JPH06504056A - トランスジェニック架橋ヘモグロビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニック架橋ヘモグロビン 発明の分野 本発明は、一般に、組換えＤＮＡ技術の分野に関する。さらに詳しくは、本発明 は、ヒトにおいて無細胞血液代替物として用いるのに適したトランスジェニック ・ヘモグロビンの提供に関する。

発明の背景 血液は生命を維持する流体として認識されているので、がっ、科学および技術が 進歩すめにつれ、血液についての人工的代替物を生産するのはヒトの工夫のゴー ルであった。このゴールに向けて、ムルダー（ｌｕｌｄｅｒ）ら（１９３４、ジ ャーナル・オブ・セル・コンブ・フィシオル（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｃｏｍｐ、　 Ｐｈｙｓｉｏｌ、　）　５　：　３８３−３９７）は、古い血液からの精製した ヒト・ヘモグロビンを用い、一時的血液代替物としての無細胞ヘモグロビンをテ ストする最初の実験を行った。１９７６年、モス（Ｍｏｓｓ）ら（１９７６、サ ージャ１ル・シネコロジー・アンド・オブステトリックス（Ｓｕｒｇ、　Ｇｙｎ ｅｃｏｌ、０ｂｓｔｅｔ、）１４２　：　３５７−３６２）は、ムルダー（Ｍｕ ｌｄｅｒ）　（前掲）らの実験を追試し、組織への酸素伝達は通常よりも低いが 、無細胞ヘモグロビンは効果的な酸素担持体として働くことを確認した。

次いで、無細胞ヘモグロビンの酸素親和性改変の問題を解決するためにいくつか のアプローチがなされた。該アプローチの一つは、βグロビンポリペプチドのア ミノ末端にピリドキサールリン酸を共有結合的に攻撃することである（アール・ イー・ベネシュ（Ｒ，Ｅ、Ｂｅｎｅｓｃｈ）ら、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃ ｈｅ＋ａ、　）　１１　：　３５７６　（１９７２）：ジイ・ニス・モス（Ｇ、 　Ｓ、　Ｍｏ５ｓ）ら、サージャリイ（Ｓｕｒｇｅｒｙ）９５：２４９　（１９ ８４）：エル・アール・セガル（Ｌ、　Ｒ，Ｓｅｈｇａｌ）ら、サージャリイ（ Ｓｕｒｇｅｒｙ）９５　：　４３３　（１９８４）　）　。第２のアプローチは 、化学的な架橋によって、赤血球中で通常形成されるヘモグロビン四量体を安定 化させることであった（シンダー（Ｓｙｎｄｅｒ）ら、１９８７、プロシーディ ングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ　８４　ニア２８０−７２８４ 　；モス（Ｍｏｓｓ）ら、１９８８、バイオマド・アート・セルズ。

アート・オルレグ（Ｂｉｏｍａｔ、＾ｒｔ、　Ｃｅ１ｌｓ、＾ｒｔ、　ｏｒｇ、 ）１６　：　５７”６９）。

分子内架橋は安定性をかなり改良するが、ヘモグロビンは実験動物の尿中で検出 可能であり、腎毒性が副作用として観察された。

ボルド（Ｇｏｕｌｄ）ら（１９９０、アン・サージ（Ａｎｎ、Ｓｕｒｇ、）２１ １３９４−３９８）が、重合したピリドキシル化ヒト・ヘモグロビンが効果的な 酸素担持体および一時的血液代替物としてよく適合することを証明した時にさら に進歩がなされた。

これらの進歩は有意義であったが、認識されるべき重要な制限要因はヒト・ヘモ グロビンの源は血液であり、ヒト血液は供給が少ないことである。さらに、肝炎 およびヒト免疫不全ウィルスのごとき薬剤での当該血液の汚染の危険は、特に、 種々の異なる源からの大量のヒト血液が生産タイプの施設で取り扱われる場合に 、遍在する問題である。

最近、ナガイ（Ｎａｇａｉ）ら（１９８５、プロシーディングズ・オブ・ナショ ナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）ＵＳＡ８２　：　７２５２−７２５５）およびリアン（Ｒｙａｎ）ら（サ イエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２４５　：　９７ｌ−９７３）は、組換えＤＮＡ 技術によって非ヒト宿主でヒト・ヘモグロビンを合成することによって別のアプ ローチを示している。

発明の要約 本発明は、トランスジェニック組換え架橋ポリマー化ヒト・ヘモグロビンをその 要旨とし、それは、無細胞血液代替物として用いるのに十分な安定性と酸素交換 効率を示す。好ましくは、本発明のポリマーヘモグロビンは四量体、六量体、十 三量体、またはその組合せであって、分子内または分子間ジスルフィド架橋、あ るいはその双方の形成を容易とする組換え導入システイニル残基を含むＤＮＡ分 子によってコードされる。ジスルフィド結合を介しての２またはそれを超える四 量体の連結は特に重要である。何故ならば、かがる連結によって提供される増加 した分子サイズは、腎臓による濾過を最小化し、それは、四量体またはそれより 小さいサイズの分子で起こりかるである。組換え導入システイニル残基によって 形成し得るジスルフィド架橋は、好ましくは、（ａ）α１９２ないしβ２４０＋ （ｂ）β１１ないしβ２　１４６；あるいは（ｃ）　αｌ　１３０ないしα２１ ４２のカルボキ７末端に付加したシステイニル残基のうちの１またはそれ以上の 間のものである。

本発明のヘモグロビンは、好ましくは、一対の組換えＤＮＡ分子によってコート され、そこでは、第１の分子は非ヒト・トランスジェニック動物における第１の ヒト・ヘモグロビン鎖をコードし、第２の組換え分子は動物における第２の異な るヒト・ヘモグロビン鏑をコードし、それにより、完全なヒト・ヘモグロビンが 赤血球細胞中で形成され、このヘモグロビンが実質的に純粋な形態で単離され、 ヘモグロビンに存在するヘム基の酸化なくしてヘモグロビンの蛋白部分の酸化を 可能とする条件下にて約４℃でインキュベートした場合、安定なポリマー状のヘ モグロビンがさらに化学的に修飾する必要なくして得られる。

本発明は、無細胞血液代替物としてヒト患者でのその使用を可能とする天然へモ グロビンに十分に近い酸素交換特性を有する安定なポリマー状ヒト・ヘモグロビ ンを提供する。

本発明の組換え突然変異ヒト・ヘモグロビン分子の１つのクラスにおいて、２つ の突然変異があり、その第１のものは酸素親和性を増加させ、その第２のものは 酸素親和性のバランスする減少を引き起こし、従って、正味の結果は天然に存在 するヒト・ヘモグロビンと比較して分子の酸素親和性を低下させる結果となる。

すなわち、酸素親和性減少突然変異は酸素親和性増加突然変異よりも大きな効果 を有する。好ましくは、組換え分子の酸素親和性は天然に存在する分子のそれの ７５〜９０％である。酸素親和性の増加を引き起こす突然変異は、好ましくは、 ジスルフィド架橋の形成についてのシステイニル残基の導入を含む。

