JPH05506578A - 変性ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ殺虫性結晶タンパク質遺伝子及びそれらの植物細胞中での発現 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 変性ＢＡＣＩＬＬＵＳ　ＴＨＬＩＲＩＮＧＩＥＮＳＩＳ殺虫８タンパ　び　れら の　−ｌ虫二９１１または殺虫性部分をコードする変性Ｂｔ遺伝子（“変性Ｂｔ ＩＣＰ遺伝子″）に係わる。変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて形質転換された植 物は、それによってコードされる工ＣＰの発現レベルがより高く、優れた耐虫性 を示し得る。

先五血１遣 植物遺伝子工学技術は二二１０年の間に著しい進歩を遂げた。外来遺伝子を植物 中に安定して導入することができるようになった。これは、現代農業にとってす ばらしい機会を提供している。植物病原体Ｎに立立立且工至エユ１ｍ　ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドの誘導体は、外来遺伝子を植物及び植物細胞中 に導入するのに有効であり、極めて融通性のあるビヒクルであることが立証され ている。更に、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、花粉仲介 遺伝子移送及び粒子ガン（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ｇｕｎ）技術といった種々の遊離 ＤＮＡ送達法がこの目的のために開発されている。

遺伝子工学による植物形質転換の主目的は作物の改良である。初期には、耐弧性 のような有効な性質を植物中に作り出すことに研究の焦点がおかれていた。この 点でトランスジェニック植物において耐弧性を作り出すことは、Ｂｔ株由来のＩ ＣＰをコードする遺伝子を使用すること（Ｖａｅｃｋら、１９８７）により進歩 した。Ｂｔ株は、幼虫に対して特異的に毒性を示す結晶タンパク質からなるバラ 胞子結晶＜ｐａｒａｓｐｏｒａｌ　ｃｒｙｓｔａｌ）を生成する胞子形成グラム 陽性細菌である。Ｂｔ　ＩＣＰは特異的な殺虫スペクトルを有し、他の動物及び ヒトに対しては毒性を示さない（Ｇａｓｓｅｒ及びＦｒａｌｅｙ、１９８９）。

従って、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は植物工学（ｐｌａｎｔｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ） に極めて適している。

２０年以上にわたり、Ｂｔ結晶胞子調製物は生物殺虫剤として使用されている。

しかしながらＢｔスプレーの一般使用は、生産コストが高いことや、結晶タンパ ク質は圃場に暴露されたときに不安定であることによって制限されている（Ｖａ ｅｃｋら、１９８７）、Ｂｔ株の異種も十分に報告されており、鱗翅類（Ｌｅｐ ｉｄｏｐｔｅｒａ）（Ｄｕｌｍａｇｅら、１９８１）、双翅１（Ｄｉｐｔｅｒａ ）（Ｇｏ　ｌｄｂｅｒｇ及びＭａｒｇａｌ　ｉｔ、１９７７）及び甲虫類（Ｃｏ １ｅｏｐｔｅｒａ）（Ｋｒｉｅｇら、１９８３）に対して活性の株が記載されて いる。

Ｂｔ株は胞子形成のときに内因性結晶を産生ずる。幼虫によって摂取されると、 この結晶は昆虫牛腸のアルカリ性環境中で溶解して毒素前駆体（ｐｒｏｔｏｘｉ ｎ）を生じ、次いでこれがタンパク質分解して毒性コアフラグメント、即ち６０ 〜７０ｋＤａの毒素に変換される。毒素は牛腸上皮細胞の溶解を惹起する。Ｂｔ 　ＩＣＰの特異性は、昆虫の牛腸上皮に存在する高親和性結合部位との相互作用 によって判定することができる。

Ｂｔ　ＩＣＰの同定並びにＢｔ　ＩＣＰ遺伝子のクローニング及び配列決定はＨ ２５ｆｔｅ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ（１９８９）によって総説されている。ＢｔＩ ＣＰ遺伝子は多数の共通の特性を有している。それらは通常は、６０±１０ｋＤ ａの毒素フラグメントを含む１３０ｋＤａ〜１４０ｋＤａまたは約７０ｋＤａの 殺虫性タンパク質をコードする（Ｈ６ｆｔｅ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ、１９８９） 、ＢｔＩＣＰ遺伝子は、構造的類似性及び殺虫スペクトルに従つて４つの主要グ ループ、即ち、鱗翅類特異的遺伝子（ＣｒｙＩ）、鱗翅類及び双翅類特異的遺伝 子（Ｃｒ　ｙ　ＩＩ）、甲虫類特異的遺伝子（Ｃｒ　ｙ　ＩＮ）及び双翅類特異 的遺伝子（Ｃｒｙ　ＩＶ）に分類されている（Ｈ６ｆｔｅ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ 。

１９８９）、鱗翅類特異的遺伝子（Ｃｒ　ｙ　Ｉ　）は全てが１３０〜１４０ｋ Ｄａのタンパク質をコードする。これらのタンパク質は通常は毒素前駆体として 合成される。毒性領域は毒素前駆体のＮ末端半分内に位置している。ＩＩ！つか のＣｒｙｌ遺伝子の欠失分析により、毒素前駆体の３′部分は毒性に必ずしも必 要ではないことが確認されている（Ｓｃｈｎｅｐｆら、１９８９）、ＣｒｙＩＩ 遺伝子は６５ｋＤａのタンパク質をコードする（Ｗ　ｉ　ｄ　ｎ　ｅ　ｒ及びＷ ｈｉｔｅＩｅｙ、１９８５）。Ｃｒ　ｙ　ＩＩＡタンパク質は鱗翅類及び双翅類 の両方に対して毒性を示すが、Ｃｒ　ｙ　ＩＩＢタンパク質は鱗翅類の昆虫のみ に毒性を示す。甲虫類特異的遺伝子（Ｃｒ　ｙ　ＩＩＩ）は通常は分子量約７０ ｋＤａを有するタンパク質をコードする（Ｗｈｉｔｅｌｅｙ及びＨ６ｆｔｅ、１ ９８９）、Ｅ、ｃｏ　ｌ　ｉ中で発現される対応遺伝子（Ｃｒ　ｙ　ＩＩＩＡ　 ）は、コロラドハムシ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ　ｐｏｔａｔｏ　ｂｅｅｔｌｅ）に対 して毒性を示す７２ｋＤａのタンパク質の合成を誘起する。この７２ｋＤａのタ ンパク質は、最初の５７個のＮ末端アミノ酸を切り離す胞子随伴の細菌プロテア ーゼによって６６ｋＤａのタンパク質にプロセッシングされる（Ｍｃ　Ｐｈｅｒ ｓｏｎら、１９８８）、欠失分析から、このタイプの遺伝子は、毒性を失わせる ことなく３゛末端で切除することはできないことが判った（Ｈｉ；ｆｔｅ及びＷ ｈｉｔｅｌｅｙ、１９８９）、最近、１３０ｋＤａのタンパク質を産生ずる抗甲 虫株が報告された（欧州特許出願（“ＥＰＡ”）第８９４００４２８．２号）、 ＣｒｙＩＶクラスの結晶タンパク質遺伝子は、異種の双翅類特異的結晶タンパク 質遺伝子グループからなる（Ｈ６ｆｔｅ及びＷｈ　ｉ　ｔｅ　ｌ　ｅｙ、１９８ ８）。

Ｂｔ　ＩＣＰを使用することにより耐弧性トランスジェニック作物を生産し得る 可能性が示されている（Ｖ　ａ　ｅ　ｃｋら、１９８７；Ｆｉｓｃｈｏｆｆら、 １９８７；及びＢａｒｔｏｎら、１９８７）、）ランスジェニック植物は重要な 代替物を与え、安全であり、環境に容認され且つコスト面で効率的である、農業 における全く新規の昆虫制御方法を提供する（Ｍｅｅｕｓｅｎ及びＷａｒｒｅｎ 、１９８９）、昆虫制御は圃場条件下で成功している（Ｄｅｌａｎｎａｙら、１ ９８９；Ｍｅｅｕｓｅｎ及びＷａｒｒｅｎ、１９８９）。

全てのケースで、ｍ物中でキメラＢｔ　ＩＣＰ遺伝子を発現させるためにはＡ　 ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ仲介遺伝子の移入が使用されている（Ｖ　ａ　ｅ　ｃ　 ｋら、１９８７．Ｂａｒｔｏｎら、１９８７；Ｆｉｓｃｈｏｆｆら、１９８７） 、Ｂｔ　ＩＣＰは、植物細胞中で遺伝子発現を誘起し得る強力なプロモーターの 制御下に置かれる。しかしながら、截形遺伝子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｇｅｎｅ ｓ）を使用すると植物細胞中での発現レベルが、昆虫駆除レベルのＢｔＩＣＰ遺 伝子を得るのに十分に高くなることには注目する必要がある（Ｖ　ａ　ｅ　ｃ　 ｋら、１９８７；Ｂａｒｔｏｎら。

１９８７）、全長Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むトランスジェニック植物は昆虫駆除 活性を生成しない、更にＢａｒｔｏｎら（１９８７）は、全Ｂｔ　ＩＣＰコーデ ィング配列で形質転換されたタバコｃａｌｌｉが壊死することも示した。これら の結果は、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子が、植物において有意な発現レベルを得るために 解消せねばならない異例の問題を与えることを示している。植物の形質転換に截 形Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を使用したとしても、トランスジェニック植物において得 られるＢｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡの定常状態レベルは、マーカーとして使用される 隣接のＮＰＴＩＩ遺伝子及び他のキメラ遺伝子によって産生されるレベルと比較 して極めて低い（Ｂ　ａ　ｒ　ｔ　ｏ　ｎら、１９８７：Ｖａｅｃｋら。

１９８７）、更にＢｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡはノーザンプロット分析によって検出 することができない、同様の知見がＦｉｓｃｈｏｆｆら（１９８７）によっても 見いだされており、彼らは、Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡレベルは、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターから発現されるキメラ遺伝子で期待されるよりもはるかに低いこと を報告した。即ち、ｂｔ　ｍＲＮＡの細胞質内蓄積、つまり、植物細胞中での該 ｍＲＮＡの合成及び蓄積、これによるＢｔ　ＩＣＰタンパク質の発現は極めて非 効率的である。これとは対照的に、微生物においては、截形Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子 は全遺伝子よりも好ましくないことが示されており（Ａ　ｄ　ａ　ｎ　ｇら、１ ９８５＞、これは、非効率的な発現が単に植物中でのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子の異穫 発現のみに関係しているにすぎないことを示している。

植物細胞において有意なりｔ　ＩＣＰ発現レベルを得る問題は、Ｂｔ　ｒｃＰ遺 伝子に固有の本質的な問題であると考えられる。更に、植物細胞において発現レ ベルが比較的低いことは、全てのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子に共通の現象であるらしい 。

真核細胞において遺伝子発現を制御し得る段階は６つあることが公知である（Ｄ ａｒｎｅ　１１．１９８２）：１）転写制薄； ２　）ＲＮ　Ａプロセッシング制御； ３）ＲＮＡ輸送制御； ４　）ｍ　ＲＮ　Ａ分解制５９（ｍＲＮＡ　ｄｅｇｒａｄａ−ｔｉｏｎ　ｃｏｎ ｔｒｏｌ）； ５）ｌ！訳制御；及び ６）タンパク質活性制御。

全ての遺伝子において、転写制御は最も重要であると考えられる（Ｔｈｅ　Ｍｏ １ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ　１１．１９８９＞。

欧州特許出願公開（“ＥＰ”）第３８５．９６２号及び第３５９．４７２号には 、植物細胞中での発現を向上するためにＢｔ　ＩＣＰ遺伝子のコドン用途（ｃ　 ｏ　ｄ　ｏ　ｎ　ｕ　ｓ　ａｇｅ）を変更する試みが報告されている。しかしな がら、コドン用途の大規模なく即ち非選択的な）変更は遺伝子牛に調節シグナル を導入し、それによって遺伝子発現の上記６段階のうちの１つ以上に問題を惹起 し、Ｍ物細胞中での変性外来遺伝子の転写及び／または翻訳を阻害または妨害し 得る。例えば、コドン用途の変更によってｍＲＮＡの産生率に差が生じ、このよ うに生成されたｍＲＮＡを（例えばリポソームで保護されていないｍＲＮＡ領域 を細胞質酵素による攻撃及び分解に暴露することにより）不安定にする。

