JPH05503706A - 極洋の魚類から単離および精製された熱ヒステリシスタンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 生体材料の生存を改善する組成物 発明の背景 発明の分野 本発明は、生体組織中の水の凍結プロセスを変えるのに有用な物質、例えば存機 分子の水性組成物に関するものである。特に、本発明は、不凍化タンパク質また は糖タンパク質、例えば北氷洋および南氷洋の魚の体液または血清から得られた ものを使用することに関するものである。好ましい不凍化化合物は天然の動物源 から得られたものに関係する。一層好ましいのは、多重の一アラニン−アラニン −トレオニン−または−アラニンーアラニンーアラニンーセグメントを有するポ リペプチドである。いくつかの例では、穂側基がトレオニン部分に共宵結合し不 凍化タンパク質溶液は、動物または植物の組織、動物の臓器または生きている動 物全体に潅流さぜる。次いで、組織、臓器、または植物あるいは動物を一〇、５ °Ｃより低い温度まで注意して冷凍し、この低い温度に保持する。氷は主として 氷の結晶のＣ軸に沿って形成し、氷の形成は氷の結晶のａ軸（面）の方向で抑制 される。針状の氷の成長によって塩濃度か区画され、その結果隣接細胞は破壊し ない、すなわち完全には脱水されない。組織、臓器または動物を注意して解凍す ると、組織、臓器または動物は機能しており、生存能力を存する。保存臓器はヒ トにおける移植療法に特に有用である。

また、本発明は、非生理熱的条件および非生理化学的条件に曝されたことによる 損傷から少くとも細胞膜を保護し、漏洩から細胞内容物を保護することにより、 正常な生理温度および生理雰囲気とは異なる温度および化学的雰囲気に曝された 生体材料、例えば微生物、動物および植物の細胞、組織、臓器および植物全体ま たは動物全体における生存、機能性および／または構造保全性（ｓｔｒｕｃｔｕ ｒａｌ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）を改善するのに有用な物質、例えば有機分子から 成る組成物に関するものである。

関連技術の説明 生存能力を存する動物組織、動物臓器および生きている動物を保存することは、 最近の実験室および医学における集中的研究の主題である。現在、心臓、腎臓、 肺臓、肝臓などのヒトの臓器の移植か可能であるのは、外科技術が改善され、拒 絶反応防止薬が改善され、提供された臓器を直ちに使用できるからである。現在 では、提供者の臓器を提供者から取り呂し、冷却し、濡れた氷の上で凍結しない ように貯蔵し、最高数時間以内に受容者の体内に外科的に入れている。

現在、動物組織、動物臓器および無傷で生存能力のある動物を低温で冷凍するこ とにより保存するのは、数時間に限定されており、それは臓器内に氷が通常のよ うに形成するため、局部的に濃縮された塩溶液が生成するからである。近くの細 胞から水が移動して、細胞は可逆的に脱水される。これらの結果は臓器構造を崩 壊させ、臓器は解凍しても元に戻らないことが、大きな問題である。

免疫抑制剤の開発における進歩、臓器移植技術における改善および凍結を利用す る臓器の長期保存の成功は、凍結による生体臓器の長期保存方法に関する集中的 研究努力に動機を与えた。

最近、Ｂ、　Ｒｕｂｉｎｓｋｙ　、米国特許第４．５３１．３７３号は、生体組 織における凍結プロセスの研究を容易にするために、方向凝固ステージおよび低 温走査電子顕微鏡法を使用する実験技術を開示している。

また、Ｂ、　ＲｕｂｉｎｓｋＹ等、　（（１９８８）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ 　ｏｆ　ｔｈｅ　ＲｏｙａｌＳｏｃｉｅｔｙ　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｂ、、　Ｖｏｌ 　２３４．　ｐｐ、　３４３−３５８　）は、生体組織および生体臓器における 凍結プロセスおよび損傷機構に関する実験結果および数学的モデルを記述してい る。

入手できる後記の文献はいづれも凍結された組織、臓器または動物全体を長時間 保存するための組成物または方法を開示していない。

初期の実験結果は、単一で連続する氷の結晶は凍結組織の血管に沿って形成する のか普通であることを示している。

Ｂ、　Ｒｕｂｉｎｓｋｙ等、　（１９８８）　Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、　Ｖ ｏｌ、　８．　ｐ、　３７０　：Ｂ、　Ｒｕｂｉｎｓｋｙ等、　（１９８８）　 Ｒｒｏｃ、　Ｒｏｙａｌ　Ｓａｃ、　Ｌｏｎｄ、、　Ｂ２３４．３４３参照。凍 結組織の構造は冷凍中の冷却速度（すなわち、単位時間当りの温度変化）によっ て左右される。肝臓のような組織を低い冷却速度（約１°Ｃ／分〜約１０’Ｃ／ 分）で冷凍した場合には、比較的細い血管（飼様血管）は、未凍結の常態の肝臓 組織の血管より膨張する。さらに、膨張した洞様血管に隣接する細胞（肝細胞） は、細胞内に氷を形成することなく脱水される。しかし、冷却速度か比較的高い 場合には、細胞（肝細胞）に細胞内水が形成し、その結果洞様血管の膨張が小さ くなる。

血管に沿って連続する氷の結晶の形成が観察されたこと、凍結血管の膨張および 比較的高い冷却速度での冷凍中における細胞内水の形成についての一つの説明は 、脈管系内に形成した氷か細胞膜または血管壁を通って拡がらないことである。

その代りに、氷は血管内で形成し、血管に沿って拡がり、血管には氷の結晶の成 長プロセスに対する障壁が存在しない。先ず、凍結血管を取り巻き、小容積に区 画されている細胞内の水は過冷却状態のままである。脈管内に氷が形成するにつ れて、脈管腔内の溶液から水か除去されて、残りの溶液か高張溶液になる（塩濃 度か比較的高くなる）。この比較的高い溶質濃度は、水を周囲の細胞から半透過 性細胞膜を経て血管中に不可逆的に移動させて、化学的ポテンシャルの差を平衡 させる。この結果、血管を取り巻く細胞は脱水され、細胞から畠だ水は次に脈管 系内で凍結する。細胞から細胞膜を経て血管内に入る水の移送は律速プロセスで あって、細胞膜の透過性によって左右される。従って、比較的高い（すなわち、 比較的速い）冷却速度を使用して比較的大きい臓器を冷凍する場合には、細胞の 完全脱水以前に分子内水か形成するのに十分な水か細胞内に残る。この説明を支 持する冷凍プロセスおよび数学的モデルの一層詳細な説明はＲｕｂｉｎｓｋｙ等 （１９８８）の上述の文献中に見い比される。また、この結果、凍結組織に対す る可能性のある損傷モデルの一つは血管の膨張が観察されることであって、これ か臓器の構造的（機械的）保全性の崩壊の原因となるという結論になる。この損 傷モデルか粁濁状態て凍結された細胞に影響を及ぼさないのは明らかであり、懸 濁状態の細胞か生存する条件と同し条件下に凍結しても臓器か生存しない理由を 、この損傷モデルによって説明することかできる。

氷の成長の極めて好ましい方向か六角柱の氷の結晶のａ軸（角柱面）である通常 の氷形成パターンか、組織にεける冷凍プロセスを支配する。三次元の氷の結晶 のａ軸の任意の六角形柱小面は同様に著しく好適であり、従って組織の冷凍中に 、氷の結晶か血管に沿って連続的に引続いて形成し、成長する。なお、上述のよ うに、通常の凍結による氷の大きい結晶には、溶質か混入されない。このように 溶質か排除される結果、溶質濃度の増大、物質移動プロセスおよび局部細胞およ び局部組織から開放脈管中への水の不可逆移動か生しる。この移動によって組織 および臓器の細胞の構造的保全性が崩壊する。

追加の背景情報は次の文献中に見い出すことかできる。

Ｂ、　ＲｕｂｉｎｓｋＹ等、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、 　Ｃｏｍｍｕｎ、、　Ｖｏｌ。

１７３、　＃　３．　Ｄｅｃ、　１９９０．　ｐ、　１３６９−１３７４゜Ｎ、 Ｖ、　Ｊａｍｉｅｓｏｎ等、　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　２５．３ ００−３１０　（１９８８）。

Ｒ，Ｌ、　Ｖｅｅｃｈ、米国特許第４．６６３．２８９号。

Ｃ，Ａ、　Ｋｎｉｇｈｔ等、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２４ ５．　Ａｕｇ、　４．　１９８９、ｐｐ、　５０５−５０７゜ Ｊ、Ａ、　Ｒａｙｍｏｎｄ等、　（１９８９）　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ 　ｔｈｅ　ＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｕ、Ｓ 、Ａ、、　Ｖｏｌ、　８６．　ｐｐ、　８８１−８８５゜Ｄ、Ａ、Ｐｏｗｅｒｓ 、（１９８９）　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２４６．　０ｃｔｏｂｅｒ　２０． 　１９８９゜ｐｐ、　３５２−３５８゜ Ａ、Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ、　（１９８４）　Ｐｈ１１．　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ， Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｖｏｌ。

Ｂ　３０４．　ｐｐ、　５７５−５８８゜Ｃ，−Ｈ，Ｃ，Ｃｈｅｎｇ等、　（１ ９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａｌＡｃｔａ、 Ｖｏｌ、９９７．　ｐｐ、５５−６４゜Ｗ、　Ｗｉｐｐｉｃｈ、Ｆイツ連邦共和 国特許第１３９．２００号、　Ｄｅｃ、１９゜１９７９゜ Ｊ、Ｄ、　Ｓｃｈｒａｇ等、　（１９８７）　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｅｔ　 Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ａｃｔａ。

Ｖｏｌ、９１５．　ｐｐ、３５７−３７０゜Ｃ，Ａ、　Ｋｎｉｇｈｔ等、　（１ ９８４，）　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３０８．　ｎｏ−５９５６，ｐ＋）。

２９５−２９６　。

Ｊ、Ａ、　Ｒａｙｍｏｎｄ等、（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ 、　Ｓｃｉ、　ＩＪ、Ｓ、Ａ、。

Ｖｏｌ、７４．　ｎｏ、６．　ｐｐ、２５８９−２５９３゜Ｊ、、Ａ、　Ａｈｌ ｇｒｅｎ等、　（１９８８）　Ｊ、　ＥＸＰ、　Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、　１３７ ．　ｐｐ。

５４９−５６３　。

Ｐ、Ｍａｚｕｒ、（１９６３）　Ｊ、Ｇｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、Ｖｏｌ　４７ ．　ｐ、３４７゜Ｐ、　Ｍａｚｕｒ、（１９７０）　５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、 １６８．　ｐ、９３９゜、Ａ、Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ等、　（１９７０）　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｎ、、　Ｖｏｉ、　２４５．　ｐｐ２９０１−２９０８ 　。

Ｊ、Ａ、　Ｒａｙｍｏｎｄ等、　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡ　Ｖｏｌ。

７４、ｐｐ、２５８９２５９３゜ Ａ、Ｌ、Ｄｅｃｒｉｅｓ、Ｃ１９８４）　Ｔｒａｎｓ、Ｒｏｙａｌ　Ｓｏｃ、Ｌ ｏｎｄ、、Ｖｏｗ。

Ｂ５０４．　ｐｐ、５７５−５８８゜ Ａ、Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ、　（１９８８）　Ｃａｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　 Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｖｏｌ、　９０Ｂ（３）、ｐｐ、６１１−６２１゜ Ｊ、Ａ、　Ｒａｙｍｏｎｄ等、　（１９８９）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　８６（３）、Ｉ）ｌ）、８８１−８８５゜ Ｈ，Ｎｉｅｍａｎｎ、（１９８５）　Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、 　２３．　ｐｐ、２１３゜Ｍ、Ｌ、　Ｆａｈｎｉｎｇ等、（１９８９）　Ｃｒｙ ｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　２６．　ｐｐ、　５６３゜Ｓ、　１ａｙａｓｈ ｉ等、（１９８９）　Ｔｈｅ　Ｖｅｔ、　Ｒｅｃ、、　ｐｐ、　４３−４４゜Ｃ ，Ｃ，Ｃｈｅｎｇ等、（１９８９）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ、　Ａｃ ｔａ、、　Ｖｏｌ、９９７゜ｐｐ、５５−６４　。

Ｇ、Ｍ、　Ｆａｈｙ等、　（１９８４）　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、 　２１．　ｐｐ、　４０７−４２６゜Ｗ、Ｆ、　Ｒａ１１等、　（１９８５）　 Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３１３．　ｐｐ、　５７３−５７５゜Ａ、Ｔｒｏｕ ｎｓｏｎ、（１９８６）　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　５ｔｅｒｉｌｌｔｙ、 Ｖｏｌ、４６゜ｐｐ、１−１２゜ ＷＪ、Ｒａ１１．　（１９８７）　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、２４．　 ｐｐ、３８７−４０２゜Ｊ、Ｍ、　Ｓｈａｗ等、　（１９８９）　Ｃｒｙｏｂｉ ｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　２６．　ｐｐ、　４１３−４２１゜ＧＪｌ、Ｆａｈｙ 、（１９９０）　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ、Ｖｏｌ−２６２， ｐｐ、２０゜Ａ、　Ａｒａｖ等、　（１９９０）　Ｐｒｏｃ、　２８ｔｈ　Ａｎ ｎｕａｌ　Ｍｅｅｔｉｎｇ　Ｓｏｃ、　ｆｏｒＣｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｂｓ ｔｒａｃｔｓ　４２．　４３゜Ｄ、Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、（１９６９）　Ｃｏｎｔ ｅｍｐ、Ｐｈｙｓ、Ｖｏｌ、１０．　ｐｐ、４７３−４８８゜Ｂ、　Ｒｕｂｉｎ ｓｋｙ、米国特許第４．５３１．３７３号、　Ｊｕｌｙ　１９８５゜Ｂ、　Ｒｕ ｂｉｎｓｋｙ等、　（１９８５）　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　２２ ．　ｐｐ、　５５−６２゜ｋｌ、　＆Ｉａｔｔｉｏｌｉ等、　（１９８８）　Ｇ ａｍｅｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｖｏｌ、　２１．　ｐｐ。

２２３−２３２゜ Ａ、　Ａｒａ、ｖ等、　（１９８８）　Ｃｒｙｏｔ＋ｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、 　２５．　ｐｐ、　５６７゜Ｐ、　Ｑｕｉｎ等、　（１９８２）　Ｊ、　Ｒｅｐ ｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、、　Ｖｏｌ、　６６、　ｐｐ、　１６１−１６８゜ Ｄ、　Ｐｏｐｅ、（１９７７）　Ｊ、　Ａｎｉｍ、　Ｓｃｉ、、ｖｏｌ、　４４ ．　ｐｐ、１０３６−１０４０　。

この明細書で引用しだす・（ての文献、特許、論文、標準などは参考として記載 したものである。

植物または動物の細胞組織中の生体液の保存プロセスを変える組成物および方法 を持っていることは極めて存利である。凍結した組織、臓器、植物または動物を 注意して解凍すると、生存能力を有する細胞、組織、臓器、植物または動物か得 られる。

本発明はこのような保存用組成物および保存方法を提供するも本発明は、タンパ ク質、脂質および少くとも細胞膜との相互作用によって、常態の生理温度より高 いか低い非生理温度または非生理化学的雰囲気を適用されたタンパク質、酵素、 脂質、細胞膜、動物または植物の細胞、微生物、組織、臓器、動物全体または植 物全体を包含する生体材料の生存、機能性、安定性および構造保全性にとって有 用な生体適合性物質、例えば不凍化ペプチドの組成物に関するものである。

また、他の面において、本発明は： （ａ　）タンパク質、酵素、脂質または少くとも植物または動物の細胞膜の直ぐ 近くの氷の結晶構造を変えることにより、（ｂ）氷の結晶の数を減らし、大きさ を小さくすることにより、あるいはタンパつ７質、酵素１、脂質まフ：、ｉよ少 くとも細胞膜の直ぐ近くの氷の結晶を完全に無くすことにより、（Ｃ）氷の結晶 （−二よ−〕て溶質か排除されるモートを変えて、タンパク質、酵素、脂質また は少くとも細胞膜を取り巻く溶液の化学的組成を変えることに、より 氷の結晶の存在下に０゛Ｃより低い温度を適用されたタンパク質、酵素、脂質、 細胞膜、細胞（動物または植物）、微生物、組織、臓器、動物または植物を包含 する生体材料の生存、機能性、安定性および構造保全性を改善するのにを用な不 凍化タンパク質の組成物に関するものである。

また、本発明は、膜におけるイオン通路を閉塞してイオンのる漏洩を遅らせるか 阻止しく一般的に）かつ細胞膜を安定化する（一般的に）か、あるいはタンパク 質、脂質または少くとも細胞膜に他のマクロ分子を結合させるのに有用な組成物 に関するものである。

先にその有用性を説明した組成物は、少くとも１種の生体適合性不凍化物質、お よび生体適合性水溶液を含有する。

一つの面において、生体適合性不凍化物質は、魚、両生類、虫（ｗｏｒｍ）　、 昆虫または爬虫類から選択された動物、好ましくは北氷洋、南氷洋、北温帯また は南温帯からの魚から得られるマクロ分子であるか、あるいは上述の動物から誘 導されるマクロ分子と実質的に同しである。一層好ましいのは、南氷洋の魚、例 えばディー、マウノニ（Ｄ、　Ｍａｗｓｏｎｉ）種およびビー　ホルクグレビン キ（Ｐ、　ｂｏｒｃｈｇｒｅｖｉｎｋｉ）種を包含するノトテニア科（Ｎｏｔｏ ｔ、ｈｅｎｉｉｄａｅ）の南氷洋の魚、または南氷洋のゲンゲ科の魚であるリゴ フィラ・デアルポル＝　（Ｒｈｉｇｏｐｈｉｌａ　ｄｅａｒｂｏｒｎｉ）、また は南氷洋のカレイ類の魚からの体液（例えば、血液）からのタンパク質である。

これらの不凍化タンパク質はすべて既知であり、氷の結晶構造を変える共通の性 質を有する。

−例では、ポリペプチド、糖ペプチド、生体許容性担体に共有結合させたポリペ プチド、担体に共有結合させた糖ポリペプチドまたはこれらの混合物から生体許 容性物質を選択する。

他の面にδいて、生体適合性物質は、氷の結晶のａ軸に沿った氷の結晶の成長を 促進し、氷の結晶のａ軸に沿った氷の結晶の成長を抑制する。他の例では、生体 適合性マクロ分子の少くとも１種は、文旦ζこ配列する疎水性区域および親水性 区域を育し、これらの区域はそれぞれ１６〜１７オングストロームまたは１９〜 ２０オングストロームの間、好ましくはそれぞれ約１６，５オングストロームま たは約１９．５オングストロームの間繰り返えされる。

−例では、水性組成物は、さらに、グリセリン、ジメチルスルホキシド、エチレ ングリコール、ポリビニルピロリドン、グルコース、スクロース、プロパンジオ ール、プロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、またはこれらの化 合物の混合物から選択され、細胞および生体材料を凍傷から保護するかあるいは ガラス化を促進させることが知られている追加の保存作用、保護作用またガラス 化作用を存する化合物を含有する。

膜を保護または安定化できるこれらの化合物の性質は、食品の保存：皮膚組織を 回復、保護または修復するための化粧品。

または細胞膜の不安定性と関連する疾病の治療法においても有用である。

イオン通路を閉塞できる性質は、細胞内または細胞外のイオン輸送の不均衡と関 連する疾病を治療するのに利用される。

細胞膜に結合し、植物膜と相互作用できる性質は、種々のマクロ分子を不凍化タ ンパク質に結合させて、細胞膜に対するマクロ分子の結合を容易にするのに利用 される。

他の面において、本発明は、非生理温度または非生理化学的組成物におけるタン パク質、酵母、脂質、細胞膜、細胞（動物または植物）、微生物、組織、臓器、 動物全体または植物全体を包含する生物材料の保存状懸、生存、機能性、安定性 および構造保全性を向上させる方法に関するもので、この方法では。

（ａ）保存しようとする部分を、タンパク質、脂質、細胞膜、細胞（動物または 植物）、微生物、組織、臓器、動物全体または植物全体のす・Ｎてと相互作用す るのに十分な濃度の生体適合性物質と接触させ。

（ｂ）非生理条件に曝し。

（Ｃ）随意に、先ずマクロ分子を除去し、。

（ｄ）　油泥タンパク質、脂質、細胞膜、細胞（動物または植物）、微生物、組 織、臓器、動物または植物を生理温度および生理組成物に戻し、随意にこれと同 時にマクロ分子を除去し：あるいは随意に （ｅ）次いて、前記生体材料を生理温度および生理組成物に戻した後に、マクロ 分子を除去する。

