまたはｓ　ＯＡＬｇを１．Ｐ、注射した。血清中の免疫毒素 レベルを異なる時間に測定した。結果は２回の別の実験の平均である。

図５ＡはヌードマウスにおけるＡ４３１の増殖へのａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰ Ｅ４０の影響を示す。マウスには３Ｘ１０＠Ａ４３１細胞を注射し、そして上記 のように免疫毒素で処理した。マウスには以下に示された日に各５０μｇを４回 投与した：　（・）２．４，６．８日；　（ム）９，１１．１３および１５日； 　（■）処置せず。

図５Ｂは５，７．９および１１日目に４回投与したマウスに対する結果を示し； 　（■）処置せず；　（ロ）５μｇ：　（・）２０μｇ：　（ム）５０μｇ；（ △）５Ｂ目に１５０μｇ１回のみの投与。

図６はＨＥ１１−ＰＥ４０での処理を行った、および行わなかったヌードマウス における皮下Ａ４３１！！瘍の全体の外観を示す。

ヌードマウスにはＯＢ目に３Ｘ１０’Ａ４３１細胞を皮下注射した。さらに処理 しない場合、５Ｂ目に腫瘍が皮膚の下に小さなこぶとして現れた（Ａ；矢印）。

１５日目までに腫瘍は太き（なり、しばしば皮膚表面から飛び出していた（Ｂ） 。ＨＥ１１−ＰＥ４０で２．４．６および８Ｅｆ目に処理したマウスは通常腫瘍 を示さず、２６日目に全体に腫瘍が存在しないとしてここでは示されていた（Ｃ ）。大きな腫瘍を存するマウスをＨＥ１１−ＰＥ４０　（９，１１，１３および １５日目）で処理した場合、腫瘍はしばしば縮小を始め、それらの壊死中心内ま で消失した（Ｄ；矢印）。

図７は典型的な処理および対照Ａ４３１皮下腫瘍の組織学的外観を示す。

Ａ４３１腫瘍を壊死部から採取し、ホルムアルデヒドで固定し、そして通常のパ ラフィン包埋および切片化処理を施し、さらにヘマトキシリンおよびエオシンで 染色した。１５日目にマウスから除去された腫瘍細胞からの切片がＡ−４に示さ れている。９，１１．１３および１５日目にａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０ で処理した１９日目のマウスから採取した腫瘍の小切片はＢ　−Ｂ　ｌ：示され ている。Ａに示される切片は、未処理腫瘍の大部分が小さな一領域のみの壊死（ 矢印）を有する生存腫瘍細胞（ＶＴ）を含むことを明らかにする。これに対し、 処理マウスからの腫瘍（Ｂ）は、腫瘍の大部分が壊死部（ＮＴ）であり、わずか に周縁に生存腫瘍（ＶＴ）が残っているだけであることを示すＣｓ＝皮膚）。（ Ａ′。

Ａ“′）および（Ｂ’、Ｂ“１）は、未処理腫瘍が均一な生存膿瘍（ＶＴ）から ほとんど構成され、一方処理腫瘍が結合組織嚢（ｃ　ｔ）に隣接した目に見える 厚さの生存細胞の周縁を示すことを明らかにする腫瘍の周縁部からのより高倍率 の領域である。処理腫瘍の大部分は中央壊死の大きな領域を示し、そして腫瘍周 縁のいくつかの領域において、全ての腫瘍細胞は壊死であり、一方、その他の領 域である生存腫瘍周縁部においてわずかな細胞の厚さが残っているのみである（ Ｅ’″、二重矢印）（倍率：Ａ、Ｂ＝Ｘ５．バー＝１ｍｍ；Ａ’、Ｂ’＝ｘ２６ ．バー＝２００μｍ；Ａ”、Ｂ”＝ｘ２８０．バー＝２０μｍ）。

発明の詳細な説明 本発明の上記および種々のその他の目的は、シュードモナス固有の外毒素の受容 体結合性ドメインＩａ内に欠失を含むタイプの改良されたシュードモナス外毒素 （ＰＥ）であって、該改良は、ＰＥ分子のドメインＩａに少なくとも１個のりジ ン残基を有し、さもなければ受容体結合性ドメインＩａに欠失を育する場合にリ ジン残基を欠くであろう組換えＰＥ分子からなり、前記リジン残基は組換えＰＥ のその他の分子（例えば抗体等）への有効なカップリングのための実質的な結合 を供給する、前記改良されたシュードモナス外毒素により達成される。