コドン用途の変更は更に、このように変性された遺伝子においてＲＮＡのポリメ ラーゼＩＩ伸長の阻害または停止を不注意にもたらし得る。

１皿五Ｊ１ 本発明によれば、外来遺伝子を用いて形質転換される植物細胞中でのその発現の レベル及び／または割合が、該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの核内生成 率及び／またはレベルによって制限される外来遺伝子、特にＢｔ　ＩＣＰ遺伝子 を変性する方法が提供され、該方法は、そのままではｍＲＮＡの転写、核内蓄積 及び／または核外移行、特に転写、とりわけ植物細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩ による転写伸長を抑制（即ち阻害または妨害）する核内事象を直接的または間接 的に惹起する遺伝子の複数の翻訳コドンにおいて、アデニン及びチミン配列を、 同じアミノ酸をコードする対応のグアニン及びシトシン配列に変更するステップ を含む、アデニン及びチミン配列は、そのままでは転写の際に、遺伝子の別の隣 接上流（即ち５’１ｌｌ）領域と比較してＲＮＡポリメラーゼＵの割合が相対的 に低い遺伝子の１つ以上の領域にある翻訳コドンにおいてシトシン及びグアニン 配列に変更されるのが好ましい。

更に本発明によれば、上記方法で得られた変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子が提供される 。

更に本発明によれば、植物細胞ゲノムを少なくとも１種の変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝 子を用いて形質転換することにより、植物の害虫に対する耐性を向上する方法が 提供される。

本発明は更に、操作可能なように連結されるＤＮＡフラグメント、即ち： １）変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子； ２）植物細胞において変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の転写を誘起するのに適したプロ モーター； ３）植物細胞において変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を発現させるのに適した、転写物 ３′末端形成シグナル及びポリアデニル化シグナル を同じ転写単位内に含み、植物細胞と形質転換するのに使用できるキメラ遺伝子 にも係わる。

本発明は更に下記のものにも係わるニ ーその核ゲノムが、好ましくは安定に組み込まれた変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子、特 にキメラ遺伝子を含むように形質転換された植物細胞； 一上記植物細胞からなる４Ｍ胞培養体；−そのゲノムが変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子 、特にキメラ遺伝子を含み向上された耐虫性を示す、上記形質転換植物細胞から 再生された植物またはこのように再生されたＭ物から産生された植物； 一上記植物の種子；及び 一植物細胞の核ゲノムを変性Ｂｔ　ｒｃＰ遺伝子、特にキメラ遺伝子を用いて安 定に形質転換するためのベクター。

免豆五■１ 本明細書において“Ｂｔ　ＩＣＰ”とは、殺虫活性を有し、Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　 １ｅｎｓｉｓによって実際に産生され得る無傷のタンパク質またはその一部分で あると理解されたい、Ｂｔ　ＩＣＰは毒素前駆体、及び結晶である必要もなく天 然タンパク質である必要もない毒素前駆体の活性毒素または他の殺虫性截形部分 であり得る。ＢｔＩＣＰの例はＢｔ２殺虫性結晶タンパク質（Ｈ８ｆｔｅら、１ ９８６）、並びに、トリプシン切断部位に向がってＣ末端及び／またはＮ末端で 切断され、好ましくは分子量６０〜８０ｋＤａを有する殺虫性部分である。Ｂｔ 　ＩＣＰの他の例としては、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９０／１５１３９号及びＷ○９ ０１０９４４５号、Ｈ６ｆｔｅ及びＷｈｉｔｅｌｅｙ（１９８９＞及び欧州特許 出履第９０４０３７２４．９号に記載の、Ｂｔ２、Ｂｔ３、Ｂｔ４、Ｂｔ１３、 Ｂｔ１４、Ｂｔ１５、Ｂｔ１８、Ｂｔ２１、Ｂｔ２２、Ｂｔ７３、Ｂｔ２０８、 Ｂｔ２４５、Ｂｔ　Ｉ　２６０及びＢｔ１１０９Ｐを挙げることができる。

本明細書において“毒素前駆体（ｐｒｏｔｏｘｉｎ）”とは、Ｂｔ　ＩＣＰをコ ードする全長遺伝子の一次翻訳産物であると理解されたい。

本明細書において“毒素（ｔｏｘｉｎ）”または“活性毒素＜ａｃｔｉｖｅ　ｔ ｏｘｉｎ）″または“毒性コア（ｔ　ｏ　ｘｉｃ　ｃｏｒｅ）”とは、プロテア ーゼ（例えばトリプシン）切断によって得ることができ且つ殺虫力を有する毒素 前駆体の部分であると理解されたい。

本明細書において“截形Ｂｔ遺伝子（ｔ　ｒ　ｕ　ｎ　ｃ　ａ　ｔ　ｅｄ　Ｂｔ 　ｇｅｎｅ）”とは、Ｂｔ　ＩＣＰの少なくとも毒性部分、好ましくは毒素をコ ードする全長Ｂｔ遺伝子のフラグメントであると理解されたい。

本明細書において“変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子”とは、Ｂｔ　ＩＣＰをコードし、 且つ、Ｂｔ　ＩＣＰの元のアミノ酸配列に影響することなくＤＮＡ配列の１つ以 上の領域で、好ましくは３つ以上のコドンにおいてアデニン（“Ａ”）及びチミ ン（Ｔ”）がグアニン（Ｇ”）及びシトシン（“Ｃ”）に変更されているＤＮＡ 配列であると理解されたい。

ＤＮＡ配列の２つ以上の領域、特に３つ以上の領域において、３つ以上のコドン 内のＡ及びＴがＧ及びＣに変更されているのが好ましい、ＤＮＡ配列の翻訳開始 部位より下流の領域においては、約１０個以上のコドン、特に約３３個以上のコ ドンのＡ−ＴがＧ−Ｃに変更されているのが好ましい。

変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の“領域”とは、植物中での該遺伝子の発現に影響する ３つ以上の翻訳コドンをコードする任意の配列を意味する。

本発明によって、ｍＲＮＡの代謝回転研究によって、互（ユ、ｂｔ１４、ｂｔ１ ５及びｂｔ１８のようなりｔ　ｒＣＰ遺伝子の発現系は植物細胞中の核レベルで 特異的に阻害されることが判明した。別の分析においては、核ランオンアッセイ （ｎｕｃ　１ｅａｒ　ｒｕｎ　−ｏｎ　ａｓｓａｙ）においてトランスジェニッ クタバコ植物、即ちＮ２３−２２０（Ｖａｅｃｋら、１９８７）の核を使用し、 キメラＢｔＩＣｐＨ［ｌ遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体 の分布及び相対効率を決定した。この点に関して言えば、ランオンアッセイは、 最初は、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の転写を開始するＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体の 相対効率を測定するのに使用され、その後、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子におけるＲＮＡ ポリメラーゼＩＩ結合体の相対分布及び移動効率を測定するのに使用されるよう になった。

Ｎ２３−２２０はキメラ遺伝子として、ＴＲ２’プロモーターの制御下にｂｔ８ ８４フラグメントを含む、Ｂｔ８８４は、ｂｔ２遺伝子（Ｈｉｘｉ　ｆ　ｔ　ｅ ら、１９８６）のコドン６１０までの５゛フラグメント（Ｖ　ａ　ｅ　ｃ　ｋら 、１９８７）である、核ランオン分析を使用し、Ｎ２３−２２０の単離様を高度 に標識した放射性ＲＮＡ前駆体と一緒にインキュベートすると、このとき合成さ れたＲＮＡ転写物は放射性標識された。細胞内の転写作用で捕捉されたＲＮＡポ リメラーゼ１１分子はｉｎ　ｖｉｔｒｏで同じＲＮＡ分子の伸長を続ける。

Ｎ２３−２２０培養体の核の核ランオンアッセイ（非誘導細胞ＴＲ１’−ｎｅｏ 及び誘導細胞ＴＲ２’−ｂｔ８８４）は、ＴＲ１″及びＴＲ２°プロモーターか らの転写はおおよそ同等に有効であることを明らかにした。これは、ＢｔＩＣＰ （即ちＢｔ８８４）発現レベルの低さは、ＴＲ２’プロモーターの転写活性が特 に低いからでないことを示唆している。しかしながらＮ２３−２２０核について の核ランオン分析は、新生の（ｎａｓｃｅｎｔ）Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡの転写 伸長が、転写開始部の下流の７００〜１０００ヌクレオチドのどこかで損なわれ ることを示した。これは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩはＢｔ　ＩＣＰコーディング 配列を１００％の効率では転写し得ないことを意味する。この領域に広がる標識 Ｂｔ　ＤＮＡフラグメントとタバコ核から調製したタンパク質抽出物とを使用す るフィルター結合アッセイから、このＤＮＡ領域が核中に存在するタンパク質と 特異的に相互作用することが明らかとなった。かかる相互作用は、ＤＮＡポリメ ラーゼＩＩによる転写がこの領域を通して伸長するのを妨害するかまたはこれに 影響する第一の候補事象であるにの領域を変性して特異的タンパク質結合と消去 することにより、Ｂｔ　ＩＣＰ発現レベルは増大する。しかしながらこの領域に おける伸長妨害に作用する他の機構は除外することはできない。

更に本発明では、細胞質Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡレベルの抑制に関与するコーデ ィング領域内の配列を欠失分析によって同定した。このために、ｐＶＥ３６の欠 失誘導体を２４個楕築した。３種の主要タイプの欠失突然変異株を構築した（図 ３参照）ニ ー５′末端欠失体 一３°末端欠失体 一中闇部欠失体。

突然変異ハイブリッドｂｔ２−ｎｅｏ遺伝子（Ｂ　ｔ　２　（Ｈｄｆｔｅら、１ ９８６）及びＮＰＴＩＩの融合タンパク質をコードするもの）の発現を、参照と してｃａｔ遺伝子を使用する一時的発現実験（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ　ｅｘｐｒｅ ｓｓｉｏｎ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）によって調査した。このために、ＳＲＩ 原形質体のＲＮＡ抽出物において測定した。工且至及びｃａｔ　ｍＲＮＡの比を 使用して、穫々の構築物によって産生されたｍユ転写物（即ちｍＲＮＡ）レベル を相対的に定量化した。かかる実験により、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列のカ ルボキシ末端（即ち３°）部分またはアミノ末端（即ち５°）部分を順次欠失す ると旦」ト３一旦」−転写レベルを次第に増加する結果となることが判った。更 に、転写レベルの変化はそれほど急激ではないので、かかる結果から、Ｂｔ　Ｉ ＣＰ遺伝子によって産生される転写レベルの低さは単一因子によって制御される ものではないことが判る。しかしながら、ｂｔ２コーディング配列の個々の変性 は、転写物伸長、核内蓄積及び核外移行段階で、植物細胞においてＢｔ　ＩＣＰ 遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの発現の妨害及び／または阻害を著しく低 下し得る。更に変性はかかるｍＲＮＡ細胞質調節及び代謝並びにそれらの翻訳に 影響し得る。

欠失分析は明らかに、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング領域内に位置する幾つかの中間 配列がＢｔ　ＩＣＰ発現の抑制に関与し得ることを示した６例を挙げると、ｂｔ ２遺伝子において、Ｂｔ　ＩＣＰ発現の抑制に関与するヌクレオチド位Ｍ６７４ からヌクレオチド位置１０００の間に位置する３２６ｂＰの領域（図６）、特に ヌクレオチド位置７３３から１０００の間に位置する２６８ｂｐ、とりわけ、動 物系においてＤＮＡポリメラーゼＩＩによる転写伸長効率の低下及び停止を惹起 し得ることが知られている２つの完全なＣＣＡＡＴボックス（Ｃｏｎｎｅｌｌｙ 及びＭａｎｌｅ３／。

