JPH06157339A - 骨形成組成物及びその使用方法 - Google Patents
骨形成組成物及びその使用方法Info
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- JPH06157339A JPH06157339A JP5207328A JP20732893A JPH06157339A JP H06157339 A JPH06157339 A JP H06157339A JP 5207328 A JP5207328 A JP 5207328A JP 20732893 A JP20732893 A JP 20732893A JP H06157339 A JPH06157339 A JP H06157339A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 有効量の腫瘍増殖因子−βに操作的に結合し
た鉱質消失骨基質及び薬学的に許容しうる担体を含む組
成物。 【効果】 骨折、骨格欠損、外科的修復及び顎顔面再建
の治療において、非吸収性の永続的な硬い新生骨を形成
する。
た鉱質消失骨基質及び薬学的に許容しうる担体を含む組
成物。 【効果】 骨折、骨格欠損、外科的修復及び顎顔面再建
の治療において、非吸収性の永続的な硬い新生骨を形成
する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、非吸収性の有効な骨形
成を生じる組成物及び方法に関する。本発明は、骨折、
骨格欠損及び顎顔面再建の治療に用いることができる。
成を生じる組成物及び方法に関する。本発明は、骨折、
骨格欠損及び顎顔面再建の治療に用いることができる。
【０００２】
【従来の技術】骨は、著しい再生能力を有する。しかし
ながら、骨結合を犠牲にして線維発生を促進する症状が
骨の修復過程に悪影響を及ぼすことがある。結果とし
て、顎顔面及び整形外科医は、外傷、感染及び新生組織
に由来する連続及び形状欠損を復元するために移植骨及
び充填材のような骨誘導物質を使用する。現在、自家海
綿骨が、頭蓋下顎顔面及び長骨欠損の双方に用いられる
最適な移植骨材料である。自家骨又は同種（他家）骨を
骨髄の骨原性細胞と混合し(Lindholm T.S.等,(1982)Cli
n.Orthop.171:251; Simmons,D.J.等,(1973)Clin.Ortho
p.97:237)、これらの物質を複合移植骨材料として用い
ることにより、骨誘導が高められる。しかしながら、そ
れらの有効性にもかかわらず、自家骨の移植骨は、供給
量に限度があり、複数あるいは大量の欠損の修復に適さ
ず、複数の処置を要する患者に永久に用いることができ
ない。更に、自家骨の収集は、しばしば痛みを伴ない、
また費用及び主要な外科的処置より超えた病的状態を伴
う。
ながら、骨結合を犠牲にして線維発生を促進する症状が
骨の修復過程に悪影響を及ぼすことがある。結果とし
て、顎顔面及び整形外科医は、外傷、感染及び新生組織
に由来する連続及び形状欠損を復元するために移植骨及
び充填材のような骨誘導物質を使用する。現在、自家海
綿骨が、頭蓋下顎顔面及び長骨欠損の双方に用いられる
最適な移植骨材料である。自家骨又は同種（他家）骨を
骨髄の骨原性細胞と混合し(Lindholm T.S.等,(1982)Cli
n.Orthop.171:251; Simmons,D.J.等,(1973)Clin.Ortho
p.97:237)、これらの物質を複合移植骨材料として用い
ることにより、骨誘導が高められる。しかしながら、そ
れらの有効性にもかかわらず、自家骨の移植骨は、供給
量に限度があり、複数あるいは大量の欠損の修復に適さ
ず、複数の処置を要する患者に永久に用いることができ
ない。更に、自家骨の収集は、しばしば痛みを伴ない、
また費用及び主要な外科的処置より超えた病的状態を伴
う。
【０００３】研究者等が骨修復のための代用材を継続し
て探究しているのはこれらの理由のためである。顔面の
骨格の形状を整え再建するために同種形成材料が１０年
間用いられてきたが、成功は感染、突出(Davies,P.K.B.
等(1971)Br.J.Plast.Surg.24:405）、骨の圧迫侵食(Job
e,R.等(1973)PRS 51:169) 、充填材安定化の欠乏（Brow
n,B.L.等(1979)Arch.Otolaryng.105:605) 、異物（巨細
胞）慢性反応（Brown,B.L.等(1979)Arch.Otolaryng.10
5:605) 及び充填材吸収（Brown,B.L.等(1979)Arch.Otol
aryng.105:605) に限られている。これらの合成材料は
骨置換として働き、骨に対して生理的に適格状態にあ
り、物理的に等価である新生骨を再生するものではな
い。これらの材料による挫折のため、任意の修復材料の
基本的な要求に一致した骨再生を生じる骨誘導の新しい
モデルに一部関心が注がれた。
て探究しているのはこれらの理由のためである。顔面の
骨格の形状を整え再建するために同種形成材料が１０年
間用いられてきたが、成功は感染、突出(Davies,P.K.B.
等(1971)Br.J.Plast.Surg.24:405）、骨の圧迫侵食(Job
e,R.等(1973)PRS 51:169) 、充填材安定化の欠乏（Brow
n,B.L.等(1979)Arch.Otolaryng.105:605) 、異物（巨細
胞）慢性反応（Brown,B.L.等(1979)Arch.Otolaryng.10
5:605) 及び充填材吸収（Brown,B.L.等(1979)Arch.Otol
aryng.105:605) に限られている。これらの合成材料は
骨置換として働き、骨に対して生理的に適格状態にあ
り、物理的に等価である新生骨を再生するものではな
い。これらの材料による挫折のため、任意の修復材料の
基本的な要求に一致した骨再生を生じる骨誘導の新しい
モデルに一部関心が注がれた。
【０００４】鉱質消失骨基質（ＤＢＭ）が異所的宿主部
位に新生骨形成を誘導することができるという発見(Uri
st,M.R.(1965)Science 150:893) が現在の骨誘導技術の
研究の基礎を形作った。しかしながら、多くの場合、Ｄ
ＢＭ充填材では骨吸収が生じる。最近の研究は、ＤＢＭ
が許容しえないほど高い吸収率を有し、充填材が原始間
葉細胞又は造骨細胞の豊富な部位に位置する場合にのみ
用いられるべきであると結論している(Toriumi等(1990)
Arch.Otolaryng.Head Neck Surg.116:676-680)。骨誘導
(Mulliken J.B.等(1984)J.Surg.Res.37:487)は、非コラ
ーゲン骨基質と結合して“保存" される散在性タンパク
質基質によって仲介されると考えられている(Hauschka
P.V.等(1986)J.Biol.Chem.261:12665;Urist,M.R.等(197
2)J.Dent.Res.50:1392; Sampath T.K.等(1987)PNAS USA
84:7109) 。区画された“骨成長因子" の放出は、隣接
の骨コンピテント細胞の分化及び刺激を生じる。応答す
る骨形成細胞は、新しい骨欠損縁に骨内膜と骨膜と共に
存在する。
位に新生骨形成を誘導することができるという発見(Uri
st,M.R.(1965)Science 150:893) が現在の骨誘導技術の
研究の基礎を形作った。しかしながら、多くの場合、Ｄ
ＢＭ充填材では骨吸収が生じる。最近の研究は、ＤＢＭ
が許容しえないほど高い吸収率を有し、充填材が原始間
葉細胞又は造骨細胞の豊富な部位に位置する場合にのみ
用いられるべきであると結論している(Toriumi等(1990)
Arch.Otolaryng.Head Neck Surg.116:676-680)。骨誘導
(Mulliken J.B.等(1984)J.Surg.Res.37:487)は、非コラ
ーゲン骨基質と結合して“保存" される散在性タンパク
質基質によって仲介されると考えられている(Hauschka
P.V.等(1986)J.Biol.Chem.261:12665;Urist,M.R.等(197
2)J.Dent.Res.50:1392; Sampath T.K.等(1987)PNAS USA
84:7109) 。区画された“骨成長因子" の放出は、隣接
の骨コンピテント細胞の分化及び刺激を生じる。応答す
る骨形成細胞は、新しい骨欠損縁に骨内膜と骨膜と共に
存在する。
【０００５】筋及び筋膜のような結合組織(Urist,M.R.
(1969)Clin.Orth.64:194)、胸腺(Friedenstein A.J.(19
73)Determined and Inducible Osteogenic Precursor C
ellsIn Hard Tissue Growth,Repair and Remineralizat
ion.Sognas R.,Vaughan J.(eds).Ciba Foundation Symp
osium II.Associated Scientific Publishers,Amsterda
m,p.169)及び内蔵器官の結合組織鞘(Chalmers J.等(197
5)J.Bone Joint Surg.57B:36) を含む多くの非骨組織も
これらの骨誘導成長因子に応答することができる。これ
らの組織は十分な未分化原始間葉細胞を有し（Urist M.
R.等(1969)Clin.Orthop.64:194) 、表現型の変化により
骨誘導因子に応答し、“誘導性骨形成前駆細胞" と呼ば
れている(Friedenstein A.J.(1973)Determined and Ind
ucible Osteogenic Precursor Cells In Hard Tissue G
rowth,Repair and Remineralization.Sognas R.,Vaugha
n J.(eds).Ciba Foundation Symposium II.Associated
Scientific Publishers,Amsterdam,p.169)。まだ行われ
ていない間葉細胞の細胞分化は、一連の連続した事象：
間葉細胞増殖及び活性化、軟骨形成、網状骨形成及び最
後の葉状骨発生を含んでいる。現在、数種の骨成長の可
能性のある物質が配列決定されており、骨形成、骨形態
発生タンパク質及び腫瘍増殖因子−βを含む研究に利用
されている。
(1969)Clin.Orth.64:194)、胸腺(Friedenstein A.J.(19
73)Determined and Inducible Osteogenic Precursor C
ellsIn Hard Tissue Growth,Repair and Remineralizat
ion.Sognas R.,Vaughan J.(eds).Ciba Foundation Symp
osium II.Associated Scientific Publishers,Amsterda
m,p.169)及び内蔵器官の結合組織鞘(Chalmers J.等(197
5)J.Bone Joint Surg.57B:36) を含む多くの非骨組織も
これらの骨誘導成長因子に応答することができる。これ
らの組織は十分な未分化原始間葉細胞を有し（Urist M.
R.等(1969)Clin.Orthop.64:194) 、表現型の変化により
骨誘導因子に応答し、“誘導性骨形成前駆細胞" と呼ば
れている(Friedenstein A.J.(1973)Determined and Ind
ucible Osteogenic Precursor Cells In Hard Tissue G
rowth,Repair and Remineralization.Sognas R.,Vaugha
n J.(eds).Ciba Foundation Symposium II.Associated
Scientific Publishers,Amsterdam,p.169)。まだ行われ
ていない間葉細胞の細胞分化は、一連の連続した事象：
間葉細胞増殖及び活性化、軟骨形成、網状骨形成及び最
後の葉状骨発生を含んでいる。現在、数種の骨成長の可
能性のある物質が配列決定されており、骨形成、骨形態
発生タンパク質及び腫瘍増殖因子−βを含む研究に利用
されている。
【０００６】種々の頭蓋骨下顎顔面用に鉱質消失骨が用
いられているが、実際の新生骨成長量はかなり変動して
いる（Mulliken J.B.(1985)Induced Osteogenesis and
Craniofacial Surgery In Caronnie E.(ed.):Craniofac
ial Surgery.Little Brown,Boston;Toriumi D.M.等(199
0)Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.116:676)。鼻骨背
側、頬骨隆起、眼窩上隆線、鼻骨尖端上の下顎に沿った
増量処置において鉱質消失骨を用いると、高い吸収率が
生じる。後鼻骨充填材の長期再調査は、容認しえない高
い吸収率を示しており、少量の充填材の場合５0.７％
（平均１３ヵ月）から多量の充填材の場合８2.５％（平
均２４ヵ月）までの範囲にある (ToriumiD.M.等(1990)H
ead Neck Surg.116:676) 。高い吸収率は、鉱質消失骨
が裂肋骨のような固体形として用いられる場合特に問題
であり、周囲の骨との不十分な接触又は骨材基質タンパ
ク質の隣接組織へのわずかな拡散を示す。吸収は、充填
材が新しい骨要素に当てはまらない場合も致命的であ
る。積層組織収縮からの圧迫、虚血及び感染もまた、骨
誘導を超える割合で充填材吸収を容易にする。
いられているが、実際の新生骨成長量はかなり変動して
いる（Mulliken J.B.(1985)Induced Osteogenesis and
Craniofacial Surgery In Caronnie E.(ed.):Craniofac
ial Surgery.Little Brown,Boston;Toriumi D.M.等(199
0)Arch.Otolaryngol.Head Neck Surg.116:676)。鼻骨背
側、頬骨隆起、眼窩上隆線、鼻骨尖端上の下顎に沿った
増量処置において鉱質消失骨を用いると、高い吸収率が
生じる。後鼻骨充填材の長期再調査は、容認しえない高
い吸収率を示しており、少量の充填材の場合５0.７％
（平均１３ヵ月）から多量の充填材の場合８2.５％（平
均２４ヵ月）までの範囲にある (ToriumiD.M.等(1990)H
ead Neck Surg.116:676) 。高い吸収率は、鉱質消失骨
が裂肋骨のような固体形として用いられる場合特に問題
であり、周囲の骨との不十分な接触又は骨材基質タンパ
ク質の隣接組織へのわずかな拡散を示す。吸収は、充填
材が新しい骨要素に当てはまらない場合も致命的であ
る。積層組織収縮からの圧迫、虚血及び感染もまた、骨
誘導を超える割合で充填材吸収を容易にする。
【０００７】骨誘導体充填材の骨誘導作用を高める努力
において、本発明は、骨誘導に関与する基質結合タンパ
ク質成長因子の単離、確認及び精製に重きを置いてい
た。そこで、構造上関連した数種の骨成長因子が単離、
配列決定され(Wang E.A.等（1988)PNAS USA 85:9484; W
ang E.A.等（1990)PNAS USA 85:2220; Ozkaynak E.等(1
990)EMBO 9:2085)、送達のために生物分解性キャリヤと
混合し、実験用動物モデルで試験した。しかしながら、
骨誘導研究に適した動物モデルに関して、研究者等の中
で一致がほとんど得られず、意味のある有効なデータの
比較ができない。実験用動物の中で骨修復率は、系統発
生学的段階に沿った順序（Prolo,D.J.等(1982)Clin.Ort
hop.108:230)及び動物の成熟状態（年齢)(Prolo,D.J.等
(1982)Clin.Orthop.108:230;Robinson R.A.(1971)J.Bon
e Joint Surg.53A:1017)に関して逆に変動する。実際
に、低段階の幼若種で用いると、多数の有効な骨誘導タ
ンパク質は、自然治癒に対して無限の能力を有する優れ
た造骨能力を有することが知られている。骨修復の性状
もまた、欠損の骨格場所(Harris W.H.等(1968)J.Bone J
oint Surg.50A:1118) 及び大きさ (Hjorting-Hansen E.
