JPH06197794A - 酵素固定化用担体および固定化酵素 - Google Patents
酵素固定化用担体および固定化酵素Info
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- JPH06197794A JPH06197794A JP34844592A JP34844592A JPH06197794A JP H06197794 A JPH06197794 A JP H06197794A JP 34844592 A JP34844592 A JP 34844592A JP 34844592 A JP34844592 A JP 34844592A JP H06197794 A JPH06197794 A JP H06197794A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 疾病の診断に用いられる臨床検査に応用可能
な体液成分の微量分析法において使用される酵素固定化
用担体及び固定化酵素。 【構成】 固定化酵素及び酸化反応により塩基性（カチ
オン性）の増加する色素を用いて体液中の微量成分を検
出する際に用いるための、塩基性または中性の酵素固定
化用担体。 【効果】 本発明による固定化酵素を用いることによ
り、高感度に体液中の微量成分を測定することが可能と
なる。
な体液成分の微量分析法において使用される酵素固定化
用担体及び固定化酵素。 【構成】 固定化酵素及び酸化反応により塩基性（カチ
オン性）の増加する色素を用いて体液中の微量成分を検
出する際に用いるための、塩基性または中性の酵素固定
化用担体。 【効果】 本発明による固定化酵素を用いることによ
り、高感度に体液中の微量成分を測定することが可能と
なる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は疾病の診断に用いられる
臨床検査に応用可能な体液成分の微量分析法において使
用される酵素固定化用担体及び固定化酵素に関する。
臨床検査に応用可能な体液成分の微量分析法において使
用される酵素固定化用担体及び固定化酵素に関する。
【０００２】
【従来の方法】血清、血漿、尿等の体液中の特定の物質
を定量するのに、酵素の特異性を利用して該物質を分離
することなく高感度に定量することが行われている。な
かでも酸化酵素により過酸化水素を生成させ、これをペ
ルオキシダーゼなどの作用下に、被酸化性の呈色色素や
蛍光色素等を用いて定量する方法の重要性が増しつつあ
る。しかしながら、酵素は高価なものであり利用に制限
がある。現在、酵素を固定化しバイオリアクターとして
繰り返して利用することが種々の分野で実用化されてい
る。
を定量するのに、酵素の特異性を利用して該物質を分離
することなく高感度に定量することが行われている。な
かでも酸化酵素により過酸化水素を生成させ、これをペ
ルオキシダーゼなどの作用下に、被酸化性の呈色色素や
蛍光色素等を用いて定量する方法の重要性が増しつつあ
る。しかしながら、酵素は高価なものであり利用に制限
がある。現在、酵素を固定化しバイオリアクターとして
繰り返して利用することが種々の分野で実用化されてい
る。
【０００３】酵素を固定化するには吸着法、包括法、架
橋化法、共有結合法がある。吸着法ないし包括法は操作
は簡便であるが反応の際に酵素の離脱を防ぐことが困難
であり、また、架橋法は多量の酵素を要し効率が低く、
固定化時に酵素の活性低下が起こり易いのに対し、共有
結合法により固定化された酵素は高活性を示し、さらに
酵素の離脱がきわめて少ないという利点を持ち、共有結
合法により固定化された酵素は、バイオリアクターとし
て用いるには最適である。共有結合法で酵素を固定化す
る担体としては、その材質、イオン性、粒径、ポアサイ
ズ等の異なる様々なものが知られている。一方、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいはフローイン
ジェクション分析法（ＦＩＡ）の検出器としてバイオリ
アクターを利用し、体液成分を定量する際、ペルオキシ
ダーゼと発色基質を用いて定量する方法が用いられてい
る。
橋化法、共有結合法がある。吸着法ないし包括法は操作
は簡便であるが反応の際に酵素の離脱を防ぐことが困難
であり、また、架橋法は多量の酵素を要し効率が低く、
固定化時に酵素の活性低下が起こり易いのに対し、共有
結合法により固定化された酵素は高活性を示し、さらに
酵素の離脱がきわめて少ないという利点を持ち、共有結
合法により固定化された酵素は、バイオリアクターとし
て用いるには最適である。共有結合法で酵素を固定化す
る担体としては、その材質、イオン性、粒径、ポアサイ
ズ等の異なる様々なものが知られている。一方、高速液
体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）あるいはフローイン
ジェクション分析法（ＦＩＡ）の検出器としてバイオリ
アクターを利用し、体液成分を定量する際、ペルオキシ
ダーゼと発色基質を用いて定量する方法が用いられてい
る。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、該方法
によっては、体液中の微量成分の定量が困難な場合が多
い。
によっては、体液中の微量成分の定量が困難な場合が多
い。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、体液中の
微量成分を高感度に検出できる方法について鋭意検討し
た結果、発色定量する際に用いる色素と酵素固定化用担
体として特定のものを組合わせて用いることにより、体
液中の微量成分の定量を高感度で行なうことが出来るこ
とを見出し本発明を完成した。
微量成分を高感度に検出できる方法について鋭意検討し
た結果、発色定量する際に用いる色素と酵素固定化用担
体として特定のものを組合わせて用いることにより、体
液中の微量成分の定量を高感度で行なうことが出来るこ
とを見出し本発明を完成した。
【０００６】即ち、本発明は（１） 固定化酵素及び酸
化反応により塩基性（カチオン性）の増加する色素を用
いて体液中の微量成分を検出する際に用いるための、塩
基性または中性の酵素固定化用担体，（２） 酵素がペ
ルオキシダーゼである上記（１）の担体，（３） 色素
がロイコ型の色素である上記（１）又は（２）の担体，
（４） 酵素を固定化した上記（１），（２）又は
（３）の固定化酵素，に関する。
化反応により塩基性（カチオン性）の増加する色素を用
いて体液中の微量成分を検出する際に用いるための、塩
基性または中性の酵素固定化用担体，（２） 酵素がペ
ルオキシダーゼである上記（１）の担体，（３） 色素
がロイコ型の色素である上記（１）又は（２）の担体，
（４） 酵素を固定化した上記（１），（２）又は
（３）の固定化酵素，に関する。
【０００７】本発明の特徴は、固定化酵素と酵素反応に
