JPH05500799A - エキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドおよびその調製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エキソヌクレアーゼ氏几性オリコ゛ヌクレオチドおよびその一０聚立皮 五里 皮盃立旦 本発明は、３′−および７・′または５−がキャップされた末端を含み、それに よってエキソヌクレアーゼによって分解されなくなるオリゴヌクレオチドに関す る。エキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドを分 解されないようにする２つまたはそれ以上のヌクレオチド間ホスホアミデート結 合を、−末端あるいは両末端に有する。

ＤＮＡ分子は、細胞、培養物培地およびヒト血清中に存在するエキソヌクレアー ゼによって分解されるヌクレオチド間のホスホジエステル結合を含む。例えば、 ＤＮＡの組織培養培地中におけるエキソヌクレアーゼによる分解は、約３０分か ら約６時間以内に観察され得る。ホスホジエステル結合を有する合成オリゴデオ キシヌクレオチドは、例えば、ライブラリーからの特異的なＲＮＡまたはＤＮＡ の断片の位置付けをするために、遺伝子工学において日常的に使用される。オリ ゴヌクレオチドは通常、培養培地の様に比較的厳格なストリンジエンシーの環境 にさらされることはないため、この様な使用に対してはオリゴヌクレオチドの長 期安定性は主要な問題ではなく、従って、エキソヌクレアーゼ分解は実質的な問 題ではない。

しかし、長期間（すなわち、数時間または数日より長い期間）の使用に対して安 定なオリゴデオキシヌクレオチドを製造することがしばしば望まれることも事実 である。例えば、ホスホジエステル結合を有するオリゴデオキシヌクレオチドは 、相補的なメツセンジャーＲＮＡに水素結合することによりタンパク質合成をブ ロックするために使用され得、それによってアンチセンス的な様式で用いる核酸 を提供できる。エキソヌクレアーゼに対して安定で切断されないオリゴデオキシ ヌクレオチドはまた、天然に発生する結合因子と競合することによって、または 遺伝子破壊によって、転写過程またはＤＮＡ複製に干渉し得る二本鎖ＤＮＡを形 成するのにも使用され得る。しかし、このように合成オリゴヌクレオチドを使用 するためには、細胞および血清中で、３′から始まって５′同かって現れる、す なわち、オリゴヌクレオチドの消化を、３゛末端から開始する主要活性の、エキ ソヌクレアーゼに対して、合成オリゴヌクレオチドは安定でなければならない。

従って、本発明は、このようなエキソヌクレアーゼ安定性オリゴヌクレオチドに 関する。

鼠１反人： 以下の関連技術は、現在クレームされている本発明の１つまたはそれ以上の局面 に関連する。

ＦｒｏｅｈｌｅｒのＴｅｔ、Ｌｅｔｔ、２７（４６）＋５５７５−５５７８　（ １９８６）は、ポリマーに結合しているデオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート ジエステルを前駆体として、ＤＮＡのアナログである、ホスホアミデート、チオ ホスフェートおよびホスフェートトリエステルを作ることを記載している。

Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１６（１１）：４８３１− ４８３９（１９８８）は、−級および二級アミン由来の１２個のホスホアミデー ト結合を有する１５−ｍａｒの合成を記載している。この化学工程は、参考文献 の４８３３ページに示された図に要約されている。

Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、ｌ＋口１３）　：５３９９ −５４０７　（１９８６）は、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を 経由したデオキシオリゴヌクレオチドの合成を記載している。この化学工程は、 参考文献の５４０１ページの式２に実質的に示されている。

１９８７年４月２日付けで公開された、Ｆｒｏｅｈｌｅｒのヨーロッパ特許公開 第２１９３４２−Ａ２号は、デオキシヌクレオシドＨ−ホスホネート中間体を経 由したＤＮＡの合成が示されている点で、上記の後者２つの参考文献の教示に類 似している。

Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１４（８）：３４ｇ？ −３４９９（１９８６）は、ポリウリジル酸（ポリＵ）およびポリチミジル酸（ ポリｄＴ）と、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合によってオリゴヌクレオチ ド鎖と結合している異なるペンダント基をもつオリゴヌクレオチド、との複合体 を記載している。

５ｔｅｉｎら、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、■（８）　：３２０９−３２２１ （１９８８）は、ホスホロチオエート結合を含むように修飾されたオリゴデオキ シヌクレオチドの研究を示している。著者らは、このようなオリゴヌクレオチド の多数の池の物理化学特性を評価するのに加えて、多数のエンドヌクレアーゼお よびエキソヌクレアーゼに対するこの化合物の感受性を研究している。著者らは 、対照のジエステル体（図３）と比較して、完全に置換されたホスホロチオエー トオリゴデオキシヌクレオチドのＴ、の著しい減少、すなわち、完全に置換され た分子で、Ｔｍの１５−２０℃の減少、および△Ｈの３０−４０　Ｋｃａｌ／ｍ ｏｌｅの減少を、見い出した（　３．２１５ページ）。

Ｂｒ１ｌｌら、Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２９（４３）：５５１７−５５２０（１ ９８８）は、チオホスフェートトリエステルの硫黄酸化によるジヌクレオシドホ スホロジチオエートの調製を記載している。

Ａｇｒａｗａｌ、　Ｔｅｔ、　Ｌｅｔｔ、　２８（３１）：３５３９−３５４２ （１９８７）は、ヌクレオシドメチルホスホンアミダイトを出発物質として使用 した、メチルホスホネート結合を含む、オリゴデオキシヌクレオシドの自動化さ れた合成を記載している。著者は、ヘビ毒ホスホジェステラーゼおよび肺臓ホス ホジェステラーゼによる分解に対する保護を、３°末端における２つの隣接した メチルホスホネート結合が提供するとの結論を下している（そして、５ｔｅｉｎ らと同様に、この著者も、血清、組織培養培地または細胞中におけるオリゴヌク レオチドのヌクレアーゼ安定性を評価していない）。

ＰＣＴ公開ＷＯ３９１０５３５８号の発明者であるＷａｌｄｅｒらは、オリゴヌ クレオチド鎖が細胞および体液内において分解されないように、３”末端を修飾 しオリゴデオキシヌクレオチドを記載している。好ましい修飾は、３−末端ホス ホトリエステル結合の導入であると述べているが、開示されている、３゛−末端 ホスホジエステル結合における修飾には、この結合を、アルキルあるいはアリル ホスホトリエステル、水素ホスホネート、アルキルあるいはアリルホスホネート 、アルキルあるいはアリルホスホアミデート、ホスホロチオエート、あるいはホ スホロチオエ−トと置換させることが含まれている。

