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JPH0631305B2 - ヌクレオシド誘導体 - Google Patents

ヌクレオシド誘導体

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Publication number
JPH0631305B2
JPH0631305B2 JP62085615A JP8561587A JPH0631305B2 JP H0631305 B2 JPH0631305 B2 JP H0631305B2 JP 62085615 A JP62085615 A JP 62085615A JP 8561587 A JP8561587 A JP 8561587A JP H0631305 B2 JPH0631305 B2 JP H0631305B2
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JP
Japan
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group
formula
hydrogen atom
compound
nucleoside derivative
Prior art date
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Expired - Lifetime
Application number
JP62085615A
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JPS62294692A (ja
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デイデイエ・モルコ
ジヤン−クロード・シユルホフ
ロベール・トウール
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Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of JPS62294692A publication Critical patent/JPS62294692A/ja
Publication of JPH0631305B2 publication Critical patent/JPH0631305B2/ja
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、新規なヌクレオシド誘導体およびオリゴヌク
レオチドを合成するためのその使用に関するものであ
る。
さらに詳細には、本発明は、環外NH2基を有するピリミ
ジンもしくはプリン塩基から生成されるヌクレオシド誘
導体、すなわちアデニン、グアニンもしくはシトシンか
ら生成され、特にオリゴヌクレオチドを合成するために
使用しうるヌクレオシドに関するものである。
オリゴヌクレオチドの合成は、燐酸基によりこれらのヌ
クレオシドを互いに結合させてＤＮＡ（デオキシリボ核
酸）鎖もしくはＲＮＡ（リボ核酸）鎖を生成させること
よりなっている。この結合において、ヌクレオチド間の
燐酸基はまだヌクレオシドの３′位置におけるヒドロキ
シル基を他のヌクレオシドの５′位置におけるヒドロキ
シル基と結合している。したがって、合成反応に際しヌ
クレオシドの３′末端と５′末端とのみが作用を受け、
使用する核塩基（プリンもしくはピリミジン）はこの結
合に際し関与してはならない。
これらの塩基が環外NH2基を含む場合、オリゴヌクレオ
チドの合成に際しこれらの基を保護する必要がある。何
故なら、これらは極めて反応性が大きいため合成反応を
阻害しうるからである。
環外NH2基のこの保護は次のことを満足せねばならな
い：これは選択性でありかつ実施容易でなければらな
い；これは他のヌクレオシド部位に対する反応性変化を
誘発してはならずかつオリゴヌクレオチド合成工程全体
にわたり安定でなければならない；これは合成されたオ
リゴヌクレオチドを破壊することなく緩和な条件下で除
去されうるものでなければならない。
ヌクレオシドの環外NH2基は特にしばしば、たとえばア
デニンおよびシトシンの場合にはベンゾイルもしくはア
ニソイル基により〔Ｈ．SCHALLER等、ジヤーナル・アメ
リカン・ケミカル・ソサエテイ（１９６３）、第８５
巻、第３８２１〜３８２７頁〕或いはグアニンの場合に
はイソブチリル基により〔Ｈ．ＢＣＨＩおよびＨ．KH
HORANA、ジヤーナル・モレキュラ・バイオロジー（１９
７２）、第７２巻、第２５１〜２８８頁〕によりアミド
として保護されている。
これらの保護基は、推奨されているように合成の終了時
に６０℃の温度にて１７時間にわたる２８％アンモニア
の作用により除去することができる。しかしながら、プ
ロトンのNMR分析が示すところでは、これらの条件下に
おいてグアニンのイソブチリル基の全部は除去されな
い。したがって、反応時間を７２時間まで延長させる６
０℃の温度に保つことが好ましい。
保護基を除去するためのこの方法は欠点を有する。何故
なら、使用する条件は、たとえば５，６−ジヒドロチミ
ジンの場合のようにアルカリ性媒体中で大して安定でな
い修飾ヌクレオシドについて使用しうるには充分緩和で
ないからである。
さらに、除去するのがより容易であり、特に支持体上で
の合成方法によつて不安定なヌクレオシドからオリゴヌ
クレオチドを合成するために特に使用しうる他のアシル
基を用いる可能性についても研究が行なわれており、こ
の方法は連鎖の第１ヌクレオシドを一般にシリカよりな
る支持体に固定し、次いでこの第１ヌクレオシドに対し
所望順序で他のヌクレオシドを固定する縮合サイクルを
順次に行なうことからなつている。除去するのがより容
易なアシル基の使用は、より良好な保護解除収支を得る
ことを可能にする。この点は極めて重要である。何故な
ら、不完全に保護解除された塩基の存在は、得られる生
成物の使用に対し欠点となるからである。
したがつて、本発明の目的は、容易に除去しうるアシル
型の保護基を有する新規なヌクレオシド誘導体を提供す
るにある。
本発明によるヌクレオシドの誘導体は、式： 〔式中、Ｂは式： から選択され、その環外ＮＨ基によつてＣＯ基に結合さ
れる二価の基を示し、 Ｒ1は水素原子またはアルキル基を示し、 Ｒ2は水素原子、アルキル基、アルコキシ基およびアリ
ールオキシ基を示し、これらはいずれも未置換またはNO
2、ＣＮ、アルコキシ、アリールオキシ、Ｃｌ、Ｆ、 置換されていてもいなくてもよいアルキルもしくはアリ
ール、ＳＲ（ここでＲはアルキルもしくはアリール基を
示す）より成る群から選択される１個もしくはそれ以上
の基により置換され、ただしＢが基(II)もしくは(III)
である場合のＲ1＝ＨかつＲ2＝CH3およびＢが基(II)で
ある場合のＲ1＝Ｒ2＝CH3を除き、 Ｒ3は水素原子、酸性媒体中において不安定な基（保護
基）または式： （ここでＲ1およびＲ2は上記の意味を有する）の基を示
