JPH04501123A - 脱水／水補給リポソームに被嚢されたペプチド／タンパク質の局所送達 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 脱水／水補給リボソームに被覆されたペプチド／タンパク質の局所送達 発明の背景 発明の分野 本発明は小ペプチド／タンパク質、特にインターフェロンな経皮的に皮膚の深部 組織まで局所送達する技術に関する。脱水／水補給法（ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ ／ｒｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ）によって製造されたリポソーム被嚢 小ペプチド／タンパク質ならびにこれの経皮局所送達は皮膚の深部組織の上皮細 胞内にその被嚢されていたペプチドを沈着させることによる各種疾患の処置のた めに有用である０本発明は、特に、ウィルス、細菌、炎症またはその他の原因に よる皮膚障害の進行を、当該感染上皮細胞に対する損傷を低減しつるまたはウィ ルスの複製と発現を阻害しつるリポソーム被嚢された小ペプチドで該上皮細胞を 処置することによって抑制するために有用なものである。

ｌ遷扱血辺訓示 皮膚上皮細胞を冒す病気であって、その患者を望ましくない副作用を通常惹起す るような大量の薬剤を系統的に投与して処置しなくとも成功的に処置できるよう な病気は多くある。

）　そのような病気の例を特にあげればウィルス性または細菌性感染症、皮膚ア レルギー、炎症、ホルモン失調、ガン性または増生的細胞増殖、肉腫たとえばカ ポジ肉腫、いぼたとえば生殖器いぼ、乾せん、脱毛症などである。

これらの疾患の多くはペプチド薬剤たとえば抗ウイルス性お５　よび抗細菌性ペ プチド、ホルモン、抗アレルゲンおよび他の小ペプチドまたはタンパク質によっ て有利に処置しつるはずである。

しかしながら、容易に理解されるように、これらタンパク質またはペプチドのあ るものは、たとえば、表皮成長ホルモンはきわめて強力でありそして系統的、非 経口的に大量投与された場合は非常に有害となるおそれがあり、また他方、経口 的に投与された場合には胃腸管内で各種のタンパク質分解酵素によって急速に不 活性化されてしまう可能性がある。

すなわち、上記したような疾患のあるものは当該疾患に特異性のある治療学的に 有効なペプチド薬剤を非経口的に大量投与することによって系統的に処置するこ とが可能ではあるが、そのような系統的非経口処置に要する投与量は過大ならざ るを得す、望ましくないあるいはまた有害な副作用を伴なう０局所的に投与され た場合には、かかる薬剤は角質層内に浸透できないためにその有効性を失うこと が多い。

したがって、薬剤を系統的に大量投与する必要がない、あるいは、非効果的局所 処置が回避されるような、上記した疾患に対する局所処置が可能となったらきわ めて有益である。

ペプチド薬剤による局所処置の主な目標疾患の１つはウィルス性感染症、特にヘ ルペスウィルスの感染症である。ヘルペスウィルス感染症はきわめて広（昔から 知られた病気である。報告によれば米国の人口のほとんど半分が再発性単純唇部 ヘルペスに感染しておりそしてこれら感染者の２５％は頻繁および、／または重 度の再発を経験している。外陰部ヘルペスは最近５００万以上の米国人が感染し ている性交によって広がる流行病である。

これまで多くの治療法が試験されてきたが、これらヘルペス病の臨床学的発症の 重度ならびに頻度を低減させる上で明確に有効であることが証明されたものはな い。Ｃａｎ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ１．１２５：　２３（１９８１１参照。

ひとたび定着すると、ヘルペスウィルス粒子は神経幹内に隠れそして無症候時期 は潜伏状態になる。この時期にはウィルスは神経節に居住し、そして治療のため に接近することはできない、したがって、唇部ヘルペスを成功的に抑制すること はそのウィルスが再び姿を現わした時に制圧できるか否かにかかつている、この 目的のためには、病変の前徴段階に皮膚の生きた上皮組織内に有効な抗ウィルス 剤を投与することが最も効果的であると思われる。この時期に化学治療薬または 免疫治療薬たとえばインターフェロンによってウィルスの増殖とその基底層への 外方拡散を阻止することができると考えられる。Ｃａｎ、Ｍｅｄ、Ａｓ５ｏｃ、 Ｊ、　＋２５：２３（１９８１１参照。

抗ウイルス剤インターフェロンは分子量がｚｏ、　ｏｏｏていどの大分子ペプチ ドである。これは活性または不活性化ウィルスによる感染に感応する細胞培養基 または宿主組織内で産生されそして同類または非同類ウィルスの重感染に対する 抵抗状態を誘導することができる６インターフエロンは小クンバク質であり、そ れらの形成を誘発したウィルス以外のウィルスに干渉するが、他の細胞内よりも それらがその中で誘出された種類の細胞内でより有効である。

インターフェロンはヘルペス、尖圭湿いぼおよび類似の症候の処置のために特に 高い効能を示すものと見られる。しかしながら、皮膚症候を抑制するために適当 なインターフェロンで系統的処置を行なうとしばしば逆効果が生じる。また、目 標組織まで薬剤が接近不能であるという難点の克服もまだなされていない、すな わち、ヘルペスおよび類似の他の症候の効果的処置を最も制限している要素はイ ンターフェロン薬剤の投与の問題である。

したがって、系統的逆効果を回避または防止し、しかも目標細胞まで抗ウィルス 剤を到達させつるインターフェロン投与システムの提供が切望されている。

ヘルペスと同様に、多くの細胞性疾病たとえば細菌感染症、炎症、アレルギー反 応、細胞代謝またはホルモン失調なども同じ問題に直面している。深部皮膚組織 に位置する細胞に経皮的に直接薬剤を送るための便利かつ有効な方法が入手でき ないと、これらの病気は系統的に処置するしか方法がない。

したがって、系統的逆反応を回避または防止し、しかも目標細胞までペプチド／ タンパク質薬剤を到達させつるようなペプチド／タンパク質投与システムの提供 が望まれているのである。

インターフェロンの抗ウィルスの機能は予防的性格のものであるように思われる 。その抗ウィルス作用はウィルスが侵入するのを防止するため他の細胞にメツセ ージを伝達することにある。また、インターフェロンは各種の段階でウィルス複 製を損なういくつかの酵素を誘導させるものと思われる。したがって、インター フェロンはヘルペスならびに類似症候のウィルス性疾患の処置のために極めて有 力であるが、すでに感染した細胞を守ることはできない。

予防的機能に加えて、インターフェロンは本来のキラーリンパ球のリンパ球毒作 用を強めることによって宿主免疫を増強することができる。堕叩旦框胆ｕ、　３ ２：５３７（１９８６１に記載された多数の最近の臨床研究からのデータはイン ターフェロンは生殖器イボ（ｇｅｎｉｔａｌ　ｗａｒｔｓｌおよびヘルペス感染 の両者についてはそれが臨床的使用された場合よりも、むしろ予防的に使用され た場合に最も効果的であることを示している。さらに以下のことも判明している 。すなわち、遺伝子組み換えインターフェロン−アルファ（ＩＦＮ−アルファ） がヒトパビロマウイルス関連生殖器イボをもつ患者に極めて有効である。低投与 処理（１５ＸＩＯ’単位）は高投与処置（１８Ｘ　１０’単位）と少なくとも等 価である。やや高いＩＦＮ−アルファ投与（３ｘｌＯ’単位）では生殖器ヘルペ スの大発症はほとんどなくなり、ウィルス潜伏の期間はより短くなり、かゆみは 少なく、早く治る。これに対してより低いＩＦＮ−アルファ投与（ＩＸＩＯ’単 位）では効果は見られなかった。　Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、　１５４： ４３７（１９８６１。

これらの研究と他の研究を併せてみて明らかなことは、インターフェロンのマク ロファージを活性化する能力がその治療学的効果、特に予防薬としての効果にお いて従来認識された以上の重要な役割を果たすこと、インターフェロンが抗ウィ ルス剤としてよりも免疫調節剤としてより多く働くこと、および最初のインター フェロンによる処置の仕方がその病気の以後の経過、すなわち再発に影響を与え うることである。　Ｇｅｎ１ｔｏｕｒｉｎ、Ｍｅｄ、、　６２：９７ｆ１９８６ ＋。

ヘルペスおよび同類の病気の処置のために細胞毒抗ウイルスアシクロビル（ａｃ ｙｃｌｏｖｉｒｌの有用性が限られたものであることはそれが免疫抑制剤として 働き得ないからであろう。

ウィルス複製を制止するために必要なインターフェロンの組織レベルは未知であ る。相当な証拠の示すところでは動物とヒトの正常組織内には低レベルの内生イ ンターフェロンが存在する。

このインターフェロンがウィルス感染に対する自然のバリヤーの重要な一部分を 構成するものと推定される。たとえばＪ、　ＴｎｆｅｃＬ　Ｄｉｓ、　、　１３ ３　：Ａ６　（１９７６１にはウサギにヒト白血球インターフェロンを静脈注射 した薬力学的研究の結果、ウサギの血清および他の実験動物ならびにヒトの血清 中にも水庖性口炎ウィルスに対するベースライン作用の低レベル（３５−３５０ 単位／■ｌ）の存在が突きとめられたことが記載されている。インターフェロン は単離。

特性化されなかったけれども、これらの発見は正常組織内に内生低レベルのイン ターフェロンが存在することを強く示唆している０重要なことはインターフェロ ンの抗ウィルス作用が特定のａ−インターフェロンまたは酸不安定α−インター フェロンに帰属されたことである。

抗ウイルス薬剤を血管外位置に送達するため系統的投与が使用された場合には体 の全組織にその薬剤が分配されることを考慮して十分な量の薬剤を投与しなけれ ばならない、このため、皮膚症候を抑制するために適当な系統処置はしばしば系 統的逆効果を示しそして薬剤が目標組織に到達不可能であることさえも解決され ない、この点において、薬剤の送達がヘルペスの効果的処置を制限する唯一最大 のファクターとして残されている。よく知られていることであるが、最適の予防 的および治療的処置は次ぎの条件を含む。すなわち、ｆｉｔ好都合な投与経路、 （ｉｉ）副作用が無い、ｆｉｉｉｌ良好な治療効果、相当な治療効果を達成する ためにはインターフェロンを非経口的に大量投与する必要があるので、条件ｆｉ ｔ　とｆｉｉｌは満足されない。

したがって、望ましくない系統的逆作用を回避しかつ最適の予防的および治療的 処置を達成しながら、最小量の薬剤で目標器官において最大の治療効果が得られ る好都合な薬剤投与ルートをもつことが有益である。

過去５年間にわたって、多数の研究報告がヘルペス感染症と生殖器イボをインタ ーフェロンの局所投与によって処置した場合の各種成功例を伝えてきた、例えば 、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｋｉ、２８：８４８（１９８３１はブタ白血球インターフ ェロン含有軟膏が顔の皮膚および生殖器のヘルペス感染症に顕著な治療効果があ ったと報告している。ま白血球インターフェロン含有軟膏で唇および生殖器のヘ ルペスを処置して再発頻度の減少と病変サイズの縮小に成功したと報告している 。

Ｊ、Ａ＋ｗ、Ａｃｄ、　Ｄｅｒｍａｔｏｌ、　、　５：９８９　（１９８６）は 再発性生殖器ヘルペス患者をクリームベースの界面活性殺菌剤ノンオキシノ−ル ー９と組み合わせたα−インターフェロンで処置して新規病変形成の終結。

かさぶた化および病変の治癒に改善があったことを報告している、　Ｌａｎｃｅ ｔ、２３：１５０（１９８８１は唇か生殖器にヘルペスをもつ患者にヘルペスの 発疹時期にカルボキシメチルセルロースゲルペースに配合したインターフェロン −βを局所塗布して再発の平均回数ならびに発疹期間の減少が見られたと報告し ている。このゲル薬剤を発疹の時に塗布した場合には処置した生殖器ヘルペスの １２症例のうち１０例においては少なくとも１年間は再発がなかった。