（以下余白） 灸朋王」１玉 従って、本発明の第一の目的は、当該分野における上述された要求、およびエキ ソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドを提供することに向けられている。

本発明の他の目的は、３′−末端が修飾されたエキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴ ヌクレオチドを提供することであり、その結果、最初に存在したホスホジエステ ル結合は、所望する数のホスホアミデート結合で置換サレル。

本発明のさらに他の目的は、ホスホロモノチオエートおよび／あるいはホスホロ ジチオエート結合をさらに含有するエキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチ ドを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、相捕的なオリゴヌクレオチド鎖にハイブリダイズし 得るエキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオチドを提供することである。

本発明のさらなる目的は、このようなエキソヌクレアーゼ抵抗性オリゴヌクレオ チドを製造する方法を提供することである。

本発明のなお一層さらなる目的は、多数の機能を行い得る、例えば、輸送を助け る、色素標識として働（、あるいは架橋結合を可能とする、基でオリゴヌクレオ チドをエンドキャッピングするための方法を提供すること。

本発明のさらなる目的、利点、および新しい特徴は、以下に示す記述において一 部分が明らかにされ、そして、一部分は以下の試験によって、当業者にとって明 らかであり、あるいは本発明の実施により知られ得る。

第一の局面において、本発明は、３゛末端および／あるいは５°末端において２ 個あるいはそれ以上のホスホアミデート結合を有するオリゴヌクレオチドを提供 し、そして、このオリゴヌクレオチドはエキソヌクレア７ゼによる分解に対して 、抵抗性がある。ホスホアミデート結合の数は、少なくとも１個であり、そして 相補的なオリゴヌクレオチド鎖に対するハイブリダイゼーションを妨げる数より 少ない、および／あるいは前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡにハイブリダイズす る場合、ＲＮＡ５ｅ活性を妨げる数より少ない。好ましくは、少な（とも２個で あり、そして、さらに好ましくは、約２個〜ｌＯ個である、ホスホアミデート結 合が、３°末端および５°末端のいずれか一方あるいはその両方で組み込まれる 。このホスホアミデート結合は、以下で詳細に記載される多くの異なるタイプの 基のいかなるものによっても置換され得る。

他の局面において、エキソヌクレアーゼ抵抗性は下式Ｌ！ｌあるいはＩＩＬ　す なわち、上で記載されたホスホアミデート結合およびホスホロモノチオエートお よび／あるいはホスホロジチオエート結合を有することで提供される：（以下余 白） ここで、各ｎ、ｍ、ｉｓ　ｊおよびＳは、独立して整数であり、そして、各Ｓは 、約２〜ｌＯの範囲であり；各ｎおよびｍは、独立して１〜約５０であり：式Ｉ および１１においてＳ＋ｎは、１００より小さく；そして、式ＩＩ＋においてｓ 十ｓ＋ｍは、約１００より小さく；各ｉは、ｌ＝ｎまで変化し；各ｊは、ｌ−ｍ まで変化し；Ｔは、水素あるいはヒドロキシル保護基てあり、　Ｒ１およびＲ２ は、Ｒ１およびＲ２の両方が水素ではないという条件で、水素、２０個あるいは それより少ない炭素原子を有するヒドロカルビル置換基、および２０個あるいは それより少ない炭素原子および１個〜３個のオキ／基を有するオキシヒドロカル ビル、からなる群かう独立して選択される基であり、ここで、該ヒドロカルビル およびオキシヒドロカルビル置換基は、１個〜２０個の炭素原子を有する直鎖ア ルキルあるいは分枝鎖アルキル、２個〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニ ルあるいは分枝鎖アルケニル、３個〜２０個の炭素原子を有するシクロアルキル あるいはシクロアルケニル、１個〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルコキシあ るいは分枝鎖アルコキシ、あるいは６〜１８個の炭素原子を有するアリールであ り； 各Ｂは、独立して、保護された複素環式塩基あるいは保護されていない複素環式 塩基であり； 各Ｘ、およびＸ、は、独立して、０あるいはＳであり；そして、各ＹＩおよびＹ 、は、独立して、Ｒ１−５Ｒあるいは−ＯＲであり、ここでＲは、Ｒ１およびＲ ２で定義されたのと同じである。

本発明はまた、このようなエンドキャップされたオリゴヌクレオチドを調製する 方法を提供する。

発明日を　する　゛ ここで用いられている用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」 は、包括的に、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リポースあ るいはその修飾された形を含む）、ポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースあるい はその修飾された形を含む）、および、プリンあるいはピリミジン塩基のＮ−グ リコンド、または修飾されたプリンあるいはピリミジン塩基のＮ−グリコンドで ある、いかなる他のタイプのポリヌクレオチドでもあり得る。用語「ヌクレオシ ド」は、同様に、包括的に、リポヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド、あ るいは、プリンあるいはピリミジン塩基の、または修飾されたプリンあるいはピ リミジン塩基のＮ−グリコシドである、他のいかなるヌクレオシドでもあり得る 。用語「ポリヌクレオチド」と「オリゴヌクレオチド」との間には、長さに関し て意図した区別はなく、これらの用語は、交換して使用され得る。

ここで用いられる用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、周知のプリ ンおよびピリミジン塩基、すなわち、アデニン、チミン、シトシン、グアニンお よびウラシルだけでなく、保護基を含む他の複素環式塩基、または他の修飾され たあるいは誘導された他の複素環式塩基、をも含有する基を包含し得ることは評 価されるべきである。

ここで用いられるような「修飾されたヌクレオシド」または「修飾されたヌクレ オチド」によって、１個あるいはそれ以上の保護基、例えば、アシル、インブチ リル、ベンゾイルなど、および当該分野において知られている広範囲の修飾され た塩基および誘導された塩基のいかなるものも含有する化合物をも含有すること を意図している。このような修飾された塩基あるいは誘導された塩基の例として は、以下のものが包含サレる＝５−フルオロウランル、５−ブロモウラシル、５ −クロロウラシル、５−ヨードゥランル、ヒボキサンチン、牛サンチン、４−ア セチルントンン、５−（カルボキシヒドロ牛ジメチル）ウラシル、５−カルボキ シメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキンメチルアミノメチル ウラシル、ジヒドロウラシル、β−Ｄ−カラクトンルクエオシン、イノノン、Ｎ ６−イツペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシ ル、ｌ−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２ −メチルアデニン、２−エチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシト シン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウ ラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルク エオシン、５゜−メト牛ジカルボニルメチルウラシル、５〜メトキシウラシル、 ２−メチルチオ−Ｎ６−イツペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メ チルエステル、ウラ／ルー５−オキシ酢酸、シェードウラシル、フェオシン、２ −チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオ ウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウ ラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプ ロピル）ウラシル、および２．６−ジアミノプリン。