等(1971)Br.J.Oral Surg.9:33;Simmons D.J.(1980)Frac
ture Healing in Urist M.R.(ed.)Fundamental and Cli
nical Bone Physiology.J.B.Lippincott,Philadelphia,
p.291)に左右される。
において、本発明は、骨誘導に関与する基質結合タンパ
ク質成長因子の単離、確認及び精製に重きを置いてい
た。そこで、構造上関連した数種の骨成長因子が単離、
配列決定され(Wang E.A.等（1988)PNAS USA 85:9484; W
ang E.A.等（1990)PNAS USA 85:2220; Ozkaynak E.等(1
990)EMBO 9:2085)、送達のために生物分解性キャリヤと
混合し、実験用動物モデルで試験した。しかしながら、
骨誘導研究に適した動物モデルに関して、研究者等の中
で一致がほとんど得られず、意味のある有効なデータの
比較ができない。実験用動物の中で骨修復率は、系統発
生学的段階に沿った順序（Prolo,D.J.等(1982)Clin.Ort
hop.108:230)及び動物の成熟状態（年齢)(Prolo,D.J.等
(1982)Clin.Orthop.108:230;Robinson R.A.(1971)J.Bon
e Joint Surg.53A:1017)に関して逆に変動する。実際
に、低段階の幼若種で用いると、多数の有効な骨誘導タ
ンパク質は、自然治癒に対して無限の能力を有する優れ
た造骨能力を有することが知られている。骨修復の性状
もまた、欠損の骨格場所(Harris W.H.等(1968)J.Bone J
oint Surg.50A:1118) 及び大きさ (Hjorting-Hansen E.
等(1971)Br.J.Oral Surg.9:33;Simmons D.J.(1980)Frac
ture Healing in Urist M.R.(ed.)Fundamental and Cli
nical Bone Physiology.J.B.Lippincott,Philadelphia,
p.291)に左右される。
【０００８】挫傷サイズは、自然治癒の可能性を排除
し、充填材、移植骨又は骨誘導タンパク質の骨形成の可
能性を明白に評価するためにかなりの割合を有しなけれ
ばならない。これらの厳しい要求を満たすように計画さ
れた実験モデルが限界サイズ欠損（ＣＳＤ）であり、動
物の生涯にわたって自然治癒しない具体的な種類及び骨
格場所における最少の挫傷として定義される (Schmitz
J.P.等(1986)Clin.Orthop.Rel Res.205:299)。限界サイ
ズ欠損は、線維性閉塞で治癒し(Frame J.W.(1980)J.Ora
l Surg.38:176)、骨形成せず、顎顔面及び下顎仮関節の
過程を研究するのに有効な現在最良の原型である (Schm
itz J.P.等(1986)Clin.Orthop.Rel.Res.205:299)。頭蓋
冠の限界サイズ欠損は、頭蓋が生物学的に相対的に不活
性であり、骨髄欠乏及び無栄養血液供給に対応するの
で、骨誘導能力の最も厳しい試験と考えられる (Prolo
D.J.等(1982)Clin.Orthop.108:230)。ヒト頭蓋冠は小さ
な欠損でさえも自然に治癒しない (Prolo D.J.等(1984)
Neurosurgery 14:183)。頭蓋冠ＣＳＤは、膜前駆体から
発生学的に誘導することが類似しているために、顎顔面
及び下顎仮関節に有効なモデルである(Frame J.W.(198
0)J.Oral Surg.38:176)。更に、頭蓋冠の生理状態が萎
縮性下顎骨に似ており(Bays R.A.(1983)Current Concep
ts In Bone Grafting in Irby W.B.,Shelton D.W.(eds)
Current Advances In Oral and Maxillofacial Surger
y,Mosby,St.Louis,Vol.4,p.109)、線維性仮関節になり
やすい。頭蓋冠骨の限界サイズ欠損は、４種の動物種：
ラット、ウサギ、イヌ及びサルで確立されている。Fram
e(Frame J.W.(1980)J.Oral Surg.38:176) は、ウサギに
おいて１５mm径ＣＳＤの正当性を確立しており、これは
霊長類と一致する (Hollinger J.等(1989)J.Oral Mixol
lofac.Surg.47:1182) 。今日までのところ、ウサギモデ
ルにおいて、骨誘導及び骨伝導物質により一致した信頼
できる治癒が達成されていない。
し、充填材、移植骨又は骨誘導タンパク質の骨形成の可
能性を明白に評価するためにかなりの割合を有しなけれ
ばならない。これらの厳しい要求を満たすように計画さ
れた実験モデルが限界サイズ欠損（ＣＳＤ）であり、動
物の生涯にわたって自然治癒しない具体的な種類及び骨
格場所における最少の挫傷として定義される (Schmitz
J.P.等(1986)Clin.Orthop.Rel Res.205:299)。限界サイ
ズ欠損は、線維性閉塞で治癒し(Frame J.W.(1980)J.Ora
l Surg.38:176)、骨形成せず、顎顔面及び下顎仮関節の
過程を研究するのに有効な現在最良の原型である (Schm
itz J.P.等(1986)Clin.Orthop.Rel.Res.205:299)。頭蓋
冠の限界サイズ欠損は、頭蓋が生物学的に相対的に不活
性であり、骨髄欠乏及び無栄養血液供給に対応するの
で、骨誘導能力の最も厳しい試験と考えられる (Prolo
D.J.等(1982)Clin.Orthop.108:230)。ヒト頭蓋冠は小さ
な欠損でさえも自然に治癒しない (Prolo D.J.等(1984)
Neurosurgery 14:183)。頭蓋冠ＣＳＤは、膜前駆体から
発生学的に誘導することが類似しているために、顎顔面
及び下顎仮関節に有効なモデルである(Frame J.W.(198
0)J.Oral Surg.38:176)。更に、頭蓋冠の生理状態が萎
縮性下顎骨に似ており(Bays R.A.(1983)Current Concep
ts In Bone Grafting in Irby W.B.,Shelton D.W.(eds)
Current Advances In Oral and Maxillofacial Surger
y,Mosby,St.Louis,Vol.4,p.109)、線維性仮関節になり
やすい。頭蓋冠骨の限界サイズ欠損は、４種の動物種：
ラット、ウサギ、イヌ及びサルで確立されている。Fram
e(Frame J.W.(1980)J.Oral Surg.38:176) は、ウサギに
おいて１５mm径ＣＳＤの正当性を確立しており、これは
霊長類と一致する (Hollinger J.等(1989)J.Oral Mixol
lofac.Surg.47:1182) 。今日までのところ、ウサギモデ
ルにおいて、骨誘導及び骨伝導物質により一致した信頼
できる治癒が達成されていない。
【０００９】ＴＧＦ−βは、多種類の細胞の成長及び分
化を調節する24,000ダルトンのポリペプチドである。骨
に潜在するＴＧＦ−βは、体内において１０の因子によ
る最大プールを含む。これは高度に保存されたタンパク
質であり、細胞生理学に実質的な役割を示す。ＴＧＦ−
βのヒト及びサル成熟形態は同一である。研究されたほ
とんどの種類のヒト細胞は、ＴＧＦ−β及びそのレセプ
ターの双方を発現する(Bonewald L.F.等(1990)Clin.Ort
hop.250:261-76) 。これは、大きなキャリヤタンパク質
に結合した潜在形態で分泌される。その活性化は熱烈な
研究課題である。ｐＨの極値及びカテプシンＤ及びプラ
スミンのような酵素は、活性化因子として確認されてい
る (Pfeilschifter J.等(J.Bone Mineral Res.5(1):49-
58) 。試験管内実験により、少量のＴＧＦ−βが骨芽細
胞様細胞を刺激してＩ型コラーゲン、オステオネクチ
ン、オステオポンチン及びフィブロネクチンの産生を著
しく増加させることが知られている(Strong D.D.等(199
1)J.Bone Mineral Res.6(1):15-23)。ＴＧＦ−βは破骨
細胞を阻害し、破骨細胞は骨潜在ＴＧＦ−βを活性化す
る。破骨細胞のラッフルドボーダーの下で見られる低い
ｐＨ及び高い酵素活性は活性化に理想的なマイクロエン
バイロンメントをなすことが提唱されている。破骨細胞
活性が骨の再造形に主要な事象であるので、これは骨潜
在ＴＧＦ−βの活性化の誘発作用を与えることができ、
引き続き破骨細胞を刺激し、新生基質を形成する(Bonew
ald L.F.等(1990)Clin.Orthop.250:261-76) 。新生骨の
有効な非吸収性誘導を開発する要求によって、本発明が
完成された。本発明においては、ＤＢＭとＴＧＦ−βを
組み合わせてＣＳＤモデルの基準を満たすことができ、
以前にＤＢＭの使用から生じた骨吸収の問題を克服する
新生骨を形成する。本発明においては、硬い非吸収性の
新生骨が形成される。
化を調節する24,000ダルトンのポリペプチドである。骨
に潜在するＴＧＦ−βは、体内において１０の因子によ
る最大プールを含む。これは高度に保存されたタンパク
質であり、細胞生理学に実質的な役割を示す。ＴＧＦ−
βのヒト及びサル成熟形態は同一である。研究されたほ
とんどの種類のヒト細胞は、ＴＧＦ−β及びそのレセプ
ターの双方を発現する(Bonewald L.F.等(1990)Clin.Ort
hop.250:261-76) 。これは、大きなキャリヤタンパク質
に結合した潜在形態で分泌される。その活性化は熱烈な
研究課題である。ｐＨの極値及びカテプシンＤ及びプラ
スミンのような酵素は、活性化因子として確認されてい
る (Pfeilschifter J.等(J.Bone Mineral Res.5(1):49-
58) 。試験管内実験により、少量のＴＧＦ−βが骨芽細
胞様細胞を刺激してＩ型コラーゲン、オステオネクチ
ン、オステオポンチン及びフィブロネクチンの産生を著
しく増加させることが知られている(Strong D.D.等(199
1)J.Bone Mineral Res.6(1):15-23)。ＴＧＦ−βは破骨
細胞を阻害し、破骨細胞は骨潜在ＴＧＦ−βを活性化す
る。破骨細胞のラッフルドボーダーの下で見られる低い
ｐＨ及び高い酵素活性は活性化に理想的なマイクロエン
バイロンメントをなすことが提唱されている。破骨細胞
活性が骨の再造形に主要な事象であるので、これは骨潜
在ＴＧＦ−βの活性化の誘発作用を与えることができ、
引き続き破骨細胞を刺激し、新生基質を形成する(Bonew
ald L.F.等(1990)Clin.Orthop.250:261-76) 。新生骨の
有効な非吸収性誘導を開発する要求によって、本発明が
完成された。本発明においては、ＤＢＭとＴＧＦ−βを
組み合わせてＣＳＤモデルの基準を満たすことができ、
以前にＤＢＭの使用から生じた骨吸収の問題を克服する
新生骨を形成する。本発明においては、硬い非吸収性の
新生骨が形成される。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、非吸収性硬
骨の成長及び形成を促進する組成物及び方法に関する。
鉱質消失骨基質及びＴＧＦ−βを含む本発明の組成物
は、新生骨形成が所望される生体領域において骨の発生
を刺激するために用いることができる。従来の研究で
は、吸収を行わない永続的な骨形成を与えることは不可
能であった。本発明においては、使用される物質の組み
合わせが、一般に骨再生がほとんど行われない骨格欠
損、例えば頭蓋骨の外科的陥凹の骨形成を効果的に生じ
た。骨成長の刺激並びに骨折、骨格欠損、歯周疾患及び
顎顔面再建の治療方法が本発明により企図される。本発
明の組成物及び方法は、骨粗鬆症から仮関節骨折を治療
する下顎再建までの範囲にある治療、美容及び外科的処
置に用いられる。当業者に容易に明らかになるであろう
本発明の他の用途及び応用も企図され、上述の具体的な
適用に本発明が限定されるものではない。
骨の成長及び形成を促進する組成物及び方法に関する。
鉱質消失骨基質及びＴＧＦ−βを含む本発明の組成物
は、新生骨形成が所望される生体領域において骨の発生
を刺激するために用いることができる。従来の研究で
は、吸収を行わない永続的な骨形成を与えることは不可
能であった。本発明においては、使用される物質の組み
合わせが、一般に骨再生がほとんど行われない骨格欠
損、例えば頭蓋骨の外科的陥凹の骨形成を効果的に生じ
た。骨成長の刺激並びに骨折、骨格欠損、歯周疾患及び
顎顔面再建の治療方法が本発明により企図される。本発
明の組成物及び方法は、骨粗鬆症から仮関節骨折を治療
する下顎再建までの範囲にある治療、美容及び外科的処
置に用いられる。当業者に容易に明らかになるであろう
本発明の他の用途及び応用も企図され、上述の具体的な
適用に本発明が限定されるものではない。
【００１１】
【課題を解決するための手段】本発明は、非吸収性硬骨
成長の発生を誘導する方法に関する。本発明において
は、鉱質消失骨基質と腫瘍増殖因子βを含む組成物によ
って骨成長が刺激される。鉱質消失骨として分類された
物質に関する以前の研究では、骨粉に存在する骨形態発
生タンパク質（ＢＭＰ-2）のような種々の骨成長因子に
起因した若干の骨成長が生じていた。この粉末から形成
された骨は、高い吸収率を示したので、永続的な硬骨形
成を構成しなかった。この課題は、酸処理及び凍結乾燥
して調製された鉱質消失骨基質（ＤＢＭ）の利用により
本発明者等によって克服された。ＤＢＭは、低レベルの
成長因子活性を有する。ＤＢＭに検出される因子を表１
に挙げる。ＤＢＭは、ＴＧＦ−βに操作的に結合され
る。好ましい態様においては、ＤＢＭは、ＴＧＦ−βが
ＤＢＭに対して実質的に不可逆的結合を生じるのに十分
なＴＧＦ−β量と混合される。ＤＢＭとＴＧＦ−βがこ
のように混合され、投与されると、骨誘導が生じ、硬い
非吸収性の新生骨が形成される。
成長の発生を誘導する方法に関する。本発明において
は、鉱質消失骨基質と腫瘍増殖因子βを含む組成物によ
って骨成長が刺激される。鉱質消失骨として分類された
物質に関する以前の研究では、骨粉に存在する骨形態発
生タンパク質（ＢＭＰ-2）のような種々の骨成長因子に
起因した若干の骨成長が生じていた。この粉末から形成
された骨は、高い吸収率を示したので、永続的な硬骨形
成を構成しなかった。この課題は、酸処理及び凍結乾燥
して調製された鉱質消失骨基質（ＤＢＭ）の利用により