し、 Ｒ4は水素原子、含燐基（保護されたリン酸基）または
式： （ここでＲ1およびＲ2は上記の意味を有する）の基を示
し、 Ｒ5は水素原子またはＯＨ基を示す〕 に相当する。
たとえば、式（Ｉ）の化合物におけるＲ3を構成するた
めに使用しうる酸性媒体中にて不安定な基は特にオリゴ
ヌクレオチド合成で使用しうる基であり、たとえば式： 〔式中、Ｒ6、Ｒ7およびＲ8は同一でも異なつてもよく
水素原子、アルキル基もしくはアルコキシ基を示す〕 によるトリチル基、たとえばモノメトキシトリチル基ま
たは式（Ｖ）においてＲ6およびＲ7がメトキシ基を示し
かつＲ8が水素原子を示すトリチル基、並びにピキシル
基および９−フエニル−キサンテニル基である。
たとえば、式（Ｉ）の化合物におけるＲ4を構成するた
めに使用しうる含燐基もしくはオリゴヌクレオチド合成
に使用しうる基であり、たとえば式： の基、式： の基、または式： のホスホネート基である。
本発明によれば、Ｒ5が保護されたＯＨ基を示す場合、
このＯＨ保護基はリボヌクレオチドの合成に従来使用さ
れている基によつて構成される。
したがつて、本発明によるヌクレオシドの誘導体は、
(1)グアニン、シトシンもしくはアデニンにより構成さ
れる塩基と、(2)リボースもしくはデオキシリボースと
の結合生成物であり、これらヌクレオシドは少なくとも
その塩基の環外NH2基にて式： の基により修飾されている。
さらに、これらはデオキシリボースの３′および５′位
置またはリボースの２′，３′および５′位置にて前記
の同じ基において修飾することもでき、或いはリボース
もしくはデオキシリボースの３′および５′位置は他の
基によつても修飾することができ、これらの基はリボー
スもしくはデオキシリボースの５′位置については不安
定和な基Ｒ3でありかつ３′位置については含燐基Ｒ4で
ある。
本発明に使用される式： のアシル基は、特にヌクレオチドの合成に対し興味があ
る。何故なら、これらは操作の終了時にたとえば使用す
る基に応じて室温にて２〜８時間のアンモニア処理によ
り容易に除去することができ、これにより合成されてい
る支持体上のポリヌクレオチドを支持体法での合成を用
いる場合に同時に遊離させうるからである。
本発明に使用される式： の保護基において、Ｒ1は水素原子またはアルキル基と
することができ、Ｒ2は水素原子、アルキル基、アルコ
キシ基またはアリールオキシ基とすることができ、これ
らは適宜異なる基によつて置換される。
Ｒ1およびＲ2につき使用しうるアルキル基は直鎖もしく
は分枝鎖の基とすることができ、たとえばメチル、エチ
ルなどの基である。
Ｒ2につき使用しうるアルコキシ基も直鎖もしくは分枝
鎖の基とすることができる。使用しうるアリールオキシ
基は特にベンゼン、ナフタレンおよびアントラセンから
誘導される基（たとえばフエノキシ基）とすることがで
き、これらは１個もしくはそれ以上の上記置換基によつ
て置換することができる。
本発明によれば環外NH2基の保護基は、アルカリ処理に
対し所望の耐性を得るため、使用する塩基に応じて選択
される。一般に使用する塩基がグアニンである場合、Ｒ
1は水素原子を示しかつＲ2はアルコキシ基または適宜置
換されたアリールオキシ基を示す。たとえば、基Ｒ2は
フエノキシ基、メトキシ基または２−クロルフエノキシ
基とすることができる。
使用する塩基がアデニンである場合、Ｒ1は好ましくは
水素原子を示しかつＲ2は適宜置換されたアリールオキ
シ基、たとえばフエノキシ基を示す。
塩基がシトシンである場合、基Ｒ1およびＲ2は好ましく
は水素原子またはアルキル基、たとえばメチル基であ
る。
上記保護基の使用により、本発明によりヌクレオシドを
結合させて得られたオリゴヌクレオチドの保護解除時間
を短縮することが可能になる。何故なら、この時間は以
前に必要とされた１７〜７２時間でなく、使用する基に
応じて僅か２〜８時間としうるからである。さらに、保
護解除は室温で生ずるので緩和な反応条件下で操作する
ことが可能となり、これに対し従来は６０℃まで加熱す
る必要があつた。さらに、これらの一層容易に除去しう
る保護基の使用は、オリゴヌクレオチドの合成に際し、
より強力なアルカリ性条件に対し感受性である修飾され
た該塩基を組込み、たとえば抗体に対して感受性である
リガンドを有するＤＮＡ断片を合成することを可能にす
る。
本発明はリボースから誘導されたヌクレオシドおよびデ
オキシリボースから誘導されたヌクレオシドに適用され
るが、好ましくはデオキシリボースから誘導されたヌク
レオシド、すなわち式（Ｉ）においてＲ5が水素原子で
ある誘導体につき使用される。
本発明によるヌクレオシドの誘導体は、ベンゾイルおよ
びアニソイル基をアデニンもしくはシトシンに基づくヌ
クレオシドへ固定するために使用される方法と同一の常
法によつて製造することができる。これらの方法におい
てはグアニン、シトシンもしくはアデニンのヌクレオシ
ドから出発し、これを式： の酸クロライドまたは式： の酸無水物と反応させる。
この反応に際し、酸クロライドもしくは無水物はさらに
リボースもしくはデオキシリボースの３′および５′位
置におけるヒドロキシル基と反応し、かくして三重保護
されたヌクレオシド誘導体が得られ、すなわち式（Ｉ）
において、Ｒ3およびＲ4の両者が基： を示す誘導体が得られる。しかしながら、３′および
５′位置におけるこれらの基は選択的加水分解によつて
除去することができ、これは式（Ｉ）においてＲ3およ
びＲ4が水素原子を示すヌクレオシドの誘導体を得るこ
とを可能にする。
予め得られたヌクレオシドの誘導体を適当な溶媒中で対
応の塩化トリチルと反応させることにより、式（Ｉ）に
おいてＲ3が式（Ｖ）のトリチル基、たとえばジメトキ
シトリチル基を示しかつＲ4が水素原子を示すヌクレオ
シドの誘導体を製造することができる。
式（Ｉ）においてＲ3がトリチル基を示しかつＲ4が式
（VI）の基または式（VII）の基、或いは式： 〔式中、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は同一でも異なつてもよ
くアルキル基、たとえばエチルである〕 の基を示すヌクレオシドの誘導体は、式（Ｉ）において
Ｒ3がトリチル基を示しかつＲ4が水素原子を示すヌクレ
オシドの誘導体から常法により製造することができる。
Ｒ4がたとえば式（VI）の基を示す場合、このヌクレオ
シド誘導体を適当な溶媒中で４−クロルフエニルホスホ
リルビストリアゾリデートと反応させる。この４−クロ
ルフエニルホスホリルビストリアゾリデートは、４−ク
ロルフエニルジクロルホスフエートをジオキサン中のト
リアゾールとトリエチルロアミンとの懸濁物へ添加して
製造することができる。
Ｒ4がたとえば式（VII）の基を示す場合、ヌクレオシド
誘導体をジイソプロピルエチルアミンの存在下で適当な
溶媒中にてβ−シアノエチル−モノクロル−Ｎ，Ｎ−ジ
イソプロピル−アミノホスホルアミダイトと反応させる
ことができる。
Ｒ4がたとえば式： 〔式中、Ｒ11、Ｒ12およびＲ13は同一でも異なつてもよ
くアルキル基である〕 の基を示す場合、このヌクレオシド誘導体を２−クロル