修飾されたヌクレオチドあるいはヌクレオチドはまた、糖基上にも修飾を含有し 得る。例えば、１個あるいはそれ以上のヒドロキシル基が、ハロゲンあるいは脂 肪族基で置換されるか、あるいは、エーテル、アミンなどに機能化され得る。

本発明によるポリヌクレオチドは、いがなる長さでもあり得るが、たいていの遺 伝子工学の応用においては、長さ約３個〜約ＳＯ個のヌクレオチドが、特に有用 である。本発明では、ポリヌクレオチドの３°末端および／あるいは５°末端は 、少なくとも２個のホスホアミデートによるヌクレオチド間結合を含有する。そ の残りのヌクレオチド間結合は、ホスホジエステル結合、ホスホロチオエート結 合あるいはホスホロジチオエート結合、あるいはホスホアミデート以外の他のい がなるヌクレオチド間結合でもあり得、あるいはこれらの他の結合の組み合せで あり得る。このような非ボスホアミデート結合を調製する方法は、当該分野で知 られており、例えば、上記で引用され、そしてここでは参考文献として援用され ている、ＦｒｏｅｈｌｅｒらのＮｕｃ、Ａｃｆｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：５３９９ −５４６７（１９８６）、およびＦｒｏｅｈｌｅｒ、　Ｂ、のＴｅｔ、Ｌｅｔｔ 、　２７：５５７５−５５７８（１９８６）に教示されている。

ヌクレオチド間のホスホジエステル結合は、好ましくは酸化によって、例えば、 水性のヨウ素で、水素ホスボネート結合から調製される。典型的な手順は、Ｐｙ ｒ／ＮＭＩ／ｌ１２０／ＴＨＦ　（５：　ｌ　：５：９０）に溶解した０、１Ｍ のヨウ素中で、水素ボスボネートを約２〜３分間処理し、次いで、Ｅｔ３／Ｈ２ ０／ＴＨＦ（５：５：９０）に溶解した０゜１Ｍのヨウ素でさらに約２〜３分間 処理することを包含する。

最初に存在する水素ホスホネート結合をイオウで処理することにより、ホスホロ モノチオエート結合は形成される。この反応は、ピリジンのような塩基性溶媒を 加えた、ＣＳ２のようなイオウ溶媒を典型的に含む溶媒系中で、室温付近で約２ ０分間程度行われる。他の適切な溶媒系としては、ＣＳ２／ルチジンおよびＣ３ ２／トリエチルアミンが挙げられ、イオウ元素を溶解するよう作用するイオウ溶 媒としてＣＳ２が好ましい。以下の式は、推測される反応を示している： （例えば、上記で引用された５ｔｅｉｎらを参照せよ。）水素ホスホロジチオエ ート結合を形成するために、ホスホロモノチオエート基の調製に関して上記で記 載したものと同じ条件を用いて、水素ホスホロモノチオエート結合のイオウ化は 行われる。（注意：ここで用いられる用語「ホスホロチオニート」は、「ホスホ コモ／チオエート」および「ホスホロジチオエート」結合の両方を包含すること を意図する。）エンド牛ヤＩブされたオリゴヌクレオチドの構造：本発明のオリ ゴヌクレオチドは、上記で述べられているように、生理学的条件および組織培養 条件の両方の下で、分解に対して低抗性があり、そして特に、二手ソヌクレアー ゼによる分解に対して抵抗性がある。

オリゴヌクレオチドがこのような酵素分解に対して低抗性カアルために、３“末 端に最初に存在したホスホジエステル結合は、所望された数のホスホアミデート で置換され、その数は、少なくとも１個であり、そして、相捕的なオリゴヌクレ オチド鎖にハイブリダイズすることを妨げられる数より少なく、および／あるい は前記オリゴヌクレオチドがＲＮＡにハイブリダイズした場合ＲＮＡ　ｓｅＨ活 性が妨げられる数より少ない。このような修飾は、付加的にあるいは選択的に５ °末端に作成され得る。

ホスホアミデート結合の数は、相補鎖と形成したいかなる二本鎖の融点も、最初 のホスホジエステル結合のみを含有するオリゴヌクレオチドの融点に対して、約 １０’Ｃより少ない温度の低下がもたらされるように、選択されることが好まし い。

好ましくは、ホスホアミデート結合の数は、形成された二本鎖の融点が、約５℃ より少ない温度だけ低下されるような数である。存在するホスホアミデート結合 の数は、典型的におよび好ましくは、約２と１０との間の数、さらに好ましくは 、約２と８との開の数、そして最も好ましくは、約２と６との間の数である。

ホスホアミデート結合は次式を有する：（以下余白） ここで、Ｒ１およびＲ２基は、置換基であり、それは、相補鎖とハイブリダイゼ ーションすることを妨げないように選択されなければならない。はとんどの場合 、この基Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１およびＲ２の両方が水素ということはない条件 で、水素、２０個あるいはそれより少ない炭素原子を有するヒドロカルビル置換 基、および１個〜３個のオキシ基を含有し、２０個あるいはそれより少ない炭素 原子を有するオキシヒドロカルビル１ｍ基、からなる群から独立して選択される 。すなわち、ここでいうホスホアミデート結合は、いつもＮ−置換されている。