上記のような成功例にもかかわらず、局所的インターフェロン治療においていく つかの失望的臨床例も出ている。たとえば、ハ■鮭二蝕」μ匹１工に〃帥肛、３ １：１１３７（１９８７１は再発性生殖器ヘルペスの９４人の患者について、α −２ａインターフエロンの水溶液をかさぶた化していない小庖に塗布した場合、 ウィルス潜伏期間、かさぶた時期およびヘルペス病変の治癒までの時間に関して はその薬剤含有水溶液と偽薬とは効果が同程度であったと報告している。このイ ンターフェロン製剤が効果を欠いたことはおそらく皮膚を通してインターフェロ ンを運搬させるための投与ビヒクルの選択（単なる水溶液）の失敗に帰せられる であろう、この推論はＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅｎ＋ｏｔｈ ｅｒ、２５：１０（１９８９）の報告によって支持されている。すなわち、この 報告は局所投与されたアシクロビルの効果はアシクロビルが皮膚を浸透しつるか 否かに依存している、したがって、使用された投与ビヒクルに依存していること を報告している。同じく上記推論を支持する報告としてムＩｎｔｅｒｆｅｒ、　 Ｒｅｓ、　７：２１３　（１９８７）には、遺伝子組み換えインターフエ。

ンーアルファの背皮膚ＨＳ　Ｖ　−１で実験感染させたモルモットに対する治療 効果は投与システムとその使用のタイミングとに関連しているとの最近の研究を 発表している。

したがって、皮膚を通してインターフェロンを最大効率で送達することのできる インターフェロン含有製剤が入手できればきわめて有益となる。

本来活性な薬剤を目標組織まで送達するより有効な手段を探索する中で最近リポ ソームが多くの注目を集めるようになった。リポソームは同数の水性コンパート メントを含有する二層の１種またはそれ以上の濃脂質から構成されている顕微鏡 的小嚢である。

モデル薄膜系として紹介されて、その生物学的膜横這および機能のわれわれの理 解が深まった。ごく最近になって、リポソームはインスリン、酵素、抗微生物剤 、抗ガン剤、生物学的反応調節剤などの薬剤の位置指向投与のための有力なキャ リヤーとして注目されてきた。　Ａｍ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、３０８： ２８１４１９８８１１照、薬剤キャリヤーとしてのリポソームの魅力はその中に 薬を包嚢しそして物理的に保護することができること、身体の各種の位置に薬を 集中させまた各種の位置まで薬を送達することができること、生体膜を横断して 薬の運搬の便利な地点までも送達できることなどである。さらに加えて、リポソ ームは一般に非毒性でありそして容易に物質代謝される。

薬物担体としてのリポソームの有効性は多くの事例で立証されている。たとえば 、リポソームの脂質組成が包嚢、貯蔵安定性、リポソーム内の薬の配置、生理学 的環境内での薬とリポソームの安定性、リポソームと被嚢された薬との両者の薬 学的力価および組織特異性、リポソームおよび／または被嚢薬物の細胞膜透過能 力およびリポソーム被嚢された薬剤の薬学的活性度に大きく影響を与えることが 判明している。ム茎辻ｏ、、４！：５７５（１９８２１；Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒ ｏｎ　Ｒｅｓ、、　１：４９５（１９８１）および２：１１Ｈ１９８２）　９照 、リポソームの脂質組成は容易に操作できるから、特定のタイプのリポソーム搬 送薬剤のためにより効果的な新規な投与系を設計することができる。

線維芽細胞インターフェロンもリンパ球インターフェロンも共にリポソームに成 功的に被嚢されている。　Ｊ、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　Ｒｅｓ、。

３：１６１　［１９８３＋で報告されている研究では、リポソーム内へのインタ ーフェロンの挿入の物理的位置および範囲ならびにインターフェロンの安定性と 抗ウィルス活性はそのリポソームの脂質組成に依存することを示している。

局所投与のための薬剤キャリーとしてのリポソームの有用性の最初の示唆はＬｉ ｆｅ　Ｓｃｉ、、２６：１４７３ｆ１９８６）に発表された。これには次ぎのよ うなことが記載されている。リポソーム被嚢された薬剤、トリアムシノロン（ｔ ｒｉａｍｃｉｎｏｌｏｎｅ）のウサギの皮膚を通した経皮的吸収はその薬剤を軟 膏として塗布した場合に比較して減少したが、しかしリポソームにより送達され た薬剤の濃度は局所的に表皮および真皮内で大幅に増大したにのことはリポソー ムが生体膜を透過、横断して選択された組織位置まで到達することを示す。

その後、Ｉｎｔ、Ｊ、Ｐｈａｒ＋＊、、２０：１３９ｆ１９８９１　および、Ｊ 、Ｃｏｎｔ　Ｒｅ１ｅａｓｅ、。

２：６１　ｆ１９８８１によって、生のリポソームそのものは生の皮膚を通過で きないが、それはリポソーム二重層膜と組合せられた薬を皮膚内部に沈積させる のを助長することが報告された。

皮膚ウィルス感染症をインターフェロンで成功的に処置できるか否かはインター フェロンを感染した細胞まで有効に送達することができるか否かにかかっている 。したがって、リポソーム送達糸されたインターフェロ＝７を使用したどしても 、従来法による局所投与によってヘルペスおよび他の同類の皮膚ウィルスを抑制 するだけの十分な組織内濃度レベルを得ることは側底不可能である。

したがって、系統的投与の欠点が克服されそしてペプチド／タンパク質およびイ ンターフェロンを感染細胞まで適切かつ効果的に送達でき、しかしてヘルペスお よび他の皮膚病を抑制しつるに十分な薬剤の組織レベルを保証することのできる 小ペプチド／タンパク質および抗ウイルスインターフェロンを局所送達するため に適当な薬剤組成物が提供されたならば極めて価値あることである。

ここに本発明によって、かかるリポソーム被嚢薬剤系の薬化学的挙動ならびに最 終的治療効果に関しては、リポソームの製造方法が非常に重要であることが見い だされたのである。とりわけ重要なことは、小ペプチド／タンパク質またはイン ターフェロンを従来の方法で製造されたリポソームに包嚢した場合には、治療効 果が欠如することを発見したことである。しかしながら、ポリペプチドリポソー ムがリポソーム二重膜とポリペプチドの結合を促進する技術によって製造された 場合には、そのポリペプチドは生の皮膚を透過しそして治療学的にきわめて活性 となる。そのための技術はリポソームの脱水とその脱水されたリポソームへ再び 水を補給することを包含するものであることが見い出された。この脱水／水補給 リポソーム小嚢（ＤＲＶｓ）内へのポリペプチドの物理的取り込みのメカニズム やその正確な位置および該リポソーム嚢内でのポリペプチドの分布は明らかでは ないが、大量のポリペプチドがＤＲＶｓによって取り込まれ、そのポリペプチド の相当量はＤＲＶｓ内に内面化され、そしてリポソーム被嚢されたポリペプチド はこの状態でその抗ウィルス活性を保持したまま少なくとも１年間は安定である 。

したがって、本発明の主要な目的は小ペプチド、ポリペプチドおよびインターフ ェ（７ンをリポソーム送達糸により効果的に局所投与するために適当なシステム を提供することである。

！刀 本願の発明の１つは、通常は皮膚を透過しないペプチド／タンパク質をリポソー ムにより角質層を通過させ局所経皮送達するための薬剤組成物である。

本願のいま１つの発明はペプチドに増強された皮膚透過性を与えかつ下部目標細 胞組織内での該ペプチドの増大された体内利用性を与えるためにカプセル化され た小ペプチドを含有する局所用リポソーム被嚢製剤である。

本願のいま１つの発明はリポソーム被嚢された小ペプチドを患部細胞内に経皮的 に送達する方法である。

本願のいま１つの発明はヒトまたは動物の皮膚表面に本発明のペプチド含有薬剤 組成物を経皮的に投与することによって患部細胞および組織を処置する方法であ る。

本願のいま１つの発明は取り込まれたペプチドを含有する局所薬剤リポソーム組 成物の製造方法である。

本願のさらにいま１つの発明はリポソーム被嚢されたインターフェロンをウィル ス感染細胞に経皮的に送達する方法である。

本願のさらにいま１つの発明はリポソーム被嚢された抗ウイルスインターフェロ ンを局所経皮的に送達するための薬剤組成物である。

本願のさらにいま１つの発明はインターフェロンに増強され１ご皮膚透過性を与 えかつ細胞内での該インターフェロンの増大された生物学的利用性を提供する被 嚢されたインターフェロンを含有する局所用リポソーム被嚢製剤である。

本願のいま１つの発明はヒトまたは動物の皮膚表面に本発明のインターフェロン 含有薬剤組成物を経皮的に投与することによってウィルス感染細胞および組織を 処置する方法である。

本願のさらにいま１つの発明は取り込まれたインターフェロンを含有する局所薬 剤リポソーム組成物の製造方法である。

叱ｌ旦■叉五呈韮 本発明の好ましい実施例は脱水／水補給法によって製造された、被嚢率ペプチド 約５乃至３０％と共に卵レシチン、コレステロール、ホスファチジルセリンを含 有するリポソーム製剤である。

本発明のさらに好ましい実施例は脱水／水補給法によって製造された。被嚢率ペ プチド約１５乃至３０％と共にシミリストイル−ホスファチジルコリン、コレス テロール、ホスファチジルセリンを２：１：０−３３の比で含有するリポソーム 製剤である。

本発明の最も好ましい実施例は被嚢ペプチドと共に、セラミド、コレステロール 、バルミチン酸、硫酸コレステリルを４＝２．５：２．５：１の比で含有するリ ポソーム製剤である。

図面の簡単な説明 第１図は水滴液のペプチドインターフェロン−アルファのＨ３Ｖ−■病変に対す る局所抗ウィルス作用を皮膚感染症モルモットモデルにおいてウィルス対照と比 較して示す。

第２図は油中水型エマルジョンに取り込まれたペプチドインターフェロン−アル ファのＨ３Ｖ−Ｉ病変に対する局所抗ウィルス作用を皮膚感染症モルモットモデ ルにおいてウィルス対照と比較して示す。

第３図は陰性荷電ＥＬ　：　ＣＨ：　ＰＳ−ＭＬＶｓに取り込まれたインターフ ェロン−アルファのＨ３Ｖ−Ｉ病変に対する局所抗ウィルス作用を皮膚感染症モ ルモットモデルにおいてウィルス対照と比較して示す。

第４図は陰性荷電ＥＬ　：　ＣＨ：　ＰＳ−ＬＵＶｓに取り込まれたペプチドイ ンターフェロン−アルファのＨ５Ｖ−Ｉ病変に対する局所抗ウィルス作用を皮膚 感染症モルモットモデルのウィルス対照と比較して示す。

第５図は脱水／水補給法によって製造された陰電気性ＥＬ：ＣＨ：　ＰＳ−ＤＲ Ｖｓに取り込まれたインターフェロン−アルファの局所抗ウィルス作用を皮膚感 染症モルモットモデルにおいてウィルス対照と比較して示す。

第６図は脱水／水補給法によって製造された陰性荷電ＤＭＰＣ：ＣＨ：　ＰＳ− ＤＲＶｓに取り込まれたインターフェロン−アルファの局所抗ウィルス作用を皮 膚感染症モルモットモデルにおいてウィルス対照と比較して、病変部スコアで示 す。

第７図は皮膚脂質ＣＭ：　ＣＨ：　ＰＡ　：　ＣＨ５−ＤＲＶｓに取り込まれた インターフェロン−アルファの局所抗ウィルス作用を皮膚感染症モルモットモデ ルにおいてウィルス対照と比較して、病変部スコアで示す。

第８図は遊離インターフェロン−アルファ含有皮膚脂質ＣＭ：ＣＨ：　ＰＡ　： 　ＣＨ５−ＤＲＶｓの局所抗ウィルス作用を皮膚感染症モルモットモデルにおい てウィルス対照と比較して、病変部ス■ “リン脂質−とはシミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、　コレス テロール（ＣＨ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、卵レシ チン（ＥＬ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ステアリルアミン（ＳＡ）、コ レステロール（ＣＨ）、硫酸コレステロール（ＣＨ３）、ホスファチジン酸（Ｐ ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ） 、ホスファチジルイノシトール（ｐＨ、カルシオリビン（ＣＬ）、プラスマロゲ ン（ＰＭ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ウシ脳髄セラミド（ＣＭ）およびパ ルミチン酸（ＰＡ）などの脂質を意味しそしてそれらを包含する。これらリン脂 質は完全飽和または不完全水素化されつる。これらは天然産物でも合成品であっ てもよい。

