JPH05502797A - コリネバクテリアのインテグロン、該インテグロンによるコリネバクテリアの形質転換方法、及び得られたコリネバクテリア - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コリネバクテリアのインチグロン、該インチグロンによるコリネバクテリアの形 質転換方法、及び得られたコリネバクテリア 本発明はコリネバクテリア（ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）のゲノム中におけ る予め定められたＤＮＡ配列の組込みに関する。

この組込みは２つの主要な目的を有する。一方で、コリネバクテリウムの株によ り特定タンパク質を産生ずることが、このタンパク質が関連株で正常には発現さ れないことから又は該株に相同タンパク質を過剰産生させるためのいずれかから 望まれる。しかし他方で、遺伝子を妨げることにより該遺伝子の発現を遮断して 、対応酵素活性の失効及び細胞中における反応基質の蓄積を起こすことが望まれ る。

コリネバクテリウムに加えてブレビバクテリウム（ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒＩの ）を含めたコリネバクテリアは取扱がこれまでにかなり扱いにくいことがわかっ た細菌であるニー最初に、それらの形質転換を可能にする方法がほとんど又は全 く存在しないのである；及び−他の細菌源からのＤＮＡを用いた形質転換がほと んど無効であることが多いという結果として、大きな制限障壁が存在する。

最近、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃＨｏｐｏ＋ａｔｉｏｎ）法でコリネバ クテリアを形質転換しうる可能性について証明することができた。しかしながら 、自己複製ベクターによる形質転換法は有用であるが、染色体内部への組込みで 形質転換された利用可能な細菌、即ち組込み要素のコピー数に関して及びその位 置に関して経時的に安定である株を有することがほとんどのケースで及び工業的 規模で好ましい。

本発明の目的はコリネバクテリアのゲノム内部への組込み用の系について提案す ることである。

本発明はコリネバクテリアのインチグロンに関し、それらはニ ー上記コリネバクテリウムにおいて、以下で“選択遺伝子”と称される、有効な 選択を保障する遺伝子−上記コリネバクテリウムのゲノムの相同配列を含み、上 記配列が上記細菌に適合されていることで特徴付けられる。

“インチグロン”とはコリネバクテリウムのゲノム内に組込まれる性質を有した 非複製ベクターを意味するとして理解され、このインチグロンは直鎖状でも又は 環状形でも可能である。

しかしながら、インチグロンは異なる宿主、例えば大腸ｍ　（Ｅ＋ｃｈｃｒｉｃ ｈｉａ　ｃｏｌｉ）において合成しうる自己複製プラスミドから通常得られる。

しかし組込み段階前において、非コリネバクテリア起源のＤＮＡのすべての痕跡 は選択遺伝子及び特に複製に関与するすべての配列を除き除去されることが好ま しい。

上記コリネバクテリアで有効な選択用遺伝子はニー特定の物質、特に抗生物質に 対する耐性に関する遺伝子；又は 一明確に同定可能な表現型、例えば着色及び／又は相補性を付与する遺伝子 である。

本発明においては、抗生物質耐性に関する選択が特に一層有用である。このため ・ −ＫｍＲと表示されるカナマイシン耐性を付与するＡ　ｐ　ｈ　ＩＩ＋遺伝子 −Ｃｍ”と表示されるクロラムフェニコール耐性を付与するＣａｔ遺伝子 を用いることができる。但し他の遺伝子、特にエリトロマイシン耐性に関する遺 伝子も用いてよい。

“相同配列”は形質転換されたコリネバクテリウム中に存在するものに相当する か又は８０％以上の相同性レベルを示す配列を意味するとして理解され、それら は同種からの又はそれ以外の種からの配列であってもよく、これらの配列は更に 合成であってもよい。

その配列は適合させるべきか又はそうさせるべきでなく、即ちそれらは、例えば 以下で記載された方法を用いてコリネバクテリアに存在する制限障壁の問題を考 慮にいれるべきである。

好ましくは、このインチグロンはそのインチグロンに加えて複製領域を含むプラ スミドから得られるが、そのインチグロンはその切出しを可能にする制限部位、 好ましくはそのインチグロンに存在しない制限部位、例えばＮｏｔ　Ｉ、Ｂｓ　 ｔＸＪ又は５ａｃＩに相当する逆方向反復配列と隣接している。このため、上記 制限部位を認識する酵素を用いた消化により、インチグロンは直接得てもよく、 しかも得られる末端は相補的であることから、必要であればコリネバクテリウム の形質転換に用いられる前に環化させてもよい。

したがって本発明による系内において、インチグロンは複製領域におかれた複製 源、即ちレプリコンを用いて複製することができるプラスミドベクターの一部で あることが好ましい。この複製カセット中に存在するレプリコンの性質に応じて 、この複合プラスミドは、それが１つの内在レプリコンのみからなる場合はコリ ネバクテリアにおいて排他的に、又は２つの異なるレプリコンがプラスミドで組 合されて各々がそれ自身の宿主で複製できる場合はコリネバクテリアにおいて並 びに外来宿主、例えば大腸菌において複製される。

このケースにおいて、そのプラスミドの組立てはコリネバクテリアと異なる系内 で行ってもよく、これはコリネバクテリウム及びブレビバクテリウム内における 組立て困難性があるときに時には有用であろう。

インチグロン及びゲノムに同時存在する相同配列の存在のおかげで、インチグロ ンは組換えを介して染色体内部に挿入される。このため、−次形質転換体内部に おいてインチグロンの多クローニング部位で最初にクローニングされた遺伝子は 細菌染色体内部で重複される（概略図２ａ参照）。

このような重複は、遺伝子の倍増がこの遺伝子でコードされる活性、特に対応酵 素活性に関して増加を起こすという点で技術的な有用性を有する。

−次インテグラント（ｉｎｉｅｇｒａα０の構造が選択遺伝子を囲む相同配列の 直接タンデム重複に相当するため、選択遺伝子を過剰発現する株を検出できる培 地において一次インテグラントの増殖物の選択によりこの構造を増幅させること ができる。このため、選択遺伝子が抗生物質耐性に関する遺伝子である場合、最 も耐性な株は抗生物質含有率を増加させた培地で選択されるが、その株は相同配 列だけでなくインチグロン内部に挿入されたあらゆる遺伝子又はＤＮＡ配列に相 当する遺伝子の過剰産生に適している。

当然ながら、インチグロンは相同配列に加えて、有用な配列、特に相同な、即ち コリネバクテリウムから得られる、又は非相同な、即ち他の細菌種から得られる 、真核細胞起源でも合成起源であってもよい有用なペプチド又はタンパク質につ いてコードする配列を含むことが好ましいであろう。

これらの配列は好ましくはコリネバクテリアにおいてそれらの発現を保障する要 素を含むか又はそれらはそれらが宿主細菌の発現要素で発現されつるように枠内 で挿入される。

コリネバクテリウムの場合では、例えばある酵素、特にｇｌｔＡ又はｇｄｈＡの 過剰発現を得ることが有用かもしれない。

前記のように、本発明によるインチグロンを用いることで遺伝子の遮断を保障す るためにこの系を用いることが可能である。図２ｂで記載されたような遮断又は 置換により対応遺伝子は不活性化され、これにより対応遺伝子でコードされる酵 素の基質を過剰産生させる。

一般に、インチグロンは組込みカセットの形でデザインされる、即ち、ある場合 では同一であってもよい選択遺伝子及び相同配列に加えて、望ましいＤＮＡ配列 及び／又は遺伝子の挿入を可能にするいくつかのクローニング部位を含んだ配列 が得られる。

すべての場合において、遺伝的制限の目的で、他の種からの複製ＤＮＡを欠くイ ンチグロンを提供する試みが行われる。

更に複雑な組込み系、特に転位要素の配列を更に含む組込み系を提供することも 可能である。転位要素の配列はコリネバクテリウムでコードされたタンパク質を 除いて転位を保障するすべての配列であるが、但しそれらはトランスボゼースに ついてコードする配列を欠いた転位要素であってもよい。

転位要素の中では、特にミニＭｕファージ形のＭｕファージが挙げられる。以下 でみられるミニＭｕファージのような転位要素のケースにおいて、そのファージ 又は異なる起源の一部であるマーカー、例えば着色されたマーカーが用いられた 。

本発明は様々なコリネバクテリア、特にブレビバクテリウムから得られる転位要 素、更に詳しくは図９で記載されたようなｒｓａＢｌを用いたインチグロンにも 関する。

例１０は要素ｌ５ａＢ１の特徴を示し、例１１はこのタイプの転位要素を選択か つ同定することを可能にする一般的方法について示す。

本発明は転位された要素、特にトランスボゼース及び／又は転位のリプレッサー についてコードする要素から得られる配列を含むインチグロンにも関する。

本発明によるインチグロンは関連配列の全部又は一部、特にｌ５ａＢ１に相当す る配列を含んでいてもよい。

ミニＭｕファージの断片、相同ＤＮＡ配列及び選択遺伝子を含むこのタイプの組 込み構造は、前記構造を用いたケースのように必要なときに特定遺伝子の過剰発 現又は遺伝子の破壊のいずれかを得ることを可能にする。