この場合、２個の置換基のうちの１個が水素であることが好ましい。適切なヒド ロカルビル置換基およびオキシヒドロカルビル置換基は、以下のものを包含する 。例えば、１個〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルキルあるいは分枝鎖アルキ ル、２個〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルケニルあるいは分枝鎖アルケニル 、３個〜２０個の炭素原子を有するシクロアルキルあるいはシクロアルケニル、 １個〜２０個の炭素原子を有する直鎖アルコキシあるいは分枝鎖アルコキシ、あ るいは６個〜１８個の炭素原子を有するアリール。このヒドロカルビル置換基は 、例えば、弐ＣＨ３０−（ＣＨ２）Ｘ−を有するアルコキシ置換基あるいは式Ｃ Ｈ３（ＣＨ２）、−を有する直鎖アルキル基であり得、ここで、Ｘは１〜２０の 範囲を包含する整数であり、好ましくは、１〜１ｏの範囲を包含する整数であり 、そして、ｙは０〜１５の範囲を包含する整数である。上述され１こ基に含まれ る好ましいオリゴヌクレオチド結合の例においては、Ｒ’およびＲ２のうちの１ 方はＨであり、他方は２−メトキシエチル、ドデシル、あるいは１−プロピルの いずれかである。　（２−メトキシエチルおよびドデシル結合ハ、本明細書では しばしば、それぞれｒ　ＭＥＡＪおよびｒ　Ｃｌ２Ｊと呼ばれる。） このＲ１およびＲ２基はまた、前記のものに加えて、高分子種、例えば、糖、ポ リペプチド、色素基、親油基、ポリマー、ステロイドホルモンなどであり得る。

「親油性」基は、外部細胞表面と化学的に親和性の基、すなわち、オリゴヌクレ オチドを、膜と付着させ、膜と融合させ、そして通過させることを可能とする基 、を指す。このような親油基の例には、　（上記で記載された長鎖のヒドロカル ビル基に加えて）脂肪酸および脂肪アルコールがある。

Ｒ１および／あるいはＲ２に用いられ得る好ましいポリペプチドの例としては、 トランスフェリンおよび上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）が包含され、一方、適切な 非ポリペプチドポリマーとしては、イオン性、非イオン性および両性イオンポリ マーが包含される。特に好ましいポリマーの例は、ポリエチレングリコールであ る。

ステロイド置換基としては、以下の基本的な構造を含む、ステロール、バイオア シッド（ｂｉｏａｃｉｄｓ）　、カルシアツクグリコシド（ｃａｒｄｉａｃ　ｇ ｌｙｃｏｓｉｄｅｓ）、セポナン（５ｅｐｏｎａｎｓ）、および性ホルモンを含 む一般的な系列の脂質化合物のいずれをも包含する： ン（副腎線で製造される）、性ホルモン（プロゲステロン、アンドロゲンおよび エストロゲン）を包含する。

これら種々のＲ１およびＲ２基は、オリゴヌクレオチドにいかなる種類の所望の 性質をも与え得る。例えば、Ｒ１およびＲ２がポリマー、例えば、ポリエチレン グリコール、ポリペプチドあるいは長鎖のヒドロカルビル基のような親油基であ る場合、このような基は、細胞膜を通じたオリゴヌクレオチドの輸送あるいは透 過を促進し得、その結果、オリゴヌクレオチドの細胞内吸収を増加する。Ｒ１あ るいはＲ２基はまた、標的鎖に開裂を促進する、または該オリゴヌクレオチドを 標的鎖に挿入するための共有結合を提供するような、オリゴヌクレオチドが結合 する標的ＤＮＡあるいはＲＮＡに影響を及ぼす基であり得る。

Ｒ１およびＲ２基は、さらに、切断基（例えば、相補的な鎖を切断するための部 位）、あるいはりセブター基（例えば、リセブターリガンド）として機能し得る 。

これらの置換基がエキソヌクレアーゼ抵抗性を与え、そして、相補的なオリゴヌ クレオチド鎖にハイブリダイゼーションすることを妨げない限りは、本発明のオ リゴヌクレオチドが、ここでは明白には開示されていない他のホスホアミデート Ｎ−置換基をも包含し得ることは、当業者によって評価されるべきである。

（以下余白） 本発明はまた以下の式１．　ＩＩまたはｍのオリゴヌクレオチドを含有するオリ ゴヌクレオチド組成物を包含する。即ち、ホスホロモノチオエートおよび／また はホスホロジチオエート結合がホスホアミデート結合の他に取り込まれている。

ここで、Ｂ、Ｔ、Ｒ’、Ｒ２、Ｘｉ、Ｘ、、Ｙｊ、Ｙｊ、ｎＳ　ｍ。

１１　ｊ及びＳは前記と同じである。これらの構造においてはホスホアミデート 結合の数を定義するＳ″は２−８の範囲にあり、さらに好ましくは２−６の範囲 である。ｍおよびｎもまた上記範囲にあることが好ましい。

合成方法： 本発明の一つの実施態様によると、３′−キャップされたオリゴヌクレオチドは 、式■で示されるポリマーに結合したポリヌクレオシドを最初に調製することに よって得られる。

ここで、ｐは固体状態のポリマー担体または他のタイプの固体担体であり、Ｂは ヌクレオシドの塩基部分、即ち、プリンもしくはピリミジン塩基、またはあらゆ る修飾されたプリンもしくはピリミジン塩基である。オリゴヌクレオチドの合成 に常用されるように、塩基の官能基すなわちアミン基は合成の過程中適当に保護 され、完成したポリヌクレオチドがポリマー担体から離された後に、除去される 。一般的に、上記式■において、ポリマー担体へは３′　ヒドロキシ基を介して 結合し、ヌクレオシドの５′　ヒドロキシ基が遊離ヒドロキシ基である。Ｔ残基 はオリゴヌクレオチド合成に使用される一般的なヒドロキシ保護基を表し、好ま しくはＤＭＴ基（ジメトキントリチル）またはＭＭＴ基（モノメト牛シトリチル ）を表す。該分野の公知の方法でポリマーに結合したポリヌクレオシド水素ホス ホネート（■）は、好ましくは、５′〜が（好ましくは５　ＤＭＴで）保護され たヌクレオシド水素ホスホネートのＤＢＵ（１，β−ジアザビシクロ［５，４， Ｏ］ラウンク−７−ニンアンモニウム塩）を活性化側存在下、３°　ヒドロキシ 基を介してポリマーに結合したヌクレオシドと反応させることにより調製される 。このようなポリマーに結合したポリヌクレオシド水素ホスホネートの調製法は 例えばＦｒｏｅｈｌｅｒ、Ｂ、、ら、　Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１６：　４８３１−４８３９　（１９８８）；　Ｆｒｏ　ｅｈｌ　ｅｒ。

Ｂ、　、　ら、　Ｎｕｃ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４：５３９９−５４６７ 　（１９８６）；およびＦ　ｒ　ｏ　ｅ　ｈ　ｌ　ｅ　ｒ、Ｂ、。