本発明者等によって克服された。ＤＢＭは、低レベルの
成長因子活性を有する。ＤＢＭに検出される因子を表１
に挙げる。ＤＢＭは、ＴＧＦ−βに操作的に結合され
る。好ましい態様においては、ＤＢＭは、ＴＧＦ−βが
ＤＢＭに対して実質的に不可逆的結合を生じるのに十分
なＴＧＦ−β量と混合される。ＤＢＭとＴＧＦ−βがこ
のように混合され、投与されると、骨誘導が生じ、硬い
非吸収性の新生骨が形成される。
【００１２】
【表１】 表１ 成長因子 濃度μg/g 湿潤骨粉 ──────────────────────────────────── (IGF -II) インシュリン様成長因子-II 1.26 (TGF -β) 腫瘍増殖因子 -β 0.46 (IGF -I) インシュリン様成長因子-I 0.085 (PDGF) 血小板由来成長因子 0.067 (FGF) 線維芽細胞成長因子 0.024 (EGF) 表皮成長因子 検出不能 ────────────────────────────────────
【００１３】本発明のＤＢＭは、骨をＨＣl で鉱質消失
させた後、凍結乾燥して調製された骨誘導体である。最
終の粉末は、サイズ範囲７４〜６４０μm の粒子を含
む。ＴＧＦ−βは、間葉細胞の移動、増殖及び基質合成
を刺激する２４kDの同種二量体タンパク質である。骨は
体内のＴＧＦ−βの最大のレザバーであり(S.M.Seyedin
等(1986)J.Biol.Chem.261:5693-5695)、その骨形成促進
能は骨損失疾患の治療剤としての可能性があることを示
している(Noda,M.,Camilliere,J.(1989)Endocrinology
124:2991-2207)。骨膜に隣接したＴＧＦ−βの生体内適
用は、骨の厚みや軟骨形成を増大させることが知られて
いる(Joyce等(1990)J.Cell Biol.110:2195; Marcelli等
(1990)J.Bone Miner.Res.5:1087-1096;Mackie E.J.,Tre
cksel,U.(1990)Bone 11:295-300) 。ＴＧＦ−βは頭蓋
骨の大きな骨欠損の骨閉鎖を誘導することも知られてい
る（Beck等(1991)J.Bone,Miner.Res.6:1257-1265) 。本
発明においては、ＴＧＦ−β及びＤＢＭの組成物は、骨
折の治療、歯科用充填材及び顎顔面再建のような構造上
の欠損の治療に用いることができる。本発明の特に有効
な態様は、指定された形態又は形状の骨成長が所望され
る生体領域にＤＢＭ及びＴＧＦ−βを含む形成された基
質を適用することを含む。例えば、本発明の組成物を成
形し、頭及び頸外傷又は疾患の結果として再建手術を必
要としている患者の顎の下顎領域の骨成長を生じるよう
に患者に適合させることができる。本発明は、また歯喪
失及び骨欠損のような歯科疾患の治療用組成物及び充填
材を含む（本明細書において“歯科用充填材”と呼ばれ
る）。
させた後、凍結乾燥して調製された骨誘導体である。最
終の粉末は、サイズ範囲７４〜６４０μm の粒子を含
む。ＴＧＦ−βは、間葉細胞の移動、増殖及び基質合成
を刺激する２４kDの同種二量体タンパク質である。骨は
体内のＴＧＦ−βの最大のレザバーであり(S.M.Seyedin
等(1986)J.Biol.Chem.261:5693-5695)、その骨形成促進
能は骨損失疾患の治療剤としての可能性があることを示
している(Noda,M.,Camilliere,J.(1989)Endocrinology
124:2991-2207)。骨膜に隣接したＴＧＦ−βの生体内適
用は、骨の厚みや軟骨形成を増大させることが知られて
いる(Joyce等(1990)J.Cell Biol.110:2195; Marcelli等
(1990)J.Bone Miner.Res.5:1087-1096;Mackie E.J.,Tre
cksel,U.(1990)Bone 11:295-300) 。ＴＧＦ−βは頭蓋
骨の大きな骨欠損の骨閉鎖を誘導することも知られてい
る（Beck等(1991)J.Bone,Miner.Res.6:1257-1265) 。本
発明においては、ＴＧＦ−β及びＤＢＭの組成物は、骨
折の治療、歯科用充填材及び顎顔面再建のような構造上
の欠損の治療に用いることができる。本発明の特に有効
な態様は、指定された形態又は形状の骨成長が所望され
る生体領域にＤＢＭ及びＴＧＦ−βを含む形成された基
質を適用することを含む。例えば、本発明の組成物を成
形し、頭及び頸外傷又は疾患の結果として再建手術を必
要としている患者の顎の下顎領域の骨成長を生じるよう
に患者に適合させることができる。本発明は、また歯喪
失及び骨欠損のような歯科疾患の治療用組成物及び充填
材を含む（本明細書において“歯科用充填材”と呼ばれ
る）。
【００１４】本発明の特に有効な組成物は、骨成長が所
望される部位に形を合わせることができる非液状の展性
のある可塑性基質として存在する。次いで、基質の形態
及び形状に従って新生骨形成が生じる。本方法は、類似
の新生骨を製造し、顎、頭蓋骨板、頬骨、鎖骨、仮関節
骨折、指、足指等の再建手術用骨構造を置換及び修復す
ることができる。本発明及びその態様を更に明らかにす
るために、下記定義を包含する。本明細書で用いられる
“ＴＧＦ−β”とは、腫瘍増殖因子β群の任意の物質を
意味し、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、
ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５及びＴＧＦ−５βと称する
ＴＧＦ−β１／β２ハイブリッド分子が挙げられる。Ｔ
ＧＦ−５βと称する新規なＴＧＦ−β形は、ＴＧＦ−β
１及びＴＧＦ−β２のハイブリッドアミノ酸残基配列を
含む。ＴＧＦ−５βは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２
のいずれかに見られるより有効な組換えプロセシング及
び発現を有する。ＴＧＦ−５βの詳細な説明は、 Madis
en等(1990)Transforming Growth Factorβ′s,Chemistr
y,Biology and Therapeutics,Anal.N.Y.Acad.Sci.593:7
-25 及び1991年 3月14日に出願された米国特許出願第 6
69,171号及び1992年 3月 8日に出願された同第 667,246
号に開示されており、これらの開示を参考として本明細
書に引用する。
望される部位に形を合わせることができる非液状の展性
のある可塑性基質として存在する。次いで、基質の形態
及び形状に従って新生骨形成が生じる。本方法は、類似
の新生骨を製造し、顎、頭蓋骨板、頬骨、鎖骨、仮関節
骨折、指、足指等の再建手術用骨構造を置換及び修復す
ることができる。本発明及びその態様を更に明らかにす
るために、下記定義を包含する。本明細書で用いられる
“ＴＧＦ−β”とは、腫瘍増殖因子β群の任意の物質を
意味し、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、
ＴＧＦ−β４、ＴＧＦ−β５及びＴＧＦ−５βと称する
ＴＧＦ−β１／β２ハイブリッド分子が挙げられる。Ｔ
ＧＦ−５βと称する新規なＴＧＦ−β形は、ＴＧＦ−β
１及びＴＧＦ−β２のハイブリッドアミノ酸残基配列を
含む。ＴＧＦ−５βは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２
のいずれかに見られるより有効な組換えプロセシング及
び発現を有する。ＴＧＦ−５βの詳細な説明は、 Madis
en等(1990)Transforming Growth Factorβ′s,Chemistr
y,Biology and Therapeutics,Anal.N.Y.Acad.Sci.593:7
-25 及び1991年 3月14日に出願された米国特許出願第 6
69,171号及び1992年 3月 8日に出願された同第 667,246
号に開示されており、これらの開示を参考として本明細
書に引用する。
【００１５】“単位用量”及び“十分量”及びその文法
上種々の形の用語は同じ意味で用いられ、患者に単位投
薬として適切なＴＧＦ−β及びＤＢＭのような物質の物
理的に分離している量を意味し、各単位は必要な希釈
剤、即ち、担体又は賦形剤と共に所望の治療効果を生じ
るように算出された活性物質の所定量を含む。本発明の
新規な単位用量の基準が定められ、（ａ）活性物質のユ
ニークな特徴及び達成されるべき具体的な治療効果及び
（ｂ）そのような活性物質を治療用に配合する当該技術
において固有の制約に直接的に左右される。本明細書で
用いられる“有効量”とは、患者の所望部位において骨
発生及び形成を刺激するのに十分な量を意味する。個々
の患者に効果的な量は、骨折、損傷又は欠損の程度、患
者の全身状態、投与方法、副作用の程度等の要因により
異なってもよい。ＴＧＦ−βのペプチド配列及び他の任
意のペプチドに関して本明細書で用いられる文法上種々
の形の“対応する”とは、アミノ末端とカルボキシ末端
のいずれか又は両方において３個までのアミノ酸を加減
して記載され、ペプチド及び／又はポリペプチド配列に
沿った特定のアミノ酸残基にのみ保存的置換を含むペプ
チド配列を意味する。
上種々の形の用語は同じ意味で用いられ、患者に単位投
薬として適切なＴＧＦ−β及びＤＢＭのような物質の物
理的に分離している量を意味し、各単位は必要な希釈
剤、即ち、担体又は賦形剤と共に所望の治療効果を生じ
るように算出された活性物質の所定量を含む。本発明の
新規な単位用量の基準が定められ、（ａ）活性物質のユ
ニークな特徴及び達成されるべき具体的な治療効果及び
（ｂ）そのような活性物質を治療用に配合する当該技術
において固有の制約に直接的に左右される。本明細書で
用いられる“有効量”とは、患者の所望部位において骨
発生及び形成を刺激するのに十分な量を意味する。個々
の患者に効果的な量は、骨折、損傷又は欠損の程度、患
者の全身状態、投与方法、副作用の程度等の要因により
異なってもよい。ＴＧＦ−βのペプチド配列及び他の任
意のペプチドに関して本明細書で用いられる文法上種々
の形の“対応する”とは、アミノ末端とカルボキシ末端
のいずれか又は両方において３個までのアミノ酸を加減
して記載され、ペプチド及び／又はポリペプチド配列に
沿った特定のアミノ酸残基にのみ保存的置換を含むペプ
チド配列を意味する。
【００１６】上記で用いた“保存的置換”とは、アミノ
酸残基１個が別の生物学的に類似した残基に置き換えら
れているアミノ酸残基を示す。保存的置換の例として
は、Ｉle、Ｖal、Ｌeu又はＭetのような疎水性残基１個
が別の残基に又はＡrgとＬys、ＧluとＡsp又はＧlnとＡ
snとの間等のように極性残基が別の残基に置き換わるこ
とが挙げられる。ある場合には、イオン残基の反対に荷
電したイオン残基による置換、例えばＡspのＬysによる
置換は、当該技術において保存的と決められており、そ
れらのイオン基は単に可溶性を助けるためであると考え
られる。しかしながら、一般的には、本明細書で述べら
れる置換は、全タンパク質に比べて比較的短い合成域に
あるのでイオン残基のもう１つの反対の電荷のイオン残
基による置換は、非イオン残基とイオン残基及びＰhe、
Ｔyr又はＴrpのような大きい残基とＧly、Ｉle及びＶal
のような大きくない残基による置換のように、“ラジカ
ル置換" であると考えられる。“非イオン”及び“イオ
ン”残基は、生理的ｐＨ値において各々電荷を持たない
又は通常は電荷を持ったアミノ酸残基を示す一般の意味
で本明細書で用いられる。非イオン残基の例としてはＴ
hr及びＧlnがあり、イオン残基の例としてはＡrg及びＡ
spがある。
酸残基１個が別の生物学的に類似した残基に置き換えら
れているアミノ酸残基を示す。保存的置換の例として
は、Ｉle、Ｖal、Ｌeu又はＭetのような疎水性残基１個
が別の残基に又はＡrgとＬys、ＧluとＡsp又はＧlnとＡ
snとの間等のように極性残基が別の残基に置き換わるこ
とが挙げられる。ある場合には、イオン残基の反対に荷
電したイオン残基による置換、例えばＡspのＬysによる
置換は、当該技術において保存的と決められており、そ
れらのイオン基は単に可溶性を助けるためであると考え
られる。しかしながら、一般的には、本明細書で述べら
れる置換は、全タンパク質に比べて比較的短い合成域に
あるのでイオン残基のもう１つの反対の電荷のイオン残
基による置換は、非イオン残基とイオン残基及びＰhe、
Ｔyr又はＴrpのような大きい残基とＧly、Ｉle及びＶal
のような大きくない残基による置換のように、“ラジカ
ル置換" であると考えられる。“非イオン”及び“イオ
ン”残基は、生理的ｐＨ値において各々電荷を持たない
又は通常は電荷を持ったアミノ酸残基を示す一般の意味
で本明細書で用いられる。非イオン残基の例としてはＴ
hr及びＧlnがあり、イオン残基の例としてはＡrg及びＡ
spがある。
【００１７】本発明の第２鉄塩は、任意の生理的に許容
しうる有機塩を包含し、特にクエン酸第２鉄が挙げられ
る。本明細書で同じ意味で用いられる“薬学的に許容し
うる塩”及び“生理的に許容しうる塩”とは、医薬業界
で用いられる非毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩及びアンモニウム塩を意味し、ナトリウム、カリウ
ム、リチウム、カルシウム、マグネシウム及びアンモニ
ウム塩等が挙げられ、当該技術において周知の方法によ
り調製される。この用語は、非毒性酸付加塩も包含し、
通常、本発明の化合物と適切な有機酸又は無機酸とを反
応させることにより調製される。代表的な塩としては、
塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シ
ュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、ホ
ウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、
クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、
酒石酸塩等が挙げられる。本明細書で用いられる“操作
的に結合された”とは、その物質の所望の生物活性が結
合により阻害されないような方法での物質の結合を意味
する。本明細書で用いられる“操作的に連結された”と
は、上記のように機能する連結された物質の両者の能力
を妨害しない結合を意味する。１つの好ましい態様にお