ＰＥが抗体またはその他の標的性分子に化学的に結合する場合に、ＰＥをその他 の分子にカップリングするためにリジン残基が必要とされる。ドメインエがＰＥ から欠失されてドメイン■のリジン残基１２個全てが失われている場合、分子の その他の部分（例えばドメイン■）にある３個の残基の１つがＰＥ４０を抗体ま たは別の標的性分子に結合するために使用されなければならない。

しかしながら、これら３個のりジン残基の１つが使用される場合、低活性の複合 体が得られる（　Ｋｏｎｄｏ等、　Ｊ、　ＢｉｏＬ、　Ｃｈｅｒｔｒ、　２６３ ：９４７０．１９８８　）　。この問題を克服し、そして高活性の複合体を得る ために、ドメインエのほとんど（残基６−２５２）を欠失するが、ドメインＩに 本来存在する１２個のりジン残基の１つを残すことにより新規ＰＥ分子が創成さ れた。本発明に係るこの新規分子は本明細書においてＬｙｓＰＥ４０と表記され る。

新規分子の免疫毒素構築物への作用を示すために、２種類の新規免疫毒素、第一 にａｎｔｉＴａｃ抗体に複合させたＬｙｓＰＥ４０、および第二にヒトトランス フェリン受容体に特異的な抗体（ａｎ　ｔ　１−ＴＦＲ）に複合させたＬｙｓＰ Ｅ４０が作成された。

特記しない場合、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は本発明 の属する技術の通常の熟練者により通常理解されているものと同様の意味を有す る。

本明細書に記載されている同様または等価のあらゆる方法および材料が本発明の 実施または試験において使用され得るけれども、好ましい方法および材料はここ で記載される。以下に記載される全ての刊行物は参照により本明細書に編入され る。特記しない限り、本明細書で使用されている技術は当業者に十分に公知の標 準的な方法論である。材料、方法および実施例は説明のためだけのものであり、 限定するものではない。

本明細書中で使用される［抗体ｊという用語は、抗原に結合し得る免疫グロブリ ン分子（Ｗ、　Ｅ、　Ｐａｕｌｉｉ、ｒ基礎免疫学Ｊ　（’Ｆｕｎｄａｍｅｎｔ ａｌ　［ｍｍｕｎｏｌａｇｙ”）、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ。

Ｎ、　Ｙ、、　１９８４．　Ｉ）［１，１３１−１６５：ｌの一部を意味する。

この定義に従って、「抗体」という用語は種々の形態の修飾または改変された抗 体、例えば免疫グロブリン自体、軽鎖および重鎮可変領域のみを含むＦｖ断片、 可変領域および一部の不変領域を含むＦａｂまたは（Ｆａ、ｂ）’□断片、−重 鎖抗体（Ｂｉｒｄ等、　１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２４２．４２４−４２６； 　ＨｕＳｔＯｌｌ等、１９８８．　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＩＪｓＡ　８５゜５８７９−５８８３）等を包含する。抗体は動物（特に マウスまたはラット）もしくはヒト起源であっても、またはキメラ（Ｍｏｒｒｉ ｓｏｎ等、１９８４．　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪ ｓＡ　８１、６８５１−６８５５）もしくはヒト化されたもの（Ｊｏｎｅｓ等。

１９８６、　Ｎａｔｕｒｅ、　３２１．５２２−５２５および公開英国特許出願 第８７０７２５２号）であってもよい。本発明における使用に適当である抗体を 製造する方法は当業者に十分公知であり、そしてＨａｒｌｏｗ　＆　Ｌａｎｅ、 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ １ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８８のよう な刊行物の記載をみることができる。抗体鎖をコード化する遺伝子は当業者に公 知のあらゆるクローニング方法により、ｃＤＮＡ中で、またはゲノム形態でクロ ーン化されてもよい。例えば、Ｍａｎｉａｔｆｓ等、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ ｌｏｎｆｎｇ：　Ａ　ｔ、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓ ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　１９８２参照。

本明細書で使用される「顕著な細胞毒性なしに」という用語は、本発明の融合タ ンパク質が容易に感知できる程度または異常なレベルまで非標的化細胞の通常の 機能に影響を及ぼさないことを意味する。