ら、　Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ　ａｎｄ　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄ旦　旦：　２８７ −２９１　（１９８７）に開示されている。

次に、ポリマーに結合したポリヌクレオチドの５′　ヒドロキシ基を連続的に脱 保護し、次のヌクレオシド水素ホスホネートと縮合することにより、（ポリヌク レオチドの３′末端で２またはそれ以上のヌクレオチド間結合を形成するために ）１またはそれ以上のヌクレオシド水素ホスホネートが付加され得る。オリゴヌ クレオチド鎖の延長は、一連の縮合の中で予め決められた配列に従って進行され る。それぞれの縮合はオリゴマーに他のヌクレオシドを付加することになる。縮 合は典型的には脱水剤を用いて行われる。脱水剤は適切なリン酸化剤またはアシ ル化剤であり、例えばインブチルクロロフォルメート、ジフェニルクロロホスフ ェート、有機酸無水物（無水酢酸、無水イソ酪酸、トリメチル酢酸無水物等）及 び例えば、ピバロイルクロライド、ピバロイルブロマイド、１−アダマンチルカ ルボキシリッククロライドあるいはベンゾイルクロライド等の有機酸ハロゲン化 物が挙げられる。好ましい縮合剤はピリジン　アセトニトリル中のピバロイルク ロライドである。それぞれの連続するヌクレオシド水素ホスホネートの添加の前 に、５′−保護基あるいは担体に結合したヌクレオチドは除去される。典型的に は、ＤＭＴ基の除去は２゜５％ｖｏ　ｌ　ｕｍｅ／ｖｏ　ｌ　ｕｍｅのジクｏｏ 酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２で処理するが、１％ｗｅ　ｉ　ｇｈ　ｔ／ｖｏ　ｌ　ｕｍｅ のトリクロロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２またはＺｎＢｒ２飽和ニトロメタンも有用であ る。池の公知の保護基に適した他の脱保護手段は当業者には当然であろう。

担体は無水ピリジン／アセトニトリル（１／１．ｖ／ｖ）で洗浄するのが好適で あり、縮合反応は要求されるだけのサイクルで完成し、所望の数の３”末端のヌ クレオチド間結合を形成し、ホスホアミデートに変換される。必要な回数の合成 終了後、担体に結合したポリヌクレオチド水素ホスホネートは酸化され、水素ホ スホネートヌクレオチド間結合は、好ましくは、Ｆ　ｒ　ｏ　ｅ　ｈ　１　ｅ　 ｒ、Ｂ、、ら、ＮｕｃｌｅｆｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、　上６：　４８３１−４８ ３９　（１９８８）に記載されているように、Ｒ１およびＲ２は先に定義したも のである所望のアミンＮＨＲ’Ｒ２およびＣＣｌ４で処理することにより、ホス ホアミデート結合に変換される。四塩化炭素が好適であるものの、他の穏やかな 酸化剤も使用できる。

ホスホアミデートヌクレオチド間結合を形成する酸化反応の終了後、オリゴヌク レオチドが、非ホスホアミデート結合、例えばホスホジエステル結合、ホスホロ チオエート結合するいはホスホロジチオエート結合を形成する方法で完成される 。

これらの方法は上記引用されている分野で公知であり、または本明細書に引用さ れている。オリゴヌクレオチドを完成させる好ましい方法は、５′が保護された ヌクレオシド水素ホスホネートで配列を続けることである。例えば、５′末端が キャップされていない場合は、最後の５′か保護されたヌクレオシド水素ホスホ ネートが付加された後、すべての水素ホスホネート結合が酸化されてジエステル 結合を形成する。この酸化は好ましくはヨウ素水溶液あるいは他の酸化剤例えば Ｎ−クロロスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシンイミド、塩、過ヨウ素酸による 。これにより、ホスホアミデート結合である３′末端がキャップされた結合を除 いて、全てのヌクレオチド間結合がホスホジエステル結合となる。その後、オリ ゴヌクレオチドは通常の方法、好ましい例としては濃アンモニア水中で反応させ ることにより、担体から分離され得る。あらゆる保護基もその保護基の性質に応 じて、上述のように約２％のジクロロ酢酸／ＣＨ２Ｃｌ２、あるいは約８０％酢 酸あるいは他の通常の方法で除去される。所望のオリゴヌクレオチドはその後Ｈ ＰＬＣ，ポリアクリルアミドゲル電気泳動または他の慣用的な技術を用いて精製 される。

以下のスキームは本発明の範囲にある種々の合成プロセスを説明するものである 。

１」＝Ａユ Ｔ：保護基 Ｏ：保護基または固体の担体 ｉｌｌから５に変化する Ｑ：水素または−ＮＲＩＲ２（ただし、少なくとも一つの。１は水素である） Ｂ・プリンまたはピリミジン塩基 Ｒ１、Ｒ２，明細書参照 スキーム２ａ ↓ Ｔ、＠、Ｘ＋、Ｙｌ、Ｒ１、Ｒ２＝明細書およびスキーム１でｌ二≦仁≧ Ｔ、Ｘ：、Ｙ、、Ｒ１、Ｒ２、ｓ、ｎ＝明細書およびスキーム１および２ａで定 義されているとおり 」２ニム１ ６）追加の５″保護のヌクレオシドボスポネートと縮合、酸化剤存在下、随意的 にＨＮＲＩＲ２と反応してもよい前述の考察はモノヌクレオシド水素ホスホネー トの連続的付加についてであるが、ポリヌクレオチド例えばジヌクレオチドまた はトリヌクレオチドを用いることによって、所定のサイクルにおいて、１個また はそれ以上のヌクレオチドが付加され得ることは理解される。

また、上述の方法が固形状態の担体の使用と関連して記載されている一方、目的 とするオリゴヌクレオチドが小さい場合、すなわち例えばわずか５個のヌクレオ チドを含有°する場合（従って４つのヌクレオチド間の結合のみを有し、そのう ちの２つはホスホアミデート結合である）、固形状態の担体を使用しなくても合 成を実行することが可能であることもまた理解される。このような場合は、３′ 保護基がそのまま残って５′保護基だけが選択的に除去されるように、合成に使 用される５′保護基とは異なる通常の３′　ヒドロキシ保護基が使用され得る。