１９８９）を有する、ヌクレオチド位置７６５〜７９４に位置する２９ｂｐの領 域が同定された。この中間遺伝子フラグメント、即ち阻害ゾーン自体は、Ｂｔ　 ＩＣＰ発現レベルを低下するか、または発現を阻害もしくは妨害する他のゾーン と直接的もしくは間接的に相互作用する複数の阻害ゾーンを含む、この阻害ゾー ンのコドン用途を第２ステツプにおいて、アミノ酸配列に影響することな（Ａ− ＴをＧ−Ｃに置き換えることにより変性した。この点に関して言えば、３２６ｂ ｐの中間フラグメント（図６ｂ）を、５９個の変性コドンを含む本発明の変性Ｂ ｔ　ＩＣＰフラグメントで置き換えた。Ｂｔ　ＩＣＰ発現に及ぼす上記阻害ゾー ンのこのような変性の効果を、一時的な及び安定な両植物形質転換体において評 価した。結果は、このようなコドン用途の変更は、Ｂｔ　ＩＣＰ発現レベルを有 意に増加し、従って耐虫性を向上することを示しな。

更に、Ｎ末端の最初の２８個のアミノ酸を欠失することにより、坦１ユ遺伝子の Ｎ末端欠失突然変異体が作製されている（Ｈｉ：１ｆｔｅら、１９８６）、ｂｔ ２遺伝子において最初の２８個のコドンは、毒性を損失することなく欠失し得る ことが知られている（Ｈ６ｆｔｅら、１９８６；Ｖａｅｃｋら、１９８７＞、更 に、２９〜３１番目の３つのコドンの用途を、本発明に従ってアミン酸配列に影 響することなくＡ−ＴをＧ−Ｃに置き換えることにより変更した。

更に、図６ａに示したＪｏｓｈｉ（１９８７）のコンセンサス配列に基づいて最 適翻訳開始（ＡＴＧ）部位を作製した。

この変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて形質転換された植物は著しく高いＢｔ　Ｉ ＣＰ発現レベルを示す。

本発明によって、本発明の変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の全部または一部は植物ｍ胞 の核ゲノム中に通常の方法で安定に挿入することができ、このように形質転換さ れた植物細胞を使用して、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の発現が向上したトランスジェニ ック植物を生産することができる。この点に関して言えば、Ａ　ｒｏｂａｃｔｅ ｒｉｕｍ（例えばＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中の変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を 含む失効（ｄ　ｆ　ｓａｒｍｅｄ）Ｔｉプラスミドを使用し、例えば欧州特許出 願公開第１１６，７１８号及び欧州特許出願公開第２７０．８２２号、ＰＣＴ出 願公開第８４１０２９１３号、欧州特許出願第８７４００５４４．０号及びＧｏ ｕｌｄら（１９９１）に記載の方法によって、植物細胞を形質転換することがで きる（上記文献は参照により本明細書の一部を構成するものとする）、好ましい ＴｉプラスミドベクターはＴｉプラスミドのＴ−ＤＮＡの境界配列間または少な くとも右側境界配列の左方に外来ＤＮＡ配列を含む。

勿論、他のタイプのベクターを使用して、直接遺伝子移入（例えば欧州特許出願 公開第２３３．２４７号に記載のものン、花粉仲介形質転換（例えば欧州特許出 願公開第２７０，３５６号、ＰＣＴ出願公！ＷＯ８５１０１８５６号及び米国特 許第４．６８４，６１１号に記載のもの）、植物ＲＮＡウィルス仲介形質転換（ 例えば欧州特許出願公開第６７．５５３号及び米国特許第４，４０７，９５６号 に記載のもの）、リポソーム仲介形質転換（例えば米国特許第４．５３６．４７ ５号に記載のもの）、及び所定のトウモロコシ系を形質転換するための最近記載 された方法（Ｆｒｏｍｍら、１９９０　；Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍら、１９９０ ）のような他の方法によって、植物細胞を形質転換することもできる。

変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は、植物ゲノム中の、植物細胞において遺伝子の発現を 誘起し得るプロモーターの下流に、つまりこのプロモーターの制御下に挿入する のが好ましい。

好ましいプロモーターとしては、限定的ではないが、カリフラワーモザイクウィ ルスの強力な構成的３５Ｓプロモーター（Ｏｄｅｌｌら、１９８５）を挙げるこ とができ、３５Ｓプロモーターは種々の単離体から入手されている（Ｈｕｌ］及 びＨｏｗｅｌ　ｌ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　８６．４８２−４９３（１９８７））、 他の好ましいプロモーターとしてはＴＲＩ’プロモーター及びＴＲ２°プロモー ター（Ｖｅｌｔｅｎら、１９８４）を挙げることができる。或いは、構成的なも のではなくて１種以上の組織または器官に特異的なプロモーターを使用すること もできる０例えば、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は、欧州特許出願第８６３００２９ １．１号に記載のごときリブロース−１，５−ホスフェート−カルボキシラーゼ の小サブユニット遺伝子のプロモーターのような光誘導性プロモーターの制御下 に該遺伝子を置くことにより、植物の緑色組織中で選択的に発現させることがで きる。別の方法としては、温度または化学的因子によってその発現が誘導可能な プロモーターを使用することがあ変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は、オクトビンシンタ ーゼ遺伝子（Ｇｉｅｌｅｎら、１９８４）またはＴ−ＤＮＡ遺伝子７（Ｖｅｌｔ ｅｎ及び５ｃｈｅ　ｌ　ｌ、１９８５＞の３′非翻訳末端のような適当な３°転 写調節シグナル（即ち転写３゛末端形成シグナル及びポリアデニル化シグナル） の上流に挿入されるのが好ましい。

得られる本発明の形質転換植物は変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子発現が向上しており、 従って高いレベルのＢｔ　ＩＣＰの産生を特徴とする。このような植物は通常の 育成スキームに使用して、同じ優れた耐虫性を有するより多くの形質転換植物を 生産したり、同じまたは近縁の植物種の他の変種に変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を導 入することができる。形質転換植物から得られる種子は、変性Ｂｔ　ＩＣＰを安 定なゲノム挿入物として含んでいる。

更に、２種の非競合的結合の、抗鱗翅類または抗甲虫類Ｂｔ　ＩＣＰをコードす る少なくとも２種の変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を植物発現ベクター中にクローニン グすることもできろく欧州特許出願第８９４０１４９９．２号〉、このようなベ クターを用いて形質転換された植物は、２種以上の変性Ｂｔ　ｒｃＰ遺伝子の同 時発現を特徴とする。得られるトランスジェニック植物は、植物に摂食昆虫のＢ ｔ　ＩＣＰ耐性の発生を防止または遅延させるのに特に有効である。

以下の実施例は本発明を説明するものであり、本発明の範囲を制限するものでは ない、実施例において参照する図面は下記の通りである。

図１−−　Ｎ２３−２２０の核中のＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体の転写開始頻 度の比較、標識したｌＬ１ユ」ｍＲＮＡ及びＢｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡとサテンプ ロット上に存在するそれらの相補的ＤＮＡとのハイブリダイゼーション効率を比 較した。ＤＮＡフラグメントは、プラスミドｐＧＳＨ１６３を消化することによ り得た。この領域の概略図を与える。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター上にプロット したフラグメントの長さく１）、プラスミドｐＧｓＨ１６３上の同種遺伝子（２ ）及びデンシトメーター値（３）は下記の通りである： 消化物＝　１　２　３ ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ　２３５８　ｎｅｏ　１２３８６１５４Ｕヱ　− 図２ａ−−Ｎ２３−２２０の核中のＢｔＩＣＰ：Ｉ−ディング配列上のＲＮＡポ リメラーゼＩＩ結合体の分布の測定。核ランオンによって調製した標識ＲＮＡと Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列のＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーショ ンを定量化した。制限フラグメント及び走査値を表及び図面に与える。走査値は “Ｘ”、ＤＮＡフラグメントのサイズ、及びＲＮＡフラグメントハイブリダイジ ング当たりのＵＴＰ数に比例する。“Ｘ”は、ＤＮＡフラグメントを通るＲＮＡ ポリメラーゼの数に正比例する。“Ｘ”は、走査値をＵＴＰ数で割った値に比例 する０種々の制限フラグメントのＸ値を図に示す、この点に関して言えば、ハイ ブリダイズしたＲＮＡに相補的なりＮＡフラグメント中に存在するｄＡＴＰの数 値を正規化することにより、種々のデンシトメーター値を相対ハイブリダイゼー ション効率に変換して値“Ｘ”を得た。“Ｘ”は、転写物の数及び伸長の長さの 相対尺度である。“ｘ″は、特定のＤＮＡ配列を転写するＲＮＡポリメラーゼの 数及びそれらの伸長率に反映される。植物ベクターｐＧｓ８１６３のプラスミド ＤＮＡのサザン消化物に存在するＤＮＡフラグメントの各々は、下記のようなＨ ｙｂｏｎｄ−Ｎフィルター上にプロットしたフラグメントの長さく１）、プラス ミドｐＧＳＨ１６３上の同種遺伝子（２）及びデンシトメーター（ｉ！（３）を 有する。

消化物：　１　２　３ Ｂａｓ＋Ｈｒ／ＥｃｏＲＩ　８８７７　ｎｅｏ　１５３３３７２６　川（Ｚ）　 ２９２６ ５８３　■罎３）　６３５ ２７１　穎（１）− ＢａｍＨＩ／ＥｅｏＲＶ　８８８７　ｎｅｏ　１５１８２８４　匡　２４６６ ７２９　匡　１１０ｌ １０２Ｂａ／ＨｉｎｄｌｌＩ　６２５０　−　−２３５８　ｎｅｏ　１２３８６ １６９５　圃　６５６５ ＢａｍＨＩ／５ａｃＩ　８０５３　ｎｅｏ　１４１９４１３５３　肛罎１）　４ ５７２ １０５１　■盪２）　６１５ Ｘｓｎ＋　４９７３　ｎｅｏ　１３２１９６２８Ｉユ（２）　１８１７ 図２ｂ−−Ｍ１Ｂベクターのポリリンカー、ＭＰ１８及びＭＰ１９（Ｙａｎｉｓ ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）中に挿入した９つのｂｔ８８４ＤＮＡフラグ メントの概略図。Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列はＡＵＧから１６００ヌクレオ チド下流まで示しである。ＤＮＡフラグメントの関連制限部位及びサイズも示し である。ヌクレオチド番号はＡＵＧに相対的なものである。サブクローンは図に 示したようにｐＪＤ７１、ｐＪＤ７２、ｐＪＤ７３等（ｐＪＤ７９まで）と名付 けた。挿入物は、−重鎖Ｍ１３がＢｔ　ＩＣＰコーディング配列のフラグメント をアンチセンス方向で有するような向きでＭ１３ベクター中に挿入した。

図２ｃｍ−Ｃｏｘ及びＧｏ　Ｉｄｂｅｒｄ（１９８８）によって記載されてよう なＮ２３−２２０核を用いた３種の核ランオン分析の概略図０分析は５．１０及 び３０分間実施した。標識様ＲＮＡを、ナイロン膜上に固定した５μｇの一重ｇ ｐＪＤ７１〜ｐＪＤ７９及びＭＰ１８　ＤＮＡとハイブリダイズさせた。膜をオ ートラジオグラフィー処理し、オートラジオグラムを走査することによりデンシ トメーター値を得た。横軸は、Ｂｔ（即ち則１ユ）コーディング配列のＡＵＧに 相対的なヌクレオチド位置を示している。

グラフでは各−重鎖Ｂｔ　ＤＮＡフラグメントの中央が示されている。縦軸は、 ３種のインキュベーション時間の各々においてフラグメント中のｄＡＴＰの数に 対して補正し、ｐＪＤ７１の値を１００％として調整した、各フラグメントにお ける相対ハイブリダイゼーションシグナルを与えている。全ての値は、−重ＭＭ Ｐ１８　ＤＮＡへの非特異的ハイブリダイゼーションに対して補正されている。

相対値は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによるｂｔ　ｍＲＮＡ合成の再活性化の指標 となる。アッセイは、ｍＲＮＡ伸長の数とｍＲＮＡ伸長の長さとを区別しなかっ た。

図３−一　細胞質Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡレベルに及ぼす影響を測定するための ｂｔ８６０〜ｎｅｏ遺伝子の欠失突然変異体の構築。親ベクターｐＶＥ３６を示 す。下記の欠失突然変異体を生成した。

１、ＰＪＤ５０：　ｐＪＤ５０は、ＢａｍＨＩ及び５ＰｈＩを用いて消化するこ とによりｐＶＥ３６から誘導した。５゛及び３′の突き出し末端はフレノウＤＮ Ａポリメラーゼ■酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれ を使用してＭＣ１０６１＃ｌＩ胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ”表現型 について選択した。