組換え抗体−ＬｙｓＰＥ４０融合タンパク質は１本のポリペプチド鎖または２本 の鎖を含み得る。本明細書に開示された例は１本鎖の場合に関する。２本鎖を製 造するために、アミノ酸リンカ−はＶ、配列とＶＬｌ配列の間に挿入されないで あろう。その代わり、終止コドンがｖ、ｌ配列の後ろに挿入され、そして開始コ ドンとリポソーム結合性配列がＶＬｌ配列前に挿入されるであろう。

本発明の別の実施態様において、ＶＬおよびＶ、配列にはそれぞれ軽鎖および重 鎮不変領域の一部または全部、例えば全体のカッパ軽鎖不変領域および重鎮不変 領域のＣ，１ドメインが重鎖ヒンジドメインと共にまたはなしで続（であろう。

Ｖ　Ｌ　、　Ｖ　ＨおよびＰＥ４０遺伝子はあらゆる順序でプラスミドに現れて もよく、従って、ＰＥ４０遺伝子は軽鎖または重鎮遺伝子いずれかの５′または ３′末端のいずれかに結合され得る。当業者は、さらに修飾、欠失、挿入等が抗 体およびＰＥ４０遺伝子になされ得ることを知っているであろう。特に欠失また は変更は、標的細胞に対する融合タンパク質の細胞毒性を高めるか、または抗体 に対する抗原のない細胞に対して細胞毒性を減らすために、ＬｙｓＰＥ４０また は抗体遺伝子をＬｙｓＰＥ４０に連結するリンカ−においてなされてもよい。全 てのそのような構築物は当業者に十分公知な遺伝子操作の方法により行われ得（ 一般にはＭａｎｉａｔｉｓ等、同上、参照）、そして様々な臨床用途または生物 学的用途に特に適したものとする親和性、特異性、安定性および毒性の異なる特 性を存するタンパク質を製造し得る。

材料および方法 以下の実施例が説明のために提示されるが、これに限定されるものではない。

ＬｙｓＰＥ４０をコード化し、そして培地中にそれを分泌するベクターの構築 プラスミドｐＶＣ４（ｐＪＨ４を５ｐｈｌおよびＴｔｈｌｌｌＩで処理し、そし てＰＥ遺伝子を含む大断片を再び連結することによりｐＪＨ４から誘導される） をＣｈａ’ｕｄｈａｒｙ等、　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　８Ａ　８５．２９２９−２９４３、１９８８に記載されるようにＯｍｐＡシグ ナル配列に結合し、ｐＶＣ４５を製造した。部位関連突然変異誘発は欠失体を作 成する便利な方法であり、図１に示されるＬｙｓＰＥ４０を産生するプラスミド ｐＪＹ８５Ｌ、を創成するために用いられた。ｐＶＣ４５内のＰＥ遺伝子のＨｉ ｎｄＩ［［／５ａｆｌ断片をクンケルの方法（Ｋｕｎｋｅｌ。

Ｔ、　Ａ、　Ｐｒｏｃ、　Ｍａｔｅ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪｓＡ　８２ ．４８８−４９２．１９８５）により調製された一本鎖ＤＮＡを含む、Ｍ１３、 ｍｐ１９およびウラシル中にクローン化した。以下の構造＝５’　ＣＣＡＧＧＣ ＴＧＣＣＧＣＣＣＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＧＧＣＧＴＡＡＴＣＡＴＧ　３’の長さ ３６ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが合成され、これはＰＥ中にアミノ酸６ ないし２５２の間の大きな欠失を生じ、そしてアミノ酸５と２５３の間にリジン 残基が保持されており、次式： ％式％ の配列を有する分子を得た。

１７６ｂｐのＨｉｎｄＩ［［／Ｓａｉ’Ｉ断片をＭ２Ｓ内の突然変異ＤＮＡの複 製体から切除し、モしてｐＶＣ４５の３．３ｋｂのＨｉｎｄＩｆ［／５ａｆＩ断 片と連結して、以下の構造： Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−ＩＩｅ−Ａｌａ−１１ｅ−Ａｌａ− ＶａＩ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ ↓ Ａｌ　ａ−Ｔｈ　ｒ−Ｖａ　ｌ−Ａ　Ｉａ−Ｇｌ　ｎ−Ａｌ　ａ−Ａ　１ａ−Ａ ｓ　ｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌ　ｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ ｃｔｙ−ｃｘｙ−ｓｅｒ　、、、。