２つまたはそれ以上のホスホアミデート結合はそれぞれが同一のＲ１およびＲ２ 基を有する必要はないこともわかる。このことは、最初のヌクレオチド間の水素 ホスホネート結合を生じ、次にこれを第一番目のアミンで酸化して、第２の水素 ホスホネートヌクレオチド間結合を形成し、次に第２の（異なる）アミンの存在 下でこれを酸化することにより達成される。この結果、混合のホスホアミデート ヌクレオチド間結合を有する、キャップされたオリゴヌクレオチドが生じる。

本発明の他の実施態様は、５′−キャップのオリゴヌクレオチドが生じ得る。こ のような場合、水素ホスホネートヌクレオチド間結合のみを有するポリマーに結 合したオリゴヌクレオチドを最初に形成し、次にこのヌクレオチド間結合を酸化 してホスホジエステル（またはホスホロチオエートあるいはホスホロジチオエー ト結合）を形成することにより、上述の方法が改変され得る。その後、最後の２ （あるいはそれ以上の）サイクルの間で、最後の２あるいはそれ以上のヌクレオ シドが添加され、ついでアミンＮＨＲ’Ｒ２と反応させて５′−エンドキャ、ブ が形成される。別の方法として、５′末端はポリヌクレオチド、例えば所望のホ スホアミデートのヌクレオチド間結合を有するトリヌクレオチドあるいはテトラ ヌクレオチドを添加することにより付加される。

更に別の実施態様として、５′および３′末端がキャップされたオリゴヌクレチ ドを作るのに上記方法の両方を組み合わせて使用され得る。３′で結合したオリ ゴヌクレオド上の最初の２つ（またはそれ以上）のヌクレオチド間結合は酸化さ れ得てホスホアミデート結合を形成し、その後、　（ホスホジエステル、ホスホ ロチオエートあるいはホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合を有し）、最 後の２つくまたはそれ以上）の結合が前述の方法で形成されるホスホアミデート 結合であるように、オリゴヌクレオチドの非末端部分が形成される。

使用方法： 本発明に従って作成される５′−あるいは３′−にホスホアミデートキャップを 有するオリゴヌクレオチドはウィルス病（例えばＨＩＶ、Ｂ型肝炎、サイトメガ ロウィルス）、癌（例えば白血病、肺癌、乳癌、結腸癌）あるいは代謝異常の治 療剤、免疫調整剤などとして使用され得る。この末端がキャップされたオリゴヌ クレオチドは、細胞内の環境のみならず血清などの細胞外流動体においても安定 であり、病気や障害に独特に関係する蛋白の合成、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ の転写、複製を選択的に阻害するのに用いられ得る。本発明の末端がキャップさ れたオリゴヌクレオチドは同様に動物の健康管理の治療剤、植物遺伝子調節（例 えば植物成長促進因子）あるいは例えば安定なりＮＡプローブとして微生物、オ ンコジーン、遺伝的欠損その他の検出するためのヒト診断薬としても、あるいは 動物細胞、植物細胞、微生物およびウィルスの遺伝子機能の研究試薬としても使 用され得る。また病気治療のためあるいは化粧用途として皮膚科学に適用もでき る。そのほかにもエキソヌクレアーゼによる分解に対して安定であることから、 細胞の比較的厳しい環境のなかでも長くオリゴヌクレオチドとしての状態を保つ ため多数の他の用途が可能である。

本発明は好ましい特定の実施態様と関係して記述されているが、上記記載と以下 の実施例は発明の説明を意図し、発明の範囲を限定するものではないことが理解 されよう。別の局面で、本発明の範囲内における効果あるいは変更は、本発明− に関係する当業者には明がである。

（以下　余白） 寒ｊＩ−二 ポリマーに結合したポリヌクレオシドＨ−ホスホネートは、Ｆｒｏｅｈｆｅｒら 、前出、により記述されているように、保護されたヌクレオシドＨ−ホスホネー トのＤＢＵ塩を用い、多孔質性のコントロールガラス上で調製された。ジエステ ル結合はヨウ素水溶液の酸化により作り出され、アミド結合はアミン／　ＣＣ１ ａの酸化により作り出された。２回のカップリングの後、ポリヌクレオ／ドＨ− ホスボネートを２−メトキシエチルアミン／ピリジン／　ＣＣｌ　ａ　（１：　 ５　：　５　）溶液で酸化したく２０分）。続いてさらに１２回のカップリング およびヨウ素水溶液（０，１Ｍ　Ｎ−メチルモルホリン／水／ＴＨＦ。

５：５：　９０中）による酸化で、３”末端に２つのホスホアミデート結合を有 し、そして１２個のジエステル結合を有する１５−ｍａｒを生成した。このオリ ゴマーを固体担体がら除去し、濃ＮＨ４ＯＨ（４５°ｃ／１８時間）により脱保 護し、そして５０ｍＭＴＥＡＰ水溶液中のアセトニトリル（ＣＨｓＣＮ）グラジ ェントによるＨＰＬＣ（ＰＲＰ）で精製した。ＤＭＴを生成物の画分から除去し く８０％酢酸／室温／２時間）、蒸発、脱塩、および蒸発を行った。さらに特徴 づけるために、およそ１８ｇの精製した生成物の５゛末端をＴ４ポリヌクレオチ ド牛ナーゼおよびγ−３２Ｐ　ＡＴＰでラベルした。

Ｋ皿皿主 ポリマーに結合したポリヌクレオシドＨ−ホスホネートは、前出実施例のように 保護されたヌクレオシドＨ−ホスホネートのＤ８Ｕ塩を用いて多孔質性コントロ ールガラス上で調製した。１２回の力、プリングの後、ポリヌクレオシドＨ−ホ スホネートをヨウ素水溶液（０，１Ｍ濃度　Ｎ−メチルモルホリン／水／ＴＨＦ 、５：　５：　９０中）で酸化し、続いてさらに２回のカップリングおよび２− メトキシエチルアミン／ピリジン／　ＣＣＩ　ｍ　（１：　５　：　５　）溶液 による酸化（２０分）で、３“末端に１２個のジエステル結合および５′末端に おける２つのホスホアミデート結合を有する１５−ｍａｒを生成した。このオリ ツマ−を固体の担体から除去し、濃ＮＨ４ＯＨにより脱保護しく４５°Ｃ／１８ 時間）、そして５０ｍＭＴＥＡＰ水溶液中のアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）グラ ジェントによるＨＰＬＣ（ＰＲＰ）で精製した。ＤＭＴを生成物の画分から除去 しく８０％酢酸／室温／２時間）、蒸発、脱塩、および蒸発を行った。