より塩基性（カチオン性）の増加する色素を用いて体液
中の微量成分を定量する場合、塩基性または中性の担体
を用いて酵素を固定化することにある。
より塩基性（カチオン性）の増加する色素を用いて体液
中の微量成分を定量する場合、塩基性または中性の担体
を用いて酵素を固定化することにある。
【０００８】本発明によれば例えばロイコ型の色素のよ
うな酸化反応により塩基性の増加する色素を用いてバイ
オリアクターを利用したＨＰＬＣあるいはＦＩＡにて発
色定量すると、検出器から得られたピークがシャープに
なり微量定量が可能となる。
うな酸化反応により塩基性の増加する色素を用いてバイ
オリアクターを利用したＨＰＬＣあるいはＦＩＡにて発
色定量すると、検出器から得られたピークがシャープに
なり微量定量が可能となる。
【０００９】本発明の固定化酵素は公知の方法でカラム
に充填してバイオリアクターとし、公知の方法に従っ
て、ＨＰＬＣやＦＩＡの装置に接続して使用する。これ
らの装置は、少なくとも送液ポンプ、試料注入装置、検
出器、指示記録装置と流路を構成する配管類からなって
いる。
に充填してバイオリアクターとし、公知の方法に従っ
て、ＨＰＬＣやＦＩＡの装置に接続して使用する。これ
らの装置は、少なくとも送液ポンプ、試料注入装置、検
出器、指示記録装置と流路を構成する配管類からなって
いる。
【００１０】これら装置を用いて定量を行なう際に用い
られる緩衝液やバイオリアクターのカラムサイズ等は、
使用する酵素及び色素に応じて適宜選択される。例え
ば、緩衝液としては、リン酸塩、クエン酸塩、ほう酸
塩、トリス塩酸塩、グッドの緩衝液等が使用できる。ま
た、界面活性剤等も必要に応じて添加される。
られる緩衝液やバイオリアクターのカラムサイズ等は、
使用する酵素及び色素に応じて適宜選択される。例え
ば、緩衝液としては、リン酸塩、クエン酸塩、ほう酸
塩、トリス塩酸塩、グッドの緩衝液等が使用できる。ま
た、界面活性剤等も必要に応じて添加される。
【００１１】バイオリアクターのカラムサイズは通常１
０μl から１０ｍｌで使用されるが、好ましくは５０か
ら５００μl 程度のカラム容量が良い。バイオリアクタ
ーにおける反応温度は通常０〜８０℃の範囲で好ましく
は４〜４０℃の恒温の条件が良い。
０μl から１０ｍｌで使用されるが、好ましくは５０か
ら５００μl 程度のカラム容量が良い。バイオリアクタ
ーにおける反応温度は通常０〜８０℃の範囲で好ましく
は４〜４０℃の恒温の条件が良い。
【００１２】本発明において、塩基性または中性の担体
としてはアミノ基、エポキシ基、水酸基等を官能基とし
て持つ担体、あるいは多糖類のようにαβ位に２つの水
酸基を持つ化合物が挙げられる。特に好ましくはアミノ
基、エポキシ基をもつ担体が挙げられる。また、酵素固
定化反応の時に副反応として酸性の官能基が生成するよ
うな活性基（例えばトレシル基）を有する担体はその酸
性の官能基を完全にブロックして中性又は塩基性にコン
トロールできれば使用可能である。又、担体の保存中に
酸性基を生じるような官能基（例えばホルミル基、トレ
シル基等）を有する担体は、製造後間もないものであれ
ば使用可能であり、あるいは、使用時にそのような官能
基（ホルミル基、トレシル基等）を導入して使用するこ
ともできる。
としてはアミノ基、エポキシ基、水酸基等を官能基とし
て持つ担体、あるいは多糖類のようにαβ位に２つの水
酸基を持つ化合物が挙げられる。特に好ましくはアミノ
基、エポキシ基をもつ担体が挙げられる。また、酵素固
定化反応の時に副反応として酸性の官能基が生成するよ
うな活性基（例えばトレシル基）を有する担体はその酸
性の官能基を完全にブロックして中性又は塩基性にコン
トロールできれば使用可能である。又、担体の保存中に
酸性基を生じるような官能基（例えばホルミル基、トレ
シル基等）を有する担体は、製造後間もないものであれ
ば使用可能であり、あるいは、使用時にそのような官能
基（ホルミル基、トレシル基等）を導入して使用するこ
ともできる。
【００１３】塩基性または中性の担体のうち好ましいも
のを具体的に挙げると、アミノトヨパール（東ソー
（株）製）、アミノセルロファイン（生化学工業（株）
製）、アミノプロピル−ＣＰＧ（フナコシ（株）販
売）、ＡＨセファローズ４Ｂ（ファルマシア（株）
製）、エポキシトヨパール（東ソー（株）製）、エポキ
シ活性化セファローズ６Ｂ（ファルマシア（株）製）、
ＤＥＡＥ−セルロファイン（生化学工業（株）製）、Ｄ
ＥＡＥ−トヨパール（東ソー（株）製）、ショーデック
スゲル ＤＥＡ（昭和電工（株）製）、ＣＮＢｒ活性化
セファローズ４Ｂ（ファルマシア（株）製）トレシルト
ヨパール（東ソー（株）製）等が挙げられるが特にこれ
に限定するものではない。粒子径としては１〜３００μ
ｍ、官能基濃度としては１〜５００μmol/ml-gelのもの
が一般的に用いられる。
のを具体的に挙げると、アミノトヨパール（東ソー
（株）製）、アミノセルロファイン（生化学工業（株）
製）、アミノプロピル−ＣＰＧ（フナコシ（株）販
売）、ＡＨセファローズ４Ｂ（ファルマシア（株）
製）、エポキシトヨパール（東ソー（株）製）、エポキ
シ活性化セファローズ６Ｂ（ファルマシア（株）製）、
ＤＥＡＥ−セルロファイン（生化学工業（株）製）、Ｄ
ＥＡＥ−トヨパール（東ソー（株）製）、ショーデック
スゲル ＤＥＡ（昭和電工（株）製）、ＣＮＢｒ活性化
セファローズ４Ｂ（ファルマシア（株）製）トレシルト
ヨパール（東ソー（株）製）等が挙げられるが特にこれ
に限定するものではない。粒子径としては１〜３００μ
ｍ、官能基濃度としては１〜５００μmol/ml-gelのもの
が一般的に用いられる。
【００１４】担体への酵素の固定化方法は公知の種々の
方法が適応されるが共有結合法が好ましい。共有結合法
としては、例えば、酵素を過ヨウ素酸で酸化した後アミ
ノ基を有する担体に結合する方法、アミノ基を有する担
体にグルタルアルデヒドを反応させ酵素を結合する方
法、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノエチル基
等の３級アミノ基を持つ担体にエピクロルヒドリンを反
応させ酵素を結合する方法、エポキシ基、トレシル基等
の官能基を有する担体に酵素を結合する方法、多糖類の
ようにαβ位に２つの水酸基を持つ化合物にブロムシア
ンを反応させ酵素と結合する方法等が適用できる。
方法が適応されるが共有結合法が好ましい。共有結合法
としては、例えば、酵素を過ヨウ素酸で酸化した後アミ
ノ基を有する担体に結合する方法、アミノ基を有する担
体にグルタルアルデヒドを反応させ酵素を結合する方
法、ジメチルアミノエチル基、ジエチルアミノエチル基
等の３級アミノ基を持つ担体にエピクロルヒドリンを反
応させ酵素を結合する方法、エポキシ基、トレシル基等
の官能基を有する担体に酵素を結合する方法、多糖類の
ようにαβ位に２つの水酸基を持つ化合物にブロムシア
ンを反応させ酵素と結合する方法等が適用できる。