を有するタンパク質をコード化するｐＪＹ８５Ｌが得られた。このタンパク質は （↓）でプロセシングされ、そしてプロセシング後の生成物は培地中に分泌され た。プラスミドが大腸菌ＢＬ２１（λＤＥ３）細胞中に発現されたとき、Ｌｙｓ ＰＥ４０が培地中に見出され、そしてリットルあたりＩｍｇより多い収量で培地 から精製された。そのアミノ末端のアミノ酸配列はＤＮＡ配列から予測されたも のであることが判明した： Ｈ！Ｎ　Ａｌ、ａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｈｅ −Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（数字は本来のＰＥ構造におけるアミノ酸の 位置を示す）プラスミドｐＪＹ８５Ｌの寄託は、アメリカ合衆国。

２０８５２メリーランド、ロツクヴイレ、パークロウン・ドライブ１２３０１の アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ、　Ｔ　ＣＣ’）に１９８ ９年１２月１８日に行い、寄託番号は６８１８９である。寄託物は寄託日から３ ０年間または寄託試料の最後の請求日から５年のより長い方の間生存したまま保 管され、もし生存していない場合は再寄託するであろう。そして法律に特に制限 のない場合一般に分譲される。特許および商標症の長官は請求に応じて寄託物を 利用するであろう。

ＬｙｓＰＥ４０の発現 ＢＬ２１　（λＤＥ３）細胞をプラスミドｐＶＣ８５Ｌで形質転換し、そして１ ００μｇ　／　ｍ　ｌアンピシリンを含むＬＢ培培地中子７℃増殖させた。吸光 度０．　６　（６５０ｎｍ）でイソプロピル−１−チオ−β−ガラクトピラノシ ドを最終濃度１ｍＭまで添加した。細胞を９０分後に集めた。タンパク質のほと んどが培地中に分泌されたので、培養培地をＬｙｓＰＥ４０の供給源として使用 した。　ＬｙｓＰＥ４０の精製 ＬｙｓＰＥ４０を含存する清澄化培養培地２５リツトルを冷却脱イオン水で４倍 に希釈し、そして１０×５．５ｃｍシリカをベースとした陰イオン交換カラム（ ＱＭＡ、ウォーターズ）に１００ｍｌ／分の流速で注入した。カラムを０．０５ Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で洗浄し、そしてタンパク質を平衡緩 衝液中の０，２５Ｍ　ＮａＣｆ２リツトルで溶離した。ＱＭＡカラムからのＬｙ ｓＰＥ４０をアミコンＹＭ３０メンプランを用いて１５０ｍｌまでさらに濃縮し 、０．０２Ｍ）リス−ＭＣＩ！　（ｐＨ７，６）に対して１２−１６時間透析し 、１１００００Ｘで２０分間遠心分離し、そして０．０２Ｍトリス−ＨＣｆ　（ ｐＨ７，６）で平衡化した２、５Ｘ１４ｃｍのＱ−セファロースカラムに注入し た。タンパク質を０−０．５Ｍ　ＮａＣ１のリニアグラジェント５００ｍｌで溶 離し、ＬｙｓＰＥ４０含存画分をＳＤＳ　ＰＡＧＥにより検出し、プールし、０ ．　０２Ｍ　Ｍｅｓ　（ｐＨ５，５）で１０倍に希釈し、そして０．０２Ｍ　Ｍ ｅｓ　（ｐＨ５，５）で平衡化したＦＰＬＣＭｏｎｏ　Ｓ　１８／１０カラムに 載せた。ＬｙｓＰＥ４０はカラムに結合し、モして０−０．５ＭＮａＣｌ！のり ニアグラジェント１００ｍＡで溶離された。それをさらに１ｍＭ　ＥＤＴＡ含有 の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）を用いてＴＳＫ２５０（２２ ，５Ｘ　６６０ｍＭ）カラム（バイオラド）で精製した。

免疫複合体の構築 １ｍＭ　ＥＤＴＡ含有の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７，０）中のＬ ｙｓＰＥ４０　（２，５ｍｇ／ｍＩりを３倍モル過剰のＳＭＣＣと混合し、そし て室温（約２２−２４℃）で３０分間保温した。タンパク質をＰＤＩＯカラム上 の未反応クロスリンカ−から分離した。