後者の構造は、前構造とは異なるが、それにもかかわらず簡略化のために“イン チグロン”と称される。

本発明は、特にインチグロンが電気形質転換で導入された場合に、前記インチグ ロンを用いた組込み形質転換で得られるコリネバクテリウム株にも関する。

使用してもよいコリネバクテリア株の中では、産業上の有用性から以下が更に具 体的に挙げられるニーＢ、ラクトファーメンタム（ｌａｃｔｏｆｅ＋ｍｅｎｔａ ｍ）−Ｂ、フラバム（ｆｌａｖｕｍ） −〇、グルタミカム（ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍｌ−〇、メラッセコラ（ｍｅｌａｓ ＋ｅｃｏｌａ）クローニングがインチグロンの最終宿主であるコリネバクテリウ ムとは異なる宿主で行われるケースにおいて、インチグロンの移入にはインチグ ロンをコリネバクテリウムに適合させるために、コリネバクテリウム内部で組立 て体の可能な複製性質を利用してもよい。このため、操作は組込みが行われるち ょうどその株の内部にインチグロンに加えて複製領域を含むプラスミドを導入す ることで開始し、次いでこうして適合されたこのインチグロンはプラスミドの抽 出により回収され、しかる後インチグロンを放出する酵素で消化され、次いで精 製された断片は自己結合されるか又はされず、結合産物は組込み形質転換に用い られる；このケースにおいて、制限障壁はもはや問題ではない。

中間コリネバクテリウムを経由することが有用である場合、特にＤＮＡが大腸菌 起源である場合においては、インチグロンをコリネバクテリウム・メラッセコラ に適合させる前にそれをブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムに適合する ことが有用であろう。

最後に、本発明は特に本発明によるインチグロンを用いたタンパク質又は代謝産 物の製造に関する工業的プロセスにおいて本発明によるコリネバクテリアの使用 に関する。

以下の例によれば本発明の利点を更に詳しく説明することができるであろう。

添付された図面においてニ 一部１は複製プラスミドから出発するインチグロンの製造の概略図である。

一部２は： ・単一組換えによる（ａ） ・二重組換えによる（ｂ） インチグロンの挿入の概略図である。

−図３はｐｃＧＬ５１９の構造の概略図である。

−図４は２つの形質転換株に関する時間の関数としてカナマイシン耐性率の図表 である。

一部５はミニＭｕファージ： ・Ｍｕ　ｄｌｌｌ　６　８　１ ・　Ｍｕｄｌｌ１６８１−Ｃａｔ の構造の概略図である。

一部６はプラスミド： ・ｐｃＧＬ１０７及び ・ｐＣＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ＋ の概略図である。

一部７はミニＭｕを含む又は含まない望ましいインチグロンの組込み概略図であ る。

一部８はｌａｃオペロンの３′末端においてインサートからクローニングされた ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＣＧＬ２００５　（Ｂ１１５）の挿 入要素の制限地図を表す。

一部９はＩ　５ａＢ１配列を表す。

−図１０はｌ５ａＢｌの制限地図を表す。

−図１１はｐｃＧＬ３３０プラスミドの制限地図を表す。

−図１２はｐ　ＣＧＬ　３３１プラスミドの制限地図を表す。

Ｃ，メラッセコラ株ＡＴＣＣ１７９６５の染色体ＤＮＡを　Ａｔｚｕｂｅｌら（ １９８７）の修正法に従い得た。

ＭｂｏＩ制限エンドヌクレアーゼ〔ベーリンガ−（Ｂｏｅｈ＋１ｎＢｒ）：ｌに よる制御的切断をＭａｎｉａｔｉｓら（１９８２）により記載された操作に従い このＤＮＡ　１０μｇで行った。

このＤＮＡ断片をＡｕ５ｏｂｅｌら（１９８７）により記載されたようなスクロ ース勾配上でそれらのサイズに従い分離した。

サイズ６〜１５ｋｂの断片をライブラリー組立てのために選択した。

ｐＵＮ１２１クローニングプラスミド（ｌｌｉｌ＋＋ｏｎら。

１９８３）を自由に入手可能な大腸菌株ＧＭ２１９９からＢｉ＋ｎｂａｉｍ及び Ｄｏｌｙ（１９７９）の方法で得た。プラスミドをＢｃｌＩ制限エンドヌクレア ーゼ（ベーリンガー）で直鎖化した。

ライブラリーをＢｃｌＩで直鎖化されたｐＵＮ１２１プラスミド１μｇ及び前記 ６〜１５ｋｂＤＮＡ断片２μｇからＡｏｓｕｂｅｌら（１９８７）により記載さ れた条件下でＴ４ＤＮＡリガーゼ（ベーリンガー）での結合により組立てた。結 合混合物をＤｏｖｅ　ｒら（１９８８）により記載された操作に従いエレクトロ ポレーションで大腸菌株Ｄ　Ｈ５ａｌｐｈａ中に導入した。組換えプラスミドを 有する大腸菌クローンはテトラサイクリン１０μｇ／ｍ　ｌ含有ＬＢ培地で増殖 しうるそれらの能力により直接選択した。すべてのテトラサイクリン耐性クロー ンのプラスミドをＢｉ＋ｎｂｏｉｍ及びＤＯｆｙ（１９７９）の方法で得た。全 体としてまとめられたこれらのプラスミドがＤＮＡライブラリーに相当する。

クエン酸シンターゼ活性を欠く大腸菌株Ｗ６２０をＣ。

メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５ＤＮＡライブラリーで形質転換した。テトラサ イクリン含有最少選択培地上で増殖しうる大腸菌Ｗ６２０形質転換クローンを選 択した。

このクローンはｐｃＧＬ５０８組換えプラスミドを有する。様々なサブクローニ ングで、完全ｇｌｔＡ遺伝子を有するＣ、メラッセコラＤＮＡ断片を２つのＢｉ ｎｄＩ１１制限部位で範囲制限された３、５ｋｂＤＮＡ断片に短縮することがで きた。

インチグロンの製造図は図１で示されている。

ａ　ｐ　ｈ　Ｉｌｌ遺伝子を選択遺伝子として選択した；それは１つのコピーが 染色体に組み込まれたときに６００μｇ／ｍ　１以内のカナマイシンに対する耐 性を付与する。

２５μｇ／ｍ　ｌが通常用いられる。例１で得られたＣ、メラッセコラのクエン 酸シンターゼについてコードするｇｌｔＡ構造遺伝子を有する３、５ｋｂＨｉ　 ｎ　ｄｌｌｌ断片をコリネバクテリアゲノムの相同的ＤＮＡ断片として出発時に 選択し、多クローニング部位の独特な部位の１つ（Ｈｉｎｄｌ１１部位）に挿入 した。組込み戦略で最も広く用いられると考えられるインチグロンの範囲を制限 する制限部位は８−ヌクレオチド配列に相当するＮｏｔＩ部位及びＢｓｔＸ１部 位である。酵素ＢｓｔＸＩは配列（ＣＣＡＮ５ＮＴＧＧ）を認識する；その結果 、それは６−ヌクレオチド酵素と同じくらい頻繁に切断し、い（つかの断片が産 生されると予想できる。しかし放出された断片は異なるＢｓ　ｔＸＩ部位の内部 配列の性質に応じて組換えられるが、これから最後に出発断片単独を再構成する べきである。

ｐｃＧＬ５１９プラスミド（図３）はインチグロンを産生できる多用性プラスミ ドの例である。Ｃ，メラッセコラにおけるその組込みカセットの組込みは、Ｎｏ ｔＩ部位で範囲制限された２つの複製及び組込み断片からなる大腸菌ｐｃＧＬ５ １９から最初に得られるプラスミドを用いて試験した。第一断片は多クローニン グ部位、ａ　ｐ　ｈ　ＩＩＩ選択遺伝子及びクエン酸シンターゼについてコード するｇｌｔＡ遺伝子を有する染色体の相同Ｈｔｎｄｌｌｌ断片を含むインチグロ ンに相当する。第二断片はコリネバクテリアで複製されるｐＢＬＩプラスミドの 複製領域（３ｋｂＳｓｐ　Ｉ−Ｈｐａ　Ｉ断片）、大腸菌ｏｒｊ　ｐ１５Ａで複 製されるｐＡｃＹ１８４プラスミドの複製領域及びトランス相補性Ｍ１３ファー ジの複製源を含む。ｐｃＧＬ５１９プラスミドはｐＣＧＬ２４３ベクター内にｇ ｌｔＡ遺伝子を含む３．５ｋｂＨｉｎｄＩＩ＋断片の挿入により大腸菌で組立て た。

図１で示されるように、クローニング後、ｐＣＧＬ５１９はＢ、ラクトファーメ ンタムを形質転換させるために用いる。ブレビバクテリウム・ラクトファーメン タムＣＧＬ２００２へのｐｃＧＬ５１９の移入と同時に、ｐＢＬＩの複製領域が 大腸菌内で不活性化されたことから、複製源を含むＮｏｔｌ断片が置換された。