【００１５】本発明で用いられる酵素としてペルオキシ
ダーゼがあるが、その起源、由来に限定はなく、植物、
動物、微生物由来のペルオキシダーゼが使用できる。
ダーゼがあるが、その起源、由来に限定はなく、植物、
動物、微生物由来のペルオキシダーゼが使用できる。
【００１６】ペルオキシダーゼと共に、過酸化水素を生
成する酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。例
えば、酸化酵素とペルオキシダーゼを別々にカラムに充
填し連結して使用する事ができる。本発明の担体を用い
た場合、固定化酸化酵素と固定化ペルオキシダーゼを同
一のカラムに充填し一本のバイオリアクターとして用い
ることもできるし、それぞれの酵素を一緒に固定化して
用いることもできる。
成する酸化酵素を組み合わせて用いることもできる。例
えば、酸化酵素とペルオキシダーゼを別々にカラムに充
填し連結して使用する事ができる。本発明の担体を用い
た場合、固定化酸化酵素と固定化ペルオキシダーゼを同
一のカラムに充填し一本のバイオリアクターとして用い
ることもできるし、それぞれの酵素を一緒に固定化して
用いることもできる。
【００１７】ペルオキシダーゼと組み合わせて使用でき
る過酸化水素を生成する酸化酵素としてはピラノースオ
キシダーゼ（ＰＲＯＤ）（ＥＣ １．１．３．１０）、
Ｌ−ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１
１）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）（ＥＣ １．
１．３．４）、ウリカーゼ（ＥＣ １．７．３．３）、
コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．
６）、プトレシンオキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．１
０）等が挙げられるが、これに限定されるものではな
く、過酸化水素を発生する酸化酵素はすべて使用するこ
とができる。
る過酸化水素を生成する酸化酵素としてはピラノースオ
キシダーゼ（ＰＲＯＤ）（ＥＣ １．１．３．１０）、
Ｌ−ソルボースオキシダーゼ（ＥＣ１．１．３．１
１）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯＤ）（ＥＣ １．
１．３．４）、ウリカーゼ（ＥＣ １．７．３．３）、
コレステロールオキシダーゼ（ＥＣ １．１．３．
６）、プトレシンオキシダーゼ（ＥＣ １．４．３．１
０）等が挙げられるが、これに限定されるものではな
く、過酸化水素を発生する酸化酵素はすべて使用するこ
とができる。
【００１８】本発明において、酸化反応により塩基性の
増加する色素としては、例えばロイコ型色素が挙げら
れ、具体的には、N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,
4’-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt
（ＤＡ−６４）、10-(Carboxymethylaminocarbonyl)-3,
7-bis(dimethylamino)-phenothiazine sodium salt（Ｄ
Ａ−６７）、 4,4’-bis(dimethylamino)diphenylamin
e、10-N-methylcarbamyl-3,7-bis(dimethylamino)-10H-
phenothiazine、Bis(3-bis(4-chlorophenyl)methyl-4-d
imethyl-aminophenyl)amine等が挙げられる。特に好ま
れるものとしてモル吸光係数が高く水溶性の高いN-(Car
boxymethylaminocarbonyl)-4,4’-bis(dimethylamino)-
diphenylamine sodium salt （ＤＡ−６４）、10-(Carb
oxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)-phe
nothiazine sodium salt（ＤＡ−６７）が挙げられる
が、特に限定されるものではない。微量成分の定量を行
なう際これら色素は０．１〜１０００μＭの濃度で用い
るのが適当であるが、特に１〜２５０μＭが好ましい。
増加する色素としては、例えばロイコ型色素が挙げら
れ、具体的には、N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,
4’-bis(dimethylamino)-diphenylamine sodium salt
（ＤＡ−６４）、10-(Carboxymethylaminocarbonyl)-3,
7-bis(dimethylamino)-phenothiazine sodium salt（Ｄ
Ａ−６７）、 4,4’-bis(dimethylamino)diphenylamin
e、10-N-methylcarbamyl-3,7-bis(dimethylamino)-10H-
phenothiazine、Bis(3-bis(4-chlorophenyl)methyl-4-d
imethyl-aminophenyl)amine等が挙げられる。特に好ま
れるものとしてモル吸光係数が高く水溶性の高いN-(Car
boxymethylaminocarbonyl)-4,4’-bis(dimethylamino)-
diphenylamine sodium salt （ＤＡ−６４）、10-(Carb
oxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)-phe
nothiazine sodium salt（ＤＡ−６７）が挙げられる
が、特に限定されるものではない。微量成分の定量を行
なう際これら色素は０．１〜１０００μＭの濃度で用い
るのが適当であるが、特に１〜２５０μＭが好ましい。
【００１９】体液としては、血清、血漿、尿、髄液、唾
液等が挙げられ、微量成分の定量を行なう際、体液はそ
のままあるいは必要に応じて前処理をしてから測定する
ことができる。
液等が挙げられ、微量成分の定量を行なう際、体液はそ
のままあるいは必要に応じて前処理をしてから測定する
ことができる。
【００２０】測定（検出）する微量成分としては、例え
ば、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グルコー
ス、尿酸、コレステロール、ポリアミン等が挙げられ
る。
ば、１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール、グルコー
ス、尿酸、コレステロール、ポリアミン等が挙げられ
る。
【００２１】本発明によれば、酵素反応を利用した定量