ＭｏＡｂ　（ＨＢ２１またはαＴａｃ）（５−１０ｍｇ／ｍｆ）を、１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ含有の０．２Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８，０）中の３倍モル過剰 の２−イミノチオラン−ＨＣｌと混合し、そして３７℃で１時間保温した。誘導 された抗体がＰＤＩＯカラム上の反応体から分離された。免疫毒素を製造するた めに、誘導化Ｌ７５ＰＥ４０および誘導化抗体が４＝１のモル比で混合され、そ して室温で１６−２０時間保温された。免疫毒素を次にｍｏｎｏＱおよびＴＳＫ ２５０カラムでの連続クロマトグラフィーにより精製した。

有効性を決定するために、２種の異なる免疫毒素が準備され、そして使用された 。１つはヒトトランスフェリン受容体（ＴＦＲ）に結合するａｎ　ｔ　ｆ　−Ｔ ＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０であり、そして他方はヒトＩＬ２受容体の５５ｋＤサブユ ニツトに結合するａｎｔｉ−Ｔａｃ−ＬｙｓＰＥ４０である。

５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびイムノブロッティング５ＤＳ−ＰＡＧＥは文献に記載さ れている。

タンパク質合成阻害アッセイ 複合体の活性がＡ４３１．ＫＢ、ＨＵＴ　１０２．ＨＴ２９．０ＶＣＡＲ２，０ ＶＣＡＲ３，０ＶＣＡＲ４，ＣＥＭおよびＭＯＬＴ４細胞に対してｓＨ−ロイシ ン取込みを測定することにより試験された（Ｋｏｎｄｏ等、　Ｊ、　３ｉ。

Ｌ、　ＣｈｅｒＩｌ、　２６３：９４７０．１９８８　）　、　ＨＵＴ　１０２ 細胞をＲＰＭ１６４０で２回洗浄し、そしてすぐに使用した。免疫毒素を細胞へ の添加前にＰＢＳ中の０．２％ヒト血清アルブミンで希釈した。

マウスにおけるａｎ　ｔ　１−ＴＦＲ−Ｌｙ　ｓ　ＰＥ　４０の血液レベルのア ッセイ Ａ４３１を生じるＢＡＬＢ／Ｃマウスまたはヌードマウスに免疫毒素１００μｇ または５０Ｍｇを１．Ｐ、注射した。異なる時点で採血し、そして血清をＡ４３ １細胞と保温し、タンパク質合成への影響を測定することによりＩＴのレベルを 調べた。標準曲線はａｎｔｔ　−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０を用いて作製された。

ヒト類表皮腫瘍を生じるヌードマウスにおけるａｎｔｉ−ＴＦＲ−Ｌｙ　ｓ　Ｐ Ｅ　４０の抗腫瘍活性Ａ４３１細胞（ｃＸ１０＠）を０日目にヌードマウスの皮 下に注射した。この注射は５日目までには全てのマウスに検出可能な腫瘍を生じ た。マウスの処置は腫瘍移植の２．５または９Ｂ後のいずれかに始められた。各 処置群は４−６匹の動物から構成される。腫瘍は４日毎にカリバスを用いて測定 され、そして腫瘍の容積は次式：腫瘍の容積（ｎｎｍ”　）＝長さ×（輻）”Ｘ ｏ、４を用いて計算された。ａｎｔｉ−Ｔａｃ−ＬｙｓＰＥ４０での試験も同様 に行われた。

上記したように、ＰＥ４０のアミノ末端は、１個のりジン残基およびＯｍｐＡシ グナル配列を含むように改変された（ＯｍｐＡシグナル配列はＬｙｓＰＥ４０の 成長培地への輸送を主として指示するために添加された）。

ＬｙｓＰＥ４０およびＴ７プロモーターの制御下にあるＬｙｓＰＥ４０をコード 化するプラスミドの構造は図１に示されている。ＰＥ４０と同様にＬｙｓＰＥ４ ０もまた培養培地中に大量に分泌された。各精製段階でのタンパク質の純度は図 ２に示されている。第１段階として使用されたＴＳＫ２５０カラムからの物質は ＳＤＳ　ＰＡＧＥにより（図２１列５）ならびにＰＥに対する抗体とのイムノブ ロッティング（データは示していない）により分析された場合に均一であること が判明した。典型的には、２ｍｇの純粋なＬｙｓＰＥ４０が培養１リツトルから 得られた。