一リポソームーという言葉は下記のごときリポソーム小嚢を意味しそしてそれら を包含する。マルチラメラ小嚢（ＭＬＶｓ）、通常１１００ｎよりも大きい大型 車ラメラ小嚢（ＬＵＶｓ）、約２５乃至５０ｎ１１の閉鎖二重膜小嚢である小型 車ラメラ小嚢（ＳＵＶｓ）、および脱水の間に微小な小嚢が融合してマルチラメ ラフィルムとなることによって形成される大型車ラメラまたはオリゴラメラリポ ソームである、層と層との間に大量の薬を有効的に包嚢することができそして水 を補給した時に比較的大きな小嚢となる。脱水／水補給小嚢（ＤＲＶＳ）。

“ペプチド−という言葉は分子量が９００乃至５０，０００のポリペプチドを含 むすべての小タンパク質およびペプチド／タンパク質を包含する。これらは動物 またはヒトの体内の天然産物または人工的に製造および／または合成されたもの または精製されたものでありうる。

製Ｍ法 ■、リポソーム リポソームのタイプ、サイズ、脂質組成および電荷は薬剤の取り込みすなわちリ ポソーム被嚢の程度、リポソーム内の薬の位置、そのリポソームおよび／または リポソーム被嚢された薬剤の安定性、薬物動態、組織特異性、細胞膜透過能力お よび薬理作用発揮能に影響する。

ｉ！風或よＩＡ 本発明によるリポソームは電気的に中性たとえば卵レシチン（ＥＬ）やコレステ ロール（ＣＨ）から形成されたもの、あるＩ／）は陽性たとえば卵レシチンとコ レステロールと共にステアリルアミンを含有するもの、あるいは陰性たとえばホ スファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）、ホスファ チジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルコリン（ｐｃ）、ホスファチジン 酸（ＰＰＡ）、シミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジステ アロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）を含有するものでありうる。ＥＬ： ＣＨ：５Ａ（２：ｌ：０．３３）含有陽性リポソームはやや皮膚を刺激すること が判明した１本発明による中性リポソームは貯蔵１週間以内に大きい集塊に凝集 する傾向が見られた。陽性リポソームも中性リポソームも本発明の範囲に包含さ れるものであるが、本発明を実施するために最も好ましいリポソームは電気陰性 のリポソームであり、脱水／水補給技法によって製造された、ＥＬ　：　ＣＨ： ＰＳまたはＤＭＰＣ：　ＣＨ：　ＰＳを１　：０．５：０．０１乃至３：３：　 ｌのモル比、好ましくは２：ｌ：０．３３の比で含有しているＭＬＶｓとＬＵＶ ｓの両者である。

さらに、いわゆる“皮膚脂質−リポソームが角質層内に見られるものと同様な組 成を有する脂質から製造された。これら皮膚リポソームは好ましくは下記の脂質 から製造される：ウシ脳髄セラミド（ＣＭ）、コレステロール（ＣＨ）、バルミ チンＩＩＩ　（ＰＡ）および硫酸コレステリル（ＣＨＳ）。

伯のすべての生物学的膜とは異なり、角質層はリン脂質を含有せず、主としてセ ラミド（４０％）、コレステロール（２５％）、バルミチン酸のごとき脂肪酸（ ２５％）および硫酸コレステリル（１０％）とよりなる６上記の脂質を使用した 脂質組成物から製造されたリポソームは安定な皮膚リポソームを形成した。皮膚 脂質の成分のモル比を変えるとそれらの二重膜の相転移および得られる構造の安 定性が変化することが判明した６局所薬剤投与系としておよび／またはモデル薄 膜系としての皮膚脂質リポソームが、共に脱水／水補給法によって製造された陰 性リポソームと並行的に試験された。

本発明を実施するために最適のリポソームは、本明細書に記載した、脱水／水補 給法によって製造されたリポソーム（ＤＲＶｓｌである。これらは別の技法で製 造されたＭＬＶｓとＬ　Ｕ　Ｖ　ｓよりもインターフェロンの取り込みおよび皮 膚ヘルペス症モルモッｔ・モデルで測定された抗ウィルス活性の点において優れ ている。標準的技法によって製造されたＭ　Ｌ、　Ｖ　ｓとＬ　Ｔ−Ｉ　Ｖ　ｓ が新規組成物、特に皮膚脂質リポソームの生物学的有効性を比較するための対照 リポソームとして使用された。

Ｋルチラメラリポソーム　Ｍ＋、■） Ｍ　Ｌ　Ｖ　ｓは当技術分野で公知の技術で製造された。すなわち、各種脂質混 合物をクロロホルムに溶解しそして任意適当な方法たとえば窒素雰囲気下の乾燥 のごとき方法を使用して回転蒸発させる。薄い脂質膜を含有しているフラスコを 残留溶剤の除去のために真空下で５乃至４８時間、好ましくは一晩貯蔵する。こ の脂質膜を次ぎに、使用したリン脂質の相転移温度以」−の温度で、各種濃度の ペプチドたとえばインターフェロン、ホルモン等を含有する適当な緩衝液たとえ ばカルシウム−マグネシウムを含まないリン酸塩緩衝サリン（ｐＨ７，０）にア ルブミンの存在で再懸濁する。この懸濁物を５乃至６０分間、好ましくは１０乃 至３０分間撹拌し、そして取り込まれない遊離ペプチドを好ましく適当な５ｅｐ ｈａｄｅｘＧ　−７５カラムに通すことによって、あるいは１００．０００ｇで 反復遠心分離することによって除去する。シ、かじ、たとえ遊離の薬物が除去さ れなくとも、水性コンパ−１−メントからの漏洩は最小である８なぜならば、そ の外部熱力学的作用は該リポソームの水性コンパートメント内の熱力学的作用と 近似しでいるからである。

対明リポソームも上記方法で製造された。ただしインターフェロンは存在させな い。

型゛ラメラバー　Ｌ　Ｕ　Ｖ Ｌ　Ｕ　Ｖ　ｓは任意適当な方法で製造することができる。たとえば、参考文献 として引用した、米国特許第４５２９５０１号明細書に記載されている逆相蒸発 （ＲＥＶ）法、薄膜水和、ソニケーション、高ぜん断細断、凍結乾燥または好ま しくは押出し法によって製造することができる。これらの方法はすべて当技術分 野で公知である。

高い包嚢効率を有する大型車ラメラおよびオリゴラメラ小嚢がＢ　Ｂ　Ａ　、　 ８１６：１ｆ１９８５）に報告された方法で作成された。すなわち、押出し工程 で、ＭＬＶｓをくり返し細孔直径が微細なポリカーボネート１ｉ（０，１ｕ＋ｉ ）を通過させて高圧下（２５０ｐｓｉまで）で押出す、これにより平均直径が段 々と小さくなり、約５乃至１０回通過後は最小１００ｎｎ＋に到達する。Ｍ　Ｉ −Ｖ　ｓが強制的に微細孔を通過させられるので、順次層がはがされ最後はＩＭ だけ残る。

実施例のための押出し型リポソームを製造するため、押出装置［カナダ、　Ｂ、 Ｃ，バンク−バー所在のりペックス・バイオメンプラン社ｆｔｈｅ　Ｌｉｐｐｘ 　ＢｉｏＩＩｌｅｍｂｒａｎｅ　Ｉｎｃ、、ｌから入手した押出機］に１１００ ｎ細孔ザイズのポリカーボネート膜フィルター　［カナダ、Ｐｌｅａｓａｎｔ、 ｏｎ所在のヌクレオボア社（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ） 製品］を取り付けて使用した。

対照リポソームも上記方法で製造された。ただしペプチドは存在させない７ 腕述１９飢査餡ｄ辰ツニムバ−１）ＲＶ上ＤＲＶは７二ｅｃｈｎｏ１ｏｒｚ、ｌ ：１９−２８（１９８４１、シー・アール・シープレス社（ＣＲＣＰｒｅｓｓｌ 出版、編集者Ｇ、　Ｇｒｐｇｏｒｉａｄｉｓ。に記載されている方法によって製 造された。

この方法では、空の超音波破壊された小嚢が所望の包嚢されるべきペプチド溶質 を含有している水溶液中で混合され、この混合物が窒素流下で乾燥される。この 脱水の間に複数の小嚢が融合し−Ｃ１つのマルチラメラ膜を形成する。この膜は 順次層間に溶質分子を効果的に保持する。水補給時に、大きなリポソーム嚢が形 成され、こねはその中に被嚢された相当部量の溶質を含有し２ている。空の対照 リポソームも上記方法で、ただしペプチドの不存在で製造された７ −１−記した方法は都合の良いように変更して大規模生産のために使用すること ができる。この方法は土に制御された乾燥と再給水の工程に依存するものであり 、有機溶剤、洗剤または透析系を大量に使用する必要がない、したがって、ペプ チドは決して有機溶剤や洗剤と接触しない。

リボソニ９旦亘里珀丑３ サイズと一形尼 リポソームのサイズ分布は光学顕微鏡と電子顕微鏡の併用によって測定した。直 径〉０．５ミクロメーターを有するリポソームを目で見るためにニコンジアフォ ト倒立顕微鏡を使用した。非電荷の中性リポソームの光学顕微鏡による試験は肉 眼で明らかになる前は長い間フロキュレーションの問題があった。

電子顕微鏡を小さな小胞（直径０．５ミクロン）のサイズ分布を測定するために 使用した。３００メツシユの銅又はステンＬノス鋼グリッドを氷酢酸中で超音波 的に洗浄し、ホルムバールで被覆した。グリッドを炭素で被覆するためにデント ン５０２蒸発器を使用した。リポソームのネガティブ染色は小胞試料の小滴を新 しく調製したグリッド表面に滴下し、余分を濾紙で吸い取ることによって行なっ た。２％リンクングスデン酸ナトリウム又は２％モリブデン酸アンモニウムｐＨ １’、４の１滴をグリッドに滴下し、３０秒間染色した。過剰染色を除去し、グ リッドを乾燥し、７５にＶで操作したＪＥＭｌ、００ＣＸ電子顕微鏡で見た。

インターフェロンとの反応によるリポソームの形態変化の測定に対しては凍結割 断電子顕微鏡技術を使用した。リポソーム試料を１００，０００ｇで遠心分離し 、緩衝液中３０％グリセロールに懸濁させた。試料（約！０Ｉｌｌｌｌの小滴を ゴールドコツプに載せ、脂質フレオン２２中で急速に凍結した。これらの試料を 使用するまで液体窒素に貯蔵し、使用時に一１５℃でバルザースＢＡ３６０Ｍフ リーズエツチング装置に入れ最後の割断の後２秒以内に白金で影をつけた。炭素 でレプリカした後、試料をチェンバーから取り除き１％次亜塩素酸溶液中で洗浄 した。蒸留水で２回すすいだ後、レプリカを銅グリッドに取り付け、ＪＯＥＬ　 ＪＥＭｌ　０Ｏ−Ｃ５型電子顕微鏡で研究した。

リポソームを電子顕微鏡で確認した後、準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）をリポソーム の研究調製物の品質管理検査として使用した。ここでは５ｍｗヘリウム−ネオン レーザ−光源（波長＝６３２．８ｎ■）と散乱固定角９０を含むラングレー−フ ォードＬＳＡ−２分光計を使用する。リポソームを、試料時間２．９ｘｌＯ−’ 秒を用いて試験する６粒子サイズの直径の計算は６４チヤンネルを用いて１０９ １０９６Ｃ型オートコレクターにより行なった。