−（５，６−ａ）−ベンゾ−〔１，３−ジオキソ−２−
ホスホル−４−イノン〕と反応させ、次いでたとえば酢
酸トリエチルアンモニウムのようなトリアルキルアンモ
ニウム塩と反応させることができる。
これら３種の方法により得られるヌクレオシドの誘導体
は、Ｒ4が式（VI）の基である場合にはホスホトリエス
テル合成により、或いはＲ4が式（VII）の基である場合
にはホスホルアミダイド合成により、或いはＲ4が式： の基である場合にはＨ−ホスホネート合成により、オリ
ゴヌクレオチドの合成に使用することができる。また、
オリゴヌクレオチド連鎖の結合には他のヌクレオシドた
とえばチミジンおよび２′−テオキシウリジンに対応す
るもの、或いはアルカリ媒体中で不安定な塩基を有する
ヌクレオシド、或いはアルカリ媒体中で不安定な他のヌ
クレオシドを使用することができる。
オリゴヌクレオチドを合成するための本発明による方法
は、 (i)ヌクレオシド誘導体もしくはオリゴヌクレオチドに
対し式： 〔式中、Ｂは式： もしくは から選択され、その環外NH2基によりＣＯ基に結合され
る二価の基を示し、 Ｒ1は水素原子もしくはアルキル基を示し、 Ｒ2は水素原子、アルキル基、アルコキシ基、アリール
オキシ基を示し、これは未置換またはNO2、ＣＮ、アル
コキシ、アリールオキシ、Ｃｌ、Ｆ、 アルキルもしくはアリール（これらは未置換であつても
置換されてもよい）、ＳＲ（ここでＲはアルキルもしく
はアリール基を示す）から選択される１個もしくはそれ
以上の基により置換され、ただしＢが基（II）もしくは
（III）である場合のＲ1＝ＨかつＲ2＝CH3およびＢが基
（II）である場合のＲ1＝Ｒ2＝CH3を除き、 Ｒ3は酸性媒体中で不安定な基を示し、 Ｒ4は含燐基を示し、 Ｒ5は水素原子を示す〕 のヌクレオシド誘導体を縮合させる少なくとも１つの縮
合サイクルと、 (ii)式： 〔式中、Ｒ1およびＲ2は上記の意味を有する〕 の保護基を、たとえばオリゴヌクレオチドを室温にてア
ンモニアと接触させることにより除去する工程と からなつている。
オリゴヌクレオチド合成は、溶液中での方法或いは支持
体上での合成法のいずれかによつて行なうことができ
る。好ましくは、支持体上での合成法を使用する。何故
なら、これは結合に際し収率損失を生ずることなくより
不安定なヌクレオシドを使用するのに一層適するからで
ある。
たとえば、本発明によるヌクレオシドはＤＮＡもしくは
ＲＮＡ断片の合成に使用される塩基生成物として興味あ
る用途を有する。さらに、これらは合成オリゴヌクレオ
チド中へ、特にＤＮＡγ−放射線分解生成物または光分
解生成物に関する不安定な修飾塩基を組み込むにも適し
ている。本発明によるヌクレオシドにより、さらに抗ウ
イルス活性を有する新規な分子および新規なＤＮＡブロ
ーブを得ることも可能になる。
〔実施例〕
以下、本発明をヌクレオシドの製造および使用に関する
実施例につき説明するが、これらのみに限定されないこ
とは明らかである。
実施例１：（Ｎ２−フエノキシアセチル）−２′−デオ
キシグアノシン（化合物１）の製造 １０８０mg（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシン
を無水ピリジンの連続添加および蒸発によつて乾燥さ
せ、次いでこれらを２０mlの無水ピリジン中に懸濁さ
せ、次いでこの懸濁物をフラスコ中に導入した。このフ
ラスコを氷浴によつて冷却し、かつこれへ６当量（4.25
ｇ；２４ミリモル）のフエノキシアセチルクロライドを
０℃にて徐々に添加した。反応を室温にて９０分間継続
させた。反応媒体中に白色の塩化ピリジニウム沈澱物が
生じた一方、反応媒体は橙色から褐色となつた。これに
より三重保護された出発ヌクレオシド誘導体、すなわち
式(I)においてＢが式(II)の基を示す誘導体（Ｒ1が水素
原子を示し、Ｒ2がフエノキシ基を示し、Ｒ3およびＲ4
がフエノキシアセチル基を示しかつＲ5が水素原子を示
すグアニン誘導体）を得た。
次いで、過剰の酸塩化物を２mlの２回蒸溜した水により
０℃で分解して、反応媒体を可溶化させた。次いで、こ
れを１００mlのクロロホルムで希釈した。クロロホルム
相を５０mlの５％重炭酸ナトリウム水溶液で４回洗浄し
て生成フエノキシ酢酸を除去した。次いで、クロロホル
ム相を硫酸ナトリウムで脱水し、溶剤を蒸発させかつ橙
色残留物を得た。これを１００mlの０℃まで冷却された
ピリジンに溶解させ、次いで１００mlの0.2Ｎソーゾを
０℃にて添加した。かくして、３′および５′位置の選
択的加水分解を２０分間行なつた。次いで、媒体を１０
０〜２００メツシユ（0.074〜0.149mm）の粒子寸法を有
するピリジニウム型の陽イオン交換樹脂ダウエツクス５
０Ｗ−Ｘ８によつて中和した。樹脂を過しかつ洗浄し
た後、液を蒸発乾固させた。
これに続いて、シリカカラム（直径３cm、高さ１５cm）
でのクロマトグラフイーによりクロロホルム−メタノー
ル濃度勾配によつて溶出させ、生成Ｎ2−フエノキシア
セチル−２′−デオキシグアノシンを単離した。求める
生成物を含有するフラクシヨンの蒸発により２５０mgの
Ｎ−フエノキシアセチル−２′−デオキシグアノシンを
回収することができ、これは収率１５％に相当した。
得られた生成物の同定および純度を２５０MHzでの核磁
気共鳴、薄層クロマトグラフイーおよび質量分析器によ
つて監視し、次の結果が得られたＲf＝0.36、クロロホ
ルム−メタノール移動混合物（容量で８０／２０） （Ｍ＋Ｈ）分子ピーク（m/e：４０２−１３％）； フエノキシアセチル化グアニン（m/e：２８６−５１
％）。
実施例２：〔Ｎ2−（２−クロルフエノキシ）−アセチ
ル〕−２′−デオキシグアノシン（化合物２）の製造 １０８０mg（４ミリモル）の２′−デオキシグアノシン
を実施例１におけると同様に乾燥し、次いで２０mlの無
水ピリジン中に懸濁させかつ氷水浴中に入れたフラスコ
に導入した。これに続いて０℃で６当量（5.1ｇ；２４
ミリモル）の（２−クロルフエノキシ）−アセチルクロ
ライドを徐々に添加した。反応を室温にて１５０分間継
続させた。反応媒体において緑色乃至栗色が出現し、こ
のようにして三重保護された出発ヌクレオシド誘導体が
生成され、すなわち式(I)においてＢが式(II)の基を示
す誘導体、すなわちＲ1が水素原子を示し、Ｒ2が２−ク
ロルフエノキシ基を示し、Ｒ3およびＲ4が２−クロルフ
エノキシ−アセチル基を示しかつＲ5が水素原子である
グアニン誘導体を生成した。
過剰の酸クロライドを０℃にて２mlの蒸溜水により分解
して、反応媒体を可溶化させた。次いで、これを１００
mlのクロロホルムで溶解させ、前記クロロホルム相と同
様に５０mlの５％重炭酸ナトリウム水溶液で４回洗浄し
てクロルフエノキシ酢酸を除去した。クロロホルム相を
硫酸ナトリウムで脱水し、溶剤を蒸発させかつこのよう
にして橙色残留物を得た。この残留物を１００mlのピリ
ジン中に溶解し、得られた溶液を氷水浴中に入れ、かつ
0.2Ｎソーダ１００mlをこれに加えて0.1Ｎの滴定値を有