これはカセット構造の利点を更に示している。

大腸菌に対して非常に制限的なコリネバクテリウム・メラッセコラＡＴＣＣ１７ ９６５へのｐｃＧＬ５１９の移入はＢ、ラクトファーメンタムから抽出された同 様のプラスミドを用いて行った。提案された系は大腸菌に対しては完全に制限的 であるが但しＢ、ラクトファーメンタムに対しては部分的にすぎないＣ，メラッ セコラ株ＡＴＣＣ１７９６５からｐｃＧＬ５１９プラスミドを単離することを可 能にする。こうして、受容株の変化を所有する組込みカセットを得た。

Ｃ，メラッセコラＡＴＣＣ１７９６５から得られたｐｃＧＬ５１９プラスミドを Ｎｏｔｌ制限エンドヌクレアーゼ（ベーリンガー）で切断した後、ｇｌｔＡ遺伝 子及びＡ　ｐ　ｈ　＋１１選択遺伝子を含むインチグロンを低融点アガロースゲ ルから単離かつ精製した。次いでこうして精製されたインチグロンを結合による 自動再環化に付した。次いで結合混合物をエレクトロポレーション（Ｂｏｎａｍ ｙら、　１９９０）でＣ，メラッセコラ株ＡＴＣＣ１７９６５に導入した。カナ マイシン２５μｇ１０１に耐性のＣ６メラッセコラクローンを分析に付した。

５００の形質転換体を得た。分析された５０のうち３１はｐｃＧＬ５１９プラス ミドを有さず、それらのうち２０はＸｂａＩ切断後にサザンプロットで分析した 。

それらはすへてｇｌｔＡ領域で相同的組換えにより行われる同様の組込み事象に 相当する。結合産物の性質（環状モノマー分子又は直鎖状もしくは環状ポリマー 分子）に応じて、−次インテグラントは単−又は二重“乗換え”から得られると して解釈される。ＮｏｔＩ切断後におけるパルスフィールド分析しかる後ｇｌｔ Ａを含む３．５ｋｂＨｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌｌ断片に相当するプローブとのハイブリ ッド形成を行った。インチグロンの単一コピーの組込みはこの分析で確認する。

モデルではｇｌｔＡ遺伝子の野生コピーの重複を伴う：酵素活性を測定したとこ ろ、それは１．８２倍で増加しているが、これはプロットの解釈と一致し、組込 まれたコピーが不活性化されていないことを示す。その結果は野生株及び複製プ ラスミドで形質転換された株に関する表１で一括されている。組込まれた構造の 安定性は約３０世代後におけるカナマイシン耐性細胞のパーセンテージ（図４） 及び安定化しているクエン酸シンターゼの酵素活性に関して測定した。

組込まれた構造の増幅は、過剰のカナマイシンを含む皿上における増殖物の選択 、８００μｇ／ｍ　ｌ、しかる後１０００μｇｅｍ　ｌ及び次いでカナマイシン 及びネオマイシン１０００μｇ／ｍ　ｌでの選択により行った。直接タンデム増 殖を得た。増殖された構造及びカナマイシン耐性の安定性にもかかわらず、クエ ン酸シンターゼのケースで最初に得られる高レベルの酵素活性はその後に維持さ れなかった。ｇｌｔＡ遺伝子の特異的不活性化が生じた可能性がある。

この例で選択されたＭｕ誘導体は、１’４．８ｋｂ及び１６．６ｋｂのサイズを 各々有するＭｕｄｌｌ１６８１及びＭｕｄｌｌ１６８１−Ｃａｔ　（各々ＫｍＲ 及びＣｍＲ）である（図５）。ミ＝ＭｕＭｕｄｌｌ１６８１−Ｃａｔはトランス ポゾンＭｕｄｌｌ１６８１の誘導体である（Ｃａｔｔｉｌｈｏら、　１９８４） 。それは既に示された転位に必要な要素（ＨＵを除＜）、更に熱感受性リプレ・ ソサー遺伝子Ｃ（トランスポザーゼＡ及びＢの発現のレギュレーター）、抗生物 質耐性に関する遺伝子（各々ａｐｈｌｌ及びｃａｔ）と１ａｃＡ、１ａｃＹ及び １ａｃＺ−遺伝子を有する。

後者は８番目のコドンで始まり、Ｍ　ｕ　ｄが読取り枠内に挿入された場合にタ ンパク質の翻訳融合を検出することを可能にする。

これらのトランスポゾンをコリネバクテリアに移入した。染色体内部におけるト ランスポゾンの組込み後、例８で記載された方法は組込まれたコピーを増幅させ ることができた。この増幅と一緒に、組込み事象の標的遺伝子（グルタミン酸デ ヒドロゲナーゼに関する構造遺伝子）も多数のケースにおいて２５倍以内の対応 酵素活性増加で増幅された。

」 ミニＭｕの移入に関するベクターの組立て組込みベクター（ｐｃＧＬ１０７−図 ６）はカナマイシン耐性マーカーＫｍ　（ａｐｈ［ｌｌｌ、ｐＵＮ１２ルプリコ ン（ｏ　ｒ　ｉ）　（Ｎｉｌ＋ｓｏｎら、１９８３）とテトラサイクリン（Ｔｅ ｔＲ）及びアンピシリン（ＡｍｐＲ）耐性を付与する遺伝子により遮断されたｇ ｄｈＡ遺伝子（Ｇｄｈ”）を含んでいる。このベクターがブレピノくクテリウム ・ラクトファーメンタム内で複製されないとすれば、それはｇｄｈＡ遺伝子の相 同的部位に単一の“乗換え”で組込まれる。

Ｍｕｄｌｌ１６８１−　Ｃａ　ｔをＭＣ４１００株内に大腸菌からのミニミュダ クション（ｍｉｎｉｍｎｄｕｃｔｉｏｎ）で組込みベクターｐＣＧＬ１０７に導 入した。得られた様々なインサートの中から、大腸菌でＬａｃ−表現型を示すも の（１）ＣＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ＋、図６）を選択した。トランスポゼース Ａ及びＢに関する遺伝子がＨｉｎｄｌｌｌ切断で欠失された無能化Ｍ　ｕ　ｄ　 （ｐ　ＣＧ　Ｌ　１０７・：Ｍｕｄ−１図６）をこの同一プラスミドから得た。

他の移入戦略を試験した；　Ｍｕ　ｄｌｌｌ　６８１を他の２タイプのベクター 内にトランスポゾンをいれることでコリネバクテリア中に導入した。

−Ｍｕｄｌ１１６８１が導入されたｌａｃ遺伝子を欠くｐＵｃ１８の誘導体であ る自殺ベクター（非複製、非組込み）　ｐＥＶＩ　１　：　：Ｍｕｄ −ｐＢＬルプリコン（Ｈｉｎｄｌｌｌ　−Ｈｐａｌ断片）、ｐ１５Ａレプリコン 及びＴｎ９　ｃ　ａ　を遺伝子を有するシャトルベクター（ｐＣＧＬ２２９）、 Ｍｕｄｌｌ１６８１を大腸菌Ｒｅｃ本におけるミニミュダクションによりシャト ルベクター内に導入した。得られた様々なインサートの中から、Ｌａｃ−表現型 を示すもの（ｐＣＧＬ２２９　：　：Ｍｕｄ＋）を選択した。トランスボゼース Ａ及びＢに関する遺伝子がＰｓｔＩ切断で欠失された無能化ＭｕｄＳｐＣＧＬ２ ２９　：　：Ｍｕｄ−をこのベクターから得た。

大腸菌（Ｄ　Ｈ５ａｌｐｈａ）株と２つのブレピノくクテリウム・ラクトファー メンタム株ＣＧＬ２００２及びＣＧＬ２００５　（Ｂ１１５）を前記ベクターで 電気形質転換した。これら２つの株は大腸菌から得られるＤＮＡに対して部分的 に許容される。実験では表２で示された結果を与えた。下記コメントが加えられ るニ ー形質転換効率は大腸菌で実質上減少されるが、それはＭｕｄ＋がベクター中に 存在している場合においてシャトルベクターｐＣＧＬ２２９のケース又はベクタ ーｐｃＧＬ１０７　（そこで複製できる）のケースであって、転位遺伝子が欠失 されたケースではない。活性Ｍｕ誘導体を有する複製プラスミドに典型的である この現象はその天然宿主内におけるＭｕトランシスゼースの非常に高い発現に寄 与している。これは前記組立てにおいて用いられるＭｕｄ＋ｈランスボゾシスＭ ｕ　ｄｌｌｌ　６８１及びＭｕｄｌｌ１６８１−Ｃａｔ）が有効に活性テアルコ トヲ示す。

