JPH05507500A - 骨成長刺激物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 骨成長刺激物質 発明の背景 成長を刺激するための一定のポアサイズを有するデキストランビーズの使用方法 に関するものである。

的な研究が行なわれている。いろいろな研究努力がなされているなかでも、整形 関心を持つようになったため、興なってはいるが互いに関連している２つのアプ ローチ方法が注目を浴びてきている。箪−のアブクーチ方法は、電気的効果によ り新しい骨の形成を誘導するという臨床学的研究からなる方法である。そして、 第二のアプローチ方法は、骨の成長、力１ブリング、骨形成因子および骨形５発 されている、は骨形成を刺激し、そして調整するため、電場をかけるものである 。また今日に至るまでの４０年間は、多くのレポートが動物試験と臨床試験とに おいて、陰極が骨誘導活性化を刺激すると報告している。さらに、いくつかの体 当に絹み合わせたもの、もしくはほかの同定されていない材料が骨の再生に重要 た骨誘導タンパク貢である。さらに上記タンパク質を移植すること（こより、新 しい骨の形成を促進させることができるということが、研究により明らかにされ てより最近になって、研究者たちは新しい骨の形成を促すために、電荷を帯びた デキストランビーズを用いる実験を行なった。この電荷を帯びたデキストランビ ーズの特徴は、多孔性、大きい表面積、翼なる荷電した基、および異なるタンパ ク質へのそれらのｌｌｓ：Ｊ性であり、これらの特徴は幾つかの有益な結果をも たらす。そのような有益な結果は、１９８８年２月１日〜４日まで開催された箪 ２４回整形外科学会の年金において報告され、また論文“荷電ビーズ：４＃の発 生と巨大細胞＋　（骨および鉱物研究雑誌、１９８８年）　（−ＣｈａｒａｌＢ ｅｄ　Ｒｅａｄｓ：　ＧａｎａｒａｔｉｏｎｏｆＢｏｎｅ　ａｎｄ　Ｇｉａｎｔ 　Ｃｅ１ｌｓ−、Ｊ、　Ｂｏｎｅ　＆　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅｓ、、　１９８８ ）として刊行された。

従来の研究では、ファルマンア社（Ｐｈａｒｍａｅｆ、　Ｉｎｃ、）製の３種類 の異なるセファデックスデキストランビーズを同等前処理せずに用いた。これら のビーズは、エビクロロヒドリンにより架橋されたポリグルコースデキストラン から形成されている。負または正の電荷を生じさせる荷電を帯びた基は、安定な エステル結合によってマトリックス内のグルコース単位に結合する。これらのビ ーズは、タイロードの平衡塩類溶液（ｐｌｆ−７，３で緩衝）に懸濁されており 、紫外１１ｆｉ園されている。このようζこして調製されたビーズの物理および 化学的特性は、表１にまとめられている。１分画範囲”は、明示された分子量（ １ｍｌ）を持つタンパク質を分けるためのビーズの能力を示すものである。

以下、余白。

分画範囲（Ｍｆ） 竺二工　竺二工！亙　１１工息二１　江１エヱヱ　１久ム乙二二１Ｇ−２５なし 　中性　なし　！０００−５０００吐＾−Ａ−２５正　弱塩基　Ｃ１−＜３００ ｆｌＯＣＭ−Ｃ−２５負　弱酸　Ｎａ＋　＜３００００この研究実験では、負に 荷電したＣＭ−Ｃ−２５ビーズのみが骨誘導効果を示した。そしてこの実験によ り、負電荷が骨の成長を刺激すると結論された。