１ボソームの　四 タンパク質及びポリペプチドはタンパク質と二重層との相互作用によってリポソ ーム二重層と相互に作用する。この相互作用はタンパク質とリン脂質との疎水結 合によるものであり、初期の静電的結合によって促進される。一般にインターフ ェロンのようなペプチド／タンパク質はリン脂質単分子層や二重層に浸透しない がポリペプチドがリポソームに取り込まれた場合、二重層の先端の極性基に吸着 すると思われる。リポソームの表面電荷に関するインターフェロンの効果をその 二重結合の程度を測定するために研究した。リポソームの電気泳動移動度（ゼー タ電位）を測定するために５０１型レイザージー（Ｌａｚｅｒ　Ｚｅｅｌ　メー ターを使用した。この装置は個々の粒子は扱わないがむしろ回転プリズム技術を 用いて像が粒子の静止した曇りを生じるように調節するため非常に感度が高い、 多くの研究はリポソームのリン脂質含量がインターフェロンのようなペプチド／ タンパク質の二重層内での取り込みの程度に悪影響することを示している。ペプ チドを含む又は含まない種々のリポソームの電気泳動移動度の測定がこれらの相 互作用の程度を示すために使用された。成るリポソーム組成物に対して（ｉｌ　 “ブランク”リポソーム、（ｉｉｌペプチドと温置した“ブランク”リポソーム 、（ｉｉｉ）取り込まれたペプチドを含むリポソーム及び（ｉＶｌ取り込まれた ペプチドを含むリポソームのトリプシン処理後についてゼータ電位を測定した。

ペプチド取　゛み　の′ 成るリポソーム系に非特異的に取り込むことができるペプチドの理論量を計算す るためにはリポソームの内部容量（水性コンパートメントの容量）を知ることが 必要である。内部容量は、ホッペーザイラーＨｏ　ｅ−３ｅ　ｌｅｒ　Ｐｈ　５ ｉｏ１．　Ｃｈｅｗ、第３６２巻：　１０５１頁（１９８１年）に記載される方 法で測定した。リポソームはに、（ＣＮ）６を含む緩衝液（２５０■０５Ｍ１中 で調製し、試料を予め洗浄膨潤させたセファデックスＧ−２５カラムを通過させ て遊離の捕捉溶質を分離した。リポソーム内部に存在するに、（ＣＮ）　。量（ 水相取り込み）はリポソームをトリトンＸ−１００で溶解した後４２００■に於 ける吸光度からめた。

捕捉したペプチド量は多くの方法で定量した。まずペプチドを含むリポソーム、 この場合１４０−組換え休日血球Ａインターフェロンな捕捉効率に対するスクリ ーニング操作に使用した。リポソーム分散液の試料をトリトンＸ−１００（０， ５％）と温置してリポソームを完全に破壊し、取り込まれたインターフェロンを 分離した。取り込まれたインターフェロン量はシンチレーション計数で定量し、 脂質量はＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｓ、第６６巻：３７５頁＋１９２５年）に記 載される方法で定量した。更に遊離のインターフェロン又は他のペプチドを全て 除去するために、これらの系をトリプシン処理にかけリポソーム内に移行してい ないインターフェロンを破壊した。これらの操作はインターフェロンを有効に内 部移行しない系を速かに除去した。スクリーニング操作を通るリポソーム調製物 は前述のペプチド生物検定を用いて試験した。

種々のリポソームに対するペプチドインターフェロンの取り込み度は次の通り定 量した。１００μｍの２アリコートを取り除き、ｌアリコートは全ペプチドイン ターフェロン（全ＩＦＮ）を定量する今後の検定のために凍結した。２番目のア リコートをベックマン遠心管に入れ、ベックマンエアファージ中１４８．０００ 　ｘｇで３０分間遠心分離した。上清を取り沈降物をＨＥＰＥＳ緩衝液１００μ ｌで３回洗浄した。洗液と共に上清を遊離ペプチドインターフェロン（遊！ＩＮ Ｆ）を定量する今後の検定のために凍結した。沈降物を）ＩＥＰＥＳ中０．４％ デオキシコール酸ナトリウム５００μｍに溶解しく以前にインターフェロン検定 を妨害しないことが示されている）。試料を取り込まれたペプチドインターフェ ロン（取り込みＩＦＮ）量を定量する今後の検定のために凍結した。

遊離した又は二重層の外面（トリプシン感受性）に結合する沈降物−結合インタ ーフェロン％を定量するためにＩｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ。

第３１巻、１０９９頁ｆ１９８１年）に記載される方法を使用した。遊離のある いはリポソーム内に含有されるインターフェロンをトリプシン（５０＋ｓｇ／ｌ １ｌｌ　と３７℃で３０分間温温置、この時点で抗トリプシンｆ１５０ｍｇ／ａ ｌｌを更に３０分間加えた。対照は試料を３７°Ｃで緩衝液中少な（とも１時間 温置して行なった０次いで遊離インターフェロンの場合には直接又はリポソーム に取り込まれたインターフェロンの場合には洗浄剤に溶解した後試料のインター フェロン活性を検定した。トリプシンは遊離インターフェロンの活性を９９．９ ％破壊した。

上述と同し検定を本発明の範囲に入る他のペプチド／タンパク質全てに使用する 。

Ｉポソームに　゛まれたペプチドの リポソーム系の安定性は複雑な問題である。全体の安定性は多（のパラメータ（ ｉ）　リポソームの形態（ｉｉ）リポソーム脂質の化学安定性（ｉｉｉ）取り込 まれた薬剤の化学安定性及び（ｉｖｌ薬剤に関するリポソームの統合性即ち漏出 性を含んでいる。リポソームに取り込まれたペプチドインターフェロン分散液を ４．２５及び３７℃で貯蔵した。１ケ月間は１週毎にその後は１ケ月毎に次のこ とを監視するために試料を分析した。

１−　扱ユ変進：形態学的変化例えばリポソームサイズ及びサイズ分布、融合の 根拠及びフロキュレーションの根拠を観察するために光学顕微鏡及び電子顕微鏡 を使用した。

２、傷ヱ支呈羞：脂質の過酸化は、２３０〜２６０ｎ腸範囲のＵＶ吸収の増加に よって定量される共役ジエンの出現によって監視し、脂質加水分解はリン脂質抽 出後ＴＬＣによるＰＣ及びリゾ−ＰＣの分離によって定量されるリゾ−ＰＣの出 現によって監視される。

３、疲ユ乙及ス蚕工：試料を適当な時に取り出し、取り込み度を定量するために 上述の通り処理した。インターフェロン活性を定量し、ゼロ時の値と比較した。

上澄及び沈降物を分析してリポソームから漏出しているが遊離状態で活性のまま であったインターフェロンのパーセントの測定を行った。２５及び３７℃の試料 に対して得られたデータから我々のスクリーニング操作を設定し、皮膚ヘルペス モルモットモデルの皮膚への輸送及び皮肉作用特性の評価および長時間安定性試 験のための更に安定な系が選択できた。

固炸止食〕 本発明の活性化合物は通常の条件下で皮膚にほとんど浸透しないか全く浸透しな いペプチドあるいはタンパク質であり、従って局所治療効果が制限されるか又は 存在しない０本発明の主な目的は角質層を通して浸透させるか又は浸透を高める ことによってこれらのペプチド／タンパク質が角質層の下にある目標の組織及び ／又は組繊細胞に達する手段を提供するものであり、このような浸透はリポソー ムで包囲することにより達成された。

上述した方法によって調製したリポソームで包まれた化合物は定義に於て規定し た通り分子量９００〜５０，０００を有するペプチドを含むがこれらに限定され ない、抗ウィルス剤、抗炎症剤、抗増殖剤、抗細菌剤、抗アレルギー剤、抗腫瘍 剤として又はホルモン療法２カボジ肉腫、幹部、脱毛症、性器いぼの治療及び他 の治療用途に有効且つ有用なペプチド／タンパク質及び他の低分子量てが本発明 のリポソームに有利に処方することができ、皮肉に投与することができる。

下にある目標組織まで角質層内にまた角質層を通して皮肉浸透する局所リポソー ム処方に包囲されるのに適した、通常には皮膚及び又は角質層に浸透しない有効 化合物の具体例は、ペプチド例えばＴＣＭＰ−８０−Ｆ−細胞調節ベブチド、ブ ラジキニン拮抗物質、アナリチド、オーリフリン心房性ペプチド、ペンタゲチド ：腫瘍壊死因子：ワクチン例えば肝炎Ｂワクチン、大腸菌ワクチン、Ｉ−ＩＩＶ ＡＣ−１ｅワクチン、Ｖａｘｓｙｎ　ＨＩＶ−１゜インフルエンザ菌の複合ワク チン、癌ワクチン、マラリアワクチン、第ＶＩＩＩ因子二〇、内在性ヒト−イン シュリン又は組換え体ＤＮＡ由来のもの、内在性ソマトトロピン又は組換え体Ｄ ＮＡ由来のもの、ヒト成長ホルモン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ＭＡｂ ：抗凝血物質又は血栓崩壊物質例えばプロウロキナーゼ、コロニー刺激因子例え ば顆粒球／コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージ／コロニー刺激因子、ジス ムターゼ例えばスーパーオキシドジスムターゼ、ＰＥＧ−ＳＯＤスーパーオキシ ドジスムターゼ：エリスロポイエチン例えばエポゲン、マロゲン、エブレクス： インターフェロン例えばインターフェロン−α、インターフェロン−α２ａ、イ ンターフェロン−０２ｂ、ヒト白血球インターフェロンα５組換え体ヒトインタ ーフェロン−β、インターフェロンγ、インターフェロン−共通型：インターロ イキン例えばインターロイキン−２、組換え体ヒトインターロイキン−２、組換 え体ヒトインターロイキンー２／ＬＡＫ細胞療法５組換え体ヒトインターロイキ ンー２／ロフエロンーＡ併用剤：モノクローナル抗体例えば抗−Ｌｅｕ−２ＭＡ ｂ、ＭＡｂ−Ｌｂ、セントキシン、バルックス、卵巣ＲＴ、セントレル抗血小ｉ ＭＡｂ、オンコーラドＭＡｂ、ＡＤＤＣ物質ＭＡｂ、オンコシントＣＲ１０３Ｍ Ａｂ、黒色腫Ｉ−１ｌ−１３ｌ、オルトクローンＯＫＴ３ＭＡｂ、Ｘｏｍｅｎ− Ｅ５ＭＡｂ、ＸｏｍａＺｙｍｅ−Ｍｅｌ。

ＭＡｂ、ＸｏｍａＺｙｍｅ−Ｈｂ５、他のペプチド例えばチムロシン又は第ＶＩ ＩＩ因子Ｃ１抗体例えば内毒素抗体、毒素例えばジフテリア毒素、免疫毒素等で ある。また本明細書で請求するリポソーム組成物に処方するのに適しているもの としてはＡＮＦ心房性ナトリウムＩＩ尿因子、ＴＰＡ、プロウロキナーゼ、エリ スロボイエチン、ｈ　Ｇ　Ｈ５ＥＧＦ表皮増殖因子、血管形成誘導因子、リポコ ルチン、シクロスポリン、グルコプロティン、カルシトニン−遺伝子−緩和ペプ チド、ＩＬ−１、ＩＬ、−２、Ｉ　ｌ−−３、マルチ−Ｃ５Ｆ、ＩＬ−４Ｂ−細 胞ＧＦ、ＧＭ−Ｃ５Ｆ、Ｍ−Ｃ３ＦＣ５Ｆ−１，Ｇ−Ｃ５Ｆ、ＴＮＦ−α、ＴＮ Ｆ−β、ミュラー管阻害物質、ムロモナブーＣＤ！　、ＭＡｌ）／免疫毒素、肝 炎３表面Ａｇ、ヘルペス１７表面Ａｇ、マラリアＡｇ、　Ｈｉ　ＶＡｇ、　ｂＧ Ｈ２ｐＧＨ，ＢｏＩＦＮ−ａ、ＢｏＩＬ−２、Ｈｕ　Ｉ　ＦＮ−ａ、Ｅｇ。

