JPH05501800A - グリコール酸の酵素酸化によるグリオキシル酸の製造法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の名称 グリコール酸の酵素酸化によるグリオキシル酸の製造法技術分野 本発明は、グリコレートオキシダーゼ触媒によるグリコール酸の酸化によってグ リオキシル酸を製造するための改良された方法に関する。グリコール酸と酸素の 酵素触媒反応は長年にわたって知られているが、従来記述されている方法はいく つかの理由のために商業的に有利であると証明されていない。これらのうち最も 重量なことは、従来の反応がグリコール酸の高希釈で、典型的には４０ｍＭ又は それ以下の濃度で行われるということである。グリオキシル酸の選択率及びグリ オキシル酸生成物の収率は普通低かった。非常に希釈された出発グリコール酸濃 度を用いることの欠点は、高生産速度を達成するために大きく且つ高価な反応容 器が必要となることである。更に、グリオキシル酸は普通５０％水溶液［ウルマ ン（Ｕｌ　１ｍａｎｓ）］として販売されるから、希釈出発試剤を用いて製造さ れる希グリオキシル酸を濃縮することは費用がかかる。

更にそのような濃縮を蒸発によって又は逆滲透法によって行うならば、非揮発性 副生物例えばシュウ酸及びぎ酸及び／又はその塩及び未反応のグリコール酸が不 純物として溶液中に残るであろう。最後に反応に用いる比較的高価な酵素が効率 よく又は有効に循環できるならば、また環境に有害な排水が生じないならば、そ れは有利となるである。

本発明は、出発物質の濃度を増加させ且つ選択された収率を改善する添加剤を用 いて、グリコール酸をグリコレートオキシダーゼ触媒で酸化することによってグ リオキシル酸を製造するための商業的に実施しうる方法を提供する。

背景の技術 本発明は、酵素グリコレートオキシダーゼを反応触媒として用いて、グリコール 酸を酸素で酸化することによるグリオキシル酸の製造法である。

Ｎ、Ｅ、）ルバート（Ｔｏ　Ｉ　ｂｅ　ｒ　ｔ）ら、Ｊ、パイオル・ケム（Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、１８１．９０５〜９１４　（１９４９）は、タバコの葉か ら抽出した酵素がグリコール酸の、中間体グリオキシル酸を経るぎ酸及びＣＯ２ への酸化の触媒となることを報告している。更に彼らは、ある種の化合物例えば エチレンジアミンが中間体グリオキシル酸の他の生成物への酸化を阻止するとい うことを発見した。この酸化反応は、グリコール酸の初期濃度が１３２〜１９６ ｍＭ程度であると非常に概略的に記述されている（９０７頁）１つの実験を除い て、約３〜４０ｍＭのグリコール酸濃度を用い、ｐＨ約８で行った。この実験に ついて与えられた唯一の詳細は、凡そのグリコール酸の濃度であり、酸化が完了 するまで進行しないという事実であり、またグリオキシル酸の２゜４−ジニトロ フェニルヒドラゾンが単離されていたということである。

特に収率及び反応期間については詳細な記述はない。グリコレートの酸化に対す る最適なｐＨは８．９であると報告されている。シュウ酸（１００ｍＭ）はグリ コレートオキシダーゼの触媒作用を禁止すると報告されてもいる。

■、ゼリチュ（Ｚｅｌｉｔｃｈ）及びＳ、オチョア（Ｏｃｈｏａ）、Ｊ　パイオ ル・ケム、λ且１．７０７〜７１８　（１９５３）は、グリコール酸の、グリコ レートオキシダーゼ触媒による酸化反応でのぎ酸及びＣＯ２の生成は、グリコー ル酸の酵素触媒酸化反応の主たる生成物であるグリオキシル酸のＨｚ　Ｏ！との 非酵素的反応に由来すると報告した。

斯くして彼らは、ＨｔＯ□の分解の触媒となる酵素のカタラーゼが、ぎ酸及びＣ Ｏ２の生成を抑制することによりグリオキシル酸の収率を非常に改善することを 観察した。彼らが用いたグリコレートオキシダーゼはホウレン草の葉から単離し たものであった。それをｐＨ約８で、またグリコール酸初期濃度１０ｍＭで使用 した。更に彼らは、ＦＭＮ　（フラビンモノヌクレオチド）の添加がグリコレー トオキシダーゼの効率を非常に増大させるということも発見した。

Ｊ、Ｃ，ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）ら、Ｊ　パイオル・ケム、２３７．２ ００１〜２００９　（１９６２）も、カタラーゼがグリオキシル酸のグリコール 酸からの収率を増大させるこを発見した。彼らは見かけ上刃タラーゼ　グリコレ ートオキシダーゼを約８０・１の比で使用した。また彼らは、カタラーゼがグリ コール酸の、グリコレートオキシダーゼ触媒による酸素との反応で生成する過酸 化水素を分解すると結論している［論文では、グリコレートオキシダーゼは「短 鎖し一α−ヒドロキシ酸オキソダーゼ」として言及されている］。更に彼らはＦ ＭＮがグリコレートオキシダーゼ活性を維持するのに役立つことを発見した。ま た彼らはグリコール酸の、グリコレートオキシダーゼ触媒による酸化の最高速度 はグリコール酸（基質）の濃度３．３ｍＭで起こること及び「反応か−−−−− （ｅ）これらの基質、グリコレート、及び−−−一−の高濃度によって禁止され ることが判明した」ということを報告した。

ＫＥ、リチャードンン（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ）及びＮ、Ｅトルバート（Ｔｏｌ ｂｅｒｔ）、Ｊ、パイオル・ケム、２３６．１２８０−１２８４　（１９６１） は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンを含む緩衝剤がグリコール酸のグ リコレートオキシダーゼ触媒による酸化反応でのシュウ酸の生成を禁止すること を示した。更に彼らはこの反応をｐＨ約８で行い、ＦＭＮがグリコレートオキシ ダーゼの効率を増大させることを発見した。彼らが用いたグリコール酸の最高濃 度は２０ｍＭＣ１０クラゲット（Ｃｌａｇｅ　ｔ　ｔ）　、Ｎ、Ｅ、トルバート 、及びＲ，Ｈ，グリス（Ｂｕｒｒｉｓ）、Ｊ　パイオル・ケム、よヱ旦、９７７ 〜９８７　（１９４９）は、グリコール酸の、グリコレートオキシダーゼ触媒に よる酸素酸化に対する最適なｐＨが約７８〜８．６であり、そして最適温度が３ ５〜４０°Ｃであることを発見した。

グリコール酸オキシダーゼ触媒によるグリコール酸の酸化に関しては他にも多（ の参考文献がある。例えば −酵素の単離（普通分析法を含む）− ホウレン草及びタバコの葉から、■、ゼリチュ著、メソッズ・オブ・エンザイモ ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１巻、アカデミツ ク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、１９５５． ５２８〜５３２頁。