新しい骨の形成を誘導するために荷電ビーズを用いることは、効果を誘発する電 場および骨誘導因子効果の両方、またはいずれか一つに由来するのであろう。

かなり小数ではあるが、生物活性に関する生体材料の表面電荷の効果を調べる研 究はあるが、骨誘導過程における生体材料の多孔性効果に関しては殆ど研究がな 費誘導活性を有する生体材料は、欠損または破壊された骨をいやすためにのみ用 いられるのみならず、生物活性を有する材料によって被覆された移植体が存在す る場合、周辺組織と移植体との適合性を改善するためにも用いられる。後者のよ うに用いる場合、生体材料と隣接する組織との接触面の結合は、移植を成功させ るた４の重要なカギとなるであろう。

骨形成を誘発する生体材料の機構を理解するためには、骨構造の詳細にわたる理 解が必要である。骨は、細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からなる分化 された結合ｊａｍである。細胞のひとつのタイプである骨芽細胞は、ＥＣＭ形成 の原因である。このＥＣＭは、有機化合物および無機化合物から形成されている 。

全重量の約３５％を占める有機化合物は、はとんどＩ型コラーゲン（９５％）か らなる化合物である。残りの部分（５％）は非コラーゲン性タンパク賀と他の高 分子とからなる複合混合物である。このようなタンパク質のなかの、例えば骨形 １発生タンパク質（ＢｌｌＩＰ）、ヒト骨格成長因子（ｈｓＧＦ）　、および他 の成長因子のようないくつかは、細胞の増殖を促進させることが知られており、 また分化した細胞機能に対して重要な効果を有している。しかし、このような高 分子の正確な作用ａｍはほとんど理解されていない。骨ＥＣＭの無機成分はカル シウムヒドロ牟／アパタイト複合体であり、ヒトクキ／アパタイトの理論的な式 よりも複雑で、その式はＣａ、＠（Ｐｏａ）＠（Ｏｆ（）’ｔであろうと推測さ れる。

骨芽細胞およびいくつかの骨誘導因子が骨形成過程で果たす重要な役割によれば 、用いられる生体材料が骨形成誘導高分子をコクニー化および濃縮化させる能力 、またはこれらの生体材料の表面に向かって骨芽細胞を移動させる能力のどちら かを有すると期待される。デキストランビーズの独特な特性により、デキストラ ンビーズは骨誘導物質のすぐれた候補となる。

系−に、移植された＊、　ビーズを帯電させることにより体内の電気的環境を作 ることができ、これにより電極が作り出すのと同様の効果が与えられる。第二に 、ビーズの翼なる荷電された基およびビーズの異なる多孔性により、特定の分子 量と電荷とを持つある種のタンパク質へ選択的に結合することが可能となる。荷 電されたビーズは、タンパク質の分子量の違いとビーズへの親和性の違いとに基 づいて、タンパク質の分離に利用される。この特徴により、もし正しいビーズの 選択がなされた場合、ビーズがビーズに近いある骨誘導因子へ結合したり、それ らの因子を濃縮することが可能となる。

生体材料によって誘導された実際の骨形成は複雑でかつ調節されているプロセス であり、その正確なメカニズムは充分理解されていない。立体電荷、多孔性、粒 子サイズ、材料の特性などの生−銭料の特性と、生体内および生体外での結果と のつじつまを合わせるべくいくつかの仮説が出されている。これらの仮説のなか のひとつは、生体材料と骨誘導因子との間の相互作用に関して多くの説明を割い ており、それは骨誘導因子形成タンパク賞（ＢＭＰ）、ヒト骨格成長因子（ｈＳ ＧＦ）、およびいくつかの他の成長因子にまで及んでいる。この相互作用は、実 際には骨誘導因子のコロニー化、濃縮化、そして最後に活性化を起こす可能性が ある。いくつかの生物学的分子、特にＢＭＰは、新しい骨の形成を誘発するのに 関与するということは周知である。他の仮説は、生体材料と骨細胞、特にＥＣＭ の形成に関与する骨芽細胞との相互作用についてより強調している。骨芽細胞は 、興なる速度で翼なる生体材料に向けて移動し、生体材料の表面電荷に依存して 、興なる形態形成をともなって結合するということが生体内では知られている。