一試験されたいずれのコリネバクテリウム株においてもシャトルベクターｐＣＧ Ｌ２２９　：　：Ｍｕｄ＋又は＝（又は自殺ベクターｐＥＶ１１　：　：Ｍｕｄ ）を有する形質転換体を得ることはできない。ｐＣＧＬ２２９誘導体のケースに おいては、ｐＢＬルプリコンが大腸菌Ｒｅｃ＋中へのミニミュダクション中に不 活性化できたが、これはＢ、ラクトファーメンタム内で増加することに関してそ のベクターの不能力を示している。

−形質転換体は組込みベクターｐｃＧＬ１０７及びその誘導体を有するＢ、ラク トファーメンタムＣＧＬ２００５（Ｂ１１５）で得た。ｐｃＧＬ１０７：Ｍ　ｕ 　ｄ＋又はｐｃＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ−で得られた形質転換効率は同様であ り、これはミニＭｕ　Ｍｕｄｌ１１６８１−Ｃａｔ　Ａ＋Ｅ＋が組込みベクター を用いてＢ、ラクトファーメンタム中に導入される場合に高い効率で転位されな いことを示している。

ｐｃＧＬ１０７自体と比較された２つのｐＣＧＬ１０７誘導体の形質転換効率に 関して観察された減少（２０フアクター）はおそらく形質転換プラスミドのサイ ズ減少によるものであろう（ｐｃＧＬ１０７のケースで１０ｋｂ、ｐｃＧＬ１０ ７　：　：Ｍｕｄ＋のケースで２６．７ｋｂ及びｐｃＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ −のケースで内へのｐｃＧＬ１０７：・Ｍｕｄ＋の組込みに関する事象の研究 ｐｃＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ＋　（以下、ｐｃＧＬ３２０と称される）を有す る株ＣＧＬ２００５　（Ｂ１１５）の形質転換から１４７のカナマイシン耐性ク ローン（２５μｇ／ｍ　ｌ　）を得ることができたが、但し形質転換体はクロラ ムフェニコール（５μｇ／ｍｌ）耐性に関して選択した場合に得られなかった。

しかしながら、これらクローンのうち１０３はクロラムフェニコール上で複製後 にクロラムフェニコールに対して耐性である。したがって、Ｔｎ９ｃａｔ遺伝子 の単一コピーはコロニーの一次選択を行うために充分には発現されないようであ る；逆に、この発現はストリークを用いた次の試験で耐性表現型を調べるために は充分である。得られたすべてのクローンは大腸菌で観察された表現型に相当す る表現型１ａｃ−である。

２タイプの得られたインチグランド（タイプ１形質転換体、ＫｍＲＣｍ８及びタ イプ２形質転換体、ＫｍＲＣｍＲ）は、二重“乗換え”事象によるｇｄｈＡ遺伝 子の置換と単一“乗換え”事象によるｇｄｈＡ部位内への完全プラスミドの組込 みに各々相当する（図７）。この解釈に有利な観察は以下のとおりである。

−タイプ１及び２形質転換体におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼアッセイ（ Ｍ！ｅｒｓら、　１９７０の方法に従う）（表３）、７つのタイプ１形質転換体 のうち５つ（例えばに２及びに３、表３）はｇｄｈ活性を有しないが、これは遮 断遺伝子によるｇｄｈＡ遺伝子の置換と一致する。

５つのタイプ２形質転換体のうち４つはコントロールに類似したｇｄｈ活性を有 する（例えばＫＯ２及びＫＯ２、表３）。

一タイプ１形質転換体（Ｋ２）及びタイプ２形質転換体（ＫＯ２及びＫＯ２）の ＢａｍＨＩ切断に相当するサザンプロット分子分析並びにプラスミドプローブｐ ｃＧＬ１０７による特徴的バンド（図７で示す）の検出（結果は示されない）。

それらはｇｄｈ−形質転換体（Ｋ２）の分子構造が遺伝子置換に従うことを示す 。それらによればｇｄｈ十形質転換体〔タイプ２事象（ＫＯ２及びＫＯ２）及び 一部のタイプ１事象（Ｋｌ）：］がｇｄｈＡ部位におけるプラスミドの組込みで 得られることも確認する。

タイプ２形質転換体（Ｋｍ　及びＣｍＲ）はクロラムフェニコール５μｇ／ｍｌ の存在下で単離されたコロニーの増殖を得るためにクロラムフェニコール耐性遺 伝子を充分には発現しない。したがって、我々は（ｃａｔ遺伝子を有する）Ｍｕ ｄの転位を選択しようという希望をもってこれらの形質転換体でサブクローンＣ ｍＲを捜した。

これらのサブクローンは１０５細胞当たり１つに近い頻度で得られた。Ｘｇａｌ で複製後、これらのクローンは白〜青で色の全種類を示す（３０％は明らかに青 色である）。この結果はβ−ガラクトシダーゼ活性の測定により確認される（表 ４）。それはＭｕｄの転位、クロラムフェニコール耐性の増幅及び挿入部位での タンパク質融合によるβ−ガラクトシダーゼ活性の発生を示すであろう。実際に 、ｐｃＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ−で行われた同様の実験ではこれらの事象が転 位事象によるものでないことを示す同様の結果を生じた。

例９ ｐｃＧＬ１０７　：　：Ｍｕｄ＋プラスミド染色体におけるタンデム増幅の証明 既に単離されたほぼすべてのこれらＬａｃ＋クローン（ＫＣ３Ｔ４を除く）は増 幅されたｇｄｈ活性も有するらしい（表４）。更に、１つの例外（Ｋｃ３Ｔ４） を除き、β−ガラクトシダーゼ（Ｍｉ　ｌｌｅ＋、　１９７２に従い調べる）及 びｇｄｈ活性はほぼ釣り合っている。同様の評価はクロラムフェニコールアセチ ルトランスフェラーゼのアッセイ（Ｓｈａｗ、　１９７５．表５の方法に従う） に関して行ってもよい。この結果はＭ　ｕ　ｄの転位と一致せず、その転位に際 して隣接配列を決して運搬しない。むしろ、それは配列相同性で範囲制限された 反復単位ｐＵＮ−Ｍｕｄ−ｇｄｈの染色体においてタンデム増幅を示す。この点 はＢａｍＨＩ、Ｎｏ　ｔ　Ｉ及びＸｂａＩによる株ＫＣ３、ＫＣ３Ｔ１及びＫＣ ３Ｔ３のゲノムＤＮＡの切断から確認した。Ｍ　ｕ　ｄ内部のＢ　ａ　ｍ　ＨＩ バンド（７ｋｈに等しい）だけでなく、タンデム増幅をうけかつ転位事象を妨げ るＭｕｄの末端を含むバンド（ｌｌｋｂ及び２．４ｋｂ）も増幅される。更に、 ＮｏｔＩ切断（Ｍｕ　ｄｌｌｌ　６８１−Ｃａｔ内で１回だけ切断する）及びＸ ｂａＩ切断（ｇｃ（ｈ−内で１回だけ切断する）は実質上２４ｋｂバンドの反復 単位を増幅させる。

この増幅は、β−ガラクトシダーゼ活性が選択圧力なしで１５世代後に初期活性 の７０％のレベルであるとすれば、比較的安定であるらしい。Ｃａｔ及びＧｄｈ 活性も２５世代後に３０％の喪失を示す。このタンデム増幅はバチルス・ズブチ リス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）におけるＡｌｂｅｒｆｉｎｉ　ら （１９８５）及びＩａａｎｉｅｒｅら（１９８５）の結果と類似している。増幅 されたクローンのβ−ガラクトシダーゼ活性はＢ、ラクトファーメンタムに存在 し大腸菌では検出しえない増幅された寄生翻訳（ｌａｃオペロンが融合されたア ンピシリン耐性遺伝子の読取り枠外）に寄与し挿入要素ｌ５ａＢ１の研究及び特 徴 挿入要素はＫＣ３Ｔ４の増幅ＤＮＡから大腸菌ＤＨ５ａｌｐｈａのプラスミドを 回収することで単離した。

Ｂ、ラクトファーメンタム株ＣＧＬ２００５　（Ｂｉ１２）、一部の誘導体及び コリネバクテリアの他の株のゲノムＤＮＡは既に単離された挿入要素を含むプロ ーブを用いて探査された。最初に、ＫＣ３Ｔ４において増幅されたＤＮＡから生 じかつ挿入要素を含むＭｕ内の３．５ｋｂＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ断片は、インチグラ ンド及び様々な増幅された株（ＫＣ３Ｔ４を含む）からのＢａｍＨＩ切断ＤＮＡ を含む初期プロットをプローブ探査するために用いた。

インサートがＢ　ａ　ｍ　ＨＩ部位を含まないため、この実験では少なくとも１ つのインサート又は１つの挿入断片を含むＢａｍＨＩゲノム断片を明らかにする ことができる。

Ｋ１−株（ｐｃＧＬｌ　０７　：　：Ｍｕｄ−から得られるタイプ１置換インチ グランドに相当する）の場合には５つのバンドが出現し、これはインサートのい くつかのコピー（完全又は不完全）の存在を示す。