カポチャの子葉から、Ｎ、ニジムラら、アーク・バイオケム・バイオフィズ（Ａ ｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）　、λλ又、３９７〜４０２　（ １９８３）； ラットの肝臓から、Ｈ，アスカ−（Ａｓｋｅｒ）及びＤ　デーピース（Ｄｅｖｉ ｅｓ）、バイオヒム・バイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ 、Ａｃｔａ、）、ヱ旦↓、１０３〜１０８　（１９８３）： 氷厚（Ｌｅｍｎａ　Ｍｉｎｏｒ）Ｌから、ＭＪ、エメス（Ｅｍｅｓ）及びに、　 Ｈエリスマン（Ｅｒ　ｉ　ｓｍａｎｎ）　、インド°Ｊ　バイオケム（［ｎｔ、 Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、１６−１１３７３〜１３７８（１９８４）。

一酵素の構造 Ｅ、セダールンド（Ｌｅｄｅｒｌｕｎｄ）ら、ニール−Ｊ、バイオケム（Ｅｕｒ 、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　）、１７３．５２３〜’５３０　（１９８８）： Ｙ　リンドキスト（ＬｉｎｄｑｕｉＳｔ）及びＣ，ブランアン（Ｂｒａｎｄｅｎ ）　、Ｊ　パイオル・ケム、２６４．３６２４〜３６２８　（１９８９）。

すべての上述した参考文献、並びにすべての他の研究において［但しＮ、Ｅ、） ルバートら、Ｊ、パイオル・ケム、１８１．９０５〜９１４（１９’４９）の論 議において上述した１つの例を除＜］、使用されたグリコール酸の初期最高濃度 は約４ＱｍＭであり、ｐＨは普通約８〜９であり、ＦＭＮが時に添加され、アミ ンが時に添加され、そしてカタラーゼが時に添加された。グリオキシル酸の収率 を改善する他の添加剤も言及されている。

グリオキシル酸の工業的合成に対する多（の通常の化学的（非酵素的）方法は、 例えば米国特許第３．２８１．４６０号、第４．　１４６．　７３１号、及び第 ４．２３５．６８４号、並びにウルマン（Ｕｌｌｍａｎｎ）の技術化学辞典、第 ４版、１２巻、３８１頁、フェアラグ・ヘミ−（Ｖｅｒｌａｇ　Ｃｈｅｍｉｅ、 Ｗｅｉｎｈｅｉｍ）、１９７６年（本明細書ではウルマンと記述）に提案されて いる。これらの方法のいくつかは環境に有害な生成物を生成する。これらのいず れもがグリコール酸のグリオキシル酸への酸化を考えていない。

例えグリコール酸が商業的製品であるとしても、本申請者の知るところによれば 、グリオキシル酸の製造に対してグリコール酸の、グリコレートオキシダーゼ触 媒による酸化を用いることは従来誰も考えていなかった。これは化学者及び化学 技術者が酵素反応（生化学）に不慣れなため、生化学者の、そのような反応が望 ましいという認識の欠如のため、文献の多くに報告されている比較的低い収率又 は転化率のため、報告されている基質の禁止作用のため、及び／又は従来使用さ れた基質の低濃度のためであると推測される。

発明の要約 本発明は、ｐＨ約７〜約１０の水溶液中において、グリコール酸、グリコレート オキシダーゼ及び酸素（０□）を、グリオキシル酸の収率を改善する添加剤の有 効量の存在下に、更にグリコール酸の初期濃度を２００〜約２５００ｍＭにして 接触させることを含んでなるグリオキシル酸の製造法に関する。本方法は比較的 高いグリコール酸濃度で行えることが特色の商業的に実施できる製造法である。

最適な条件下において、これはグリオキシル酸を高転化率下に非常に高い収率で 生成し、また本方法で用いる比較的高価な酵素を有効利用する。

２００〜約２５００ｍＭのグリコール酸濃度を使用することができ、またグリコ レートオキシダーゼ触媒の他に１種又はそれ以上の化合物例えばカタラーゼ及び ある種のアミンも、グリオキシル酸の収率を改善するために存在させつる。添加 されるＦＭＮは随時酵素の生産量を改善するだめに存在しつる。反応の酸化剤と しては普通空気からの又はより純粋な形の（例えば工業用酸素としての）酸素が 使用される。反応は反応速度を増大させるために大気圧以上の酸素圧で行っても よい。

発明の詳細な記述 本発明はグリコール酸のグリコレートオキシダーゼ触媒による酸化に関する。

約２５００ｍＭという高い初期基質濃度において、グリオキシル酸が高収率で得 られるということが発見された。更に収率はカタラーゼ又は他の添加剤を単独で 又は組合せて添加することによって最大にすることができる。この高収率は、報 告されているグリコレートオキシダーゼの基質による禁止及び／又は可能な生成 物による禁止、更には存在するならばそのカタラーゼの可能な禁止作用を考える と予期を越えたものである［基質及び生成物の禁止作用の議論に対しては、Ｍ　 ジクソン（Ｄｉｘｏｎ）ら、エンザイムズ（Ｅｎｚｙｍｅ　ｓ）、第３版、アカ デミツク・プレス、１９７９年、９６〜７．１２６〜７頁、及びＴ　ゴツトフリ ー（Ｇｏｄｆｒｅｙ）及びＪ　ライヘルド（Ｒｅｉｃｈｅｌｔ）、インダストリ アル・エンザイモロノー（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ）、ザ・ネーチャー・プレス（Ｔｈｅ　Ｎａｔｕｒｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ ｅｗ　Ｙｏｒｋ）、１９８３年、８４７頁を参照］。確かに今回、約２５００ｍ Ｍ以上のグリコール酸初期濃度において、グリコレートオキシダーゼ触媒による 反応は比較的遅いということを見出した。この反応速度の低下は、１５００ｍＭ 以上の初期濃度において顕著となり、基質濃度の増加について徐々に低下した。

幸運にもこの低下はこの十分な高濃度で起こるから、実際的な工程を行うことが できる。この反応速度の低下が基質又は生成物の禁止のためか、或いは何か他の 因子のためかどうかは証明されていない。（存在する場合）選択された添加剤例 えば収率を増加させるために添加されるアミンも、高濃度において１つ又は双方 の酵素の禁止又は更には変性の原因となることがある。

基質の高濃度は本明細書に記述する商業的に有用な方法に対する鍵であるけれど 、工程の有用性を高める他の因子はグリオキシル酸生成物に対する高選択性及び 基質のグリオキシル酸生成物への高転化率である。

副生物又は副反応を非常に少くしてグリオキシル酸を高収率で得るためには、グ リオキシル酸の収率を改善する添加剤例えば酵素カタラーゼ又は選択されたアミ ン例えばエチレンジアミンを反応混合物に添加することが有利であると判明した 。最良の収率はカタラーゼ及び選択されたアミンの双方を反応系に添加した時に 得られる。更にグリコレートオキシダーゼの生産性を向上させるために、フラビ ンモノヌクレオチド（以下ＦＭＮ）を随時少量で添加することができる。

本明細書における「収率」とは、反応の開始時に存在するグリコール酸の全量に 基づいて得られるグリオキシル酸のパーセントを意味する。

本明細書における「転化率」とは、反応していずれか他の生成物を生成した反応 の開始時に存在するグリコール酸のパーセントを意味する。本明細書における「 選択率」とは、反応したグリコール酸から得られるグリオキシル酸のパーセント を意味する。それ故に数学的には、収率は転化率×選択率に等しい。「酵素生産 性」とは酵素の単位当りの生産するグリオキシル酸の量を意味する。