Ｂｏ、Ｐｏ妊性ホルモンＦ　Ｓ　Ｈ及びＬＨ１偽性狂大病Ａｇ、組換え体筒ＶＩ Ｉｉ因子、フィブロネクチン、インシュリン様成長因子工１組換え体α−１−抗 トリブシン、アスパラギナーゼ、アデノシンデアミナーゼ、組換え体可溶性ヒト ＣＤ４、グルコセレブロシダーゼ、チミオペブチンＴＰ５及び、内在性か組換え 体由来いずれか又はヒト又は動物に自然発生するか合成いずれかの他のペプチド 又はタンパク質である。

本発明は主としてその用途の例示としてペプチドインターフェロン特にインター フェロン−αを使用するが定義の範囲内にある他のペプチド／タンパク質及び他 の分子量ての使用が本発明の範囲として予想される。

１且エバ（インターフエユ２ 組換え体日血球Ａインターフェロンはホフマンーラロツシュ社、ナトレー、ニュ ーシャーシーから注射用凍結乾燥粉末として入手した。これは再構成した場合約 ２Ｘ１０’単位／ｍ＋を含む（比活性は２Ｘ１０’単位／ｍｇにほぼ等しい）。

”Ｃ−組換λ体日血球Ａインターフェロン（約１０マイクロキユリー／３００ミ クログラム）もまたホフマンーラロッシュ社により供給された。

インターフェロン、つ Ｃａｎ、Ｊ、ＭｉｃｒｏｂｉｏＬ第２１巻、１２４７頁（１９７５年）に記載さ れる生物検定を次の２つの理由からペプチドインターフェロンの測定法として選 択した＝（ｉ）インターフェロンタンパク質のピコグラムの検出を可能にする感 度レベルが通常の放射線免疫検定系を超えるｆｉｉ）生物学的に活性なインター フェロン分子又は失活インターフェロンタンパク質を区別することができる生物 検定である。

上の引用した方法をわずかに変更して使用した。簡単に言えば増殖培地を集密状 態に達したヒト胎児肺細胞（ＨＥ　Ｌ、　）の９６穴マイクロタイタープレート 培養から除去した。インターフェロンを含む試料を希釈するために２％ウシ胎児 血清と抗生物質を加λアールの塩を含むイーグルの最少必須培地を滅菌容器に入 れ、各つニルに先端が複Ｖのピペッタ−で１１０μｌづつ加えた。各ペプチドイ ンターフェロン試料又は１０００国際基準単基準金む適当なペプチドインターフ ェロン標準５０ＬＬｌを８−ウェル列の最初のウェル（１０−０，Ｉ′希釈液） にミクロピペット・で分注した。各試料を２連又は３連で検定した。先端か複数 のピペッタ−で試料を８ウエルに連続して５０ｕｌづつ移すことにより１　／　 ２　ｌｏｇ＋、０倍希釈で細胞を直接希釈した。適当な細胞及び・フィルス対照 を含めた。３７℃で５時間以上インギュベー　トした後ペプチドインターフェロ ン試料を取り除いた。培養細胞をＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水で洗浄後、２％ウシ 胎児血清と抗生物質で補足したＭＥＭ（Ｅ）中水面性口内炎ウィルス約５０プラ ーク形成単位を含む浮遊液２５μｌを各ウェルに加え（細胞対照ウェルには補足 したＭＥＭ　（Ｅ）だけを加える）、湿度調節した４％ＣＯ２濃厚雰囲気中３７ ℃で１時間インキュベートした。未吸収のウィルスを注意して除去し２％ウシ胎 児血清と（５０μｌ）抗生物質で補足したメチルセルロース上層培地をピペット で各ウェルに分注した。

３７℃、４％ｃｏ、で１６〜２４時間更にインキュベートシた後プラークを顕微 鏡で計数するか染色して肉眼で見えるようにした。染色は上層培地を除去し、ｌ ウェル当りクリスタルバイオレット溶液５０ｕ１を加えた６３分後向　Ｂ　Ｓで すすいで過剰の染色を除去した。プラークを計数し、下記の通り終点を計算した 。

プラーク減少検定に於て攻撃ウィルスプラークを５０％阻害する試料の最大希釈 液にインターフェロン１単位が含まれる。用量一応答関係はプラーク形成の阻害 ％とインターフェロン濃度の対数の直線回帰阻害値で作成した。５０％阻害（１ ５０）濃度と９５％信頼間隔は必要な場合、回帰直線から計算し、それらの結果 を国際基準単位に表わすために更に計算した。

この検定は本発明を実施するのに有用な全ての抗ウイルスペプチド／タンパク質 に利用できる。

ペプチドとリン２　び　゛　び二　との１皿座皿工玉方Ａ リポソーム包囲ペプチドはリン脂質リポソームから皮膚に伝達される。リポソー ム特にリポソームＤＲＶで包囲したインターフェロンのようなペプチドはリポソ ーム二重層に浸透せず、二重層の極性基と結合する。この方法ではリポソームは 供与体として、皮膚の角質層は受容体として作用する。

虱分玉ｕ９旦３ ポリペプチド−脂質相互作用の方法をペプチドと単分子層の相互作用を定量する ために使用した。この方法に於ては、脂質を緩衝液の表面に拡散し、ペプチドを 下層（サブフェーズ）に注入し、得られた相互作用の程度を表面圧の変化を測定 することによって定量した。この方法により人工及び天然脂質二重層とのタンパ ク質相互作用を洞察した。単分子膜浸透の研究はＪ、　Ｐｈａｒｍ。

Ｓｃｉ工第２巻、２４４頁（１９８３年）の一定面積単分子膜性操作の変法によ り行なった。

使用した脂質混合液は試験される種々のリポソーム脂質組成物に対応する。これ らの混合液の個々の脂質成分を試験した。実験は表面張力を測定するためにサン ドブラスト白金ウィルヘルミープレートを備えたロサノサーフエステンションメ ーター（ラボラトリ−プロダクツ社、ボストン、マサチューセッツ）を用いて２ ５℃と３５℃で行なった。サブフェーズはイオン強度を０．２に調節するために 塩化ナトリウムを含む０．０５Ｍ　ＨＥＰＥＳｐＨ７，０，９０，０ｍｌから構 成した。純粋な脂質又は脂質混合液を初表面圧を十分生じる量で適当な溶媒から 拡散した。取りはすしのできるガラス注射器をつけた固定針を用いてＩＦＮ−α の可変量を０．２＋ｗｌずつ増加して表面下のサブフェーズに供給した０表面張 力を５分毎に、変化が更に観察されなくなるまで（＜０．０５ダイン／ｃａｌ　 ３０分間読み取った０表面圧は脂質膜がないものと膜被覆面との表面張力の差と して計算した０表面圧の変化はタンパク質のサブフェーズへの注入による脂質膜 の表面圧とタンパク質を含まない表面圧即ち初表面圧との差として計算した。リ ン脂質と皮膚脂質から調製した単分子膜とのペプチド相互作用の比較が特に興味 深いものであった。

Ｉ！１皿匁旦ヌ インターフェロンの、リン脂質リポソーム（薬剤送達系）から角質層脂質リポソ ーム（モデル膜系）への伝達を研究するために水性コンパートメントマーカーの 非特異的伝達を研究する主イＬ二二第２８１巻＝６９０頁＋１９７９年）に記載 されるテルビウム−ジピコリン酸検定を使用した。リポソームの次の４集団を調 製した。

（ｉｔ　２．５ｍＭＴｂＣ１，，５０ｍＭＤＰＡ及び５０ｍＭクエン酸ナトリウ ムを含むリン脂質リポソーム；　（ｉｉ）５０ｍＭＤＰＡを含む皮膚脂質リポソ ーム：　（ｉｉｉｌ　２．５ｍＭＴｂＣ１ｍ、５０ｍＭＤＰＡ及び５０ｍＭクエ ン酸ナトリウムを含むリン脂質リポソーム：及び（ｉｖ）２．５ｍＭＴｂＣ１ｇ 、５０ｍＭＤＰＡ及び５０ｍＭクエン酸ナトリウムを含む皮膚脂質リポソーム、 分散液をセファデックスＧ−７５のｌｘ４５ｃｍを通過させて非包囲物質から小 胞を分離した。リポソーム調製物（ｉ）及び（ｉｉ）の混合液（１：１ｖ／ｖｌ を３５℃でインキュベートし蛍光測定を種々の時間間隔で行なった。最大Ｔｂ蛍 光（２；）のリポソーム集団を完全に混合するときに得られる）は調製物（ｉ） と（ｉｉｌの混合液の量と同じリポソーム調製物（ｉｉｉｌ又はＩＶ）の量の蛍 光強度を測定して決定した。

ペプチドインターフェロンの特異的転移は１４Ｃ−インターフェロンを含むリン 脂質リポソームを皮膚脂質リポソームとインキュベートして研究した。２つのリ ポソーム集団をカラムクロマトグラフィーに於て固定相としてセファロース２Ｂ に還元的に結合したネオマイシンを用いて分離した。この方法は種々の陰電荷脂 質のネオマイシンに対する親和性に基づいてリポソーム集団を量的に分離するも のである０例えば１０モル％ＰＩＰ、Ｌか含まないＥＬのリポソームは０．２Ｍ ＮａＣ１中に定量的に残っているがＰＳを含むリポソームは７０〜９７％回収さ れる。この研究の結果をテルビウム−ジピコリン酸研究と比較した。

層２　に　するリン２　リポソームの影リポソームに取り込まれたペプチドイン ターフェロンは十分な厚さの皮膚に浸透し角質層と関係ある脂質の構造上の特徴 を変えることができる。皮膚脂質とリン脂質リポソームとの関係は角質層脂質組 成にわずかな変化をもたらし、二重層の方向と透過性障害の一部破壊をもたらす リン脂質リポソームとインキュベートする前及び後に皮膚脂質リポソームのサー モグラムを比較した。更にＰｈａｒｍ、　Ｒｅｓ、第５巻＝１４０頁ｆ１９８８ 年）に記載される方法によってモルモット及び遺体から得た角質層をリン脂質リ ポソームとインキュベートする前及び種々の時間インキュベートした後にサーモ グラムを比較して試験した。特徴的サーモグラム特に脂質領域と関係のあるピー クの逸脱は脂質混合、相分離及び相転移例えば六方晶相に対する二重層の程度の 優れた変化指標である。・データ分析のためのデータステーションと必要なソフ トウェアでグレードアップしたパーキンエルマーＤＳＣ１２Ｃ走査熱量計をこれ らの研究に使用した。リポソーム分散液又はすすいだ角質層を遠心分離し、湿っ た沈降物を密封した試料パンに入れた。

対照パンには同量の緩衝液を含有させた。走査は全て加熱速度５℃／分及び範囲 幅ｌ■ｃａｌ／秒から得た。熱量計を検定するためにインジウム標準を使用した 。得られたサーモグラムを相転移温度、相分離挙動及び転移ピークのエンタルピ ーの変化に対して分析した。

の＝　な　膚・　°　を゛しての、リポソーム　に・　したペプチドの　の澗　 に　する　法 ジエイ、インフエクト、ディス、（Ｊ、Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、、）１５３：６ ４（１９８６１に記載されている方法に従って、フランツ（Ｆｒａｎｚ）分散セ ルにおけるモルモットの切除された皮膚が、局所施用された抗ウイルス性のペプ チド／蛋白の効果に対する皮膚透過性を評価するために、無毛のマウスの皮膚、 無毛のモルモットの皮膚及び人間の死体の皮膚と共に用いられた。用いられた皮 膚の膜は、表皮のすべて、真皮及び真皮の基底部において拡がる薄膜を含んだ。

このような膜を、所定の大きさになるように切り、拡散セルチャンバー間に締め つけた。使用したすべての皮膚膜の、角質層のない膜は、テープを用いる皮膚の ストリッピングと、穏やかな加温（６０℃で約６０秒）による別の試験用の全表 皮と真皮の単離によって調製された。このような膜調製物は、皮膚のより深い層 におけるインターフェロンの拡散性の移動性を示すのに有用であった。