−例では、この温度は低温、すなわち０°Ｃに近いか０°Ｃより低い低温であっ て、タンパク質、脂質、細胞膜、細胞（動物または植物）、微生物、組織、臓器 、動物または植物を保存するのに使用される。例えば、ブタ卵母細胞は約４°Ｃ において２４時間以上このようにして保存される。ラフ１〜肝臓は４　’Ｃにお いて２４時間以上この方法により保存される。

他の面に３いて、本発明は、０”Ｃより低く約４Ｋまでの温度において、タンパ ク質、酵母、脂質、細胞膜、細胞（動物または植物）、微生物、組織、臓器、動 物または植物を保存する方法に関するもので、この方法では （ａ＞保存しようとする部分を、生体適合性物質（例えば、水溶液のみの存在に おけるＡＦＰまたはＡ　Ｆ　Ｇ　Ｐ　）と、あるいは生体適合性物質にグリセリ ン、プロピレングリコールなとのような他の凍結防止化合物を添加したものと接 触させ。

（ｂ）好ましく（二極低温まで（液体窒素のような手段により）冷却ｌ１５２、 比較的高い濃度のブクビレングリコールまたはグリセリンのような追加の化合物 と、ガラス化および一層低い凍結温度をもたらす比較的高い冷却速度とを使用し て、種々の濃度および冷却速度に従って系をガラス化または凍結させ（例えば、 ４０％ｖ　／　ｖのプロピレングリコール／水を使用し、１．７５０°Ｃ／分の 冷却速度を使用してガラス化を達成する）：（Ｃ）前記タンパク質、脂質、細胞 膜、細胞（動物または植物）、微生物、組織、臓器、動物または植物を、上述の 温度に２４時間、７日、５２週間または１０年以上までの間維持し、（ｄ）暖か い流体またはマイクロ波加熱のような手段によって生理条件まで加温し： （ｅ）前記生体適合性物質、例えば不凍化糖タンパク質および他の化合物を除去 しく例えば、潅流またはフラノソング（ｆ　ｌａｓｈｉｎｇ）により、前記生体 適合性物質および前記池の化合物を生理適合性溶液と置き換えて生存能力のある 生体部分を再生させる。

例えば、１２．５％Ｖ　／　Ｖのプロピレングリコール／水を使用して１．２０ ０°Ｃ／分の冷却速度において氷の結晶を形成させた。すへての場合に、−１３ ０″Ｃに数時間曝した後に生存能力のあるマウス胚およびブタ卵母細胞を得た。

この実験計画では、ブタ卵母細胞、ブタ胚およびマウス胚は、ノトテニア科の南 氷洋の魚からの不凍化糖タンパク質２０ｍｇ／）の水性組成物中で生存していた 。

図面の簡単な説明 図ＩＡ、、ＩＢおよび１．　Ｃは、方向凝固ステージ（米国特許第４、５３１． ３７３号参照）において４°Ｃ／分の冷却速度で水溶液を凍結した場合の氷の結 晶（ｉ）の透過光顕微鏡写真である。

図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃは、４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰ　（下記の定義を参照の こと）を潅流させ、約４．０００°Ｃ／分の冷却速度で冷凍した肝臓組織の走査 電子顕微鏡写真である。

図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ，３Ｄおよび３Ｅは凍結した肝臓組織の走査電子顕微鏡写真 である。

図４（図４Ａ〜図４Ｄ）は未成熟ブタの卵母細胞を凍結保存したものを示す写真 である。

図５（図５Ａ−図５Ｂ）は二細胞段階のブタ胚を凍結保存したものを示す写真で ある。

図６（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）は二細胞段階のマウス胚を凍結保存したものを 示す写真である。

図７（図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ）はブタ卵母細胞を低温保存したものを示す写真 である。

図８はラットの肝臓組織（図７Ａ）を約４００倍の倍率で示す写真である。この 組織はＡＦＧＰ処理せずに２１．５°Ｃ／分において一３５°Ｃに冷却した。

図９はラットの肝臓組織の約４００倍の倍率における写真である。この肝臓組織 には２０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰフラクション１〜８（表１）を含有するクレブス （Ｋｒｅｂｓ）溶液を３７°Ｃで潅流させ、その後に２１．５°Ｃ／分において 一３５°Ｃまて冷却した。

図１０はクレブス溶液およびＡＦＧＰを含有するクレブス溶液で処理したラット の全肝臓からの胆汁生成量を時間の関数として示すグラフである（例７Ａ参照） 。

図１１はクレブス溶液およびＡＦＧＰを含有するクレブス溶液て処理したラット の全肝臓からのＬＤＨレベルを時間の関数として示すグラフである（例７Ａ参照 ）。

図１２はＡＦＧＰの不存在下および種々の濃度のＡＦＧＰの存在下に４°Ｃにお いて４時間低温に曝した後の正常膜電位を育する卵母細胞の百分率を示すグラフ である。

図１３はＡ、　Ｆ　Ｇ　Ｐの不存在下および種々の濃度のＡＦＧＰの存在下に４ °Ｃにおいて２４時間低温に曝した後の正常膜電位を存する卵母細胞の百分率を 示すグラフである。

使用した用語は次のように定義する。

「異常な非生理化学的条件」とは、正常な生理条件とは異なる条件のことて、高 温または低温、凍結状態、過大または限定された二酸化炭素、過大または限定さ れた酸素、過大または限定された無機塩、過大または限定された有機化合物、異 なるｐＨ値、放射状態またはこれらの組合せを包含するが、これらに限定される ものではない。

「不凍化タンパク質」または「不凍化ポリペプチド」（「ＡＦＰＪ）または「不 凍化機タンパク質」または「不凍化糖ペプチドＪ　（ｒＡＦＧＰ」）とは、直接 的相互作用によって水の相転移温度を非束−的に低下させ、前記相転移温度より 低い温度で形成する氷の結晶核の成長抑制を非束−的に低下させる一般に知られ ている性質を育する若干の動物（例えは、冷血動物）の体液中に存在するマクロ 分子のことである。

また、不凍化化合物は「熱ヒステリシスタンパク質」として知られ、その理由は 、相転移温度は、冷凍中には分子の束−作用より著しく大きい程度まで明らかに 低下するか、融解中には分子の束−作用によって生じる範囲以外には低下しない からである。本発明以前においては、これがこれらの不凍化化合物の唯一の既知 の性質であった。（不凍化ペプチド源（または不凍化タンパク質源）は後述の通 りである）。

「極低温」とは、０°Ｃより低く４に以下程度の低い温度までの低温生物学の範 囲の温度のことである。

「高温」とは、細胞、組織、臓器、植物または動物の正常な生理温度より高い温 度のことである。

「低温」とは、細胞、組織、臓器、植物または動物の正常な生理温度より低い温 度のことである。

「随意の」または「随意に」とは、本発明の範囲内において、成分か存在してい ても存在していなくてもよい状況、あるいは工程を実施しても実施しなくてもよ い状況のことである。

「角柱面」とは、氷の結晶上で成長する氷の形成を説明するために慣用的に使用 されている別の用語である。ａ軸に垂直な二次角柱面およびこれらの面から突出 する角錐面か存在する。

結晶学の用語では、これらの面を下記の角錐のミラー・ブラヘイスＱｔｉ　１ｌ ｅｒ−Ｂｒａｖａｉｓ）インデックスで表わすニー次角柱面からの角錐面　（２ ０２１）正常な雰囲気下では、氷の結晶成長はａ軸に沿って進行する。

本発明に係るＡＦＰまたはＡＦＧＰを使用して氷の結晶成長を変えてＣ軸方向を 選ぶようにする。

さらに詳しい情報については、Ｐｅｔｅｒ　Ｌ　Ｈｏｂｂｓ、（１９７４）　ｒ ｃｅＰｈｙｓｉｃｓ、　Ｃ１ａｒｅｎｄｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　０ｘｆｏｒｄ、　 Ｅｎｇｌａｎｄ、　Ａｐｐｅｎｄｉ：ｘ　Ａ等。

ｐ７２５以降を参照されたい。

「急冷」とは、極低温における細胞および生体臓器の長期保存のために開発され た技術のことである。急冷は極めて小さし）無傷の氷の結晶を生成させるために 使用される。Ａ　Ｔｒｏｕｎｓｏｎ。

（１９８６）　Ｆｅｒｔｉｌｉｔｙ　ａｎｃｉ　５ｔｅｒｉｌｉｔｙ、　Ｖｏｌ −４６，１−１２を参照されたい。

「ガラス化」とは、極低温における細胞および生体臓器の長期保存のために開発 された技術のことである。この技術で（よ、束−的に水の相転移温度を低下させ かつ水の温度を上昇させるグリセリン、ジメチルスルホキシド、プロピレングリ コールなとのような種々の凍結防止化合物を生体材料中に導入する。次いで、全 細胞懸濁液または臓器を、凍結防止化合物の存在下（こ、生体材料中の水かガラ ス形態において多形状態に留まり、力１つ無傷の氷の結晶か生成することを期待 して、急冷する。（Ｆａｈｙ。

Ｇ、Ｍ、等、　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、　Ｖｏｌ、　２１．４０７−４２６． 　（１９８４）　；　Ｗ、Ｆ、。

Ｒａ１ｌ　ａｎｄ　Ｒａｈｙ、　Ｇ、Ｍ、、Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３１３ ．５７３−５７５．　（１９８５）参照） 不凍化タンパク質源 不凍化タンパク質（ＡＰ、これはＡＦＰおよびＡＦＧＰを包含する）は最初海洋 の硬骨前の低滲透圧体液中に見い出され、この魚は−０，７°Ｃの血清凍結点を 存し、種水の存在する水に棲息している（Ｓｃｈｏｌａｎｄｅｒ等、　Ｊ、　Ｃ ｅ１ｌ　Ｃａｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ−、Ｖｏｌ。

４９、５−２４．１９５７）　。最初のＡＰはＤｅＶｒｉｅｓ　（Ｄｏｃｔｏｒ ａｌ　Ｔｈｅｓｉｓ。

５ｔａｎｆｏｒｄ、　１９６８）によって南氷洋のノトテニア科の魚に見い出さ れた。２種の不凍化タンパク質、すなわち糖タンパク質およびペプチドが極間ま たは温帯の魚から単離された。これらの２種を除く魚の研究では、不凍化化合物 は糖ペプチドである。

これらの不凍化糖ペプチド（糖タンパク質）は２．５００〜３４、０００の範囲 にわたる８種の異なる分子量クラス中に存在する。

不凍化糖ペプチド（糖タンパク質）は、一般的に、トリペプチドであるアラニル ーアラニルーレトオニルの繰返しからなるペプチド主鎖（小さい糖ペプチドでは ７位で始まるビロリンで若干のアラニンを置き換えることかできる）と、グリコ シド結合を介して各トレオニンの水酸基側鎖に結合している三糖類てあるβ−〇 −ガラクトピラノシル＝（１→３）−２−アセトアミ、ドー２−デオキシーα− Ｄ−ガラクトピラノースとからなる（Ａ、　ＤｅＶｒｉｅｓ、　５ｃｉｅｎｃｅ 、　Ｖｏｌ、　１７２．１１５２−１１５５．１９７１）。

これらのポリペプチドまたは糖ポリペプチドは多数の天然資源、例えば、爬虫類 （例えば、刀メ）、無を椎動物、昆虫、両生動物または魚の体液から入手できる 。北氷洋、南氷洋、北温帯または南温帯の魚の血清または体液からＡＦＰを得る のか好ましい。北氷洋または南氷洋の魚の血清および体液を使用するのか一層好 ましい。例えば、次の表１を参照されたい。

Ａ、南氷洋のノトテニア科の魚　バゴテニア（Ｐａｇｏｔｈｅｎｉａ）　（トレ マトムス（Ｔｒｅｍａｔｏｍｕｓ）　）・ボルクグレビンキから単離した不凍化 糖ペプチド 不凍化糖ペプチド　分子量（約） ２　２８、８００ ３　２１、５００ ４　１７、０００ ５　１０．５００ １３　７、９００ 次の構造式 ％式％ を有するデイスソスティクス・マウソニ（Ｄｉｓｓｏｓｔｉｃｈｕｓ　ｍａｗｓ ｏｎｉ）からの糖ペプチド。

これらのフラクションの分子量は前記表１に示す分子量と本質的に同一である。

南氷洋のノトテニア科の魚の血液から単離したＡＦＧＰは、糖トリペプチド基本 単位の繰返し数によって少くとも８種の大きさで存在する（表１参照）。分子量 は２．６００〜３３．７００の範囲である（ＤｅＶｒｉｅｓ等（１９７０）　） 　。ＡＦＧＰは前記魚の血液の３〜４％を占め、ＡＦＧＰは塩化ナトリウムと共 に魚の凍結、つを海水の凍結点より低くする。ＡＦＧＰは氷の結晶に吸着するこ とにより氷の結晶の成長を抑制する（Ｒａｙｍｏｎｄ等（１９７７）、　ＤｅＶ ｒｉｅｓ（１９８４，）　）。吸着は氷の結晶の特定の面（−次角柱面（１０１ ０））の上で起り、その結果これらの面の上における氷の成長か抑制される（Ｄ ｅＶｒｉｅｓ、　１９８４）　ｏその結果、ＡＦＧＰ溶液中では、氷の結晶は、 主としてＡＦＧＰか吸着されていない基礎面（Ｃ軸に平行である）の上で成長し 、極めて小さい針様の氷の結晶の形態になる（Ｒａｙｍｏｎｄ等（１９７７）　 ：　ＤｅＶｒｉｅｓ　（１９８８）　）。不凍化ペプチドは北温帯、北氷洋およ び南氷洋のいくつかの魚に見い出されることかある。このようなペプチドは大き さおよび組成か多様である。

これらのポリペプチドは、実質的に各トレオニンがグリコシド結合によって三糖 類：β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキ シ−α−ガラクトピラノースによって結合している長さの本質的に異なる繰り返 しトリペプチドニーアラニン−アラニン−トレオニン−である。

また、小さい糖ペプチドも７位、１０位および１３位に位置するプロリンを少量 育していることかあるか、他の点ては大きい糖ペプチドと構造上置しである。

一般的に、分子量が大きい程、例えば精製によって得られるような前記フラクシ ョン１〜５のそれぞれまたは混合物におけるように、不凍化糖ペプチドのＣ軸に 沿った氷の結晶の成長を促進する効果は大きい。分子量の比較的小さいフラクシ ョン６．７および８はそれぞれまたはグループとして保存効果が明らかに小さい 。

不凍化糖ペプチドはパゴテニア・ホルクグレンビンキ、トレマトミスーニコリア （Ｔｒｅｍａｔｏｍｉｓ　Ｎ１ｃｏｌｉａ）　、およびディスソスティクス・マ ウソニを包含する南氷洋のノトテニア科のすへての魚において本質的に類似して いる（Ｊ、Ｔ、　Ｅａｓｔｍａｎ、　ａｎｄ　Ａ。

Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ、　Ａ、Ｌ、　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ 、　Ｖｏｌ、　２５４．１．０６−１１４（１９８６）　）。また、同じ８種の 糖ペプチドが北半球のタラ科の魚（ｇａｄｉｄ）、岩場に生息する魚（ｒｏｃｋ 　ｃｏｄ）　（ガデウス・オガク（Ｇａｄｕｓ　ｏｇａｃ）およびタラ科（ｆａ ｍｉｌｙ　Ｇａｄｉａｅ）に属する若干の他の北部のタラ（ｃｏｄ）から単離さ れた（Ａ、Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ、　Ｃｏｍｐ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　９０Ｂ、　Ｎｏ、　３．　 ｐｐ、６１１−６２１　（１９８８））。

従来単離されているＡＦＧＰはすべて構造の点て類似しているか、北部の種では 不凍化糖ペプチド８中のプロリンの占める位置のような比較的小さな変化かあり 、あるいは北部のタラでは大きさに差異かあるか、本質的に同し組成である（Ａ 、Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ。

（１９８４）　Ｐｈ１１．　Ｔｒａｎｓ、　Ｒ，５ｏｃ１．　Ｌｏｎｄ、、　Ｖ ｏｌ、　Ｂ　３０４．５７５−５８８）。

魚に見い出される他の種類の不凍化タンパク質はポリペプチドである。不凍化粧 タンパク質は、Ｔｈｒ側鎖に三糖類か結合している糖トリペプチド単位：　Ａｌ ａ−Ａｌａ−Ｔｈｒの一般的な重合体の形態をしているが、ペプチドは構造的に 全く異なり、大きさおよび組成も変化している。

カレイ類の魚（ｗｉｎｔｅｒ　ｆｌｏｕｎｄｅｒ）　、ブソイドブレウロネクテ ス°アメリカヌス（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ　ａｍｅｒｉｃａｎ ｕｓ）からの不凍化タンパク質は、分子量の比較的大きい糖タンパク質と類似の 比活性（ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）を有しているか、全く糖を含有 しておらず、その代りに親水性アミノ基（特にトレオニンおよびＡｓｐ　）を大 きい百分率で有し、かつ多量（約６０モル％）のアラニンを保有している。カレ イ類の魚のタンパク質の一次構造はアラニン配列によって分離された親水性アミ ノ酸のクラスターを有する（ＤｕｍａｎおよびＤｅＶｒｉｅｓ、　（１９７６） 　Ｃｏｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｖｏｌ、　５３３．３７５−３８０）。

カレイ類の魚からのペプチド Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａ　１．　ａ−Ａ　Ｉａ−Ａ　Ｉａ −Ａ　Ｉａ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ａ　１．ａ−Ａ　１ａ−Ａ ｓ　ｐ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａ　１ａ−Ａ　Ｉａ−Ａ　１ａ−Ａ　ｌａ、−Ｌ ｅ　ｕ−Ｔｈｒ−Ａ　ｌ　ａ−Ａ　ｌ　ａ−Ａｓ　ｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ −Ａｌａ−Ａｌａ−Ａ１．ａ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｌａ　０生体適合性 物質源。

南氷洋のゲンゲ科の魚（ｅｅｌ　ｐｏｕｔ）　（リゴフィラ・デアルホルニ（Ｒ ｈｉｇｏｐｈｉｌａ　ｄｅａｒｂｏｒｎｉ）　）からのベプチトペプチドＮｏ、 　分子量 １、　２．　３　（三成分＞　６．９００Ａ　５ｎ−１，ｙｓ−３ｅｒ−Ｖａ　 １−Ｖａ　１−Ａ　１ａ−Ａｓ　ｎ−Ｇ　ｌｎ−Ｌｅｕ−（１ｅ−Ｐｒ　ｏ−Ｉ 　１　ｅ−Ａ　ｓ　ｎ|Ｔｈｒ− Ａ　１．ａ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｌｅ　ｕ−１１ｅ−Ｍｅ　ｔ−Ｌｙｓ　−Ａ　１ ａ−Ｇ　１ｕ−Ｖａ　１−Ｖａ　Ｉ　−Ｔｈｒ−Ｐ　ｒｏ−lｅ　ｔ　− Ｇ　ｌ　ｙ−１１ｅ−Ｐｒｏ−Ａ　１ａ−Ｇ　１ｕ−Ａｓ　ｐ−［１ｅ−Ｐｒｏ −Ａｒｇ−ｒ　１ｅ−１１ｅ−Ｇ　ｌｙ−Ｍｅ　ｔ−Ｇ　１氏| Ｖａ　１−Ａｓｎ−Ａｒｇ−Ａ　１ａ−Ｖａ　ｉＰ　ｒｏ−Ｌｅ　ｕ−Ｇ　ｌ　 ｙ−Ｔｈｒ−Ｔｙ　ｒ−Ｌｅ　ｕ−Ｍｅ　ｔ　−Ｐ　ｒｏ−`ｓ　ｐ− Ｍｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−０不凍化ペプチドを生成す る他の魚、例えばアラスカのヒラメ、大西洋のカジカ科の魚（ｓｃｕｌｐｉｎ） 　、カジカ科の小さい魚（ＧｒｕｂｂｙＳｃｕｌｐｉｎ）　（Ｄ、Ｓ、Ｃ，Ｙａ ｎｇ、　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３３３．２３２−２３７．１９８８）およ び南氷洋のゲンゲ科の魚（リゴフィラ・デアルボルニ）が、Ａ、Ｌ、　ＤｅＶｒ ｉｅｓ、　Ｐｈ１１．　Ｐｒｏｍｓ、　Ｒ，Ｓｏｃ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　Ｖｏｌ 、　３０４．５７５−５８８　（１９８４）に記載されている。また、前空の不 凍化タンパク質の最近の論評は（ＦｅｅｎｅｙおよびＢｕｒｃｈａｎ、　（１９ ８６）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　１５．５３− ７８）および（Ｄａｖｉｅｓ等、　（１９８８）　Ｃａｎａｄｉａｎ　Ｊ、　Ｚ ｏｏｌ、　Ｖｏｌ、　６６、２６１１−２６１７　）中に見い出すことができる 。