いては、ＤＢＭは、ＴＧＦ−βがＤＢＭと共に骨形成を
刺激する骨芽細胞と相互作用し且つＴＧＦ−βの生物活
性を妨害しない方法で生物学的に活性なＴＧＦ−β化合
物に操作的に連結される。これは、ＤＢＭが破骨細胞に
よって吸収されるとＴＧＦ−βを放出することができ
る。
しうる有機塩を包含し、特にクエン酸第２鉄が挙げられ
る。本明細書で同じ意味で用いられる“薬学的に許容し
うる塩”及び“生理的に許容しうる塩”とは、医薬業界
で用いられる非毒性アルカリ金属塩、アルカリ土類金属
塩及びアンモニウム塩を意味し、ナトリウム、カリウ
ム、リチウム、カルシウム、マグネシウム及びアンモニ
ウム塩等が挙げられ、当該技術において周知の方法によ
り調製される。この用語は、非毒性酸付加塩も包含し、
通常、本発明の化合物と適切な有機酸又は無機酸とを反
応させることにより調製される。代表的な塩としては、
塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、酢酸塩、シ
ュウ酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、ラウリル酸塩、ホ
ウ酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、
クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、
酒石酸塩等が挙げられる。本明細書で用いられる“操作
的に結合された”とは、その物質の所望の生物活性が結
合により阻害されないような方法での物質の結合を意味
する。本明細書で用いられる“操作的に連結された”と
は、上記のように機能する連結された物質の両者の能力
を妨害しない結合を意味する。１つの好ましい態様にお
いては、ＤＢＭは、ＴＧＦ−βがＤＢＭと共に骨形成を
刺激する骨芽細胞と相互作用し且つＴＧＦ−βの生物活
性を妨害しない方法で生物学的に活性なＴＧＦ−β化合
物に操作的に連結される。これは、ＤＢＭが破骨細胞に
よって吸収されるとＴＧＦ−βを放出することができ
る。
【００１８】本発明のＴＧＦ−βとＤＢＭは、１種以上
の薬学的に許容しうる担体と共に医薬組成物として存在
することが好ましい。本明細書で用いられる“生理的に
許容しうる”及び“薬学的に許容しうる”は、同じ意味
で用いられ、患者に投与した場合にアレルギー反応又は
類似の副作用、例えば胃の不調、めまい等を生じない分
子物質及び組成物を意味する。担体は、活性化合物を投
与するのに有効な物質であり、組成物の他の成分と適合
しその宿主に有害でない意味の“許容しうる”でなけれ
ばならない。本明細書で用いられる“薬学的に許容しう
る担体”とは、患者への投与と適合し、その投与時に毒
性又は副作用を生じない化合物を意味する。薬学的に許
容しうる担体の具体例は、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲ
ル液、油、ゲル、天然又は合成ポリマー及び中心体を含
む生物分解性マトリックス及びリポソームである。他の
薬学的に許容しうる担体は製薬の分野で周知であり、本
発明によって予想される。本明細書で用いられる“標識
物質”とは、本発明の生成物に操作的に連結される場
合、その存在を分析方法で検出することができる単一原
子又は分子を意味する。具体的な標識物質は、蛍光染
料、放射性同位元素、酵素及び抗体であり、独立して検
出することができるしそれと反応する基質又は他の分子
の添加物と連結して検出することができる。
の薬学的に許容しうる担体と共に医薬組成物として存在
することが好ましい。本明細書で用いられる“生理的に
許容しうる”及び“薬学的に許容しうる”は、同じ意味
で用いられ、患者に投与した場合にアレルギー反応又は
類似の副作用、例えば胃の不調、めまい等を生じない分
子物質及び組成物を意味する。担体は、活性化合物を投
与するのに有効な物質であり、組成物の他の成分と適合
しその宿主に有害でない意味の“許容しうる”でなけれ
ばならない。本明細書で用いられる“薬学的に許容しう
る担体”とは、患者への投与と適合し、その投与時に毒
性又は副作用を生じない化合物を意味する。薬学的に許
容しうる担体の具体例は、リン酸塩緩衝食塩水、リンゲ
ル液、油、ゲル、天然又は合成ポリマー及び中心体を含
む生物分解性マトリックス及びリポソームである。他の
薬学的に許容しうる担体は製薬の分野で周知であり、本
発明によって予想される。本明細書で用いられる“標識
物質”とは、本発明の生成物に操作的に連結される場
合、その存在を分析方法で検出することができる単一原
子又は分子を意味する。具体的な標識物質は、蛍光染
料、放射性同位元素、酵素及び抗体であり、独立して検
出することができるしそれと反応する基質又は他の分子
の添加物と連結して検出することができる。
【００１９】本明細書で用いられる“実質的に”とは、
高レベルの類似性を意味する。本発明の実質的に精製さ
れたペプチドは、約１０％未満の外来性ペプチドが存在
した標品を意味する。本発明の実質的に類似の配列は、
参照配列についての変化が約１０％より少ない。医薬組
成物は、製薬技術において周知の任意の方法により調製
され、全て活性化合物とその担体の結合を生じることを
含んでいる。治療用の場合、本発明で用いられる薬剤
は、慣用的な医薬組成物として投与することができる。
そのような組成物は、非経口投与又は充填材として適す
るように処方することができる。これらの組成物におい
て、典型的には、生理的に許容しうる担体に薬剤を溶解
又は分散させる。一例として、本発明の化合物は、骨折
又は欠損に適合するように形成することができる無菌懸
濁液又はパテ様基質又は適切な保存剤を含む等張製剤の
ような展性のある非液状可塑性組成物として用いること
ができる。成形基質に骨芽細胞が移動し骨形成すること
ができる水性等張物質及び無菌半剛性物質で構成された
生物分解性の展性のある基質が本発明の目的に特に十分
適する。
高レベルの類似性を意味する。本発明の実質的に精製さ
れたペプチドは、約１０％未満の外来性ペプチドが存在
した標品を意味する。本発明の実質的に類似の配列は、
参照配列についての変化が約１０％より少ない。医薬組
成物は、製薬技術において周知の任意の方法により調製
され、全て活性化合物とその担体の結合を生じることを
含んでいる。治療用の場合、本発明で用いられる薬剤
は、慣用的な医薬組成物として投与することができる。
そのような組成物は、非経口投与又は充填材として適す
るように処方することができる。これらの組成物におい
て、典型的には、生理的に許容しうる担体に薬剤を溶解
又は分散させる。一例として、本発明の化合物は、骨折
又は欠損に適合するように形成することができる無菌懸
濁液又はパテ様基質又は適切な保存剤を含む等張製剤の
ような展性のある非液状可塑性組成物として用いること
ができる。成形基質に骨芽細胞が移動し骨形成すること
ができる水性等張物質及び無菌半剛性物質で構成された
生物分解性の展性のある基質が本発明の目的に特に十分
適する。
【００２０】本明細書で記載される医薬処方は、上記担
体成分の他に、適切とされる１種以上の追加の担体成
分、例えば希釈剤、バッファー、結合剤、界面活性剤、
シックナー、滑沢剤、保存剤（酸化防止剤を含む）等及
び企図された宿主の血液と処方を等張にする目的で含め
られた物質を含めることができることは、理解されるべ
きである。本明細書で用いられる“約”とは、示された
値より１０％以下だけ大きい及び／又は小さい数値範囲
を意味する。例えば、約２０℃の温度は１８〜２２℃の
温度を含むことである。本発明で用いられる“可塑性”
及び“展性”は、同じ意味で用いられ、指定された形態
に形成又は成形することができ、形成された形態を維持
させることができる物質を意味する。本発明の特に好ま
しい支持材料は、ＤＢＭ及びＴＧＦ−βを含む生物分解
性基質及び分解性ホモポリマー又はコポリマーを含む。
具体的なホモポリマー又はコポリマーとしては、ポリ乳
酸、乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリグリコール
酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリア
ンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、
ポリアミド、ポリアセタール、ポリアミノ酸及びポリシ
アノアクリレートが挙げられる。
体成分の他に、適切とされる１種以上の追加の担体成
分、例えば希釈剤、バッファー、結合剤、界面活性剤、
シックナー、滑沢剤、保存剤（酸化防止剤を含む）等及
び企図された宿主の血液と処方を等張にする目的で含め
られた物質を含めることができることは、理解されるべ
きである。本明細書で用いられる“約”とは、示された
値より１０％以下だけ大きい及び／又は小さい数値範囲
を意味する。例えば、約２０℃の温度は１８〜２２℃の
温度を含むことである。本発明で用いられる“可塑性”
及び“展性”は、同じ意味で用いられ、指定された形態
に形成又は成形することができ、形成された形態を維持
させることができる物質を意味する。本発明の特に好ま
しい支持材料は、ＤＢＭ及びＴＧＦ−βを含む生物分解
性基質及び分解性ホモポリマー又はコポリマーを含む。
具体的なホモポリマー又はコポリマーとしては、ポリ乳
酸、乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリグリコール
酸、ポリカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリア
ンヒドリド、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、
ポリアミド、ポリアセタール、ポリアミノ酸及びポリシ
アノアクリレートが挙げられる。
【００２１】腫瘍増殖因子−β1(TGF-β1)は、細胞増殖
及び分化の多機能調節物質である。これは、サル腎細胞
の増殖抑制(Tucker,R.F.,G.D.Shipley,H.L.Moses & R.
W.Holley(1984)Science 226:705-707) 、数種のヒトが
ん細胞系の増殖抑制(Roberts,A.B.,M.A.Anzano,L.M.Wak
efield,N.S.Roches,D.F.Stern & M.B.Sporn(1985)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82:119-123;Ranchalis,J.E.,L.E.Ge
ntry,Y.Agawa,S.M.Seyedin,J.McPherson,A.Purchio &
D.R.Twardzik(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.148:7
83-789)、マウスケラチン細胞の抑制(Coffey,R.J.,N.J.
Sipes,C.C.Bascum,R.Gravesdeal,C.Pennington,B.E.Wei
ssman & H.L.Moses(1988)Cancer Res.48:1596-1602;Rei
ss,M.& C.L.Dibble(1988 In Vitro Cell.Dev.Biol.24:5
37-544)、AKR-2B線維芽細胞(Tucker,R.F.,M.E.Olkenan
t,E.L.Branum & H.L.Moses(1988)Cancer Res.43:1581-1
586)及び正常ラット腎臓線維芽細胞(Roberts,A.B.,M.A.
Anzano,L.C.Lamb,J.M.Smith & M.B.Sporn(1981)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 78:5339-5343) の増殖刺激、フィブロ
ネクチン及びコラーゲンの合成及び分泌刺激(Ignotz,R.
A.& J.Massague(1986)J.Biol.Chem.261:4337-4345;Cent
rella,M.,T.L.McCarthy& E.Canalis(1987)J.Biol.Chem.
262:2869-2874) 、筋間葉細胞における軟骨特異的巨大
分子産生の誘導(Seyedin,S.M.,A.Y.Thompson,H.Bentz,
D.M.Rosen,J.McPherson,A.Contin,N.R.Siegel,G.R.Gall
uppi & K.A.Piez(1986)J.Biol.Chem.261:5693-5695)及
びＴ及びＢリンパ球の増殖抑制(Kehrl,J.H.,L.M.Wakefi
eld,A.B.Roberts,S.Jakeoview,M.Alvarez-Mon,R.Derync
k,M.B.Sporn & A.S.Fauci(1986)J.Exp.Med.163:1037-10
50;Kehrl,J.H.,A.B.Roberts,L.M.Wakefield,S.Jakovie
w,M.B.Sporn & A.S.Fauci(1987)J.Immunol.137:3855-38
60;Kasid,A.,G.I.Bell & E.P.Director(1988)J.Immuno
l.141:690-698;Wahl,S.M.,D.A.Hunt,H.L.Wong,S.Doughe
rty,N.McCartney-Francis,L.M.Wahl,L.Ellingsworth,J.
A.Schmidt,G.Hall,A.B.Roberts & M.B.Sporn(1988)J.Im
munol.140:3026-3032)のような異種効果をもたらすこと
ができる。
及び分化の多機能調節物質である。これは、サル腎細胞
の増殖抑制(Tucker,R.F.,G.D.Shipley,H.L.Moses & R.
W.Holley(1984)Science 226:705-707) 、数種のヒトが
ん細胞系の増殖抑制(Roberts,A.B.,M.A.Anzano,L.M.Wak
efield,N.S.Roches,D.F.Stern & M.B.Sporn(1985)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 82:119-123;Ranchalis,J.E.,L.E.Ge
ntry,Y.Agawa,S.M.Seyedin,J.McPherson,A.Purchio &
D.R.Twardzik(1987)Biochem.Biophys.Res.Commun.148:7
83-789)、マウスケラチン細胞の抑制(Coffey,R.J.,N.J.