の時に、発色により塩基性が増加する色素を用いて発色
定量する際に特定の担体を用いて固定化した酵素を使用
することにより、高感度に体液中の微量成分を測定する
ことが可能となる。
の時に、発色により塩基性が増加する色素を用いて発色
定量する際に特定の担体を用いて固定化した酵素を使用
することにより、高感度に体液中の微量成分を測定する
ことが可能となる。
【００２２】
【実施例】以下、比較例および実施例により本発明を具
体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定される
ものではない。
【００２３】実施例１ ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）２５０
００ユニットを０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液４ｍ
ｌに溶解し、６０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム４ｍｌ
を加えて室温で３０分間反応させ、１．６Ｍ グリセリ
ン ４００μｌを加え室温にて３０分撹拌した。次いで
０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）２Ｌ、４℃で透
析した。その液に上記炭酸緩衝液で平衡化したアミノト
ヨパール（東ソー（株）製）６ｍｌを加え４℃、４時間
振盪しその温度で２４時間静置した。その後、担体粒子
を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌの順で良く洗浄した。さら
に、活性基をブロックするため、０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ ８）に担体粒子を移し、２５℃で２時間反
応させ、蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌの順で良く洗浄し、固
定化ＨＲＰを調製した。
００ユニットを０．３Ｍ炭酸水素ナトリウム水溶液４ｍ
ｌに溶解し、６０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリウム４ｍｌ
を加えて室温で３０分間反応させ、１．６Ｍ グリセリ
ン ４００μｌを加え室温にて３０分撹拌した。次いで
０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）２Ｌ、４℃で透
析した。その液に上記炭酸緩衝液で平衡化したアミノト
ヨパール（東ソー（株）製）６ｍｌを加え４℃、４時間
振盪しその温度で２４時間静置した。その後、担体粒子
を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌの順で良く洗浄した。さら
に、活性基をブロックするため、０．１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ ８）に担体粒子を移し、２５℃で２時間反
応させ、蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌの順で良く洗浄し、固
定化ＨＲＰを調製した。
【００２４】固定化ＨＲＰを内径４．６ｍｍ、長さ３５
ｍｍのカラムに０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
にて充填した。得られた固定化ＨＲＰリアクターは東ソ
ーＣＣＰＭポンプ，島津ＳＰＤ−１０ＡＶ検出器，東ソ
ーＳＣ−８０１０データ処理装置、レオダイン７１６１
試料注入装置よりなるＨＰＬＣシステムの検出器の前に
設置した。溶離液として０．２ｍＭのＤＡ−６４を含む
０．１Ｍ りん酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を１ｍｌ／ｍ
ｉｎの流速で送液し、０．０１〜５mg/Lの過ほう酸ナト
リウム（安定な過酸化水素）１０μｌを注入した。カラ
ムで生成した色素による７２７nmの吸光度をクロマトグ
ラムとして測定した。測定は２５℃で行った。このとき
ピークとして認められた最小過ほう酸ナトリウム濃度は
０．０１mg/Lであった。また、ピーク形状の指標として
クロマトグラムの面積と高さの比（Ａ／Ｈ）をもとめた
ところ過ほう酸ナトリウム５mg/LのＡ／Ｈは１１．６で
あり、シャープな波形であった。結果は表１に示した。
ｍｍのカラムに０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ ７．５）
にて充填した。得られた固定化ＨＲＰリアクターは東ソ
ーＣＣＰＭポンプ，島津ＳＰＤ−１０ＡＶ検出器，東ソ
ーＳＣ−８０１０データ処理装置、レオダイン７１６１
試料注入装置よりなるＨＰＬＣシステムの検出器の前に
設置した。溶離液として０．２ｍＭのＤＡ−６４を含む
０．１Ｍ りん酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を１ｍｌ／ｍ
ｉｎの流速で送液し、０．０１〜５mg/Lの過ほう酸ナト
リウム（安定な過酸化水素）１０μｌを注入した。カラ
ムで生成した色素による７２７nmの吸光度をクロマトグ
ラムとして測定した。測定は２５℃で行った。このとき
ピークとして認められた最小過ほう酸ナトリウム濃度は
０．０１mg/Lであった。また、ピーク形状の指標として
クロマトグラムの面積と高さの比（Ａ／Ｈ）をもとめた
ところ過ほう酸ナトリウム５mg/LのＡ／Ｈは１１．６で
あり、シャープな波形であった。結果は表１に示した。
【００２５】実施例２ ＨＲＰの担体への固定化は実施例１と同様にして行った
が、担体としてアミノセルロファイン（生化学工業
（株）製）を用いた。この固定化ＨＲＰを実施例１と同
様にカラムに充填し、実施例１と同様な方法で過ほう酸
ナトリウムを測定した。
が、担体としてアミノセルロファイン（生化学工業
（株）製）を用いた。この固定化ＨＲＰを実施例１と同
様にカラムに充填し、実施例１と同様な方法で過ほう酸
ナトリウムを測定した。
【００２６】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
は表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と良好であった。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
は表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と良好であった。
【００２７】実施例３ ＨＲＰの担体への固定化は実施例１と同様にして行った
が、担体としてアミノプロピル−ＣＰＧ ポアサイズ１
４００（フナコシ（株）販売）を用いた。この固定化Ｈ
ＲＰを実施例１と同様にカラムに充填し、実施例１と同