また、Ｖ、Ｓ、　Ａｎａｎｔｈａｎａｒａｙａｎａｎ、　Ｌｉｆｅ　Ｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔｓ。

Ｖｏｌ、　７．　ｐｐ、　１−３２　（１９８９）には、不凍化タンパク質源、 特にタイプ１．　ｆｆｌおよび■の不凍化タンパク質源か記載されている。

これらのＡＦＰ、ＡＦＧＰ　（あるいはこれらのフラクションおよびその混合物 ）およびその他のものは、申し込みに応じて叶、　Ａｒｔｈｕｒ　ＤｅＶｒｉｅ ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、　Ｂｕｒｒｉｌｌ Ｈａｌｌ、　４０７　Ｓ、　Ｇｏｏｄｗｉｎ、　Ｌｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ 　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　Ｕｒｂａｎａ、　ＩＬ６１８０１から入手できる。

また、本発明に係るこれらの不凍化タンパク質またはペプチドは合成手段によっ て製造することができる。これらの手段としては、米国カルフォルニア州フォス ター市所在のアプライド・バイオシステムス社のモデル４３０Ａとして当業界で 商業的に入手できるペプチド合成装置の使用かある。このペプチド合成装置の操 作マニュアルが有用である。Ｊ、Ｊ、　Ｎｅ５ｔｏｒ等、米国特許第４．３１８ ．９０５号およびＲ，Ｂ、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、米国特許第３，５３１．２ ５８号の合成方法を特に参考としてここに記載する。これらの合成方法は上述の Ａｌａ−Ａｌａ−Ｔｔｌｒ化合物およびＡｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ化合物を製造す るのに適している。ペプチドを生成した後に、トレオニン残基を三糖類に従来方 法によって随意に結合させる。

本発明に係る不凍化タンパク質は、タンパク質そのものまたは糖タンパク質、あ るいは生体適合性抗体、ゼラチン、生体適合性重合体、ペプチド、糖または炭水 化物のような担体に共有結合させたタンパク質または糖タンパク質から独立的に 選択される。これらの不凍化物質の混合物は期待され、本発明の一部を構成する 。当業者に知られている方法によってタンパク質を担体に共有結合させることは 、例えばに、　Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ等、米国特許第３．８１７．８３７号、ま たはＭ、　Ｇｏｏｄｍａｎ等、米国特許第４．８３７、３０５号中に見い出され 、これらの米国特許を参考として特にここに記載する。

不凍化ポリペプチドの組換えＤＮＡの製造また、本発明の範囲には、組換えＤＮ Ａ技術によって製造したペプチドを含有する組成物を製造することも含まれる。

これらの遺伝子を暗号化するＤＡＮ配列は従来から説明されている。

例えば、Ａ、Ｌ、　ＤｅＶｒｉｅｓ等、　（１９７１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、　２４６゜ｐ、　３０５　；　Ｙ、　Ｌｉｎ等、（１９７ ２）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、。

Ｖｏｌ、　４６．　ｐ、　８７　：　Ｄ、Ｓ、Ｃ，Ｙａｎｇ等、　（１９８８） 　Ｎａｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　３３３゜ｐ、　２３２　；　Ｙ、　Ｌｉｎ、（１ ９８１）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｌｌ−３，Ａ、　 Ｖｏｌ。

７８、　ｐ、　２８２５　；　Ｐ、Ｌ、　Ｄａｖｉｅｓ等、（１９８２）　Ｊ、 　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ。

７９、　ｐ、　３３５　：　Ｂ、　Ｇｏｕｒｌｉｅ等、　（１９８４）　Ｊ、　 Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、’２５９、　ｐ、　１４９６０　：　Ｐ、 Ｌ、　Ｄａｖｉｅｓ等、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　ｐ、９２４１　：Ｇ 、に、　５ｃｏｔｔ等、　（１９８６）　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｆｉｓｈ、　Ａｇｕ ａｔ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　４３゜ｐ、　１０２８　：　Ｇ、に、　５ｃｏ ｔｔ等、（１９８８）　Ｊ、　Ｍｏ１．、　Ｅｖｏｌ、、　Ｖｏｌ、　２７．　 ｐ。

２９を参照されたい。ＡＦＰ遺伝子を他の種に微量注射することには成功してい る。例えば、Ｚ、　Ｚｈｕ等、（１９８５）Ａｎｇｅｗ、１ｃｈｔｏｙｏｌ。

Ｖｏｌ、　１．　ｐ、　３１　：　Ｋｅｘｕｅ　Ｔｏｎｇｂａｏ、　（１９８６ ）　Ｖｏｌ、　３１．　ｐ、　９８８　：Ｄ、　Ｃ１１０ｕｒｒｏｕｔ等、　（ １９８６）　Ａｇｕａｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　５１．　ｐ、　１４３　； 　Ｒ。

Ａ、　Ｄｕｎｈａｎ等、　（１９８７）　Ｔｒａｎｓ、　Ａｍ、　Ｆｉｓｈ、　 Ｓａｃ、、　Ｖｏｌ、　１１６．　ｐ。

８７　：　Ｇ、Ｌ、　Ｆｌｅｔｃｈｅｒ等、（１９８８）　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｆ ｉｓｈ、　Ａｇｕａｔ、　Ｓｃｉ、。

Ｖｏｌ、　４５．　ｐ、　３５２　：　Ｎ、Ｄ、　Ｍａｃｌｅａｎ等、（１９８ ７）　Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、　５．　ｐ、　２５７　；　Ｇ 、Ｗ、　５ｔｕａｒｔ等、　（１，９８８）　ＤｅｖｅＩｏｐｍｅｎｔ、　Ｖｏ ｌ−１，０３，ｐ、　４０３　：　Ｔ、　ｋｉｃＥｖｏｙ等、（１９８８）　Ａ ｇｕａｃｕｌｔｕｒｅ、　Ｖｏｌ、　６８゜ｐ、　２７　；　Ｋ、　０ｚａｔｏ 等、（１９８６）　Ｃｅ１ｌ　Ｄｉｆｆｅｒ、、　Ｖｏｌ、１９．　ｐ、　２３ ７　：Ｔ、Ｔ、　Ｃｈｅｎ等、（１９８９）　［ＪＣＬＡ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ 　ｏｎ’Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓ丁Ｔ、　Ｃｈｅｎ等、（１９８ ９）　Ａｇｕａｃｕｌｔｕｒｅ　：　Ｐ、　Ｚｈａｎｇ等、（１９８９）　Ｍｏ ｌ。

Ｒｅｐｒｏｄ、　Ｄｅｖ、；　Ｄ、Ａ、　Ｐｏｗｅｒｓ等、　（１９８９）　Ｎ ｒＨＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎＴｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ａｎｉｍａｌｓを参照さ れたい。タンパク質を生成するためのＤＮＡ配列の一般的な形成方法は次の米国 特許第４．２３７．２２４号二同第４．７０８．９４８号−同第４．３７６、０ ７１号：同第４．３５０．６８７号：同第４．４４４．７６０号、および同第４ ．７２２．９９８号中に見い出される。

これらの方法はＡＦＰを製造するのに適している。これらのすへての文献を参考 として特にここに加入する。

また、本発明において宵月である不凍化タンパク質（熱ヒステリシスタンパク質 ）は最近多くの無を推動物中に見い出されている。これらの無を推動物のリスト を文献と共に表２および表３に示す。文献はこれらの表のなかにこれらの表の直 ぐ後に示されている。

表２ 熱ヒステリシスタンパク質を生成する無を推動物（Ａｒｃｙｎｏｐｔｅｒｙｘ− ｃｏｍｐａｃｔａ）　Ｓｏｍｍｅ、　１９８７直翅目　バルコブラタ・ペンシル バニヵ　Ｄｕｍａｎ、　１９７９（Ｐａｒｃｏｂｌａｔａ　−ｐｅｎｎｓｙｌｖ ａｎｉｃａ）半翅目　オンコベルッス・ファスシ了ツス　Ｐａｔｅｒｓｏｎ等、 　Ｉ９ｇ＋（Ｂｏｒｅｕｓ−ｗｅｓｔｖｏｏｄｉ）　Ｚａｃｈａｒｉｓｓｅｎ、 　１９８０鱗翅目　コリストネウラ・フミフェラナ　Ｈｅｗ等（Ｃｈｏｒｉｓｔ ｏｎｅｕｒａ　−ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）し Ｄｕｍａｎ、１９７８ メラカンタ・コントラクタ　Ｄｕｍａｎ、　＋９７７ａ（Ｍｅｒａｃａｎｔｈａ 　−ｃｏｎｔｒａｃｔａ）つ０７−イムブソサ　Ｄｕｍａｎ、　１９７９（ｌｌ ａｍａ　−ｉｍｐｒｅｓｓａ） ブラチデ７ＦＩ　Ｄｕｍａｎ、　＋９７９（Ｐｌａｔｙｄｅｍａ　ｓｐ） コメノキムン科　アムベデウスーリネアソス　Ｄｕｍａｎ、　＋９７９（Ａｍｐ ｅｄｕｓ　１ｉｎｅａ＋ｕｓ）アムペデウス種　Ｄｕｍａｎ、　１９７９（、Ａ ｍｐｅｄｕｓ　ｓｐ） レビトノス・ディスコイブウス　Ｄｕｍａｎ、　１９７９表　２　（つづき） ヒラタムン科　ククジュス・クラビベス　Ｄｕｍａｎ、　１９７９（Ｃｕｃｕｊ ｕｓ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）ピロクリダニ　プントロイデス・カナデシンス　Ｄｕ ｍａｎ、１９７９（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ　ｓｐ） チンドウムシ科　コクン不う・ノベムノタタ　Ｄｕｍａｎ等川９８２用Ｃｏｃｃ ｉｎｅｌ　ｌａ　−ｎｏｖｅｍｎｏ＋ａｔａ）キクイムノ科　イブス・アクミナ ッス　Ｇｅｈｒｋｅｎ、　＋９８４（［ｐｓ　−ａｃｕｍｉｎａｔｕｓ） カミキリムシ科　ラギウム・イングイシトル　Ｂｒｅｍｄａｌおよび（Ｒｈａｇ ｉｕｍ　°　ｉｎｇｕｉｓｉｔｏｒ）　Ｚａｃｈａｒｉａｓｓｅｎ。

Ｃ１非昆虫の節足動物 （Ｐｈｉｌｏｄｒｏｍｕｓ　ｓｐ） クルビオナ種（Ｃ１ｕｂｉｏｎａ　ｓｐ）　Ｄｕｍａｎ、＋９７９ポリフアンテ ス・インデクス　Ｈｕｓｂｙεよび（Ｂｏｌｙｐｈａｎｔｅｓ−ｉｎｄｅｘ）　 Ｚａｃｈａｒｉａｓｓｅｎ、　１９８０ムカデ類　リトビウス・フォルフィヵッ ス　Ｄｕｍａ口等川９８用（Ｌｉ　ｔｈｏｂｉｕｓ　−ｆｏｒｆ　１ｃａｔｕｓ ）　ＴｕｒｓｍａｎおよびＤｕｍａｎ　、未発表 ダニ　アラスコゼテス・アンタルクティ　ＢｌｏｃｋδよびＤｕｍａｎ。

クス（Ａｌａｓｋｏｚｅｔｅｓ−ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）　１９８９Ｄ　他の 無腎椎動物 イガイ　ミチルス・エデウリス　Ｔｈｅｅｄｅ等−１９７６（Ｍｙｔｉｌｕｓ− ｅｄｕｌｉｓ） 表３ テネブリオ・モリトル（Ｔｅｎｅｂｒｉｏ　Ｍｏ１ｉｔｏｒ）ＡＳＸ　１１．３ 　７．３　５．３　９．５　１４．３Ｔｈｒ　１１．０　＆６　２．３　６．０ 　１７．２Ｓｅｒ　１４．８　７．４　１１．１　１３．０　１０．３ＧＩＸ　 １５．３　８．９　１２．４　１＋、０　５．２Ｐｒｏ　５．９　５．９　０． ０　５．０　２．６ｃｔｙ　７．６　８，３　１１．４　１．５．０　６．５Ａ ｌａ　９，６　１４．３　５．０　８．０　８．４１／２Ｃｙｓ　Ｏ，００，０ ２８，０６，０＋５．９Ｖａｌ　７．２　１１．５　２．３　３．０　１．７　 ’Ｍｅｔ　Ｏ，０４，８０，００，００，２ｒｌｅ　３．３　７．１　１．０　 １．２　１．５Ｌｅｕ　３．９　０．０　２．２　６．５　１．９Ｌｙｓ　４． ８　６．８　１５．４　３．１　３．４Ａｒｇ　１１　２．６　０．０　８．０ 　４．８Ｔｙｒ　１−２　２．３　０．０　１．０　３．９Ｐｈｅ　１．５　３ ．９　０．０　２．２　０．０Ｈｉｓ　１．５　１．９　３．１　０．０　！、 ９親水性部分１％　５８，３　４０．０　４６．５　５０．６　５５．２ａ　Ｐ ａｔｔｅｒｓｏｎおよびＤｕｍａｎ、１９７９ｂ　Ｔｏｍｃｈａｎｅｙ等、　１ ９８２ｃ　ｐａｔｔｅｒｓｏｎおよびＤｕｍａｎ、　１９８２ｄ　ＨｅＷ等、　 １９８＋ ｅ　ＷｕおよびＤｕｒｎａｎ、未発表 ｆ　ＭａｎａｖａｌａｎおよびＰｏｎｎＬｓｗａｒｎｙ　（１９７８）の分類に 従った親水性側鎖（ＡＳＸ、　ＧＩｘ、　Ｌｙｓ、　Ａｒｇ、　Ｓｅｒ、　Ｔｈ ｒ）を有するアミノ酸残基の百分率表２および表３に関する刊行物： Ｗ、　ＢｌｏｃｋおよびＪ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、、　（１９８９）　Ｊ、　Ｅｘ ｐ、　２ｏｏ１．　Ｖｏｌ。

２５０、１）Ｉ）、　２２９−２３１゜Ｊ、Ｇ、　ＤｕｍａｎおよびＡ、Ｌ、　 ＤｅＶｒｉｅｓ、　（１９７６）　Ｃａｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｖｏｌ、　５４Ｂ、　ｐｐ、　３７５−３８００Ｊ、Ｇ、　 Ｄｕｍａｎ、　（１９７７ａ）　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、Ｖｏｌ 、　１１５．　ｐｐ。

２７９−２８６゜ Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、　（１９７６）　Ｊ、　ＥＸＩＴ、　Ｚｏｏｌ、　ＶＯ ｌ、　２０１．　ｐｐ、　８５−９３゜Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、　（１９７９ｂ ）　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、１３１．　ｐｐ、　３４ ７−３５２゜ Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、　（１９８０）　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 、　Ｖｏｌ、　１３６．　ｐｐ、　５３−５９゜ Ｊ、Ｇ、Ｄｕｍａｎ、（１９８２）　Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、１９． 　ｐｐ、６１３−６２７゜Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ等、　（１９８２）　Ｃｏｍｐ 、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ａ、、　Ｖｏｌ。

４５、　ｐｐ、　２６］−２７０゜ Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、　（１９８３）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ 、、　Ｖｏｌ、　４５．　ｐｐ。

２６１〜２７０゜ Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ等、（１９８４）　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、 　Ｂ、、　Ｖｏｗ、１５４゜ｐ、ｐ、　７９−８３゜ Ｊ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ等、　（１９８５）　Ｊ、Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ 、、　Ｖｏｔ、　３１．　ｐｐｌ−８゜ Ｕ、　Ｇｅｈｒｋｅｎ等、　（１９８７）　Ｊ、Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ 、、　Ｖｏｌ、　３３．　ｐｐ。

９８７−９９１　。

Ｃ，Ｌ、　Ｈｅｗ等、（１９８３）　Ｃａｎ、　Ｊ、　Ｚｏｏｌ、、　Ｖｏｌ、 　６１．　ｐｐ、　２３２４−２３２８゜ Ｋ、Ｌ、　ＨｏｒｗａｔｈおよびＪ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、　（１９８３）　Ｊ、 　Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、。

Ｖａｔ、、１５１．　ｐｐ、２３３−２４０゜Ｊ、Ａ、　Ｈｕｓｂｙ等、（１９ ８０）　Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ　Ｖｏｌ、　３６．　ｐｐ、　９６３−９６４ ゜Ｌ、Ｌｅｖｅｎｂｏｏｋ、（１９８５）　“１ｎｓｅｃｔ　ｓｔｏｒａｇｅ　 ｐｒｏｔｅｉｎｓ、−Ｉｎ：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｐｈ ｙｓｉｏｌｏｇｙ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇ ｙ、　Ｖｏｌ、　１０．　Ｇ、Ａ、　Ｋｅｒｕｔおよびり、１．　Ｇｉｌｂｅｒ ｔｍｐｐ、３０７−３４６．　Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　。

Ｓ、Ｈ，Ｌｏｏｍｉｓ、（１９８７）　Ｃｒｙｏ−Ｌｅｔｔｅｒｓ、Ｖｏｌ、　 ８．　ｐｐ、１８６−１９５゜Ｌ、に、Ｍｉｌｌｅｒ、（１９８２）　Ｃａｍｐ 、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、、Ｖｏｌ、７３Ａ。

ｐｐ、５９５−６０４゜ Ｌ、Ｇ、　Ｎｅｖｅｎ等、　Ｊ、　Ｃｏｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、 　１５９．　ｐｐ、　７１−８２゜Ｊ、Ｌ、　ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＪ、Ｇ 、　Ｄｕｍａｎ、　（１９７８）　Ｊ、　ＥＸＩＴ、　Ｂｉｏｌ、。

Ｖｏｌ、、７４．　ｐｐ、３７−４５゜Ｊ、Ｌ、　ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＪ 、Ｇ、　Ｄｕ＋ｎａｎ、　（１９７９）　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｚｏｏ、。

Ｖｏｌ、２１．０．　ｐｐ、３６１−３６７゜Ｊ、Ｌ、　Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ等 、　（１９８１）　Ｊ、　Ｃａｍｐ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、１４２゜ ｐｐ、５３９−５４２゜ Ｊ、Ｌ、　ＰａｔｔｅｒｓｏｎおよびＪ、Ｇ、　Ｄｕｍａｎ、　（１９８２）　 Ｊ、　ＥＸＩＴ、　ＺＯＯｌ、。

Ｖｏｌ、２１９．　ｐｐ、３８１−３８４゜Ｄ、Ｅ、　Ｒａｎｃｏｕｒｔ等、　 （１９８７）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、、　Ｖｏｌ、　７．　ｐｐ。

２１８８−２１９５　。

Ｒ，ＳｃｈｎｅｐｐｅｎｈｅｉｍおよびＨ，Ｔｈｅｅｄｅ、（１９８０）　Ｃｏ ｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、Ｂ、Ｖｏｌ、６７、ｐｐ、５６１−５６８゜Ｄ、Ｇ、　Ｓｌａ ｕｇｈｔｅｒ等、　（１９８１）　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、 　２５６、ｐｐ。

２０２２−２０２６゜ Ｌ、Ｓｏｍｍｅ、（１９７８）　Ｎｏｒｗ、Ｊ、Ｅｎｔ、、Ｖｏｌ、２５．　ｐ ｐ、１８７−１８８゜Ａ、Ｐ、　Ｔｏｍｃｈａ、ｎｅｙ等、（１９８２）　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、、　Ｖｏｌ、２１．　ｐｐ、　７１６−７２１゜Ｊ、Ｚｅｔｔｅｌ 、（１９８４）　Ｒｅｖ、Ｅｃｏｌ、Ｂｉｏｌ、Ｓｏｌ、、Ｖｏｌ、２１．　ｐ ｐ。

１８９゜ 全般 水性不凍化タンパク質組成物を使用する本発明では、組織における氷生成凍結プ ロセスが変り、組織に対する構造上の損傷は氷の結晶の成長パターンの変更によ って減少または消滅する。

このような進歩は、新規な組成物、例えば北氷洋または南氷洋の魚あるいは他の 供給源からのペプチドまたは糖ペプチドを使用して、組織における氷の結晶の成 長パターンを変更させることによって達成される。水溶液における凍結パターン に及はす不凍化タンパク質の作用は上述のように広く文献に記載されている。異 なる供給源からの異なる不凍化タンパク質は異なる結晶面に吸着するが、すべて の不凍化タンパク質は熱力学的に好ましい成長方向であるａ軸に平行な氷の結晶 の成長を抑制する。

どのような種類の不凍化タンパク質てあっても不凍化タンパク質の存在下に冷凍 すると、氷の結晶は常にＣ軸方向に形成する。

氷の結晶は針状体（スパイク様構造）の形態て成長する。これらの小さなミクロ ンおよびサブミクロンスケールの針状構造は安定であり、氷の形成中に排除され た溶質はこれらの構造の間に閉し込められる。