精製タンパク質（ＬｙｓＰＥ４０）のＮ−末端配列はＡ　１ａ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ −Ａｌａ−Ｇ　１　ｕ−Ａ　１ａ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌ　ｙ−Ｇｌ　ｙ−Ｓｅ 　ｒ−Ｌｅ　ｕであることが見出された。精製タンパク質はＤＮＡ配列から期待 される正確な配列を有し、そしてプロセシングはＯｍｐＡ配列内に生じていた（ 図１）。これに対し、ＰＥ４０のＮ末端配列はＡｌａ−Ａｓｒ＋−Ｌｅｕ−Ａｌ ａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−ｃｔｙである。

ＬｙｓＰＥ４０を存する免疫毒素の構築ＬｙｓＰＥ４０を２種類のモノクローナ ル抗体、ヒトトランスフェリン受容体に結合するＨＢ２１　（ａｎｔｉ−Ｔ　Ｆ 　Ｒ）　（Ｈａｙｎｅｓ等、　Ｊ、ＩｒｎｒｔｔｕｎｏＬ、１２７＋３４７．　 １９８１　）およびヒトインターロイキン２受容体の５５ｋＤａサブユニツトに 結合するａ　ｎ　ｔ　ｉ　−Ｔ　ａ　ｃ　（Ｕｃｈｉｙａｍａ等、Ｊ。

ＩｍｒｕｕｎｏＬ、　１２６：１３９３．１９８１）に化学的にカップリングさ せた。複合の後に、免疫毒素（ＩＴ）をＭ　ｏ　ｎ　ｏ　ＱおよびＴＳＫ２５０ カラムで精製した。精製複合体は軽鎖および重鎮の両方にカップリングしたＬｙ ｓＰＥ４０を含み、そしていかなる遊離ＬｙｓＰＥ４０も含まない（図３）。比 較のために、天然のＰＢを用いた免疫毒素も製造した。

ＬｙｓＰＥ４０を用いて製造された免疫毒素の活性ａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰ Ｅ４０の活性が種々のヒト細胞株に対してアッセイされ、そして調べたヒト細胞 株の全てにおいてタンパク質合成を阻害した（表１）。

ａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０はＡ４３１１胞に対してＩＤ、。４．０ａｇ ／ｍ７で最も活性だった。特異性は過剰な非複合抗体がａｎｔｉ−ＴＦＲ−Ｌｙ ｓＰＥ４゛０の細胞毒性効果を抑制することを示すことにより証明された（図３ Ａ）、ａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０はマウス５ｗ１ｓｓ３Ｔ３細胞に対し て２　ｉｔ　ｇ／ｍ　ｌでさえも細胞毒性ではなかった（データは示されていな い）。

ａｎｔ　１−Ｔａｃ−ＬｙｓＰＥ４０の細胞毒性活性がＨＵＴ　１０２細胞、Ｉ Ｌ２受容体を含むヒトＴ細胞白血病株に対して決定された。図５に示されるよう に、ａｎｔｉ−Ｔａｃ−ＬｙｓＰＥ４０はＨＵＴ　１０２細胞においてＩ　Ｄｓ ｏ２．５　ｎ　ｇ／ｍｆでタンパク質合成を阻害し、そして過剰のａｎｔｉ−Ｔ ａｃは免疫毒性の特異性を示すこの効果を阻害した（図３Ｂ）ｏ　ａｎｔｉ−Ｔ ａｃ−ＬｙｓＰＥ４０はＩＬ２受容体陰性細胞では２０００ａｇ／’ｍｉ！でさ えもタンパク質合成を阻害せず、さらにＩＴの特異性を示した。

マウスにおけるａｎｔ　１−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０の血液レベル Ｂ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ　マウスに１００μｇ（７）ａｎｔｉ−ＴＦＲ−Ｌｙｓ ＰＥ４０を１．Ｐ、注射し、そして免疫毒素活性をアッセイするために注射後の 異なる時点で採血した。

図４に示されるように、７８μｇ　／　ｍ　１の最高血液レベルは注射４時間後 に得られ、そして１０μｇ　／　ｍ　１のレベルが注射２４時間後でも依然と存 在した。同様の実験がＡ４３１を生じるアサイミックマウスにおいて行われた。

５０μｇのａｎｔｆ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０を注射した後、２７μｇ　／　ｍ 　１の血液レベルが注射４時間後に、そして２４時間後に８μｇ　／　ｍ　ｆの 血液レベルが検出された（図４）。