Sipes,C.C.Bascum,R.Gravesdeal,C.Pennington,B.E.Wei
ssman & H.L.Moses(1988)Cancer Res.48:1596-1602;Rei
ss,M.& C.L.Dibble(1988 In Vitro Cell.Dev.Biol.24:5
37-544)、AKR-2B線維芽細胞(Tucker,R.F.,M.E.Olkenan
t,E.L.Branum & H.L.Moses(1988)Cancer Res.43:1581-1
586)及び正常ラット腎臓線維芽細胞(Roberts,A.B.,M.A.
Anzano,L.C.Lamb,J.M.Smith & M.B.Sporn(1981)Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA 78:5339-5343) の増殖刺激、フィブロ
ネクチン及びコラーゲンの合成及び分泌刺激(Ignotz,R.
A.& J.Massague(1986)J.Biol.Chem.261:4337-4345;Cent
rella,M.,T.L.McCarthy& E.Canalis(1987)J.Biol.Chem.
262:2869-2874) 、筋間葉細胞における軟骨特異的巨大
分子産生の誘導(Seyedin,S.M.,A.Y.Thompson,H.Bentz,
D.M.Rosen,J.McPherson,A.Contin,N.R.Siegel,G.R.Gall
uppi & K.A.Piez(1986)J.Biol.Chem.261:5693-5695)及
びＴ及びＢリンパ球の増殖抑制(Kehrl,J.H.,L.M.Wakefi
eld,A.B.Roberts,S.Jakeoview,M.Alvarez-Mon,R.Derync
k,M.B.Sporn & A.S.Fauci(1986)J.Exp.Med.163:1037-10
50;Kehrl,J.H.,A.B.Roberts,L.M.Wakefield,S.Jakovie
w,M.B.Sporn & A.S.Fauci(1987)J.Immunol.137:3855-38
60;Kasid,A.,G.I.Bell & E.P.Director(1988)J.Immuno
l.141:690-698;Wahl,S.M.,D.A.Hunt,H.L.Wong,S.Doughe
rty,N.McCartney-Francis,L.M.Wahl,L.Ellingsworth,J.
A.Schmidt,G.Hall,A.B.Roberts & M.B.Sporn(1988)J.Im
munol.140:3026-3032)のような異種効果をもたらすこと
ができる。
【００２２】最近の研究では、ＴＧＦ−β１が多数の密
接に関係した増殖調節タンパク質群であり、ＴＧＦ−β
2(Seyedin,S.M.,P.R.Segarini,D.M.Rosen,A.Y.Thompso
n,H.Bentz & J.Graycar(1987)J.Biol.Chem.262:1946-19
49;Cheifetz,S.,J.A.Weatherbee,M.L.-S.Tsang,J.K.And
erson,J.E.Mole,R.Lucas & J.Massague(1987)Cell 48:4
09-415;Ikeda,T.,M.M.Lioubin & H.Marquardt(1987)Bio
chemistry 26:2406-2410)、ＴＧＦ−β3(TenDijke,P.,
P.Hansen,K.Iwata,C.Pieler & J.G.Foulkes(1988)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85:4715-4719;Derynck,R.,P.Lindqu
ist,A.Lee,D.Wen,J.Tamm,J.L.Graycar,L Rhee,A.J.Maso
n,D.A.Miller,R.J.Coffey,H.L.Moses & E.Y.Chen(1988)
EMBO J.7:3737-3743;Jakowlew,S.B.,P.J.Dillard,P.Kon
daiah,M.B.Sporn & A.B.Roberts(1988)Mol.Endocrinolo
gy.2:747-755) 、ＴＧＦ−β4(Jakowlew,S.B.,P.J.Dill
ard,M.B.Sporn & A.B.Roberts(1988)Mol.Endocrinolog
y.2:1186-1195) 、ミュラー阻害物質(Cate,R.L.,R.J.Ma
ttaliano,C.Hession,R.Tizard,N.M.Faber,A.Cheung,E.
G.Ninfa,A.Z.Frey,D.J.Dash,E.P.Chow,R.A.Fisher,J.M.
Bertonis,G.Torres,B.P.Wallner,K.L.Ramachandran,R.
C.Ragin,T.F.Manganaro,D.T.Maclaughlin & P.K,Donaho
e(1986)Cell 45:685-698)及びインヒビン(Mason,A.J.,
J.S.Hayflick,N.Ling,F.Esch,N.Ueno,S.-Y.Ying,R.Guil
lemin,H.Niall & P.H.Seeburg(1985)Nature 318:659-66
3)を含むことが指摘されている。
接に関係した増殖調節タンパク質群であり、ＴＧＦ−β
2(Seyedin,S.M.,P.R.Segarini,D.M.Rosen,A.Y.Thompso
n,H.Bentz & J.Graycar(1987)J.Biol.Chem.262:1946-19
49;Cheifetz,S.,J.A.Weatherbee,M.L.-S.Tsang,J.K.And
erson,J.E.Mole,R.Lucas & J.Massague(1987)Cell 48:4
09-415;Ikeda,T.,M.M.Lioubin & H.Marquardt(1987)Bio
chemistry 26:2406-2410)、ＴＧＦ−β3(TenDijke,P.,
P.Hansen,K.Iwata,C.Pieler & J.G.Foulkes(1988)Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 85:4715-4719;Derynck,R.,P.Lindqu
ist,A.Lee,D.Wen,J.Tamm,J.L.Graycar,L Rhee,A.J.Maso
n,D.A.Miller,R.J.Coffey,H.L.Moses & E.Y.Chen(1988)
EMBO J.7:3737-3743;Jakowlew,S.B.,P.J.Dillard,P.Kon
daiah,M.B.Sporn & A.B.Roberts(1988)Mol.Endocrinolo
gy.2:747-755) 、ＴＧＦ−β4(Jakowlew,S.B.,P.J.Dill
ard,M.B.Sporn & A.B.Roberts(1988)Mol.Endocrinolog
y.2:1186-1195) 、ミュラー阻害物質(Cate,R.L.,R.J.Ma
ttaliano,C.Hession,R.Tizard,N.M.Faber,A.Cheung,E.
G.Ninfa,A.Z.Frey,D.J.Dash,E.P.Chow,R.A.Fisher,J.M.
Bertonis,G.Torres,B.P.Wallner,K.L.Ramachandran,R.
C.Ragin,T.F.Manganaro,D.T.Maclaughlin & P.K,Donaho
e(1986)Cell 45:685-698)及びインヒビン(Mason,A.J.,
J.S.Hayflick,N.Ling,F.Esch,N.Ueno,S.-Y.Ying,R.Guil
lemin,H.Niall & P.H.Seeburg(1985)Nature 318:659-66
3)を含むことが指摘されている。
【００２３】ＴＧＦ−β１は、２個の同一のジスルフィ
ド結合１２kDのサブユニットからなる24-kDaのタンパク
質である(Assoian,R.K.,A.Komoriya,C.A.Meyers,D.M.Mi
ller& M.B.Sporn(1983)J.Biol.Chem.258:7155-7160;Fro
lik,C.A.,L.L.Dart,C.A.Meyers,D.M.Miller & M.B.Spor
n(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3676-3680;Frolik,
C.A.,L.M.Wakefield,D.M.Smith & M.B.Sporn(1984)J.Bi
ol.Chem.259:10995-11000) 。ヒト(Derynck,R.,J.A.Jar
rett,E.Y.Chem,D.H.Eaton,J.R.Bell,R.K.Assoian,A.B.R
oberts,M.B.Sporn & D.V.Goeddel(1985)Nature 316:701
-705)、マウス(Derynck,R.,J.A.Jarrett,E.Y.Chem,& D.
V.Goeddel(1986)J.Biol.Chem.261:4377-4379)及びサル
(Sharples,K.,G.D.Plowman,T.M.Rose,D.R.Twardzik &
A.F.Purchio(1987)DNA 6:239-244)ＴＧＦ−β１をコー
ドするｃＤＮＡクローンの分析により、このタンパク質
が大きな３９０アミノ酸プレ−プロ−ＴＧＦ−β１前駆
体として合成され、次いで、カルボキシ末端の１１２ア
ミノ酸部分がタンパク質分解的に切断されてＴＧＦ−β
１モノマーを生成することが示されている。
ド結合１２kDのサブユニットからなる24-kDaのタンパク
質である(Assoian,R.K.,A.Komoriya,C.A.Meyers,D.M.Mi
ller& M.B.Sporn(1983)J.Biol.Chem.258:7155-7160;Fro
lik,C.A.,L.L.Dart,C.A.Meyers,D.M.Miller & M.B.Spor
n(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80:3676-3680;Frolik,
C.A.,L.M.Wakefield,D.M.Smith & M.B.Sporn(1984)J.Bi
ol.Chem.259:10995-11000) 。ヒト(Derynck,R.,J.A.Jar
rett,E.Y.Chem,D.H.Eaton,J.R.Bell,R.K.Assoian,A.B.R
oberts,M.B.Sporn & D.V.Goeddel(1985)Nature 316:701
-705)、マウス(Derynck,R.,J.A.Jarrett,E.Y.Chem,& D.
V.Goeddel(1986)J.Biol.Chem.261:4377-4379)及びサル
(Sharples,K.,G.D.Plowman,T.M.Rose,D.R.Twardzik &
A.F.Purchio(1987)DNA 6:239-244)ＴＧＦ−β１をコー
ドするｃＤＮＡクローンの分析により、このタンパク質
が大きな３９０アミノ酸プレ−プロ−ＴＧＦ−β１前駆
体として合成され、次いで、カルボキシ末端の１１２ア
ミノ酸部分がタンパク質分解的に切断されてＴＧＦ−β
１モノマーを生成することが示されている。
【００２４】サルＴＧＦ−β１ｃＤＮＡクローンは、チ
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で高レベルま
で発現している。これらの細胞によって分泌されたタン
パク質の部位特異的抗ペプチド抗体、ペプチドマップ及
びタンパク質配列決定を用いた分析により、ＴＧＦ−β
の成熟及び前駆形双方が作製され、ジスルフィド結合の
複合配列によって部分的に一緒に保持されることがわか
った(Gentry,L.E.,N.R.Webb,J.Lim,A.M.Brunner,J.E.Ra
nchalis,D.R.Twardzik,M.N.Lioubin,H.Marquardt & A.
F.Purchio(1987)Mol.Cell Biol.7:3418-3427;Gentry,L.
E.,M.N.LiouBin,A.F.Purchio & H.Marquardt(1988)Mol.
Cell.Biol.8:4162-4168) 。精製して２４kD成熟ｒＴＧ
Ｆ−β１から分離すると、９０〜１１０kD前駆複合体が
３種類：プロＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１前駆体のプロ
領域及び成熟ＴＧＦ−β１からなることが判明した(Gen
try,L.E.,N.R.Webb,J.Lim,A.M.Brunner,J.E.Ranchalis,
D.R.Twardzik,M.N.Lioubin,H.Marquardt & A.F.Purchio
(1987)Mol.Cell Biol.7:3418-3427;Gentry,L.E.,M.N.Li
ouBin,A.F.Purchio & H.Marquardt(1988)Mol.Cell.Bio
l.8:4162-4168) 。分析する前に酸性化して最適生物活
性を検出するとｒＴＧＦ−β１が潜在形態として分泌さ
れたことを示した。
ャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞で高レベルま
で発現している。これらの細胞によって分泌されたタン
パク質の部位特異的抗ペプチド抗体、ペプチドマップ及
びタンパク質配列決定を用いた分析により、ＴＧＦ−β
の成熟及び前駆形双方が作製され、ジスルフィド結合の
複合配列によって部分的に一緒に保持されることがわか
った(Gentry,L.E.,N.R.Webb,J.Lim,A.M.Brunner,J.E.Ra
nchalis,D.R.Twardzik,M.N.Lioubin,H.Marquardt & A.
F.Purchio(1987)Mol.Cell Biol.7:3418-3427;Gentry,L.
E.,M.N.LiouBin,A.F.Purchio & H.Marquardt(1988)Mol.