本発明の他の特徴および利点はその好ましい具体例の以下の記載、および請求の 範囲から明らかであろう。

詳細な記載 図面につき最初に記載する。

界面 図１はα９２−β４〇四量体架橋を示す。

図２は六量体突然変異およびα１−β２四量体架橋を示す。

図３はウシおよびボルト・アレブレ（Ｐｏｒｔｏ　Ａｌｅｇｒｅ）突然変異を含 有する十三量体を示す。

図４は本発明で創製され、突然変異ヘモグロビンを合成するのに使用される種々 の突然変異のヌクレオチド配列（パネルＡ−Ｆ）を示す。

図５はマイクロインジェクションで用いるニスミド構築体の地図を示す。

遺伝的に修飾したヘモグロビン 本発明の前記したおよび種々の他の目的ならびに利点は、化学的架橋な（して、 全血におけるヘモグロビン分子と同様の安定度および酸素交換特性度を有する遺 伝的に修飾された組換えトランスジェニック・ヒト・ヘモグロビン分子によって 、および非ヒト・トランスジェニック動物で該分子を合成するためのＤＮＡ構築 体によって達成される。

特に断りのない限り、本明細書で用いるすべての技術および科学用語は本発明が 属する分野の当業者によって通常理解されるのと同一の意味を有する。本明細書 に記載したのと同様もしくは同等の方法および材料を本発明の実施およびテスト で用い、好ましい方法および材料は本明細書に記載する。言及されるべての文献 はここで引用して一体化させる。特に断りのない限り、本明細書で使用し、ある いは考えられる技術は当業者によく知られた標準的な方法である。材料、方法お よび実施例は例示的なものであって、限定的なものではない。

本明細書で用いる「実質的に純粋」なる語は、本発明が関連する当該分野で知ら れた標準的な単離および精製技術によって精製できる限りの純粋さを意味する。

本明細書で用いる「組換えにより修飾した」なる語は、分子の遺伝的作成物が、 部位特異的突然変異等を含めた組換えＤＮＡ技術によって修飾されており、当該 分子の化学的処理によって修飾されたものではないことを意味する。

本明細書で用いる「トランスジェニック」なる語は、後記にて詳細に説明するご とく、修飾したヒト・ヘモグロビンを発現するトランスジェニック動物から当該 分子が得られたことを意味する。安定なポリマーヘモグロビン（高分子量凝集体 の四量体）を生産するためのジスルフィド架橋の形成に必要な分子の修飾は、通 常の化学的架橋技術ではなく遺伝子組換え法によりヘモグロビン遺伝子に導入す る。

本明細書で用いる「ヒト・ヘモグロビン分子」なる語は、そのアミノ酸配列が、 突然変異したあるいは突然変異していないを問わず、少なくとも一部分、天然に 存在するヒト・ヘモグロビン分子のアミノ酸配列に対応する分子を意味する。

分子内ジスルフィド架橋をもつヒト・ヘモグロビンヘモグロビン四量体は、赤血 球を溶解し、ヘモグロビン濃度を希釈によって低下させた場合、急速にαβ二量 体に解離する。四量体が解離するのを防ぐために、本発明では、内部ジスルフィ ド架橋をヒト・ヘモグロビンに導入するためのいくつかの部位を同定した。これ らの架橋はＣ２β２四量体を安定化し、従って、無細胞ヘモグロビンの半減期を 延長する。脱酸素−および酸素付加−ヘモグロビン双方の結晶構造は正確に決定 されており、サブユニット相互作用の重要な部位は公知である。サブユニット相 互作用の領域における種々のアミノ酸間において原子の距離を調べ、αおよびβ ポリペプチドで通常のアミノ酸の代わりにシスティン置換した結果、これらの鏡 開にジスルフィド架橋が形成されるいくつかの部位を同定した。都合良いジスル フィド結合のための結合角を可能とするそれらの部位を突然変異につき選択した 。

ヒト・ヘモグロビン四量体の安定化には、２つのαβ二量体間のジスルフィド架 橋が必要である。架橋は、Ｃ１およびβ２サブユニツト間、Ｃ１およびＣ２サブ ユニット間、またはβ１およびβ２サブユニツト間で可能である。コンピュータ ーによるモデル化およびエネルギー最小化を用いて、通常のアミノ酸の代わりの システィン置換が最も安定なジスルフィド架橋に導く部位を同定した。か（して 決定された最も安定な四量体ジスルフィド架橋は・１）Ｃ１９２ないしβ２４０ ２）β１１ないしβ２１４６ ３）Ｃ２１３０ないしαｌ鎖のカルボキシ末端に付加したシスティン（α１１４ ２と表示） からのものを包含する。

前記ジスルフィド架橋のうち、好ましいものは、Ｃ１９２ないしβ２４０あるい はＣ２９２ないしβ１４０架橋である。何故ならば、この位置におけるジスルフ ィドは、酸素の協働的架橋に間における相互に対するαβ二量体の回転を妨げな いからである。図１は、α９２−β４〇四量体架橋を示す。黄色のボールはジス ルフィド架橋に含まれる硫黄原子を表す。

ヘモグロビン四量体のポリマー化についての分子間ジスルフィド四量体を安定化 するに加え、ジスルフィド架橋は四量体を一緒に連結して六量体等のごときポリ マーを形成するのに用いることができる。化学架橋によって安定化された四量体 は、ｉｎ　ｖｉｙ□において４時間に過ぎない半減期を有する。四量体は６４０ ００の分子量を有するが、腎臓によって濾過され、腎臓障害を起こし得る。２つ の四量体の連結は、約１２８０００ダルトンの分子を生じる。化学架橋によって 生じた六量体および高分子量ポリマーはｉｎ　ｖｉｖｏにて４０〜４８時間の半 減期を有し、これらの分子は腎臓によって濾過されない（ゲルト（Ｇｏｕｌｄ） ら、（１９９０）、アン・サージ（＾ｎｎ、Ｓｕｒｇ、）２１１　：　３９４− ３９８）。

ヘモグロビンのポリマー化のもう１つの重要な利点は、ポリマーの浸透圧特性に 関する。アイソ−オスモティック（ｉｓｏ−ｏｓ＋ｎｏｔｉｃ）であろう架橋四 量体の最高濃度は７ｇ／ｄｌである。しかしながら、この濃度は十分な酸素担持 能力を提供しない（ゲルト（Ｇｏｕｌｄ）ら、（１９９０）、アン・サージ（＾ ｎｎ、Ｓｕｒｇ、）２１１　：　３９４−３９８）。六量体ポリマーは、生理学 的ヘモグロビン濃度である１４ｇ／ｄ１においてアイソ−オスモティックであろ う。よりて、脱酸素−および酸素付加−ヘモグロビンの結晶構造を調べて、２つ の四量体の間のジスルフィド架橋についての最良の位置を決定した。α１アスパ ラギン酸７５をシスティンに変化させると、分子間架橋を形成できる分子を生じ るのが判明した。一旦、六量体が形成されると、立体障害によりさらなる重合が 抑制される。図２は、六量体突然変異およびＣ１−β２四量体架橋を説明する。