亙１」引エ ポリマーに結合したポリヌクレオシドＨ−ホスホネートは、前出実施例のように 保護されたヌクレオシドＨ−ホスホネートのＤ　Ｂ　Ｕ塩を用いて多孔質性コン トロールガラス上で調製した。ジエステル結合はヨウ素水溶液の酸化により作り 出され、アミド結合はアミン／　ＣＣｌ　ｍの酸化により作り出された。

２回のカップリングの後、ポリヌクレオシドＨ−ホスホネートを２−メトキンエ チルアミン／ピリジン／ＣＣ１４（１：５＝５）溶液で酸化したく２０分）。続 いてさらに１ｏ回のカップリングおよびヨウ素水溶液（０，１Ｍ　Ｎ−メチルモ ルホリン／水／ＴＨＦ、５：　５：　９０中）による酸化で、３′末端に２つの ホスホアミテート結合を有し、そして１０個のジエステル結合を有する１３−ｍ ｅｒが生成された。これをさらに２回の力・７ブリングおよび２−メトキシエチ ルアミン／ピリジ：’／ＣＣ１ａ（１：　５：　５）溶液による酸化（２０分） を行うことにより、３”末端に２つのホスホアミデート結合、１０個のジエステ ル結合、および５′末端に２つのホスホアミデート結合を有する１５−ｍｅｒを 生成した。このオリゴマーを固体担体から除去し濃ＮＨＡＯＨにより脱保護しく ４５トリル（ＣＨ２ＣＮ）グラジェントによるＨＰＬＣ（ＰＲＰ）で精製した。

ＤＭＴを生成物の画分から除去しく８０％酢酸／室温／２時間）、蒸発、脱塩、 および蒸発を行った。

Ｌ皿匹土 実施例１の手順を繰り返し、ドデシルアミンを用いて３′末端に２つのホスホア ミデート結合と１２個のジエステル結合を有する１５−ｍａｒを作った。このホ スホアミデート結合は、本文中の前半に定義されているＲ１とＲ２の一方が水素 で他方がドデシルである。

Ｋ里五二 ２−メトキシエチルアミンのかわりにドデシルアミンを用いて実施例２の手順を 繰り返し、３′末端に１２個のジエステル結合と５′末端に２つのホスホアミデ ート結合を有スる１５−ｍｅｒか生成した。このホスホアミデート結合は、前出 例のように置換されている。すなわち、Ｒ１とＲ２の一方が水素で他方がとドデ シルである。

Ｋ里匹旦 ２−メトキシエチルアミンのかわりにドデシルアミンを用いて実施例３の手順を 繰り返し、３″末端に２つのホスホアミデート結合と１０個のジエステル結合、 および５″末端における２つのホスホアミデート結合を有する１５−ｍｅｒが生 成した。このホスホアミデート結合は、先の２実施例のようにＮ−置換されてい る。

Ｋ血二二 プロピルアミンを用いて実施例１の手順を繰り返し、３′末端に２つのホスホア ミデート結合と１２個のジエステル結合を有する１５−ｍｅｒを作った。このホ スホアミデート結合は、本文中ですでに定義されているＲ１とＲ２の一方が水素 で他方がｎ−プロピルである。

Ｋ里丘主 ２−メトキノエチルアミンのかわりにプロピルアミンを用いて実施例２の手順を 繰り返し、３′末端に１２個のジエステル結合と５″末端に２つのホスホアミデ ート結合を有する１５−ｍｅｒが生成した。このホスホアミデート結合は、前出 例のように置換されている。すなわち、Ｒ１とＲ２の一方が水素であり、他方が とｎ−プロピルである。

Ｋ皿五且 ２−メトキシエチルアミンのかわりにプロピルアミンを用いて実施例３の手順を 繰り返し、３′末端に２つのホスホアミデート結合と１０個のジエステル結合、 および５′末端に２つのホスホアミデート結合を有する１５−ｍａｒが生成した 。このホスホアミデート結合は、先の２実施例のようにＮ−置換されている。

以下の実施例は、本文中に記述されクレームされているようにエンドキャップさ れたオリゴヌクレオチドを用いて行われたハイブリッド形成の安定性の研究につ いて述べている。

エンドキャップを含むオリゴヌクレオチドについて、相補的な一本鎖ＤＮＡ配列 が安定な二量体を形成しうる能力を検討した。検討した種々のヌクレオチドを以 下の表１に示す。

二量体の安定性は、広い温度範囲にわたり溶液中の融解温度Ｔ、を決めることに より測定した。実験は、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ。

５ｍＭＮａ２ＨＰＯ４と３μＭのＤＮＡ５　ｐＨ７，１の溶液中で行った。得ら れた表１に示す結果は、相補的配列との結合が実質的には３′−エンドキャップ の修飾に影響されないことを意味している。

（ＣＭ２１．、ＣＭ、（Ｃａ１２）Ｈｅド３寒韮ヱ［Ｌ工 ３′末端の２つのヌクレオチド間結合がエンドキャップされた他の数個のオリゴ ヌクレオチドについて相補的な一本鎖ＤＮＡとの安定な２量体を形成する能力を 、前出例で記述されているように調べた。結果は表２に示す。

寒韮ヱ１１１２ 以下の実施例は、エンドキャップされたオリゴデオキシヌクレオチドのウィルス 阻害活性と細胞毒性の程度を決めるために使用され、２種類の３′末端のヌクレ オチド間結合が２−メトキシエチルアミンおよびドデシルアミンでキャップされ たオリゴヌクレオチドを用いた。

急性感染のアッセイは、ＨＩＶ感染に影響を受けやすいＭ○ＬＴ−４セルライン を使用した。ＨＩＶ　ｐ２４の測定は、およそ０．１の感染多重度でウィルスに 感染してから７日後にウィルスの複製阻害を測定して行った。およそ１Ｘ１０６ 個の細胞をオリゴヌクレオチド中で前培養し、洗浄し、ウィルスのストックで感 染させた後、オリゴヌクレオチド中で７日間培養した。ＨＩＶ　ｐ２４の上澄中 の含量をラジオイムノアッセイで測定し、オリゴヌクレオチドのないコントロー ルの感染と比較した。結果は、オリゴヌクレオチドを含む培地中で検出されたｐ ２４のフントロールに対する割合として表された。アンチセンスオリゴヌクレオ チドの配列は、表３にあるＨＩＶの標的と相捕的であった。毒性データは、３− エンドキャップされたオリゴヌクレオチドを非感染細胞とインキユベートし、そ の細胞数を、オリゴヌクレオチドの非存在下でインキュベートしたコントロール 培養の細胞数と比較した。