マウスにおけるＡ４３１臘瘍へのａｎ　ｔ　ｉ　−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０の効 果 ａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０がヌードマウスにおいて皮下異種移植片とし てのＡ４３１細胞の増殖を阻害する能力に対してアッセイされた。膿瘍を発生さ せるために、３Ｘ１０”Ａ４３１細胞がＯＢ目に皮下注射された。希釈剤のみで 処理した対照群において、膿瘍は非常に迅速に増殖し、そしてその動物は皮膚を 貫通する非常に大きな腫瘍を存していた１９日目に殺された（図５゜６）、２， ４．６．８日目にａｎｔ　１−ＴＦＲ−Ｌ７ＳＰＥ４０を受容した群において、 実験を終えた２４日目に腫瘍は認められなかった（図５Ａ、および６）。別の群 の動物において、腫瘍の容積が約１２５ｍｍ”になるまで処置は遅延され、そし て９，１１．１３および１５日目に行われた。処置が開始されるとすぐに、腫瘍 の大きさの増大が停止しく図５Ａ、および６）、そして柔らかい中心部を発達さ せた。組織学的試験は、腫瘍中心部のほとんど全ての細胞が生存していなかった （図７）。

しかしながら、膿瘍の周辺部に多くの生存細胞が観察された。

抗腫瘍効果が投与量に関係するか否かを決定するために、種々の量のａｎｔｉ− ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０での処置が、小さい腫瘍が出現した５日目に始められた （図５Ｂ）。５μｇの投与量でさえも腫瘍増殖の遅延が生じたが、処置が１１１ 日目停止された後、腫瘍は急速に増殖し始めた。投与量が増加されるにつれ（２ ０または５０ｇｇ）、腫瘍のいくつか、または全ては１１１日目でに検出できな い程度になったが、時の経過につれ再び現れ、そして増殖した。動物の１群は５ 日目にＩＤｓ＊に近接している１５０ｇｇの１回投与を受けた。２匹の動物が死 亡したが、その他の３匹の動物において腫瘍が後退し、そして再び現れなかった 。腫瘍と反応しなかった抗体単独または該抗体からなる免疫毒素（ＭＯＰＣ−１ ゜ｙｓＰＥ４０）が５０ｇｇの投与量で投与された場合、抗腫瘍応答は観察され なかった。

要するに、この結果は、ＬｙｓＰＥ４０が抗体に効率よ（カブブリングされ得、 適当な抗原を産生ずる培養細胞株に対して高活性の細胞毒性を有する免疫毒素を 生じ、そして該抗体が結合しない培養細胞に対する細胞毒性を検出し得ないこと を示す。さらに、ＬｙｓＰＥ４０にカップリングされたヒトトランスフェリンに 対する抗体からなる免疫毒素（ａ　ｎ　ｔ　ｉ　−ＴＦＲ−Ｌｙ　ｓ　ＰＥ　４ ０）はマウスに大量に安全に投与され得、そして皮下に移植された急速に増殖す るヒト上皮腫瘍の後退を引き起こし得る。

マウスに腹腔内投与した場合、ａｎｔｉ　−ＴＦＲＬｙｓＰＥ４０は血液中に迅 速に現れた。５０ｇｇの投与量は約３０μｇ　／　ｍ　ｌの注射４時間後の最高 血液レベルを与え、そして血液レベルは２４時間で依然として８μｇ／ｍｆであ り、この免疫毒素が比較的長い半減期を有することを示した。１００μｇの１回 投与は８０ｇｇ／ｍｌの最高血液レベルを与えた。１０ｇのマウスは約１ｍｌの 血液容量を有するから、腹腔内投与４時間後の血液中にほとんど全ての免疫毒素 が見出される。

本明細書に記載された処置プロトコルにおいて、腫瘍細胞は増殖して、処置が開 始される前に検出可能な硬い腫瘍を形成し得た。これらの条件下、８日間にわた る４回の注射からなる処置は明確な腫瘍後退を引き起こした（図５Ｂ）。小さい 腫瘍に対するより低い投与量で、または大きい膿瘍に対して高い投与量レベルで さえも、生存腫瘍細胞が残った。より長期間の処置を継続することにより、より 大きい抗腫瘍効果が達成され得るであろう。

しかしながら、プロトコルは標準的化学療法に耐性の硬い腫瘍の著しい後退を生 じた。それ故に、ＬｙｓＰＥ４０は標的特異性抗体に結合したとき強力な免疫毒 素として作用することを示す。