グリコール酸（２−ヒドロキシ酢酸）はＥ、１．デュポン社から止車されている 。本反応において、その初期濃度は２００〜約２５００ｍＭ、好ましくは約２５ ０〜約１５００ｍＭ、最も好ましくは約５００〜約１０００ｍＭの範囲である。

グリコレートオキシダーゼ触媒による酸化は７〜１０のｐＨで行われ、これは酸 化中グリコール酸をグリコレートアニオンとして存在させると思われる。ここに グリコール酸という術語の使用は、約４以上の高ｐＨの媒体中でのグリコール酸 に関する場合、グリコレートアニオンも意味することを理解すべきである。

酵素グリコレートオキシダーゼは多くの起源（上述）から単離することができる 。単行本「酵素命名法」、１９８４年、［国際生化学連合の、酵素触媒反応の命 名法及び分類に関する命名法委員会の推奨］、アカデミツク・プレス、（以下Ｉ ＵＢ）　、５２〜３頁によれば、この種の酵素に対する系統的名称は（Ｓ）−２ −ヒドロキシ酸オキシダーゼであり、その番号はＥ、Ｃ，１，１，２，１５であ る。ここにＩＵＢは参考文献として引用される。反応に用いるグリコレートオキ シダーゼは有効濃度、普通約１００１〜約１０００ＩＵ／ｍ／、好ましくは約０ ．１−約４ＩＵ／ｍｌの濃度で存在すべきである。ＩＵ（国産単位）は基質１μ モル／分の転化を触媒する酵素の量として定義される。この酵素の分析法は、本 明細書に参考文献として引用される■　ゼリチュ及びＳ、オチョア、Ｊ、パイオ ル・ケム、２０１．７０７〜７１８　（１９５３）に見出される。この方法は回 収された又は循環されるグリコレートオキシダーゼの活性を分析するために使用 される。　゛反応溶液のｐＨは約７〜約１０、好ましくは約８．　０〜約９．５ 、最も好ましくは８．０〜９．０であるべきである。酵素活性はｐＨと共にに変 化するから、ｐＨを緩衝剤によって維持することができる。今回反応のｐＨは反 応の進行につれて僅かに減少し、斯くして最高酵素活性のｐＨ範囲、即ち約９． ０〜９．５の高い方のｐＨ値付近で反応を開始し、それが反応中に低下してもよ いようにすることがしばしば有利であることが発見された。更にある種のアミン 例えばエチレンジアミン及びトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（以下ト リス）はグリオキシル酸の収率を改善することも見出された。無機緩衝剤も使用 しつるけれど、これらのアミンを（グリコール酸のモル量以上に）過剰量で用い て緩衝剤として作用させ且つ収率を改善することは好適である。エチレンジアミ ンは好適である。即ちこれらのアミンは、アミン／グリコール酸（出発量）約１ ．０〜約３．０、好ましくは約１０〜２．　０、及び最も好ましくは約１．０５ 〜約１３３のモル比で使用される。この範囲内において、所望のｐＨを得るため の正確な値に調整することができる。高アミン／グリコール酸比で使用される非 常に塩基性のアミンの場合には、酸例えば塩酸又は硫酸を添加する如くしてｐＨ を調節する必要のあることがある。トリスのように塩基性の低いアミンでは、所 望のｐＨを維持するために塩基の添加が必要なことがある。アミンをより高量で 用いることも可能であるけれど、そのような多量は普通殆んど又は全熱有利な効 果を示さず、特に生成物の単離において経費がかさむことになる。従ってアミン とグリコール酸の最小比は所望の収率、選択率及びｐＨを得ることと一致して好 適に使用されるはずである。

グリオキシル酸の収率を向上させるために使用しつる他の添加剤は酵素カタラー ゼである。カタラーゼ［これは系統的名称であり、番号はＥ。

Ｃ，１，１１，１，６（ＩＵＢ）である］は、過酸化水素の水及び酸素への分解 の触媒となり、本方法においてはグリオキシル酸と酸素のグリコレートオキシダ ーゼ触媒による反応でグリオキシル酸を製造する際の１次生成物である過酸化水 素の分解を促進することによって本方法の収率を改善すると思われる。カタラー ゼの濃度は約５０〜約１００．００ＱＩＵ／ｍ／、好ましくは約３５０〜約１４ ．　０００　Ｉ　Ｕ／ｍ／テあるべきである。カタラーゼ及びグリコレートオキ シダーゼの濃度はカタラーゼ：グリコレートオキシダーゼの比（各に対してＩＵ での比）が少くとも約２５０　：　１であるように上記範囲内で調節することが 好適である。

ＦＭＮは随時添加される成分であり、０．０〜約２．０ｍＭ、好ましくは約０． ０１〜約０．２ｍＭの濃度で使用される。ＦＭＮはグリコレートオキシダーゼの 生産性を向上させると思われる。ここにグリコレートオキシダーゼの生産性とは 、酵素単位当りの、グリオキシル酸に転化されるグリコール酸の量を意味する。

添加されるＦＭＨの濃度は、しばしば酵素の製造中に酵素に添加されるから、酵 素と共に存在するいずれかのＦＭＮに付加されることを理解すべきである。ＦＭ Ｈの構造及びその分析法は、Ｋ　ヤガイ（Ｙａｇａｉ）、「生化学分析法」、第 Ｘ巻、インターサイエンス・パブリッンヤーズ（ＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅＰｕ ｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）、１９６２年、３１９〜３５５頁に見出 される。これは本明細書に参考文献として引用される。

酸素（０２）はグリコール酸のグリオキシル酸への転化に対する酸化剤である。

例えばそれは気液界面での液体の撹拌により、又は酸素を透過する膜を通して反 応系に気体として添加することができる。以下の仮定に束縛されたくはないけれ ど、多くの条件下における反応速度は酸素が水性媒体へ溶解する速度によって少 くとも一部制御できると思われる。

即ち酸素は空気中の酸素として反応に添加しつるけれど、比較的純粋な形の酸素 を用いること及び更には昇圧を用いることが好適である。酸素圧の上限は知られ ていないけれど、約５０気圧までの酸素圧は好適であり、約１５気圧までの酸素 圧は最も好適である。撹拌は高酸素溶解（従って高反応）速度を維持するために 重要である。いずれか通常の形式の撹拌、例えばかき混ぜが有用である。同業者 には公知のように、高剪断撹拌又は泡を生ずる撹拌は酵素の活性を減するので、 回避すべきである。

反応温度は、それが反応速度及び酵素の安定性に影響するから重要な変数である 。約０〜約４０℃、好ましくは約５〜約３０℃、最も好ましくは５〜２０℃の反 応温度範囲が使用できる。勿論温度は水が凍結しはじめる程低くてはならない。

これらの好適な温度は従来報告されているものよりも低く、酵素活性の保持並び に反応（グリコレートの酸化）速度を考慮している。温度は常法によって、例え ばジャケント付きの反応容器を使用し、このジャケットに適当な温度の液体を通 すことによって調節できるが、これに限定されるものではない。