溶質の製造 ＡＦＰ組成物またはＡＦＧＰ組成物の水溶液はいくつかの方法で製造される。水 （通常無菌の水）をＡＦＰまたはＡＦＧＰと接触させ、混合して水中に０．１〜 １００　ｍｇ／ｍｌの溶質が溶解している溶液を生成する。普通、不凍化タンパ ク質は水中では約１０００ｇ／ｍｌより大きい濃度で飽和状態になる。約１〜６ ０ｍｇ、特に約２０〜４０ｍｇ／ｍｌのＡＰ溶液を生成するのが好ましい。また 、水相は、塩、糖、イオン栄養物（例えば、クレブス溶液）およびこれらの混合 物を、当業界で生体物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｇｅｎｔ）の保存に有用で あることか知られている濃度で含有することかできる。また、水相は、組織、細 胞膜などの保存に有用な他の物質、例えばグリセリンを含有することができる。

臓器移植などに使用するには、無菌条件および無菌溶液を使用する必要がある。

無菌溶液は無菌材料および無菌条件を使用して製造することかできる。また、溶 液は当業界で知られている方法、例えばコバルト６０の放射に短時間曝すことに より無菌状態にすることかできる。

組織の保存 氷の結晶構造に対するＡＦＰの作用を例示するために、本発明に関する初期の研 究からの実験結果を示す。この研究では、生理食塩水における凍結パターンを、 南氷洋のノトテニア科の魚（表１）からの不凍化機タンパク質を約１〜１００　 ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約４０ｍｇ／ｍｌ添加した生理溶液における凍結パター ンと比較した。この比較実験では、方向凝固ステージにおいて制御された熱条件 下に試料を凍結させた。方向凝固ステージは米国特許第４．５３１．３７３号に 詳細に記載されており、このステージは溶液または組織試料を所定温度の間で一 様な速度て凍結することかてきる装置のことである。この装置を光学顕微鏡と併 用して、不凍化機タンパク質の存在下における針状体の成長を示す図ＩＡ、ＩＢ およびＩｃに示されている結果を得た。

本発明の一例では、臓器の脈管構造を経て不凍化タンパク質を含有する溶液を潅 流させる。凍結した際に、形成する氷の結晶は小さく、針状てあり、存在する溶 質を閉じ込める。その結果、細胞は高い塩濃度に曝されず、損傷を生じる血管の 膨張か消滅する。この作用を、方向凝固ステージおよび走査電子顕微鏡を併用し た詳細な実験結果として、図２Ａ、２Ｂおよび２Ｃならびに図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ ，３Ｄおよび３Ｅに示す。

ガラス化 以前に、細胞、組織または臓器は、急冷または「見掛けのガラス化」によって凍 結が起ると、生存できないことかあることか観察されている。ここでは、「見掛 けのガラス化」という表現は、時として、極低温まで急冷した後でも溶液が透明 のままである場合に、溶液かガラス化したと考えられるという観察結果を記載す るために使用する。しかし、透明であるという性質は、氷の結晶が小さすぎるか 少なすぎて光を反射しないこと、従ってガラス化は見掛けにすぎないことを示す ものであるにすぎない。本発明の一つの面では、細胞（または臓器、組織、動物 ）を含有する溶液を急冷または見掛けのガラス化によって凍結させる技術によっ て保存された細胞（または臓器、組織、動物）は、核形成位置として役立つこと のある極小の氷の結晶か細胞膜の上に選択的に形成することによって損なわれる ことかあることか期待される。不凍化糖ペプチドおよび不凍化ペプチドは、氷の 針状構造の生成によって形成する氷の結晶の成長を抑制し、結晶の大きさを有意 に小さくする。従って、これらの生体適合性物質は、おそらく、細胞膜の上にお ける氷の結晶の成長を阻止することにより、あるいはこれらの氷の結晶の大きさ を小さくすることにより、低温保存効果を向上させるのてあ不凍化タンパク質の （ガラス化における）効果を、急冷および「見掛けのガラス化」によって凍結さ れた未成熟ブタの卵母細胞、ブタの二細胞段階の胚３よびマウスの二細胞段階の 胚について評価した。ブタ卵母細胞およびブタの二細胞段階の胚を選択したのは 、従来成功を収めなかった凍結保存に対して極めて魅力的なモデルを提供するか らである。実際に、ブタ卵母細胞およびブタの初期段階の胚は、１０°Ｃ程度の 高い温度に曝されると、たとえ短時間であっても生存できないのが普通である。

冷却中に氷の結晶核か形成する確率は、粘度および温度の逆関数であり、容積の 一次関数である（Ｄ、　Ｔｕｒｎｂｕｌｌ、　１９６９）。急冷による凍結保存 の際に、種々の凍結防止剤の濃度を大きくすることにより、溶液粘度を増大させ 、かつ相転移温度を低下させて核形成の確率を小さくすることか試みられている 。しかし、凍結防止剤濃度か大きくなると、生体材料を損傷する作用か生し、従 って、核形成を抑制するのに十分な高い濃度と、脆い細胞の損傷を回避するのに 十分な低い濃度との間に、適切なバランスを見い出す必要かある。

Ｂ、　Ｒｕｂｉｎｓｋｙ　、米国特許第４．５３１．３７３号によって開発され た特定の実験方法において、大きさおよび組成の異なる液滴を種々の冷却速度に 曝すことにより、これらの実験を行った。試料の急冷ならびに急激な加温は、特 定の方向ステージが取り付けられているライフ・ダイアプラン（Ｌｅｉｔｚ　Ｄ ｉａｐｌａｎ）　Ｈ微鏡を使用して行った（Ａ、　Ａｒａｖ等、　１９９０　： 　Ｂ、　Ｒｕｂｉｎｓｋｙ、　１９８５　：　Ｂ。

ＲｕｂｉｎＳｋｙ等、　１９８５）。このステージでは、所定温度間の冷却およ び加温の速度を、特に急冷によるガラス化および凍結に適、用した場合には、正 確に制御することかできる。ビデオカメラを顕微鏡と併用して細胞の形態および 溶液の物理的状態を評価した。

「見かけのガラス化溶液Ｊ　（ＡＶＳ）としては、１７．５％のプロピレングリ コール（スイス国フル力ケミカルス（Ｆｌ　ｕｋａＣｈｅｍｉｃａｌｓ）社、２ ．５％のグリセリン（英国ビーディーエッチ・アナラー（ＢＤＨＡｎａｌａｒ） 　、２０％のＦＣ３（ウシ胎児血清）（英国スコツトランド、ギブコ（Ｇｉｂｃ ｏ）社）およびＰＢＳ　（ダルベツコ社のリン酸緩衝液に０．４ｍ／ｖのＢＳＡ 　（ウシ血清アルブミン）　、０．３４　ｍＭのピルビン酸塩（ｐｙｒｕｖａｔ ｅ）、５．５ｍＭのグルコースおよび７０Ｍｇ／ｍｌのカナマイシンを加えたも の）中の０゜０５Ｍのスクロースを含有するものか有用であった。

この溶液はマウス胚、ブタ胚およびブタ卵母細胞と生理適合性である。ＡＶＳ溶 液の０．１μＩの液滴を１．７００’Ｃ／分の速度（方向凝固ステージを使用し た場合の最高速度）で−１３０’Ｃの温度（この溶液のガラス形成温度より低い 温度）まて冷却した場合に、氷の結晶は倍率３４０倍の顕微鏡によっても観察さ れなかった。容積および溶質濃度の作用を説明するために、１２．５％のプロピ レングリコールおよび２．５％のグリセリンを含有するＡ、　Ｖ　Ｓ溶液の液滴 かすべて０．５μｌより大きい場合およびすへて０．１　μｌである場合につい て、１．７００″Ｃ／分で冷却した場合の氷の結晶を観察した。見かけのガラス 化は観察されなかった（すなわち、１２．５％のプロピレングリコールおよび２ ．５％のグリセリンを含有するＡＶＳ溶液の液滴が０．５μｌより大きい場合お よびすべて０．１μｌである場合について、１．７００″Ｃ／分で冷却した場合 に、氷の結晶の形成か観察された）。見掛けのガラス化か生じない（すなわち、 氷の結晶か形成する）ことは、試、料を一１３０°Ｃに保持した場合に観察され た。しかし、若干の試料において常温まで加温した際に１．７００″Ｃ／分程度 の高い速度においても失透が観察された。ＡＦＧＰまたはＡＦＰを添加しても、 ＡＶＳ溶液は「見かけのガラス化」の後のまれに起るランダムな失透の生起を妨 害しなかった。ＡＶＳは、使用した液滴か０．５ｍｌより大きい場合および「見 かけのガラス化Ｊのための０．１ｍｌの液滴である場合において、急冷した場合 の凍結作用を評価するために実験で使用した基本溶液である。ガラス化の研究で は、失透を生じなかった溶液からの結果のみを評価した。

卵母細胞および胚におけるＡＦＧＰおよびＡ、ＦＰの凍結防止特性の評価 Ａ、　Ｆ　Ｇ　ＰおよびＡＦＰの凍結防止特性を評価するために、未成熟ブタの 卵母細胞、ブタの二細胞段階の胚およびマウスの二細胞段階の胚を、ＡＦＧＰま たはＡＦＰを含有するかあるいは含有しないＡＶＳを急冷することにより凍結さ せるために、ガラス化のための０．１ｍｌの液滴または０．５ｍｌより大きい液 滴のなかに導入した。これらの液滴を方向凝固ステージ上て顕微鏡による観察下 に１．７００°Ｃ／分の速度で一１３０°Ｃまて冷却した。これらの温度におい て１５分後に、試料を１．７００°Ｃ／分の速度で常温まで加温した。胚および 卵母細胞の生存を、インビトロ培養の後に形態および発育状態を解析することに より評価した。対照実験は、冷却および加温を行わない点を除けば急冷実験と同 じ実験計画において胚および卵母細胞を種々の溶液に曝し、次いてこれらの生存 力を評価することより行った。この実験に使用した糖ペプチドはノトテニア科（ ディスソスティクス・マウソニ）（表１）に属する南氷洋の魚から得た。米国イ リノイ大学のＡ、　ＤｅＶｒｉｅｓから得られるようなフラクション１〜５（高 分子量）１部とフラクション７および８（比較的低分子量）２部とから成る生理 組成物を使用した。フラクション１〜５は混合物として得、フラクション７〜８ も混合物として得た。実験は糖ペプチド濃度４０ｍｇ／ｍｌの溶液を使用して行 った。ＰＢＳは標準緩衝液である。この特定の値を選択した理由は、研究の結果 、不凍化タンパク質水溶液の凍結点の低下が濃度依存性であり、上述のような濃 度において前記水溶液か飽和に達することが分ったからである。Ａ、Ｌ、　Ｄｅ Ｖｒｉｅｓ、　（１９８８）。

ＡＦＧＰの凍結防止特性を明確にした後に、マウスの二細胞段階の胚を使用して パラメーターの検討を行って胚の生存に対する濃度の作用をめた。この動物モデ ルをパラメーター実験のために選択したのは、糖ペプチドの作用に対して極めて 敏感であることか分ったからである。糖ペプチドの不存在下（糖ペプチド０％） では胚の生存が達成されなかったが、糖ペプチドの存在下（糖ペプチド８２．５ ％、胚磐胞段階までインビトロ発育させた際）では胚の極めて高い生存か達成さ れた。パラメーター検討の詳細を表４にまとめた。ブタ卵母細胞およびブタ胚に ついての実験方法は下記の例４に記載され、マウス胚については例５に記載され ている。

表４は、ブタ卵母細胞に次いてブタ胚を使用して已発する下記の例４およびマウ ス胚を使用して出発する下記の例５の実験結果をまとめたものである。また、表 ４には胚および卵母細胞を試験する際に使用した溶液を示す。

存在下では、急激に冷凍またはガラス化された細胞は表４に示細胞に適用した実 験計画は先に記載したもので、この実験計画では胚および卵母細胞を種々の溶液 中に導入し、胚および卵母細胞のうちのあるものには急冷を適用し、他のものは 冷却せずに溶液作用に対する対照として保持する。結果は、ブタ卵母細胞につい ては、インビトロ成熟後にＭＩ段階またはＭＩ［段階に達した卵母細胞の数と、 実験計画を適用した卵母細胞の全数との比として示す。ブタ胚については、イン ビトロ発育後に四細胞段階に達した胚の数と、実験計画を適用した胚の全数との 比である。マウス胚については、胚磐胞段階に達した胚の数と実験計画を適用し た胚の全数との比である。括弧内の数値は百分率で示した上述の比を示す。

ブタ卵母細胞、ブタ胚およびマウス胚をＡ、　Ｖ　Ｓ溶液に曝した実験は、この 溶液か損傷作用を有していないことを示した。しかし、胚および卵母細胞をＡＶ Ｓ溶液中で極低温まで急冷またはガラス化した場合には、１個の胚または卵母細 胞も生存しなかった。これらの結果は、これらの細胞に対する損傷か冷却および 極低温に曝された結果であることを示す。顕微鏡検査は、ＡＶＳ溶液中ての急冷 による主な損傷位置か、卵母細胞の場合には卵細胞膜であり、胚の場合には卵割 球膜であり、卵細胞膜δよび卵割球膜は図面、特に図４Ｂ、５Ａおよび６Ｂに示 すように保全性を保持しないことを示した。しかし、糖ペプチドのと相互作用さ せ、また細胞膜の構造保全性を保護すると共に細すように生存力を保持していた 。

図１２および１３には、４°Ｃに４時間および２４時間保持した卵母細胞につい ての膜電位を示す。１〜４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰ濃度において生存力を示す膜 電位か劇的に保持されていることか図１３に示されている。図１２および１３の 数値は平均値士標準偏差の１倍である。各実験グループは５個の卵母細胞から成 り、ｎはグループ数を示す。

特に、実験３に記載されているように、細胞膜は糖ペプチドによって保護されて いた。

有用性 上述の説明から明らかなように、本発明のＡＦＰおよびＡＦＧＰの水性組成物は 、細胞の保存、膜の保存、組織の保存、臓器の保存、あるいは植物全体または動 物全体の保存に有用である。

一般的に、不凍化タンパク質は水溶液の見掛けの凍結点を非束−的に低下させる 性質を有し、その結果凍結温度か融解温度より低くなる。また、不凍化タンパク 質は、氷の結晶の種々の小面の上における成長を抑制または制限するか、Ｃ軸に 沿った成長を許容するという一般的性質を育する。今日まで、これらのタンパク 質を他のタンパク質、特に細胞膜表面のタンノ（り質胞膜を通る漏洩を止めかつ イオン通路を閉塞するのにも使用できることは全く知られていない。これらの性 質およびその適用か観察され、発明の一部として記載されたのは、最初のことで ある。

細胞膜におけるＡＦＧＰの効果 当初、氷の結晶成長の変化における不凍化タンパク質の効果は、氷結以下の温度 で細胞、組織、臓器および動物全体を保存する際にこの性質を利用する点に集中 されていた。しかし、細胞膜の形態を評価している上述の研究および例１および ４（または表４）のような実験では、不凍化タンパク質が膜の形態およびその構 造保全性を完全に保護することか一貫して明らかにされた。それ故、不凍化タン パク質が細胞膜と直接に相互作用することにより、また不凍化タンパク質か細胞 膜に直接に接触することにより保護作用をするかどうかを明確にするために、手 順を開発した。

ブタ卵母細胞をこの研究における実験モートとして選択した。

なぜならば、こちらの卵母細胞はｌＯｏＣのような高さの低温に、すなわち、相 転移温度より高い温度にさらした際に生存てきないためである。それ故、細胞に 対するＡＦＧＰの効果を、相転移温度より高くしかも正常体温より低い温度で研 究する実験を計画した。ＡＦＧＰの保護効果か確められた場合でも、この保護効 果は化合物か氷の結晶形態を変える性質または氷結晶の形成を抑制する性質とは 直接には関係していないと思われる。

卵母細胞をノトテニア科の魚からの不凍化機タンパク質（表１のフラクション１ 〜５）を含む標準緩衝ＰＢＳ溶液の種々の溶液に導入した。これらの溶液を定温 雰囲気内に種々の時間にわたって維持し、次いて膜電位を調べた。また、構造保 全性を顛微鏡評価により調へた。

無傷の卵細胞膜についての判定基準を確立するために、予備実験を卵母細胞の各 バッチについて行った。この際、新鮮な卵母細胞の膜電位を２２°Ｃて測定した 。電位の平均値Ｕおよび標準偏差Ｖを各バッチについて計算した。平均値および 標準偏差を、緩衝溶液中、およびＡ、　ＤｅＶｒｉｅｓ、同上から得られるよう な４０ｍｇ／ｍｌの不凍化糖ペプチドフラクション１〜８（表１）を含む緩衝溶 液中の新鮮な卵母細胞について測定した。

を要約したものである。表４は、４０°ＣにおいてＡＦＧＰの異なる濃度および 異なる時間における各実験条件に用いた卵母細胞の数に対する無傷の卵細胞膜を 有すると思われる卵母細胞の数の割合を与える（カンコ内の数値は百分率で表わ した割合である）。

比較すると、糖ペプチドか各卵母細胞の静止電位に対して小さい効果を有するこ とが分かる。卵細胞膜の保全性をめるために、２つの統計的判定基準を一方か他 方よりきびしくならないように定めた。卵母細胞における卵細胞膜は、測定した 静止電位差の絶対値が：　ｕ　＋　：　Ｖ　：または）ｕ：　：２Ｖ：のいずれ かの絶対値より大きかった場合に、無傷であると考えた。

卵細胞膜の構造保全性の評価からの結果は電位測定と一致しており、これらの結 果を図７Ａ、　７Ｂおよび７Ｃに示す。これらの結果は、膜が糖ペプチドの存在 下において形態学的に無傷に保存されることを明示している。さらに、低温にさ らされている間の最も一般的な損傷の原因と思われるイオン漏洩は不凍化タンパ ク質の存在下に有意に抑制される。これは、不凍化タンパク質が細胞膜を低温で 保護する能力およびイオン通路を閉塞する能力を有することを意味する。細胞お よび臓器の低温保存にこの新規な技術を使用した結果は、後述の例６および７の それぞれに与えられている。

この研究以前には、不凍化タンパク質か細胞膜を保存し、かつイオン通路を閉塞 する官用な特性を有することは全く知られ哺乳動物、例えはラットからの臓器全 体、例えば、肝臓の凍結保存を後述する例２，７および７Ａに記載する。臓器は 外科的に摘出し、保存溶液中に２０〜３７°Ｃ１好ましくは２４°Ｃて保持する 。

主血管にカニユーレを挿入する。周知のランゲンドルフ潅流システム（例えば、 クレブス溶液および１　ｍｇ／ｍ１〜１００ｍｇ／ｍｌの不凍化ポリペプチドの 入っている第１ボトルを使用する）を用いる。例えば、Ｄ、　Ｅ、　Ｐｅｇｇ等 （１９８６）、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、２３．　ｐｐ、１５０〜１６ ０参照。

溶液の第２ボトルには、生理適合性食塩水および適当量のグリコール、ジメチル スルホキシド、エチレングリコール、ポリビニルピロリドン、グルコースなど、 または生体臓器の細胞にとっての保護剤として知られているこれらの物質の混合 物を入れる。

溶液のこれらの２個のボトルを既知の調整可能な流量（例えば０．１〜１０−７ 分、好ましくは約５−７分）を育する混合弁および流量を正確に変えるコンピュ ータに連結し、各ボトルの内容物を潅流直前に混合する。

ボトルｌおよび２の溶液を用いる潅流は腎臓については上述するり、　Ｅ、　Ｐ ｅｇｇ等（１９８８）の文献に記載され、心臓についてはＧ、　Ｎ。

れているように、当業界においてよく知られている。クレブス溶液は約２０〜３ ７°Ｃに保持された臓器を経て約４　ｍｌ／分の速度で潅流させる。

混合スイッチは、中間量のクレブス溶液およびグリセリン溶液を、コンピュータ により制御された時間の長さ、例えば０．０１秒のパルスで供給する。２種の溶 液は送出管または特定の混合室内で混合される。