２、ＰＪＤ５１：　ｐＪＤ５１は、５ｐｅＩ及びｓｐｈ　Ｉを用いて消化するこ とによりｐＶＥ３６から誘導した。５′及び３′の突き出し末端はフレノウＤＮ ＡポリメラーゼＩ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれ を使用してＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ゛表現型につ いて選択した。

３、ＰＪＤ５２：　ＰＪＤ５１は、ＥｃｏＲＶ及び５ｐｈＩを用いて消化するこ とによりｐＶＥ３６から誘導した。５°及び３”の突き出し末端はフレノウＤＮ ＡポリメラーゼＩ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれ を使用してＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ”表現型につ いて選択した。

４、ＰＪＤ５３：　ｐＪＤ５３は、ＸｃａＩ及びｓｐｈ　Ｉを用いて消化するこ とによりｐＶＥ３６から誘導した。３′の突き出し末端はクレノウＤＮＡポリメ ラーゼエ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれを使用し てＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ”表現型について選択 した。

５、ＰＪＤ５４：　ｐＪＤ５４は、Ａｆ　Ｉ　Ｉ　Ｉ及びｓｐｈ　Ｉを用いて消 化することによりｐＶＥ３６から誘導した。５′及び３′の突き出し末端はクレ ノウＤＮＡポリメラーゼエ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次 いでそれを使用してＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ”表 現型について選択した。

６、ＰＪＤ５５：　ｐＪＤ５５は、Ｃ１ａＩ及び５ｐｈＩを用いて消化すること によりｐＶＥ３６から誘導した。５″及び３′の突き出し末端はフレノウＤＮＡ ポリメラーゼＩ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれを 使用してＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ゛表現型につい て選択した。

７、ＰＪＤ５６：　ｐＪＤ５６は、ＸｈｏＩ及びｓｐｈ　Ｉを用いて消化するこ とによりｐＶＥ３６から誘導した。５°及び３′の突き出し末端はフレノウＤＮ ＡポリメラーゼＩ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれ を使用してＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ゛表現型につ いて選択した。

８、ＰＪＤ５７：　ｐＪＤ５７は、Ａｆ　Ｉ　Ｉ　Ｉ及びＢａｍＨＩを用いて消 化することによりｐＶＥ３６から誘導した。５°及び３′の突き出し末端はクレ ノウＤＮＡポリメラーゼエ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次 いでそれを使用してＭＣ１０６１細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ”表 現型について選択した。

９、ＰＪＤ５８：　ｐＪＤ５８は、ＸｃａＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化するこ とによりｐＶＥ３６から誘導した。５″の突き出し末端はフレノウＤＮＡポリメ ラーゼＩ酵素を用いて充填した。処理したＤＮＡを連結し、次いでそれを使用し てＭＣ１０６４細胞を形質転換した。形質転換体をａｍｐ”表現型について選択 した。

１０、ＰＪＤ５９：　ｐＪＤ５９は、ＥｃｏＲＶ及びＢａｍＨＩを用いて消化す ることによりｐＶ Ｅ３６から誘導した。５′の突き出し 末端はフレノウＤＮＡポリメラーゼＩ 酵素を用いて充填した。処理したＤＮ Ａを連結し、次いでそれを使用してＭ Ｃ１０６１細胞を形質転換した。形質 転換体をａｍｐ”表現型について選択 した。

１１、ＰＪＤ６０：　ｐＪＤ６０は、５ｐｅＩ及びＢａｍＨＩを用いて消化する ことによりｐＶＥ ３６から誘導した。５゛の突き出し末 端はフレノウＤＮＡポリメラーゼＩ酵 素を用いて充填した。処理したＤＮＡ を連結し、次いでそれを使用してＭＣ １０６１細胞を形質転換した。形質転 換体をａｍｐ”表現型について選択し た。

１２、ＰＪＤ６１：　ｐＪＤ６１はＰＪＤ５０から誘導した。

ＰＶＥ３６をＸｂａＩを用いて消化し、クレノウボリメラーゼＩを用いて充填 した。ＰＪＤ５０をＢａｍＨＩを用い て直線化し、クレノウボリメラーゼＴ を用いて充填した。ＰＶＥ３６の３７ ５ｂｐのＸ　ｂ　ａ　’ＩフラグメントをｐＪＤ５０のＢａｍＨＩ充填物に連結 した。

連結混合物を使用してＭＣ１０６１細 胞を形質転換した。形質転換体をａｍ ρ゛表現型について選択した。

１３、ＰＪＤ６２：　ｐＪＤ６２はＰＪＤ５０から誘導した。

ＰＶＥ３６をＸｃａＩ及びＥｃｏＲＶ を用いて消化した。ＰＪＤ５０をＢａ ｍＨＩを用いて直線化し、クレノウボ リメラーゼエを用いて充填した。Ｐ■ Ｅ３６の３７５ｂｐのＸｃａＩ−Ｅｃ ｏＲＶフラグメントをｐＪＤ５０のＢ ａｍＨＩ充填物に連結した。連結混合 物を使用してＭＣ１０６１細胞を形質 転換するした。形質転換体をａｍｐ” 表現型について選択した。

１４、ＰＪＤ６３：　ｐＪＤ６３はＰＪＤ５０から誘導した。

ＰＶＥ３６をＸｃａｌ及びＥｃｏＲＶ を用いて消化した。ＰＪＤ５０をＢａ ｍＨＩを用いて直線化し、クレノウボ リメラーゼＩを用いて充填した。ＰＶ Ｅ３６の４７４ｂｚ）のＸｃ　ａ　Ｉ−ＥｃｏＲＶフラグメントをｐＪＤ５０の Ｂ ａｍＨＩ充填物に連結した。連結混合 物を使用してＭＣ１０６１細胞を形質 転換した。形質転換体をａｍｐ”表現 型について選択した。

１５、ＰＪＤ６４：　ｐＪＤ６４はＰＪＤ５０から誘導した。

ＰＶＥ３６をＥｃｏＲＩ及びＥｃｏＲ Ｖを用いて消化し、クレノウボリメラ ーゼ■を用いて充填した。ＰＪＤ５０ をＢａｍＨＩを用いて直線化し、クレ ノウボリメラーゼＩを用いて充填した。

ｐＶＥ３６の４５８ｂｐのＥｃｏＲＩ −ＥｃｏＲＶフラグメントをｐＪＤ５ ０のＢａｍＨＩ充填物に連結した。連 結混合物を使用してＭＣ１０６１細胞 を形質転換した。形質転換体をａｍｐ ゛表現型について選択した。

１６、ＰＪＤ６５：　ｐＪＤ６５はＰＪＤ５０から誘導した。

ＰＶＥ３６をＥｃｏＲＩ及びＸｂａｌ を用いて消化し、クレノウボリメラー ゼＩを用いて充填した。ＰＪＤ５０を ＢａｍＨＩを用いて直線化し、クレノ ウボリメラーゼエを用いて充填した。

ＰＶＥ３６の３２７ｂｐのＥｃｏＲＩ −ＸｂａＩフラグメントをｐＪＤ５０ のＢａｍＨＩ充填物に連結した。連結 混合物を使用してＭＣ１０６１細胞を 形質転換した。形質転換体をａｍｐ” 表現型について選択した。

１７、ＰＪＤ６６：　ｐＪＤ６６はＰＪＤ５ｏがら誘導した。

ＰＶＥ３６を５ｐｅＩ及びＸｃａＩを 用いて消化し、クレノウボリメラーゼ Ｉを用いて充填し？’、：、ＰＪＤ５０ｆ：ＢａｍＨＩを用いて直線化し、クレ ノウ ポリメラーゼエを用いて充填した。Ｐ ＶＥ３６の１０２１ｂｐの５ｐｅｌ− ＸｃａＩフラグメントをｐＪＤ５０の ＢａｍＨＩ充填物に連結した。連結混 合物を使用してＭＣ１０６１細胞を形 質転換した。形質転換体をａｍｐ”表 現型について選択した。

１８、ＰＰ５５６Ｄ１：　ＰＰ５５６Ｄ１は、ＥｃｏＲＶで消化することにより ＰＪＤ５６が ら誘導した。処理したＤＮＡを連 結し、次いでそれを使用してＭＣ １０６１細胞を形質転換した。形 質転換体をａｍｐ”表現型につい て選択した。

１９、ＰＰ５５６Ｄ２：　ＰＰ５５６Ｄ２は、ＸｃａＩ及びＡｆ　Ｉ　Ｉ　Ｉで 消化することによりＰＪＤ５６がら誘導した。５′の 突き出し末端はクレノウボリメラ ーゼエを用いて充填した。処理し たＤＮＡを連結し、次いでそれを 使用してＭＣ１０６１細胞を形質 転換した。形質転換体をａｍｐ” 表現型について選択した。

２０、ＰＰ５５６Ｄ３：　ＰＰ５５６Ｄ３ｉ、ｔ、Ｓｐｅ　Ｉ及びＥｃｏＲＶを 用いて消化すること によりＰＪＤ５６がら誘導した。

５′の突き出し末端はクレノウポ リメラーゼＩを用いて充填した。

処理したＤＮＡを連結し、次いで それを使用してＭＣ１０６１細胞 を形質転換した、形質転換体をａ ｍ　ｐ　６表現型について選択した。

２１、ＰＰ５５６Ｄ４：　ＰＰＦ；５６Ｄ４は、Ｘ　ｃ　ａ　ｒ　”Ｃ”溝”化 し且つＥｃｏＲＶで部分消化す ることによりＰＪＤ５６から誘導 した、処理したＤＮＡを連結し、 次いでそれを使用してＭＣ１０６ １細胞を形質転換した。形質転換 体をａｍｐ”表現型について選択 ２２、ＰＰ５５６Ｄ６：　ＰＰ５５６Ｄ６は、５ｐｅｌで消化し且つＥｃｏＲＶ で部分消化す ることによりＰＪＤ５６から誘導 した、５°の突き出し末端はフレ ノウポリメラーゼエを用いて充填 した、処理したＤＮＡを連結し、 次いでそれを使用してＭＣＬＯ６ １ＩＩＭ胞を形質転換した。形質転換 体をａｍｐ”表現型について選択 した。

２３、ＰＰ５５６Ｄ７：　ＰＰ５５６Ｄ７は、５ｐｅＩ及びＸｃａＩで消化する ことによりＰ ＪＤ５６から誘導した。５°の突 き出し末端はクレノウボリメラー ゼ■を用いて充填した。処理した ＤＮＡを連結し、次いでそれを使 用してＭＣ１０６１細胞を形質転 換した。形質転換体をａｍｐ”表 現型について選択した。

２４、ＰＰ５５６Ｄ８：　ＰＰ５５６Ｄ８は、Ｓｐｅ　Ｉで消化し且つＥｃｏＲ Ｖで部分消化す ることによりＰＰ５５６Ｄ２から 誘導した。５°の突き出し末端は クレノウボリメラーゼＩを用いて 充填した。処理したＤＮＡを連結 し、次いでそれを使用してＭＣｌ ０６１細胞を形質転換した。形質 転換体をａｍｐ”表現型について 選択した。

図４−一　細胞質内Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡレベルに及ぼすＢｔ　ＩＣＰコーデ ィング配列中の欠失の影響、不変旦１１参照遺伝子及び図３に記載の種々のＢｔ 　ＩＣＰ欠失突然変異体によって特定化された細胞質内ｍＲＮＡレベルを表にま とめな、測定値は相対Ｂｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡ数に変換したものである。Ｂｔ　 ＩＣＰ及びｃａｔｍＲＮＡの定量化はＣｏｒｎｅｔ　Ｌｓｓｅｎ（１９８９）に よって記載されているように行なった。全ＲＮＡをスロットプロットし、ｎｅｏ 及びｃａｔコーディング配列と相補的な放射性定量化した。