反応容器は反応成分に不活性ないずれかの材料でできていてよい。

反応の完了時に酵素を濾去し、又はその存在が害とならない程十分少量で存在す るならば５分間７０℃まで加熱して酵素を変性してもよい。

アミンはイオン交換樹脂を用いて最も簡便に除去される。適当な樹脂はアンバー ライトＣＧ１２０、アンバーライトｌＲ１２０［ローム・アンドＩＩハース社（ Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ　Ｃｏ、）製］、及びダウエックス５０［ダウ・ケミカ ル社（Ｄｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）製］を含む。このようにアミンを回 収し、続いてこの樹脂を強塩基で処理することによりアミンを再循環することが できる。酵素の濾過及びアミンの回収は更に実施例で例示される。

生成物グリオキシル酸はバニリン、エチルバニリンの製造に有用であり、並びに イオン交換樹脂に及び製薬工業における酸触媒として使用されるしウルマンを参 照］。上述したように、それは普通５０重量％水溶液として販売される。ここに グリオキシル酸が特に約２３以上のｐＨの溶液中に存在する場合には、本明細書 におけるグリオキツル酸はグリオキシレートアニオンをも意味するということを 理解すべきである。

次の実施例及び実験において、断らない限り撹拌は磁気撹拌機を用いて行った。

残存する酵素活性は、反応液の一部を取り出し、標準的な分析法（上述）で直接 分解することによって測定した。

これらの実施例及び実験において、正確な分析法をもつことは必須である。高速 液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）は優秀な分析法であることがわかり、これ を本明細書で報告する分析に使用した。

ＨＰＬＣ法 反応混合物１００μｌを０．１Ｎ　Ｈ２ＳＯ４３００μｌと混合し、次いで得ら れる溶液をミリポア・ウルトラフリー（Ｍｉ　ｌ　ｌ　ｉｐｏｒｅＵｌｔｒａｆ ｒｅｅ）ＭＣフィルター装置（１０，０００ｍｗのものを濾去）を通して濾過す ることによって分析試料を調製した。グリコール酸、グリオキシル酸、シュウ酸 及びぎ酸に対する分析は、バイオ−ランド・アミネックス（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ａ ｍ１ｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（３００Ｘ７．８ｍｍ）及び溶媒として流速 １．０ｍ１１分のＨ２ＳＯ４（０，０ＩＮ）及びｌ−ヒドロキシエタン−１，１ −ジホスホン酸（０，１ｍＭ）の水溶液を用いるＨＰＬＣで４０℃下に行った。

装置はウォーターズ（Ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ　ｓ）の、ポンプ５１０型、ＷＩＳＰオ ートサンプラー７１２型、順次ＵＶ検知器４９０Ｅ、及び示差屈折計４１０型を 用いる８４０型ＨＰＬＣ系であった。シュウ酸、グリオキシル酸、グリコール酸 、ぎ酸、及びプロピオン酸（内部標準）に対する保持時間はそれぞれ４．２９． ６．０９．７．７７．８７９及び１１，４ホウレン草からのグリコレートオキシ ダーゼの製造０．１Ｍ燐酸カリウム緩衝剤（ｐＨ８，０）１０００ｍｌを含む４ １の市販の混合機中においてホウレン草の葉（２０００ｇ）を４０°Ｃでホモゲ ナイズした。このパルプを４層のチーズ布を通して絞り、ジュース１８００ｍｌ を得た。抽出物を、氷酢酸約１ｍｌの添加によってｐＨ５，２の酢性にした。混 合物を１４０００９で１５分間遠心分離にかけて固体を除去した。この上澄液に 、２０％飽和を達成するために固体の硫酸アンモニウム（１０，６９／抽出物１ ００　ｍＡ’）を添加した。ｐＨを６ＮＫＯＨの添加によって７．８〜８．０に 維持した。溶液を１５分間放置した後、これを１４０００９で２０分間遠心分離 にかけ、ベレットを捨てた。この上澄液に全体で３５％飽和にするために硫酸ア ンモニウム（８，３９／１００ｍ１）を添加した。１５分後に、１４０００ｇで ２０分間遠心分離することによって沈殿を集めた。このペレットを、２ｍＭフラ ビンモノヌクレオチドを含む２０ｍＭエチレンジアミン−ＭＣＩの最小容量（ｐ Ｈ８，０７（約１８０　ｍｌ）に溶解した。溶解した後、硫酸アンモニウムを３ ．２Ｍの最終濃度まで添加した。グリコレートオキシダーゼ硫酸アンモニウム墾 濁液を４℃で暗所下に貯蔵した。

３オンスのフイブリ’ｒ　（Ｆｉｓｈｅｒ）−ポーター（Ｐｏ　ｒ　ｔ　ｅ　ｒ ）ガラス製エーロゾル反応容器に、磁気撹拌棒とグリコール酸（２５０ｍＭ）、 エチレンジアミン（ＥＤＡ）（３３０ｍＭ）　、ＦＭＮ　（０゜０１ｍＭ）、プ ロピオン酸（ＨＰＬＣ内部標準、７５ｍＭ）グリコレートオキシダーゼ（ＧＡＯ ）（ホウレン草から、２．　ＯＩ　Ｕ／ｍ／）　、及びカタラーゼ（黒色麹菌ク ロカビから、１４００１Ｕ／ｍｆ）を含む水溶液ｌＱｍｎとを入れた。この溶液 の最終ｐＨは８．９であった。反応容器を密閉し、反応混合物を１５℃まで冷却 し、次いで反応容器を７０ｐｓｉｇまで加圧し且つ常圧まで脱気し、これを撹拌 しながら５回行うことによって容器を酸素でフラッシュした。次いで容器を酸素 で７０ｐｓｉまで加圧し、混合物を撹拌した。ＨＰＬＣでの分析のために規則的 な間隔で試料採取口を通して（容器の圧力降下を招かずに）試料（０，１０ｍ／ ）を取出し、反応の進行を監視した。４時間後、グリオキシレート、オキザレー ト、及びホーメートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ９８．９％、領　５％及び０％で あり、グリコレート０６％が残った。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼ の残存活性は双方ともその初期値の１０エチレンジアミンの代りにに２ＨＰＯ４ （３３０ｍＭ）を用い且つ溶液の最終ｐＨを濃塩酸でｐＨ８，０に調節する以外 実施例１の反応を繰返した。４時間後に、グリオキル−ト、オキザレート、及び ホーメートのＨＰ　Ｌ　Ｃ収率はそれぞれ２４．０％、０３％、及び８．４％で あり、６７．１％のグリコレートが残存した。グリコレートオキシダーゼ及びカ タラーゼの残存活性はそれぞれ初期値の９５％及び４４％であった。