Ｂ、ラクトファーメンタムＣＧＬ２００５　（Ｂ１１５）から得られたゲノムＤ ＮＡのＢａｍＨＩ切断ではＫｌ−でも観察される４つのバンド（各々サイズで１ ８　ｋｂ。

５．９ｋｂ、、５ｋｂ及び４．５ｋｂ）を示した；他の株Ｋ１−１ＫＣＩ−及び ＫＯ２で観察される５番目のバンド（サイズ６．５ｋｂ）はこれらの株が誘導さ れた株ＣＧＬ２００５（Ｂ１１５）セグレガント（ｓｅＨｅｇａｎ＋）において 転位を示しているのかもしれない。

２つの異なるブレビバクテリウム系、（ｉ）ブレビバクテリウム・ラクトファー メンタムＣＧＬ２００５　（Ｂ１１５）及び（１１）ブレビバクテリウム・ラク トファーメンタムＣＧＬ２００２に共通であるサイズ１８ｋｂ及び４．５ｋｂの ２バンドが出現する；逆に、株ＣＧＬ２００２は他のバンドを示さない。これは その要素の移動性を示す。コリネバクテリウム・メラッセコラ株は弱いハイブリ ッド形成シグナルを生じ、そのインサートは他の異なるが但し関連した配列のこ の種における存在を示す。

Ｂ、ラクトファーメンタムに特異的な第一移動挿入要素を同定かつクローニング した；それはＩ　５ａＢ１と命名したが、いくつかのコピー（２〜５コピー）が そのゲノムに存在しているかもしれない。それは増幅された領域において異なる 部位で数回転位させることができる。

その詳しい制限地図は公知である。異なるが但し関連した配列は他のコリネバク テリアのゲノムに存在している。

Ｉ　５ａＢ１は１２８８塩基対からなる；その末端はＩ　５ａＢ１がＨｃｄｉｇ ａ＋　ｅ（ａｌ、　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ＋ｔｒ７　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２．１９８２）で配列決定されたｌａｃオ ペロンの末端領域（３′）に相当する断片に挿入されていることから同定しても よい。ｌ５ａＢ１は５ｂｐ標的配列（ＣＣＧＡＴ）を重複するヌクレオチド５５ ７５と５５７６との間に挿入した（図８）。Ｉ　５ａＢ１の完全配列は図９で、 制限地図は図１０で示されている。配列分析によればトランスポゼース構造遺伝 子及び転位リプレッサー遺伝子に相当する２つのオープン読取り枠が確認された 。

例１１ 挿入要素及びトランスポゾンに関するトラッピングベクター Ｉ　５ａＢ１インサートはＢ、ラクトファーメンタムＣＧＬ２００５　（Ｂ１１ ５）の染色体における遺伝子増幅研究で得た。コリネバクテリアで転位されつる すべての挿入要素を単離するため、特定の組込みベクターｐｃＧＬ３３０及びｐ ＣＧＬ３３１を組立てた（図１１及び１２）。これら２つのベクターはｐＵＮ１ ２１から誘導される第一断片からなる。ｐＵＮ１２１プラスミドは大腸菌で複製 でき、アンピシリン耐性を付与する：それはラムダファージＰＬプロモーターと テトラサイクリン耐性遺伝子とのオペロン融合の発現を阻害するラムダファージ ｃｌリプレッサーについてコードする配列を有している。ｃＩ遺伝子内への挿入 は結果的にリプレッサーを不活性化させ、それによりＰ、のコントロール下にお いてコリネバクテリアで発現されるテトラサイクリン耐性遺伝子を発現させるよ うになる。このため挿入事象はテトラサイクリン耐性に関して選択してもよい。

ベクターｐＵＮ１２１を５ｓｐ１部位で直鎖化し、ＥｃｏＲＩによるベクターｐ ｃＧＬ１０７の切断で得られる第二断片と融合させ、フレノウ断片を用いて補充 し、大腸菌Ｄ　Ｈ５ａｌｐｂａで形質転換後にベクターｐｃＧＬ３３０及びｐｃ ＧＬ３３１を得たが、これらはそれらのクローニング方向に関して異なる。ｐｃ ＧＬ１０７から誘導されたＥｃｏＲＩ断片は、コリネバクテリアの直接的形質転 換に関する選択遺伝子（カナマイシン耐性を付与するａ　ｐ　ｈ　Ｉｆ！遺伝子 ）とコリネバクテリアの染色体内部における組込み部位として機能するｇｄｈＡ 遺伝子（グルタミン酸デヒドロゲナーゼ構造遺伝子）の相同領域を含む断片を含 んでいる。

Ｂ、ラクトファーメンタム株ＣＧＬ２００５　（Ｂｉ１２）　及ヒＣＧＬ　２０ ０２をｐｃＧＬ３３０及びｐＣＧＬ３３１プラスミドでカナマイシン耐性に関し て電気形質転換した。形質転換頻度は各ケースにおいて約１ｏ３／μｇであった が、これはプラスミドの組込みに適合する。

（ＣＧＬ２００５　：　：　ｐｃＧＬ３３０及びＣＧＬ２００５　：　：ｐＣＧ Ｌ３３１のような）形質転換体は、ｃＩによるＰ、の調節が形質転換体でうまく 機能することを確認するテトラサイクリンに対して感受的である。テトラサイク リン耐性セグレガントの頻度は約１０世代後に測定した。

ｃｌ遺伝子を不活性化する変異は２　Ｘ　１０　’／世代の頻度で組込みプラス ミドｐｃＧＬ３３０及びｐＣＧＬ３３１を有する株において出現する。

プラスミドの回収は株ＣＧＬ２００５　：　：　ｐＣＧＬ３３１及びＣＧＬ２０ ０５　：　：　ｐＣＧＬ３３０から単離されたテトラサイクリン耐性セグレガン トから抽出されＰｓｔｌ酵素で切断されたゲノムＤＮＡから行った。

これらの切断ＤＮＡを結合し、その結合産物を用いてテトラサイクリン耐性に関 し大腸菌の株Ｄ　Ｈ５ａｌｐｈａを形質転換した。回収されたプラスミドを分析 したところ、９つのテトラサイクリン耐性クローンのうち７つで挿入要素を確認 した。１つのケース（ＣＧＬ２００５　：　：ｐｃＧＬ３３１から生じる）にお いて、ｌ５ａＢ１と同一でかつｃＩ内に位置する挿入要素が確認された（サイズ １．２ｋｂ、独特なＡｃｃＩ、ＥｃｏＲＶ及びＸｈｏＩ部位を有する）。もう１ つのケース（ＣＧＬ２００５　：　：ｐｃＧＬ３３０から生じる）において、ｌ ５ａＢ１とは異なる挿入要素（サイズ１．Ｏｋｂ、ＥｃｏＲＶ又はＸｈｏＩ部位 ではなくＡｃｃＩ部位を有する）が確認された。

トランスポゾントラッピングベクターは機能的である；はとんどのケースにおい て、得られた変異は挿入である。

したがってテトラサイクリン耐性の頻度はかなり正確に転位の頻度を反映する： したがってほとんどの移動性要素が確認された；それらの中からｌ５ａＢ１を再 単離し、ｌ５ａＢ１とは異なるもう１つの挿入要素を確認した。

記載された株は下記起源を有する： 大腸菌 −ＤＨ５ａｌｐｈａ　：ギブ：７　（Ｇｉｂｃｏ）　Ｂ　ＲＬ・Ｍ　Ｃ４１００ ：　Ｃａ＋ａｄａｂａｎ（ｆ９７６）・ＯＲ１８３６：　Ｒｅ１ｅ＋ ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム・ＣＧ　Ｌ　２００２　：　Ｂｏｎ ａｍ４ら（１９９０）・ＣＧＬ２００５　（Ｂｌ　１５）＋Ｂｏｎｎａ＋＋ｉｅ ら（１９９０）コリネバクテリウム・メラッセコラ ・ＡＴＣＣ１７９６５：０Ｒ３ＡＮ ・ＡＴＣＣ１７９６５：：ｇｌｔＡ　：（本出願）これらの株のうち４つは１９ ９１年７月２３日付でパスツール研究所（パリ）のコレクシオン・ナショナール ・ドウ・キュルチュール・ドウ・ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　 Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｄｅＭｉｃ＋ｏｏｒｇａｎｉ＋ ｍｅ＋）　（ＣＮＣＭ）に寄託したニーコリネバクテリウム・メラッセコラＡＴ ＣＣ１７９６５：：ｇｌｔＡ：ｎ’　ｌ−１１２４−大腸菌０Ｒ１８３６：ｎ’ 　ｌ−１１２５−ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムＣＧＬ２００５　 （Ｂ１１５）：ｎ’　ｌ−１１２６−ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ ムＣＧＬ２００２：ｎｏ　ｌ−１１２７ 株Ｄ　Ｈ５ａｌｐｈａはクロンチック・ラボラトリーズ・カタログｆｃｌｏｎＮ ｃｂ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｃａｔｘｌｏｑｕｅ）、　ｎｏ。