する混合物を得、ヌクレオシドの３′および５′位置を
選択的に２０分間で加水分解することができた。次い
で、この媒体をピリジニウム型の実施例１に使用した陽
イオン交換樹脂ダウエツクス５０Ｗ−Ｘ８によつて中和
した。この樹脂を過しかつ洗浄し、次いで液を蒸発
乾固させた。これにより〔Ｎ2−（２′−クロルフエノ
キシ）−アセチル〕−２′−デオキシグアノシンが得ら
れ、これはピリジン中に僅か可溶性であつた。
これをシリカカラム上でのクロマトグラフイーによつて
精製し、その際クロロホルム−メタノール濃度勾配を使
用した。かくして、２２０mgの化合物２が単離され、こ
れは収率１３％に相当した。この化合物を薄層クロマト
グラフイーおよび質量分析挿器によつて特性化し、次の
結果が得られた： Ｒf＝0.4、クロロホルム−メタノール移動混合物（容量
８０／２０）中、 （Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（ｍ／ｅ：４３６−１７％）； ２−クロルフエノキシアセチル化グアニン（ｍ／ｅ：３
２０−４４％）。
生成物の純度は、２５０MHzにおける核磁気共鳴での分
析によつて確認した。
実施例３：（Ｎ2−メトキシアセチル））−２′−デオ
キシグアノシン（化合物３）の製造 5.4ｇ（２０ミリモル）のデオキシグアノシンを乾燥
し、次いで１００mlの無水ピリジン中に懸濁させた。０
℃まで冷却し、次いで4.5当量（１０ｇ；９０ミリモ
ル）のメトキシアセチルクロライドを徐々に添加した。
反応を室温で３時間継続して三重保護された出発化合物
の誘導体、すなわち式(I)においてＢがグアニンから誘
導された式(II)の基を示し、Ｒ1が水素原子を示し、Ｒ2
がメトキシ基を示し、Ｒ3およびＲ4がメトキシアセチル
基を示しかつＲ5が水素原子である誘導体を生成させ
た。
過剰の酸クロライドをメタノールにより３０分間分解し
て、低沸点（１２９−１３０℃）を有するメチルメトキ
シアセテートを生成させた。溶剤を蒸発させ、かつ残留
物をクロロホルムロで溶解させた。次いで、これを５０
％重炭酸ナトリウム水溶液で洗浄した。クロロホルム相
を硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発させて橙色残留
物を得、これは三重保護された誘導体に相当した。
誘導体をシリカカラムクロマトグラフイー（直径４cm、
長さ１０cm）により精製し、その際クロロホルム−メタ
ノール濃度勾配を使用した。かくして、７ｇの三重保護
された誘導体が回収され、これは収率７３％に相当し
た。
次いで、エステル基をトリエチルアミンとピリジンと水
との混合物（容量で２０：２０：６０）により加水分解
した。次いで、溶剤を蒸発させかつＮ2−メトキシアセ
チル−２′−デオキシグアノシン（化合物３）をシラン
化したシリカカラムにおけるクロマトグラフイーによつ
て精製し、その際水とアセトンとの混合（７０：３０v/
v）で溶出を行なつた。かくして3.4ｇの生成物が得ら
れ、これは収率５１％に相当した。この生成物を２５０
MHzにおける核磁気共鳴および質量分析器によつて検査
し、次の結果を得た： （Ｍ−Ｈ）：分子ピーク（m/e：３３８−１０％）； メトキシアセチル化グアニン：（ｍ／ｅ：２２２−３１
％）。
実施例４：（Ｎ6−フエノキシアセチル）−２′−デオ
キシアデノシン（化合物４）の製造 １０２５mg（４ミリモル）のデオキシアデノシンを乾燥
させ、次いで２０mlの無水蒸溜ピリジン中に溶解させ、
かつ氷水浴中に入れたフラスコに導入した。これに続い
て、０℃のピリジン２０ml中に溶解させた８当量の無水
フエノキシ酢酸（9.4ｇ；３２ミリモル）を徐々に添加
した。反応を室温にて９０分間継続し、かつ黄色の着色
が徐々に出現した。このようにして、Ｂがアデニンから
誘導された式(IV)の基を示し、Ｒ1が水素を示し、Ｒ2が
フエノキシ基を示し、Ｒ3およびＲ4がフエノキシアセチ
ル基を示し、かつＲ5が水素原子を示す式(I)のヌクレオ
シド誘導体が生成した。
過剰の酸無水物を次いで０℃にて３mlの蒸溜水を添加す
ることにより分解し、次いで反応媒体を１００mlのクロ
ロホルムで希釈した。クロロホルム相を５０mlの５％重
炭酸ナトリウム水溶液で４回洗浄し、かつ溶剤を蒸発さ
せて黄色残留物を得た。これを１００mlのピリジン中に
溶解し、かつ溶液を氷水浴中に入れた後、１００mlの0.
2Ｎソーダを０℃で添加してアデノシンの３′および
５′位置を１５分間選択的に加水分解した。次いで、媒
体を実施例１に使用したピリジニウム型の陽イオン交換
樹脂ダウエツクス５０Ｗ−Ｘ８で中和した。樹脂を過
しかつ洗浄し、次いで液を蒸発乾固させた。
これにより（Ｎ6−フエノキシアセチル）−２′−デオ
キシアデノシン（化合物４）を得、これをシリカカラム
クロマトグラフイー（直径４cm、長さ１０cm）により精
製し、その際クロロホルム−メタノール濃度勾配（１０
０−０〜９６−４）を使用した。求める生成物を含有す
るフラクシヨンを次いで蒸発させ、かつこのようにして
１０１０mgの白色粉末を得、これは収率６５％に相当し
た。
次いで、生成物を薄層クロマトグラフイーと２５０MHz
におけるプロトンの核磁気共鳴と質量分析器とで特性化
した。次の結果が得られた： Ｒf：0.66、クロロホルム−メタノール移動混合物（容
量で８０：２０）。
２５０MHzにおけるプロトンの核磁気共鳴：1 H−NMR（ピリジンd5）：2.7−3.3（ｍ，２Ｈ，H2 ′，H
2 ″）；4.1−4.35(m,2H,H5H5 ″)；4.6(m,H4 ′)；5.25
(m,H3 ′)；=5.65(s,2H,CH2)；7.0(m,H1 ′)；6.9−7.4
(m,5H,C6H5)；8.75および9.05（ｓ，Ｈ2およびＨ8） 質量分析：（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（m/e：３８６−１
６％）；アセチル化フエノキシアデニン（m/e：２７０
−６６％） 実施例５：（Ｎ4−イソブチリル）−２′−デオキシシ
チジン（化合物５）の製造 ４ミリモルのデオキシシチジンを乾燥させ、次いで１５
mlの無水ピリジン中に溶解させ、かつ溶液を氷水浴中に
入れたフラスコに導入した。これに続いて６当量（2.5m
l；２４ミリモル）のイソブチリルクロライドを徐々に
添加した。反応を室温にて１２０分間継続し、媒体は橙
色に変化した。このようにして三重保護された出発ヌク
レオシド誘導体、すなわち式(I)においてＢがシトシン
から誘導された式(III)の基を示し、Ｒ1およびＲ2がメ
チル基を示し、Ｒ3およびＲ4がイソブチリル基を示しか
つＲ5が水素原子を示す誘導体が生成した。
過剰の酸クロライドを２mlの２回蒸溜した水で０℃にて
分解し、かつ反応媒体を１００mlのクロロホルムで希釈
した。このクロロホルム相を５０mlの重炭酸ナトリウム
５％水溶液で４回洗浄して、精製したイソ酪酸を除去
し、硫酸ナトリウムで脱水し、次いで蒸発乾固させた。
これにより橙色残留物が得られ、これを５mlの０℃まで
冷却されたピリジンに溶解した。これに続いて、１００