様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定した。
が、担体としてアミノプロピル−ＣＰＧ ポアサイズ１
４００（フナコシ（株）販売）を用いた。この固定化Ｈ
ＲＰを実施例１と同様にカラムに充填し、実施例１と同
様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定した。
【００２８】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
は表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と良好であった。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
は表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と良好であった。
【００２９】実施例４ ＨＲＰ２５０００ユニットを０．３Ｍ炭酸水素ナトリウ
ム溶液４ｍｌに溶解し、６０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム４ｍｌにて室温で３０分間反応させ、１．６Ｍ グ
リセリン ４００μｌを加え室温にて３０分撹拌した。
次いで０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）２Ｌ、４
℃で透析した。その液に１００ｍｇのヘキサメチレンジ
アミンを加え４℃、２４時間撹拌しながら反応させた。
さらに０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）２Ｌ、４℃
で透析した。これに０．３ｇのエポキシトヨパール（東
ソー（株）製）を加え、３７℃で４時間振盪した。その
後、担体粒子を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌ、１／１５Ｍ
りん酸緩衝液（ｐＨ７．２）の順で良く洗浄し固定化Ｈ
ＲＰを調製した。
ム溶液４ｍｌに溶解し、６０ｍＭメタ過ヨウ素酸ナトリ
ウム４ｍｌにて室温で３０分間反応させ、１．６Ｍ グ
リセリン ４００μｌを加え室温にて３０分撹拌した。
次いで０．０１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ ９．５）２Ｌ、４
℃で透析した。その液に１００ｍｇのヘキサメチレンジ
アミンを加え４℃、２４時間撹拌しながら反応させた。
さらに０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ７．２）２Ｌ、４℃
で透析した。これに０．３ｇのエポキシトヨパール（東
ソー（株）製）を加え、３７℃で４時間振盪した。その
後、担体粒子を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌ、１／１５Ｍ
りん酸緩衝液（ｐＨ７．２）の順で良く洗浄し固定化Ｈ
ＲＰを調製した。
【００３０】実施例１と同様にカラムに充填し、実施例
１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定した。
１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定した。
【００３１】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
は表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と良好であった。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
は表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と良好であった。
【００３２】実施例５ Arthromyces ramosus 由来のペルオキシダーゼ（ＡＲ
Ｐ、フナコシ（株）販売）２５０００ユニットを用いて
実施例１と同様に固定化ＡＲＰを調製した。
Ｐ、フナコシ（株）販売）２５０００ユニットを用いて
実施例１と同様に固定化ＡＲＰを調製した。
【００３３】これを実施例１と同様にカラムに充填し、
実施例１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定し
た。
実施例１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定し
た。
【００３４】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と低値の検出も良好であった。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。実施例１と同様にピークはシャープで
あり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０１mg/L
と低値の検出も良好であった。
【００３５】実施例６ 実施例１で調製した固定化酵素を用い、ＤＡ−６４の代
わりに０．２ｍＭのＤＡ−６７を用いて実施例１と同様
の試験をした。測定波長は６６６ｎｍである。実施例１
と同様にピークとして認められた最小過ほう酸ナトリウ
ム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果を表１に示した。
わりに０．２ｍＭのＤＡ−６７を用いて実施例１と同様
の試験をした。測定波長は６６６ｎｍである。実施例１
と同様にピークとして認められた最小過ほう酸ナトリウ
ム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果を表１に示した。
【００３６】実施例１と同様にピークはシャープであり
過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０２mg/Lと低
値の検出も良好であった。
過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も０．０２mg/Lと低
値の検出も良好であった。
【００３７】実施例７ ＨＲＰ２５０００ユニットを０．１Ｍ りん酸緩衝液
（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐＨ ７．０）４０ｍｌ
中に溶解し、トレシルトヨパール（東ソー（株）製）１
ｇを加え、４℃にて一昼夜振盪した。その後、担体粒子
を蒸留水、１ＭＮａＣｌで良く洗浄しＨＲＰを固定化し
た。さらに、活性基をブロックするため、０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐＨ ８．
０）にて２５℃、１時間反応させ、同様に洗浄して固定