Ｃ１０２１−１（パローアルト、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手でき、株Ｍ　Ｃ４１０ ０はｎｏ、　３５６９５としてＡＴＣＣから入手できる。

表１ クエン酸シンターゼの比活性 μｍｏｌ　Ｃｏ　Ａ　Ｓ　Ｈ／ｗｉｎ／ｍｇタンパク質に関するクエン酸シンタ ーゼの比活性 ！！２　ニミニＭｕ）ランスポゾンを有するベクターの形質転換効率 ｐＣＧ１２２９　５ＸＩＱ７１０５１０６ｐＣＧＬ２２９：：Ｍｕｄ＋　２ｘｌ Ｏ’　Ｏｎ、ｄ。

ｐＣＧＬ２２９　：　：Ｍｕｄ−４Ｘ　ＬＱ６０　ｎ、　ｄ。

ｐｃＧＬＩ０７　１０”　３Ｘ１０”　１０’ｐｃＧＬＩＯ７：：Ｍｕｄ＋　５ 刈０２［１４刈０２ｐＣＧＬＩＧ７：：Ｍｕｄ−ｌｆｆ５ｎ、ｄ、　５刈Ｏ２表 １．−次形質転換体におけるグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアッセイ 初期株ＫｍＳＣｍＳ ＣＧＬ２００５　（Ｂ１１５）　２．１８形質転換体ＫｍＲＣｍＳ Ｋｌ　２・Ｏ Ｋ２　≦０．０６ に３　≦０．０６ に４　≦０．０６ に５　≦０．０６ に６　２．＋８ に７　≦０．０６ 形質転換体Ｋｍ”　ＣｍＲ ＫＣ７２，０６ ゼ及びグルタミン酸デヒドロゲナーゼのアッセイ初期株ＫＩＩＩＳＯｍＳ ＣＧＬ２０Ｄ５　（Ｂ１１５）　３．７　２．４８ＫＣ３４，５２，［１５ にＣ２Ｔｌ　７□４　２．７３ 表５＝増幅株におけるＣＡＴ、β−ＧＡＬ及びＧＤＨ活性のアッセイ 初期株ＫＩＩＩＳＣｍＳ ＣＧＩ、２Ｈ５（Ｂ１１５）　３．７　≦０．０７　２．１８−次インテグラン トにのＲｃｍＳ Ｋ２　≦０．０７　≦１１．（１０６ に３　≦０．０７　≦０．００６ −次インチグランドＫＩＲＣＩＩＩＲ ＫＣ３４，５２，７２２，０６ ＫＣ７３，４１，８２ 増幅インチグランド ＫＣ３Ｔ１　２７．９　１９．７　１８．２ＫＣ３７３４ｇ、２　３３．３　４ ９．６ＫＣ３Ｔ４　３２．２　１８．４　２．２４にＣ３Ｔ５　１９．７　１３ ．Ｉｉ　８．５５参考文献 Ａｌｂｅｒｔｉｎｉ　Ａ、Ｍ、ａｎｄ　Ｇａｌｉｚｘｉ人、　（１９８５）。

Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ａ　ｃｈｒｏｍｏ＋ｏｏａｌ　ｒｅｇｉｏ ｎ　ｉｎ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂ＋ｉｆ目（バチルス・ズブチリスにおける染 色体領域の増幅）　；Ｊ、　８ａｃｔｅｒｉｏ１．　、１６２：１２０３−１２ １１Ａｕｓｕｂｅｌ　Ｍ、Ａ、、Ｂ＋ｅｎｔ　Ｒ，、にｉｎｇ＋ｔｏｎ　Ｒ，Ｅ 、、Ｍｏｏｓｅ　Ｄ、Ｄ　。

Ｓｅｉｄｍａｎ　Ｊ、Ｇ、、Ｓｍ１ｔｈ　Ｊ、Ａ、ａｎｄ　５ｔｒｏｂｌ　Ｋ、 　（１９８７）　ｉｎ’Ｃｕｒｒｅｎｔ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇ７’　（分子生物学における現行プロトコール）、Ｇ ＋ａａｎｅ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓ＋ｏｃｉａｔｅｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｅｙ −１ｎｆｅ＋５ｃｉｅｎｃｅ　’Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ｔ（、Ｃ，ａｎｄ　Ｄｏｌ ｙ　１．、　（１９７９）、Ａ　＋ａｐｉｄａｌｋａｌｉｎｅ　ｅｘｔｒａｃｔ ｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　＋ｃ＋ｅｅｎｉｎｇ＋ｅｃｏｍｂｉｎａ ｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮ人　（組換えプラスミドＤＮＡのスクリーニングに 関する急速アルカリ抽出操作）。

Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒ２Ｈ，、７１１５＋３−３−１５２３Ｂｏｎａ　 Ｃ，、Ｇｕｙｏｎｖａ＋ｃｈ　Ａ、、Ｒｅｙｅ＋　Ｏ，、Ｄａｖｉｄ　Ｆ、ａｎ ｄＬｅｂｌｏｎ　Ｇ、　（１９９０）、　Ｉｎｔｅｚｐｅｃｉｚ　ｅｌｅｃｔｔ ｏｔ＋ａｎ＋ｔｏ＋ｍａｔｉｏｎｉｎ　Ｃｏ＋ｙｎｅｂａｃ＋＋＋ｉａ（コリネ バクテリアにおける異種間電気形質転換）、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃ＋ｏｂｉｏｌｏｇ ｙ　Ｌｅｖｅｒｓ、６６：２６３−２７０Ｂｏｎｎａ＋＋ｉ＋　Ｓ、、Ｏ＋ｅｇ ｌｉａ　１．、ＴｒａｕｔｖｅＮｅ＋　Ａ、ａｎｄＳｉｃａｒｄ　Ａ、Ｍ、（１ ９９０）、Ｉ＋ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａ＋ａｃ＋ｅ＋ｉ＋ａｔｉｏｎｏ ｆ　ａ　ｒｅｓｔ「１ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｄｅｆ ｉｃｉｅｎ＋　ｍｕ＋ａｎｔａｔ　Ｂ＋ｅｖｉｂａｃｔｅ＋ｉｏｍ　ｌａｃｔｏ ｌｅｒｍｅｍｔｕｍ（ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの制限及び変 化欠陥変異体の単離及び特徴）、ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇ７　Ｌｅｖ ｅｒｓ、７２：１４３−１４６Ｃａ＋ａｄａｂａｎ　Ｍ、］、、Ｔ＋ａｎｓｐｏ ＋１ｌｉｏｎ　ａｎｄ　ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｌａｃ　ｇｅｎｚ　ｔｏ　 ＋ｅ［ｅｃｔｅｄ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｉｎ　Ｅ、ｃｏｌｉ　ａｓｉｎｇｂａ ｃ＋ｅ＋ｉｏｐｈａｇｅ＋　ｌａｍｂｄａ　ａｎｄ　Ｍｕ、（バクテリオファー ジラムダ及びＭｕを用いた大腸菌内における選択プロモーターへのｌａｃ遺伝子 の転位及び融合）、　Ｉ、　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、。

Ｃａｓ＋１ｌｈｏ　Ｂ　人、、０１ｊｓｏｎ　Ｐ、　ａｎｄ　Ｃａ５ａｂａｄａ ｎ　Ｍ、１．　（１９８４）。

Ｐｌａｓｍｉｄ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉ＋　ａｎｄ　ｌａ ｃ　ｇｅｎｅｆｕｓｉｏｎｗｉｔｂ　ｍｉｎｉＭｕ　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇ ｅ　＋ｒａｎ＋ｐｏ＋ｏｎｓ　（プラスミド挿入変異誘発及びミニＭｕバクテリ オファージトラシスボゾンとのｌａｃ遺伝子融合）、　１．　Ｂａｃｊｅ＋ｉｏ １．、１５ｇ：４８８−Ｄｏｗｅ＋　Ｗ、Ｊ、、Ｍｉｌｉｅ＋　ｊ、Ｆ、ａｎｄ 　Ｒａｇｓｄｘｌａ　Ｃ，Ｌ、ＨｉｇｈＥｆｌｉｃｉｅｎｃ７　＋ｒａｎｓｆｏ ｒｍａｔｉｏｎ　ｏ！　Ｅ、ｅｏｌｉ　ｂｌ　ｈｉｇｈｖｏｌｔａｇｅ　ｅｌｅ ｃｔ＋ｏｐｏ＋ａｊｉｏｎ（高電圧エレクトロポレーションによる大腸菌の高効 率形質転換）、Ｎｏｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｒ、。

＋６（１，９８８）　６１２７−６１４５ｊａｎｎｉｅｒｅ　Ｌ、、Ｎ１ａｕｄ ｅｔ　Ｂ、、Ｐｉｅ＋ｒｅ　Ｅ、、Ｅｈ「１ｉｃｈ　Ｓ、Ｄ（１９８５）、５ｔ ａｂｌｅ　ｇｅｎｅ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｃｈｒｏＩ Ｉｌｏｓｏｍｅｏｌ　Ｂａｃｉｌｌｕ＋　＋ａｂｔｉｌｉｓ　（バチルス・ズブ チリスの染色体における安定な遺伝子増幅）、　Ｇｔｎｅ、　４０：４７−５５ Ｍａｎｉａｔｉ＋　Ｔ、、Ｆｒ１ｔ＋ｃｈ　Ｅｄ、　ａｎｄ　Ｓａｍｂ＋ｏｏｋ 　Ｊ、　（１９８２：。