拡　セルについての言載 局所的に用いられる薬剤の道程を、そのとおりに複製するように、物質を皮膚の 表面に適用させる拡散セルシステムが、試験のこのフェーズに対して必要とされ る。不十分な温度の管理、大きな流体力学的な拡散層及び真皮の下の泡の形成な どの細胞に固有のこの種の欠陥を避けるために、クラウングラス、ツマ−ビル、 エヌジェ−（Ｃｒｏｗｎ　Ｇｌａｓｓ、　Ｓｏｎｍｅｒｖｉｌｌｅ、　ＮＪＩで 製造されたフロースルーの有限の用量の拡散セルが用いられた。このフロースル ーのセルは、溶剤の流れを可能とさせるための入口と出口のある、１．０１１１ の受容器からなる。フロースルーセルの運転には、受容体の液体を、温度管理さ れている貯蔵器がらぜん動ポンプ（レイニン　ラビット、レイニン、つすバーン 、エムニー（Ｒａｉｎｉｎ　Ｒａｂｂｉｔ、Ｒａ１ｎｉｎ、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ ））を用いて、セルを通して、中ヘボンブで移動させた。この液体は、セルを出 た後、特定の長さのテフロンの配管に入り、それぞれの配管の末端部から排出す る液滴は、自動フラクションコレクター（イスコ、リンカーン、エヌイー、　ｌ ５ｃｏ、　Ｌｉｎｃｏｌｎ、ＮＥＪ中に設けられた試験管内に捕集される。この コレクターは、多数のセルから同時捕集、及び予しめ定められた間隔で、新鮮な セットの試験管との置き換えを行なうことができる。出口部で、液体によって横 切られる距離を最少になるようにしであるので、フラクションの捕集の時間は皮 膚吸収の時間と、よく相関する。フロースルーセルの拡散に対する有効面積は約 ０．８ｃｍ”である、フロースルーセルはガラスで作られ、温度管理のために被 覆されており、試験は、滲透に対する流速の影響を確認するために、種々の流速 で実施することが可能である。

この装置に膜をとりつけ、受容器のコンパートメントに約１　、　２５ｍｇ／ｍ ｌのアルブミンを含む、カルシウム−マグネシウムを含まないリン酸塩で緩衝さ れたｐＨ７，０の塩類溶液を満す、液体が完全な皮膚の下面に十分接触すること を確認し、そうする事によって泡が出ないよう注意を払った。温度は３７℃に維 持した。それぞれの管理（空のリポソームの有るが、または無い遊離のインター フェロン）と共に、適切な程度の封入と安定性を示したリポソームのシステムを 、できるだけ均一となるようにテフロンで作られた小さなスパチュラを用い、ド ナーコンパートメント用に精力的に拡げた。皮膚の層の内部及びこれを通る標識 放射能の存在を示すために、放射能標識したインターフェロンを含むリポソーム の分散剤を用いた。異なる濃度のリポソーム及びリポソーム内の異なる濃度のペ プチドインターフェロンについて検討がなされた。拡散のラグ時間（フラックス 測定を確定するまでの時間）を示すため、及び滲透速度を示すためにも、また時 間の函数としての滲透量を示すために、それぞれの滲透のプロフィルが用いられ た。従って、プロフィルの平行的な比較により、数種の適用のいずれが、好適な 状態で、より速やかに、また滲透の初期の段階で大量に薬剤を移行させるかが容 易に示される。ペプチドインターフェロンを用い、物質の爆発的分散が、生きて いる表皮膜の中を通過し、それによってウィルスの複製に対して、それ自身が直 ちに支えることのできるのが望ましい、取り込みについての適切な指標を示す、 これらのシステムは、生物学的に活性なインターフェロン分子及び不活性化され ないインターフェロン蛋白が移動されたかどうかを測定するためのプラークリダ クション検定によって検定された。

肚４貫蓬度亘圭１ 局所性の抗ウイルス性薬剤の治療効果は、いかに速やかに薬剤が基底細胞層に到 達し、ウィルスの複製を阻止するのに必要な濃度に達するかによる。したがって 、このウィルスの複製は薬剤の効果についての感受性のある指標である。速度を 制限する障壁として作用する角質層は、また薬剤の貯蔵所としても機能する。

皮膚のストリッピング法と、放射能標識した１２５　ニーインターフェロンが、 迅速な用量範囲設定のために用いられた。皮膚は、拡散セル試験で記載されたよ うに、リポソームに封入されたペプチドインターフェロン及びそれを含まないも のに暴露させた。異なる時間に、皮膚をセルから除き、表面に残っている物質を アルコール性の綿棒で拭きとった。スコッチテープを、条件の整えられた皮膚の 部分につけ、皮膚へしっかりと押しっけ、ついで引きはがした。このテープと付 着した細胞を組織オキシダイザ−を用いてダイジェストさせ、液体シンチレーシ ョン計数によって検定した。１回のテープのストリッピングから得られた組織の 量は、テープの風袋を測り、再びストリッピング後に重量を測定してめた６セロ フアンのテープは正確に重量測定をするには、あまりにも吸湿性なので、この目 的のためにはポリエステルのテープがより適切である事が認められた。ペプチド を吸収した表面は、最初のテープのストリッピングと、以降のストリッピングと を比較して調べた０通常は、角質層を完全に除くためには１０−１５回のストリ ッピングが必要とされる。これらは３回の組合せにまとめる事により、連続する ５層の深さにおける薬剤の濃度の概略が推定された。角質層が取り除かれた後に 、その下層の組織を、真皮表皮接合部における皮膚の分離を効率的にするために 、６０℃に３０秒加温し、切り出し、さらに切片とした。この加温は短時間なの で、ペプチドの活性には影響を与えながった。

適切な層の濃度を示すシステムは、生物学的な検定法を用いて検討した０組織を 均質化し、ドライアイス上で急速冷凍し、解凍後挟で細断し、ティシュマイザー （チクマー社、シンシナチ、オーエイチ（Ｔｅｋｍａｒ　Ｃｏ、、Ｃ１ｎｃｉｎ ｎａｔｉ、０Ｈ）ｌを用い氷冷した１　、　２５＋ＩＩｇ／ｍｌのアルブミンを 含むへベス（ＨＥＰＥＳ）−緩衝塩溶液（ｐＨ７，４）中で均質化した。インタ ーフェロンの生物学的活性に関する組織抽出についての影響（６０℃での３０秒 の加温と均質化）は、既知量のインターフェロンを角質層の除去後直ちに組織試 料に２反復で添加して測定した。

ｒの　の−におＧる薬剤の　′−の試 人間の皮膚中へのペプチド／蛋白質の薬剤移行に関するリポソーム担体による促 進は、ペプチドの効果の臨床的評価の中間段階として評価された０モルモットの 皮膚の作用がもっとも有効であった移行についてのリポソームのシステムを用い た前記の試験の、モルモットの皮膚を人間の死体の皮膚と入れ替えた。剖検時に 、新鮮な状態で採取された１インチｌ］の腹部の皮膚を６０℃の水で２分間処理 したにの操作は下層の組織から表皮を除く、定まった用量の細胞に対して適切な 表皮膜をこれらから切り出し、前記したように試験を行なった。

リポソームに封　したインターフェロンの、ウィルスに感　した八〇　膚　′− の　証にＶする　沿 生きているモルモットの組織層の濃度測定を下記の方法を用いて実施した。ヒル トップチャンバーｆＨｉｌｌ　Ｔｎｐ　Ｃｈａ■ｂｅｒ）粘着室を用い、生きて いるモルモットの背部の皮膚が、インターフェロンあるいは抗ウイルス性ペプチ ド濃度の測定に使用された。これらのチャンバーには、無拘束の動物を数日間保 留することができる。対象の担体を浸した吸着用パッド挿入物を、インビトロの 浸透試験期間と同様な時間、この方法で皮膚に接触させるように保った。チャン バーから移し、皮膚の種々の層中のインターフェロン濃度を生物学的に、前記し たようにして検定した。

ヘルペスのモルモットのモデルにｉ３＆るｒウィルス活　の測臨床的所見及び期 間に関して、人間にみられるものともっとも近似している状態の病気として１モ ルモットの皮膚のヘルペスのモデルの使用が選択された。このモデルは、他の動 物にみられるヘルペスウィルスの感染モデルより著しく優れている点を有する。

病巣部の採点で表わした感染の程度を、実施例６に示すように、リポソームに封 入したインターフェロンの局所性の活性を評価するために用いた。別に、紅斑及 び硬化によって測定される皮膚毒性を測定し、遊離、あるいは封入されたインタ ーフェロンのいづれかによって、またはリポソームそれ自身によって誘起される かどうかを調べた。

インターフェロン調製物の抗ウイルス性の効果を定量化するために、アレニウス 及びオバーグＡｌｅｎｉｕｓ　ａｎｄ　Ｏｂｅｒｇ、アーク、ヴイロル、、Ａｒ ｃｈ、　Ｖｉｒｏｌ、、　５８：２７７（１９７８１の採点システムが、ｌ、２ ．３、■、■、■の採点に対する標準として利用されている写真と共に用いられ た。前記したように、Ｈ３Ｖ−１をモルモットに植付けた後、植付けられた部分 を、毎月、９−１１日にわたって採点した。すべての採点はブラインドで実施さ れた。それぞれの試験製剤に対する治癌時期も記録された。統計的有意性はプロ フィル分析、対のｔ−検定及び分散分析の手法を用いて検定した。

別の試験で、感染された皮膚におけるウィルスの力価を、インターフェロン調製 物がウィルスの複製を阻止したがどうかを評価するために測定した。モルモット を層殺し、植付は部位の個々の部分を切りとった。皮膚試料を凍結、解凍した後 、鋏で細断し、１ｍｌ中に１００単位のペニシリンとＩ　ＯＯｕｇのストレプト マイシンを含むｐＨ７，４（１０２）の水冷したＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液の中で均 質化した（ティッシュマイザー、チクマー社、シンシナチ、オーエイチ、（Ｔｉ ｓｓｕｍｉｚｅｒ、Ｔｅｋｍａｒ　Ｃｏ、、Ｃ１ｎｃｉｎｎａｔｉ、０Ｈ１）　 。

懸濁液を９００Ｘｇで遠心分離し、その遠沈物をアンチミクロブ、エージェント 　ケモセル　Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ、Ａ　ｅｎｔｓ　Ｃｈｅ會ｏｔｈｅｒ、、９ ：１２０（１９７６１の手法に従って、以降ＢＨＫ−２１／４細胞を検定するた めに、−７６℃で保存した。

小さいペプチド分子とインターフェロンの局所的活性も、人間の死体から入手し た白人の皮膚を用いて試験した。皮膚は２０才から７０才の間の者で、性に関係 なく使用した。健康上の理由から、死因には制限を設けた。罹病している皮膚は 受入れなかった。死亡時期、年令、性及び皮膚が採取された部位は記録された。

泣月 脱水／再水和法によって調製された本発明の組成物はペプチドの皮肉における移 動に、もっとも好適、かつ有効なものである。

さらに、これらの組成物はペプチド／蛋白質の高い封入性を有し、非常に安定で ある。

ペプチド／蛋白質の薬剤の、リポソームから皮膚への直接の移動は、薬剤が２層 と関連する場合にのみ、起ると云う本発明の概念について試験が行なわれた。標 準的な方法で調製された負のＭＬＶｓやＬＵＶｓ、脱水／再水和法で調製された 負のＤＲＶｓ、及び脱水／再水和法で調製された皮膚の脂質のリポソームＤＲＶ ｓから成る、すべてペプチドインターフェロンの封入されている数種のリポソー ムの製剤について、実施例７に記載されているモルモットの皮膚ヘルペスのモデ ルを用いて、ウィルスコントロールに対して試験が行なわれた。用いられた製剤 は実施例２及び３に記載されている。

また、インターフェロンの水性製剤、油中水型製剤についても試験され、この局 所の活性は、図１及び２に示される。ウィルスコントロールの無処理と比較して 、水性及び油中水型製剤のいづれも、それらの局所的活性に差を示さなかった。

同様に、標準法によって調製された負のＭＬＶｓ、あるいはＬＵＶｓインターフ ェロン製剤の局所の活性も、図３及び４に見られるように、ウィルスコントロー ルのそれとは異なっていなかった。