しかし、骨細胞の形態形成と骨誘導活性との関係は、いまだ明らかにされていな い。翼なる細胞形態形成が表面電荷の直接的な効果であるのか、あるいはそうで ないのかもまた理解されていない。生体材料に向かう細胞の移動速度が、生理的 環境下での高分子、他の有機化学物質、または無機化学物質と、生体材料との間 の化学的または立体的な電荷相互作用の速度よりもかなり遅いという事実から、 細胞の移動および細胞の生体材料への付着よりも荊に、生体材料の表面電荷が変 化するにちがいない。

従来、研究は電荷効果にのみ着目していた。実際、骨芽細胞移動形管形成および 細胞外マトリックス合成が、コロニー化された生体材料の電荷に対して敏感に影 響を受けることが発見された。移植体そのものとして、または金属移植体の被覆 材として使用される生体材料の多孔性の効果に関しては、はとんど注目されてい なかった。生体材料をコロニー化する骨芽細胞は、大多孔性の、生物活性基質の 表面上の孔開口部に架かることができることが知られており、また骨芽細胞の大 きさは、この従来技術において研究された多孔性のそれよりもたいへん大きいと いう事実から、この従来技術で調べられたビーズの多孔性は、骨芽細胞移動形態 形成にわずかながら直接的な効果を示すであろう。しかし、いろいろな高分子が 、興なるポアサイズのビーズに対して異なる結合能力を持つという事実によって 引き起こされる骨芽細胞移動形態形成に対して間接的な効果を示す可能性もあろ う。はとんどの骨形成誘導性高分子の分子量範囲は、ｔｓ、ｏｏｏから３０．０ ００の範囲であることから、移植体に用いられる生体材料の多孔性は、このよう な骨形成誘導性高分子の結合能力に対して顕著な効果を示すであろう。

デキストランビーズの多孔性は、架橋形成の度合いと、それに結合する荷電され た基の集中の度合とに依存する。セファデックスＡ型およびＣ型のビーズは、マ トリックスへ荷電された基を導入することによって、Ｃ型ビーズから誘導される 。Ａ盟およびＣ型ビーズの数は、Ｃ型ビーズ（Ａ−２５およびＣ−２５はＧ−２ ５から作られ、Ａ−５０およびＣ−５０はＧ−５０から作られる）と同じである が、荷電基の導入による膨潤能力の増加にしたがって、１濁ビーズ電荷の多孔性 の帯電が充分なされる。それぞれのセファデックスビーズは、翼なる分子量範囲 を有し、この範囲内で分子がふるい分けされる。この範囲よりも大きい分子量、 排除される限界にある分子は、すべてゲルから排除される。表２は、異なるセフ ァデブクスデ亭ストランビーズの分画範囲を示すものである。

表２ セファデックスの特性 分１１ｉｉｌ囲（ＭＷ） セファデクス　ペプチドおよび　乾燥セフ！テ′プタスＩｇ当りのタイプ　ｕム ヱニＵ　デキストラ／　ユ五圭旦１−匡■Ｇ−２５１０００−５０００１００− ５０００４−６（ｉ−５０１５００−３００００５００−１００００９−１１Ｇ −）Ｓ　３０００−８００００　１０００−５００００　１２−１５Ｇ−１ｏ０ 　４００Ｇ−１５＋１０００　１０００−１０００００　１５−２０＾−２５， Ｃ−２５＜３００００７−１０Ａ−５０，Ｃ−５０３００００−１，５００００ ｐＨによりて変化デキストランビーズが議論される一方で、上記と同様な特性を 育するポリマーを用いることができる。例えば、そのようなポリマーく上記特性 を持つ）からなる完全な整形外材用移植体を作ることが可能であるし、またはそ の上に骨誘導表面を形成するために、そのようなポリマーで整形外科用移植体を 被覆することもできる。