化ＨＲＰを調製した。
（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐＨ ７．０）４０ｍｌ
中に溶解し、トレシルトヨパール（東ソー（株）製）１
ｇを加え、４℃にて一昼夜振盪した。その後、担体粒子
を蒸留水、１ＭＮａＣｌで良く洗浄しＨＲＰを固定化し
た。さらに、活性基をブロックするため、０．１Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐＨ ８．
０）にて２５℃、１時間反応させ、同様に洗浄して固定
化ＨＲＰを調製した。
【００３８】これを実施例１と同様にカラムに充填し、
実施例１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定し
た。
実施例１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを測定し
た。
【００３９】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。
【００４０】実施例１と比較するとピークは少しブロー
ドになっているが、過ほう酸ナトリウムの最小検出限界
は０．０５mg/Lと低値の検出は良好であった。
ドになっているが、過ほう酸ナトリウムの最小検出限界
は０．０５mg/Lと低値の検出は良好であった。
【００４１】比較例１ 酸性の担体であるカルボキシ−セルロファイン（生化学
工業（株）製）１．０ｇを２０ｍｌの蒸留水にて膨潤さ
せ、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ）５ｍｇ／ｍｌの水溶液１
０ｍｌを加え希塩酸にてｐＨ４．０から５．０に調整し
た。ｐＨの変化がなくなったら吸引ろ過し、蒸留水にて
充分に洗浄する。その後直ちに、別に用意したＨＲＰ２
５０００ユニットを溶解した０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）１０ｍｌに加え４℃で一晩撹拌反応させた。
活性基をブロックするため、１０％エタノールアミン
１．５ｍｌを加え、室温で２時間反応させた。その後、
担体粒子を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌ、１／１５Ｍ りん
酸緩衝液（ｐＨ７．２）の順で良く洗浄し固定化ＨＲＰ
を調製した。
工業（株）製）１．０ｇを２０ｍｌの蒸留水にて膨潤さ
せ、塩酸１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド（ＥＤＣ）５ｍｇ／ｍｌの水溶液１
０ｍｌを加え希塩酸にてｐＨ４．０から５．０に調整し
た。ｐＨの変化がなくなったら吸引ろ過し、蒸留水にて
充分に洗浄する。その後直ちに、別に用意したＨＲＰ２
５０００ユニットを溶解した０．１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ
４．５）１０ｍｌに加え４℃で一晩撹拌反応させた。
活性基をブロックするため、１０％エタノールアミン
１．５ｍｌを加え、室温で２時間反応させた。その後、
担体粒子を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌ、１／１５Ｍ りん
酸緩衝液（ｐＨ７．２）の順で良く洗浄し固定化ＨＲＰ
を調製した。
【００４２】固定化ＨＲＰを実施例１と同様にカラムに
充填し、実施例１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを
測定した。
充填し、実施例１と同様な方法で過ほう酸ナトリウムを
測定した。
【００４３】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。実施例と比較してピークがかなりブロ
ードとなり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も１．０
mg/Lと低値の検出が困難であった。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。実施例と比較してピークがかなりブロ
ードとなり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も１．０
mg/Lと低値の検出が困難であった。
【００４４】比較例２ 比較例１で調製した固定化ＨＲＰを用い、ＤＡ−６４の
代わりに０．２ｍＭのＤＡ−６７を用いて実施例１と同
様の試験をした。測定波長は６６６ｎｍである。
代わりに０．２ｍＭのＤＡ−６７を用いて実施例１と同
様の試験をした。測定波長は６６６ｎｍである。
【００４５】実施例１と同様にピークとして認められた
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。
最小過ほう酸ナトリウム濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果
を表１に示した。
【００４６】実施例と比較してピークがかなりブロード
となり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も１．５mg/L
と低値の検出が困難であった。
となり過ほう酸ナトリウムの最小検出限界も１．５mg/L
と低値の検出が困難であった。
【００４７】次に過酸化水素を生成する酸化酵素と組み
合わせた場合について示す。
合わせた場合について示す。
【００４８】実施例８ 過酸化水素を生成する酵素としてＰＲＯＤ、基質として
１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−Ａ
Ｇ）を用いた。
１，５−アンヒドロ−Ｄ−グルシトール（１，５−Ａ
Ｇ）を用いた。
【００４９】ＰＲＯＤ３４００ユニット（蛋白濃度 ３
７ｍｇ／ｍｌ）を実施例７のＨＲＰ固定化方法と同様に
０．１Ｍりん酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐ
Ｈ７．０）２０ｍｌ中に溶解し、トレシルトヨパール
（東ソー（株）製）０．５ｇを加え、４℃にて一昼夜振
盪した。以下実施例７と同様に操作し、固定化ＰＲＯＤ
を調製した。
７ｍｇ／ｍｌ）を実施例７のＨＲＰ固定化方法と同様に
０．１Ｍりん酸緩衝液（０．５Ｍ ＮａＣｌ含有）（ｐ
Ｈ７．０）２０ｍｌ中に溶解し、トレシルトヨパール
（東ソー（株）製）０．５ｇを加え、４℃にて一昼夜振
盪した。以下実施例７と同様に操作し、固定化ＰＲＯＤ
を調製した。
【００５０】固定化ＰＲＯＤを内径４．６ｍｍ、長さ３
５ｍｍのカラムに０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ ７．
５）にて充填した。ＰＲＯＤ充填リアクターを実施例１
の装置のＨＲＰ充填リアクター（固定化ＨＲＰリアクタ