一方、脱水／再水和法で調製された負のＤＲＶｓ及び皮膚の脂質のＤＲＶｓに混 入された場合には、インターフェロンはモルモットの皮膚を通して移動し、また これらの製剤は図５．６及び７に示されるように病変の採点を低下することがで きた。この事は、モルモットの皮膚モデルにおける病変の低下に、リポソームの 調製方法がもっとも重要な因子である事を示している。リポソームの脱水及びそ れに続く再水和が、角質層の脂質のコンパートメント内への移動が行なわれる場 所におけるリポソームの２層中へのペプチドの分配を助長するものと考えられる 。この所見は図７に示される結果によっても支持され、ここでは皮膚の脂質（Ｃ Ｈ：　ＣＨ：　ＰＡ・ＣＨ３）ＤＲＶリポソームは１図５及び６に示される負の ＤＲＶｓにもとづくリン脂質よりも、より有効であると考えられる。

図８は、さらにこの所見を、封入されていない遊離のペプチド／蛋白質インター フェロンを含む空の皮膚リポソームが存在するので支持している。見られるよう に、空の皮膚リポソーム、遊離のインターフェロン、及びウィルスコントロール の局所の活性には差は認められない。

実施例４及び表１に示されるように、リポソーム由来のＤＲＶは、標準法によっ て調製されたＤＲＶリポソーム内へのペプチドの封入より、さらに有利性を与え る。すべてのＤＲＶｓにおいて、封入はほとんど２倍あるいは、それ以上である 。

リポソーム由来のＤＲｖはまたＭＬＶｓに対して、より良好な安定性を示す。１ ０ケ月までの間、ＤＲＶリポソーム内へのペプチドの全封入は約９５％であり、 封入に関し、１ケ月の時点の９２％から実質的に変化を示していない。

本発明の、これらの及び他の態様は、下記の実施例によって明らかとされるが、 これらは例示のためであって、現発明を限定するものではない。

社↑は≦包迭 卵レシチン（ＥＬ）、コレステロール（ＣＨ）、コレステリルサルフェート（Ｃ Ｈ３）、牛の脳のセラミド（ＣＭ）、バルミチン酸（ＰＡ）及びシミリストイル ホスファチジルコリン（ＤＭＰＣＩは、シグマケミカル社、Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅ ｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　（セントルイス、エムオーＳｔ、Ｌｏｕｊｓ　ＭＯ，）か ら入手した。ホスファチシリルセリン（ＰＳ）はアバンティ　ポーラ−リビッド 、Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒＬｉｐｉｄｓ　（バーミングハム、エイエルエイ、 Ｂｉｒｖｉｎｇｈａｍ、　Ａｌａｌ　から入手した。アルファートコフェロール は、イーストマンコダック社、Ｅａｓｔｍａｎ　Ｋｏｄａｋ　Ｃｏ、（ロチニス ター、エヌ、ワイ。

Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｎ、　Ｙ、　ｌから入手した。バイアルに入れた。凍結 乾燥された組替白血球Ａ　ＩＦＮ、それぞれに、１８Ｘ１０’　ＩＵのＩＦＮ、 ９Ｂの塩化ナトリウム及び５ｍｇの人間の血清アルブミンを含むものは、ホフマ ン・ラロッシュ　インク、Ｈｏｆｆ■ａｕｎ〜ＬａＲｏｃｈｅ　Ｉｎｃ、　（ナ ラトレー、ジエイ、ジェイ、Ｎｕｔｌｅｙ、Ｊ、Ｊ、ｌから供給された。ＣＨは エタノールから２回再結晶した。他のすべての薬品は受領したままのものを用い た。Ｈ５Ｖ、タイプ１　ｔＨ３Ｖ−１１のＳ　−１４８種は、シエーリング　コ ープ６．ブルームフィールド、エヌ、ジェ−，ｆｓｃｈｅｒｉｎｇ　Ｃａｒｐ、 、　Ｂｌｏｏｍｆｉｅｌｄ、Ｎ、Ｊ、ｌ　のティー、ダブりニー、シェイファ− ，（Ｔ、Ｗ、５ｃｈａｆｅｒｌから提供された。滴定は１１■記したようにＢ５ Ｃ−１セル中におけるプラクリダクションによって実施した。

支五桝ユ リポソームインターフェロン １ｍｌ当たり５．４Ｘ１０’ＩＵ　（国際単位）のアルファー型インターフェロ ンを含むインターフェロン水溶液、及び、アラセル８０の鉱油緩衝溶液を含むイ ンターフェロン含有油中水型乳剤（同量のインターフェロン（５，４ＸｌＯ’Ｉ ＴＪ）を有し、６：３、ｌの割合で）を調製し１モルモット皮膚モデルで試験し 、ウィルス非処理コントロールと比較した。

結果は第１図及び第２図に示される。

Ｘ五豊ユ インターフエユ２巣工 ３ｆ！のリポソームを調製し、試験し、ウィルスコントロールと比較した。

すべてのケースにおいて、全脂質濃度が１００Ｌ１モル／ｍｌになるように、処 方最終量を調整した。ヒト血清アルブミンに対するインター７　ｓ、　ｏ　ン（ Ｉ　Ｆ　Ｎ　）の比率を４Ｘ　１０’　Ｉ　Ｕ／ｍｇとし、最終アルファー型イ ンターフェロン濃度を懸濁液１ｍｌ当たり５．４Ｘ１０’ＩＵとした。

脂質構成物の効果について、モル濃度比２：１：０．３３のＥＬ−ＣＨ−ＰＳ及 びＤＭＰＣ−ＣＨ−ＰＳのネガティブリポソームを調製することにより試験した 。酸化防止剤アルファー−トコフェロール［１％量を、Ｅｌ−を含む全てのリポ ソームに加えた。リポソームもまた、モル比４：２．５：２．５：　１の脂質Ｃ Ｍ　：　ＣＨ：　ＰＡ　：　ＣＨ５を用いて、角質層において見い出されたもの と同様の構成を有する脂質から調製した。

Ｍ　Ｌ　Ｖ　、多重膜リポソーム（ＭＬＶ）を、ここに記数する薄膜のごとき標 準法により調製した。

モル濃度比２：１：０．３３のＥＬ　：　ＣＨ：　ＰＳアルファー−トコフェロ ール（１％量）を含む脂質混合物を加え、この混合物を、クロロホルムに溶解し 、窒素下、ロータリーエバポレーターにより蒸発させた０次いで、脂質薄膜を有 するフラスコを、−晩真空下に置き、残存溶媒の除去を促進させた。この脂質膜 を、ＩＦＮ及びヒト血清アルブミンを含むカルシウム、マグネシウム−フリーリ ン酸緩衝食塩水（ｐＨ７，０）に、リン脂質の相変換温度以上の温度で、再懸濁 した。この混合物を１０〜３０分渦巻状に撹拌した。遊離薬剤は除去しなかった 。これは、水性リポソーム区画からの漏出量が、薬剤の外部熱力学的活性が、リ ポソームの水性区画の熱力学的活性に近づく際に最小にされるから（Ｎｕｃｌ　 ｅｐｏｒｅｌ　ポリカーボネートメンブランフィルタ−（１００ｎ＋＊孔径）と 適合した押出装置を用いて調製した。該方法はＭＬＶが、インチ当たり２５０ｆ ｆｂの圧力下で（２）、０．　１ｔｘｖｓ孔径ポリカーボネートメンブランを通 ってくり返し押出される場合の観察に利用でき、その平均孔径は次第に小さくな り、５〜１０回の押出しの後に１１００ｎの最小となる。ＭＴ−Ｖが孔を通って 押し出されると、未処理のバイレヤーが残存するまで、連続層がはがされる。上 記のごとく調製されたＭＬＶは、Ｌ　Ｕ　Ｖが調製されるまでくり返し押し出さ れる。

標準法により調製されたＩＦＮを含むＭＬＶ及びＬＵＶのいずハもが、ウィルス コントロールに対して試験された。結果は第３図及び第４図に示される。

友血亘旦 ゛　補　リポソーム 脱水／水補給リポソームを、キルビー及びグレゴリアゾイス“リポソームテクノ ロジー”　ｆＫｉｒｂｙ　ａｎｄ　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ　−Ｌｉｐｏｓｏｍ ｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−１第１＠、第１９〜２８頁（１９８０年）ＣＲＣ出版 に記載の方法により調製した。簡単に言えば、エンプティー超音波処理された小 胞を、アルファー型ＩＦＮ５．４ＸｌＯ’　ＩＴＪ／ｍｌを含むＩＦＮストック 溶液の一部と混合した。この混合物を窒素気流上で乾煙さゼた６脱水の際、小さ な小胞を融解し、連続的バイレヤー間にＩＦＮ溶解分子を有効にはさみこんだ多 層状膜を形成した。水補給においては、十分な割合いで溶解物を包含する、大き な小胞を生成した。３種のＤ　ＲＶリポソームＩＦＮ処方物及び１つのエンプテ ィー１）　ＲＶリポソーム処方物のいずれについても、モルモット皮膚モデルに おいて、ウィルスコントロールに対して試験された、結果を第５図〜第８図に示 す。

この実施例は、種々のリポソームへのインターフェロン捕獲の程度を説明する、 種々のタイプのリポソームを表１に従って調製し、全脂質の最終濃度が１００ｕ モル／ｍｌとなるように量を設定し、アルファー型インターフェロンの最Ｐ濃度 を懸濁液１ｍｌ当たり１．８　Ｘｌ［）’　ＩＩＪとした。

１００　＃１．１づつの２分割について、その１分割を、後のアッセイのために 凍結させ、ＨＥＰＥＳ中１２５％Ｈ５Ａを用いて容量を１ｎｉ１とした後の全Ｉ ＦＮをマークした。第２の分割物につしＡでは、ベックマン遠心管にて、ベツク マンエアーフユージ（Ａｉｒｆｕｇｅｌ中で３０分、１４８．０００Ｘｇで遠心 した。上清を除去し、ペレットを１００ＬＬｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で３回洗浄し た。ペレットの重量は約２００ｆｆ１ｇであった０次いで、ＨＥ　Ｐ　Ｅ　Ｓ中 １．２５％Ｉ−Ｉ　Ｓ　Ａ　２００μｍを加え、容量をＨＥＰＥＳを用ｌ／Ａて １ｍｌとし、サンプルを後のアッセイのために凍結させた（捕獲ＩＦＮ）。ペレ ットを、ＨＥＰＥＳ中０．４％ナトリウムデオキシコール酸塩（インターフェロ ンアッセイを妨害しないことがすでに示されている。）５００μｌ中に溶解した 。この容量を）ｌｓＡｆｆｌ液を用いて１ｍｌとした６次いで、後のアッセイの ためにサンプルを凍結させこれをＪｉｌｌｉＩＦＮと称することとした。質量バ ランス（全ＩＦＮ−捕獲ＩＦＮ十遊離ＩＦＮ）は、常に、インターフェロンアッ セイの感度の範囲内に得られた。試験された、種々のタイプのリポソームに捕獲 されたインターフェロンのノ＼−センテージが、ポジティブ、ネガティブ及びニ ュートラル小胞中のインターフェロンの捕獲において示され、ＤＲＶへの捕獲と 比較された８結果を表１に示す。

未−上 旦ｙ」１１９ヱ壮二立２土 実、苅已ｉ互 リポソームインターフェロン この実施例は、１２ケ月の保存期間にわたるリポソームインターフェロン処方物 の安定性について説明する。

ＭＬＶ及びＤＲＶの粒子サイズ分布（表２）は、光学顕微鏡により歓察されるご とく、１２ケ月の保存期間にわたって、明らかな変化はなかった。０〜１２ケ月 の保存期間における上清サンプルの電子顕微鏡写真によっては、小さい小胞の有 効量の形跡を見い出すことができなかった（容量ベースで〈５％）。

リポソーム処方物に組み込まれた場合の、遊離及び捕獲インターフェロン相方の 安定性を評価し、リポソームからの捕獲インターフェロンの放出を決定するため に、試験されたリポソーム懸濁物の各々２ｍｌを、２°〜４℃での冷却装置にて 保存した１種々の期間で、２つの分割物１００μｌを取り出し、前記項目で記載 したごとく、処理し、アッセイした０種々の期間経過後の試験された種々のタイ プのリポソームに残留する遊離及び捕獲インターフェロンのパーセンテージ（時 間ゼロでＩ　ＦＮ　１００％）を以下の表に示す。