図５−−　ｐＶＥ３６の欠失誘導体によって産生された相対転写物レベル。

図６ａ−−ｂｔ２コーディング配列のＮ末端欠失並びにコドン２９．３０及び３ １の変更を導入するのに使用した合成りＮＡ配列の概略図。Ｅｎｇｌｅｒら（１ ９８８）に従ってオリゴヌクレオチド３アニーリングし、プラスミドｐＶＥ３６ のＢｓｔＸＩ制限部位中にクローニングし、ｐメントをｐＶＥ３６の１１７７ｂ ｐのＣ１ａＩ制限フラグメントに連結し、プラスミドｐＰｓＯ２８を得た。ｐＰ Ｓ０２８は、Ｎ末端の変性を除いてはＰＶＥ３６と同一である。

図６ｂ−一　ｂｔ２コーディング配列中に中間部変性を導入するのに使用した合 成りＮＡ配列の概略図、Ｅｎｇｌｅｒら（１９８８）によって記載されているよ うにオリゴヌクレオチドをアニーリングし、連結し、得られたコンカテマ−（ｃ ｏｎｃａｔｅｍｅｒｉｃ）ＤＮＡフラグメントを制限酵素ＸｂａＩ及びＥＣ０Ｒ Ｉを用いて切断し、３２７ｂｐの変性Ｘｂａｌ−ＥｃｏＲＩ制限フラグメントを 切り放した。このフラグメントを、ｐＵｃ１９のＨｉ　ｎ　ｆｉｒ（充填）Ｂａ ｍＨ１部位内にｐＶＥ３６の１５３３ｂｐのＡｆｌＩ工（充填）ＢａｍＨＩフラ グメントを有するｐＵＣ１９誘導体（Ｙａｎｉ　５ｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９ ８５）であるｐＰＳＯ２３の３５３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩフラグメント 中に連結し、プラスミドｐＰＳ○２４を得た。プラスミドｐＰｓＯ２４を、制限 酵素ＸｂａＩを用いて消化することにより直線化し、ｐ　Ｐ　Ｓ　０２３　ノ３ ７５　ｂ　ｐ　ｆ）　Ｘ　ｂａＩ制限フラグメントを導入してｐＰｓＯ２５を得 た。ｐＰＳＯ２５の１１７７ｂｐのＣ１ａＩフラグメントをｐＰＳＯ２７の７３ ６０ｂｐのＣ１ａＩ制限フラグメント中に導入し、ｐｐｓ○２９を得た。ｐＰｓ Ｏ２９はｐＶＥ３６と同一であるが、但し、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列のア ミン末端変性と中間部変性とを含んでいる。

図６ｃｍ−プラスミドＰＶＥ３６及びｐＰＳＯ２９のヌクレオチド配列８００〜 ４０００．　Ｘ”はヌクレオチドが未知であることを示す。

図７−−　Ｂｔ　ＩＣＰ植物遺伝子のＡＴ含有量に及ぼす突然変異の影響のグラ フ。

図８ａ−一　一時的発現アッセイに使用したプラスミド構築物の概略図、関連遺 伝子が示されている。

図ｓｂ−一　典型的な一時的発現アッセイにおけるＣＡＴ（Ｎｅｕｍａｎｎら、 １９８７）及び変性Ｂｔ　ＩＣＰ（Ｅｎｇｖａｌｌ及びＰｅ５ｃｅ、１９７８） の蓄積量の変化。

以下の実施例において特に記載のない限り、組換えＤＮＡを作製及び操作する全 ての手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ １９８９）に記載の標準方法に従って実施した。

１、の ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体のキメラＢｔ　ＩＣＰ植物遺伝子において転写を 開始する相対効率を、Ｖａｅｃｋら（１９８７）によって記載されており、プラ スミドｐＧＳＨ１６３のＴ−ＤＮＡのコピーを含むトランスジェニック植物Ｎ２ ３−２２０を使用して調査した。このＴ−ＤＮＡはキメラ植物遺伝子ｐＴＲ２ｂ ｔ８８４３°ｇ７及びＰｒ＊１ｎｅｏ３’ｏｃｓを有している。Ｎ２３−２２０ の誘導葉２５ｇの核をＣｏｘ及びＧｏ　ｌｄｂｅｒｇ（１９８８）に従って調製 し、核を温度−７０℃で保管した。この方法によって新生ｍＲＮＡ前駆体鎖及び ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体は停止し、一方で、結合体はＤＮＡに結合したま まとなる。

核の転写可能性に対する指標として、かかる核バッチの放射性標識ＵＴＰを取込 む能力について評価した（Ｃｏ　ｘ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ、１９８８）、この取 込みは、α−アマニチンを終濃度２μｇ／ｍｌまで加えることによりうまく抑制 することができる。これは、ＵＴＰ取込みがＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転写 伸長によるものであり、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって支配されるタンパク質 コーディング遺伝子におけるＲＮＡ合成は、適当な実験条件下で再活性化し得る ことを示している。

Ｎ２３−２２０の核のバッチを使用して、Ｃｏｘ及びＧｏ　Ｉ　ｄｂｅ　ｒｇ（ １９８８）によって記載されているように放射性標識ＲＮＡを合成した０合成し た放射性ＲＮＡは、核中のＤＮＡにおけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体の分布 を直接表わすものである。Ｎ２３−２２０のＤＮＡはアッセイし得る２つの遺伝 子、即ちキメラ植物遺伝子とキメラＢｔ　ＩＣＰ遺伝子とを含んでいるので、が がる２つの遺伝子におけるＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体の分布を比較すること ができる。このために、放射性ＲＮＡをＣｏｘ及びＧｏｌｄｂｅｒｇ（１９８８ ＞に従って核から抽出し、通常のサザンハイプリダイゼーションにおけるプロー ブとして使用した。サザンプロットは、放射性プローブ中に存在するｎｅｏ及び Ｂｔ　ＩＣＰ　ＲＮＡ種と比較してモル過剰量のＢｔ　ＩＣＰ及びｎｅｏコーデ ィング配列を保有するＤＮＡフラグメントを含んでいた。サザンプロットの詳細 説明は図１に与える。ハイブリダイゼーション実験は見立及びＢｔ　ＩＣＰコー ディング配列の両方へのハイブリダイゼーションシグナルをもたらしたく図１） 、デンシトメーター走査は、ｎｅｏ及びＢｔ　ＩＣＰコーディング領域へのハイ ブリダイゼーションシグナルの強度がほぼ同一であったことを示した。この結果 は、ＴＲ二重プロモーターから開始する転写物の数が両方向でほぼ等しいことを 示唆している。植物Ｎ２３−２２０においては細胞質内のｎｅｏ　ｍＲＮＡレベ ルはＢｔ　ＩＣＰより数倍大きく、このことは、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列 が実際に細胞質内のＢｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡの蓄積を抑制することを示している が、この現象は、主としてキメラＢｔ　ｒｃＰ植物遺伝子の転写開始が抑制され ることに起因するものではない。

２゜ Ｖａｅｃｋら（１９８７）によって記載されているトランスジェニック植物Ｎ２ ３−２２０中に存在するＢｔ　ＩＣＰ植物遺伝子におけるＲＮＡポリメラーゼＩ Ｉ結合体の相対分布を調査した。このために、実施例１に記載のＮ２３−２２０ の核バッチを用いて第２の実験を実施した。

核をＣｏｘ及びＧｏ　ｌｄｂｅｒｇ（１９８８）によって記載されているように インキュベートし、放射性標識ＲＮＡを合成した。放射性ＲＮＡを前述のごとく 抽出し、サザンハイブリダイゼーション用のプローブを得た。この実験のために 調製したサザンプロットは、プローブ中に存在する相補的ＲＮＡと比較してモル 過剰量のＢｔ　ＩＣＰコーディング配列の数種のフラグメントを含んでいた。実 験で確認すべきは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体がＢｔ　ＩＣＰコーディング 領域領域一様に分布していれば、サチンプロット上に存在する種々のＢｔ　ＩＣ Ｐ　ＤＮＡフラグメントとのハイブリダイゼーションは、種々のフラグメントの サイズ及びｄＡＴＰ含有量に比例するであろうことである。サチンプロット上に 存在したＤＮＡフラグメントの詳細は図２ａに示す。Ｎ２３−２２０の核から抽 出された放射性ＲＮＡとサザンプロットとのハイブリダイゼーションから、Ｎ２ ３−２２０中に存在するような完全なりｔ　ＩＣＰコーディング配列はＲＮＡポ リメラーゼＩＩによって転写されることが明らとなった。

オートラジオグラムをデンシトメーター走査することによりハイブリダイゼーシ ョンシグナルを定量化すると、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列の３′末端に位置 するＢｔ　ＩＣＰ配列によりもＢｔ　ＩＣＰコーディング配列の５′末端に位１ するＢｔ　ＩＣＰ配列を表わすＤＮＡフラグメントに、より多くの放射性１［１ １ＲＮＡがハイブリダイズしたことが判った。実際の値は表２ａに与える。この ｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験は、ｉｎ　ｖｔｖｏ″？−ＲＮＡポリメラーゼがＢｔ　Ｉ ＣＰコーディング配列配列一様に分布されないことを示している。

ＲＮＡポリメラーゼＩＩ伸長を抑制するのに関与する部位をより正確に決定した 。ＡＵＧからヌクレオチド１５８４個分下流までの領域に広がるＢｔ２コーディ ング配列の一部重複フラグメントを含む９つのＭ１３誘導体を作製した。

挿入物はベクター中に、−重ｇＭ１３誘導体中でＢｔ配列がＢｔ転写物と相補的 になるような向きで挿入した。Ｍ１３クローンの概略図を図２ｂに示す。

Ｃｏｘ及びＧｏ　Ｉｄｂｅｒｇ（１９８８）によって記載されているようなＮ２ ３−２２０核についての核ランオンアッセイから調製した標識ＲＮＡとのハイブ リダイゼーション用のＤＮＡターゲットとして作用するように、モル過剰量の各 −重請抗Ｂｔ　ＤＮＡをナイロンフィルターに結合させた。インキュベーション 時間のみを変えた３種の核ランオンアッセイを同時に実施した。インキュベーシ ョン時間によって新生ｍＲＮＡ鎖の伸長の長さが定まる。インキュベーション時 間が短いほど、基質ＤＮＡに対するＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合体の位置及びそ れらのインキュベーション開始時点の伸長能力がより正確に判る。即ち、ｉｎｖ 結果は図２０に示す、５分間のインキュベーションにおけるデータは、ｂｔ２コ ーディング配列に沿ってはっきりと別れた阻害ゾーンにおいて、ｉｎ　ｖｉｖｏ で１つ以上の因子が転写伸長を妨害しており、このような因子が１工ｖｉｔｒｏ でのｍＲＮＡ伸長反応の間、ががる阻害ゾーン内に存在し続けることを示してい る。インキュベーション時間を増大すると、ＤＮＡ鋳型のサブセットにおいて、 阻害ゾーン自体における阻害は有意に取り除かれないが、このアッセイにおいて はかかる阻害ゾーンの下流でＲＮＡ合成が再開された。この点に関して、データ は下記のことを示している。

１　阻害ゾーンは、ＲＮＡポリメラーゼを休止させるが、停止はさせない、 ２、この休止は、使用したＢｔ　ＤＮＡ鋳型の小フラクションに対して一時的で しかない。

３、阻害ゾーンの下流で続けられるＲＮＡポリメラーゼ伸長は、Ｂｔ　ＤＮＡ鋳 型の比較的小さいフラクションにおいて多数のポリメラーゼによって行われる。

従って、細胞質内のＢｔ　ｍＲＮＡレベルの低さは、少なくとも一部は、新生転 写物の非効率的な伸長及び／または阻害ゾーンにおけるＲＮＡポリメラーゼ１１ 結合体の転写の停止によって惹起されるｍＲＮＡ前駆体の非効率的な生成に起因 すると考えられる。