本発明に係る治療性組成物は、標的特異性リガンドにカップリングしたＬｙｓＰ Ｅ４０の標的細胞を殺すための有効量および薬学的に許容性の担体からなる。該 標的細胞は選択的に殺されることが所望され、そして前記リガンドが特異的に結 合する結合性部位を育するものである。

もちろん、抗体以外のリガンド、例えば受容体、成長因子および標的細胞を選択 的に認識する分子が、本明細書に記載された方法論と同様にＬｙｓＰＥ４０にカ ブブリングされて、標的特異性細胞毒性体が得られる。

本明細書に記載された実施態様は説明のためだけのものであり、そして本明細書 の記載から種々の変形または変更は当業者には考えられ得るものであり、それら は本願の精神および範囲ならびに添付された請求の範囲内に包含されるべきもの であることが理解される。

表　Ｉ 種々のヒト細胞株へのａｎｔ　１−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０の活性 Ａ４３１　４．０　＞２０００ ＫＢ　１４．０　＞２０００ ＨＴ２９　６．６　＞２０００ ＨＵＴ１０２　２１．０　＞２０００ ＣＥＭ　２２．５　＞２０００ ０ＶＣＡＲ２１３５，ＯＮＤ ＯＶＣＡＲ３２８０，ＯＮＤ ＯＶＣＡＲ４３０，ＯＮＤ ＭＯＬＴ４　３２．ＯＮＤ ′″ＩＤ１　はタンパク質合成の５０％阻害に必要な免疫毒素の濃度として記載 される。

ＮＤ−行われなかった。

表　ＩＩ ａｎｔｉ−ＴＦＲ−ＬｙｓＰＥ４０と処理したヌードマウスにおける腫瘍の発生 アサイミックマウスに３Ｘ１０’Ａ４３１細胞を皮下注射した。５，７．９およ び１１日目に、動物にａｎｔｉ−ＴＦＲ−Ｌｙ　ｓ　ＰＥ　４０を示された投与 量で１．Ｐ。

注射した。腫瘍移植後の種々の日の腫瘍を存する動物数／全動物数が示されてい る。

処置　腫瘍移植後の日数 なし　５１５　５１５　５１５− ５μｇ　５／６　６／６　６／６　６／６　６／６　−２０μｇ　１１５　１１ ５　３１５　３１５　３１５　４１５５０μｇ　Ｏ１５０１５１１５１１５１１ ５２１５１５０μｇ”　Ｏ／３　０／３　０／３　０／３　０／３　０／３１５ 日目に１回投与 ’９−ｒｉ７ｖ合に、％　”ｊ　叩　ＦＩＧａ　３Ａ、０１　．１　１　１０　 １００　１１０００ｎ／ｍ１ ９−１？　７　”ｉｌ　”；　Ｆｉ’ｒ’　Ｈ’　”　”　Ｆ　ＩＧ　ｍ　３　 Ｂ、１　１　１０　１００　１０００　１１００００ｎ／ｍｌ 吋　Ｐ：ｇ ＦＩＧ、　４ ．０　１０　２０　３０　４０ 要約書 本発明は、適当な抗原または受容体を産生ずる細胞を選択的に殺すＬｙｓＰＥ４ ０−抗体免疫毒素に関する。

補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シュードモナス固有の外毒素の受容体結合性ドメインＩａ内に欠失を食むタ イプの改良されたシュードモナス外毒素（ＰＥ）であって、該改良は、ＰＥ分子 のドメインＩａに少なくとも１個のリジン残基を有し、さもなければ受容体結合 性ドメインＩａに欠失を有する場合にリジン残基を欠くであろう組換えＰＥ分子 からなり、前記リジン残基は組換えＰＥのその他の分子への有効なカップリング のための実質的な結合を供給する、前記改良されたシュードモナス外毒素。 ２。標的特異性リガンドにカップリングした請求項１記載の組換えＰＥからなる 細胞毒性分子。 ３．前記リガンドが抗体または成長因子である請求項２記載の細胞毒性分子。 ４．標的細胞を殺すための請求項２記載の細胞毒性分子の有効量および薬学的に 許容性の担体からなる組成物。 ５．殺されるべく標的化された細胞を細胞毒性量の請求項３記載の組成物と接触 させることからなる標的化細胞毒性の獲得方法であって、 前記原的細胞は標的特異性リガンドが結合する結合性部位を有するものであるが 、しかし前記組成物は前記結合性部位を欠く細胞に対して検出し得る細胞毒性を もたない、前記方法。