Cell.Biol.8:4162-4168) 。精製して２４kD成熟ｒＴＧ
Ｆ−β１から分離すると、９０〜１１０kD前駆複合体が
３種類：プロＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β１前駆体のプロ
領域及び成熟ＴＧＦ−β１からなることが判明した(Gen
try,L.E.,N.R.Webb,J.Lim,A.M.Brunner,J.E.Ranchalis,
D.R.Twardzik,M.N.Lioubin,H.Marquardt & A.F.Purchio
(1987)Mol.Cell Biol.7:3418-3427;Gentry,L.E.,M.N.Li
ouBin,A.F.Purchio & H.Marquardt(1988)Mol.Cell.Bio
l.8:4162-4168) 。分析する前に酸性化して最適生物活
性を検出するとｒＴＧＦ−β１が潜在形態として分泌さ
れたことを示した。
【００２５】ＴＧＦ−β１前駆体のプロ領域は、３つの
部位（Ａsn８２、Ａsn１３６及びＡsn１７６）でグリコ
シル化されることが判明し、これらのうちの最初の２つ
（Ａsn８２及びＡsn１３６）はマンノース−６−リン酸
残基を含有する（Brunner,A.M.,L.E.Gentry,J.A.Cooper
& A.F.Purchio(1988)Mol.Cell Biol.8:2229-2232;Purc
hio,A.F.,J.A.Cooper,A.M.Brunner,M.N.Lioubin,L.E.Ge
ntry,K.S.Kovacina,R.A.Roth & H.Marquardt(1988)J.Bi
ol.Chem.263:14211-14215)。更に、ｒＴＧＦ−β１前駆
体は、マンノース−６−リン酸レセプターに結合するこ
とができ、タンパク質分解プロセシングが生じることが
あるリソソームに送逹する機序を示すことができる(Kor
nfeld,S.(1986)J.Clin.Invest.77:1-6) 。ＴＧＦ−β２
もまた、同一のジスルフィド結合１１２アミノ酸サブユ
ニットを有する２４−kDの同種２量体である(Marquard
t,H.,M.N.Lioubin & T.Ikeda(1987)J.Biol.Chem.262:12
127-12131) 。ヒト(Madisen,L.,N.R.Webb,T.M.Rose,H.M
arquardt,T.Ikeda,D.Twardzik,S.Seyedin & A.F.Purchi
o(1988)DNA 7:1-8;DeMartin,R.,B.Plaendler,R.Hoefer-
Warbinek,H.Gaugitsch,M.Wrann,H.Schlusener,J.M.Seif
ert,S.Bodmer,A.Fontana & E.Hoefer.EMBO J.6:3673-36
77)及びサル(Hanks,S.K.,R.Armour,J.H.Baldwin,F.Mald
onado,J.Spiess & R.W.Holley(1988)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:79-82)ＴＧＦ−β２をコードするｃＤＮＡの
分析は、より大きな前駆体タンパク質としても合成され
ることを示した。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の成熟
領域は、７０％相同性を示すが、３０％相同性は前駆体
のプロ領域で生じる。サル及びヒトＴＧＦ−β２前駆体
タンパク質の場合、プロ領域の２８アミノ酸挿入により
異なり、これら２つのタンパク質をコードするｍＲＮＡ
は微分スプライシングにより生じると考えられる(Webb,
N.R.,L.Madisen,T.M.Rose& A.F.Purchio(1988)DNA 7:49
3-497) 。
部位（Ａsn８２、Ａsn１３６及びＡsn１７６）でグリコ
シル化されることが判明し、これらのうちの最初の２つ
（Ａsn８２及びＡsn１３６）はマンノース−６−リン酸
残基を含有する（Brunner,A.M.,L.E.Gentry,J.A.Cooper
& A.F.Purchio(1988)Mol.Cell Biol.8:2229-2232;Purc
hio,A.F.,J.A.Cooper,A.M.Brunner,M.N.Lioubin,L.E.Ge
ntry,K.S.Kovacina,R.A.Roth & H.Marquardt(1988)J.Bi
ol.Chem.263:14211-14215)。更に、ｒＴＧＦ−β１前駆
体は、マンノース−６−リン酸レセプターに結合するこ
とができ、タンパク質分解プロセシングが生じることが
あるリソソームに送逹する機序を示すことができる(Kor
nfeld,S.(1986)J.Clin.Invest.77:1-6) 。ＴＧＦ−β２
もまた、同一のジスルフィド結合１１２アミノ酸サブユ
ニットを有する２４−kDの同種２量体である(Marquard
t,H.,M.N.Lioubin & T.Ikeda(1987)J.Biol.Chem.262:12
127-12131) 。ヒト(Madisen,L.,N.R.Webb,T.M.Rose,H.M
arquardt,T.Ikeda,D.Twardzik,S.Seyedin & A.F.Purchi
o(1988)DNA 7:1-8;DeMartin,R.,B.Plaendler,R.Hoefer-
Warbinek,H.Gaugitsch,M.Wrann,H.Schlusener,J.M.Seif
ert,S.Bodmer,A.Fontana & E.Hoefer.EMBO J.6:3673-36
77)及びサル(Hanks,S.K.,R.Armour,J.H.Baldwin,F.Mald
onado,J.Spiess & R.W.Holley(1988)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 85:79-82)ＴＧＦ−β２をコードするｃＤＮＡの
分析は、より大きな前駆体タンパク質としても合成され
ることを示した。ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β２の成熟
領域は、７０％相同性を示すが、３０％相同性は前駆体
のプロ領域で生じる。サル及びヒトＴＧＦ−β２前駆体
タンパク質の場合、プロ領域の２８アミノ酸挿入により
異なり、これら２つのタンパク質をコードするｍＲＮＡ
は微分スプライシングにより生じると考えられる(Webb,
N.R.,L.Madisen,T.M.Rose& A.F.Purchio(1988)DNA 7:49
3-497) 。
【００２６】ＴＧＦ−βの作用は、ほとんどの細胞の表
面に存在する特異的レセプターに結合することにより仲
介されると考えられる(Massague,J.等(1985)J.Biol.Che
m.260:2636-2645; Segarini,P.R.等(1989)Mol.Endocrin
o.3:261-272;Tucker,R.F.,等(1984)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81:6757-6761;Wakefield,L.M.等(1987)J.Cell Bi
ol.105:965-975)。［125I］標識ＴＧＦ−βの細胞表面
成分に対する化学架橋により、分子量５３〜７０kDａ(I
型レセプター) 、８０〜１２０kDａ(II 型レセプター)
及び２５０〜３５０kDａ(III型レセプター) を有する３
種類のサイズが同定されている。Ｉ及びII型レセプター
は、シグナル形質導入に関与しており(Boyd,F.T.等(198
9)J.Biol.Chem.264:2272-2278;Laiho,M.等(1990)J.Bio
l.Chem.265:18518-18524)、III 型レセプターは貯蔵タ
ンパク質として作用することが示されている(Segarini,
P.R.等(1989)Mol.Endocrine.3:261-272)。レセプター−
リガンド相互作用した後に生じるシグナル形質導入機序
に関してはほとんど知られていない。
面に存在する特異的レセプターに結合することにより仲
介されると考えられる(Massague,J.等(1985)J.Biol.Che
m.260:2636-2645; Segarini,P.R.等(1989)Mol.Endocrin
o.3:261-272;Tucker,R.F.,等(1984)Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA 81:6757-6761;Wakefield,L.M.等(1987)J.Cell Bi
ol.105:965-975)。［125I］標識ＴＧＦ−βの細胞表面
成分に対する化学架橋により、分子量５３〜７０kDａ(I
型レセプター) 、８０〜１２０kDａ(II 型レセプター)
及び２５０〜３５０kDａ(III型レセプター) を有する３
種類のサイズが同定されている。Ｉ及びII型レセプター
は、シグナル形質導入に関与しており(Boyd,F.T.等(198
9)J.Biol.Chem.264:2272-2278;Laiho,M.等(1990)J.Bio
l.Chem.265:18518-18524)、III 型レセプターは貯蔵タ
ンパク質として作用することが示されている(Segarini,
P.R.等(1989)Mol.Endocrine.3:261-272)。レセプター−
リガンド相互作用した後に生じるシグナル形質導入機序
に関してはほとんど知られていない。
【００２７】ＴＧＦ−βの多面的効果は、他の遺伝子の
転写に影響する能力によることができる。ＴＧＦ−β
は、AKR-2B細胞のfos 、myc 及び sisを誘導する(Leof,
E.B.等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1453-1458)；
A549細胞のc-junBの発現を高める(Pertovaara,L.等(198
9)Molecular and Cellular Biology 9:1255-1264) ；基
質タンパク質 (Penttinen,R.P.等(1988)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 85:1105-1110)、IL-6 (Elias,J.A.等(1991)
J.Immunol.146:3437-3446)及びEGF-レセプター(Thompso
n,K.L.等(1988)J.Biol.Chem.263:19519-19528)のｍＲＮ
Ａを増加させる；及びPDGFレセプターαサブユニットの
発現を減少させる(Battegay,E.J.等(1990)Cell63:515-5
24) ことが知られている。これは、骨肉腫細胞のインテ
グリン発現のパターンを変え (Heino,J.等(1989)J.Bio
l.Chem.264:21806-21813)、ケラチン細胞の c-mysの発
現を減少させる(Coffey,R.J.等(1988)Cancer Res.48:15
96-1602)。ＴＧＦ−βは、ヒト末梢血液単球のIL-1β、
TNF-α、PDGF及びbFGFの発現を誘導する (McCartney-Fr
ancis,N.等(1991)DNA and Cell Biology 10:293-300)。
転写に影響する能力によることができる。ＴＧＦ−β
は、AKR-2B細胞のfos 、myc 及び sisを誘導する(Leof,
E.B.等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:1453-1458)；
A549細胞のc-junBの発現を高める(Pertovaara,L.等(198
9)Molecular and Cellular Biology 9:1255-1264) ；基
質タンパク質 (Penttinen,R.P.等(1988)Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA 85:1105-1110)、IL-6 (Elias,J.A.等(1991)
J.Immunol.146:3437-3446)及びEGF-レセプター(Thompso
n,K.L.等(1988)J.Biol.Chem.263:19519-19528)のｍＲＮ
Ａを増加させる；及びPDGFレセプターαサブユニットの
発現を減少させる(Battegay,E.J.等(1990)Cell63:515-5
24) ことが知られている。これは、骨肉腫細胞のインテ
グリン発現のパターンを変え (Heino,J.等(1989)J.Bio
l.Chem.264:21806-21813)、ケラチン細胞の c-mysの発
現を減少させる(Coffey,R.J.等(1988)Cancer Res.48:15
96-1602)。ＴＧＦ−βは、ヒト末梢血液単球のIL-1β、
TNF-α、PDGF及びbFGFの発現を誘導する (McCartney-Fr
ancis,N.等(1991)DNA and Cell Biology 10:293-300)。
【００２８】本発明の組成物及び方法は、骨粗鬆症の骨
の再生及び補充、顔面骨格の増大、下顎及び頭蓋骨欠損
の再建及び歯周適用のような骨形成の治療及び再建方法
で用いることができる。本発明は、新生骨の成長刺激及
び骨折した骨の再生、寛骨臼欠損の修復、骨粗鬆症、骨
の良性嚢胞性病巣又は腫瘍病巣及び骨格欠損の充填用組
成物及び方法を企図する。無菌条件下で調製されたＤＢ
Ｍ及びＴＧＦ−βの組成物を含む充填材は、骨形成が所
望される骨部位に充填することができる。そのような骨
形成を予想する部位としては、骨折、下顎欠損、手術で
生じた頭蓋陥凹、歯充填及び歯周欠損が挙げられる。本
発明で形成された骨は、血管化及び骨化され、自然に形
成された骨と構造及び機能上区別できない。本発明で形
成された骨は、骨粉により刺激された従来の骨形成とは
著しく違って吸収されない。骨の形成又は再生を必要と
する骨折、歯周疾患及び骨格欠損の治療に有効である機
能的な非吸収性硬骨を形成するために、ＤＢＭ及びＴＧ
Ｆ−βの組み合わせが本発明者等によって見出された。
の再生及び補充、顔面骨格の増大、下顎及び頭蓋骨欠損