ー）の前に設置した。
５ｍｍのカラムに０．１Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ ７．
５）にて充填した。ＰＲＯＤ充填リアクターを実施例１
の装置のＨＲＰ充填リアクター（固定化ＨＲＰリアクタ
ー）の前に設置した。
【００５１】０．２ｍＭのＤＡ−６４を含む０．１Ｍり
ん酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で
送液し、０．０１〜５mg/Lの１，５−ＡＧ１０μｌを注
入し、生成した色素による７２７nmの吸光度をクロマト
グラムとして測定した。このときピークとして認められ
た最小１，５−ＡＧ濃度は０．０１mg/Lであった。ま
た、ピーク形状の指標としてクロマトグラムの面積と高
さの比（Ａ／Ｈ）をもとめたところ１，５−ＡＧ５mg/L
の濃度のピークのＡ／Ｈは１２．３であり、シャープな
波形が得られ、最小検出限界も０．０１mg/Lと低値の検
出も良好であった。結果は表２に示した。
ん酸緩衝液（ｐＨ ７．５）を１ｍｌ／ｍｉｎの流速で
送液し、０．０１〜５mg/Lの１，５−ＡＧ１０μｌを注
入し、生成した色素による７２７nmの吸光度をクロマト
グラムとして測定した。このときピークとして認められ
た最小１，５−ＡＧ濃度は０．０１mg/Lであった。ま
た、ピーク形状の指標としてクロマトグラムの面積と高
さの比（Ａ／Ｈ）をもとめたところ１，５−ＡＧ５mg/L
の濃度のピークのＡ／Ｈは１２．３であり、シャープな
波形が得られ、最小検出限界も０．０１mg/Lと低値の検
出も良好であった。結果は表２に示した。
【００５２】実施例９ ＰＲＯＤ７０００ユニット（蛋白濃度 ３７ｍｇ／ｍ
ｌ）を用い、比較例１のＨＲＰ固定化方法と同様にカル
ボキシ−セルロファイン１．０ｇを用いて操作し、固定
化ＰＲＯＤを調製した。
ｌ）を用い、比較例１のＨＲＰ固定化方法と同様にカル
ボキシ−セルロファイン１．０ｇを用いて操作し、固定
化ＰＲＯＤを調製した。
【００５３】固定化ＰＲＯＤを実施例８と同様にカラム
に充填し、実施例８と同様な方法で１，５−ＡＧを測定
した。
に充填し、実施例８と同様な方法で１，５−ＡＧを測定
した。
【００５４】実施例８と同様にピークとして認められた
最小１，５−ＡＧ濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果を表２
に示した。実施例８と同様にシャ−プなピーク得られ、
最小検出限界も０．０１mg/Lと低値の検出も良好であっ
た。
最小１，５−ＡＧ濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果を表２
に示した。実施例８と同様にシャ−プなピーク得られ、
最小検出限界も０．０１mg/Lと低値の検出も良好であっ
た。
【００５５】実施例１０ ＰＲＯＤ７０００ユニット（蛋白濃度 ３７ｍｇ／ｍ
ｌ）を０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍｌ
に溶解し、０．５ｇのエポキシトヨパール（東ソー
（株）製）を加え、３７℃で４時間振盪撹拌する。反応
後、担体粒子を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌで良く洗浄し
た。さらに、活性基をブロックするため、０．５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）にて２５℃、１時間反応
させ、同様に洗浄して固定化ＰＲＯＤを調製した。
ｌ）を０．５Ｍりん酸緩衝液（ｐＨ ７．２）１０ｍｌ
に溶解し、０．５ｇのエポキシトヨパール（東ソー
（株）製）を加え、３７℃で４時間振盪撹拌する。反応
後、担体粒子を蒸留水、１Ｍ ＮａＣｌで良く洗浄し
た。さらに、活性基をブロックするため、０．５Ｍトリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ ８．０）にて２５℃、１時間反応
させ、同様に洗浄して固定化ＰＲＯＤを調製した。
【００５６】固定化ＰＲＯＤと実施例４で得られた固定
化ＨＲＰとを１：１の割合で混合し、これを内径４．６
ｍｍ、長さ７０ｍｍのカラムに充填し、実施例１の装置
の固定化ＨＲＰリアクターに換えて設置し、実施例８と
同様な方法で１，５−ＡＧを測定した。
化ＨＲＰとを１：１の割合で混合し、これを内径４．６
ｍｍ、長さ７０ｍｍのカラムに充填し、実施例１の装置
の固定化ＨＲＰリアクターに換えて設置し、実施例８と
同様な方法で１，５−ＡＧを測定した。
【００５７】実施例８と同様にピークとして認められた
最小１，５−ＡＧ濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果を表２
に示した。実施例８と同様にシャ−プなピーク得られ、
最小検出限界も０．０２mg/Lと低値の検出も良好であっ
た。
最小１，５−ＡＧ濃度とＡ／Ｈをもとめた。結果を表２
に示した。実施例８と同様にシャ−プなピーク得られ、
最小検出限界も０．０２mg/Lと低値の検出も良好であっ
た。
【００５８】実施例１１ 血清中の１，５−ＡＧを測定するため、ラナＡＧ（アン
ヒドログルシトール）キット（日本化薬（株）製）の前
処理カラムを用いて、その操作法に従って前処理した。
即ち、該キット前処理カラムの充填液を排液し、蒸留水
１ｍｌで洗浄しコンディショニングした。このカラムに
標準１，５−ＡＧ（０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び５
０μｇ／ｍｌ）及びヒト血清Ｎｏ．１〜１０の５０μl
を入れ、蒸留水０．５ｍｌで２回溶出した。実施例８の
装置を用い、０．０１〜５mg/Lの１，５−ＡＧ１０μl
の代りに、上記カラムからの溶出液２０μl を注入し、
その他は実施例８と同様にして測定を行った。標準１，
５−ＡＧのピーク面積値から検量線を作成し、各血清の
面積値から１，５−ＡＧ濃度を算出した。その結果とラ
ナＡＧ（アンヒドログルシトール）の測定値を表３に示
した。
ヒドログルシトール）キット（日本化薬（株）製）の前
処理カラムを用いて、その操作法に従って前処理した。
即ち、該キット前処理カラムの充填液を排液し、蒸留水
１ｍｌで洗浄しコンディショニングした。このカラムに
標準１，５−ＡＧ（０μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ及び５
０μｇ／ｍｌ）及びヒト血清Ｎｏ．１〜１０の５０μl
を入れ、蒸留水０．５ｍｌで２回溶出した。実施例８の
装置を用い、０．０１〜５mg/Lの１，５−ＡＧ１０μl
の代りに、上記カラムからの溶出液２０μl を注入し、
その他は実施例８と同様にして測定を行った。標準１，
５−ＡＧのピーク面積値から検量線を作成し、各血清の
面積値から１，５−ＡＧ濃度を算出した。その結果とラ