黄色のボールはジスルフィド結合に含まれる硫黄原子を表す。

別の自己制限重合戦術 前記した重合戦術の別法として、重合を起こす天然に存在する突然変異を調べた 。この突然変異はヘモグロビン・ボルト・アレブレ（Ｐｏｒｔｏ　Ａｌｅｇｒｅ ）として公知であり、ベータ鎖の９位におけるセリンからシスティンへの変化を 含む（トング（Ｔｏｎｄａ）ら、１９６３、アメリカン・ジャーナル・オブ・ヒ ユーマン・ジェネティックス（＾ｍｅｒ、　Ｊ、　Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓ）１５　２６５−２７９　；ポナベントウラ・アンド・リッグズ（Ｂｏｎａｖ ｅｎｔｕｒａ　ａｎｄ　Ｒｉｇｇｓ）、１９６７、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ ）１５８　：　８００−８０２）。

ヘモグロビン（Ｈｂ）ボルト・アレブレは自己制限的に重合して、２つのへモク 冶ビン四Ｉ体よりなる六量体あるいは３つの四量体よりなる十三量体を形成する （ポナベントウラ・アンド・リッグズ（Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ　ａｎｄ　Ｒｉ ｇｇｓ）、前掲；トング（Ｔｏｎｄａ）、１９７１、アン・アカド・ブラジル・ シエンク（＾ｎ、＾ｃｄ、　ｂｒａｓｉｌ。

Ｃ１ｅｎｃ）４３：６５１　６６９）。このヘモグロビンはｉｎ　ｖｉｖｏで重 合しないが、穏やかな酸化条件に暴露した後にｉｎ　ｖｉｔｒｏにて安定なポリ マーを形成する。

ｉｎ　ｖｉｔｒｏで重合した後、Ｈｂポルト・アレブレのポリマーは血清と同様 な還元状態で安定である（トング（Ｔｏｎｄａ）ら、アン・アカド・ブラジル・ シエンク（＾ｎ。

＾ｃａｄ、ｂｒａｓｉ１．ｃｉｅｎｃ）５７　：　４９７−５０６）　ｏ従って 、遺伝的に修飾したポリマーは、血液代替物として機能するのに理想的に適合す る。しかしながら、Ｈｂポルト・アレブレの１つの望ましくない特性は、その増 大した酸素親和性である。

この制限を克服するために、後記するごと（第２の酸素親和性減少突然変異を作 成できる。

ヘモク七ヒン・ボルト・アレブレにおける通常の酸素親和性の近似ヒト・ヘモシ ロビンの酸素親和性は分子２．３−ジホスホグリセレート（ＤＰＧ）によって調 節されている。赤血球細胞の外では、ＤＰＧはヘモグロビンから拡散し、ヘモグ ロビンの酸素親和性が大いに増大する。本発明はＤＰＧ調節の喪失に対してユニ ークな溶液を提供する。これは、その酸素親和性がウシ・ヘモグロビンのそれに 接近するようにヒト・ヘモグロビンを修飾することによって達成される。

ウシ・ヘモグロビンはＤＰＧに依存しない生来の低酸素親和性を有する。ベルブ およびイマイ（Ｐｅｒｕｔｚ　ａｎｄ　Ｉｍａｉ）　（１９８０、ジャーナル・ オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、墓ｏ１．Ｂｉｏ１．）１３６：１８３ 　１９１）は、ウシ・ヘモグロビンの減少した酸素親和性の原因であるアミノ酸 変化を特徴付けた。変化はベータ鎖のアミノ末端に起こり、疎水性残基でのＮＡ ２位の親水性残基の置き換えを含む。本発明は、ベータ鎖のＮ−末端における最 初の２つのアミノ酸の除去および疎水性アミノ酸メチオニンによるその置き換え を含む。得られたβ−グロビンボリヘポブチドは１４６個の代わりに１４５個の アミノ酸よりなり、アミノ末端でウシβ−グロビン鎖を模擬する。図３はウシお よびボルト・アレブレ突然変異を含有する十三量体のコンピューター・モデルを 示す。

前記したごとく、また、本発明は、Ｈｂポルト・アレブレの酸素親和性の増加に 反対に作用するよう設計された第２の突然変異を提供する。天然に生じる１つの かかる突然変異はＨｂカンザス（Ｋａｎｓａｓ）として知られている。Ｈｂカン ザスにおいて、ベータ１０２アスパラギンはトレオニンに変化している（ポナベ ントウラおよびリッグズ（Ｂｏｎａｖｅｎｔｕｒａ　ａｎｄ　Ｒｉｇｇｓ）、１ ９６８、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、 　Ｃｈｅｗ、　）、２４３：９８０−９９１）。この突然変異は、酸素が組織に 送達された後の静脈血液で通常見い出される構造であるヘモグロビンのＴまたは テンス（Ｔｅｎｓｅ）コンフォメーションを安定化させる。

Ｈｂカンザスの酸素親和性は通常のＨｂＡよりも２倍も低い。従って、Ｈｂカン サスはＨｂポルト・アレブレに関連した高親和性を異常に減少させ得ると推測さ れた。よって、Ｈｂポルト・アレブレおよびＨｂカンザスならびにＨｂポルト・ アレブレおよびウシ突然変異の組合せを構築した。本発明は突然変異ヘモグロビ ンのこれらのユニークな組合せにつき、および血液代替物としてのその使用につ き提供する。

トランスジェニック動物で合成したヒト・ヘモグロビンの他の遺伝的修飾前記し たごとく、本発明は、ヒト・ヘモグロビンの遺伝的修飾につき提供するが、これ らの特別の実施例に限定されるものではない。コンピューター・モデル化および エネルギー最小化を用いて、通常のアミノ酸の代わりのシスティン置換が最も安 定なノスルフィド架橋に導く部位を同定した。もちろん、この戦術により、これ らのヘモグロビン分子のいずれかの数の新しいデザインを作成できる。

システィン置換についての部位を同定するための基本的な戦術は以下の通りであ る。プルツクバーベン・データ・バンク（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ　Ｄａｔａ　Ｂ ａｎｋ）から得られたヘモグロビンの分子協働体をエバンス（Ｅｖａｎｓ）およ びサザーランド（Ｓｕｔｈｅｒｌａｎｄ）ＰＳ３００コンピューターグラフィッ クシステムに負荷した。種々の位置でシスティン置換を行った。α１およびβ２ 鎖上のシスティン残基の対の間の結合角を、β炭素原子を３５オングストロ一ム 未満だけ隔て、ジスルフィド結合をこれらの残基の間に形成するように調整した 。次いで、珪素グラフィックスＩＲＩＳ−４Ｄにつきポウエル（Ｐｏｖｅｌｌ） 　［１，９７７、マンマティカル・プログラミング（Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ 　Ｐｒｏｇｒａｍｉｎｇ）　１２．２４１−２５４３によって記載されているご とくに、ジスルフィド結合四量体をエネルギー最小化に付した。略言すると、エ ネルギー最小化は、ソフトウェアシステムＸ　−Ｐ　Ｌ　ＯＲバージョン２．１ （ブルンガー（Ｂｒｕｎｇｅｒ）、１９９０、Ｘ−ＰＬＯＲ：結晶学およびＮＭ Ｒについてのシステム（＾ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒ　Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐ ｈｙ　ａｎｄ　ＮＭＲ）、エール大学、ニューバーペン）に提供されているポウ エル−法コンジュゲートグラノエントミニマライザーを用いて行った。酸素付加 −および脱酸素ヘモグロビン分子協働体双方を用いて、２５００サイクルの最小 化を行った。これにより、作成したジスルフィドを有するヘモグロビンと比較さ れ得るベースライン最小合計エネルギーを確立した。