mlの0.2Ｎソーダを０℃にて添加し、デオキシリボスの
３′および５′位置におけるエステル基の選択加水分解
反応を３０分間継続させた。これに続いて、実施例１に
使用したピリジニウム型のイオン交換樹脂ダウエツクス
５０Ｗ−Ｘ８により媒体の中和を行なつた。これに続い
て、樹脂を過しかつ洗浄し、そしてこの液を蒸発乾
固させた。
精製をシリカカラムクロマトグラフイー（直径４cm、長
さ１０cm）によつて行ない、その際クロロホルム−メタ
ノール濃度勾配（１００−０〜９５−５）を用いた。溶
剤を蒸発させ、かつこのようにして６３０mgのイソブチ
リル−デオキシシチジンにより構成される白色粉末が得
られ、これは収率５０％に相当した。
この生成物を薄層クロマトグラフイーと質量分析器と２
５０MHzにおけるプロトンの核磁気共鳴によつて特性化
した。次の結果が得られた： Ｒf：0.55、クロロホルム−メタノール移動混合物（８
０：２０）、 質量分析（Ｍ＋Ｈ）：分子ピーク（m/e＝２９８−１１
％）、 イソブチリル化シトシン（m/e＝１８２−１００％）、 ２５０MHzにおけるプロトンの核磁気共鳴：1 H−NMR（メタノールｄ4）：1.2(ibのｄ，6H，２(C
H))，2.15−2.4(m,2H,H2 ′，H2 ″)，2.7(m,Hib)；3.7−
3.9(m,2H,H5 ′，H5 ″)；4.0(m,H4)；4.4(m,H3 ′)；6.25
(t,H1 ′)；7.5および8.5(d,H5およびH6) 実施例６：（Ｎ4−イソブチリル）−５′−（４′，
４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシシチジン
（化合物６）の製造 2.5ミリモルの化合物５を、無水ピリジンの連続添加お
よび蒸発によつて乾燥させた。これを２５mlのピリジン
で溶解させ、０℃まで冷却しかつ2.75ミリモル（1.1当
量）の４，４′−ジメトキシトリチルクロライドの２５
mlピリジン溶液（０℃）を添加した。反応を５℃にて１
７時間継続させ、次いで２mlのメタノールを反応媒体に
添加した。３０分間後、溶剤を回転エバポレータによつ
て除去し、かつ油状残留物を１００mlの酢酸エチルで溶
解し、次いで５０mlの５％NaHCO3水溶液で３回洗浄し、
かつ５０mlの２回蒸溜された水で１回洗浄した。次いで
有機相を硫酸ナトリウムで脱水しかつ濃縮した。シリカ
ゲルカラムでの分画により、得られた化合物６を分離
し、これは式(I)においてＢがシトシンから誘導された
式(III)の基であり、Ｒ1およびＰ2がメチル基であり、
Ｒ3が４，４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ4が水
素原子でありかつＲ5が水素原子である式(I)の誘導体に
相当した。
この化合物の物理化学的特性および反応収率を第１表に
示す。
実施例７：（Ｎ6−フエノキシアセチル）−５′−
（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシア
デノシン（化合物７）の製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代りに化合物４の2.5mmolを使用し、このよう
にして化合物７：（Ｎ6−フエノキシアセチル）−５′
−（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシ
アデノシン、すなわち式(I)においてＢが式(IV)のアデ
ニンから誘導された基を示し、Ｒ1が水素原子であり、
Ｒ2がフエノキシ基であり、Ｒ3が４，４′−ジメトキシ
トリチル基であり、Ｒ4が水素原子でありかつＲ5が水素
原子である化合物が生成された。
化合物の反応収率および物理化学的特性を第(I)表に示
す。
実施例８：Ａ（Ｎ2−メトキシアセチル）−５′−
（４，４′−ジメトキシトリチル−２′−デオキシグア
ノシン（化合物８）の製造 実施例６におけると同じ操作法を採用したが、ただし化
合物５の代りに2.5ミリモルの化合物３を使用した。
これにより式(I)においてＢがグアニンから誘導された
式(II)の基であり、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2がメトキ
シ基であり、Ｒ3が４，４−ジメトキシトリチル基であ
り、Ｒ4が水素原子でありかつＲ5が水素原子である化合
物８を得た。
この化合物の反応収率および物理化学的特性を第１表に
示す。この表において、括弧内の文字は複数のピーク、
すなわちｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリ
プレット、ｑ＝クアドラプレットおよびｍ＝マルチプレ
ットを示す。
実施例９：化合物９の製造 この実施例は、ポリヌクレオチドのホスホトリエスル合
成に使用される化合物８のホスホリル誘導体の製造を示
している。
３ミリモルの化合物８を、無水ピリジン（５mlづつ３
回）の添加及び蒸発により乾燥した。残留物を１５mlの
ピリジンおよび無水ジオキサン３０ml中の４、５ミリモ
ルの４−クロルフエニルホスホリルビストリアゾリデー
トに溶解させた（４−クロルフエニルホスホリルビスト
リアゾリデートは４、５ミリモルの４−クロルフエニル
ジクロルホスフエートを３０mlのジオキサン中における
９ミリモルのトリアゾールと9.３５ミリモルのトリエチ
ルアミンとの懸濁物に添加して得た）。反応を２０分間
継続させ、次いで６mlのH2O−トリエチルアミン混合物
（容量で１：１）を添加することにより停止させ、次い
で反応媒体の容積を蒸発により５mlまで濃縮した。これ
に続いてクロロホルム１００mlに溶解させ、かつ５０ml
のNaHCO3水溶液で３回洗浄し、次いで１００mlの水で洗
浄した。クロロホルム相を硫酸ナトリウムで脱水し、次
いで蒸発乾固させた。求める化合物をシリカゲルクロマ
トグラフイーによつて単離した。得られた生成物を次い
で質量分析器および核磁気共鳴にかけた。得られた反応
収率および結果を第２表に示す。
このように得られた化合物９は、式(I)においてＢが式
(II)のグアニンから誘導された基を示し、Ｒ1が水素原
子を示し、Ｒ2がメトキシ基を示し、Ｒ3が４，４−ジメ
トキシトリチル基を示し、Ｒ4が式(VI)の基を示しかつ
Ｒ5が水素原子を示すヌクレオシド誘導体であつた。
実施例１０：化合物１０の製造 この実施例は、化合物７のホスホトリエステル合成に関
するホスホリル誘導体を製造するための実施例９と同様
な操作手順を採用し、その際2.5ミリモルの化合物８の
代りに2.5ミリモルの化合物７を使用した。これにより
化合物１０が得られ、これは式(I)においてＢがアデニ
ンから誘導された式(IV)の基を示し、Ｒ1が水素原子を
示し、Ｒ2がフエノキシ基を示し、R3が４，４′−ジメ
トキシトリチル基を示し、Ｒ4が式(VI)の基を示しかつ
Ｒ5が水素原子を示す誘導体に相当する。
上記したように、得られた化合物の特性を質量分析器お
よび核磁気共鳴によつて決定し、得られた結果および反
応収率を第２表に示す。