不凍化タンパク質／クレブス溶液を初めに調節し、潅流プロセスの終りに１　ｍ ｇ／ｍｌ〜４０ｍｇ／ｍｌの濃度を組織の血管腔内て達成する。大部分のＡＦＰ は臓器の脈管腔（血管床）内に（肝臓または血管の細胞内ではない）見い出され る。通常、ＡＦＰ　（ｒＡＦＧＰＪ　）は分子量が大きすぎて細胞膜を有意に貫 通することはない。次いで臓器、例えば肝臓を米国特許第４．５３１．３１３号 明細書に記載されているように冷却段階に置き、次いて全潅流臓器の温度を一３ ２°Ｃまたは一７０°Ｃまで、あるいは−１５０″Ｃに達するまて１°Ｃ／分の 速度で冷却する。次いで臓器を所要に応じて液体窒素を用いて一１９６°Ｃまて 冷却するかあるいは液体ヘリウム中で４Ｋまで冷却し、この温度に不定時間（例 えば７２時間）保持する。次いで、凍結臓器を冷温の液体または温かい液体、例 えば水または食塩水中に浸すことにより、既知の技術を用いて最高３７°Ｃまて 約０．１〜１０″Ｃ／分（好ましくは約１°Ｃ／分）の速度て注意しなから解凍 する。あるいはまた、注意深く制御したマイクロ波加熱を用いて潅流臓器、例え ば肝臓を解凍する。解凍臓器（肝ＩＩ）が約Ｏ″Ｃに達した際に、クレブスの栄 養溶液を太いカニユーレ挿入血管を経て潅流させる。約２０〜３７°Ｃ１好まし くは３７°Ｃに加温された際に、解凍臓器は細胞機能を回復すると共に、臓器機 能を回復する。保存組織試料を所要に応じて採取する。

ラットの肝臓冷温貯蔵に対するＡＦＧＰの効果の系統的研究を行なって対照貯蔵 溶液とＡＦＧＰ含有溶液とを比較した（例７Ａ参照）。

得られた結果は異なる３種の貯蔵期間、すなわち６，１２および２４時間につい て比較されている。機能試験は胆汁の生成および乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ ）の酵素活性を含んでいる。クレブス溶液を対照溶液として選定する。この選択 の理由は他の貯蔵溶液の保護特性とＡＦＧＰの効果とを別けるためである。

有用な補乳類の臓器は肝臓、腎臓、心臓、脳、肺、膵臓、膵臓、卵巣、胃などを 包含する。哺乳動物、例えばヒトの臓器か哺乳動物全体、例えばラットおよびヒ トの低温保存は後述の例１．　２．　７および７Ａから実施可能である。成熟し た哺乳動物、例えばラットに麻酔をかげ、頚静脈（ｃａｒｏｔｉｄ　ｖｅｉｎ） または大動脈にカニユーレを挿入する。

コンピュータ制御混合スイッチは、コンピュータによって制御された時間の長さ 、例えば０．０１秒〜０．１秒〜１秒の間ばっと開いて、中間量の溶液１　（グ レブス溶液）および溶液２（グリセリン／塩溶液）を供給する。これらの２種の 溶液は送出管内あるいは随意に特別に設けた混合室内で混合される。

先ず、クレブス溶液を哺乳動物を経て短時間潅流させる。約１、０００〜３．０ ００単位のヘパリンを添加して凝血を抑制する。

細胞用の低温保存剤として知られている溶液、例えば食塩水中のグリセリンを、 ここに記載した混合スイッチ配置を使用して、臓器を経て潅流させる。

随意に、ライスコンシン大学溶液またはユーロコリンス（Ｅｕｒｏ−Ｃｏｌｌｉ ｎｓ）溶液のような代用血液を潅流溶液に添加する。

次いて、ラットに不凍化ポリペプチド溶液（例えば、例１）を０．１〜１０ｍ１ ／分の流量で２０分間潅流させる。哺乳動物の体温は２°Ｃより低い温度まで低 下する。次いで、哺乳動物を外部から内部まで０．１〜ｌＯ°Ｃ／分の速度で冷 却する。

次いで、この哺乳動物を一１８°Ｃまたは一１５０°Ｃまたは４Ｋまで冷却し、 この温度に不定期間、例えば７日間〜７ケ月間保持する。次いて、凍結しだ哺乳 動物を酸素／窒素（２０／８０　：　ｖ／ｖ）の存在下に約Ｏ″Ｃまで約０．１ −１．０°Ｃ／分の速度で解凍する。栄養代用血液、例えばヘパリン（約１．０ ００単位）を頚静脈を経て哺乳動物に潅流させ、この哺乳動物をその正常な生体 温度まで加温する。組織機能、臓器機能および動物全体の機能が回復さ凍結保存 を細胞、例えばヒト卵母細胞、ブタ卵母細胞、胚、ヒトまたは白血球、血小板、 例えば膵島、肝細胞、角膜、皮膚について説明する。例４および５参照。本質的 に、例３，４δよび５に記載したように、種々の凍結防止剤、例えばグリセリン 、プロピレングリコールを、不凍化タンパク質と共に細胞内に導入する。５Ｍプ ロピレングリコールのような異なる凍結防止剤溶液を凍結またはガラス化のいず れかが生じるように選択する。次いて、細胞または組織を、例えば１．７５０° Ｃ／分の冷却速度または一１３０°Ｃから一１８０°Ｃまたは４にの温度にする のに必要ようなような高い冷却速度で、凍結またはガラス化か生じるように急冷 し、これらの温度に不定期間保持する。次いて、細胞または組織を注意して解凍 する。細胞機能および組織機能か回復される。

急速な凍結またはガラス化による臓器の保存手順は全臓器保存セクションに記載 したと同しである。但し、凍結防止剤濃度を５Ｍプロピレングリコールのような 高いレヘルにし、かつ冷却速度を先願における低速凍結とは対照的に所望のよう に急速な凍結またはガラス化か生しるのに十分な１．７５０”Ｃ／分のような早 い速度にする。不凍化タンパク質の使用はガラス化による臓器組織の保存を成功 させのに不可欠である。

急速な凍結またはガラス化による哺乳動物全体の保存この場合も、手順は低速凍 結により哺乳動物全体を保存する場合と実質的に同しである。但し、５Ｍプロピ レングリコールのような高濃度の凍結防止剤および１７５０°Ｃ／分のような高 い冷却速度を使用する。不凍化タンパク質の潅流は保存に不可欠である。いくつ かの例を後に記載する。

細胞の低温保存 肝臓の細胞を、先ずＡＦＧＰ水溶液と接触させる以外は、例６の手順を繰り返し 行う。これらの細胞は冷却状態で生存し、生理温度に注意しながら加温し１こ際 に生存能力を有している。

冷温貯蔵における臓器の低温保存 臓器、例えば肝臓または心臓をＡＦＧＰ水溶液と接触させる以外は、例６の手順 を繰り返す。この臓器は冷却状態て生存し、生理温度に注意しなから加温した際 に生存能力を有している。

連続潅流による臓器の低温保存 不凍化機タンパク質を含をする血液を臓器を経て連続的に潅流させる以外は、例 ７の手順を繰り返す。

冷温貯蔵による哺乳動物全体の低温保存潅流を哺乳動物全体に適用する以外は、 例７または７Ａの手順を繰り返す。

連続潅流による哺乳動物全体の低温保存この例は、不凍化タンパク質を含有する 代用血液も動物を経て連続的に潅流した以外は、上述の保存と本質的に同しであ る。

細胞、組織、臓器、哺乳動物の低温保存不凍化タンパク質を、高温損傷がら保護 するのを望む細胞、組織、臓器、哺乳動物と接触させる以外は、例６を繰り返す 。

最適でない化学的環境からの細胞、組織（皮膚）、臓器　哺乳動物の保存 高濃度の二酸化炭素のような非生理化学的雰囲気を存在させる以外は、例６の条 件を繰り返す。

細胞膜の保存 細胞膜を不凍化タンパク質を含む生理適合性溶液と接触させる。

イオン通路の閉塞 細胞膜を不凍化タンパク質を含む生理適合性溶液と接触させる。通路において、 例えばナトリウムおよびカリウムが実質的に阻止されるのか見出される。

不凍化タンパク質による結合 種々のマクロ分子を不凍化タンパク質に人工的に結合させ、次いて細胞懸濁物、 組織、臓器または哺乳動物全体中に導入する。次いで、この不凍化タンパク質を 細胞膜に結合させ、これにより分子を細胞膜の付近にもたらす。

図面の簡単な説明 次に、図面を詳細に説明する： 図ＩＡ、　ＩＢおよびＩＣ 図ＩＡは通常の凍結プロセスの開始時における生理食塩水中の凍結領域１１（ｉ ）および平坦な固−液界面を示す。［ＪＩＢは生理食塩水の凍結中における氷１ ２（ｉ）の最後の樹枝状、フィンガー状構造を示す。図ＩＣは４０ｍｇ／ｍｌの ＡＦＰを含む、生理食塩水の凍結中における氷結晶１３（ｉ）の針状構造を示す 。図ＩＡ、　１Ｂおよび１ｃに示す目盛棒１４は５０μｍである。

図１．Ａ、　ＩＢおよびＩＣは方向凝固ステージにおいて４°Ｃ／分の冷却速度 で凍結させた水溶液における氷の結晶形感を示す。図ＩＡおよびＩＢは塩水の凍 結中に起るよく知られている逐次の結果を示す。塩水中において、氷は氷の結晶 の角柱面上で形成し、成長して、顕微鏡的に滑らかな広い表面を形成する（図Ｉ Ａ）。凍結中、氷は氷−水界面に蓄積する溶質を排除する。塩濃度が大きくなる と、界面における相温度の変化に束−的な低下か生じ、過冷却による構造的不安 定性という周知の現象を経て平坦構造から図ＩＢに示すような樹枝状構造への氷 の結晶形態の変移が生しる。しかし、図ＩＣは、不凍化機タンパク質（４０ｍｇ ／ｍｌ　）の存在下では氷の結晶成長パターンが極めて異なることを示す。図１ ０は図ＩＢに示す樹枝状氷結晶より寸法の著しく小さい針状　（スパイク状）氷 結晶を示す。不凍化機タンパク質の存在下では、氷の構造は凍結プロセスの開始 時から針状である。偏光を用いると、針状氷結晶はＣ軸方向に成長していること を示す。小さい針状氷結晶はこれらの結晶の間に溶液中のＡＦＰおよび他の溶質 を取り込む。図ＩＡ、　ＩＢおよびＩＣは、溶質の取り込みかＣ軸に沿う針状水 の成長を安定化することを示す。不凍化機タンパク質の存在下では、氷の結晶が 極めて小さくなることが観察される。塩水はサブミクロンの大きさの氷針状体の 間に取り込まれる。それ故、塩水は化学ポテンシャルに存意な変化を生じさせる はと有意には濃縮されない。この結果、水は臓器内では周囲の細胞から移動せず 、脱水されず、血管を拡張させず、かつこれらの細胞を崩壊させない。

図２．Ａ、　２Ｂおよび２Ｃ 図２Ａおよび２Ｂには黒い矢２１および白い矢２２か記載され、これらの矢は縦 横に区画された洞採血管２３（ｓ）に向けられ、洞様血管２３（ｓ）は針状氷結 晶の存在を示している。針状氷結晶はすべて同じ方向に向いている。構造的に無 傷の肝細胞は洞様血管を包囲している。丸い核が若干の細胞において明らかであ り、これを白い点２４て示す。丸い氷結晶かすべての細胞において観察される。

図２０は太い血管２５（ｂｖ）における針状木構造を拡大して示している。血管 の縁を黒い矢２６で示す。隣接する細胞内の代表的な氷結晶を白い円２７で示す 。図２Ａ、　２Ｂおよび２Ｃに示す目盛棒２８は図３Ａは上述するように方向凝 固ステージにおいて４°Ｃ／分の冷却速度で凍結させた正常肝組織を示す。連続 する滑らかな氷結晶が拡張した洞採血管（Ｓ）の内側に観察される。隣接肝細胞 （ｈ）は脱水されている。

図３Ｂおよび３Ｃは表１に示す不凍化機タンパク質に類似する不凍化機タンパク 質（４０ａ＋ｇ／ｍｌ）を潅流させ、かつ方向凝固ステージにおいて４°Ｃ／分 の冷却速度で凍結させた肝臓を示す。太い血管３１（ｂｙ）の断面は血管３３内 に閉じ込められた針状氷結晶３１を示す（血管の表面は破壊中に形成される砕片 によって傷つけられる）。細胞膜に沿って破壊したボックス状肝細胞３４（ｈ） の輪郭を矢３５て示す。肝細胞の寸法および形状は正常肝細胞の代表的なもので ある。

図３Ｄは不凍化糖タンパク質を潅流させ、方向凝固ステージにおいて４°Ｃ／分 の冷却速度で凍結させた肝組織を示す。破壊は細胞膜に沿って行われ、細胞は波 形に除去されて、階段状に配置された肝細胞３６（ｈ）の後方に残る。ボックス 状の正常な大きさの肝細胞の輪郭を黒い矢３７て示す。

図３Ｅは約４０００°Ｃ／分の冷却速度で凍結させ、かつ細胞膜に沿って破壊さ れた正常肝組織を示す。細胞は波形に除去さ０て、矢て示すように、階段状に配 置された正常な大きさのボックス状肝細胞３８（ｈ）の後方に残る。胆管３９（ ｂｄ）　（カンナクルス（ｃａｎｎａｃｕｌｕｓ）は無傷で保存されている。図 ３Ａ〜３Ｅに示す目盛棒４０は１０μｍである。

図４Ａ、　４Ｂおよび４Ｃ 図４は未成熟ブタの卵母細胞の凍結保存に関する写真である。

図４Ａは一１３０°Ｃに冷却中の透明な液滴中の１個のブタ卵母細胞を示す。液 滴の暗色の環状縁か示されている。

図４ＢはＡＶＳ溶液中で一１３０°Ｃまて急冷し、次いて４４時間インビトロ培 養し、染色した後のブタ卵母細胞を示す。細胞質は完全に退化し、膜（卵細胞膜 ）は無傷（ｉｎｔａｃｔ）てはない。

図４８はＡＶＳ溶液中で急冷した後に生存能力かあるとは考えられなかった卵母 細胞の外観を示す。写真は膜（卵細胞膜）か無傷でなく、核細部か認められない 卵母細胞を示す。

図４０はＡＦＧＰを含むＡＶＳ溶液中で極低温まで急冷しても生存し、この結果 として培養核成熟においてＭ２段階培養Ｍ２に達した卵母細胞を示す。これはブ タ卵母細胞か極低温にさらされた後に生存し、インビトロ発育する条件下に開発 された最初の方法であることを強調する必要がある。

図４０は一１３０°Ｃまで急冷した後にＭ２段階に達した卵母細胞の外観を示し ている。核発育段階が明らかである。

図４Ｄは、４４時間の温置後に正常形態を示すが核成熟（ｇ、　ｖ、段階）を示 さない表１に示されているような不凍化糖タンパク質（４０ｍｇ／ｍｌ）を含む ＡＶＳ溶液中チー１３０°Ｃに急冷した後のブタ卵母細胞：無傷卵細胞膜、無傷 ｇ、　ｖ、膜、正常細胞質の形態を示す（写真の底部は若干の堆積（ｃｏ＋ｎｎ ＋ｕｌυＳ）細胞を示す）。図４の目盛棒は５０μｍである。

図４Ｄは４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰを含むＡＶＳ中で急冷された卵母細胞を示す 。この卵母細胞は核成熟を受けていない（ｇ、　ｖ、段階に留まっている）ため に、生存能力かあるとは考えられない。それにもかかわらず、細胞は無傷の卵細 胞膜および無傷のｇ、　ｖ、膜を有する正常形態を示している。図４Ｄにおける 卵細胞膜の無傷の外観は、ＡＦＧＰ溶液の存在下に冷却されたすべての卵母細胞 を代表するものであって、ＡＦＧＰの不存在下（図４Ｂ）と対比してＡＦＧＰの 効果を説明するためのものである。この−組の実験はＡＦＧＰが凍結防止効果を 有することを明示しており、この効果は厳しい温度条件にさらされた後に細胞膜 の保全性が保持されていることに関連する。

図５Ａおよび５Ｂ 図５は二細胞段階におけるブタ胚の凍結保存に関連する写真である。図５の目盛 棒は５０μｍである。

図５ＡはＡＶＳ溶液中で一１３０°Ｃまで急冷し、２４時間温置した後の二細胞 胚を示す。膜の完全崩壊が明白である。

図５ＡはＡＶＳ溶液中で急冷した後に培養したブタ胚の外観を示す。細胞は明ら かに生存能力かなく、制球膜の崩壊が完全である。

図５Ｂは一１３０°Ｃに急冷した後の二細胞段階胚から発育した正常な四細胞段 階胚を示す。写真の上部右手側は二細胞段階に留まっている胚を示す。発育に失 敗した胚においてさえ、膜の明らかな保全性か明白である。図５の目盛棒は５０ μｍである。

［Ｎ５ＢはＡＦＧＰを含むＡＶＳ溶液中で急冷した後およびインビトロ培養した 後の四細胞段階におけるブタ胚を示す。明らかに、図５Ｂに示す胚は極低温にさ らされても生存し、インビトロで正常に発育した。これは二細胞段階におけるブ タ胚の成功した凍結保存方法の最初のレポートである。

追加の重要な情報は図５Ｂに見ることができる。写真の上部右手側は二細胞段階 に留まっているブタ胚を示し、すなわち、我々の基準に従って急冷しても生存し ていなかったことを示す。

それにもかかわらず、制球膜の明らかな保全性か認められ、これは図５Ａにおけ る崩壊した膜の外観に匹敵する。

図６Ａ、　６Ｂおよび６Ｃ 図６は二細胞段階におけるマウス胚の凍結保存に関連する写真である。図６の目 盛棒は５０μｍである。

図６Ａは７２時間温置後にＡＶＳ溶液中−１３０°Ｃまでの冷却中における透明 液滴中の１組のマウス胚を示す。

図６８は縮んだ制球を有する二細胞段階に留まっている胚の１個を示し、これは 膜の損傷を意味する。第２の胚では制球膜は完全に崩壊している。

図６８はＡＶＳ溶液中で急冷した場合に生存しなかったマウス胚の外観を示す。

図６Ｂにおける１個の胚の制球は縮んでおり、これは膜の保全性が失われている ことを意味する。膜の崩壊は写真に示されている他の胚の制球においてほぼ完全 である。急冷された卵母細胞および胚の生存は、５０ｍｇ／ｍｌのＡＰを基本の ＡＶＳ溶液に加えても、改善されなかった。細胞膜の保全性はいずれにおいても 改善されず、実際上、ＡＶＳ溶液中またはＡＰを含むＡＶＳ溶液中で急冷された 胚と卵母細胞との間には生存および形態における差異は全く認められなかった。

図６０はＡＦＧＰの存在下に一１３０°Ｃまで冷却した二細胞段階のマウス胚の インビトロ培養で生成する胚盤胞の代表的な外観を示す。

４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰを含むＡＶＳ溶液中での冷却で生成する正常マウス胚 盤胞の代表的な外観を図６０に示す。ＡＦＧＰの存在下におけるマウス胚の高い 生存率８２．５％は、ＡＦＧＰの不存在下における０％の生存率と較へた際に、 ＡＦＧＰの凍結防止特性を明示するものである。

これらの結果と同様に意味のあるのは生存に関する結果であり、同様に重要なの はブタ卵母細胞における卵細胞膜およびブタ胚における制球膜の保全性がＡＦＧ Ｐの存在下に冷却した場合に保持されていることを示す顕微鏡観察である。顕微 鏡による証明は、卵母細胞および胚をＡＦＧＰの存在下に極低温まで急冷した場 合に、４５個のブタ卵母細胞のうち３５個（８２，２％）において、また２３個 のブタ胚のうち２３個（１００％）の制球において膜か無傷であったことを示す 。二細胞段階のブタ胚の保全性は図５Ｂに関してすてに説明されている。

図５および６の結果は、４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰの添加かブタ卵母細胞および ブタ胚のそれぞれについて２４．５％および２６％の生存率、およびマウス胚に ついて８２．５％の生存率のように、胚および卵母細胞の生存率を著しく改善す ることを示している。

マウス胚か生存能力に対する明白な基準を与えるため、またＡＦＧＰの存在下に おける生存率か高いため、この動物モデルは、パラメーターの研究に特に有用で ある。また、ＡＦＧＰ濃度の効果についてのパラメーターの研究の結果は上記表 ３に記載されており、２０ｍｇ／ｍｌより高いＡＦＧＰ濃度における極めて高い 生存率と１．０ｍｇ／ｍｌより低い濃度における極めて低いかゼロの生存率との 間で急激な変化を示している。