の再建及び歯周適用のような骨形成の治療及び再建方法
で用いることができる。本発明は、新生骨の成長刺激及
び骨折した骨の再生、寛骨臼欠損の修復、骨粗鬆症、骨
の良性嚢胞性病巣又は腫瘍病巣及び骨格欠損の充填用組
成物及び方法を企図する。無菌条件下で調製されたＤＢ
Ｍ及びＴＧＦ−βの組成物を含む充填材は、骨形成が所
望される骨部位に充填することができる。そのような骨
形成を予想する部位としては、骨折、下顎欠損、手術で
生じた頭蓋陥凹、歯充填及び歯周欠損が挙げられる。本
発明で形成された骨は、血管化及び骨化され、自然に形
成された骨と構造及び機能上区別できない。本発明で形
成された骨は、骨粉により刺激された従来の骨形成とは
著しく違って吸収されない。骨の形成又は再生を必要と
する骨折、歯周疾患及び骨格欠損の治療に有効である機
能的な非吸収性硬骨を形成するために、ＤＢＭ及びＴＧ
Ｆ−βの組み合わせが本発明者等によって見出された。
【００２９】本発明の方法及び組成物は、形成外科、顎
顔面再建、骨折、骨喪失及び骨格欠損の治療及び奇形に
有効であると予想される。ＴＧＦ−βに操作的に結合さ
れたＤＢＭを含む骨形成組成物は、可塑性及び展性があ
り上記適用及び用途に伝導する形状及び設計に形成する
ことができる実施態様にあることが好ましい。これらの
組成物の１つの企図される用途は、下顎骨を再構成及び
再成形した後、顎顔面を再建するものである。もう１つ
の企図される用途は、仮関節を治療するものである。３
番目の企図される用途は、新生骨の形成又は再生及び顎
に歯科用固定物を取り付ける歯科用充填材である。本発
明の精神及び範囲と一致した全ての用途が本明細書で企
図される。本発明の１態様においては、ＴＧＦ−βがヒ
ドロキシアパタイトのようなキャリヤ又は基質成分に操
作的に連結されるＤＢＭを有する組成物として企図され
る。この態様においては、ＴＧＦ−βは支持基質に局在
したままであり、骨形成はＤＢＭと固定化されたＴＧＦ
−βとの骨芽細胞相互作用の結果として刺激される。本
発明を一般的に記載してきたが、個々の実施例によって
更に理解を得ることができ、これらは具体的に説明する
ためにのみ本明細書に記載され、特にことわらない限り
限定されるものではない。
顔面再建、骨折、骨喪失及び骨格欠損の治療及び奇形に
有効であると予想される。ＴＧＦ−βに操作的に結合さ
れたＤＢＭを含む骨形成組成物は、可塑性及び展性があ
り上記適用及び用途に伝導する形状及び設計に形成する
ことができる実施態様にあることが好ましい。これらの
組成物の１つの企図される用途は、下顎骨を再構成及び
再成形した後、顎顔面を再建するものである。もう１つ
の企図される用途は、仮関節を治療するものである。３
番目の企図される用途は、新生骨の形成又は再生及び顎
に歯科用固定物を取り付ける歯科用充填材である。本発
明の精神及び範囲と一致した全ての用途が本明細書で企
図される。本発明の１態様においては、ＴＧＦ−βがヒ
ドロキシアパタイトのようなキャリヤ又は基質成分に操
作的に連結されるＤＢＭを有する組成物として企図され
る。この態様においては、ＴＧＦ−βは支持基質に局在
したままであり、骨形成はＤＢＭと固定化されたＴＧＦ
−βとの骨芽細胞相互作用の結果として刺激される。本
発明を一般的に記載してきたが、個々の実施例によって
更に理解を得ることができ、これらは具体的に説明する
ためにのみ本明細書に記載され、特にことわらない限り
限定されるものではない。
【００３０】
【実施例１】鉱質消失骨基質の調製 瀉血した成熟ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）系ウ
サギの収集長骨から無菌条件下で鉱質消失骨基質（ＤＢ
Ｍ）を調製した。骨を粉砕し、滅菌温水中で穏やかに攪
拌して洗浄し、乾燥した。次いで、洗浄した骨をテクマ
ーボーンミルで粒子サイズ７４〜５６５μm に摩砕し、
ふるいにかけて確実にした。摩砕した骨を0.６M ＨＣl
と混合し、更にｐＨが変化しなくなるまで0.６M ＨＣl
で洗浄を繰り返して鉱質を消失させた。次いで、リン酸
塩緩衝食塩水でｐＨ7.２７に調整し、摩砕した骨を凍結
乾燥した。処理したＤＢＭを無菌に保った。処理中ＤＢ
Ｍの繰り返し培養液は細菌について陰性であり、最終産
物のカブトガニ内毒素試験も陰性であった。
サギの収集長骨から無菌条件下で鉱質消失骨基質（ＤＢ
Ｍ）を調製した。骨を粉砕し、滅菌温水中で穏やかに攪
拌して洗浄し、乾燥した。次いで、洗浄した骨をテクマ
ーボーンミルで粒子サイズ７４〜５６５μm に摩砕し、
ふるいにかけて確実にした。摩砕した骨を0.６M ＨＣl
と混合し、更にｐＨが変化しなくなるまで0.６M ＨＣl
で洗浄を繰り返して鉱質を消失させた。次いで、リン酸
塩緩衝食塩水でｐＨ7.２７に調整し、摩砕した骨を凍結
乾燥した。処理したＤＢＭを無菌に保った。処理中ＤＢ
Ｍの繰り返し培養液は細菌について陰性であり、最終産
物のカブトガニ内毒素試験も陰性であった。
【００３１】
【実施例２】充填材の調製 ３００mgのＤＢＭをＰＢＳ中0.７mlの１％ウサギ血清ア
ルブミン(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)で再構成し
て濃厚なペーストを生成することにより充填材を調製し
た。次いで、組換え体ＴＧＦ−β１あるいは担体溶液を
ペーストに加えた。ＤＢＭの乾燥重量１ｇにつき０、
１、１０、１００及び２５０μg のＴＧＦ−β１を各々
含む充填材を調製した。充填材を直径約７mm、長さ２５
mmの円柱に成形した。
ルブミン(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)で再構成し
て濃厚なペーストを生成することにより充填材を調製し
た。次いで、組換え体ＴＧＦ−β１あるいは担体溶液を
ペーストに加えた。ＤＢＭの乾燥重量１ｇにつき０、
１、１０、１００及び２５０μg のＴＧＦ−β１を各々
含む充填材を調製した。充填材を直径約７mm、長さ２５
mmの円柱に成形した。
【００３２】
【実施例３】頭蓋骨誘導 ３７匹のニュージーランドホワイト系ウサギ、雄１９匹
及び雌１８匹、体重各々約2.０kgを、実験を始める前に
検疫下に置いて１週間飼った。１、１０、１００及び２
５０μg/g ＤＢＭ乾燥重量を各々含む充填材を受けるウ
サギを４グループに分けた。無菌操作室条件下で、ケタ
ミン及びキシラジンを筋肉注射してウサギに麻酔した。
眼窩上域を１cm切開し、骨膜のすぐ上を充填材の寸法に
対応した皮下嚢状空洞とし、やすりで軽く削った。充填
材を骨膜の上に置き切開を閉じた。１μg のグループに
対照としてＴＧＦ−β１なしの第２充填材を入れた。動
物に標準食を与え、屋内の金網のかごで飼った。塩酸テ
トラサイクリン(20mg/kg,Lederle Labs,Pearl River,N
J)、デメクロサイクリン(15 mg/kg,Lederlelabs,Pearl
River,NJ)及び塩酸テトラサイクリン(20 mg/kg)を１
６、２７及び３８日目に各々筋肉注射して骨形成の三重
テトラサイクリン標識化を行った。ペントバルビタール
の心臓内過量により、４２日目に動物を犠牲にした。下
にある頭蓋骨と連続した状態のままで充填材を回収し
た。単離した試料にラベルを付け、氷冷１０％緩衝ホル
ムアルデヒド溶液に入れた。エタノール濃度を増加して
脱水した後、メタクリル酸メチル中脱灰されていない試
料を包埋し、厚さ８mmに切り分けた。次いで活性類骨鉱
質化前頭葉のテトラサイクリン標識化に対してゴールド
ナー酸性ホスファターゼ染色及び蛍光顕微鏡を用いて組
織形態学的実験を行った。全体の試験では、１００μg
及び２５０μg の充填材が共に対照より大きく、黒く、
硬かった。表２及び図１、２及び３に示される組織形態
測定データは、切片に対して骨面積及び骨表面に対して
類骨表面の著しい増加を示した。切片に対してＤＢＭ面
積の著しい減少も見られた。切断すると、新生骨は骨柱
の硬度と外観を有し、下にある頭蓋冠に融合していた。
上にある軟組織に変化は見られなかった。これらの結果
は、ＤＢＭ１g につき１００μg 及び２５０μg 用量の
ＴＧＦ−β１が骨形成を著しく増大したことを示してい
る。ＴＧＦ−β１の存在しないＤＢＭは、著しい骨誘導
活性を示さなかった。
及び雌１８匹、体重各々約2.０kgを、実験を始める前に
検疫下に置いて１週間飼った。１、１０、１００及び２
５０μg/g ＤＢＭ乾燥重量を各々含む充填材を受けるウ
サギを４グループに分けた。無菌操作室条件下で、ケタ
ミン及びキシラジンを筋肉注射してウサギに麻酔した。
眼窩上域を１cm切開し、骨膜のすぐ上を充填材の寸法に
対応した皮下嚢状空洞とし、やすりで軽く削った。充填
材を骨膜の上に置き切開を閉じた。１μg のグループに
対照としてＴＧＦ−β１なしの第２充填材を入れた。動
物に標準食を与え、屋内の金網のかごで飼った。塩酸テ
トラサイクリン(20mg/kg,Lederle Labs,Pearl River,N
J)、デメクロサイクリン(15 mg/kg,Lederlelabs,Pearl
River,NJ)及び塩酸テトラサイクリン(20 mg/kg)を１
６、２７及び３８日目に各々筋肉注射して骨形成の三重
テトラサイクリン標識化を行った。ペントバルビタール
の心臓内過量により、４２日目に動物を犠牲にした。下
にある頭蓋骨と連続した状態のままで充填材を回収し
た。単離した試料にラベルを付け、氷冷１０％緩衝ホル
ムアルデヒド溶液に入れた。エタノール濃度を増加して
脱水した後、メタクリル酸メチル中脱灰されていない試
料を包埋し、厚さ８mmに切り分けた。次いで活性類骨鉱
質化前頭葉のテトラサイクリン標識化に対してゴールド
ナー酸性ホスファターゼ染色及び蛍光顕微鏡を用いて組
織形態学的実験を行った。全体の試験では、１００μg
及び２５０μg の充填材が共に対照より大きく、黒く、
硬かった。表２及び図１、２及び３に示される組織形態
測定データは、切片に対して骨面積及び骨表面に対して
類骨表面の著しい増加を示した。切片に対してＤＢＭ面
積の著しい減少も見られた。切断すると、新生骨は骨柱
の硬度と外観を有し、下にある頭蓋冠に融合していた。
上にある軟組織に変化は見られなかった。これらの結果
は、ＤＢＭ１g につき１００μg 及び２５０μg 用量の
ＴＧＦ−β１が骨形成を著しく増大したことを示してい
る。ＴＧＦ−β１の存在しないＤＢＭは、著しい骨誘導
活性を示さなかった。
【００３３】
【表２】 表２ TGF-β用量 骨面積# 基質面積# 類骨表面+ ──────────────────────────────────── 0 6.0 ± 2.4 7.2 ± 2.7 4.4 ± 3.2 1 6.0 ± 3.8 6.8 ± 4.5 3.5 ± 1.8 10 5.6 ± 3.3 3.7 ± 2.9§ 6.6 ± 2.4 100 10.0 ± 4.8§ 2.6 ± 1.8§ 7.9 ± 3.2§ 250 10.8 ± 2.4§ 0.9 ± 0.8§ 9.5 ± 6.8§ ──────────────────────────────────── # 切片当たり +骨表面当たり; §= p<0.05／対照
【００３４】ＴＧＦ−５β２５０μg の充填材を用いて
同様の実験を行った。組織形態測定データは表３に示さ
れ、ＴＧＦ−β１で得られた結果と同様である。
同様の実験を行った。組織形態測定データは表３に示さ
れ、ＴＧＦ−β１で得られた結果と同様である。
【００３５】
【表３】 表３ ARM 骨面積(mm2) 基質粒子面積(mm2) 皮質面積(mm2) ──────────────────────────────────── 対照 14.9 ± 3.3 20.3 ± 1.4 14.7 ± 1.8 250μg β1 55.3 ± 5.2 8.1 ± 1.3 13.8 ± 3.3 250μg 5β 70.9 ± 7.1 4.5 ± 2.0 15.7 ± 1.7 ────────────────────────────────────
【００３６】
【実施例４】ＴＧＦ−βの充填材からの放出 本発明で用いられるＴＧＦ−β／ＤＢＭ充填材につい
て、数種の試験管内放出実験を行った。第１の実験で
は、２５０μg のＴＧＦ−β/gＤＢＭを含むＴＧＦ−β
1/ＤＢＭ充填材をＰＢＳ中３７℃で振盪しながらインキ
ュベートした。指定した時間にバッファーを取り出し、
新しいバッファーと取り替えた。充填材からバッファー
に放出されたＴＧＦ−β１の量をＥＬＩＳＡにより求め
た。図４は、時間が経つにつれて２種類の充填材から放
出されるＴＧＦ−βの量を示す。一方の充填材は、ＤＢ
ＭとＴＧＦ−β１とをクエン酸塩バッファー（ｐＨ2.
５）中で混合して調製し、もう一方はＰＢＳバッファー
（ｐＨ7.４）を用いて調製した。両試料共に、最も著し
いＴＧＦ−β１の放出が最初の１２０時間で生じた。ク
エン酸塩バッファーで調製した試料はＴＧＦ−βの約１
０％を放出し、ＰＢＳで調製した試料は約７％を放出し
た。ＴＧＦ−βがＰＢＳ中３７℃で不活化されるように
なる場合を求めるために、１００μg/ml試料をＰＢＳ中
でインキュベートし、ＥＬＩＳＡで分析した。１８０時
間後でさえも、ＥＬＩＳＡ結合のロスは検出されなかっ
た（図５）。放出実験で用いたものと同一の試料を４M
塩酸グアニジン、１mM N-エチルマレイミド、１０mMＥ
ＤＴＡ、ｐＨ6.８で１６時間抽出してＴＧＦ−β１がど
の程度充填材に存在するかを求めた。表４は、ＴＧＦ−
βの４８〜６０％が回収されたことを示している。即
ち、生理的条件に曝された際にＴＧＦ−β１の大部分が
ＤＢＭに結合されたままであることを示す。ＰＢＳ中で
ＴＧＦ−β１を用いて調製したＤＢＭ充填材を４℃で１
ヵ月間貯蔵した。抽出後、ＴＧＦ−β１の５５％を回収
した。これは、４℃で貯蔵したときにＴＧＦ−βがＤＢ
Ｍ充填材中で安定であることを示している。
て、数種の試験管内放出実験を行った。第１の実験で
は、２５０μg のＴＧＦ−β/gＤＢＭを含むＴＧＦ−β
1/ＤＢＭ充填材をＰＢＳ中３７℃で振盪しながらインキ
ュベートした。指定した時間にバッファーを取り出し、
新しいバッファーと取り替えた。充填材からバッファー
に放出されたＴＧＦ−β１の量をＥＬＩＳＡにより求め
た。図４は、時間が経つにつれて２種類の充填材から放
出されるＴＧＦ−βの量を示す。一方の充填材は、ＤＢ
ＭとＴＧＦ−β１とをクエン酸塩バッファー（ｐＨ2.