本発明の概要 本発明の目的は、骨の成長を促進させる移植可能な材料を提供することであるさ らなる本発明の目的は、骨形成誘導タンパク質からなる分子をその内部に保持す ることが可能なポアサイズをもつ有孔性構造を有する移植可能な材料を提供する ことである。

さらに池の本発明の目的は、骨形成誘導因子のための担体としてＩＩ用可能な移 植可能な材料を提供することである。

これらの目的および他の目的は、平均ポアサイズがすくなくとも３０オングスト ロームを示す有孔性表面を有する移植可能な生体材料によって達成される。この ポアサイズは、少なくとも１５，０００からｓｏｏ、ｏｏｏまでの分子量を持つ 分子を保持することが可能なサイズである。この分子量範囲の上限では、平均ポ アサイズは約５００オノグストクームである。デキストランビーズは、この有孔 性を示すもので、生体材料として用いられる。同様なポアサイズを有し、かつ前 記範囲内の分子を保持することが可能な他のポリマーもまた明らかに利用できる 。

この有孔性表面を宵する生体材料は、骨形成誘導高分子に結合する材料の能力に 関連して、材料の骨形Ｉｉ！誘導特性を決定するのにもちいられる。また、材料 は非荷電、負に１Ｒ１１Ｋ、または正に荷電されたものである。

このような生体材料は、すでに述べたように、セファデックスビーズである。分 子量が５０００以上の高分子に対する結合を可能とするポアサイズを有するすべ てのビーズが、骨形成誘導能力を示した。このことは、荷電に係わらず真実であ る。

生体材料は、移植前に骨誘導因子を含むｍ液またはスラリーに浸されることによ って、骨形成誘導因子が取り込まれ、それによってこの生体材料は骨形成誘導因 子を運ぶようになる。あるいは、生体材料は直接的に骨の部位に移植されて、そ こで有孔性生体材料と結合し、骨形成誘導因子を集積させるように働く。

骨の成長を促進させるように作用する有孔性生体材料は、移植可能なデノ〈イス として形成され、そして使用される。また、生体材料は、もとのデ／（イスの大 まかな特性を変丸ることのない、移植可能なデバイスを移植するための被覆材料 としても用いることができる。有孔性生体材料の骨誘導特性は、欠損または損傷 を受けた骨の回復を促進させるのみならず、被覆材として使用することにより移 植された移植体の固定具合いを改善することができる。

好ましい実施９様の記載 下記の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。なお、実施例は本発明を 説明するためのものであって、本発明の意図および範囲を定義または限定するも のではない。

実施例 ファルマノア（Ｐｈａｒｍａｅｉｉ　）社から入手した具なるポアサイズからな る２種類の中性のデキストランビーズ（Ｇ−２５およびＧ−７５）が用いられた 。ビーズを０．　１規定の水酸化ナトリウムで洗浄することによって不純物を除 去し、その後ｐＨｐ衝液でＰＨの平衡を保った。ビーズの滅菌は、これらのビー ズをオートクレーブ（１２０℃、３０分間）することによって行なった。これら のビーズの化学的および物理的特性を荷電ビーズの特性とともに表３に示した。

表３ 分１１［ｉ囲（ＭＷ） 竺二五　竺二工玉亙　ＩｕＬｉ　笠を至ヱエヱ　１区ム乙二ＵＧ−２５なし　中 性　なし　１００Ｇ−５０００Ｇ−７５すＬ　中性すＬ　３０００−４００００ ＤＥＡＥ−Ａ−２５正　弱塩基　ＣＩ−＜　３００００ノ゛エチｋＴｚノエチル ＣＭ−Ｃ−２５負　弱酸　Ｎａ＋　＜　３００００宜ル本゛今ノｌｆ＆ ドリルを用いて１８匹のウサギの大腿骨端部末端に６．０ｍｍの孔を開けた。