ここに示した結果は、ＡＦＧＰが極低温における異なる動物モデルの生存を容易 にすることを明示している。また、この結果は、保護機構が、極低温にさらされ ている間、細胞膜の保全性を維持するＡＦＧＰの能力に関連していることを示し ている。ＡＦＧＰに類似した形態の溶液中における凍結プロセスを変えるＡＦＧ Ｐ化合物は、時として膜の構造保全性を維持する効果を育していないこ図７Ａ、 　７Ｂおよび７Ｃは、ＡＦＧＰの不存在下（図７Ａ）、および４０ｍｇ／ｍｌの ＡＦＧＰの存在下（図７Ｂおよび図７Ｃ）に４°Ｃて４時間保存したブタ卵母細 胞を示す。これらの図面は卵細胞膜かＡＦＧＰの不存在下に（図７Ａ）損傷を受 けることを示す。生きていない細胞であってもＡＦＧＰの存在下では無傷のまま であり、またＭ２段階への卵母細胞のインビトロ発育を容易にする（図７Ｃ）。

表４の結果は、不凍化糖タンパク質の添加が細胞膜を保護する際およびイオン通 路を閉塞する際に有用であることを示す。不凍化糖タンパク質１〜５および７〜 ８（表４のフラクション）のそれぞれかイオン流れを保護しないという観察結果 、並びに不凍化タンパク質１〜５および７〜８を併用してもイオン流れを保護し ないという観察結果は、各タンパク質が異なるタンパク質およびイオン通路の保 護に有効であること、すなわち、特異的であることを示す。それ故、Ａ　ＦＧＰ はすべて完全な保護に必要であり、また個別的にこれらのＡＦＧＰは部分的な保 護を行う。

図８および９ 図８はクレブス溶液のみを潅流させ一３５°Ｃまて冷却したラット肝臓の写真で ある。

図９は南氷洋の魚から得られた２０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰフラクション１〜８（ 表１参照）を含む図８の場合と同じクレブス溶液を潅流させたラット肝臓の写真 である。

理論により拘束しようとするものではないか、ＡＦＧＰの保護効果は分子の特別 な化学構造に関連すると思われる。極低温にさらされている間に細胞膜に与えら れる保護は、膜タンパク質の親水性部とＡＦＧＰとの間に形成する結合の結果で あると考えることかできる。ＡＦＧＰにより与えられる保護は濃度に非直線的に 依存することが明らかにされており、この事は完全保護のためにはすへての結合 を細胞膜とＡＦＧＰとの間に形成させる必要があり、生存は細胞膜とＡＦＧＰと の部分相互作用によっては不可能であることを示す。

次に示す例は本発明をさらに説明し、記述し、かつ明確にするためのものである 。これらの例はいがなる限定をも意味するリン酸緩衝液（ＰＢＳ）は標準溶液で あり、ここに示すように成分を補充することができる、例えば高分子量ＡＦＧＰ 　１〜５は氷結晶構造を変化させるのに著しく関係と思われ、低分子量ＡＦＧＰ の生物学的機能は不明のままである。これらは分子量の大きい糖ペプチドより凍 結点を抑制する効果が低く、しかもこれらは極めて高い濃度で血清中に存在して いると思われる。

フラクション１〜８（表１）からの使用したＡＦＧＰは南氷洋の魚に見出される ものと互いに実質的に同じ割合である。フラクション６は魚に微量存在し、次の 実験におけるフラクション６の存在または不存在（フラクション１〜８の濃度で ）は実験において無視てきる効果を有するものと仮定する。

本発明における水溶液中のＡＦＰまたはＡＦＧＰ、特に表１のフラクション１〜 ８の好ましい濃度は約１〜５０ｍｇ／ｍｌの範囲である。

ある適用例では、２０〜４０ｍｇ／ｍｌの範囲が好ましい。

観察できるように、氷の結晶形成は血管および周囲の細胞組織および細胞膜の主 な崩壊原因である。

明らかなように、細胞膜構造は最小の崩壊を示す。細胞組織は別々に維持されて いると思われ、細胞膜は本質的に無傷に見え、血管は有意には拡張されていない 。

（ａ）年齢４５〜５０日の成熟した雌のスブラギューダウレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ −Ｄａｗｌｅｙ）ラットに外科処置の間エーテル麻酔をかけた。

腹部を正中線切開により開いて肝臓を露出させた。門脈を露出させ、カニユーレ を挿入した。直ちに、１．０００単位のへノ（リンを門脈に注入した。この処置 の次に、南氷洋の魚（デイスソスティリス　マウソニ）（表１参照）からのフラ クション１〜５および７．　５（２５／７５）の生理的組成を有する２００ｍｇ のＡＦＧＰを含有する５ｍｌの生理食塩水を注入した。随意に、グリセリン／食 塩水を肝臓を経て潅流させた。ＡＦＧＰは上記表１に示したものを用いた。ディ スソスティクス　マウソニからのＡＦＧＰと表１のＡＦＧＰとは互いに本質的に 同じ分子量および割合を有していた。

不凍化糖ペプチドＮｏ、１〜５およびＮｏ、６〜８の組合せはｌ／３Ｗ／Ｗの割 合で用いた。門脈は逆流を防ぐために直ちに締めつけた。２分間以内に、肝臓の 数個の方形試料（大きさ８Ｘ３Ｘ３ｍｍ）を、ローブ（ｌｏｂｅ）の周縁から約 ３ｍｍの所で単一半径方向レザーカットで切断し、２個のＮＯ６１カバーグラス 上に縦に載置した。全部で４回の動物実験を行った。

最初のカバーグラスを直ちに、真空下に一２１３°Ｃに維持された窒素スラッシ ュ（ｓｌｕｓｈ）中に投入した。沸騰は認められなかった。冷凍中の冷却速度は 約４．０００℃／分とした。同時に、他のカバーグラスを上述した方向凝固ステ ージに移した。試料を２５°Ｃの当初温度から３５°Ｃの最終温度まで４°Ｃ／ 分の冷却速度で凍結させた。凍結時間は約１５分であった。凍結後に、凍結試料 を直ちに液状窒素スラッシュ中に浸し、ＡＭＲＡＹ　１０００低温走査電子顕微 鏡（ＬＴＳＥＭ）に移した。試料は顕微鏡の低温室内で破壊されて、ローブの外 面から約２ｍｍの区域が露出し、金被覆され、凍結水和状態でＬＴＳＥＭの冷凍 段階に移された。

ＬＴＳＥＭから得られた写真は不規則に破壊された三次元表面の二次元像である 。写真は２００〜５．０００倍に変動する倍率で撮った。

図２Ａ、　２Ｂおよび２ＣはＡＦＧＰを潅流させ、窒素スラッシュ中で凍結させ た肝組織からの結果を示す。これらの写真はＡＦＧＰが哺乳動物の組織における 凍結パターンを変化させることを示している。図２Ａおよび２Ｂは１．０００倍 の倍率で操った凍結組織を示す。

図２Ａおよび２Ｂは凍結組織を僅かに放射エツチングした後に得られたもので、 氷結晶の輪郭を示している。個々の細胞が示されており、いくつかの細胞には核 も見られる。細胞中の氷結晶は血管中の氷結晶とは異なる。細胞の内側の氷結晶 は組織を液状窒素スラッシュに投入することにより形成した代表的な氷結晶に類 似している。これらの氷結晶は形状が丸く、ミクロン範囲の寸法を有し、細胞全 体にわたって均一に分布する。しかし、ＡＦＰを潅流させ血管中の氷結晶は著し く異なる。氷の結晶構造はサブミクロン範囲の寸法を有する針状体である。また 、この構造はＡＦＰ水溶液の冷凍中に観察される構造と極めて類似している（図 ＩＣ参照）。図２Ａ、　２Ｂおよび２Ｃは縦方向および横方向に破壊されたすべ ての血管における氷の針状結晶を示しており、この氷の針状結晶は血管の相対的 方向とは無関係に同じ方向に配向している。

これらの結果は、ＡＦＧＰの存在下に組織中に存在する水が、血管の方向には広 がらないで、安定なＣ軸方向に配向しておそらく温度勾配の方向に成長する氷結 晶を含有していることを示している。この事は、ＡＦＧＰ溶液中ての冷凍中に、 針状体間に閉じ込められた溶質か安定化し、氷結晶をＣ軸の方向のみに成長させ ることを報告している初期の研究に一致している。それ故、結晶の成長はＡＦＧ Ｐを含まない溶液を凍結させる場合とは異なりており、ＡＦＧＰを含まない溶液 を凍結させる場合には氷結晶は氷結晶の六角柱小面の異なる配向方向に沿って成 長することができ、氷結晶が細胞境界のような障害に遭遇するときはいっても方 向を変えることができる。ＡＦＰの存在下では、Ｃ軸の方向における成長は極め て安定しており、氷結晶が細胞境界に遭遇する場合には氷結晶の配向方向は変え ることができない。すべての針状氷結晶は血管境界で終わる。また、血管中の氷 結晶は隣接細胞における水の核形成を生じさせない。

太い血管中の針状氷結晶の高倍率の顕微鏡写真を図２０に示す。

血管中のサブミクロンの大きさの針状氷結晶と隣接細胞中のミクロンの大きさの 丸い氷結晶との間には有意な違いがあるのは明らかである。針状氷結晶の小さい 寸法はＡＦＰの他の潜在的な適用を教示している。最近、本発明における冷却速 度より数倍大きい極めて高い冷却速度（例えば４０．０００−１００．０００℃ ／分）が、顕微鏡法のための極めて小さい氷結晶を含有する組織試料の調製に用 いられている。本発明のＡＦＰを潅流させた凍結組織は、実験的に容易に達成す ることのできる低い冷却速度で組織中に小さい氷結晶を生成させるのに用いられ る。

図３Ａ、　３Ｂ、　３Ｃ，３Ｄおよび３Ｅは、低い冷却速度で凍結させ哺乳動物 組織の凍結パターンに対するＡＦＰの効果を示す。ＡＦＰの存在下に４°Ｃ／分 の冷却速度で凍結させた肝組織の構造を図３Ｂ。

３Ｃおよび３Ｄに示す。これらの図面をＡＦＰの不存在下に４°Ｃ／分の冷却速 度で凍結させた肝組織の構造を示す図３Ａ、およびＡＦＰの不存在下に約４．０ ００″Ｃ／分の冷却速度で凍結させた肝組織の構造を示す図３Ｅと比較する。

（ｂ）比較のために、図３ＡはＡＦＰの不存在下に低い冷却速度で凍結させた肝 組織の代表的な構造を示す。血管を囲む完全脱水肝組織の洞採血管に沿う大きい 連続氷結晶が明示されている。

低い冷却速度で凍結させた肝組織では肝細胞か脱水されているために、組織は細 胞膜境界に沿って破壊せず、このために大きい氷結晶の全体にわたって破壊を示 す。

（Ｃ）　ＡＦＰの存在下に低い冷却速度で凍結させた肝組織の形態は著しく異な る。図３Ｂおよび３Ｃは１００ＯＸおよび２０００　Ｘの倍率における太い血管 および隣接組織のそれぞれの断面を示す。代表的な例ではＡＦＰを含む冷凍溶液 中に見い比されるサブミクロンの大きさの針状木構造（図ＩＣ）は血管中で明ら かである。血管中のすへての氷結晶は同じ配向方向を有し、これらは血管境界に おいて終わっている。図３Ｂおよび３Ｃにおける針状氷結晶の構造は、同じ冷却 速度であるがＡＦＰの不存在下に凍結させた組織の血管中で観察された平滑な単 一氷結晶構造（図３Ａ）とは著しく異なる。それぞれ４．０００°Ｃ／分および ４°Ｃ／分の冷却速度の場合に得られた図２Ａ、　２Ｂ、　２Ｃおよび３Ａ、　 ３Ｂ、　３Ｃ，３Ｄおよび３Ｅは、哺乳動物組織を大きい冷却速度範囲にわたっ て冷却する場合に、ＡＦＰが類似のサブミクロンの大きさの安定な針状氷結晶構 造を生成させることを示す。

（ｄ）図３Ｂ、　３Ｃ，３Ｄおよび３Ｅにおける破壊は細胞膜に沿って生じ、こ の場合に細胞は波形に除去され、階段状に配置された肝細胞の後ろに残る。顛微 鏡写真は、脱水されているとは見えず、実際に正常な形状を保持しているボック ス様形状の肝細胞の輪郭を示している。図３Ｂ、　３Ｃおよび３Ｄを図３Ａおよ び３Ｅと比較すると、図３Ｂ、　３Ｃおよび３Ｄが細胞膜において破壊した代表 的な寸法を有する確認可能なボックス状肝細胞を示す図３Ｅと著しく多くの類似 点を有していることか分かる。脱水した肝細胞および膨張した洞様血管中の氷結 晶を示す図３Ａは有意に異なっている。

驚くべき結果は、図３Ｂ、　３Ｃおよび３ＤかＡＦＰを潅流させ、図３Ａに用い た冷却速度と類似している４°Ｃ／分の冷却速度で凍結させた試料から撮った写 真であるのに対し、図３ＥかＡＦＰの存在下に約４．０００°Ｃ／分の冷却速度 で液状窒素スラッシュ中で凍結させた肝組織の写真であることである。予想され るように、これらの高い冷却速度で凍結させた場合には、肝細胞の正常な構造か 保持され、図３Ｅの細胞膜に沿って胆汁を生成する胆管か示されている。ＡＦＰ の存在下に低い冷却速度（４°Ｃ／分）で凍結させた場合には、脱水肝細胞を細 胞膜に沿って破壊することかてきず、これらの写真は常に氷結晶を示している。

ＡＦＰの存在下に４°Ｃ／分で凍結させた肝組織の構造は４０００°Ｃ／分の冷 却速度で凍結させた組織の構造と似ていることが観察される。この結果は哺乳動 物組織での凍結パターンに対するＡＦＰの有意な効果を（ａ）例１に記載したラ ットからの全肝臓の凍結保存を臓器全体に適用した。ラットの肝臓を外科的に摘 出し、水溶液中で２４°Ｃに保持した。門脈にカニユーレを挿入した。周知のラ ンゲンドルフ潅流システム（クレブス溶液を含有する第１ボトルを使用する）を 用いた。手順は、例えば、Ｄ、　Ｅ、　Ｐｅｇｇ等（１９８６）、Ｃｒｙｏｂｊ ｏｌｏｇｙ　５Ｖｏ１．２３、ｐｐ１５０−１６０を参照されたい。

第２のボトルの溶液には、塩溶液および適当量の細胞保護剤として知られている グリセリン、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ポリ塩化ビニル　グ ルコース、よたはこれらの物質の混合物を、濃度４０ｍｇ／’ｍｌの不凍化糖ペ プチドと一緒に入れた。

コンピュータ制御混合スイッチは、コンピュータによって制御される時間の長さ 、例えば０．ＯＩ秒〜０．１秒〜１秒の間ばっと開いて、中間量の溶液１　（ク レブス溶液）および溶液２（グリセリン／食塩水／ＡＦＧＰ溶液）を供給した。

これらの２種の溶液は特別に設けた混合室内で混合された。

生理的溶液のこれらの２個のボトルを既知の調整可能な流量（例えば約５　ｍｌ ／分）を有する混合弁およびコンピュータに連結して、流量を正確に変えかつ潅 流直前に各ボトルの内容物を混合させた。ボトル１および２の溶液を用いる潅流 はＧ、Ｎ、Ａ１１ｎｋ等（１９７６）　、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　、Ｖｏｌ、 　１３　、　ｐｐ、　２９５〜３０４；（１９７７）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　 、　Ｖｏｌ、１４、ｐｐ、　４０９〜４１７および３９９〜４０８：および（１ ９７８）Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　、Ｖｏｌ、１５、ｐｐ、４４〜５８、および に、　Ｅ、　Ｆ、　Ｈｏｂｂｓ等（１９６９）、Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ　、　 Ｖｏｌ、６　、ｐｐ、２３９〜２４５に記載されているように周知である。クレ ブス溶液は４ｍ１／分の速度で２４°Ｃに保持された肝臓を経て潅流させた。

潅流液中のグリセリン／塩類／ＡＦＧＰの濃度は、約３モルのグリセリンおよび ４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰの濃度か潅流されるまで、ｏ、　ｏｏｔモル１０．１ 秒の速度で徐々に高めた。次いて、組織に追加の２０分間にわたって３モルのグ リセリン／塩類を潅流させた。次いて、溶液（ｆｆｌ器中でＡＦＧＰ　Ｏ，ＯＯ ＩＭ）で潅流された肝臓を冷却段階に置き（米国特許第４．５３１．３７３号明 細書）、次いて潅流肝臓全体の温度を一１５０°Ｃに達するまて１°Ｃ／分の速 度で冷却した。

次いて、この肝臓を液体窒素スラツシユを用いて一１９６°Ｃに冷却し、この温 度に７２時間維持した。次いで、凍結肝臓を温流体による既知の技術を用いて約 ０．１〜１０°Ｃ／分（好ましくは約り℃／分）の範囲の速度で注意しながら解 凍した。あるいはまた、注意して制御したクイクロ波加熱を用いて潅流肝臓を解 凍した。

解凍肝臓が約０°Ｃに達した時に、クレブス栄養溶液を、カニユーレが挿入され ている太い血管を経て潅流させた。３７°Ｃに温められた時に、解凍肝臓は組織 機能と共に臓器機能を回復した。

臓器の生存可能性を凍結および注意深い解凍に続く胆汁の生成により調べた。

（ｂ）上記（ａ）におけるラットの肝臓をラットの腎臓と置き換え、手順を繰り 返し、生存能力のある組織機能および回復した臓器機能を有する解凍腎臓を得た 。

（Ｃ）上記（ａ）におけるラットの肝臓をう・ノドの心臓と置き換えた場合に、 心室からの血液の直接除去を含む潅流を行うために心組織に特定のいくつかの追 加処理を行った。不凍化ポリペプチド潅流心臓を凍結させ、注意して解凍し、適 当な生物流体を潅流させた後に、生存能力のある組織機能および生存能力のある 臓器機能を有する再活性化心臓を得た。心臓の生存能力を、心筋の回復された収 縮を観察することにより調へた。

（ａ、）ラット全体の凍結保存を例１および２に記載したよう（こ行った。成熟 したラットに麻酔をかけ、頚静脈にカニユーレを挿入した。

コンピュータ制御混合スイッチは、コンピュータによって制御される時間の長さ 、例えば０．０１秒〜０．１秒〜１秒の間ばっと開いて、中間量の溶液１　（ク レブス溶液）および溶液２（グリセリン／食塩水／ＡＦＧＰ溶液）を供給した。

これらの２種または３種の溶液は送出管内あるいは随意に特別に設けた混合室内 で円滑に混合された。

先ず、クレブス溶液を哺乳動物を経て短時間潅流させた。

２、０００単位のヘパリンを添加して凝血を抑制した。

細胞用の低温保存剤として知られている溶液、例えば４０ｍｇ／−のＡＦＧＰを 含有する食塩水中の３モルのグリセリンを、ここに記載した混合スイッチ配置を 使用して、臓器を経て潅流させた。

随意に、食塩水および／または既知のフッ素化炭化水素のような代用血液を潅流 溶液に添加した。

次いでラットにグリセリン／食塩水／ＡＦＧＰ溶液（例えば、例１のもの）を１ ０ｒｒｄ！／分のパルス流量で２０分間潅流させた。哺乳動物の体温は２°Ｃよ り低い温度まて低下した。次いで、この哺乳動物を外部から内部まで１°Ｃ／分 の速度で冷却した。

次いて、このラットを一１５０°Ｃに冷却し、この温度に７日間保持した。次い て、この凍結した動物を酸素／窒素（２０／８０．　ｖ／ｖ）の存在下に０°Ｃ まで１０７分の速度で注意深く解凍した。クレブス溶液、ユーロコリンス溶液、 ライスコンシン大学（ＵＷ）溶液のような栄養代用血液溶液を頚動脈血管を介し てラットを経て潅流させ、凍結した動物をその正常生体温度（約３７°Ｃ）まで 徐々に加温した。組織機能、臓器機能および生存能力のあるラット全体の機能か 回復した。

気工 未成熟ブタの卵母細胞およびブタ胚の凍結保存未成熟ブタの卵母細胞をＭａｔｔ ｉｏｌｉ等（２０）による手順により、屠殺後２０°Ｃて２０分してから、サク イリック雌ブタ（ｃｙｃｌｉｃ　ｓｏｗ）の選定された卵胞から分離した。二細 胞段階のブタ胚を思春期前の未経産雌ブタ（平均体重９０Ｋｇ）から採取した。

発情誘導を１２５０１、肌の妊娠雌鳥血清ゴナドビン（Ｐｒｅｇｎａｎｔ　Ｍａ ｒｅ　ＳｅｒｕｍＧｏｎａｄｏｐｉｎ）（ＰＭＳＧ）（シグマ社、米国ミズーリ 州セントルイス）を投与し、次いて、５６時間後に７５０１．０．のヒト紫膜ゴ ナトロピン（Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ　Ｇｏｎａｄｒｏｐｉｎ）（ＨＣ Ｇ）（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）を投与することにより行った。