毒性の結果は、コントロールと比較して、７日間オリゴヌクレオチド中で培養し て得られた細胞数の減少量をパーセントチ表シた。低レベル（０，５〜５μＭ） のキャップされたオリコブオキシヌクレオチドを用いてＨＩＶ複製が効果的に阻 害されたことは、本発明のオリゴヌクレオチドのヌクレアーゼによる著しい分解 が、細胞外、細胞内のいずれにおいてもないという結論を支持する。

（以下余白） 」ＬＬ ｖ−シラ　ね乙ｉＵ　且Ｋ　ｉ　ｆｔ Ｂ８ Ｏ，Ｓ　μに　７０智　Ｏセ ５．０　μに　９ｏセ　０智 ５０．０μｓ　４セ ーＣ工２ ０．５　躍　０智　０考 ２．５　ｐＨ”１５％　０４ ５．０μｓ　ｇｏｔ　ｏ４ 工０．０　μｓ　９０を　０− ５ｏμｓ　Ｏ亀 ｚｏｏ牌　ｏｘ ７°０ビルアミン ２、！Ｉ　μに　６５龜　〇七 ”　−−ＨＷｌＬ％＋＝７ｔ＋Ｚ　Ｅｌｌ’ｓ”ＬＱｌ；い。

国際調査報告 Ｉ″Ｉ＠″′ａ′″″′１＾−崗＠−Ｎ・　ＰＣＴ／ＩＩＣ；ｏｎ／ｎｔ＋　ｔ 。

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．生理学的条件下で分解に対して抵抗性を持つオリゴヌクレオチドであって、 該オリゴヌクレオチドは、３′および／または５′末端のホスホジエステル結合 がホスホアミデート結合に置換されるように改変され、該結合の数が少なくとも １つであり、相補的なオリゴヌクレオチド鎖へのハイブリダイゼーションに干渉 し得る数よりも少なく、および／あるいは該オリゴヌクレオチドがＲＮＡにハイ ブリダイズされる際にＲＮＡｓｅＨ活性に干渉し得る数よりも少ない、オリゴヌ クレオチド。
2. ２．前記ホスホアミデートが以下の式を有する、請求項１に記載のオリゴヌクレ オチドであって：▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｒ１およびＲ２は、相補体とのハイブリダイゼーションに干渉しない置 換基である、オリゴヌクレオチド。
3. ３．前記Ｒ１およびＲ２が、独立して、Ｒ１およびＲ２の両方が水素でないとい う条件で、水素、２０個あるいはそれ以下の炭素原子をもつヒドロカルビル置換 基、および１から３個のオキシ基を含む２０個あるいはそれ以下の炭素原子をも つオキシヒドロカルビル置換基からなる群から選択される、請求項２に記載のオ リゴヌクレオチド。
4. ４．前記Ｒ１およびＲ２のうち１つが水素であり、他方がＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２） ｘ−構造をもつオキシヒドロカルビル置換基であり、ここで、ｘが１から２０を 包含する範囲の整数である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチド。
5. ５．前記ｘが２であり、前記オキシヒドロカルビル置換基が２−メトキシエチル である、請求項４に記載のオリゴヌクレオチド。
6. ６．前記Ｒ１およびＲ２のうち１つが水素であり、他方が、式ＣＨ３（ＣＨ２） ｙ−を有する直鎖アルキル部分であるヒドロカルビル置換基であり、ここで、ｙ が０から１５を包含する範囲の整数である、請求項３に記載のオリゴヌクレオチ ド。
7. ７．前記ｙが１１であり、前記ヒドロカルビル置換基がドデシルである、請求項 ６に記載のオリゴヌクレオチド。
8. ８．前記ｙが２であり、前記ヒドロカルビル置換基がｎ−プロピルである、請求 項６に記載のオリゴヌクレオチド。
9. ９．前記オリゴヌクレオチドが、３′および５′末端の両方において修飾されて いる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
10. １０．前記Ｒ１およびＲ２のうち１つが水素であり、他方が、ポリマーである、 請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
11. １１．前記Ｒ１およびＲ２のうち１つが水素であり、他方が、糖部分である、請 求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
12. １２．前記Ｒ１およびＲ２のうち１つが水素であり、他方が、発色基である、請 求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
13. １３．前記Ｒ１およびＲ２のうち１つが水素であり、他方が、ステロイド部分で ある、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
14. １４．前記結合の数が、約２から１０の範囲である、請求項１に記載のオリゴヌ クレオチド。
15. １５．３′末端あるいは５′末端のいずれかあるいはその両方に、２から１０個 のホスホロチオエート結合をさらに含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド 。
16. １６．３′エキソヌクレアーゼによる分解に対して安定なポリヌクレオチドを合 成する方法であって、（ａ）以下の式のヌクレオチドを、以下の式からの生成物 を形成するのに充分な酸化剤の存在下において、Ｒ１およびＲ２が請求項１に定 義されているアミンで処理する工程：▲数式、化学式、表等があります▼ ここで、Ｔは保護基、Ｐは保護基あるいは固体状態の担体、および各Ｂは独立し て保護されたまたは保護されていない複素環式の塩基であり、ｉは、１からｓま で変化し；少なくとも１つのＱｉは水素であるという条件で、各Ｑｉは、水素あ るいは−ＮＲ１Ｒ２である； （ｂ）保護基Ｔを除去する工程； （ｃ）５′−が保護されたヌクレオシドＨ−ホスホネート、Ｈ−ホスホロチオエ ートあるいはＨ−ホスホロジチオエートを、活性化剤の存在下で、担体に結合し たヌクレオチドの５′−末端水酸基で縮合させる工程； （ｄ）５′−末端ヌクレオシドの５′−保護基を除去する工程；（ｅ）所望の長 さのポリヌクレオチドが得られるまで、５′が保護されたヌクレオシドＨ−ホス ホネート、Ｈ−ホスホロチオエートおよび／あるいはＨ−ホスホロジチオエート を使用して、工程（ｃ）および（ｄ）を連続して繰り返す工程；（ｆ）酸化によ って、ホスホジエステル、ホスホロチオエートおよび／あるいはホスホロジチオ エートのヌクレオチド間の結合を形成する工程；および （ｇ）Ｐから該ポリヌクレオチドを分離させる工程、を含む方法。