実施例１１：化合物１１の製造 この実施例においては、実施例９の操作手順を採用し
て、ホスホトリエステル合成につき使用した化合物６の
ホスホリル誘導体を製造し、その際３ミリモルの化合物
８の代りに３ミリモルの化合物６を使用した。
これにより式(I)の化合物１１が得られ、ここでＢはシ
トシンから誘導される式(III)の基を示し、Ｒ1およびＲ
2はメチル基を示し、Ｒ3は４，４′−ジメトキシトリチ
ル基を示し、Ｒ4は式(VI)の基を示しかつＲ5は水素原子
を示す。
実施例９および１０におけると同様に、得られた生成物
を質量分析器および核磁気共鳴によつて検査した。得ら
れた反応収率および結果を第２表に示す。
実施例１２：化合物１２の製造 この実施例においては、オリゴヌクレオチドホスホルア
ミダイド合成につき使用した化合物８のホスホリル誘導
体を製造した。３ミリモルの化合物８をピリジン、トル
エンおよびテトラヒドロフラン(THF)を一緒に蒸発させ
て乾燥した。残留物を１２ミリモルのＮ，Ｎ，Ｎ−ジイ
ソプロピルエチルアミンの存在下で１５mlのTHFに溶解
させ、かつこれに続いて６ミリモルのβ−シアノエチル
−モノクロル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスホル
アミダイトを２分間かけて滴加した。５分間の反応の
後、このアミンの塩酸塩沈澱物が生成した。反応を３５
分間続行させかつ沈澱物を反応の終了時点で過した。
次いで、液を蒸発乾固させ、１５０mlの酢酸エチルに
溶解させた。１０％のNa2CO3を含有する氷冷した水溶液
で洗浄を行なつた。次いで、有機相を硫酸ナトリウムで
洗浄し、かつ蒸発乾固させた。
得られた化合物を寸法Ｂのメルク「LOBAR」カラムでの
低圧クロマトグラフイーによつて精製し、その際CH2Cl2
−ヘキサン−トリエチルアミン（容量で７０：２０：１
０）の混合物を溶出剤として使用した。得られた化合物
を最小量のジクロルメタンまたは酢酸エチルで溶解さ
せ、かつ−８０℃にてヘキサン中で沈澱させた。この生
成物を核磁気共鳴により分析した。得られた結果および
反応収率を第３表に示す。
これにより式(I)に相当する化合物１２が得られ、ここ
でＢはグアニンから誘導された式(II)の基を示し、Ｒ1
は水素原子を示し、Ｒ2はメトキシ基を示し、Ｒ3は４，
４′−ジメトキシトリチル基を示し、Ｒ4は式(VII)の基
を示しかつＲ5は水素原子を示す。
実施例１３：化合物１３の製造 実施例１２におけると同様に、３ミリモルの化合物８の
代りに３ミリモルの化合物７を用いて化合物７のホスホ
リン誘導体を作成しかつこれをホスホルアミダイト合成
に使用することができる。さらに、得られた化合物につ
き核磁気共鳴によつて分析を行なつた。反応の収率およ
び結果を第３表に示す。
これにより化合物１３が得られ、この化合物は式(I)に
おいてＢがアデニンから誘導された式(IV)の基であり、
Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2がフエノキシ基であり、Ｒ3
が４，４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ4が式(VI
I)の基でありかつＲ5が水素原子である化合物に相当す
る。
実施例１４：化合物１４の製造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
りに３ミリモルの化合物６を用いて化合物６のホスホリ
ル誘導体を作成し、これはホスホルアミダイド合成に使
用することを目的とした。さらに得られた化合物を核磁
気共鳴により分析した。反応収率および得られた結果を
第３表に示す。
これにより化合物１４が得られ、これは式(I)において
Ｂがシトシンから誘導された式(III)の基を示し、Ｒ1お
よびＲ2がメチル基を示し、Ｒ3が４，４′−ジメトキシ
トリメチル基を示し、Ｒ4が式(VII)の基を示しかつＲ5
が水素原子を示す化合物に相当する。
実施例１５：（Ｎ6−フエノキシアセチル）−５′−
（４，４′−ジメトキシトリチル）−２′−デオキシグ
アノシン（化合物１５）の製造 実施例６におけると同じ操作手順を採用したが、化合物
５の代りに４ミリモルの化合物１を使用し、このように
して化合物１５を製造し、すなわちこの化合物は式(I)
においてＢが式(II)のグアニンから誘導された基であ
り、Ｒ1が水素原子であり、Ｒ2がフエノキシ基であり、
Ｒ3が４，４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ4が水
素原子でありかつＲ5が水素原子である化合物に相当す
る。
反応収率は７０％であつた。クロロホルム：メタノール
混合物（９０：１０）におけるこの化合物のＲfは4.0で
あつた。重水素化メタノールにおけるこの分子の主プロ
トンの化学配位は次の数値を有した： Ｈ８：8.07ppm，Ｈ１′：6.45ppm(t)，Ｈ３′：4.75ppm
(m)，Ｈ，ジメトキシトリメチルのCH3：3.86ppm)(s)，
フエノキシアセチルのCH2：5.05ppm(s) 実施例１６：化合物１６の製造 実施例１２におけると同様に３ミリモルの化合物８の代
りに３ミリモルの化合物１５を用いて化合物１５のオス
ホリル誘導体を作成し、これはホスホルアミダイト合成
につき使用する。最終生成物の収率は５０％であつた。
この化合物は重水素化ピリジンにおいて１４６および１
４６．２ppmに位置する３１ＰのＮMRタブレツトを特徴
とする。重水素化アセトニトリルにおけるプロトンの主
ＮMRピークは、8.12ppm(s,H8)，6.45ppm(t,H1′)，5.05
ppm(s,CH2フエノキシアセチル）および4.88ppm(m,H3′)
に位置した。
FABイオン源を用いる質量分析器により、この生成物の
分子ピークにつき９０３のm/eの数値を観察することが
できた。
これにより化合物１６が得られ、これは式−(I)におい
てＢが式(II)のグアニンから誘導された基であり、Ｒ1
が水素原子であり、Ｒ2がフエノキシ基であり、Ｒ3が
４，４′−ジメトキシトリチル基であり、Ｒ4が式−(VI
I)の含燐基でありかつＲ5が水素原子である化合物に相
当する。
以下の実施例１７〜１９は、Ｈ−ホスホネート法によつ
てオリゴヌクレオチドを合成するために使用する完全保
護されたモノヌクレオチドの製造を示している。
実施例１７：化合物１７の製造 オリゴヌクレオチドを合成するための化合物１７を、Ｈ
−ホスホネート法により作成した。５ミリモルの化合物
７を５mlの無水ジオサンと一緒に蒸発させて乾燥し、か
つこれを１５mlの前記溶媒と５mlの無水ビリジンとに溶
解させた。これに続いて、５mlの1.25Ｍ ２−クロル−
（５，６−ａ）−ベンゾ−〔１，３−ジオキソ−２−ホ
スホル−４−イノン〕または式： のサリチルクロルホスフアイトを添加し、かつ反応を室
温にて１０分間継続させた。
これに続いて、0.5mlの水を添加しかつ加水分解を１０
分間生ぜしめた。次いで、この混合物を２５０mlの１モ
ル酢酸トリエチルアンモニウム水溶液に注ぎ入れ、かつ