実施例３ ３オンスのフィッシャー−ポーターガラス製エーロゾル反応容器に、磁気撹拌棒 とグリコール酸（７５０ｍＭ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）（８６２ｍＭ）　 、ＦＭＮ　（０，１ｍＭ）　、プロピオン酸（ＨＰＬＣ内部標準、７５　ｍＭ） グリコレートオキシダーゼ（ホウレン草から、１．ＯＩＵ／ｍｊｌ’）、及びカ タラーゼ（黒色コウジ菌クロカビから、１４００ＩＵ／ｒｒ＋／）を話む水溶液 ５０ｍ／とを入れた。この溶液の最終ｐＨは８゜９であった。反応容器を密閉し 、反応混合物を１５℃まで冷却し、次いで反応容器を７０ｐｓｉｇまで加圧し且 つ常圧まで脱気し、これを撹拌しながら５回行うことによって容器を酸素でフラ ッシュした。次いで容器を酸素で７０ｐｓｉまで加圧し、混合物を撹拌した。Ｈ ＰＬＣでの分析のために規則的な間隔で試料採取口を通して試料（０，１０ｍ１ ）を取出し、反応の進行を監視した。９０時間後、グリオキシレート、オキザレ ート、及びホーメートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ９９８％、０２％及び０％であ り、グリコレートは残らなかった。グリコレートオキシダーゼ及びカタラーゼの 残存活性はそれぞれその初期値の３４％及び８８％であった。

３オンスのフィッシャーーポーターガラス製エーロゾル反応容器に、磁気撹拌棒 とグリコール酸（２０００ｍＭ）、エチレンジアミン（２１００ｍＭ）　、ＦＭ Ｎ　（０，０１ｍＭ）　、グリコレートオキシダーゼ（ホウレン草から、１．　 ’２　ＩＵ／ｍｌ）　、及びカタラーゼ（黒色コラン菌りロカビから、１４００ 　Ｉ　Ｕ／ｒｒ＋１）を含む水溶液１０ｍ１とを入れた。この溶液の最終ｐＨは ９０であった。反応容器を密閉し、反応混合物を１５℃まで冷却し、次いで反応 容器を７０ｐｓｉｇまで加圧し且つ常圧まで脱気し、これを撹拌しながら５回行 うことによって容器を酸素でフラッシュした。次いで容器を酸素で７Ｑｐｓｉま で加圧し、混合物を撹拌した。ＨＰＬＣでの分析のために規則的な間隔で試料０ ．１０ｍ４を採取し、反応の進行を監視した。３１時間後にグリコレートオキシ ダーゼの活性は残っておらず、従ってグリコレートオキシダーゼを更に２゜Ｏｆ Ｕ／ｍ／を添加した。１４３時間後、グリオキシレート、オキザレート、及びホ ーメートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ９６．８％、２．２％、及び１．０％であり 、グリコレートは残存しなかった。グリコレートオキシダーゼ（全量基準）及び カタラーゼの残存活性はそれぞれその初期値の６９％及び１００％であった。

３オンスのフィッシャーーポーターガラス製エーロゾル反応容器に、磁気撹拌棒 とグリコール酸（２５０ｍＭ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ト リス、３３０ｍＭ）　、ＦＭＮ　（０，０２ｍＭ）　、プロピオン酸（ＨＰＬＣ 内部標準、７５ｍＭ）グリコレートオキシダーゼ（ＧＡＯ）（ホウレン草から、 ０．　２５　ｒ　Ｕ／ｍｌ）　、及びカタラーゼ（黒色コウジ菌クロカビから、 １４００１　Ｕ／ｍ７）を含む水溶液１０ｍ１とを入れた。この溶液の最終ｐＨ を５％ＮａＯＨで８．３に調節した。反応容器を密閉し、反応混合物を３０℃ま で冷却し、次いで反応容器を１５ｐｓ　ｉｇまで加圧し且つ常圧まで脱気し、こ れを撹拌しながら５回行うことによって容器を酸素でフラッシュした。次いで容 器を酸素で１５ｐｓ　ｉまで加圧し、混合物を撹拌した。ＨＰＬＣでの分析のた めに規則的な間隔で試料採取口を通して（容器の圧力降下を招かずに）試料（０ ，１０ｍＡ）を取出し、反応の進行を監視した。３０時間後、グリオキシレート 、オキザレート、及びホーメートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ８９．５％、３３％ 及び２．８％であり、グリコレートは残らなかった。グリコ１ノートオキシダー ゼ及びカタラーゼの残存活性はそれぞれその初期値の６８％及び８０％であった 。

グリコール酸及びエチレンジアミンの濃度がそれぞれ２５００及び２６３０ｍＭ であり、そして３１時間目に更なるグリコレートオキシダーゼを添加しないこと 以外実施例４の反応に従った。１４３時間後におけるグリオキシレート、オキザ レート、及びホーメートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ２７．４％、０％、及び０％ であり、７２．６％のグリコレートが残留した。このことは２５００ｍＭグリコ レートにおいて反応速度が低下することを示す。グリコレートオキシダーゼ及び カタラーゼの残存活性はそれぞれその初期値の６８％及び８０％であった。

３オンスのフィンシャー−ポーターガラス製エーロゾル反応容器を用いて、カタ ラーゼ及びＧＡＯの活性の温度依存性を決定した。グリコレート（２５０ｍＭ） 　、ｘチレンジアミン（３３０ｍＭ）、グリコレートオキシダーゼ（０，５１Ｕ ／ｍ１）　、カタラーゼ（１４００１Ｕ／ｍ１）、及びＦＭＮ　（０，０１ｍＭ ）を含む水溶ｇ！！（１０ｒｒ＋１）を、ｐＨ８，３、酸素１気圧下に種々の温 度で撹拌した。１時間後に、４ｏ、３ｏ、１５、及び５℃で行った反応からのグ リコレートの収率はそれぞれ９２．９６．９９、及び９９％であり、一方力タラ ーゼ／ＧＡＯの残存活性はそれぞれ３８／８７．６０／１００．１００／１００ 、及び１００％／１００％であった。低反応温度は高グリオキシル酸選択率にお いて高残存酵素活性をもたらした。

実施例８ グリコール酸の酸化に対する酸素圧の影響実施例１に記述した方法を用いること により、グリコール酸（２５０ｍＭ）、トリス緩衝剤（３３０ｍＭ、Ｉ）Ｈ８， ３）　、プロピオン酸（ＨＰＬＣ内部標準、７５ｍＭ）、グリコレートオキソダ ーゼ（ホウレン草：　０．２５１Ｕ／ｍ／）　、カタラーゼ（黒色コウジ菌りロ カヒ、１４０Ｑ　Ｔ　Ｕ／ｍ＋’）　、及びＦＭＮ　（０，２ｍＭ）を含む水溶 液（１０ｍＡ’）を空気１気圧（酸素０２気圧）或いは酸素１．２．３．６、又 は１０気圧下に３０℃で撹拌した。（反応の最初の１０〜１５％にわたる）グリ オキシル酸の、種々の酸素圧下の初期生成速度を下表に示す１０、０　１．０２ ５ 実施例９ グリコール酸の酸化に対するグリコレートオキシダーゼの影響実施例１に記述し た方法を用いることにより、グリコール酸（２５０ｍＭ）　、ＥＤＡ　（３３０ ｍＭ）　、プロピオン酸（ＨＰＬＣ内部標準、７５ｍＭ）、グリコレートオキシ ダーゼ（領　２０，０．４０、又は４゜０１　Ｕ／ｍｌ＞　、カタラーゼ（１４ ００ＩＵ／ｍｌ）、及びＦＭＮ　（鉤０１　ｍＭ）を含む水溶液（１０ｍｌ）を 、酸素６気圧下に１５℃及びｐＨ８，９において撹拌した。（反応の最初の１０ 〜１５％にわたる）グリオキツル酸の初期生成速度は、大根のＧＡＯを０．２０ ．０．４０、又は４．　０　Ｉ　Ｕ／ｍｉ！で用いた時それぞれ１３７．１３３ 、及び１３２μモル／ｍｌ／分であった。これらの一般的な反応条件下において 、反応速度は酵素の濃度に依存しなかった。