５）中で混合して調製し、もう一方はＰＢＳバッファー
（ｐＨ7.４）を用いて調製した。両試料共に、最も著し
いＴＧＦ−β１の放出が最初の１２０時間で生じた。ク
エン酸塩バッファーで調製した試料はＴＧＦ−βの約１
０％を放出し、ＰＢＳで調製した試料は約７％を放出し
た。ＴＧＦ−βがＰＢＳ中３７℃で不活化されるように
なる場合を求めるために、１００μg/ml試料をＰＢＳ中
でインキュベートし、ＥＬＩＳＡで分析した。１８０時
間後でさえも、ＥＬＩＳＡ結合のロスは検出されなかっ
た（図５）。放出実験で用いたものと同一の試料を４M
塩酸グアニジン、１mM N-エチルマレイミド、１０mMＥ
ＤＴＡ、ｐＨ6.８で１６時間抽出してＴＧＦ−β１がど
の程度充填材に存在するかを求めた。表４は、ＴＧＦ−
βの４８〜６０％が回収されたことを示している。即
ち、生理的条件に曝された際にＴＧＦ−β１の大部分が
ＤＢＭに結合されたままであることを示す。ＰＢＳ中で
ＴＧＦ−β１を用いて調製したＤＢＭ充填材を４℃で１
ヵ月間貯蔵した。抽出後、ＴＧＦ−β１の５５％を回収
した。これは、４℃で貯蔵したときにＴＧＦ−βがＤＢ
Ｍ充填材中で安定であることを示している。
【００３７】第２の試験管内放出実験は、異なった濃度
のＴＧＦ−β１とＴＧＦ−５βを含むＤＢＭ充填材を用
いて行った。放出速度論は、図６Ａ及び６Ｂに示され
る。再び、ＤＢＭに結合されるＴＧＦ−βの少量のみが
放出される。低量のＴＧＦ−β１を含む試料より１２５
０μg ＴＧＦ−β1/g ＤＢＭ充填材から多量のＴＧＦ−
β１が放出される。ＴＧＦ−５βを含む充填材は同様の
傾向を示すが、１２５０及び２５０μg ＴＧＦ−５β/g
ＤＢＭ両試料は１００μg ＴＧＦ−５β/gＤＢＭ試料よ
り多量のＴＧＦ−５βを放出する。これらの試料もまた
４Ｍ塩酸グアニジンで抽出した。図７は、ＴＧＦ−β１
よりＴＧＦ−５βの方がＤＢＭから抽出されたことを示
している。これらの結果は、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−５
βとの間のＤＢＭ結合親和性の相違を示すことができ
る。上記実験の結果は、生理的条件下でＤＢＭ充填材か
ら少量のＴＧＦ−β１又はとＴＧＦ−５βのみが放出さ
れ、ＰＢＳ（ｐＨ7.４）で調製された充填材よりクエン
酸塩バッファー（ｐＨ7.４）で調製された充填材の方が
ＴＧＦ−βが放出されることを示している。ＴＧＦ−β
１より多量のＴＧＦ−５βがＤＢＭから放出又は抽出さ
れ、ＴＧＦ−β１の方がＤＢＭにしっかりと結合される
ことを示している。ＴＧＦ−β１は４℃で１ヵ月までの
間貯蔵される場合ＤＢＭ中で安定なままである。
のＴＧＦ−β１とＴＧＦ−５βを含むＤＢＭ充填材を用
いて行った。放出速度論は、図６Ａ及び６Ｂに示され
る。再び、ＤＢＭに結合されるＴＧＦ−βの少量のみが
放出される。低量のＴＧＦ−β１を含む試料より１２５
０μg ＴＧＦ−β1/g ＤＢＭ充填材から多量のＴＧＦ−
β１が放出される。ＴＧＦ−５βを含む充填材は同様の
傾向を示すが、１２５０及び２５０μg ＴＧＦ−５β/g
ＤＢＭ両試料は１００μg ＴＧＦ−５β/gＤＢＭ試料よ
り多量のＴＧＦ−５βを放出する。これらの試料もまた
４Ｍ塩酸グアニジンで抽出した。図７は、ＴＧＦ−β１
よりＴＧＦ−５βの方がＤＢＭから抽出されたことを示
している。これらの結果は、ＴＧＦ−β１とＴＧＦ−５
βとの間のＤＢＭ結合親和性の相違を示すことができ
る。上記実験の結果は、生理的条件下でＤＢＭ充填材か
ら少量のＴＧＦ−β１又はとＴＧＦ−５βのみが放出さ
れ、ＰＢＳ（ｐＨ7.４）で調製された充填材よりクエン
酸塩バッファー（ｐＨ7.４）で調製された充填材の方が
ＴＧＦ−βが放出されることを示している。ＴＧＦ−β
１より多量のＴＧＦ−５βがＤＢＭから放出又は抽出さ
れ、ＴＧＦ−β１の方がＤＢＭにしっかりと結合される
ことを示している。ＴＧＦ−β１は４℃で１ヵ月までの
間貯蔵される場合ＤＢＭ中で安定なままである。
【００３８】
【表４】 表４ 試料 理論回収(ng/ml) ELISA 回収(ng/ml) % ──────────────────────────────────── ４℃で１ヵ月貯蔵 1548 850 55 ＰＢＳで調製された新試料 5161 2463 48 クエン酸塩で調製された新試料 3132 1871 60 ──────────────────────────────────── 4M塩酸グアニジン／１mM N-エチルマレイミド／10mM E
DTA/pH 6.8中４℃で16時間抽出した試料。0.2M酢酸で24
時間透析。
DTA/pH 6.8中４℃で16時間抽出した試料。0.2M酢酸で24
時間透析。
【００３９】上記の説明及び実施例は、本発明を具体的
に説明したものであるが限定するものではない。本発明
の真の精神及び範囲を逸脱することなく多くの変更及び
修正を行うことができる。
に説明したものであるが限定するものではない。本発明
の真の精神及び範囲を逸脱することなく多くの変更及び
修正を行うことができる。
【図１】各用量のＴＧＦ−βを含む充填材に対して求め
た骨面積％を示す。ゴールドナー染色で染色された充填
材切片の典型的な面積上に格子をあてた。骨面積％は、
石灰化骨を示す緑色染色を含むスクェアの％として求め
た。
た骨面積％を示す。ゴールドナー染色で染色された充填
材切片の典型的な面積上に格子をあてた。骨面積％は、
石灰化骨を示す緑色染色を含むスクェアの％として求め
た。
【図２】各用量のＴＧＦ−βを含む充填材に対して求め
た基質面積％を示す。ゴールドナー染色で染色された充
填材切片の典型的な面積上に格子をあてた。基質面積％
は、染色されない残りの鉱質消失骨基質を含むスクェア
の％として求めた。
た基質面積％を示す。ゴールドナー染色で染色された充
填材切片の典型的な面積上に格子をあてた。基質面積％
は、染色されない残りの鉱質消失骨基質を含むスクェア
の％として求めた。
【図３】各用量のＴＧＦ−βを含む充填材切片で求めた
類骨表面積(mm2) を示す。切片をゴールドナー染色で染
色し、黄色染色で示されるまだ石灰化されない新生骨を
コンピュータ面積測定分析を用いて定量した。
類骨表面積(mm2) を示す。切片をゴールドナー染色で染
色し、黄色染色で示されるまだ石灰化されない新生骨を
コンピュータ面積測定分析を用いて定量した。
【図４】ＤＢＭ充填材から放出されたＴＧＦ−β１の経
時累積％を示す。試料を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中３７
℃で振盪しながらインキュベートした。２種類の試料、
クエン酸バッファーｐＨ2.５及びＰＢＳｐＨ7.４で調製
したものを調製した。
時累積％を示す。試料を１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中３７
℃で振盪しながらインキュベートした。２種類の試料、
クエン酸バッファーｐＨ2.５及びＰＢＳｐＨ7.４で調製
したものを調製した。
【図５】１％ＨＳＡを含むＰＢＳ中３７℃でインキュベ
ートしたＴＧＦ−β１（濃度１００μg/ml) の経時ＥＬ
ＩＳＡ活性を示す。
ートしたＴＧＦ−β１（濃度１００μg/ml) の経時ＥＬ
ＩＳＡ活性を示す。
【図６】ＤＢＭ充填材から放出されたＴＧＦ−β１
（ａ）及びＴＧＦ−５β（ｂ）の経時累積％を示す。試
料に１２５０、２５０又は１００μg ＴＧＦ−β/gＤＢ
Ｍが入っており、図４と同一条件下で放出された。
（ａ）及びＴＧＦ−５β（ｂ）の経時累積％を示す。試
料に１２５０、２５０又は１００μg ＴＧＦ−β/gＤＢ
Ｍが入っており、図４と同一条件下で放出された。
【図７】種々の量のＴＧＦ−βが入ったＤＢＭ充填材か
ら抽出されたＴＧＦ−β１又はＴＧＦ−５βの全量を示
す。抽出は、４M グアニジンＮＣl 、１ mM N-エチルマ
レイミド、１０mMＥＤＴＡ、ｐＨ6.８中４℃で１６時間
行った。抽出後、試料を0.２M 酢酸で透析し、ＥＬＩＳ
Ａで分析した。
ら抽出されたＴＧＦ−β１又はＴＧＦ−５βの全量を示
す。抽出は、４M グアニジンＮＣl 、１ mM N-エチルマ
レイミド、１０mMＥＤＴＡ、ｐＨ6.８中４℃で１６時間
行った。抽出後、試料を0.２M 酢酸で透析し、ＥＬＩＳ
Ａで分析した。
フロントページの続き (72)発明者 ウェイン アール ゴンボーツ アメリカ合衆国 ワシントン州 98034 カークランド ノースイースト ワンハン ドレッドアンドトゥエンティナインス プ レイス 6406 (72)発明者 アントニー エフ パーチオ アメリカ合衆国 ワシントン州 98133 シアトル サーティサード アベニュー ノースイースト 801 (72)発明者 ディー マイケル ストロング アメリカ合衆国 ワシントン州 98020 エドモンズ ナインティフォース アベニ ュー ウェスト 18624 (72)発明者 ダグラス ジェイ キッブルホワイト カナダ ヴィ６アール ２エル４ ブリテ ィッシュコロンビア ヴァンクーヴァー ウェスト イレヴンス アベニュー 4049 (72)発明者 ウェイン エフ ララビー アメリカ合衆国 ワシントン州 98112 シアトル イースト ガーフィールド 1656
Claims (12)
- 【請求項１】 実質的に非吸収性の骨成長刺激に有効な
組成物であって、有効量の腫瘍増殖因子−βに操作的に
結合した鉱質消失骨基質及び薬学的に許容しうる担体を
含む組成物。 - 【請求項２】 腫瘍増殖因子−βがＴＧＦ−β１である
請求項１記載の組成物。 - 【請求項３】 腫瘍増殖因子−βがＴＧＦ−５βである
請求項１記載の組成物。 - 【請求項４】 該組成物が歯科用充填材として供給され
る請求項１記載の組成物。 - 【請求項５】 骨成長を刺激する方法であって、鉱質消
失骨基質、腫瘍増殖因子−β及び薬学的に許容しうる担
体を含む組成物を、骨芽細胞が該組成物と結合して骨の
形成を刺激することができるように患者の骨成長が所望
される部位に投与することを含む方法。 - 【請求項６】 該患者に投与するときに該組成物が指定
された形を維持することができる非液状可塑性組成物で
ある請求項５記載の方法。 - 【請求項７】 該組成物を患者の骨折部位に供給し、該
組成物が該骨折の間と周囲の隙間を塞ぐ請求項５記載の
方法。 - 【請求項８】 該組成物が医用充填材の表面又は該充填
材に隣接して適用される請求項５記載の方法。 - 【請求項９】 該組成物が歯科用充填材として供給され
る請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】 該組成物が骨の嚢胞又は腫瘍病巣の充
填物として供給される請求項５記載の方法。 - 【請求項１１】 骨折の治療方法であって、鉱質消失骨
基質、腫瘍増殖因子−β及び薬学的に許容しうる担体を
含む展性のある可塑性骨形成組成物を、該組成物が骨折
部位の骨の成長を刺激するように該骨折部位に投与する
ことを含む方法。 - 【請求項１２】 該腫瘍増殖因子−βがＴＧＦ−５βで
ある請求項１１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93329092A | 1992-08-21 | 1992-08-21 | |
| US07/933290 | 1992-08-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06157339A true JPH06157339A (ja) | 1994-06-03 |
Family
ID=25463696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5207328A Pending JPH06157339A (ja) | 1992-08-21 | 1993-08-23 | 骨形成組成物及びその使用方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0585168A3 (ja) |
| JP (1) | JPH06157339A (ja) |
| AU (1) | AU4468093A (ja) |
| CA (1) | CA2103943A1 (ja) |
| FI (1) | FI933642L (ja) |
| MX (1) | MX9305073A (ja) |
| NO (1) | NO932912L (ja) |
| NZ (1) | NZ248446A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US6165487A (en) * | 1996-09-30 | 2000-12-26 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for programming an organic matrix for remodeling into a target tissue |
| WO1998014222A1 (en) * | 1996-09-30 | 1998-04-09 | Children's Medical Center Corporation | Methods and compositions for programming an organic matrix for remodeling into a target tissue |
| ATE262863T1 (de) * | 1996-10-23 | 2004-04-15 | Sdgi Holdings Inc | Abstandsstück für wirbel |
| AU3556400A (en) | 1999-03-17 | 2000-10-04 | Novartis Ag | Pharmaceutical compositions |
| EP1113072A1 (en) * | 1999-12-28 | 2001-07-04 | Isotis B.V. | Tissue engineering using mandibular cells |
| AU2001210839A1 (en) * | 2000-10-13 | 2002-04-29 | Osteotech, Inc. | Method for inducing new bone growth in porous bone sites |
| IL141813A (en) * | 2001-03-05 | 2010-04-15 | Hadasit Med Res Service | Mixture comprising bone marrow cells together with demineralized and/or mineralized bone matrix and uses thereof in the preparation of compositions for the treatment of hematopoietic dusirders |
| US7442686B2 (en) | 2001-04-12 | 2008-10-28 | Bioaxone Therapeutique Inc. | Treatment of macular degeneration with ADP-ribosyl transferase fusion protein therapeutic compositions |
| WO2008022182A1 (en) * | 2006-08-16 | 2008-02-21 | The Uab Research Foundation | Methods for promoting coupling between bone formation and resorption |
| USD849946S1 (en) | 2015-12-30 | 2019-05-28 | Nuvasive, Inc. | Interspinous process spacer |
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|---|---|---|---|---|
| ATE128715T1 (de) * | 1984-07-16 | 1995-10-15 | Celtrix Pharma | Polypeptide induzierende faktoren in knochen und knorpel. |
| WO1989004646A1 (en) * | 1987-11-13 | 1989-06-01 | Jefferies Steven R | Bone repair material and delayed drug delivery |
| US5290558A (en) * | 1989-09-21 | 1994-03-01 | Osteotech, Inc. | Flowable demineralized bone powder composition and its use in bone repair |
| US5206023A (en) * | 1991-01-31 | 1993-04-27 | Robert F. Shaw | Method and compositions for the treatment and repair of defects or lesions in cartilage |
| CA2093836A1 (en) * | 1992-04-24 | 1993-10-25 | Wayne Gombotz | Biodegradable tgf-.beta. delivery system for bone regeneration |
-
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- 1993-08-18 AU AU44680/93A patent/AU4468093A/en not_active Abandoned
- 1993-08-19 NZ NZ248446A patent/NZ248446A/en unknown
- 1993-08-20 MX MX9305073A patent/MX9305073A/es unknown
- 1993-08-23 JP JP5207328A patent/JPH06157339A/ja active Pending
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| MX9305073A (es) | 1994-04-29 |
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