所望生成物を２５０mlのクロロホルムで２回抽出した。
有機相を無水硫酸ナトリウムで脱水し、かつ回転エバポ
レータで濃縮した。このように得られた残留物を、シリ
カゲルカラム（２００×４０mm）上での高性能液体クロ
マトグラフイーによつて精製した。この生成物をクロロ
ホルムにおける２％トリエチルアミン混合物中でメタノ
ール濃度を増大させた溶液（０％メタノール：２５０m
l：１％メタノール：２５０ml：２％メタノール：２５
０ml；３％メタノール：２５０ml；５％メタノール：２
５０ml；７％メタノール：５００ml）で溶出させた。求
める生成物を含有するフラクシヨンを集め、かつ溶剤を
蒸発させて生成物を白色フオームとして得た。化合物１
７の収率は５５％であつた。この化合物を核磁気共鳴に
より分析し、かつ得られた結果を第(IV)表に示す。
これにより化合物１７が得られ、これはＢがアデニンか
ら誘導された式(IV)の基を示し、Ｒ1が水素原子を示
し、Ｒ2がフエノキシ基を示し、Ｒ3が４，４′−ジメト
キシトリチル基を示し、Ｒ4が式： の含燐基を示しかつＲ5が水素原子を示す式(I)に相当す
る。
実施例１８：化合物１８の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
りに５ミリモルの化合物１５を用いたＨ−ホスホネート
法により化合物１５のホスホリル誘導体を作成し、これ
はオリゴヌクレオチド合成を目的とする。反応収率は４
８％であり、かつ得られた生成物を核磁気共鳴によつて
分析した。得られた結果を第(IV)表に示す。
これにより化合物１８が得られ、これはＢがグアニンか
ら誘導された式(II)の基を示し、Ｒ1が水素原子を示
し、Ｒ2がフェノキシ基を示し、Ｒ3が４，４′−ジメト
キシトリチル基を示し、Ｒ4が式： の含燐基を示しかつＲ5が水素原子を示す式(I)に相当す
る。
実施例１９：化合物１９の製造 実施例１７におけると同様に５ミリモルの化合物７の代
りに５ミリモルの化合物５を使用してＨ−ホスホネート
法により化合物５のホスホリル誘導体を作成し、これを
オリゴヌクレオチドを合成するために使用した。反応収
率は６２％であり、かつ得られた生成物を核磁気共鳴に
よつて分解した。得られた結果を第(IV)表に示す。
これにより化合物１９が得られ、これはＢがシトシンか
ら誘導された式(III)の基を示し、Ｒ1およびＲ2がメチ
ル基を示し、Ｒ3が４，４′−ジメトキシトリチル基を
示し、Ｒ4が式： の含燐羅基を示しかつＲ5が水素原子を示す式(I)に相当
する。
実施例２０ この実施例は次の配列： ｄ(AATTCAGATUTGATCAT)AGRE-AGRE を有するオリゴヌクレオチドを合成するための化合物
９，１０および１１を示している。この配列において、
Ａはアデニンを用いて生成されたヌクレオチドを示し、
Ｃはシトシンを用いて生成されたヌクレオチドを示し、
かつＧはグアニンを用いて生成されたヌクレオチドであ
り、Ｔはチミンを用いて生成されたヌクレオチドであり
かつＵはウラシルを用いて生成されたヌクレオチドを示
す。
この合成を行なうため、それぞれグアニン、アデニンお
よびシトシンに対応する化合物９，１０および１１並び
にチミンおよびウラシルに対応するものを使用した。後
者は、それぞれ実施例６〜１１におけると同じ操作手順
を用いて４，４′−ジメトキシトリチル基および式(VI)
の基により夫々５′および３′位置におけるヒドロキシ
ル基を保護することにより対応のヌクレオシドから得
た。
合成は、連鎖の５′末端を含む５０mg（すなわち約1.5
〜３モル）の支持体（ピアス（pierce）社の「調節気孔
ガラス」）と、１縮合サイクル当り２５mgの実施例９〜
１１で得られたヌクレオシド誘導体と、約８〜１５当量
を示すチミジンおよび２′−デオキシウリジン対応物
（synthon）と、１縮合サイクル当り２５mg（すなわち
ヌクレオシドに対し２当量）のメシチレンスルホニルク
ロライドにより構成される活性剤とを用いて、バイオサ
ーチ（Biosearch）SAM ONEオートマトン（automaton）
により行なつた。
各縮合サイクルは以下の工程を採る。
脱トリチル化：CH2Cl2における２％トリクロル酢酸、２
分間； 洗浄：CH3CN、１分間； 乾燥：無水CH3CN、６分間； 縮合：CH3CN/1−メチルイミダゾール混合物（容量で８
５：１５）におけるモノマーヌクレオシド誘導体および
メシチレンスルホニルクロライド、 １５分間；及び 洗浄：CH3CN、６分間。
かくして、これら縮合サイクルの後に、共有結合したオ
リゴヌクレオチドを含有するシリカゲルが得られた。こ
れを全てパイレツクスフラスコに移し、次いで２８％ア
ンモニアを添加しかつ室温にて８時間放置した。このよ
うにして、オリゴヌクレオチドを支持体から遊離させ、
その際本発明の目的を構成する保護基を除去した。
次いで、上橙液を除去しかつシリカを１mlの２回蒸溜さ
れた水で３回洗浄した。溶剤を蒸発させ、かつ残留物を
0.5mlの水に溶解し、次いでセフアデツクスＧ２５カラ
ム（直径１cm、高さ７cm）にて分画した。２５４ｎｍに
て紫外光の吸収を示すフラクシヨンを集め、かつ凍結乾
燥した。
Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを用いる燐３２の標識
によりかつポリアクリルアミドゲル上での電気泳動によ
り、得られた充分な長さの合成ＤＮＡ断片を検査した。
対応するストリツプを切断しかつ化合物を溶出させ、生
物学的用途を目的として化合物を生成することができ
る。
同様にして、次の配列を有するオリゴヌクレオチドの製
造を行なつた： −ｄ(AATTCAGAUCTGATCAT)， −ｄ(AATTCAGUTCTGATCAT)， −ｄ(AATTCAUATCTGATCAT)，および −ｄ(CGATGATCAGATCTG)． ここでも、良好な結果が得られると共に、常温にてアン
モニア中で緩和な条件下において保護基が除去された。
実施例２１ この実施例においては、ホスホルアミダイト合成を用い
て長さ１５ヌクレオチドの単独重合体を合成するため化
合物１２，１３および１４を使用した。
合成を実施例２０におけると同じバイオサーチSAM ONE
オートマトンを用いて行ない、かつ次の試薬量を用い
た；ポリヌクレオチド連鎖の末端３′を含む実施例１５
で使用した５０ｇ（すなわち1.5〜３モル）の支持体； １縮合サイクル当り２０mgの化合物１２，１３もしくは
１４（２０〜２５当量）；および １サイクル当り１５mg（ヌクレオチドに対し２当量）の
５−パラニトロフエニルテトラゾールにより構成される
活性剤。
各縮合サイクルは次の工程で構成した： 脱トリチル化：CH2Cl2における２％トリクロル酢酸、９
０秒； 洗浄：CH3CN，１分間； 乾燥：無水CH3CN：無水ジメチルホルムアミド（９０：
１０）、３分間； 縮合：CH3/CN：ジメチルホルムアミド混合物（９０：１
０）におけるヌクレオシド誘導体＋活性剤、３分間； 酸化：テトラヒドロフラン：水：ルチジン（89.5:10:0.