２回の人工受精をＨＣＧ注射から３４時間後および４６時間後に行った。ＨＣＧ 注射を用いる手術から６０時間後に、全身麻酔下に中腹部開腹鏡を用いる手術に より二細胞胚を動物から採取した。

低温にさらすための準備として、先ず胚および卵母細胞を、０．１Ｍのスクロー スおよび２０％のＦｅ２を含む１ｍｌのＰＢＳ中に２２°Ｃて導入した。これに 次いで、Ａｒａｖ（２１）により開発された手順により、５％のグリセリン、Ｏ ，ＩＭのスクロースおよび３５％のプロピレングリコールを含有する１ｍｌのＰ ＢＳと３分間にわたり徐々に混合した。胚および卵母細胞を、ＡＶＳまたはＡＦ ＧＰもしくはＡＦＰを含有するＡＶＳのいずれかの０．１μｍ液滴（液滴当り１ 個の胚または卵母細胞）をつけたスライドに移した（実験の条件およびパラメー タを表４に示す）。冷却前に、ブタの卵母細胞および胚をスライド上で６分間に わたり２２°Ｃで温度した。

別の実験において、卵母細胞および胚を含有する液滴に上述した冷却／加温計画 を適用した。冷却／加温プロセスを、１２０×および３４０×の倍率を有するラ イフ　ダイアプラン（ＬｅｉｔｚＤｉａｐｌａｎ）顕微鏡に取付けた記録用ビデ オカメラを用いて監視した。図４Ａは１．７００°Ｃ／分の速度で一１３０°Ｃ まて冷却する間における透明液滴の内側のブタ卵母細胞の代表的な外観を示して いる。すべての実験において、液滴は３４０×の倍率で透明てあり、これは肉眼 で見える氷結晶の不存在を示す。１．７００°Ｃ／分で加温中に、透明な液滴は 図４Ａおよび６Ａに示す液滴と同じ外観を保有していた。顕微鏡による観察から 、胚および卵母細胞の形感が冷却中および加温中に変化しなかったことが分かっ た。

加温後に、細胞培養において生存能力をアブセイする準備として、ブタの卵母細 胞および胚を、２０％のＦＣＳおよびＩＭのスクロースを含有する１［［１１の ＰＢＳ中に室温（２２°Ｃ）で３分間にわたって導入し、次いで２２°Ｃで１０ 分間にわたり２０％のＦＣＳを含有するＰＢＳ中に移し、平衡させた。

細胞培養前に、すべての胚および卵母細胞を細胞培地中で３回洗浄した。ブタ卵 母細胞を、５μｇ／ｍｌのヒツジの黄体形成ホルモン（ＮＩＨ５２０）　、ブタ の卵胞刺激ホルモン（ＬＥＲ４４１−２）および２０ｍｇ／ｎ＋１のブタ　プロ ラクチン（ＬＥＲ２０７３）を含有するように変えたＴＣＭ−１９９培地で培養 した。ブタ胚をグルコースを含まないプリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）培地て 培養した。細胞培地中で平衡させた後に、卵母細胞および胚を５％のＣＯ２を含 有する空気下にブタ卵母細胞については４４時間およびブタ胚については２４時 間にわたり３７°Ｃで温度した。

ブタ卵母細胞を酢酸アルコール（１：　３Ｖ／Ｖ）中て４４時間温１した後に固 定し、ラクモイド・スティン（ｌａｃｍｏｉｄ　５ｔａｉｎ）て染色した。未成 熟ブタの卵母細胞の生存能力を、位相差顕微鏡（２０）を用いて、インビトロて 胚胎（ｇｅｒｍｉｎａｌ　ｖｅｓｉｃｕｌａｒＸｇ、ｖ、）段階から第１中期幅 ｒ）または第２中期Ｑ！ｎ）に発育して正常形態（細胞質緻密性、完全卵細胞膜 、可視核段階）を示す能力により評価した。二細胞段階のブタ胚の生存能力を、 培養の際に完全形態（細胞膜および細胞質）を維持しながら四細胞段階に発育す る能力により評価した。インビトロ培養は四細胞段階で停止した。その理由は、 インビトロ培養した際にしばしば早期段階のブタ胚が四細胞閉塞（ｆｏｕｒ−ｃ ｅｌ、１　ｂｌｏｃｋ）に遭遇するからである。それ故、さらに温！しても極低 温にさらされた後に胚の生存能力を評価する実験目標にとって有用でなかった。

以下に記載する変更を除いて、例４に記載した手順を繰り返した。

二細胞段階におけるマウス胚を、ＣＢＡ／ＣａＪ雄と一匹づつ１対にした４週間 生育したＣ、ｔＢｌ／ＧＪマウスから得た。雌には５〜７．５１、Ｌｌ、のＰＭ ＳＧ（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）に次いで、４８時間後ｉ：：５ 〜７．５１．ＵＪ）　ＨＣＧ　（シグマ社、米国ミズーリ州セントルイス）を腹 腔内注射することによって、過剰排卵を誘発させた。受精後４０時間してから、 卵管をマウスから摘出し、二細胞胚を洗浄し、生理食塩水（ＰＢＳ）媒質中で貯 蔵した。

低温にさらすための準備として、マウス胚を例３に記載したように１ｍｌのＰＢ ＳおよびＦＣＳ中に導入した（また、実験条件は表７に示した）。冷却前に、マ ウス胚をスライド上で４°Ｃて１２分間にわたり温度した。

図６Ａは、１．７００°Ｃ／分の速度て一１３０°Ｃまて冷却中の透明液滴の内 側のマウス胚の代表的な外観を示している。すへての実験において、液滴は３４ ０×の倍率で透明のままてあり、これは見える氷結晶が存在していないことを示 す。１．７００°Ｃ／分で加温中に、透明液滴は図４Ａおよび６Ａにおけると同 じ外観を保持していた。胚および卵母細胞の形態は冷却および加温中に変化しな かったことをか顕微鏡観察によって分かった。

加温後に、細胞培養で生存能力をアッセイする準備として、例３に記載したよう に、マウス胚を２０％のＦＣＳおよび１！ｌ（のスクロースを含む１ｍｌのＰＢ Ｓに４°Ｃで３分間さらし、次いで２０％のＦＣＳを含有するＰＢＳに移し、室 温（２２°Ｃ）で１２分間にわたり平衡させた（２１）。細胞培養前に、すべて の胚を細胞培地中で３回洗浄した。マウス胚をＴ６ホイツテインハム培地（Ｗｈ ｉｔｔｉｎｇｈａｍｍｅｄｉｕｍ）（２１）に入れた。

細胞培地で平衡させた後に、マウス胚を空気中５％のＣＯ２の存在下に３７°Ｃ で７２時間にわたり温度した。

極低温にさらした後にマウス胚の生存能力を、正常な膨張形態を示しなから胚磐 胞段階までインビトロ発育する能力により評価した。実験結果は先に説明した通 りて、表１に示されている。

ブタ卵母細胞をＡＦＧＰの存在下にガラス化させる実験中に、２４％の卵母細胞 および２６％のブタ胚のみか急冷にもかかわらず生存していることが分かった。

しかし驚くへきことには、１００％近くの細胞膜が無傷のままであることが観察 された。他方ＡＦＧＰの不存在下ては細胞膜は１００％破壊された。ブタ卵母細 胞か＋１０°Ｃより低い温度で生存できないことが報告されているために、０“ Ｃより高い温度に２けるブタ卵母細胞に対するＡＦＧＰの効果を調べた。

未成熟のブタ卵母細胞を、Ｍａｔｔｉｏｌｉ等による手順により、屠殺後２０° Ｃで２０分してからサイクリリック雌ブタの選定した卵胞から得た。次いで、卵 母細胞を０．４ｗ／ｖマイクロモル（ｍｉｃｒｏｍ）／ｍ１のＢＳＡ　（ウシ血 清アルブミン）　、０．３４ｍＭのピルビン酸塩、５．５ｍＭのグルコースおよ び７０マイクロモル／［０１のカナマイシンを補給した塩水中に異なる濃度のＡ ＦＧＰ　（フラクション１〜８）を含む溶液を収容したビン中に導入した。この 実験に用いたＡＦＧＰはノトテニア科（ディスソステイクス　マウソニ）に属す る南氷洋の魚から得た。ＡＦＧＰの生理的組成物としては、１重量部のＡＦＧＰ フラクション１〜５および３重量部のＡＦＧＰフラクション７および８　（Ａ、 　Ｌ、　Ｄｅｃｒｉｅｓ同上から入手できる）を含有する組成物を、大部分の実 験で用いた。また、ＡＦＧＰフラクションｌ〜５およびＡＦＧＰ　７〜８を別々 に使用して実験を行った。種々の実験パラメ−夕を表１に示す。ＡＦＧＰの保護 効果を調べるために、卵母細胞を定温室内で４°Ｃの定温に４〜２４時間さらし た。卵母細胞を４℃の雰囲気から取り出した後に、卵母細胞の保全性をＭａｔｔ ｉｏｌｉ等による手順により、室温２２°Ｃで卵母細胞の静止膜電位を測定する ことにより調べた。細胞内電圧の測定はホウケイ酸ガラス管から作った単一微小 電極を用いて行った（Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、　ＦＤＲ）。

（極を水平ブーりて引張り、２Ｍ　ＫＣＩを充填した。電極の抵抗を１０〜２０ メガオーム（Ｍｏ）にした。膜電位を記録するために、微小電極の先端を、ノマ ルスキー光学素子（Ｎｏｍａｒｓｋｉ　ｏｐｔｉｃｓ）を装着したライフ　フル オバー）　（Ｌｅｉｔｚ　Ｆｌｕｏｖｅｒｔ）顕微鏡により４００×の倍率にわ たって割面できる極微操作装置を用いて細胞の表面に導いた。先端か細胞の表面 を丁度くぼませた時に、増幅器の容量補償を変えることにより誘導される電気的 振動を短時間生じさせることにより、最終貫入を達成した。電位の値は少なくと も１〜２秒間一定であり、この値を記録した。静止膜電位は膜保全性についての 極めて敏感な基準である。さらに、実験を行って低温条件にさらされた後のある 卵母細胞の生存能力をめた。数個の卵母細胞を基本のＰＢＳ溶液中に４０ｍ（Ｂ ／ｍｌのＡＦＧＰ１〜８を存在させた溶液および存在させなかった溶液に４°Ｃ て４時間さらし、５μｇ／ｍｌのヒツジの黄体形成ホルモン（ＮＩＨ５２０）、 ブタの卵胞刺激ホルモン（ＬＥＲ４４１−２）および２０ｎｇ／ｍｌのブタのプ ロラクチン（ＬＥＲ２０７３）を含存するように変えたＴＣＭ−１９９培地中で ５％二酸化炭素の存在下に３７°Ｃで４４時間にわたって温室した。温室後に、 卵母細胞を酢酸／エチルアルコール（１：２Ｖ／Ｖ）に固定し、ラクモイド　ス ティンで染色した。未成熟ブタの卵母細胞の生存能力を、位相差顕微鏡を用いて 、インビトロで当初の胚胎（ｇ、　ｖ、　）段階から第１中期Ｍｌまたは第２中 期Ｍ２に発育して正常形態（細胞質緻密性、完全卵細胞期、可視核段階）を示す 能力により、評価した。また顕微鏡観察により膜の構造保全性の定性的評価を行 うことができた。

各実験において、両基準についての結果を表４に示す。すべての測定値の平均値 は一３１ｍＶであり、標準偏差は４．５ｍＶであった。これらの値はブタ卵母細 胞についての膜電位の正常範囲内であった。測定電位は極めて敏感であり、膜保 全性の評価手段として認められることが明確であった。表４から、組合せたＡＦ ＧＰフラクション１〜８は、卵母細胞を低温条件にさらすことにより誘発される 損傷から卵母細胞を保護することか明らかである。氷結晶は４°Ｃでは存在しな いから、保護は南氷洋の魚の糖タンパク質と卵細胞膜との間の相互作用によって 生じる筈である。°それ故、実験のこの部分はＡＦＧＰか膜を直接保護すること を示しており、これは従来報告されたことかなかったＡＦＧＰの特性である。保 護レベルはＡＦＧＰａ度の一次関数ではなく、潅流中に約１　ｍｇ／ｍｌで飽和 に達し、０．１ｍｇ／ｍｌの低い値に低下した。これはタンパク質−タンパク質 の相互作用の代表的な特性であって、この相互作用は糖ハンバク質が卵細胞膜上 の利用できる部位に結合することにより保護作用を提供することができ、またす へての利用できる部位が占有された場合にのみ保護作用を提供することかできる ことを示す。これらの利用できる部位は膜タンパク質である。また、表４はＡＦ ＧＰ　１〜８の全生理的組合せが保護に必要であること、およびＡＦＧＰ　１〜 ５とＡＦＧＦ７．　８とが別々では膜を保護しないことを示している。この結果 が極めて驚くべきものであるのは、相転移温度を低下させかつ氷結晶形成を抑制 するＡＦＧＰの効果に関する研究から、ＡＦＧＰフラクション１〜５がＡＦＧＰ フラクション１〜８の全組合せとほとんど同様に効果的に相転移温度を低下させ ることが分かったからである。他方、ＡＦＧＰフラクション１〜５は単独では細 胞を保護しないし、ＡＦＧＰフラクション７および８も単独では細胞膜を保護し ないことか明らかである。この現象の可能性のある説明は、長さの異なるすべて の異なるタンパク質が膜の可能性のあるすべての部位への結合に必要であり、ま た可能性のあるすべての漏洩部位およびイオン通路を閉塞するのに必要であるこ とである。

４時間にわたり４°Ｃにさらし、４４時間温１した卵母細胞を顕微鏡で評価して 、静止膜電位の測定によって得られた結果を確かめた。ＡＦＧＰの不存在下に、 ２〜２０個の卵母細胞だけが完全な卵細胞膜を保持しく１０％）、１個の卵母細 胞もインビトロで成熟しなかった（０％）。図７ＡはＡＦＧＰを含まないＰＢＳ 中で４°Ｃで保存した卵母細胞の外観を示す。卵細胞膜は明らかに完全でなく、 細胞質は退化していた。これに対して、４０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰの存在下では １１〜１８個の卵母細胞が完全な卵細胞膜を保持していた（６１％）（図７Ｂ） 。この結果は、さらに、ＡＦＧＦが損傷を与える低温条件ににさらされた細胞の 卵細胞膜を保護することを示し、この結果は静止電位の測定と一致している。２ ５％近くの卵母細胞が生存し、図７０に示すようにＭ２段階まで成熟した。

手順は例１に記載したものと本質的に同じである。

実験は年齢４５〜５０日の成熟した雌のスプラギューダウレイラットを使用して 行った。ラットに外科処置によりエーテル麻酔をかけた。腹部を正中線切開によ り開いて肝臓を露出させた。

胆管を露出させ、カニユーレを挿入した。胆汁を集め、生存能力の基準として用 いた。門脈を露出させ、カニユーレを挿入した。直ちに、１．０００単位のヘパ リンを門脈に注入した。肝臓を摘出し、門脈を経て基本のクレブス溶液で洗浄し た。その後に、あるモデルにおいては、２０ａ＋ｇ／ｍｌのＡＦＧＰフラクショ ン１〜８（魚に見い出された生理的組成物中）（ノトテニア科ディスソスティク ス　マウソニに属する南氷洋の魚から得た）を含有する３ｍｌのクレブス溶液を 門脈を経て注入した。次いて、この肝臓を４°Ｃの冷凍器内に６時間入れておい た。その後に、この肝臓を取り出し、これに体温のクレブス溶液を潅流させ、体 温３８°Ｃに維持したプレート上に保持した。胆汁の生成量を生存能力について の基準として調べた。この試験は生存能力の最良の総括的表示を与えると考えら れる十分に受け入れられている基準である。結果は、ＡＦＧＰの存在下では胆汁 の生成速度か４°Ｃにおいて６時間後に当初レベルの約８５％であることを示し た。ＡＦＧＰの不存在下では、胆汁の生成速度は正常レベルの約２０％まで低下 した。３回の動物実験を対照およびＡＦＧＰ含有溶液の両者につ年齢５０〜５５ 日のスブラギューダウレイ　ラットから肝臓を外科手術により摘出した。腹膜腔 をネアンブタール麻酔下に入れた。胆管にＰＥ−３０ポリエチレン製カテーテル を挿入し、胆汁を外科処置の間１０分間にわたって採取した。肝臓を隣接組織か ら部分的に動かすことかできるようにした後に、１６ゲージ「テフロン（ＴＥＦ ＬＯＮ）Ｊ　（登録商標）製静脈用カテーテルを門脈内に導入し、３ｍｌ注射器 を用いて１．０００単位のヘパリンを含有する３、０ｍｌの潅流用緩衝液を速や かに潅流させた。上大静脈の遠位を横に切開し、門脈カテーテルに、外科処置の 残りからのＯ″Ｃで０２およびＣＯ２の９５５混合物に予め平衡させたクレブス 溶液を潅流させた。上大静脈を腎静脈の上で縛り、隣接する腹膜後の組織から離 し、カテーテルを右肩を切開することによりＰＥ　−２０５ポリエチレンを上大 静脈内に取り付けた。この時に流出液の試料を採取した。次いで、肝臓全体を周 囲組織から注意しながら切り離し、温かい塩水で洗浄した。

貯蔵および単離臓器における潅流 肝臓を試験するために、「テフロン」の潅流線（ｐｅｒｆｕｓｉｏｎｌｉｎｅ） を取り外し、南氷洋のノトテニア科の魚（ディー・マウソニ）からの２０ｍｇ／ ｍｕのＡＦＧＰフラクション１〜８を含むクレブス溶液３ｍｉをカテーテルを経 て注射した。次いで直ちに、肝臓全体を冷クレブス溶液を収容する容器内に入れ 、定温装置に戻した。この装置および肝臓を４°Ｃの一定温度に維持した。この 肝臓を６．１２および２４時間貯蔵した。

貯蔵プロセス後に、肝臓を取り呂し、２０ｍ１のクレブス溶液を周囲温度で注射 してＡＦＧＰ溶液を除去した。この肝臓を９５％酸素と５％二酸化炭素との混合 物と予め平衡させたクレブス溶液を含有するようにしたシングル　バス　ラーゲ ンヅ（ｓｉｎｇｌｅ　ｐａｓｓＬａｒｇｅｎｄｓ）ｒｆタイプ潅流回路に挿入し た。次いて、肝臓およびカテーテルの位置に注意しながら流量を５ｍ１／分から ２５［Ｄ１／分まで増加させた。肝臓に５０分間潅流を行った。肝臓からの流出 液を０〜５．５〜１０および１０〜２５分の間隔て連続的に採取した。

さらに、胆汁を１５分間隔て採取した。

対照 貯蔵した肝臓の対照研究のために、肝臓に３ｍｌのクレブス溶液を注射した。次 いで、ＡＦＧＰを加えないで上述した試験研究条件を使用して処理を行った。温 かい対照肝臓の場合、肝臓を直ちにシングル　バス潅流回路に挿入し、必要とす る流出液および胆汁試料を採取した。

各肝臓から採取した胆汁を調べ、表に記載した。採取した流出液を乳酸デヒドロ ゲナーゼ（ＬＤＨ）活性について試験した。ＬＤＨについての酵素アッセイを、 標準比色技術（シグマ社ディアクソスティクス・キット（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｓ　ＫＩＴ）５００）を用いて行った。可視紫外用分光光度計を用いた。

実験は３５匹のラットで行った。各実験点は３〜５回の動物実験を示す。

胆汁の流れは、肝臓をシングル　バス潅流システムに連結した後、３〜５分以内 に始まった。胆汁の流れは５分間の潅流中良好に維持された。ラット肝臓は胆汁 酸塩を生成しないので、任意の摘出した肝臓からの胆汁の生成は約５０分より長 く維持することはできなかった。胆汁の生成量は２回目の採取中に平坦域に達し 、潅流継続中このレベルを維持した。図１Ｏは二回目の採取からの胆汁生成量を 貯蔵時間６，１２および２４時間に対してプロットとしたグラフである。図１Ｏ は、貯蔵時間が長くなるにつれて、胆汁生成量か次第に減少して行くことを示す 。右下ハツチングカラムはクレブス溶液中にＡＦＧＰを存在させて貯蔵した肝臓 からの胆汁生成量を示す。右上りハツチングカラムはクレブス溶液のみを用いて 貯蔵した肝臓を示す。ＡＦＧＰを用いて貯蔵した肝臓からの胆汁生成量か全貯蔵 時間にわたって有意に増加した。胆汁の流れは２４時間貯蔵後に有意に減少した が、ＡＦＧＰを用いた場合の胆汁生成量はクレブス溶液のみを用いて貯蔵した肝 臓より改善されていることを示した。