ナＡＧ（アンヒドログルシトール）の測定値を表３に示
した。
【００５９】実施例１２ 実施例１１において、実施例８の装置の代りに実施例９
の装置を用い、その他は実施例１１と同様にして測定を
行った。結果を表３に示した。
の装置を用い、その他は実施例１１と同様にして測定を
行った。結果を表３に示した。
【００６０】実施例１３ 実施例１１において、実施例８の装置の代りに実施例１
０の装置を用い、その他は実施例１１と同様にして測定
を行った。結果を表３に示した。
０の装置を用い、その他は実施例１１と同様にして測定
を行った。結果を表３に示した。
【００６１】
【表１】
【００６２】
【表２】
【００６３】
【表３】
【００６４】
【発明の効果】本発明による固定化酵素を用いることに
より、高感度に体液中の微量成分を測定することが可能
となる。
より、高感度に体液中の微量成分を測定することが可能
となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 塚越 由美子 群馬県高崎市上並榎町901 (72)発明者 梅香家 佳彦 神奈川県藤沢市湘南台４丁目26−５−205 (72)発明者 古屋敷 佳久 神奈川県藤沢市湘南台４丁目26−５−304 (72)発明者 北村 隆司 山口県熊毛郡熊毛町西勝間原1100−179
Claims (4)
- 【請求項１】 固定化酵素及び酸化反応により塩基性
（カチオン性）の増加する色素を用いて体液中の微量成
分を検出する際に用いるための、塩基性または中性の酵
素固定化用担体。 - 【請求項２】 酵素がペルオキシダーゼである請求項１
の担体。 - 【請求項３】 色素がロイコ型の色素である請求項１又
は２の担体。 - 【請求項４】 酵素を固定化した請求項１，２又は３の
固定化酵素。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34844592A JP3464234B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 酵素固定化用担体および固定化酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP34844592A JP3464234B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 酵素固定化用担体および固定化酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06197794A true JPH06197794A (ja) | 1994-07-19 |
| JP3464234B2 JP3464234B2 (ja) | 2003-11-05 |
Family
ID=18397056
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP34844592A Expired - Fee Related JP3464234B2 (ja) | 1992-12-28 | 1992-12-28 | 酵素固定化用担体および固定化酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3464234B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003097865A1 (fr) * | 2002-05-21 | 2003-11-27 | Arkray, Inc. | Procede destine a empecher la formation de couleurs erronees de n-(carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamine sodium, solution de reactifs destinee a ce procede et procede de mesure faisant intervenir ledit procede |
| WO2013018609A1 (ja) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | 協和メデックス株式会社 | スフィンゴミエリンの測定方法及び測定用キット |
-
1992
- 1992-12-28 JP JP34844592A patent/JP3464234B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003097865A1 (fr) * | 2002-05-21 | 2003-11-27 | Arkray, Inc. | Procede destine a empecher la formation de couleurs erronees de n-(carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamine sodium, solution de reactifs destinee a ce procede et procede de mesure faisant intervenir ledit procede |
| US7432072B2 (en) | 2002-05-21 | 2008-10-07 | Arkray, Inc. | Method of preventing wrong color formation of n-(carboxymethylaminocarbony)-4,4′-bis(dimethylamino) diphenylamine sodium, reagent solution for the method, and measurement method employing the method |
| WO2013018609A1 (ja) * | 2011-07-29 | 2013-02-07 | 協和メデックス株式会社 | スフィンゴミエリンの測定方法及び測定用キット |
| JPWO2013018609A1 (ja) * | 2011-07-29 | 2015-03-05 | 協和メデックス株式会社 | スフィンゴミエリンの測定方法及び測定用キット |
| US9051600B2 (en) | 2011-07-29 | 2015-06-09 | Kyowa Medex Co., Ltd. | Sphingomyelin measurement method using sequential phospholipase D reactions |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3464234B2 (ja) | 2003-11-05 |
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