Ｍｏ１ａｃｕｌａｒ　ｃｌｏ、ｎｉｎｇ：Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕ ａｌ（分子クロー二ングニ実験マニュアル）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂａｒＬａｂｏ＋ａｔｏＢ　Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｔｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　［Ｉａ＋ｂ ｏｒ、ＮＹＭ＋ｅｚ　１．Ｌ、、Ｔｅｍｐｅ＋ｔ　Ｄ、Ｗ、ａｎｄ　Ｂｒｏｗｎ 　Ｃ，Ｍ、、Ｇｌｕｔ＋ｍｉｎｅ（ａｍｉｄｅ）：２−Ｏｘｏｇｌｕｔ２−０ｘ ｏ　Ａｍ１ｎｏ　Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　０ｘｉｄｅ−ｒａｄｕｃ＋ａｓｅ（ ＮＡＤＰ）、ａｎ　ＥｎＢｍｅ　１ｎｖｏｌｖｃｄ　ｉｎ　ｔｂｅＳｙｎｔｈ！ ＋ｉ＋　ｏ【Ｇｌｕｊａｍａ＋ｅ　ｂ７　Ｓｏｍｅ　ＢａｃＮｒｉａ　（一部の 細菌によるグルタミン酸の合成に関与する酵素、グルタミン（アミド）＝２−オ キソグルタミン酸アミノトランスフェラーゼオキシド−リダクターゼ（ＮＡＤＰ ））、Ｉ。

Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌｏｇｙ、６４（１９７０Ｈ８７−１９４Ｍ ｉｔｌｅｒ　Ｊ、　（１９７２）、Ｅ！ｐｅ＋ｉｍｅｎｔ＋　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃ ｕｌａｒＧｅ＋＋ｅｔｉｃ＋（分子遺伝学における実験）　（Ｃｏｌｄ　Ｓｐ＋ １ＢＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ＋ａ＋ｏｒｙ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａ＋ ｂｏｒ、ＮＹ）ｐ３５２−３５５Ｎｉｌｓｓｏｎ　Ｂ、、Ｕｈｌｅｎ　Ｍ、、Ｉ ｏ＋ｅｐｈ＋ｏｎ　Ｓ、、Ｇａｔｅｎｂｅｃｋ　Ｓ。

ａｎｄ　Ｐｈ１ｌｉｐｓｏｎ　Ｌ、　（１９８３）、Ａｎ　ｉｍｐｒｏｖｅｄ　 ｐｏｓｉｔｉｖｅ＋ｅｌｅｃｌｉｏｎ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｖｅｃｔｏｒ　ｃｏｎ ｒｔ＋ｕｃｔｅｄ　ｂ７ａｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏ＋ｉｄｅ　ｍｅｄｉａｔｅｄ　 ｍｕｔａｇｅｎｃ＋ｉｓ　（オリゴヌクレオチド媒介変異誘発で組立てられた改 良陽性選択プラスミドベクター）、　ＮＤＣ，Ａｃ１ｄ　Ｒｅｄ、、　１１．８ ０１９−８０３０Ｓｈａｖ　Ｗ、Ｖ、　（１９７５）、Ｃｈｌｏｒａｍｐｈｅｎ ｉｃｏｌ　ａｃ！＋Ｙ１ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｌｏｒａｍｐ ｈｅｎｉｃｏｌ　ｒｅｓｉｒｆａｎｔｂａｃｔｅｒｉａ　（クロラムフェニコー ル耐性細菌からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）、　Ｍｅ ｔｈ。