孔は中央表面から側方表面に向けて、後方表面まで達することなく形成された。

それぞれのウサギの有枝（ｒｆｇｂｔ　ｌ　ｉｍｂ）を対照用として用い、欠損 部を中性荷電デキストランビーズ（Ｇ−２５）で満たした。左側ドリル孔は、よ り大きなボアを有するビーズＧ−７５で満たした。

これらの材料を移植された状諒で４週間放置し、その時点でウサギは犠牲となっ た。それぞれの肢の顆を、中央部分と側方部分とに切断した。それぞれの大腿骨 の前記中央部分と側方画分とを脱灰化して、メチルメタクリレートに埋め込んだ 。組織学的試験を実施し、その結果を１１４に示した。

表４ ４ＩｌＩＩｉ学的試験結果 り人旦二工　ＬＬ！Ｌ！Ｌ！　駁１辺五監Ｇ−２５，非荷ｌｌ６ Ｇ−７５、荷電、ポアサイズ大　＋　２ψ　−１柔Ｍｉ磁にのみ増殖 ＋、顕著な骨増殖に好適 既知のデータから、骨形成誘導にとって、ビーズ内に荷電された基が存在するこ とが必要であると容易に結論される。しかし、異なるビーズの物理的特性が４Ｇ −２５ビーズがＡ〜２５およびＣ−２５ビーズ七同じポアサイズを有すると容易 に仮定することができる。なぜなら、すべての＾−２ＳおよびＣ−２５ビーズは 、Ｇ−２５ビーズに荷電された基を結合させることによって誘導されるからであ り、また同様の架橋形成ｖｒＲを有するからである。しかし、７１ｉＮＪＱ−２ ５ビーズの実際のポアサイズは、表２を見れば明らかなように、＾−２５および Ｃ−２５ビーズのポアサイズと比較してかなり興なるものである。なぜなら、ポ リマーへの荷電基の結合は、ビーズの膨張能力を増大させるからである。Ｇ−２ ５の分ｍＮＭは、１０００から５ｏｏｏまでに過ぎず、一方＾−２５とＣ−２５ との分画範囲は３００００までである。したがって、帯電効果について、＾−２ ５およびＣ−２５とそれらを比較するため、対照としてＧ−２５使用することは 不ｊｌ切である。なぜなら、これらのビーズ間で非常に異なる電荷以外のなにか （有孔性）があるからである６従来の知見でＧ−２５が骨誘導活性を有しないと いうことは、決して驚くべきことではない。なぜなら、全部ではないとしてもほ とんどの骨誘導性を有するタンパク質は、分子量が５ｏｏｏ以上であるからであ る。

これらの荷電および非荷電−２５ビ一ズ間の有孔性の顕著な違いによって、Ｇ− ７５ビーズが、これはＡ−２５ビーズ、Ｃ−４５ビーズと同じ大きさのポアアイ ズを有するものだが、骨誘導プロセスに有孔性がいかに貢献するかについて調べ るために選択された。この場合、電気的荷電効果とポアサイズ効果とを区別する ことができる。なぜなら、　Ｇ−２５およびＧ−７５ビーズは同じポリマーから できているからであり、骨誘導活性において認められる差異は、ポアサイズ効果 によるものであるはずであるからである。同時にＧ−７５ビーズの結果もまた、 従来用いられてきたビーズと比較して、いかに翼なる荷電ビーズが骨誘導に影響 を及ぼすかどうかを調べるために使用される。