グリオキツル酸の大規模な酵素による合成を、濾過膜の代りに厚さ１゜６ｍｍの テフロンレートを用い且つ機械的に駆動される翼型撹拌機を有するアミコン（Ａ ｍｉｃｏｎ）２０００型高生産性撹拌槽を用いて例示する。グリコール酸（１１ ３９，１，４９ミリモル）、エチレンジアミン（９５ｇ、１．５８モル）　、Ｆ ＭＮ　（９，７ｍ９．０．０２ミリモル）、及びカタラーゼ（黒色コウジ菌クロ カビからのもの（シグマＬ２．８Ｘ１０６１Ｕ］を含む溶液２１に、グリコレー トオキシダーゼ（２０００ＩＵ、ホウレン草から単離）を添加し、得られる混合 物（最終ｐＨ＝８゜９）を酸素６気圧下に１５℃で撹拌した。ＨＰＬＣでの分析 のために試料を規則的な間隔で採取し、反応の進行を監視した。７７時間後、反 応混合物のＨＰＬＣ分析は、グリコール酸（１１０９、収率９９６％）、ぎ酸（ ０，２％）、及び／ユウ酸（収率０．　２％）だけが反応生成物であり、またグ リコール酸の完全な添加が達成されたことを示した。グリコレートオキソダーゼ 及びカタラーゼの活性は、それぞれその初期活性の７４及び８７％であった。反 応溶液に窒素を吹きこみ、次いで反応混合物を窒素下に５分間７０℃に加熱する ことによって反応を停止させた。

沈殿した蛋白質を遠心分離によって除去し、またＦＭＮを反応混合物の活性炭を 通す濾過によって除去した。いずれか存在する可溶性蛋白質を、１０．０００ｍ ｗ排除フィルターを有するミリポア・ミニタン（Ｍｌｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｎｉ ｔａｎ）濾過システムで濾過し、次いでグリオキシレート及びエチレンジアミン （ＥＤＡ）をイオン交換クロマトグラフィーで分離した。

アンバーライトＣＧ−１２０（９００９、ローム・アンド・ハース社、１００〜 ２００メツシユ、４５ミリ当量／９）を１．ＯＮ　ＨＣＩに墾濁させて膨潤した 樹脂２．０１を得、次いでこれを蒸留水でゆすいで過剰のＨＣＩを除去した。５ ０Ｘ１００ｃｍのファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）Ｋカラムに、この洗浄し た慴脂１９００ｍ１を充填し、このカラム中を蒸留水２．Ｏｌを８．０ｍ１１分 で通し、次いでグリオキシル酸／エチレンンアミン（ＥＤＡ）反応混合物（ＥＤ Ａｏ、７８モル及びグリオキシル酸０．７５モルを含有）の半分を流速８ｍｌ／ 分でカラムに負荷した。そして２５４ｎｍの吸光度で監視して、グリオキシル酸 を最初の水流出相中に集めた。グリオキシル酸含有流出液約２．２１を集めた。

次いでエチレンジアミンをＩＮ　ＮａＯＨ３，４１で流出させ、ＥＤＡｏ、７７ モルを得た（回収率９９％）。このカラムをＩＮ　ＨＣｌ　（２，４１８）で洗 浄し、次いで蒸留水３１でゆすいでクロライドを除去した。グリオキツル酸／Ｅ ＤＡ流出物の１．１１の２つの両分をイオン交換カラムで分離することによって 得たグリオキシル酸を含むカラム留分を一緒にし、ロータリーエバポレーターで ４０℃下に濃縮し、グリオキシル酸１４０モル（収率９４％）を含む５０重量％ 溶液を得た。この製造されたグリオキシル酸の純度は＋３ｃ　ＮＭＲ分光法及び ＨＰＬＣ分析で決定して９９５％以上であった。

カタラーゼの添加を省略する以外実施例１の反応を繰返した。４時間後、グリオ キシレート、オキザレート及びホーメートのＨＰＬＣ収率はそれぞれ６．２．０ ７、及び１６３％であり、７．１％のグリコレートが残った。これはカタラーゼ が存在しないと選択率の低下することを示す、グリコレートオキシダーゼの残存 活性はその初期値の５％であった。

脱イオン水１２．５ｇ、グリコール酸３００ｍｇ、トリス１．２ｇ及びＦＭＮの ０．０２ｍＭ溶液１０９をｐＨ６，８のホスフェート緩衝液中で混合することに よって原液を準備した。次いで牛の肝臓のカタラーゼ［シグマ・ケミカル社（Ｓ ｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、。

Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，６３８７８）から購入、カタログ番号Ｃ−１０、約１ ２００　ＩＵ／ｍｇ］　２ｍｇを含む２５０ｍＡ’のアーレンマイヤー・フラス コに原液１０ｇ部分を入れた。グリコレートオキシダーゼ［シグ、マのカタログ 番号Ｇ−４１３６、砂糖大根から、溶液は２．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４，１０ｍ Ｍ）リス、５ｍＭ　ＦＭＮを含有し且つ約７゜５１Ｕ／ｍ／を有する〕呼局液０ ．５９部分を遠心分離にかけ、そして液体を捨てた。アーレンマイヤー・フラス コ中の溶液にこの固体を添加した。ｐＨは８．５であった。フラスコを、０２約 ２００ｒｒ＋４／分で５分間酸素でパージした。次いでフラスコを密閉し、これ を手首型運動振とう機で約２３時間振とうした。ＨＰＬＣによる分析（正確には 異なるが、上述したものと同様）は、グリコレートが完全にグリオキシレートに 酸化され、少量のオキザレートの生成したこと示した。

脱イオン水１２．４ｍｌ、グリコール酸３０５ｍｇ、ｐＨ７，５のホスフェート 緩衝液中０．１５ｍＭ　ＦＭＮｌ、０９、及びエチレンジアミンの２０重量％水 溶液１．３ｇを混合することによって原液を調製した。

この原液１２９、牛の肝臓のカタラーゼ（ノグマ、カタログ番号Ｃ−１０、約２ ８００　Ｉ　Ｕ／ｍｖ）　４ｍｑ、及び市販のグリコレートオキシダーゼ懸濁液 （ング７Ｇ−８６２０，３，２Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４，２ｍＭ　ＦＭＮを含有 、２．８１Ｕ／ｍ／、グリコレートオキシダーゼをホウレン草から単離）１０ｇ から遠心分離で得た固体を混合することによって反応混合物を準備した。このｐ Ｈは９１であった。