ａｌ　９２ないしβ２４０のジスルフィド結合をもつ作成ヘモグロビンは、脱酸 素−および酸素結合コンフォメーション双方において天然ヒト・ヘモグロビンの それと同様であるエネルギー最小を示した。引き続いて、この架橋を、部位特異 的突然変異によって作成されるべき四量体安定化についての最初のジスルフィド として選択した。次いで、特異的システィンコドンを部位特異的突然変異誘発に よってα−およびβ−グロビン遺伝子に導入した。さらに、トランスジェニック 動物から得られた実験データは、デザインに取り込むべきさらなる修飾を示唆し 得る。かくして、本発明は、天然に存在する突然変異体とコンピューター・モデ ル化および部位特異的突然変異誘発等によって特異的にデザインされたものとの 組合せを含めた血液代替物として用いるトランスジェニック動物で合成した突然 変異ヘモグロビンにつき提供する。

今回、本発明の種々の具体例を記載する。

実施例１ ヒトα−およびβ−グロビン遺伝子の突然変異誘発部位特異的突然変異誘発によ って突然変異を正常なヒトα−およびβ−グロビンに導入した。標準的な手法に より（マニアナイス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、１９８９、モレキュラー・クロー ニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ１ｏｎｉｎｇ＋ ＾！、ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリングＨハーバー 研究所、コールド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク州）、ヒトα−グロビ ン遺伝子をを含有する３、８ｋｂ　ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片およびヒトβ− グロビン遺伝子を含有する４、１ｋｂＨｐａ１−ＸｂａＩ断片をｐＳＥＬＥＣＴ プラスミドにクローン化した（ルイスおよびトンプソンｔＬｅｗｉｓ　ａｎｄ　 Ｔｈｏ＋ｎｐｓｏｎ）、（１９９０、ヌクレイ’ｙり・アシズ・リサーチ（Ｎｕ ｃｌ、＾ｃｉｄｓ、　Ｒｅｓ、）１８　：　３４３９−３４４３）。ルイスおよ びトンプソン（Ｌｅｗｊｓ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍｐｓｏｎ）　（１９９０、ヌクレ イツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、）１８：３４３９ −３４４３）によって記載されているごとくにオリゴヌクレオチド突然変異誘発 を行った。この手法において、グロビン遺伝子インサートにおいて突然変異をつ くりだすようにデザインした１またはそれを超えるオリゴヌクレオチドと同時に 、ｐＳＥＬＥＣＴプラスミドにおいてアンピシリン耐性遺伝子において突然変異 を修正するオリゴヌクレオチドを使用した。簡単に述べれば、グロビン遺伝子イ ンサートと共にｐＳＥＬＥＣＴプラスミドを含有するイー・コリ（ＪＭｌ、０９ ）をヘルバーファージ（Ｍ１３ＫＯ７）で感染させた。培養を一昼夜増殖させた 後（約１２〜１６時間）、上澄みから得られたファージをフ二一ノール：クロロ ホルムで抽出し、標準的な方法によって一本鎖ＤＮＡを単離した。野生型アンピ シリンオリゴヌクレオチドと共に突然変異の各々を含有するオリゴヌクレオチド をアニールして一本鎖ＤＮＡとし、３７℃にてこれらのプライマーをフレノウで 約９０分間伸長した。二本鎖１）　Ｎ　Ａをイー・コリ（ＢＭＨ７１−１８ｍｕ ｔＳ）に形質転換し、培養を７５μｇ／ｍｌアンビンリンを含有するしブロス中 で一昼夜増殖させた。これらの培養の迅速な溶解調製物から得られたＤＮＡをイ ー・コリ（ＪＭ１０９）にトランスフェクトし、アンビンリン・ブ１／−ト（７ ５μｇ／ｍｌ）上でコロニーを選択し、た。これらのコロニーの迅速な溶解調製 物から得られた二本鎖ＤＮＡを、突然変異オリゴヌクレオチドの上流に位置する オリゴヌクレオチドで配列決定した（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、ブロンーデ ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎ ａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７４：５４６３　５４６７）。野生型配列 との比較によって突然変異体は明らかに同定された。突然変異を生成するのに用 いたオリゴヌクレオチドは以下にリストするものを包含する。

下線を施した塩基は野生型と異なる塩基を示す。

Ｉ　四量体分子内架橋 Ａ　α９２アルギニンないしシスティン（配列番号１） Ｂ　β４０アルギニンないしシスティン（配列番号２） ■、ポリマー化分子間架橋 Ａ、＜１！７５アスパラギン酸ないしシスティン（αへ量体）（配列番号３） Ｂ　β９セリンないしシスティン（ボルト・アレブレ）５’ＣＣＴＧＡＧＧＡＧ ＡＡＧＴＧＴＧＣＣＧＴＴＡＣＴＧＣＣ３゜（配列番号４） ■　低酸素親和性への突然変異 Ａ　β１０２アスパラギンないしトレオニン（Ｈｂカンザス）（配列番号５） Ｂ、第１および第２コドン、ＧＴＧ　（バリン）およびＣＡＣ（ヒスチジン）が 欠失したウシ突然変異（βΔ１−２）５°ＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡＣＣＡＴＧＣＴ ＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧ３’（配列番号６） 野生型ＤＮＡ配列はＡＴＧ　ＧＴＧ　ＣＡＣＣ工ＧＡＣＴ（配列番号７）であり 、突然変異した配列はＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＴ（配列番号８）である。野生型ア ミノ酸配列はＭｅｔ−Ｖａ］−Ｈｌｓ−Ｌｅｕ−等である。アミノペプチダーゼ によってメチオニンをアミノ末端から切断し、最終蛋白は１４６個のアミノ酸よ りなる。突然変異体のアミノ酸配列はＭｅｔ−Ｌｅｔ−等である。メチオニンは アミノ末端から除去しない。何故ならば、アミノペプチダーゼはＭｅｔ−Ｌｅｕ ペプチド結合を切断しないからである。かくして、最終の蛋白は１４５個のアミ ノ酸よりなる。

２つの別々のオリゴヌクレオチドと共にα７５およびα９２突然変異を同時にα −グロビン遺伝子に導入した。２つの異なるβ−グロビンオリゴヌクレオチドで の単一の突然変異誘発にてβ４０およびウシ（βΔ１−２）突然変異をβ−グロ ビン遺伝子に導入した。同様に、２つの異なるβ−グロビンオリゴヌクレオチド での単一の突然変異誘発にて、β４０およびカンザス突然変異もまたβ−グロビ ン遺伝子に導入した。ボルト・アレブレ（β９）およびウシＨｂカンザス（β１ ０２）突然変異もまた、２つの異なるβ−グロビンでの単一の突然変異誘発にて β−グロビン遺伝子に導入した。ボルト・アレブレおよびウシ（βΔ１−２）突 然変異は単一の４８塩基オリゴヌクレオチドで生じた。α７５（図４Ｃ）、α９ ２（図４Ａ）、β９（ボルト・アレブレ）（図４Ｄ）、β４０（図４Ｂ）、β１ ０２（カンザス）（図４Ｆ）およびβΔ１−２（ウシ）（図４Ｅ）突然変異のヌ クレオチド配列を図４、パネルＡ−Ｆに示す。