本研究は、非荷電Ｇー７５ビーズを用いた場合、顕著なビーズに関連した新しい 骨の形成が観察され、一方で荷電Ｇ−２５ビーズではビーズに関連した新しい骨 の形成が認められなかった。このことは、微細な孔の存在が生体材料による骨形 成過程にとって重要な役割を演じることを示している。しかし、本発明は微細な 孔の存在が生体材料の骨誘導活性にとって唯一必要とされるものであるというこ とを示すものではない。生体材料および分子と、生きている細胞との間の相互作 用能力も大変重要である。中性または陽性に荷電されたデキストランビーズと、 荷電された骨誘導因子との間の結合を説明するために立体配置の変化による効果 を用いることは大変難しいことである。しかし、双極子力、水素結合、および疎 水結合のような他の分子間に働（力は、生体材料と、骨誘導因子および生きてい る細胞との相互作用に有効である。本発明は、単独で、または被覆部材として使 用される生体材料に存在する適切な微細な孔は、材料の骨誘導活性を促進するこ とができるということを示すものである。

分子量が約８０．　ＧｏｏであるｈＳＧＦを除いて、ＥＣＭにおいて生物学的活 性を示す高分子のほとんどは分子量がＩｓ，０００からｓｏ．ｏｏｏの間である ことから、最小平均微細孔はこれらの高分子に充分適応できる大きさであるべき であるということが予期される。微細孔の上限は、これらの高分子との結合にお いて、下限よりも制限され少ない。ひとつの大きい有孔性デキストランビーｒ　 （Ｇ−７５）のみを渭いたにもかかわらず、基本的な生化学および生物学の知見 にもとづくと、骨誘導に適応される生物学的活性物質の適当なポアサイズは、分 子分画範囲がＭＷ１５．ＯＯＯがらｓｏ，ａｏｏであり、これはお彰よそ３０オ ングストロームから５００オングストロームの大きさに該当すると外挿される。

本発明のいくつかの実施例および諒様が記載されたが、本発明の意図および範囲 から蝋れることなく、斐更および修飾することが可能であることは明らかである 。

要釣書 骨成長を促進させるための移植可能な材料は、少なくとも３０オングストローム の平均ポアサイズを示す微細孔構造を有する。またこの孔を有する材料は、少な くとも１５，０００から５００，０００までの分子量を有する分子を保持するこ とが可能である。

国際調を報告 国際調査報告

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも３０オンダストロームの平均ポアサイズを示す多孔性構造を有し 、少４（とも１５，０００から５００，０００の分子量を有する分子をこのポア 中に保持できる生体材料からなる骨成長を促進させるための移植可能な材料。
2. ２．前記生体材料が湿潤デキストランビーズである請求項１記載の移植可能な材 料。
3. ３．前記平均ポアサイズが５００オングストローム以下である請求項１記載の移 植可能な材料。
4. ４．前記分子が骨誘導因子を含有している請求項１記載の移植可能な材料。
5. ５．湿潤状態で、少なくとも３０オングストロームの平均ポアサイズを示す多孔 性構造を有し、１５，０００から５００，０００の間の分子量を有する分子をポ ア中に保持できる、多数の電荷を帯びていないデキストランビーズからなる骨成 長を促進および刺激するための移植可能な材料。
6. ６．前足分子が骨誘導因子を含有している請求項５記載の移植可能な材料。
7. ７．少なくとも３０オングストロームの平均ポアサイズを示す多孔性構造を有し 、少なくとも１５，０００から５００，０００の間の分子量を有する分子をポア 中に保持できる生体材料で置換移植された組織を被覆し、生体内の組織付近に上 記置換移植された組織を移植することからなる置換移植された組織の回りを組織 成長を促進させるための方法。
8. ８．前記生体材料が湿潤デキストランピーズである請求項７記載の方法。
9. ９．前記平均ポアサイズが５００オングストローム以下である請求項７記載の方 法。
10. １０．前記分子が骨誘導因子を含有している請求項７記載の方法。
11. １１．湿潤状態で、少なくとも３０オングストロームの平均ポアサイズを示す多 孔性構造を有し、１５，０００から５００，０００の間の分子量を有する分子を ポア中に保持できる多数の帯電されていないデキストランピーズから置換移植さ れろ組織を形成し、生体内の組織付近に上記置換移植される組織を移植すること からなる組織成長を促進させるための方法。