ｇ　９５　１１５ リポソームインターフエロン　物の生物−・活この実施例は、リポソームインタ ーフェロン処方物の生物学的活性を説明する。

フランス（Ｆｒａｎｚｌ拡散セルを、これら実験のために使用した。

セルは、拡散有効面積０．７８５０１１２を有し、受容区画容量（ｒｅｃｅｉｖ ｅｒ　ｃｏ＋ｉｐａｒｔｍｅｎｔ　ｖｏｌｕｍｅｌは、４．６″５．０ｍｌの範 囲であった。受容体区画を溶媒で満たし、毛を剃いたモルモット未処理皮膚を、 液体収縮により受容体の上部開口上にわたって置いた。ゴムの０リングを膜の外 縁に置き、上部セルキャップを締めつけた。受容区画底部で小形マグネットスタ ーラにより内容物を撹拌した０表３における各処方物０．３ｍｌを９つの供与区 画に投入した。

同様な毛を剃られたモルモット皮膚を、与えられた実験装置における９つの分散 セルのすべてに使用した。受容区画は、ＨＥＰＥＳ緩衝液中１，２５％Ｈ５Ａを 有した。サンプリングのために、受容区画から１ｍｌが取り出され、ＨＥＰＥＳ 緩衝液中１．２５％Ｈ５Ａ１ｍｌで置き換えた。試験された処方物の各々につい て、セル１〜３は、リポソーム処方物（ＩＦＮ＝１．８Ｘ１０”ｕ／ａｌｌを含 み、セル４〜６は、水性ＩＦＮコントロール（１，８ＸｌＯ”　ＩＵ／＋１ｌｌ ）を含んだ。

以下のチャートは、４８時間で移動した生物学的に活性なインターフェロンの全 量を示す、すべてのケースにおいて、試験されたコントロール処方物のいずれに ついても、受容区画において検出されたインターフェロンはなかった。

亙−ユ ＥＬ：ＣＨ：ＰＳ　ＤＲＶ　１．　７　（Ｓ、Ｄ、＝１．　０６）実」１九ヱ リポソーム　カプセル化インターフェロンの。所゛本実施例は、モルモット皮膚 モデルにおけるＨ　Ｓ　Ｖ　−１に対するリポソームカプセル化インターフェロ ンの局所活性について説明する。

内皮的に誘導されたリポソームカプセル化インターフェロンがウィルス感染細胞 にはいり込むか否かをテストするために、ヘルペス感染モルモット皮膚モデルを 使用した。感染の際の累積的損傷スコアにより測定された感染の過酷さ及び治癒 の時間が、遊離及びリポソームカプセル化インターフェロンの抗ウイルス効果を 決定するために用いられた。

成熟したメスの毛を剃られたモルモットｆ（：ｒｌ　：　ＩＡＦ　ｆＨＡ）　Ｂ ＲＩ（チャールスリバー　ラボラトリーズ、インク、ウイルミントン、エムニス （Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｊｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、Ｗｉｌ ａ＋ｉｎｇｔｏｎ。

ＭＳＩ　より提供、体重３００〜４００ｇ１を使用した。動物の背中をマーキン グベンで６つの正方形に分けた。　３．　２　Ｘ　１０’　ＰＦＵ／＋Ｉ＋１の 力価の１４８株１型単純ヘルペスウイルス（ＨＳ　Ｖ　−１）２５ｕ　ｌを、各 エリアの中央に投与した。ウィルスを、麻酔下スプリングー負荷ワクチン接種器 （スターニードルガン、パンレイ、ディヴイション１オルモントドラッグ　コ４ ．エングレウッド、エヌジエ−（Ｓｔｅｒｎｅｅｄｌｅ　Ｇｕｎ、Ｐａｎｒａｙ 　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、Ｏｒｍｏｎｔ　Ｄｒａｇ　Ｃｏ、　。

Ｅｎｇｌｅｗｏｏｄ　、Ｎｊ）ｌ　を用いて接種した。これは、各皮膚エリアの ０．７５ｍｍの深さにｌＯ回接種されたものである。方法は、基本的に、ニーエ ム、エヌ、ワイ、アカド、サイ、（Ａｎ＋、Ｎ、Ｙ−Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、１．２８４：６２４（１９７７年）に従ツタ。

各動物の左又は右側の３つのエリアを、接種後２４時間から５日間、１日１〜３ 回、遊離及びカプセル化インターフェロンの異なる濃度及び量で局所的に処理し た。リポソーム内のインターフェロン量の影響及び、インターフェロンの全リポ ソーム移動数（インビトロ）の影響についての研究の結果は、受容区画、より重 要には、皮膚内における薬剤の所望のレベルにこれらのパラメータがどの程度影 響するかを決定するために用いられた０反対側の部位は、処理も賦形剤単独の投 与も受けずコントロール部位として働く、試験調製物による皮膚毒性は、ナシ（ ０）、大変弱い（±）、弱い（＋）、中程度（＋＋）及び強い（＋＋＋）のごと く記録された。

インターフェロン調製物の抗ウイルス効果を測定するためにアレニウス及びオバ ーグｆＡｌｅｎｉｕｓ　ａｎｄ　Ｏｂｅｒｇｌの記録システムを使用した。全て のモルモット皮膚モデル実験は、毛を剃られたモルモットを用いて行われた。第 １〜８図に示される広い範囲の処方物が、実験的背部皮膚Ｈ３Ｖ−１感染に対す る治療効果について評価された０時間に対する損傷の程度についてのプロットが 、試験された全ての処方物について示された。

リポソームチャージ、構成及び調製法の効果を、ネガティブにチャージされたＤ ＲＶ、ＬＵＶ及びＭＬＶ　（ＥＬ　：　ＣＨ：　ＰＳ、モル濃度比２：ｌ：０． ３３又はＤＭＰＣ：　ＣＨ：　ＰＳ、モル濃度比２：］：０．３３）及び脱水／ 再水和皮膚リポソーム（ＣＥ：ＣＨ：ＰＡ：ＣＨ３、モル濃度比４：２．５・２ ．５：ｌ）を用いて試験した。

すべ゛〔のケースにおいて、全脂質濃度が１００Ｌ１モル／＋ｓｌとなるように 最終容量を調整した。リポソーム型の効果をＭＬＶ、り　ＲＶ及びＬＵＶを用い て試験した。ヒト血清アルブミン（）ＩＳＡＩの不在の下に行なわれた一群の実 験を除いて、Ｈ８Ａに対するインター７　ｘ　Ｏ”／　（７）比は、１ｘｌＯ’ ＩＵ：０．２５＋ｍｇとした。　インターフェロン水溶液、インターフェロン含 有油中水乳剤（鉱油：緩衝溶液：アラセル８０．６：３：ｌ）及び市販の局所抗 ウイルス生成物（アシクロビル（Ａｃｙｃｌｏｖｉｒｌ　ｌを、同一のモデルを 用いて試験した。結果を第１〜８図に示す。

感度をより高く上げるｔ：めに及び、相互主観的変化を少なくするために、各反 対部をコントロール部位として機能させる、近接対比技術が、研究の段階におけ る実験の記録のために使用された。ゼロ値がコントロールと同一であることを示 す損傷スコア変化の時間に対するプロットは、種々のインターフェロン含有処方 物の有効性又は、その欠点を示している。

夫血輿互 リポソームインターフェロン　膚す この実施例は、リポソームカプセル化インターフェロンの皮膚炎症について説明 する。

代表的なリポソーム処方物の皮膚毒性について試験した。ステアリルアミンを含 むリポソーム処方物（ポジティブにチャージされたリポソーム）のみが、３日間 、毎日２回の投与で、わずかな赤味を帯びた。ニュートラル及びネガティブにチ ャージされたリポソーム、ＭＬＶ、ＬＵＶ又はＤＲＶでは、全くないか又は非常 にわずかの赤味を帯びた。炎症の程度は、リポソームのタイプ（Ｍ　Ｌ　Ｖ、Ｌ ＵＶ又はＤＲＶ）とは無間係で、脂質の構成に関係した。ステアリルアミン及び 他のポジティブチャージ物質、１なわち第四アンモニウム化合物が皮膚炎症性で あることは以前に報告されており、従って、これら炎症を見い出したことは、お どろくべきことではない。

ＦＩＧ、ｉ 接種後の日数 接種後の日数 ＦＩＧ、３ 接種後の日数 接種後の日数 ＦＩＧ、５ 接種後の日数 ＦＩＧ、７゜ 接種後の日数 手続補正書 平成３年８月２８日

Claims (22)

【特許請求の範囲】
1. １．通常はほとんどまたは全く皮膚を透過しないペプチドまたはタンパク質をリ ボソーム被嚢した局所用組成物。
2. ２．該リポソームが脱水／水補給法によって製造される請求の範囲１記載の局所 用組成物。
3. ３．該リボソームが、通常はほとんどまたは全く皮膚を透過しないペプチドまた はタンパク質が経皮的に角質層を通ってその下の目標組織まで浸透することを可 能ならしめる請求の範囲２記載の局所用組成物。
4. ４．該リポソームが陰性に荷電している請求の範囲３記載の組成物。
5. ５．該ペプチドが９００乃至５００００の分子量を有している請求の範囲４記載 の組成物。
6. ６．該ペプチドがインターフェロン、ホルモン、酵素、免疫刺激剤からなる群か ら選択される請求の範囲５記載の組成物。
7. ７．該ペプチドがインターフェロンである請求の範囲６記載の組成物。
8. ８．該ペプチドがホルモンである請求の範囲６記載の組成物。
9. ９．該ペプチドが免疫刺激剤である請求の範囲６記載の組成物。
10. １０．リポソーム脂質が卵レシチン、コレステロール、フォスファチジルセリン 、ジミリストイル、フォスファチジルコリン、セラミド、パルミチン酸、硫酸コ レステリルからなる群から選択される請求の範囲６記載の組成物。
11. １１．該リポソームが卵レシチン、コレステロールおよびフォスファチジルセリ ンおよび場合によりα−トコフェロールを含んでいる請求の範囲１０記載の組成 物。
12. １２．卵レシチンとコレステロールとフォスファチジルセリンのモル比が２：１ ：０．３３である請求の範囲１０記載の組成物。
13. １３．該リポソームがジミリストイルフォスファチジルコリンとコレステロール とフォスファチジルセリンとを含む請求の範囲１０記載の組成物。
14. １４．ジミリストイルフォスファチジルコリンとコレステロールとフォスファチ ジルセリンのモル比が２：１：０．３３である請求の範囲１３記載の組成物。
15. １５．該リポソームがセラミドとコレステロールとパルミチン酸と硫酸コレステ リルとを含む請求の範囲１０記載の組成物。
16. １６．セラミドとコレステロールとパルミチン酸と硫酸コレステリルのモル比が ４：２．５：２．５：１である請求の範囲１５記載の組成物。
17. １７．該ペプチドがインターフェロンである請求の範囲１２記載の組成物。
18. １８．該ペプチドがインターフェロンである請求の範囲１４記載の組成物。
19. １９．該ペプチドがインターフェロンである請求の範囲１６記載の組成物。
20. ２０．ウイルス病の処置方法において、脱水／水補給法によって製造されたリポ ソーム内に破嚢された抗ウイルスペプチドまたはタンパク質の治療学的有効量を 処置を必要とする患者に局所的に投与することよりなる方法。
21. ２１．該抗ウイルス化合物がインターフェロンである請求の範囲１８記載の方法 。
22. ２２．リポソーム被嚢されたペプチドの局所用組成物の製造方法において、 （ａ）空の超音波破壊されたリポソームを製造し、（ｂ）該リポソームをペプチ ドまたはタンパク質の溶液と混合し （ｃ）該ペプチドまたはタンパク質を該リポソームの中に包嚢し （ｄ）該リポソームを脱水し、 （ｅ）該リポソームに再び水を補給する工程を包含する方法。