ＡＦＧＰを用いた２４時間貯蔵実験において、潅流プロセス中の代表的なＬＤＨ 活性は図１Ｏの右下りハツチングカラムによって示される。右上りハツチングカ ラムは対照の肝臓潅流からの結果を示しており、クレブス溶液中に貯蔵した肝臓 は右上りハツチングカラムによって示されている。ＡＦＧＰ潅流貯蔵肝臓の場合 には、酵素の放圧は潅流の最初の５分間に最大となり、次いてその後に対照レベ ル近くまで低下した。また、クレブス溶液貯蔵肝臓では潅流の最初の５分間に最 大に達した。しかし、その後の活性レベルの低下は対照レベルより有意に高いま まであった。

酵素比色試験を用いた場合に、ＬＤＨ活性からのこれらの結果はＡＦＧＰの膜保 護能力を示す。ＬＤＨ活性の高レベルの減少は膜の損傷と関連して報告されてい るから、この試験は肝細胞膜の保全性を示すものである。ＬＤＨ試験の結果は、 ＡＦＧＰ中で貯蔵された肝臓の場合には、活性が有意に低下することを示してお り、これは細胞膜に対する損傷か少ないとこを示す。これらの結果から、貯蔵プ ロセス中ＡＦＧＰか細胞膜を保護していることは明らかである。胆汁生成量が増 加することによって示されるように、ＡＦＧＰによる膜の保護はクレブス溶液単 独に比へて良好な保存能力をもたらした。

成体のウサギ心臓を用いて予備実験および対照実験を並行して行った。

２匹の白色の実験用ウサギ（体重はそれぞれ２〜３　ｋｇ）に麻酔をかけた。各 心臓を外科的に摘出した。対照心臓にクレブス溶液を５°Ｃて３０秒間潅流させ 、大動脈室（ａ、ｏｒｔａ　ｃｈａｍｂｅｒ）に５ｍｌの標準クレブス溶液（５ °Ｃ）を注射した。他方の心臓にはクレブス溶液を５”Ｃで３０秒間潅流さぜた 。大動脈室にを標準電気泳動により精製した２０ｍｇ／ｍｌのＡＦＧＰフラクシ ョン１〜５および７〜８（表１　）　（２５／７５　ｗ、ｗ）を含有する標準ク レブス溶液（５”Ｃ）を注射した。各心臓を直ちに５°Ｃのクレブス溶液を収容 する小さい試験管内に入れ、約０°Ｃの氷／水溶液中に入れた。

対照心臓（ＡＦＧＰを使用せず）を０°Ｃに４時間にわたって保持し、次いでラ ンゲンドルフ潅流システムに連結し、クレブス溶液（随意に若干のグルコースを 含有させる）を３７°Ｃで１時間にわたって潅流させた。この１時間の間、大動 脈は弱く（あるいは早く不規則に）鼓動していた。３７°Ｃ（生理的温度）で１ 時間経過した時に、大動脈圧は約２７ｍｍ水となり、大動脈の流れは無視でき、 心臓を通る流量は約２　ｃｃ／分てあった。この心臓は活発でなく、１分間に約 ３０回鼓動していた。視覚的に、心組織の諸部分は死んでいるように、または死 にかかっているように見えた。

また、実験用心臓（ＡＦＧＰ使用）を０°Ｃに４時間にわたって保持し、次いで ランゲンドルフ潅流装置に連結し、３７°Ｃてクレブス溶液（随意にグルコース を含有させる）を潅流させた。３７°Ｃで１時間経過した時に、大動脈圧は１０ ０ｍｍ水を越え、大動脈の流れは１２ｃｃ／分となり、約４７ｃｃ／分の心臓血 管流量か測定された。この心臓は活発て、１分間に約１６０回鼓動していた。視 覚的に、心臓は強壮に見え、これらの測定値は正常の心臓についての値に近かっ た。

例８ 二細胞段階におけるマウス胚を、４０ａ＋ｇ／ｍｌの不凍化糖ペプチドを含むＴ 、ホイッティンハム培地に導入し、５％ＣＯ□雰囲気の存在下に３７°Ｃで７２ 時間温１した。偶然にも、ＣＯ□濃度は約８％に増加し、温度は変動はしたが大 部分の時間の間４０°Ｃより高い温度であった。最適雰囲気ではない条件下に温 度した後に、不凍化タンパク質の存在下では８０％に近いマウス胚が胚盤胞段階 まで発育したが、不凍化タンパク質の不存在では５０％未満のものか胚盤胞段階 まで発育した。この結果は、低温および細胞と適合しない化学的雰囲気における 不凍化タンパク質の他の有用な性質を示すものである。

ここには本発明のいくつかの具体例のみを示しかつ記載したが、生存能力のある 植物または動物の細胞、あるいは解凍した際に細胞、組織、臓器または動物また は動物が生存能力を持っている生存能力のある組織または生存能力のある臓器ま たは生存能力のある植物または動物を保存する組成物および方法において、本発 明の思想および範囲を逸脱することなく種々の変更および変化を加えることかで きることは、当業技術者にとって明らかである。次に記載する請求の範囲の範囲 内に入るすへてのこのような変更および変化を実施することかできる。

ＦＩＧＵＲＥ　Ｖ（ Ｆ二〇どＲ：８ 瓢 （１，イｂ５Ｌヒさらし几イ【め正＄月鍵１１イが関するηＦ（ツ剰召月乞−肖 ［レタｒに要　約　書 本発明は低温および高温、または非生理化学的条件にされさられた生存能力のあ る植物または動物の細胞膜および組織を保護および保存するのに有用であり、か つ生物植物または動物の細胞または組織中の液体の凍結プロセスを変えるのに有 用である有機分子のような物質の水性組成物に関する。特に、本発明は例えば北 氷洋および南氷洋の魚の体液または血清から誘導した不凍化ポリペプチドまたは 不凍化糖ペプチドの使用に関する。

好ましい不凍化化合物は多重アラニン−アラニン−トレオニン−またはアラニン −アラニン−アラニン−セグメントを有するポリペプチドに関連している。いく つかの例において、ペンダント糖基は各トレオニン部分に共有結合している。ペ プチドまたは糖ペプチドの水溶液を細胞：卵子、精液、卵母細胞、胚、組織、臓 器、またはすべての生存している植物または動物と接触させる。次いて、細胞、 組織、臓器たまは植物または動物を０°Ｃまたはこれ以下（ある場合には一１９ ６°Ｃまたは４Ｋ）に注意して冷却および／または凍結し、低い凍結（またはガ ラス化）温度に維持する。氷が主としてＣ軸に沿って形成すると、その結果とし て細胞膜は破壊されず、細胞は脱水されない。細胞、組織、植物または臓器また は動物の全体を注意して解凍すると、これらのすべては生存能力かあることか認 められる。特に、保存臓器はヒトへの臓器移植に有用である。

ＰＣＴ／υＧ９１１００３５１

Claims (46)

【特許請求の範囲】
1. １．低温または高温の条件または非生理化学的条件に曝された生存能力のある植 物または動物の細胞膜を保護および保存するのに有用な組成物において、 少なくとも１種の生体適合性物質および生体適合性水溶液を含有することを特徴 とする生体材料の生存を改善する組成物。
2. ２．前記生体適合性物質がガラス化する溶液中で急冷された細胞の生存力を向上 させる物質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
3. ３．さらに、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジメチ ルスルホキシド、ポリビニルピロリドン、グルコース、プロパンジオール、カル ボキシメチルセルロース、またはこれらの化合物の混合物を含有することを特徴 とする請求の範囲第２項記載の組成物。
4. ４．生存能力のある動物細胞膜は卵子、精液、胚、細胞、組識、臓器全体または 動物全体から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組 成物。
5. ５．生存能力のある生体を再生するために低温または高温の条件または非生理化 学的条件に曝される細胞、卵子、精液、卵母細胞、胚、酵素、組織、臓器、また は植物全体または動物全体を生存能力を有する状態で保存する際；熱、放射、ま たは化学的条件によって損傷を受けた組織を医学的に処理する際；食品を保存す る際；皮膚組織を回復、保護または修復するのに使用する化粧品中；および細胞 におけるナトリウムーカリウムポンプの不均衡と関連する疾病を医学的に治療す る際に使用される不凍化糖ペプチドを含有することを特徴とする請求の範囲第１ 項記載の組成物。
6. ６．生体適合性物質は南氷洋のノトテニア科の魚からフラクション１〜５、６、 ７および８としで得られた不凍化糖タンパク質と実質的に同じペプチドから選択 されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
7. ７．不凍化糖ペプチドの約２５重量％がフラクション１〜５であり、約７５重量 ％がフラクション７および８であることを特徴とする請求の範囲第６項記載の組 成物。
8. ８．ヒトの細胞、組織、または臓器の細胞膜、またはヒト全体を保存するのに使 用されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
9. ９．生存能力のある植物または動物の細胞膜を保護または保存するに当り、 前記生存能力のある植物または動物の細胞膜を、受け入れることのできる濃度の 請求の範囲第１項記載の組成物と接触させることを特徴とする細胞膜を保護また は保存する方法。
10. １０．生体適合性物質を２０〜５０ｍｇ／ｍｌの溶液として血管内に存在させる ことを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
11. １１．動物の体液の通常の生理的凍結点より高い温度または低い温度で、あるい は非生理化学的条件で、少なくとも１種の動物臓器または動物組織または動物全 体を保存するのに有用な組成物において、 氷の結晶のｃ軸に沿った氷の結晶成長を促進させ、かつ氷の結晶のａ軸に沿った 氷の結晶成長を抑制する少なくとも１種の生体適合性物質、および生体適合性水 溶液を含有することを特徴とする生体材料の生存を改善する組成物。
12. １２．少なくとも１種の生体適合性物質はポリペプチド、糖ポリペプチド、また は担体に共有結合しているポリペプチドまたは糖ポリペプチド、またはこれらの 混合物から成ることを特徴とする請求の範囲第１１項記載の組成物。
13. １３．ポリペプチドまたは糖ポリペプチドは天然の動物源から得られたものであ るか、あるいは天然の動物源から得られたポリペプチドまたは糖ペプチドと実質 的に同じものであることを特徴とする請求の範囲第１２項記載の組成物。
14. １４．ポリペプチドはーアラニン−アラニン−トレオニン−またはーアラニン− アラニン−アラニン−の多重領域を有し；糖ポリペプチドはーアラニン−アラニ ン−トレオニンの多重領域を有し、このトレオニン残基の実質的にすべてに二糖 類β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→３）−２−アセトアミド−２−デオキシ −α−Ｄ−ガラクトピラノースが共有結合していることを特徴とする請求の範囲 第１３項記載の組成物。
15. １５．ポリペプチドまたは糖ペプチドの分子量は２．０００〜５０．０００ダル トンであることを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組成物。
16. １６．さらに、独立的に、個々の細胞を凍結による損傷から保護することが知ら れているグリセリン、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ポリビニル ピロリドン、グルコース、プロパンジオール、カルボキシメチルセルロースおよ びこれらの化合物の混合物からなる群から独立的に選択された化合物を含有する ことを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組成物。
17. １７．動物の体液の通常の生理的凍結点より高い温度または低い温度で、あるい は非生理化学的条件で、動物細胞、動物組織少なくとも１種の動物臓器または動 物全体を保存するのに有用な組成物において、 交互に配列された疎水性領域および親水性領域を有し、これらの領域はそれぞれ 約１６〜１７オングストロームの間またはそれぞれ１９〜２０オングストローム の間繰り返えされている少なくとも１種の生体適合性マクロ分子を含有すること を特徴とする生体材料の生存を改善する組成物。
18. １８．交互に配列された疎水性領域および親水性領域は、それぞれ約１６．５オ ングストロームまたはそれぞれ約１９．５オングストローム繰り返されているこ とを特徴とする請求の範囲第１７項記載の組成物。
19. １９．マクロ分子は魚、両生動物、鳥、無背惟動物、または爬虫類から得られた ものであることを特徴とする請求の範囲第１７項記載の組成物。
20. ２０．組織、臓器、または動物全体はヒトからのもの、あるいはヒトそのもので あることを特徴とする請求の範囲第１３項記載の組成物。
21. ２１．生体適合性マクロ分子は少なくとも１種の不凍化糖ペプチドから成ること を特徴とする請求の範囲第２０項記載の組成物。
22. ２２．不凍化タンパク質はペプチド、糖ペプチド、または生体適合性担体に共有 結合しているペプチドから選択したものであることを特徴とする請求の範囲第２ １項記載の組成物。
23. ２３．不凍化糖ペプチドの分子量は約２．２００〜４０．０００ダルトンである ことを特徴とする請求の範囲第２２項記載の組成物。
24. ２４．不凍化ペプチドは両生動物、爬虫類、昆虫、虫、北氷洋の魚、または南氷 洋の魚から選択された血清または体液から得られたものまたは誘導されたものと 類似していることを特徴とする請求の範囲第２３項記載の組成物。
25. ２５．生体適合性担体は抗体、ゼラチン、生体適合性重合体、ペプチド、糖また は炭水化物から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第２２項記載 の組成物。
26. ２６．タンパク質、脂質または細胞膜と相互作用することにより、正常な生理湿 度より高いか低い非生理温度、または非生理化学的雰囲気に曝されたタンパク質 、脂質、酵素、細胞膜、動物または植物の細胞、微生物、組織、臓器、動物全体 、または植物全体を包含する生体材料の生存、機能性、安定性および構造保全性 に有用であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
27. ２７．タンパク質、酵素、脂質または細胞膜の直ぐ近くで氷の結晶構造を変える ことにより、氷の存在下に０℃より低い温度に曝されたタンパク質、脂質、酵素 、細胞膜、動物または植物の細胞、微生物、組織、臓器、動物全体、または植物 全体を包含する生体材料の生存、機能性、安定性および構造保全性を改善するの に有用であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
28. ２８．タンパク質、酵素、脂質または細胞膜の直ぐ近くで氷の結晶の数を減少さ せると共に大きさを小さくすることにより、あるいは氷の結晶を完全に消滅させ ることにより、氷の存在下に０℃より低い温度に曝されたタンパク質、脂質、酵 素、細胞膜、動物または植物の細胞、徴生物、組織、臓器、動物全体、または植 物全体を包含する生体材料の生存、機能性、安定性および構造保全性を改善する のに有用であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
29. ２９．氷の形成によって溶質が排除されるモードを変えて、タンパク質、酵素、 脂質または細胞膜を取り巻く溶液の化学組成を変えることにより、氷の存在下に ０℃より低い温度に曝されたタンパク質、脂質、酵素、細胞膜、動物または植物 の細胞、微生物、組織、臓器、動物全体、または植物全体を包含する生体材料の 生存、機能性、安定性および構造保全性を改善するのに有用であることを特徴と する請求の範囲第１項記載の組成物。
30. ３０．膜におけるイオン通路を閉塞し、細胞膜を安定化するのに有用であること を特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
31. ３１．他のマクロ分子を結合させるか、タンパク質、酵素、脂質、または細胞膜 に共役させるのに有用であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
32. ３２．生体適合性物質は、魚、両生動物、無脊椎動物または爬虫類から得られた マクロ分子であるか、あるいは魚、両生動物、無脊椎動物または爬虫類から誘導 されたマクロ分子と実質的に同じであることを特徴とする請求の範囲第１項記載 の組成物。
33. ３３．生体適合性物質は、昆虫、両生動物、爬虫類、虫、または北氷洋、南氷洋 、北温帯または南温帯からの魚の体液から得られたか誘導されたものと類似の不 凍化タンパク質であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
34. ３４．生理適合性物質は北氷洋または南氷洋の魚の体液からのものであることを 特徴とする請求の範囲第３３項記載の組成物。
35. ３５．生体適合性物質は、ディー．マウソニ種、およびピー．ボルクグレビンキ 種を包含するノトテニア科の魚から選択された南氷洋の魚、または南氷洋のゲン ゲ科の魚であるリゴフイラ・デアルボルニ、または南氷洋のカレイ類の魚から得 られたか、誘導されたものと実質的に同じ不凍化タンパク質であるごとを特徴と する請求の範囲第１項記載の組成物。
36. ３６．生体許容性物質は、ポリペプチド、糖ペプチド、生体許容性担体に共有待 合しているポリペプチド、担体に共有結合している糖ポリペプチドまたはこれら の混合物から選択されたものであることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組 成物。
37. ３７．生体適合性物質は、氷の結晶のｃ軸に沿った氷の結晶成長を促進そ、氷の 結晶のａ軸に沿った氷の結晶成長を抑制する性質を有するものであることを特徴 とする請求の範囲第１項記載の組成物。
38. ３８．少なくとも１種の生体適合性マクロ分子は交互に配列された疎水性領域お よび親水性領域を有し、これらの領域はそれぞれ１６〜１７オングストロームの 間または１９〜２０オングストロームの間繰り返えされているか、あるいはそれ ぞれ１６．５オンダストロームまたは１９．５オングストローム繰り返えされて いることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
39. ３９．さらに、細胞および生体材料を保護するかあるいはガラス化を促進するこ とが知られているグリセリン、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、ポ リビニルピロリドン、グルコース、スクロース、プロパンジオール、プロピレン グリコール、カルボキシメチルセルロース、またはこれらの物質の混合物から選 択された保存作用、保護作用またはガラス化作用を有する追加の化合物を含有す ることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
40. ４０．生体適合性化合物は、南氷洋の魚からの特殊な不凍化糖タンパク質および 北氷洋の魚からの不凍化ペプチド、または昆虫または虫から誘導された不凍化タ ンパク質から選択されたものであり、非生理温度および非生理化学的雰囲気に曝 されるタンパク質、脂質、酵素、細胞膜、卵母細胞を含有する細胞、胚、微生物 、組織、臓器、または動物全体または植物全体を生存能力のある状態で保存する のに使用され、またこれらを保護するのに使用されることを特徴とする請求の範 囲第１項記載の組成物。
41. ４１．膜を保護し安定化するのに使用されるほかに、食品を保存する際；皮膚組 織を回復、保護または修復するための化粧品中；または細胞膜の不安定性に関連 する疾病にも使用されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成物。
42. ４２．細胞内−細胞外イオン輸送の不均衡と関連する疾病を治療する際にイオン 通路を閉塞するために使用されることを特徴とする請求の範囲第１項記載の組成 物。
43. ４３．種々のマクロ分子または共役分子を不凍化タンパク質に結合させ、これら の分子と細胞膜との結合を容易にするために使用されることを特徴とする請求の 範囲第１項記載の組成物。
44. ４４．非生理温度または非生理化学的組成物中におけるタンパク質、酵母、脂質 、細胞膜、動物または植物の細胞、微生物、組織、臓器、動物全体または植物全 体を包含する生物材料の生存、保存状態、機能性、安定性および構造保全性を向 上させるに当り、 （ａ）タンパク質、脂質、細胞膜、動物または植物の細胞、微生物、組織、臓器 、動物全体または植物全体のすべてと相互作用するのに十分な濃度の請求の範囲 第１項記載の生体許容性物質と接触させ； （ｂ）工程（ａ）の組み合わせを非生理条件に曝し；（ｃ）マクロ分子を除去し 、前記タンパク質、脂質、細胞膜、動物又は植物の細胞、微生物、組織、臓器、 動物全体または植物全体を生理温度および生理組成物に戻すことを特徴とする生 体材料の生存を改善する方法。
45. ４５．非生理条件はタンパク質、酵母、脂質、細胞膜、動物または植物の細胞、 微生物、組織、臓器、動物全体または植物全体を保存するための約０℃の低温で あることを特徴とする請求の範囲第４４項記載の方法。
46. ４６．０℃より低く約４Ｋまでの温度において、タンパク質、酵母、脂質、細胞 膜、動物または植物の細胞、微生物、組織、臓器、動物全体または植物全体を保 存するに当り、（ａ）請求の範囲第１項記載の生体適合性物質、またはこれに他 の凍結防止化合物を添加したものと接触させ；（ｂ）冷却することにより極低温 まで冷却し、比較的高い濃度のプロピレングリコールまたはグリセリンのような 追加の化合物と、ガラス化および一層低い凍結温度をもたらす比較的高い冷却速 度とを使用して、種々の濃度および冷却速度に従って系をガラス化または凍結さ せ；（ｃ）前記タンパク質、脂質、細胞膜、動物または植物の細胞、微生物、組 織、臓器、動物または植物を、上述の温度に１０年までの間維持し； （ｄ）暖かい流体またはマイクロ波加熱を包含する加温手段によって生理温度条 件まで加温し； （ｅ）不凍化糖タンパク質および他の化合物を除去し、前記不凍化糖タンパク質 および前記他の化合物を生理適合性溶液と置き換える ことを特徴とする生体材料の生存を改善する方法。