阻害ゾーンの、タバコ原形質体の核中に存在するタンパク質と相互作用する能力 について評価した。タバコＳＲＩの葉原形質体がらＬｕｔｈｅ及びＱｕａｔｒａ ｎｏ（１９８０）に従って組接抽出物を調製し、実質的にＤｉｆｆｌｅｙ及びＳ ｔ　ｉ　ｌ　１ｍａｎ（１９８６）によって記載されているフィルター結合アッ セイに使用した。１１００ｎのタンパク質抽出物試料を、０〜１６７０ｐｍｏｌ の種々の量の放射性標識した５３２ｂｐのＸｂａｒ−Ａｃｃｌ　ｂｔ８８４　Ｄ ＮＡフラグメントと、終容量０．１５０ｍ１の結合緩衝液（１０ｍＭ　Ｔｒ　ｉ 　ｓ　ｐＨ７，５，５０ｍＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＤＴＴ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ及 び５％グリセロール）中で混合した。室温で４５分間インキュベートした後、試 料をアルカリ洗浄したニトロセルロース膜でｒ過し、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ ７，５，５０ｍＭ　ＮａＣ１及び１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む０．１５０ｍ１の水冷 溶液で２回洗浄した。ＤＮＡ−タンパク質結合体の滞留をシンチレーションカウ ントによって定量化すると、結合が１００１００ｐ範囲の解離定数を有すること が明らかとなった。結合は、核抽出物をモル過剰量の特異的競合ＤＮＡとブレイ ンキュベートしたことに影響されなかった。

３、の 前記２つの実施例は、キメラ植物遺伝子中のＢｔ　ＩＣＰコーディング配列が、 キメラ植物遺伝子によって誘起される細胞質内のＢｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡレベル を抑制することを示した。この抑制は転写開始段階においてではなく、少なくと も一部には、ＲＮＡポリメラーゼＩＩのＢｔ　ＩＣＰ　ｍＲＮＡ前駆体を生成す る能力の低下に起因するものであることが明らかとなった。転写伸長不良が、Ｂ ｔ　１ＣＰ配列が遺伝子発現を妨害する唯一の機構であるか同定するために、キ メラＢｔ　ＩＣＰ植物遺伝子の欠失分析を実施した。実験で明らかにしたいのは 、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング領域中に特定の欠失を導入すると、抑制に作用する 配列エレメントを除去または不活性化し得るかどうかである。結果として、この ような突然変異遺伝子は細胞質内のｍＲＮＡレベルをより増大するであろう、従 ってこの方法を使用して、抑制に関与する配列のマツピング及び同定を行ない得 る。

この分析を行なうため、ｂｔ８６０−ｎｅｏ遺伝子（ｖａｅｃｋら、１９８７＞ の一連の欠失体を作製した０図３に概略図を与える。得られた欠失誘導体はＢｔ 　ＩＣＰを特定せず、従ってＲＮＡレベルのみで評価される。正確なりｔ　ＩＣ Ｐ　ｍＲＮＡ濃度値を得るために、欠失突然変異体を、ＳＲＩのタバコ葉原形質 体を使用するトランジェント発現系（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ及びＶ　ａ　ｎ　 ｄ　ｅ　ｗ　ｉ　ｅｌｅ、１９８９）において比較した。突然変異Ｂｔ　ＩＣＰ 遺伝子として同じプラスミド上に存在するｃａｔ参照遺伝子によって特定される ｍＲＮＡによって与えられる補正係数を使用し、相対ｍＲＮＡ数を計算した。遺 伝子導入の４時間後、タバコ葉原形質体を回収し、全ＲＮＡを調製し、分析した く図４）。

突然変異体番号５０〜６０（図３）から、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列のカル ボキシ末端部分またはアミン末端部分を順次欠失させると、ｎｅｏ転写物レベル を次第に増大する結果となることが判る。転写物レベルの変化はそれほど急激で はないので、上記結果から、全長Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子によって産生される転写物 レベルの低さは多数のシグナルによって制御されていることが判る。実際、Ｂｔ 　ＩＣＰコーディング配列内の欠失によって、それ自体がＢｔＩＣＰ　ｍＲＮＡ レベルの低さの原因である特定の配列エレメントは特定されなかった。同様に、 ｐＪＤ５０（図３）中のＢｔ　ＩＣＰコーディング配列のフラグメントのクロー ニングによってこのような領域を同定することもできなかった。

相対転写物レベルを、種々の欠失誘導体中に存在するＢｔ　ＩＣＰ配列の長さに 対してプロットした１図５は、Ｂｔ　ＩＣＰ配列の長さが増大するとハイブリッ ドＢｔ　ＩＣｐ−ｎｅｏ転写物レベルが下がることを示している。この点におい て突然変異体番号６１〜６６（図３）は、Ｂｔ　ＩＣＰ配列の長さに対する転写 物レベルが平均して低いことで例外となっている。

上記結果から、タバコにおけるＢｔ　ＩＣＰ植物遺伝子の転写物レベルの低さは 、新生転写物の伸長不良に起因するだけでなく、多数のシグナルが働いてキメラ Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の発現能を低下させていることが判る。

え族１ 植物中でのｂｔ２遺伝子の発現が非効率的となることにおいて、細胞質内の事象 が重要であるか判定するため、以下の試験を実施した。Ｎ２３−２２０のトラン スジェニック葉原形質体の細胞質内のｂｔ２　ｍＲＮＡ定常状態レベルでは、通 常は１細胞当たりの転写物が１以下であることが判っている。定常状態レベルは 、単位時間当たりに細胞質に進入するｂｔ２転写物の数及び転写物の細胞質内半 減期によって決定され、且つそれに比例する。定常状態レベルに達すると、細胞 質内のｂｔ２　ｍＲＮＡプール内に入る転写物と出る転写物の数は等しくなる。

従って、ｂｔ２転写物の細胞質内半減期及び細胞質内定常状態レベルから、細胞 質内定常状態レベルは、ｂｔ２転写物の流入量が比較的低いことに起因するのか 、代謝回転（即ちタンパク質への変換）率が比較的高いことに起因するのか、ま たはこれら両方の組合せに起因するのかが明らかとなる。

ｂｔ８８４転写物の細胞質内代謝回転はＧａ１ｌｉｅら（１９８９）に従って測 定した。Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ ｏｎｓｉｎ。

ＵＳＡ）のプロトコルに従って、キャップ化され且つポリアデニル化された合成 りｔ８８４ｍＲＮＡをｉｎ　ｖｉｔｒｏで作製し、合成りａｒ（Ｄｅ　Ｂｌｏｃ ｋら、１９８７）ｍＲＮＡを用いてタバコ葉原形質体中に同時に導入した。

２種の合成転写物はコーディング配列のみが異なった。ＲＮＡ送達後の種々の時 点で試料を採取し、全ＲＮＡを単離した。ノーザン分析により、合成りｔ８８４ 及びｂａｒ転写物の半減期（Ｔ　Ｉ／２）はそれぞれ約８±３時間及び５±２時 間であることが明らかとなった。下記の表１参照、これらのデータから、ｂｔ８ ８４コーディング配列、特に亘ｔ８８４コドン用途及びｂｔ８８４コーディング 配列中のＡＵに富むモチーフは、ｂｔ８８４を、タバコ葉原形質体当たり約１０ ００までの転写物を細胞質内に蓄積する（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ、１９８９に より計算）ことが知られているｂａｒ　ｍＲＮＡよりも不安定にすることはない ことが明らかである。即ちｂｔ８８４転写物の細胞質内定常状態レベルの低さは 、転写物の細胞質への流入の不足によって惹起されるものである。即ち、ｂｔ８ ８４遺伝子の発現不良は、植生での発現系を向上する変性をｂｔ８８４コーディ ング配列内に導入することにより回復せねばならない。

タバコ中でのｂｔ１４、ｂｔ１５及びｂｔ１８遺伝子の発現は、これらの遺伝子 が細胞質内ｍＲＮＡ定常状態レベルの低さを誘起していることも明らかにした。

従って、発現不良が細胞質に依存するものであるかまたは核に依存するものであ るか同定するため、合成りｔ１４、ｂｔ１５及びｂｔ　１８転写物を用いて同様 の分析を実施した。下記の表１は、３種全ての転写物がタバコ葉原形質体の細胞 質中で安定なｍＲＮＡとして挙動することを示している。即ち、ｂｔ８８４遺伝 子と同様に、ｂｔ１４、ｂｔ１５及び坑±」遺伝子も、高レベルのｂｔ転写物を 細胞質に流出させる上で欠陥をもっているはずであり、そしてかかる遺伝子の発 現を向上するためには、それらのコーディング配列を、効率的な遺伝子発現を妨 害する核内事象を避けるまたは緩和するように変性する必要がある。

表１ Ｎｉｅｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ　ｃｖ、Ｐｅｔｉｔｅ　Ｈａｖａｎｎａ　 ＳＲＩ葉原形質体における合成回及びｂａｒ　ｍＲＮＡの半減期測定実施例　１ °ｔｍＲＮＡ　Ｔｌ／２　２”＋ｅＲＮＡ　Ｔｌ／Ｚ（時間）　（時間） ｃ　ｂｔ長　１２４／−５罪　２Ｎ／−１２Ｄ　ｂｔ１８　１０＋／−５ｂａｒ 　１２＋／−５■朋 合成りａｒ転写物は７８３塩基の長さを有しており、キャップと、ＴＭＶリーダ ー（７７塩基、Ｄａｎｔｈ　ｉ　ｎｎｅ及びＶａｎ　Ｅｍｍｅｌｏ、１９９０） と、ｂａｒコーディング配列（５５２塩基；Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋら、１９８７）と 、塩基ＧＡＵＣＡ　ＣＧＣＧＡ　ＡＵＵ及びｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ） ポリリンカー（ＫｐｎＩ（Ｔ４　ＤＮＡ　Ｐｏ１．）−ＨｉｎｄｌＩＩ（Ｔ４　 ＤＮＡ　ｐｏｐ、））由来の３９塩基からなる５２ヌクレオチドのトレーラ−と 、組成（Ａ）ｓｓＧ　（Ａ　）３２Ｇ　（Ａ　）ａｚのポリ（Ａ）及び後続のヌ クレオチドＧＣＵとを含んでいた。

合成り　ｔ　８８４転写物は２０６６塩基の長さを有しており、キャップ、ＴＭ Ｖリーダー（７７塩基〉、ｂｔ８８４コーディング配列及び後続の、フレノウ処 理ＰｓｔＩ部位までのトレーラ−（合計１８４３ヌクレオチド）を含んでおり、 トレーラ−のあとには、ＡＡＵＵＣＣＧＧＧＧ　ＡＵＣＡＡ　ＵＵ、３９塩基の ｐＧＥＭ−３Ｚポリリンカー、（Ａ）。

３Ｇ　（Ａ　）３２Ｇ　（Ａ　）２１ポリ（Ａ＞、及び後続のヌクレオチドＣＧ が続いていた。

合成りｔ　１４転写物は２２８９塩基の長さを有しており、キャップと、ＴＭＶ リーダーく７７塩基）と、フレノウ処理ＢｃｌＩ部位までのｂｔ１４コーディン グ配列（２０２３塩基）と、２６個の相補的ヌクレオチドＣＧ　ＵＣＧ　ＡＣＣ ＵＧＣＡＧＣＣＡＡ　ＧＣＵ　ＵＧＣＵＧＡと、ＵＵＧＡＵ　ＵＧＡＣＣＧＧＡ ＵＣＣＧＧＣＵ　ＣＵＡＧＡＡＵＵで始まるトレーラ−及び後続の３９塩基のｐ ＯＥＭ−３２ポリリンカーと、（Ａ）３３Ｇ（Ａ）３２Ｇ（Ａ）２１ポリ（Ａ） 及び後続のヌクレオチドＣＧＧＵＡ　ＣＣＣとを含んでいた。

合成りｔ１５転写物は２１９８塩基の長さを有しており、キャッフト、ＴＭＶリ ーダー（７７塩基）と、ｐＶＥ３５（ＰＣＴ出願公開Ｗ０９０／１５１３９号） のごときｂｔ１５コーディング配列及び後続の、フレノウ処理ＢａｍＨＩ部位ま でのトレーラ−（合計１９８９塩基）と、後続のＡＡＵＵ、３つ塩基のｐＧＥＭ −３２ポリリンカーと、（Ａ　）３３Ｇ　（Ａ　）３２Ｇ（Ａ）２１ポリ（Ａ） 及び後続のヌクレオチドＣＧとを含んでいた。