5）における0.45％沃素、１分間； 不完全連鎖の延長を停止させるべく、反応しなかつたロ
ヒドロキシル基の遮蔽。無水CH3CNにおける無水酢酸と
１−メチルイミダゾールとの混合物、２分間； 洗浄：CH3CN、３分間。
同じ化合物（化合物１２，１３もしくは１４）を用いて
行なつた１４回の縮合サイクルの後、合成された生成物
を含む支持体をパイレツクスラフラスコに移し、かつ２
mlの２８％アンモニアを添加した。フラスコを室温にて
８時間保ち、これにより本発明の目的を構成する保護基
を除去することができた。
次いで、上澄液を溶解し、かつシリカを１mlの２回蒸溜
された水で３回洗浄し、次いで溶剤を回転エバポレータ
で排除した。粗製残留物を0.5mlの水に溶解させ、これ
をセフアデツクスＧ２５ゲル上でのクロマトグラフイー
によつて精製した。２５４ｎｍにて吸光するフラクシヨ
ンを集め、その含有量をＴ４−ポリヌクレオチドキナー
ゼによる燐３２標識の後にポリアクリルアミドゲル上で
の電気泳動によつて分析した。
かくして、３種の合成された単独重合体は所望長さを有
し、かつこれはそれぞれｄ(A15)，ｄ(C15)およびｄ
(G15)に対応することを確認することができた。
実施例２２：Ｈ−ホスホネート法によるオリゴヌクレオ
チドの製造 この実施例は、次の配列： ５′ｄ(ATGATCTACT)3′ を有するオリゴヌクレオチドを合成するための化合物１
７，１８および１９の使用を示している。
この配列においてＡ，Ｇ，ＣおよびＴは実施例２０の配
列におけると同じヌクレオチドを示す。
結合を行なうため化合物１７，１８および１９をそれぞ
れアデニン，グアニンおよびシトシンに対応するシント
ン（synthon）、並びにチミンに対応すシントンとして
使用した。後者は５′機能を４，４′−ジメトキシトリ
チル基で保護しかつ３′機能を式： Ｈ−Ｐ−Ｏ（C2H5)3NH+ の含燐基で保護することによりチミジンから得られ、そ
の際アデニンのＨ−ホスネート誘導体につき前記したと
同じ操作手順を用いた。
組合はバイオサーチSAM ONEオートマトンを用いて行な
い、その際次のものを使用した： ４，４′−ジメトキシトリチル基により５′位置が保護
された１μモルのチミジンでグラフトされた支持体から
なる、設計者により予備状態調節されたカラム； １縮合サイクル当り８mgのヌクレオシド誘導体１７，１
８および１９並びに約１０モル当量の対応するチミジン
誘導体および １縮合サイクル当り６μｌ、すなわち５０モル当量の活
性剤として使用されるトリメチルアセチルクロライド。
各縮合サイクルの工程は次の通りである： ジクロルメタン３ml中の２％トリクロル酢酸、１分間； アセトニトリルによる洗浄、３ml； ピリジン：アセトニトリル混合物１：１、すなわち３ml
による乾燥； 縮合：ピリジン−アセトニトリル混合物２mlにおけるヌ
クレオシド誘導体および活性剤、１分間；３mlのピリジ
ン−アセトニトリル混合物による洗浄； ３mlのアセトニトリルによる洗浄。
縮合サイクルが終了した後、２％沃素溶液をピリジン：
水混合物９８：２（３ml）中へ通すことにより、ヌクレ
オチド間の燐酸化を生せしめた。これに続いて、ピリジ
ンとアセトニトリルとの混合物（５ml）およびアセトニ
トリル（3ml）で洗浄し、次いで上記と同様に脱トリチ
ル化した。
これにより、共有結合したポリヌクレオチドからなるシ
リカゲルが得られた。これを全てパイレツクスフラスコ
に移し、２mlの２８％アンモニアを添加し、かつ常温に
て２時間放置した。かくしてオリゴヌクレオチドが支持
体から遊離され、その間本発明の目的を構成する保護基
を除去した。次いで、上澄液を溶解させ、シリカを１ml
の２回蒸溜した水で３回洗浄し、溶剤を蒸発させかつ残
留物を0.5mlの水で溶解させた。これに続いて、セフア
デツクスＧ２５カラム（直径１cm、高さ７cm）での分画
を行ない、次いで２５４ｎｍにて紫外光の吸収を有する
フラクシヨンを合し、かつこれを凍結乾燥した。
合成された生成物の正確な長さを放射性燐３２標識によ
つて検査し、その際Ｔ４−ポリヌクレオチドキナーゼを
使用し、次いでポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に
かけた。
化合物No.９ 化合物No.１０ 化合物No.１１ 化合物No.１２ 化合物No.１３ 化合物No.１４ 化合物No.１７ 化合物No.１８ 化合物No.１９
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｈ 21/04 Ａ (56)参考文献 特開 昭56−138199（ＪＰ，Ａ) Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅ ａｒｃｈ．２巻５号699−706頁（1975年) Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｍ．37巻２号363 −369頁（1981年） 有機合成化学協会誌, 36巻９号723−731（1978年)

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】式： ［式中、 Ｂは式： および から選択され、その環外ＮＨ基によってＣＯ基に結合さ
    れる二価の基を示し、 Ｒ１は水素原子、メチル基またはメチル基を示し、 Ｒ２はメトキシ基およびフェノキシ基より成る群から選
    択される基を示し、これらは未置換でもまたはＮＯ２、
    ＣＮ、メトキシ、エトキシ、フェノキシ、Ｃｌ、Ｆ、 ＳＯ２Ｒ、 置換されていてもいなくてもよいフェニル、メチルもし
    くはエチル基、ＳＲ（ここでＲはメチル基、エチル基ま
    たはフェニル基を示す）より成る群から選択される１個
    もしくはそれ以上の基により置換されていてもよく、 Ｒ３は水素原子、保護基、または式： （ここでＲ１およびＲ２は上記の意味を有する） の基を示し、 Ｒ４は水素原子、保護されたリン酸基または式： （ここでＲ１およびＲ２は上記の意味を有する） の基を示し、 Ｒ５は水素原子またはＯＨ基を示す］ を有するヌクレオシド誘導体。
  2. 【請求項２】保護基Ｒ３が式： （式中、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は同一でも異なってもよ
    く水素原子、アルキル基もしくはアルコキシ基を示す）
    のトリチル基、ピキシル基および９−フェニルキサンテ
    ニル基よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項
    記載のヌクレオシド誘導体。
  3. 【請求項３】保護されたリン酸基Ｒ４が式： 式： または式： の基よりなる群から選択される特許請求の範囲第１項ま
    たは第２項記載のヌクレオシド誘導体。
  4. 【請求項４】Ｂが式： を示し、Ｒ１が水素原子を示し、かつＲ２が式： および ＣＨ３Ｏ−から選択される基である特許請求の範囲第１
    項記載のヌクレオシド誘導体。
  5. 【請求項５】Ｂが式： を示し、Ｒ１が水素原子を示し、かつＲ２がフェノキシ
    基を示す特許請求の範囲第１項記載のヌクレオシド誘導
    体。
  6. 【請求項６】Ｒ３およびＲ４が水素原子を示す特許請求
    の範囲第１項、第４項または第５項記載のヌクレオシド
    誘導体。
  7. 【請求項７】Ｒ３が基： を示し、かつＲ４が水素原子を示す特許請求の範囲第１
    項、第４項または第５項記載のヌクレオシド誘導体。
  8. 【請求項８】Ｒ５が水素原子を示す特許請求の範囲第１
    項〜第７項のいずれかに記載のヌクレオシド誘導体。
  9. 【請求項９】Ｒ３が基： を示し、かつＲ４が基： を示す特許請求の範囲第１項、第４項または第５項記載
    のヌクレオシド誘導体。
  10. 【請求項１０】Ｒ３が基： を示し、かつＲ４が基： を示す特許請求の範囲第１項、第４項または第５項記載
    のヌクレオシド誘導体。
  11. 【請求項１１】Ｒ３が基： を示し、かつＲ４が基： を示す特許請求の範囲第１項、第４項または第５項記載
    のヌクレオシド誘導体。
  12. 【請求項１２】Ｒ５が水素原子を示す特許請求の範囲第
    １項〜第１１項のいずれかに記載のヌクレオシド誘導
    体。
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