反応器は、３つの成分即ち内径１．５ｍｍ及び外径３．２ｍｍ、長さ３．６５ｍ のシリコーンゴム管（ダウ　コーニング社（Ｄｏｗ　Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｃｏｒｐ 、）］、ｖスターフレックス（ＭａｓｔｅｒｆｌｅＸ）ぜん動式ポンプ、及び受 器として役立つ内径１０ｍｍ及び長さ１０Ｑｍｍの（ガラス製）試験管を有した 。ポンプへ及びからの管は試験管受器を閉じる栓を通過させた。反応混合物を反 応器へ導入し、次いでポンプにより３．５ｍ１７分の速度で約２３時間、管中を 通した。この期間巾約５ｍｌが管中にあり、また５ｍｌが受器中にあった（但し すべてが循環された）。この管を、穏やかな空気流中でゆるくコイル状に巻いた 。

ＨＰＬＣ分析（正確には異なるが、上述したものと同様）はグリコレートのグリ オキシレートへの完全酸化と少量のオキザレートを示した。

１５ｍ１のポリプロピレン製の遠心分離管に、グリコール酸（３，３ｍＭ）　、 Ｋ２ＨＰ　０４　（３３ｍＭ、　ｐ　Ｈ８、０）　、グリコレートオキシダーゼ （ホウレン草、０．　３３１０／ｍｌ）　、カタラーゼ（牛の肝臓、１４００　 ＩＵ／ｍｌ）　、及びＦＭＮ　（０，０１ｍＭ）を含む水溶液３ｍｌを入れた。

この溶液を空気中において３０℃に維持し、０．１５ｍＡ’の両分を取出し、ミ リポアの１０．０００ｍｗ排除フィルターを通して濾過し、そしてＨＰＬＣで分 析した。１時間後、グリオキシレート、オキザレート、及びホーメートの収率は それぞれ８０９％、３８％、及び０％であり、１５５％のグリコレートが残留し た。２時間後、グリオキシレート、オキザレート、及びホーメートの収率はそれ ぞれ８０゜６％、１９．７％、及び０％であり、グリコレートは残らなかった。

本発明の好適な具体例は上述してきたけれど、本発明をここに開示する正確な指 示に限定する意図はないことを理解すべきであり、請求の範囲に定義される如き 本発明の範囲内に入るすべての変化及び改変に対しての権利を留保していること も理解すべきである。

国際調査報告 、□８、。、１゜１．＆。。１．。１．。、。ρＣＴ／ＵＳ　９０１０５６５９

Claims (101)