合成りｔ１８転写物は２１８４塩基の長さを有しており、キャップと、ＴＭＶリ ーダー（７７塩基）と、フレノウ処理ＢｃｌＩ部位までのｂｔ１８コーディング 配列（１９１８塩基）と、後続の、翻訳終結までの２６個のヌクレオチドＣＧ　 ＵＣＧ　ＡＣＣＵＧＣＡＧＣＣＡＡ　ＧＣＵ　ＵＧＣＵＧＡと、ＵＵＧＡＵ　Ｕ ＧＡＣＣＧＧＡＵＣＧＡＵＣＣＧＧＣＵＣＡＧＡＵＣＡＡＵＵで始まるトレーラ −と、３９塩基のｐＧＥＭ−３Ｚポリリンカーと、（Ａ）、３Ｇ（Ａ））２Ｇ（ Ａ）２１ポリ（Ａ）と、後続のヌクレオチドＣＧとを含んでいた。

５、　Ｂｔ　ＩＣＰの 実施例１〜４は、植物中でのＢｔ　ＩＣＰ遺伝子の発現はＢｔ　ＩＣＰコーディ ング配列によって転写及び転写後の両段階で抑制されるが、これは主として核内 事象によることを示した。これらの実施例は更に、発現の抑制は、Ｂｔ　ＩＣＰ コーディング配列内の特定のＤＮＡ配列に限定されないことをも示した。むしろ 、遺伝子発現の抑制はＢｔ　ＩＣＰコーディング配列の固有特性である。これを 基にして、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング領域のＤＮＡ配列を指定変更することによ り、遺伝子発現が向上することと考えられる。Ｂｔ　ＩＣＰコーディング領域の 該抑制作用はコーディング配列全体に広がっているため、向上は累積的なもので ある。同様に、遺伝子発現は、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列の長さを小さくす ることによっても向上される。

この向上は、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング領域の変性と組み合わせて使用すると累 積効果を与える。

従って、２つのタイプの変性をＢｔ　ＩＣＰ（即ちｂｔ２＞コーディング配列に 導入したところ、後述するように、Ｂｔ　ＩＣＰ植物遺伝子発現に有意な増大を もたらした。まず、転写伸長はＢｔ　ＩＣＰの毒素コアフラグメントの中央領域 において妨害されるが故に、この領域においてＤＮＡ配列を変更した０次に、該 抑制作用はＢｔ　ＩＣＰコーディング配列の長さに比例するが故に、Ｂｔ　ＩＣ Ｐコーディング配列の長さを小さくした。突然変異の詳細は図６ａ、図６ｂ及び 図６０に与える０図７に示すように、変性することによりキメラＢｔ　ＩＣＰ遺 伝子のＡＴ含有量は著しく変化した。また、変性することによって、コードされ るタンパク質のアミノ酸配列に影響することなくＢｔＩＣＰコーディング配列の 一次ＤＮＡ構造は変化した。より多くのＤＮＡ突然変異誘発をＢｔ　ＩＣＰコー ディング配列中に導入するのであれば、遺伝子発現が更に向上することは明らか である。

変性の効果を測定するため、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子及び親のｂｔ８６０−ｎｅ ｏ遺伝子の発現特性を、ＣｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎとＶａｎｄｅｗｉ　ｅ　１　ｅ （１９８９）及びＤｅｎｅｃｋｅら（１９８９）によって記載されているような 一時的発現系において比較した。基本的に、調査対象の遺伝子の蓄積プロフィル を、同じ実験において存在した参照遺伝子のプロフィルと相関させることにより 比較した０図８ａはこのアッセイに使用したベクターを示しており、図８ｂは、 参照ｃａｔタンパク質の蓄積が再実験においてほぼ等しいことを示している。親 のｂｔ８６０−ｎｅｏ遺伝子によってコードされるＢｔ　ＩＣＰの蓄積を測定す ることはできないが、変性Ｂｔ　ｆｃＰ遺伝子は明らかにより多くのＢｔ　ＩＣ Ｐ合成を誘起した。

上記結果は、Ｂｔ　ＩＣＰコーディング配列の突然変異がＢｔ　ＩＣＰ［物遺伝 子の発現におけるＢｔ　ＩＣＰコーディング配列の該抑制作用を緩和したことを 示している。

６、タバコ　びジャ　イモ　における　Ｂｔｒｃｐ　のクローニン　び １９８６年１月２２日付は米国特許出願第８２１，５８２号、欧州特許出願第８ ６３００２９１．１号、欧州特許出願第８８４０２１１５．５号及び欧州特許出 願第８９４００４２８．２号に記載の方法を使用し、図６及び図７の変性Ｂｔ　 ＩＣＰ（即ちｂｔ２）遺伝子を中間Ｔ−ＤＮＡベクター、ｐＧｓＨ１１６０（Ｄ ｅｂｌａｅｒｅら、１９８８）中のＴ−ＤＮＡ末端境界反復配列間に挿入しな。

植物中で有意に発現させるため、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子は強力なＴＲ２’プロ モーター（Ｖｅｌｔｅｎら、１９８４）の制御下におき、Ｔ−ＤＮＡ遺伝子７の 転写物３′末端形成シグナル及びポリアデニル化シグナルに融合した（Ｖｅｌｔ ｅｎ及び５ｃｈｅ　ｌ　Ｉ、１９８５）。

更に、植物細胞中での翻訳開始を最適化するために、翻訳開始関連部分（ｃ　ｏ 　ｎ　ｔ　ｅ　ｘ　ｔ　）ｔたは部位をＪｏｓｈｉコンセンサス配列（Ｊｏｓｈ ｉ、１９８７）に従って変更した。このために、二重のオリゴ［（ｏ　ｌ　ｉ　 ｇｏ　ｄｕｐ　ｌ　ｅｘ）（図６ａ及び図６ｂ）を導入して翻訳開始部位に配列 ；ＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴを生成した。このようにして、アラニンをコードす る追加コドン（即ちＧＣＴ）を導入した。

更にＡＴＧ翻訳開始コドンの上流にに」二１」−及びＢｓｔＸ工部位全部位した 。

標準方法（Ｄｅｂｌａｅｒｅら、１９８５）を使用し、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子 を含む中間植物発現ベクターを、失効ＴｉプラスミドｐＧＶ２２６０（Ｖａｅｃ ｋら、１９８７）を含むＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株Ｃ５８ＣＩ　Ｒｉｆ’（ 米国特許出願第８２１．５８２号；欧州特許出願第８６３００２９１゜１号）中 に移入した。スペクチノマイシン耐性に対して選択し、ｐＧＶ２２６０と個々の 中間植物発現ベクターとからなる同時組込みプラスミドを得た。これらの組換え Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株の各々を使用して種々のタバコ植物細胞（Ｎｉｃ ｏｔｉａｎｉａ　ｔａｂａｃｕｍ）及びジャガイモ植物細胞（Ｓｏｌａｎｕｍ　 ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ＞を、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子が種々のタバコ及びジャガイ モ植物細胞中に含まれ且つ発現されるように形質転換した。

変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むトランスジェニックタバコ植物をＥＬＩＳＡアッ セイによって分析した。かかる被検植物は、非変性Ｂｔ　ＩＣＰ（ｂｔ２）遺伝 子を含むトランスジェニックタバコ植物と比較し、Ｂｔ（Ｂｔ２）タンノ（り質 のレベルが有意に増加していることを特徴とした。

形質転換タバコ及びジャガイモ植物の葉中の変性ＢｔＩＣＰ（ｂｔ２）遺伝子の 発現産物の殺虫力は、かかる２種類の被検植物の葉の上に、スズメガ（ｔ　ｏ　 ｂ　ａ　ｃ　ｃ　ｏ　ｈ　。

ｒｎｗｏｒｍ）（Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ）、タノくコガ（ｔｏｂａｃｃｏ 　ｂｕｄｗｏｒｍ）（Ｈｅｌｉｏｔｉｓ　ｖｉすることにより評価した。この結 果を、未変性また番よ親のＢｔ　ＩＣＰ（ｂｔ２）遺伝子を用いて形質転換した タノくコ及びジャガイモ植物並びに未形質転換のジャガイモ及びタバコ植物の葉 の上に置いた幼虫の成長速度と比較した。ｌ！性分析は欧州特許出願第８８４０ ２１１５．５号及び欧州特許出願第８６３００２９１．１号に記載のごと〈実施 した。

変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含みそれを発現した形質転換植物の葉の上に置いた幼 虫においては著しく高い致死率が得られた。変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むタバ コ及びジャガイモ植物は、未変性のＢｔ　ＩＣＰ遺伝子を含むタバコ及びジャガ イモ植物と比較するとかなり高いＢｔ　ＩＣＰ発現レベルを示した。

変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を含む３種のトランスジェニックタバコ植物の殺虫力を 、Ｈｅ１ｉｏｔｈｉｓ　ｖｉｒｅｓｃｅｎｓの二齢及び三齢の幼虫に対して評価 した。対照植物は形質転換しなかった。結果は下記の表２にまとめて示す。

表ユ 対照植物　害虫の致死率（％）（５日後に記録）対照　１１ Ｎｏ、１　１００ Ｎｏ、２　８８．５ Ｎｏ、３　１００ 言うまでもなく、本発明は、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて形質転換されたタ バコ及びジャガイモ植物に限定されない６本発明は、トマト、アルファルファ、 ヒマワリ、トウモロコシ、綿、ダイズ、サトウダイコン、菜種、アブラナ１（ｂ ｒａｓｓｉｃａｓ）及び他の野菜といった、変性ｈ３　ｆ、ｒ’、　Ｃ’ｒ”遺 伝子を用いて形質転換された任意の植物を包含する。

また本発明は、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて植物細胞を形質転換するために Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｔｉプラスミドを使用 することにも限定されない、リポソーム、エレクトロポレーションまたは植物ウ ィルスもしくは花粉をベースとしたベクター系といった他の公知の植物形質転換 技術を、かかる変性Ｂｔ■ＣＰ遺伝子を用いて単子葉類及び双子葉類を形質転換 するのに使用することができる。

更に本発明はｂｔ２遺伝子に限定されることもなく、ＣｒｙＩ、ＣｒｙＩＩ、Ｃ ｒ　ｙ　ＩＩＩ及びＣｒｙＩＶ全てのＢｔ　Ｉｃｐ遺伝子を包含する。

下＄乞の欠帛に；工ｅ１４１ｖｒ↓すｌ二５／Ｈトざ本成４どｊう３　ニー　人 ｄａｎｑ　ａｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　３６．　２８９−３００　（１’１５）。

−人５ｓａｌｉｎ　ａｔ　ａｌ、、Ｏｎｃｏｇｅｎａ　４．　５４９−５５８　 （１９８９）。

−Ｂａｒｔｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８５．１１ ０３−１１０９　（１９Ｂ？）。

−Ｃｏｎｎｅｌｙ　ａｎｄ　Ｍａｎｌｅｙ、　Ｃａ１ｌ　５７．　５６７−５７ １　（１９８９）−Ｃｏｎｎｅｌｙ　ａｎｄ　Ｍａｎｌｅｙ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａ ｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

旦、　５２５４−５２５９　（１９８９）−Ｃｏｒｎｅｌｉｓ＋！Ｉｅｎ、Ｎｕ ｃｌ、入ｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、ｌヱ、　７２０コー７２０９　（１９８９）。

−Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ　ａｎｄ　Ｖａｎｄｅｗｉｅｌｅ、Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、１７゜８ココ−８４：Ｉ　（’［９１！９１゜−Ｃｏｘ　ａｎｄ 　Ｇｏｌｄｂａｒｇ、　ｉｎ：　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ ｇｙ、入ｐｒａｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ、ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｃ，Ｓ ｈａｗ、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

ｐｐ・１−３５　（１９８８）。

−Ｄａｎｔｈｉｎｎａ　ａｎｄ　Ｖａｎ　Ｅｍｍａｌｏ、　Ｍｅ、Ｆａｃ、Ｌａ ｎａｏｕｖｗ。

Ｒｌｊｋｓｕｎｉｖ、ｃｅｎｔ　５５　（コａ）、１０’３７−１０４５　（１ ９９０）。

−Ｄａｒｎａｌｌ、Ｈａセｕｒｅ　２９ヱ、　コロ５−３７１　（１９８２）。

−Ｄｅｂｌａ＠ｒ＠＠ｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ　１５］、２７７−２９２（１９８ｇ）　。

−Ｄｅｂｌｔｘｅｒ＠　ａｔ　ａｌ、、Ｔｈｅｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ ａｒｃｈ　１コ、４７７７−４７８７（１９１ｉ１５）　。