ｉｎ　Ｅｎｒ、、４３ニア３７−７５５％７Ｄ−＝：？’１ＦＦ４１／：Ａ’７ ６大媚ｍｎりＤ−ニジ；”？゛シｔ−ｔｃフ、？クカ・７２トンシーメク、２１ しの〃ノｌｋ挾■Ｃ２１Ｔｎ９４１ ２７ｔマグシシ而す性ｊり〃と× ｍｕｄｌｌ　１６８１ ｍｕｄｌｌ　１６８１−Ｃａｔ 員ｕｄｌｌ　ｊ５８Ｌ　Ｃａｆ Ｓ［Ｑ　Ｏ）　ｔ４０：　１ ヌクレオチドＥＦす及びその対応タンパク質のタイプ配列の長さ・１２８８塩基 対 、鎖の数　５’−３’方向で左から右に鎖のみで示された二本鎖配列配置　直鎖 分子のタイプ　ゲノムＤＮＡ 生物源　ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム株ＣＧＬ２００５　（Ｂｉ １２　）１ｏ　直接実験源、プラスミドの回収で単離されたクローン特徴 １−３０左末端 表示路における６５−３５５コード配Ｊす１５　表示路における４８７−１２４ ８コード翫ツリ１２５８−１２８８右末端佐末端に相同的な逆方向配列）特徴の 確認方法 性質、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体の移動性挿入ＥＶＩ Ｉ２０ｃａｃｙｃｘｃｅｃｃｔａｒｔ−ｒｃＧｔｃａｘｃＡｃｃＴＴｃ、入ＡＡ ｃｃＡｃｃＡｔｃ＾ｒｃｃｒＧＧＧｓｗｃＧＴｙｖｃ丁ｃｃ６O ＡｔＣＴＣＣＣＡｅａｃＱ＾ｒｅｅｙｅａｃｅＣｃｔｃｃ＾Ｃ〒Ｃ＾＾ａａｃｔ ｃ↑ＣＴ丁Ｃ＾ｅＣ＾ｅＣｃ八＾＾＾ｒａｃτＴＣＹ５４５５Ｍｔｌ電ｆ龜ａｐ ａｌｍｌｌａＬ＠ｗｇｌｙａｌ轟蟲ｔｑｗａｎｌｙｍａｈａｖ番１ｐｈ＠ｔａｒ ｔｈｒ９Ｌｕ＆−内ｑ１ｙｃｙ＋１ｋｉＣＯＧＧＣＣ入＾（＋ｅｅＣ＾Ｔｅ＾ｅ ｅｅｃテα入＾Ｃ〒Ｃ入＾＾Ｇ＾ＣＣ＾ｃｃｔｃｃ＾ｉ【＾ｙａ＾ｃｅｃｃｃτ ＾入＾丁６０U ｔｙｒ４１ｙａｈａ１ｙ＊ａｔｑＬＬａｔｈｒａｉｍ＠ｌｍｌ＠ＩＩＩＶ−暴島 １λ内▼亀１−自一ｈ１一蟲畠−２τＯ繁薯ｌａ＊ｎｅｃ？ＣｊｌｍｅＡｆＣ＋ ＣｃｅＴＣｕτＴＹＸｋＡｔｌＣｍＴ丁？ＣＣζｒ＾ＣａｃａＭｅＡＡＡｅｃｃ ６６６ｈｌｊｌｙ＠ａｔｑｖ亀五ａｌａａｒｇｗａＬｍｔａｔ＠ｍａｒｌａｗｌ ｙｓｌａｗｐｈｅｌｌｙｔＹｆｔｈｒｌｙｅｌｙ＋ａｔｑｌＯ入＾ａａｔｅＡｃ ｅＭ：ｅＡｅｙｃｒｃｒｅａＩ：Ａ７人＾＾＾ｃ’ｅ＾＾ク＾ＣｋＧＷ丁テ▼Ｃ Ｃ↑ロ＾（Ｃ丁↑Ｃ〒ＣロｃｅｃｃｃV２６ 五ｙｓｖａｉｔｈｒｔｈｒｔｈｔｖａｌｎｅｔａｍ＠ｌｙｅ−ｈｔｌｙａｔｈｅ ｖａ▲ｐｉｌｌｐｔｌｌａｓ−λ脅＠ｖａｎｌｌ７＆ｔＱ入＾ＧＴｉｃＡｌ：ｅ Ｃｅフ入＾７ＡＪｋｅ（Ｍ：＾＾Ａ？ｃＡｃｃテａＴ＾ｅＣｔｔＧクｑαＡぐ＾ Ｔ（＾ＣＯＴ＾ζＣ丁ｃｃｅｃ＾ｆ？V６６ ｌｙｓｐｈ＠ｔｈｔａｌａａａｎｌｙ＋ｐｒｅａｓｓ＠ｈａｗａ▲ｔｙｒｗａｓ ｑｓｙａｇｅＩｎｔｈｅ＋ｙｒｘｅｗｐｅａｌｌ＠！？＋＋ＡｔＧＣｔＺｆｆｅ ＡＡ？＾丁ＣＴ＾ｃｃｒａｃｅ↑＾ＣＯＧτＣ＾丁↑Ｃ＾ＣＴＧＣＴ＾ｔｔｃｅ ｅｃｃ＾ｕＴＴＧ６１０８４６Ｉｓｍｌａａ呻ｑ五Ｖｌ＠ｒ＊ｇＭＭＥｔｙｒｊ ＠ｗｄａｔｊ＋ｒＷａ１１１８ｊｔｐＣ７ａｔｆｔＩ＠ｔｍｔｑｙ９１＊ｖｙａ ｋＣｕｅ１丁１１Ｃ？ＡＴＣｃ＋ｃＡＣＡＴＣＡｅｋＴＧＣｅ？ＭＭ：ｔｅｃＣ ＴＣＣ’ＭＣＡＢＧＡＣｆｌＣＯＧＣ丁ＣＡＴＧｅ（ｆ９Ｑ５ｑ１ｙｐｈ＠ｓａ ｔ１ゑ＠ａｌａａａｐｈｌａｍｔａｔ＠ｔｋｒｍａｔｌｍ＋＋ｖａ１ｑｌｎｍ４ −▲１五ｍｕＬａｕｍｔａｌａ２０＾Ｃｔｙｅｔｅ＾ぐＣ【＾ｉ丁ＣＣＡｅＷ＾ ＣＡｅｅ１６１ＡＡＡ’ａＡｃＣＴＣ（ｈｃｔＺＡＴ＾ｍｅ鳥心ｔｅａ＾ＴｅＣ Ｃ＾ｔｃ＾P０２６ ｔｌｔａ●ｔｈロａｕａｐｈ鳴ＩＬＲａｌｐｔＭｅＹ＠ｌｙｅｍａｐＬａｗ９１ ＹＬλｓａｔ＠９▲内ｍａｒｍｔｌｌｙｒａｔ＾ｔｃウκ＾α置閣ｔ　ｃｃｃ　 ｃ＾ＣＡＡ？ズｃ　ｃｙｃ　ａｃｔ　ａ関Ｔｅｌ：　ＴπＡＡＣズ＾ｃｃｘ　ａ ｔク虞Ｃ〃Ｃυ１０８６１１倫ｑｌｙｔｈｒｔａｒ−五ａａｍｐ＆＃ｌｌａｈｍ ｌ．＠１１ａｌａｌｌｗｎｏｒｐｍＡｌｌｌｂｈａ−五−１＊ｖｌｙｌａｒｑｑ ｌｍｅｙｅｃ了ＣＣＡＣＣ＾ｆｆｌｅｅｋＡＧ＾Ｃ＾丁丁ｃＡｔｃ入＾ｃｃ＾Ｃ τｔａｃｃｃτＧ１ｃｃｃｃロｃｃ＾ｃａｔｅｉｙｅｃｃｃｌｌS６ ２５　ｖａｉ　ｌ＠ＩＩ　啼工内　一呻　−●ｔ　１ｙｅ　ｔｈｅ　ｐハ−　ｓ ｅｔ　ａｍ＾　啼五ｎ　Ｌａｕ　ｐｔ●　ｅｙａ　ａｔ啼　|Ｃ喀　息ｕｐ　ｖ ｍｌ　ｐｈａ　ａｒｒｒＴＧＯＩＧ１ＡＣＣＣｌ．（τ＾ＣＡＡＣ＾丁ｃＧ？Ｇ ｃＧｃｅｃｅｃｉｔｔｅＣｔｏｅｔＣｒＡＡＡｗ＾ｙｃ丁ｃａｃｅｃｃ丁ｃｃａ １２O５ ｔｒｐａｙｓｔｈｒｅｒｇｔｙｒａｍｎｍｔｗａｘａｒｃａｔｑｈａｔａｎｔｔ ｒｙｅｙｅｌｙｍｇｒｌｕｌｌａ＾−ｐｒｅａｌａＧＴＧ１１丁ＧＭｒＡＡ（； ｅｅｌ：ＴＯ？ＣＣ↑ＣＣＴＡテＣｅｔｃＩＪａＴｅ↑ａｃｔｙｃｅ丁ｃａＩ２ ５ｌｗｍｊｐｈ＠ｑλＷｒｙＩｈｔｑｅｙｅｙｅｓｂｓａＬｉｅｌ＋＋ｕ五７１ １＠ｆａｌａＮ働ｔ｛−０ソクＪ−ｊ：５．４７／ａｐｈ１１１．Ｈｌｎｄ１ｌ １．Ｃｌｍｌ．５ａ１１．Ｍｌｖｌ．Ｎｃａｌ．ＢｇｌｌｌポツノＪ−１　＋　 ６．２２ｔａｐｈｍ．ｈＵｎｄ用．ＣＩａｌ．Ｓａｌｌ．ＭＩｕｌ．Ｎｃｏｌ． Ｂｇｌｌｌ要　約　書 コリネバクテリアのインテグロンはそのコリネｌくクテリアにおいて効率的な選 択を保障する遺伝子、上記コリネバクテリアのゲノムの相同配列、上記バクテリ アに適合された上記配列を含むことで特徴付けられる。適用は上記インテグロン が関心のあるタンパク質についてコードする配列を含む場合にそのインテグロン で形質転換されたコリネバクテリアの培養によるタンパク質の産生で特にみられ る。

国際調査報告 ｌｆｉｌａ１Ｍｌ＋ｅ″＋−＾”ｈｃ＃＋”’　”　Ｐｒ／Ｆ’Ｒ９１１０％Ｓ ６国際調査報告 ＦＲ９１００６ｂ６ ＳＡ　５０７９１

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. １．コリネバクテリウムのインテグロンであって、−上記コリネバクテリウムに おいて有効な選択を保障する遺伝子 −上記コリネバクテリウムのゲノムの相同配列を含み、上記配列が上記バクテリ ウムに適合されていることを特徴とするインテグロン。
2. ２．インテグロンに加えて複製領域を含むプラスミドから得られ、そのインテグ ロンがインテグロンに存在しない制限部位に相当する逆方向反復配列と隣接され ている、請求項１に記載のインテグロン。
3. ３．複製領域がコリネバクテリウムではないバクテリウム内で有効な複製源を含 む、請求項２に記載のインテグロン。
4. ４．複製源が大腸菌内で有効である、請求項３に記載のインテグロン。
5. ５．複製領域がコリネバクテリアで有効な複製源を含む、請求項２〜４のいずれ か一項に記載のインテグロン。
6. ６．転位要素の配列を更に含む、請求項１に記載のインテグロン。
7. ７．転位要素がコリネバクテリウムから得られる配列を含む、請求項１〜６のい ずれか一項に記載のインテグロン。
8. ８．配列がブレビバクテリウムから得られる、請求項７に記載のインテグロン。
9. ９．配列が図９で記載されるようなＩＳａＢ１から得られる、請求項８に記載の インテグロン。
10. １０．コリネバクテリウムでコードされるタンパク質を除いて転位を保障する転 位要素の配列を更に含む、請求項６〜９のいずれか一項に記載のインテグロン。
11. １１．転位要素の配列がトランスポゼースについてコードする配列を欠いている 、請求項６〜１０のいずれか一項に記載のインテグロン。
12. １２．有用な配列を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインテグロン 。
13. １３．有用な配列が有用なペプチド又はタンパク質についてコードしている、請 求項１２に記載のインテグロン。
14. １４．有用なタンパク質が格同タンパク質である、請求項１３に記載のインテグ ロン。
15. １５．有用なタンパク質が非相同タンパク質である、請求項１４に記載のインテ グロン。
16. １６．有用なタンパク質が酵素である、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載 のインテグロン。
17. １７．有用なタンパク質についてコードする配列が下記遺伝子： −ｇｌｔＡ −ｇｄｈＡ から選択される、請求項１６に記載のインテグロン。
18. １８．インテグロンに存在しない制限部位が：−ＮｏｔＩ −ＢｓｔＸＩ から選択される、請求項２〜１７のいずれか一項に記載のインテグロン。
19. １９．配列がコリネバクテリウムの株に適合された、請求項１〜１５のいずれか 一項に記載のインテグロン。
20. ２０．配列がコリネバクテリウムで適合される前にブレビバクテリウムの株に移 入された、請求項１９に記載のインテグロン。
21. ２１．配列が増幅された、請求項２０に記載のインテグロン。
22. ２２．増幅が安定な増幅配列を産生した、請求項２１に記載の増幅インテグロン 。
23. ２３．ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体内に組込みできるコ リネバクテリウム・メラッセコラの相同配列を含む、請求項１に記載のインテグ ロン。
24. ２４．請求項１〜２３のいずれか一項に記載されたインテグロンでコリネバクテ リウムの株を形質転換するための方法であって、 インテグロンがエレクトロポレーションで上記株に導入されることを特徴とする 方法。
25. ２５．請求項２４に記載された方法で得ることができるコリネバクテリウム。
26. ２６．下記の株： −Ｂ．ラクトファーメンタム −Ｂ．フラバム −Ｃ．グルタミカム −Ｃ．メラッセコラ である、請求項２５に記載のコリネバクテリウム。