【特許請求の範囲】
1. １．水溶液中ｐＨ約７〜約１０において、グリコール酸、グリコレートオキシダ ーゼ及び酸素を、グリオキシル酸の収率を改善する１種又はそれ以上の添加剤の 有効量の存在下に接触させることを含んでなる、但しグリコール酸の初期濃度が ２００〜約２５００ｍＭである、グリオキシル酸の製造法。
2. ２．初期グリコール酸濃度が約２５０〜約１５００ｍＭである請求の範囲１方法 。
3. ３．初期グリコール酸濃度が約５００〜約１０００ｍＭである請求の範囲２方法 。
4. ４．グリコレートオキシダーゼが約０．００１〜約１０００ＩＵ／ｍｌの濃度で 存在する請求の範囲１の方法。
5. ５．グリコレートオキシダーゼが約０．１〜約４ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する請 求の範囲４の方法。
6. ６．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲１の方法。
7. ７．ｐＨが約８．０〜約９．０である請求の範囲６の方法。
8. ８．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲３の方法。
9. ９．ｐＨを反応の開始時に約９．５に調節し、反応の進行につれて約８．０程度 の低値へ低下せしめる請求の範囲１の方法。
10. １０．グリコール酸の収率を改善する添加剤がエチレンジアミン及びトリス（ヒ ドロキシメチル）メチルアミン及び／又はその混合物である請求の範囲１の方法 。
11. １１．添加剤がエチレンジアミンである請求の範囲１０の方法。
12. １２．グリコール酸の収率を改善する添加剤がエチレンジアミン及びトリス（ヒ ドロキシメチル）メチルアミン及び／又はその混合物である請求の範囲３の方法 。
13. １３．添加剤がエチレンジアミンである請求の範囲１２の方法。
14. １４．アミン添加剤がグリコール酸のモル量よりも過剰量で存在する請求の範囲 １０の方法。
15. １５．出発のアミンとグリコール酸との比が約１．０〜約３．０である請求の範 囲１４の方法。
16. １６．出発のアミンとグリコール酸との比が約１．０〜約２．０である請求の範 囲１５の方法。
17. １７．出発のアミンとグリコール酸との比が約１．０５〜約１．３３である請求 の範囲１６の方法。
18. １８．水溶液中ｐＨ約７〜約１０において、グリコール酸、グリコレートオキシ ダーゼ及び酸素をカタラーゼの存在下に接触させることを含んでなる、但し該グ リコール酸の初期濃度か２００〜約２５００ｍＭである、グリオキシル酸の選択 的製造法。
19. １９．カタラーゼの濃度が約５０〜約１００，０００ＩＵ／ｍｌである請求の範 囲１８の方法。
20. ２０．カタラーゼの濃度が約３５０〜約１４，０００ＩＵ／ｍｌである請求の範 囲１９の方法。
21. ２１．カタラーゼとグリコレートオキシダーゼの比が少くとも約２５０：１であ る請求の範囲１９の方法。
22. ２２．カタラーゼ及び選択されたアミンの双方が添加剤として存在する請求の範 囲１の方法。
23. ２３．初期のアミンとグリコール酸との比が約１．０〜約２．０であり、カタラ ーゼの初期濃度が約５０〜約１００，０００ＩＵ／ｍｌであり、そしてグリコレ ートオキシダーゼの初期濃度が約０．００１〜約１０００ＩＵ／ｍｌである請求 の範囲２２の方法。
24. ２４．初期のアミンとグリコール酸との比が約１．０５〜約１．３３であり、カ タラーゼの初期濃度が約３５０〜約１４．０００ＩＵ／ｍｌであり、そしてグリ コレートオキシダーゼの初期濃度が約０．１〜約４．０ＩＵ／ｍｌである請求の 範囲２３の方法。
25. ２５．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲２４の方法。
26. ２６．温度が約０〜約４０℃である請求の範囲２５の方法。
27. ２７．温度が約５〜約３０℃である請求の範囲２６の方法。
28. ２８．温度が約５〜約２０℃である請求の範囲２７の方法。
29. ２９．酸素を大気圧下に気体として添加する請求の範囲１の方法。
30. ３０．酸素を大気圧以上の圧力において気体として添加する請求の範囲１の方法 。
31. ３１．酸素を約５０気圧までの圧力において気体として添加する請求の範囲３０ の方法。
32. ３２．酸素を約１５気圧までの圧力において気体として添加する請求の範囲３１ の方法。
33. ３３．カタラーゼ及び選択されたアミンの双方が添加剤として存在する請求の範 囲３の方法。
34. ３４．初期のアミンとグリコール酸との比が約１．０〜約３．０であり、カタラ ーゼの初期濃度が約５０〜約１００，０００ＩＵ／ｍｌであり、そしてグリコレ ートオキシダーゼの初期濃度が約０．００１〜約１０００ＩＵ／ｍｌである請求 の範囲３３の方法。
35. ３５．初期のアミンとグリコール酸との比が約１．０５〜約１．３３であり、カ タラーゼの初期濃度が約３５０〜約１４，０００ＩＵ／ｍｌであり、そしてグリ コレートオキシダーゼの初期濃度が約０．１〜約４．０ＩＵ／ｍｌである請求の 範囲３４の方法。
36. ３６．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲３５の方法。
37. ３７．温度が約０〜約４０℃である請求の範囲３６の方法。
38. ３８．温度が約５〜約３０℃である請求の範囲３７の方法。
39. ３９．温度が約５〜約２０℃である請求の範囲３８の方法。
40. ４０．酸素を約５０気圧までの圧力において気体として添加する請求の範囲３７ の方法。
41. ４１．酸素を約１５気圧までの圧力において気体として添加する請求の範囲４０ の方法。
42. ４２．ＦＭＮが工程に存在する請求の範囲１の方法。
43. ４３．ＦＭＮが工程に存在する請求の範囲１０の方法。
44. ４４．ＦＭＮが工程に存在する請求の範囲１８の方法。
45. ４５．ＦＭＮが工程に存在する請求の範囲２２の方法。
46. ４６．添加されるＦＭＮの初期濃度が約２．０ｍＭ又はそれ以下である請求の範 囲４２の方法。
47. ４７．添加されるＦＭＮの初期濃度が約０．０１〜約０．２ｍＭである請求の範 囲４６の方法。
48. ４８．反応に対する酸素を気体として添加し、そして水溶液を酸素と反応溶液の 界面において撹拌することによって該溶液と接触させる請求の範囲１の方法。
49. ４９．反応に対する酸素を気体として添加し、そして水溶液を酸素と反応溶液の 界面において撹拌することによって該溶液と接触させる請求の範囲２２の方法。
50. ５０．酸素を酸素透過性の膜を通して添加する請求の範囲１の方法。
51. ５１．酸素を酸素透過性の膜を通して添加する請求の範囲２２の方法。
52. ５２．酸素を空気として添加する請求の範囲４８の方法。
53. ５３．酸素を空気として添加する請求の範囲５１の方法。
54. ５４．酸素が本質的に純粋形である請求の範囲４８の方法。
55. ５５．酸素が本質的に純粋形である請求の範囲４９の方法。
56. ５６．撹拌に供する請求の範囲１の方法。
57. ５７．反応温度が約０〜約４０℃であり、但し温度が反応混合物中の水を凍結さ せるほど低くない請求の範囲１の方法。
58. ５８．反応温度が約５〜約３０℃である請求の範囲５７の方法。
59. ５９．反応温度が約５〜約２０℃である請求の範囲５８の方法。
60. ６０．反応温度が約０〜約４０℃であり、但し温度が反応混合物中の水を凍結さ せるほど低くない請求の範囲３の方法。
61. ６１．反応温度が約５〜約３０℃である請求の範囲６０の方法。
62. ６２．反応温度が約５〜約２０℃である請求の範囲６１の方法。
63. ６３．反応後に存在するいずれかの酵素を濾去する請求の範囲１の方法。
64. ６４．初期グリコール酸濃度が約５００〜約１０００ｍＭである請求の範囲１８ の方法。
65. ６５．グリコレートオキシダーゼが約０．００１〜約１０００ＩＵ／ｍｌの初期 濃度で存在する請求の範囲６４の方法。
66. ６６．グリコレートオキシダーゼが約０．１〜約４ＩＵ／ｍｌの初期濃度で存在 する請求の範囲６５の方法。
67. ６７．ｐＨが約８．０〜約９．０である請求の範囲１８の方法。
68. ６８．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲６５の方法。
69. ６９．アミンをエチレンジアミン及びトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン から選択する請求の範囲２２の方法。
70. ７０．存在する唯一のアミンがエチレンジアミンである請求の範囲６９の方法。
71. ７１．出発のアミンとグリコール酸の比が約１．０〜約２．０である請求の範囲 ６９の方法。
72. ７２．出発のアミンとグリコール酸の比が約１．０５〜約１．３３である請求の 範囲７１の方法。
73. ７３．カタラーゼの初期濃度が約５０〜約１００，０００ＩＵ／ｍｌである請求 の範囲７２の方法。
74. ７４．カタラーゼの初期濃度が約３５０〜約１４，０００ＩＵ／ｍｌである請求 の範囲７３の方法。
75. ７５．カタラーゼの初期濃度が約３５０〜約１４，０００ＩＵ／ｍｌである請求 の範囲７１の方法。
76. ７６．グリコレートオキシダーゼの初期濃度が約０．１〜約４ＩＵ／／ｍｌであ る請求の範囲７５の方法。
77. ７７．初期のカタラーゼとグリコレートオキシダーゼの比が少くとも約２５０： １である請求の範囲７６の方法。
78. ７８．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲７７の方法。
79. ７９．温度が約０〜約４０℃である請求の範囲７８の方法。
80. ８０．温度が約５〜約３０℃である請求の範囲７９の方法。
81. ８１．温度が約５〜約２０℃である請求の範囲８０の方法。
82. ８２．添加されるＦＭＮも初期濃度が約２．０ｍＭ又はそれ以下である請求の範 囲７９の方法。
83. ８３．添加されるＦＭＮの初期濃度が約０．０１〜約０．２ｍＭである請求の範 囲８２の方法。
84. ８４．初期のカタラーゼとグリコレートオキシダーゼの比が少くとも約２５０： １である請求の範囲８１の方法。
85. ８５．ＦＭＮが存在する請求の範囲３の方法。
86. ８６．ＦＭＮが約２．０ｍＭ以下の初期濃度で存在する請求の範囲４４の方法。
87. ８７．ＦＭＮが約０．０１〜約０．２ｍＭの初期濃度で存在する請求の範囲８６ の方法。
88. ８８．ＦＭＮが存在する請求の範囲３７の方法。
89. ８９．ＦＭＮが存在する請求の範囲２６の方法。
90. ９０．ＦＭＮが約２．０ｍＭ以下の初期濃度で存在する請求の範囲８９の方法。
91. ９１．ＦＭＮが約０．０１〜約０．２ｍＭの初期濃度で存在する請求の範囲９０ の方法。
92. ９２．ＦＭＮが約２．０ｍＭ以下の初期濃度で存在する請求の範囲４３の方法。
93. ９３．ＦＭＮが約０．０１〜約０．２ｍＭの初期濃度で存在する請求の範囲９３ の方法。
94. ９４．グリコレートオキシダーゼが約０．１〜約４ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する 請求の範囲２０の方法。
95. ９５．ｐＨが約８．０〜約９．５である請求の範囲９４の方法。
96. ９６．温度が約０〜約４０℃である請求の範囲９５の方法。
97. ９７．温度が約５〜約２０℃である請求の範囲９６の方法。
98. ９８．ＦＭＮが存在する請求の範囲９７の方法。
99. ９９．反応後に存在するいずれかの酵素を濾過及び／又は加熱によって除去する 請求の範囲１の方法。
100. １００．反応後に存在するいずれかのアミンをイオン交換樹脂の使用によって除 去する請求の範囲１０の方法。
101. １０１．反応後に存在するいずれかのアミンをイオン交換樹脂の使用によって除 去する請求の範囲２２の方法。