−Ｄａ　Ｂｌｏｃｋ　ａｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ、６．　２５１３−２５１８　 （１９８７）。

−Ｄｅｌａｎｎａｙ　ａｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙヱ、１２６ ５−１２６９　（１９８９）。

−Ｄｅｎａｃｋａ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈ−Ｍｏｂ、Ｃａ１−　Ｂｉｏｌ、１ ．　１９−２７（１９Ｂ９）。

−Ｄｉｆｆｌｅｙ　ａｎｄ　Ｓｔｉｌｌｍａｎ、Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃａ１１． 　Ｂｉｏｌ、６゜１コ６コー１３７３　（１９８６）。

−Ｄｕｌｍａｇｅ　Ｈ，Ｔ、”Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃセａｒｉａ 　ｆｏｒ　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　工ｎｇｅｃｔ−ｓ″　 １１　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ＆１Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｉｎ　ＣｒｏｐＰｒｏｄｕｃｔｉ ｏｎ″　Ｅｄ、　Ｐａｐａｒｉｚａｓ　Ｄ、　Ｃ−、ｏｓｍｕｍ　Ｐｕｂｌｉｓ ｈｅｒｓ。

Ｔｏｔｏｗａ、Ｎ、Ｙ、、ＵＳＡ、ｐｐ、１２９　−　１４１　（１９８１）。

−Ｅｎｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２互ユ、１ ２コ８４−１２コ９゜（１９８８）。

−Ｅｎｇｖａｌｌ　ａｎｄ　Ｐａ５ｃｅ、　５ｃａｎｄ、工ｍｚ＊ｎｏ１．５ｕ ｐｐ１．７　（１９７８）。

−Ｆｉｓｃｈｏｆｆ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　５．　 ａ０７−１１１２　（１９８７）。

−Ｆｒｏｍｎ　＠ｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　旦、　８ココ　 ａｔ　ｓａｑ、（１９９０）。

−Ｇａ１ｌｉ＠　ａｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｃ＠ｌｌ　Ａ、コ０１−３１！　 （１９５１９）。

−Ｇａｓｇａｒ　ａｎｄ　Ｆｒａｌｅｙ、５ｃｉａｎｃａ　２４４．　１２９コ −１２９９（１９８９）。

−Ｇｉｅｌｅｎ　ａｔ　ａｌ、、ＥにＢＰ　Ｊ　２．　８コ５−８４５　（１９ ８４）。

−Ｇｏｌｄｂｅｒｇ　Ｌ、ａｎｄ　Ｍａｒｇａｌｉｔ　Ｊ、、Ｍｏ５ｑ、Ｈａｙ ｓ　ユ２．　コ５５−３５８（１９７７）　。

−Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｗ　ｅセ　ａｌ、、Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　２． 　６０３　ｅｔ　ｓｅｑ。

（１９９０）　。

−Ｇｏｕｌｄ　ａｔ　ａｌ、、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、９−互、４２６− ４３４　（１９９１）。

−Ｈｏｆｆｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ 、ＵＳＡ　且互。

７８４４−７８４８　（１９８８）。

−Ｈ６ｆｔｅ　＠ヒ　ａｌ、、Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ　１６１．　２７コ ー２８０　（１９８６）。

−Ｈ６ｆｔｅ　Ｈ，ａｎｄ　Ｔｈｉセｅｌｅｙ　Ｈ，Ｒ，、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｏｇｉｃａｌ　Ｒａｖｉｅｗｓ且、　２４２−２５５　（１９８９）。

−Ｊｏｓｈｉ、（１９８７）　Ｎｕｃｌ、入ａｉｄｓ　Ｒｅｓ、１５．　６６４ コー６６５３゜−Ｋｒｉｅｇ　ｅｔ　ａｌ、、Ｚ、入ｎｑ、Ｅｎセ　９６．　５ ００−５０８　（１９ｆｌコ）。

−Ｌｕセｈｅ　ａｎｄ　Ｑｕａｔｒａｎｏ、　Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｐｈｙｓｉ ｏｌｏｇｙ　６５．　コ０５（１９８０）。

−Ｍｃ　Ｐｈｅｒｓｏｎ　ａｔ　ａｌ、、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　６． ６１−６６　（１９８８）。

−Ｍｅｅｕｓｅｎ　ａｎｄ　Ｗａｒｒｅｎ、　入ｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｅｎｔｏｍ ｏｌ、　３４．　３７３−３８１（１９ｇ９）　。

−Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌｕｌａ ｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ９゜５３４０−５３４９　（１９８９）。

−”Ｔｈｅ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ、 ５ｅｃｏｎｄ　Ｅｄｉｔｉｏｎ”。

Ｅｄｓ、入１ｂｅｒｔｓ　ｅセ　ａｌ、、Ｇａｒｌａｎｃ！　Ｐｕｂｌｉｓｈｉ ｎｇ　Ｃｏ、、Ｎ、Ｙ、ａｎｄＴＡｎｄｏｎ　（１９８９）。

−Ｎｅｕｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　５．　１４４ 　（１９８７）　。

−０ｄｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１３．　８１０−８１２　（ １９８５）。

−５ｃｈｎｅｐｆ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、２６０．６２６ ４−６２７２　（１９８５）。

−Ｖａｅｃｋ　ａＬ　ａＬ、、Ｎａｔｕｒｅ　ユヱｌ、　ココ−３７（１９８７ ）。

−Ｖｅｌｔｅｎ　ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ ５ｅａｒｃｈ　１３゜６９８１−６９９８　（１９８５）。

−Ｖａｌｔｅｎ　ａｔ　ａｌ、、ＥＭＢＯＪ　！、２７２コ−２７コＯ（１９８ ４）。

−Ｗｉｄｎｅｒ　ａｎｄ　Ｗｈｉｔｅｌｅｙ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　１７１ ．　９６５−９７４（１９８９）。

−Ｙａｎｉｇｃｈ−Ｐａｒｒｏｎ　＠ｔ　ａｌ、、Ｇａｎａ　３３．　１０コー １０９　（１９８５）。

肋＝１盈 ↓見４フ背゛〜ジグ曲び１１ニアづ 尺ＮΔポ゛リメラーｔ“二つ＋ｙ劫 ヌクレオチド　づｆＬＩＬ ｒ＋ａＲＥ３ １）ＶＥ　３６　、’　、ＳＥに１品ＯＯ壜基汀すｊ；４ｖｘ　、？′＊ｒ＝　 ＰＶＥ　３６　、　ＳＥＱ　Ｉ　：　ｇｌ：、ｏ。

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ネ約 Ｂｔ結晶タンパク質の全部または殺虫性部分をコードするＤＮＡフラグメントを 、Ａ及びＴ配列を、同じアミノ酸をコードする対応のＧ及びＣ配列に変更するこ とにより変性する。

国際調査報告　ρＣＴ／ＥＰ　９１１００７３３ρＣＴ／Ｅρ　９１１００７３ ３

Claims (17)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて形質転換した植物細胞中での前記遺伝子の発現 を向上するために、Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を変性する方法であって、植物細胞中で の前記遺伝子のｍＲＮＡへの転写、ｍＲＮＡの核内蓄積及び／またはｍＲＮＡの 核外移行、特に遺伝子転写を向上するように、前記遺伝子の複数の翻訳コドンに おいてＡ及びＴ配列を、同じアミノ酸をコードする対応のＧ及びＣ配列に変更す るステップを含む方法。
2. ２．前記複数の翻訳コドンが、転写の際に、前記遺伝子の別の隣接上流領域と比 較して植物細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩの割合が相対的に低い該遺伝子の１つ 以上の領域にある、変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を用いて形質転換した植物細胞中で の前記遺伝子の転写を向上するためにＢｔ　ＩＣＰ遺伝子を変性するための請求 項１に記載の方法。
3. ３．前記Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子が、トリプシン切断部位に向かって、好ましくはそ のＣ末端及びＮ末端の両方で切断されたＢｔ殺虫性結晶タンパク質をコードし、 好ましくは約６０〜８０ｋＤａのタンパク質の一部分、特に該タンパク質の毒素 をコードする請求項１または２に記載の方法。
4. ４．前記遺伝子の翻訳開始部位にある３つ以上のコドンのＡ及びＴ配列がＧ及び Ｃ配列に変更されており、前記翻訳開始部位の下流にあって好ましくは転写伸長 に影響する前記遺伝子の第２の領域において、約３つ以上、好ましくは約１０個 以上、特に約３３個以上のコドンのＡ及びＴ配列がＧ及びＣ配列に変更されてい る請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. ５．好ましくは細胞質内ＲＮＡ濃度に影響する前記遺伝子の第３の領域において 、約３つ以上、好ましくは約１０個以上、特に約３３個以上のコドンのＡ及びＴ 配列がＧ及びＣ配列に変更されている請求項１から４のいずれか一項に記載の方 法。
6. ６．前記遺伝子の翻訳終結末端にある約３つ以上のコドンのＡ及びＴ配列がＧ及 びＣ配列に変更されている請求項４または５に記載の方法。
7. ７．前記遺伝子が、ｂｔ２、ｂｔ１４、ｂｔ１５またはｂｔ１８遺伝子、好まし くはｂｔ２遺伝子のようなＣｒｙ１遺伝子、またはこれと実質的に相同の配列を 有する遺伝子である請求項４から６のいずれか一項に記載の方法。
8. ８．前記遺伝子がｂｔ２遺伝子であり、前記第２の領域が、おおよそヌクレオチ ド６７４から１０００の間であり、約５９個以上のコドンのＡ及びＴ配列が、第 ２の領域中、特におおよそヌクレオチド７３３から１０００の間、とりわけおお よそヌクレオチド７６５から７９４の間でＧ及びＣ配列に変更されている請求項 ７に記載の方法。
9. ９．前記遺伝子が更に、そのＡＴＧ翻訳開始部位をＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＣＴで 置換することにより変性されている請求項１から８のいずれか一項に記載の方法 。
10. １０．請求項１から９のいずれか一項に記載の方法によって得られる変性Ｂｔ　 ＩＣＰ遺伝子。
11. １１．植物の細胞を形質転換するためのキメラ遺伝子であって、同じ転写単位内 に、下記の操作可能なように連結されたＤＮＡフラグメント： ａ）請求項１０に記載の変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子；ｂ）植物細胞において前記変 性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子の発現を誘起し得るプロモーター；及び ｃ）植物細胞において前記変性Ｂｔ　ＩＣＰ遺伝子を発現させるのに適した、転 写物３′末端形成シグナル及びポリアデニル化シグナル を含むキメラ遺伝子。
12. １２．請求項１１に記載のキメラ遺伝子を用いて形質転換された請求項１１に記 載の植物細胞。
13. １３．請求項１２に記載の植物細胞からなる植物、植物組織または植物細胞培養 体。
14. １４．請求項１３に記載の植物の種子。
15. １５．請求項１１に記載のキメラ遺伝子を含む、植物の核ゲノムを安定に形質転 換するためのベクター、好ましくはＴｉプラスミド。
16. １６．請求項１１に記載のキメラ遺伝子を用いて植物のゲノムを形質転換するス テップを含む、請求項１０に記載の植物を害虫から保護する方法。
17. １７．外来遺伝子を用いて形質転換した植物細胞中での該遺伝子の発現率及び／ または発現レベルが実質的に、該遺伝子によってコードされるｍＲＮＡの核内生 成率及び／またはレベルによって制限される外来遺伝子を変性する方法であって 、前記遺伝子の複数の翻訳コドン、特に、転写の際に該遺伝子の別の隣接上流領 域と比較して植物細胞のＲＮＡポリメラーゼＩＩの割合が相対的に低い該遺伝子 の１つ以上の領域にある複数の翻訳コドンにおいて、Ａ及びＴ配列を変更するス テップを含んでおり、前記Ａ及びＴ配列を、植物細胞中での該遺伝子のｍＲＮＡ への転写、ｍＲＮＡの核内蓄積及び／またはｍＲＮＡの核外移行、特に該遺伝子 のｍＲＮＡへの転写、とりわけ該遺伝子上でのＲＮＡポリメラーゼＩＩによる転 写伸長を向上するように、同じアミノ酸をコードする対応のＧ及びＣ配列に変更 する方法。