突然変異体α−およびβ−グロビン遺伝子をｐＳＥＬＥＣＴプラスミドから切り 出し、Ｃｏｓ部位を含有する「右腕」プラスミドにサブクローンした。特に、α −グロビンｐＳＥＬＥＣＴプラスミドからの１．２ｋｂ　ＮｃｏＩ−ＸｂａＩ断 片およびβ−グロビンｐＳＥＬＥＣＴプラスミドからの１．４ｋｂ　Ｃ１ａＩ− ＢａｍＨＩ断片を、対応するα−およびβ−グロビン遺伝子野生型断片の代わり に右腕プラスミドに導入した。α−グロビン右腕プラスミドをＣ］ａＩおよびＭ ＩｕＩで消化し、Ｃｏｓ部位に連結した突然変異α−グロビン遺伝子を含有する ４、８ｋｂ断片をアガロースゲルから精製した。β−グロビン右腕プラスミドを Ｃ１ａｌおよびＨｉｎｄＩ［Ｉて消化し、Ｃｏｓ部位に連結した突然変異β−グ ロビン遺伝子を含有する６、５ｋｂ断片をアガロースゲルから精製した。これら の断片を含有するニスミドをフォー・ウェイ結紮にて構築した（リアン（Ｒｙａ ｎ）ら、１９８９、ジーンズ・デブ（Ｇｅｎｅｓ、　Ｄｅｖ、）、３　：　３１ ４−３２３）、左腕はコスミドベクターｐｃＶＯＯ１から得られた９、０ｋｂ　 Ｍｌｕｌ−８ａｌＩ断片であった（ラウおよびカン（Ｌａｕ　ａｎｄ　Ｋａｎ） 、１９８３、プロンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイ エンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　Ｕ　Ｓ　Ａｓ２ ・５２２５−５２２９）。この断片はＣｏｓ部位、アンピンリン耐性遺伝子、Ｃ ｏ１Ｅ１複製開始点および５Ｖｎｅｏ遺伝子を含有していた。２つの内部断片は ＤＮ７　ｆＩ超悪感受性Ｈ５）　部位Ｖ、ＩＶおよび■を含有する１０．７ｋｂ ＳａｌＩ−ＫｐｎＩ断片ならびにＨ８ＩＩおよびＩを含有する１０．９ｋｂ−Ｋ ｐｎｉ−Ｃ１ａＩ断片であった。４つの断片をベクター腕の２：１：１：２のモ ル比にてインサートに一緒に結び、パッケージングした（パッヵジーン（Ｐａｃ ｈａｇｅｎｅ　；プロメガ（Ｐｒｏｉｅｇａ））。イー・コリＥＤ８７６７をパ ッケージしたニスミドで感染させ、アンピシリン平板上で平板培養した。アンピ シリン耐性コロニーの大規模培養を増殖させ、ニスミドを標準的な手法によって 調製した。

標準的な手法によってニスミドＤＮＡを調製した。前記した突然変異を含有する Ｈ３　Ｉ−ＶαおよびＨ３Ｉ−Ｖββススドを受精したマウス卵に直接注射する か、あるいは構築体を５ａｌＩで消化し、インサートＤＮＡを注射前にアガロー スゲル電気泳動によってプラスミドＤＮＡから分離した。該卵を注射し、似妊娠 借腹親に移入しくプリンスター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ）ら、１９８５、プロシーデ ィングズ・オブ・ナンコナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８２　：　４４３８−４４４２）　、トランスジェニック後代 を尾部ＤＮＡのサザーンブロットハイブリダイゼーションによって同定した。同 様に、大きな動物卵を同一の構築体と共に注射し、プルセル（Ｐｕｒｓｅｌ）ら （１９８９、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４　：１２８１−１２８８）に よって記載されているごとくに借腹親に移入した。

典型的には、トランスジェニック動物の赤血球細胞におけるα−およびβ−グロ ビン合成の高レベルを指令するように設計した発現ベクターにヒトα−およびβ −グロビン遺伝子をクローンした。これらの構築体をマウス受精卵に共注射し、 発育したトランスジェニック動物で発現を分析した。正しく発現されたトランス ジーン（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）の無傷コピーを含有するマウスのすべては、特に 赤血球組織にて、ヒトα−およびβ−グロビンのｍＲＮＡを開始した。溶血物の 等電点電気泳動は、完全なヒト・ヘモグロビンが成人赤血球で形成されることを 示し、これらのマウスから精製したヒト・ヘモグロビンの酸素平衡曲線は、当該 分子が十分機能することを示した。該動物は健康て、間違いなくヒト遺伝子を後 代に伝達する。これらの動物を２０世代にわたり育成し、後代はヒトおよびマウ ス・ヘモグロビンの同等量を合成し続けた。

同様の方法を用いて、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ等のごとき大きな動物において 機能的（酸素を組織に十分に伝達できる）ヒト・ヘモグロビンを産生できること を指摘する。

実施例４ トランスジェニック動物からの血液の分析トランスジェニック動物から収集した 血液を生理食塩水で洗浄し、リアン（Ｒｙａｎ）ら（１９９０、サイエンス（Ｓ ｃｉｅｎｃｅ）２４５　：　９７１−９７３）によって記載されているごとくに 溶血物を調製した。等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル上でヘモグロビンを分析した （リアン（Ｒｙａｎ）ら、１９９０、前掲）。ヒト・ヘモグロビンのバンドをＩ ＥＦゲルから切り出し、尿素セルロースアセテート・ストリップ上で分析して、 ヒト・ヘモグロビンのバンドがヒトα−およびβ−グロビンポリペプチドよりな ることが示された。ヒト・ヘモグロビンが内因性ヘモグロビンから分離するのが 困難ならば、ヒト・ヘモグロビンの等電点（ｐＩ）を増大または減少させる突然 変異をα−およびβ−グロビン遺伝子に導入できるのは注！すべきである。ｐＪ の増大は、塩基性（正に荷電した）アミノ酸を蛋白に導入することによって達成 され、減少は、酸性（負に荷電した）アミノ酸を導入することによって達成され る。これらの荷電アミノ酸を、蛋白の構造または機能を害しない箇所に導入する 。次いて、精製したヘモグロビンの酸素平衡曲線をリアン（Ｒｙａｎ）　（１９ ９０、前掲）によって記載されているごと（に決定した。

ジスルフィド架橋の形成 蛋白におけるジスルフィド架橋は赤血球内には容易には形成されない。何故なら ば、高濃度のグルタチオンが酸化を妨げるからである（トンド（Ｔｏｎｄｏ）ら 、１９８５、前掲）。分子内および分子間両ジスルフィド架橋は、ヒト・ヘモグ ロビンを前記したごとくに等電点電気泳動によって精製した後に形成される。大 規模な精製はクロマトフォーカンングによって達成され（ギリ（Ｇｉｒｉ）、１ ９９０１メソツズ・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　） 、１８２：３８０−３９２）によって達成され、そこでは、その等電点に従って 蛋白が分離される。次いで、精製したヒト・ヘモグロビンをわずかにアルカリ性 の条件中（０，１Ｍ　トリス−ＭＣＩ　ｐＨ８，０；７ツムラ（Ｍａｔｓｕｍｕ ｒａ）ら、１９８９、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オ ブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８６：６５６２１−６５６６）、４℃ニテ数日間インキュベー トしてヘム基を酸化することなく蛋白を穏やかに酸化する。架橋ヘモグロビンを 、接線方向流動限外濾過によりｐＨ７，５にて、分子量１０００００を超えるポ リマーを保持する膜に対し、リン酸緩衝化生理食塩水に透析した（ンロアシュ（ Ｓｈｉｌｏａｓｈ）ら、１９８８、アドブ・バイオチクノル・プロセシズ（＾ｄ ｚ。

Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）８　：　９７−１２５）　ｏ次 いで、これらの精製した蛋白を還元および非還元ポリアクリルアミドゲル上で分 析した。また、これらの試料の酸素平衡曲線を得る。最後に、当該分野でよく知 られた標準的な手法に従い、動物における酸素担持能力につき該ヘモグロビンを テストする。

遺伝子導入により産生された本発明のヒト・ヘモグロビンは、いずれの細胞また は細胞上成分もない実質的に純粋な形態で単離されるので、非免疫原性であり； 従って、全血または赤血球細胞（ＲＢＣ）を用いるべきであれば必要となる血液 の型測定の必要なくして血液代替物として有用である。加えて、動物起源である ので、本発明のトランスジェニック・ヘモグロビンもまたＨＩＶのごときウィル スがない。

本発明の組成物は、生物学的機能量（すなわち、組織と効果的な酸素交換できる ）または血液代替量の実質的に純粋なトランスジェニック・ヒト・ヘモグロビン および生理食塩水のごとき医薬上許容される賦形剤：非毒性の滅菌緩衝化媒質： ヒト血漿等よりなる。

本発明の実質的に純粋で、無細胞で、非免疫原性で、生物学的に機能的で、非毒 性で、ポリマーの、トランスジェニック・ヒト・ヘモグロビンは、赤血球細胞（ ＲＢＣ）または天然に存在する（野生型）全血を本発明の精製されたトランスジ ェニック・ヘモグロビンで置き換えることによって、ＲＢＣの酸素交換能を補う のに有用である医薬品を製造する方法を提供する。本発明の組換えヘモグロビン は、緊急手術の間、あるいは全血輸血が可能となるまでのごとき臨界的時の間に 組織に酸素を供給するのに、あるいは総じて全血輸血の必要性を回避するのに、 少なくとも一時的代替物として適当である。

本明細書に記載した実施例および具体例は例示目的のものであり、それを考慮し た種々の変形または変化は当業者に示唆的であり、それらも本出願の精神および 範囲ならびに添付の請求の範囲の範囲内のものである。

配列リスト （１）一般的情報： （ｉ）出願人：ザ・ニー・エイ・ビイ・リサーチ・ファウンデーション（ｉｔ） 発明の名称ニドランスジェニック架橋ヘモグロビン（ｆｆｉ）配列の数：８ （ｉｖ）通信宛名： （Ａ）名宛人：フィッシュ・アンド・リチャードソン（Ｂ）ストリート：フラン クリン・ストリート２２５番（Ｃ）都市名：ボストン （Ｄ）州・マサチューセッツ （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０２１１０−２８０４（Ｖ）コンピューター解読形態： （Ａ）媒体タイプ＝３．５”ディスケット、１．４４Ｍｂ（Ｂ）コンピューター ：ＩＢＭ　ＰＳ／２モデル５０Ｚまたは５５ＳＸ（Ｃ）オペレーティング・シス テム：ＩＢＭ　ｐ、ｃ、ＤＯ８（バージョン３．３０） （Ｄ）ソフトウェア・ワードパーフェクト（バージョン５．０）（ｖｉ）現在の 出願データ： （Ａ）出願番号：０７／６３０．８２５（Ｂ）出願日：　２Ｏ−ＤＥＣ−１９９ ０（Ｃ）分類： （ｖｉ）優先権出願データ： （Ａ）出願番号 （Ｂ）出願日 （蝋）代理人情報 （Ａ）氏名：クラーク、ポール・ティ （Ｂ）登録番号・３０．１６２ （Ｃ）参照／書類番号：　０４００５１００４００１（ｉｘ）遠距離通信情報。

（Ａ）電話：　（６１７）５４２−５０７０（Ｂ）テレックス：　（６１７）５ ４２−８９０６（Ｃ）テレックス：　２００１５４ （２）配列番号の情報　１ （ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ：２７ （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）錆性　−末鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （Ｘｌ）配列記載：配列番号　１ にＣにＣＡＣＭにＣｍＧｃＧＴＧＧＡ　ＣＣＣＧＣＴＣ（２）配列番号の情報： ２ （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ　２７ （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）Ｍ性　−末鎖 （Ｄ）トポロン−線状 （ＸＩ）配列記載　配列番号　２ ＣＣＴＴＧＧＡＣＣＣＡＧＴＧＴＴＴＣＴＩ’　ＴＧＡＧＴＣＣ（２）配列番号 の情報・３ （］）配列特徴 （Ａ）長さ　２５ （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）錆性ニー重鎖 （Ｄ）トポロジー　線状 （Ｘｌ）配列記載：配列番号：３ ＣＧＣＡＣＧＴＧＧＡ　ＣＴＧＣｋＴＧＣＣＣＡＡＣにＣ（２）配列番号の情報 ＝４ （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ：２７ （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）錆性・−末鎖 （Ｄ）トポロジー：線状 （ｘｉ）配列記載、配列番号・４ ＣＣＴにＡＧＧＡＧＡ　ＡＧＴＧＴＧＣＣＧＴ　τＡＣＴＧＣＣ（２）配列番号 の情報：５ （ｉ）配列特徴： （Ａ）長さ、２７ （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）照性・−末鎖 （Ｄ）トポロジー二線状 （Ｘｌ）配列記載　配列番号、５ ＧＴＧＧＡＴＣＣＴＧ　ＡＧＡＣＣＴＴＣＡＧ　ＧＧＴＧＡＧＴ（２）配列番号 の情報　６ （ｉ）配列特徴 （Ａ）長さ°２７ （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）錆性　−末鎖 （Ｄ）トポロジー、線状 （Ｘ］）配列記載　配列番号・６ ＣＡＡＡＣＡＧＡＣＡ　ＣＣＡＴＧＣＴＧＡＣＴＣＣＴＧＡＧ（２）配列番号の 情報、′１ （ｉ）配列特徴・ （Ａ）長さ　１５ （Ｂ）タイプ　核酸 （Ｃ）錆性　−末鎖 （Ｉ））ｌ・ボロ２・−線状 （ｘｌ）配列記載　配列番別　７ （２’、配列番５−ニーの情Ｗ８ （１）配列特徴 （Ａ）長さ　９ （［い　や１−グ　核酸 （Ｃ）錆性　−末鎖 ＜１））ｌ−１：ｒ−＋　ノ−−−線状（ｘｉ）配列記載　配りす番寸　８ ＡＴＧＣＴＧＡｒ ＡＣＧＴ ＣＧＧ−−π℃ Ａｒｇ　−−−Ｃｙｓ ＡＣＧＴ に℃−＋ＴＧＴ Ａｒｇ　−−−Ｃｙｓ アルファ八量体 υＤ−◆π℃ Ａｓｐ→Ｃｙｓ Ｓｅｔ−一−Ｃｙｓ ＡＣＧＴ ウシ ＦＩＧ、４Ｅ ＡＣＧＴ ＡＡＣ−＋　ＡＣＣ ＡＳｎ−＋Ｔｈｒ ＦＩＧ、４Ｆ ＦＩＧ、　５ 国際調査報告 ｅ＋＋ａ＊５ｎａＨｏｎｆｅｅｓｓｕｉｔｂｅｐａｔｄ＊Ｃ１ａｉｍ　７．　ｔ ｈｅ　ｓｌ　Ａｓｐ＋７５１　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｑ９　Ｓｅｒ　ｉｓ　ｒｅｐｌａ ｃｅｄ　ｗｉｔｈ　ａ　ＣｙｓｌＣｌａｉｍ　ｌ・、ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ａ −ｇｌｏｂｉｎ　ＤＮＡ、。−ｇｌｏｂｍｎ　ＤＮＡ、ａｎｄ　ＤＮＡｃｏｄｉ ｎｇ　ｆｏｒ　＠　ａｎｄ　Ｇ　ｇｌｏｂｕｎ。

Ｃｌａｉｍ　１１．　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｔｈｅ　ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ　ＤＮＱ 　５ｐｅｅｉｅｓ＋ａｌｔｖｒｅｄ　ｓｅｒ＋ｎｅ　ｐａｒｔｏ　Ｇｌｌｅｇｒ ｅｌ＋ｅ）　ＴＧＴ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ　ｆｏｒ　ＴＣＴ　（Ｓｅｒ　９ ．　Ｇ　ｇｌｏｂｉｎｌ＋ｆｌ　ＧＴＧＣＡＣｃｏｄｉｎｇ　ｆｏ＋−ｕａｌ　 １−）１ｉｓ　２　ｏｆ　Ｇ　ｇｉｏｂｉｎ　ｄｏｌｅｔｅｄＧｒｏｕｐ　ＩＩ 　ｗｔｌｌ　ｂｅ　５ｅａｒｃｈｅｄ　ｕｇａｎ　ｐａｙｓｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈ ｅ　ｒｅｑｕｉｓｉｔｅ　ａｄｄｉｔｉｏ獅≠戟@ｆｅｅ ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｅｍｂｏｄｉｅｄ　５ｐｅｅｘｅｓ　 ｌｂｌ　ｔｈｒｏｕｇｈ　Ｔｋｌ　ｆｏｒ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉh　ｗｒｌｌ　ｂｅ ｓｐａｒｅＭｄ　ｕｐｏｎ　ｐａｙ＠ｅｎｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｅｑｕｓｉｉｔ ｅ　ａｄｄｉｔｉｏｎａｌ　ｆｅｅｓ　ｆｏｒ　５ｐｅｅｓ■奄■≠撃撃■ ＋ｄｅｎｔ＋ｆｉｅｄ　％ｐｅｅｖｅ％。

Ｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｉ、ｔｈｅ　ｏｃｔｏ會ｅｒｓ、ｄｏｄｅｅａｓｅｒｓ　ａ ｎｄ　ｃｏｍｂｔｉａｔｓｏｎｓ　ｏｆ　ｔｅｔｒａｓｅｒ刀B ａｅｔｏ＠ｅｒｓ、ａｎｄ　ｄｏｄｅｅａ＠ｅｒｓ　ａｒｅ　ｅａｃｈ　ｄｓｓ ｔ＋ｎｅｔ、ｏｎｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　−ｎ盾狽■@ｔｈａｔ　 ｔｈｅ ｏｃｔｏ＠ｅｒｓ　ａｎｄ　ａｎｄ　ｄｏｄｅｅａｓｅｒｓ　ａｒｅ　ｎｏｔ　 ｔｈｅ　ｓａｇｅ　ａｓ　ｔｈｅ　ｗｔｌｄ−ｔｙｐｅ　ｈ■翌盾■撃盾ｂ狽■ ｔｐｔｒａ曽ｅｒ　ｏｒ　ａ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ｔｅｔｒａｓｅｒｌ　ｔｈｅ 　ｈｕｍａｎ　ｗｔｌｄ　ｔｙｐｅ　ｉｓ　ｄｓｓｔ＋ｎｅ煤@ｆｒｏｍ　ｔｈ ａｔ　ｏｆ Ｇ’ｏｒｔｏ　Ａｌｅｇｒｅ、ｂｏｖｔｎｏ、ａｎｄ　にａｎｓａｓ　ｆｏｒｓ ｓ　ｆａｔｔ曹ｎｔ＋ｏｎ　ｒｓ　ｄｉｒｅｃｔｖｄ　ｔｏ@１ｐｅｅｔｆｉｃ ａｔ＋ｏｎ ｐｍ９ｅｓ　８◆）　ａｎｄ　ｈａｖｅ　ｄｓｆｆｅｒｅｎｔ　ｂｉａｌｏｇ＋ ｃａｌ　ｅｆｆｅｃｔｓ’　ｔｈｅ　ｔｙｐｅ　ａｎｄ　ｋ奄獅п@ｏｆ ｄ＋１ｕｌｆｉｄｅ　ｂｒ＋ｄｇｅａ　ｒｎ　ｃｌａｓｓｓ　５　ａｎｄ　ｆｓ 　ｈａｖｅ　ｄｌｆｆｅｒｅｎｔ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｗｉｔ■@ｒｅｇａｒｄ　 ｔ。

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Ｂｅｅａｕｓｅ　ｔｈｅｓｅ　ｇｒｏｕｐｓ　ａｒｅ　ｄｉｓｔｉｎｅｔ　ｆｏ ｒ　ｔｈｅ　ｒｅａｓｏｎｓ　ｇムｗｎ　ａｂｏｖｅ　ａｎп@５ｚｎｅｅ ｔｈｅｙ　ｈａｖｅ　ａｅｑｕｘｒｅｄ　ａ　５ｅｐａｒａｔｅ　５ｔａｔｕｓ 　ｉｎ　ｔｈｅ　ａｒｔ　ａｓ　ｓｈｏｗｎ　ｂｙ　ｔｈｅ奄秩@ｄｉｆｆｅｒ ｅｎｔ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ、５ｕｂｊｅｃｔ　＠ａｔｔｅｒ、ａｎｄ　ａｒ ｅ　５ｅｐａｒａｔｅｌｙ　ａｎｄ　１ｎｄｅｐｅｎｄｅｒ{ｔｌｙ　５ｅａｒ ｃｈｅｄ。

ｔｈｅ　ｈａｌｄｉｒ＋ｇ　ｏｆ　１ａｃｋ　ｏｆ　ｕｎｔｔｙ　ｏｆ　１ｎｖ ｅｎｔｉｏｎ　１ｓ　ｐｒｏｐｅｒ。

フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　ｃｔ、　Ｓ　識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０ ２　Ｃ８２１４−４Ｂ（７２）発明者　マクキューリ、ステイーブン・エルアメ リカ合衆国アラバマ州３５２０９、バーミンガム、スキー・ロッジ・ザ・サード １０４０番 Ｉ

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．トランスジェニック組換え架橋ポリマー状ヒト・ヘモグロビン分子。
2. ２．無細胞血液代替物として適する程度の安定性および酸素交換効率を有する請 求の範囲第１項記載の分子。
3. ３．四量体、八量体、十二量体、およびその組合せよりなる群から選択される請 求の範囲第１項記載のポリマー分子。
4. ４．ヒト野生型、ボルト・アレグレ、ウシ、またはカンザスヘモグロビン分子の 天然に存在するまたは突然変異体形態のアミノ酸配列に少なくとも一部分対応す るアミノ酸配列を有する融合蛋白よりなる請求の範囲第２項記載の分子。
5. ５．（ａ）分子内ジスルフィド架橋；（ｂ）分子間ジスルフィド架橋；または（ ｃ）その組合せを形成するための組換えにより導入されたシステイニル残基を有 する請求の範囲第１項記載の分子。
6. ６．該ジスルフィド架橋が、（ａ）α１９２ないしβ２４０；または（ｂ）β１ １ないしβ２１４６；または（ｃ）α１１３０ないしα２１４２のカルボキシ末 端に付加されたシステイニル残基：または（ｄ）該架橋のいずれかの組合せの間 であるように該システイニル残基を導入した請求の範囲第５項記載の分子。
7. ７．α１アスパラギン酸７５をシステインで置き換えるか、あるいはβ９セリン をシステインで置き換えることによって該システイニル残基を導入した請求の範 囲第５項記載の分子。
8. ８．請求の範囲第１項または第２項記載の分子の生物学的機能量もしくは血液代 替量および医薬上許容される担体よりなる組成物。
9. ９．組換えＤＮＡ分子、非ヒト・トランスジェニック動物において第１のヒト・ ヘモグロビン鎖をコードする第１の組換え分子、および該動物における第１のも のとは異なる第２のヒト・ヘモグロビン鎖をコードする第２の組換え分子の対で あって、赤血球細胞中で形成された完全なヒト・ヘモグロビンを実質的に純粋な 形態で単離し、該ヘモグロビンに存在するヘム基を酸化することなくヘモグロビ ンの蛋白部位の酸化を可能とする条件下、約４℃で一緒にインキュベートした場 合、請求の範囲第２項の分子が該ヘモグロビン鎖のいずれの他の化学的修飾もな くして得られる該対。
10. １０．該第１の組換えＤＮＡ分子が組換えにより修飾されたヒトの（ａ）α−グ ロビン遺伝子：（ｂ）β−グロビン遺伝子：または（ｃ）その組合せである請求 の範囲第９項記載の組換えＤＮＡ分子の対。
11. １１．該第１の分子において、 （ａ）α−グロビン分子の９２位のアルギニンをコードするヌクレオチド配列Ｃ ＧＧがシステインをコードする配列ＴＧＣに変化され；（ｂ）α−グロビン分子 の７５位のアスパラギン酸をコードするヌクレオチド配列ＧＡＣがシステインを コードする配列ＴＧＣに変化され：（ｃ）一方がα−グロビン分子の９２位のア ルギニンをコードし、他方が７５位のアスパラギンをコードする２つのヌクレオ チド配列の各々がシステインをコードする配列ＴＧＣに変化され： （ｄ）β−グロビン分子の４０位のアルギニンをコードするヌクレオチド配列Ａ ＧＧがシステインをコードする配列ＴＧＴに変化され；（ｅ）β−グロビン分子 の９位のセリンをコードするヌクレオチド配列ＴＣＴがシステインをコードする 配列ＴＧＴに変化され；（ｆ）β−グロビン分子の各々１および２位のバリンお よびヒスチジンをコードするヌクレオチド配列ＧＴＧＣＡＣが欠失され；（ｇ） β−グロビン分子の１０２位のアスパラギンをコードするヌクレオチド配列ＡＡ Ｃがトレオニンをコードする配列ＡＣＣに変化され；（ｈ）β−グロビン分子の ４０位のアルギニンをコードするヌクレオチド配列ＡＧＧがシステインをコード する配列ＴＧＴに変化され、およびβ−グロビン分子の各々１および２位のバリ ンおよびヒスチジンをコードするヌクレオチド配列ＧＴＧＣＡＣが欠失され； （ｉ）β−グロビン分子の４０位のアルギニンをコードするヌクレオチド配列Ａ ＧＧがシステインをコードするＴＧＴに変化され、およびβ−グロビン分子の１ ０２位のアスパラギンをコードするヌクレオチド配列ＡＡＣがトレオニンをコー ドする配列ＡＣＣに変化され： （ｊ）β−グロビン分子の９位のセリンをコードするヌクレオチド配列ＴＣＴが システインをコードする配列ＴＧＴに変化され、およびβ−グロビン分子の各々 １および２位のバリンおよびヒスチジンをコードするヌクレオチド配列ＧＴＧＣ ＡＣが欠失され：または （ｋ）β−グロビン分子の９位のセリンをコードするヌクレオチド配列ＴＣＴが システインをコードする配列ＴＣＴに変化され、およびβ−グロビン分子の１０ ２位のアスパラギンをコードするヌクレオチド配列ＡＡＣがトレオニンをコード する配列ＡＣＣに変化された請求の範囲第１０項記載のＤＮＡ分子の対。
12. １２．その胚細胞および体細胞のすべてが、胚段階で動物、または該動物の先祖 に導入された請求の範囲第９項記載の組換えＤＮＡ分子を含有するトランスジェ ニック非ヒト動物。
13. １３．該動物が哺乳動物である請求の範囲第１２項記載の動物。
14. １４．請求の範囲第１２項記載の動物から産生された実質的に純粋なヘモグロビ ン分子。
15. １５．哺乳動物において天然に存在する全血の酸素運搬能を補充する医薬品の製 造における請求の範囲第１項、第２項、第８項または第１４項記載の組成物の使 用。
16. １６．（ａ）請求の範囲第１２項記載のトランスジェニック動物の赤血球からヘ モグロビン分子を単離し：（ｂ）工程（ａ）から得られたヘモグロビンから実質 的に純粋なヘモグロビンを回収し：（ｃ）ヘモグロビン鎖に与在するヘム基を酸 化させることなくヘモグロビン鎖における蛋白部位の酸化を可能とする条件下、 約４℃で、工程（ｂ）から得られた実質的に純粋なヘモグロビン分子をインキュ ベートし、次いで、（ｄ）工程（ｃ）からのポリマー状で実質的に純粋なヘモグ ロビン分子を回収する工程よりなることを特徴とするトランスジェニック組換え 架橋ポリマー状ヒト・ヘモグロビンの生産方法。
17. １７．２つの突然変異を含有し、第１の該突然変異は酸素親和性の増大を引き起 こし、第２の該突然変異は酸素親和性の減少を引き起こし、該２つの突然変異の 正味の結果は天然に存在するヒト・ヘモグロビンと比較して、該分子の酸素親和 性を低下させる組換え突然変異ヒト・ヘモグロビン分子。
18. １８．該第１の突然変異がジスルフィド架橋の形成のためのシステイニル残基の 導入である請求の範囲第１７項記載の分子。
19. １９．該分子の酸素親和性が天然に存在するヒト・ヘモグロビンの７５−９０％ である請求の範囲第１７項記載の分子。