JPH06504430A - 植物細胞の増殖および成長 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １９、該細胞周期蛋白がｐ３４°６°２またはｐ３４　ｃｄ＋１様分子である請 求の範囲第１８項記載のトランスジェニック植物または植物細胞。

２０、さらにｐｘ３１ｕｃｌ、サイクリン、ｃｄｃ２５、ｎ１ｍ−１、ｗｅｅ− １またはｍ１ｋ−１遺伝子のうち１またはそれを超えるものよりなる請求の範囲 第１９項記載のトランスジェニック植物または植物細胞。

２１　該植物細胞が単子葉植物または双子葉植物である請求の範囲第１８項、第 １９項または第２０項記載のトランスジェニック植物または植物細胞。

２２、該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様 な作物である請求の範囲第２１項記載のトランスジェニック植物または植物細胞 。

２３、植物がその成長を修飾するのに十分な時間および条件下で該植物における 分裂できる１またはそれを超える植物細胞中の細胞周期蛋白のレベルおよび／ま たは触媒活性を調節することを特徴とする１またはそれを超える環境条件の存在 下で植物の成長挙動を修飾する方法。

２４、該細胞周期蛋白がｐ３４”°２またはｐ　３４　””様分子である請求の 範囲第２３項記載の方法。

２５、該細胞周期蛋白がｐ１３５ｕＣＩ、サイクリン、ｃｄｃ２、またはｎ１Ｉ １１−１、ｗｅｅ−１もしくはｍ１ｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれ らによって制御される請求の範囲第２３項記載の方法。

２６、該植物が単子葉植物または双子葉植物である請求の範囲第２３項、第２４ 項または第２５項記載の方法。

２７、該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様 な作物である請求の範囲第２６項記載の方法。

２８、該環境条件が温度上昇、病気への暴露または水もしくは他の栄養の過剰も しくは欠乏のうち１またはそれを超えるものからなる請求の範囲第２３項記載の 方法。

２９、細胞周期蛋白をコードする第１のＤＮＡおよび選択可能マーカーをコード する第２のＤＮＡならびに有益遺伝子に隣接するＡｃ要素をプロトプラストに浸 透させ、該浸透プロトプラストを固体培地上で培養してミクロカルスを得、次い で、苗条および根の再生のためにの該ミクロカルスを培養することを特徴とする 再生植物における発現で有益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから 植物を再生させる方法。

３０　該有益遺伝子が菌類または害虫に対する耐性、凍結および／′または細胞 分裂を修飾することに対する耐性を特徴とする請求の範囲第２９項記載の方法３ ．３１、該細胞周期蛋白がｐ３４　Ｎｄｔ２またはｐ　３４　””様分子である 請求の範囲第２９項または第３０項記載の方法。

３２、該第１のＤＮＡがさらに細胞周期蛋白を制御する産物をコードする遺伝子 を含有する請求の範囲第２９項記載の方法。

３３、該細胞周期蛋白がｐｌａｓｓｅｌ、サイクリン、ｃｄｃ２５またはｒｉｍ −１、ｗｅｅ−１もしくはｍ１ｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれらに よって制御される請求Ｉの範囲第３２項記載の方法。

３４、該植物が単子葉植物である請求の範囲第２９項ないし第３３項いずれか１ 項記載の方法。

３５、該浸透がエレクトロポレーションによるものである請求の範囲第２９項記 載の方法。

３６、該細胞周期蛋白が構成的に発現される請求の範囲第２９項記載の方法。

明細書 植物細胞の増殖および成長 本発明は、一般に、植物細胞成長の制御方法に関する。さらに詳しくは、本発明 は、細胞周期制御蛋白レベルを調節するか、あるいは植物細胞に作用する酵素レ ベルを変更することによりその活性を調節することによる植物細胞の増殖および 分化の制御に指向される。

植物体の形成は、分裂周期による新しい細胞の生成および特殊化した構造および 代謝のそれらにおける発育を含む。特殊化には、穀類のごとき単子葉植物の細胞 において特別な迅速性をもって減衰する分裂能の減少が伴う。

酵母では、ｃｄｃ２遺伝子機能が２つの主要制御点を通過する進行に必要であり 、その時点で、細胞周期は細胞サイズおよび栄養が満たされるまで遅延させ得る （１；２）。これらの地点の制御は、ｃｄｃ２遺伝子産物のｐ３４”“２と刺激 要素および抑制要素との相互作用によって行われる（３　；　４）。

発育の間の細胞分裂を制御するためのｐ３４°′ルベルの変化の可能な寄与はい ずれの生物体においてもほとんど研究されていない。

本発明では、今回、穀類植物の葉において、ｐ３４″′１ｃ２の同族体が細胞の 分裂および発育の制御に寄与することが判明した。この蛋白の発現および／また は活性の調節により、細胞の増殖および分化の制御が可能となり、植物の再生お よび発育のごときプロセスは容易であろう。

従って、本発明の１の態様は、細胞分裂を修飾するかまたは制御するのに十分な 時間および条件下で植物における細胞周期制御蛋白のレベルおよび／または触媒 活性を調節することを特徴とする植物細胞成長を制御する方法である。

本発明のこの態様において、「植物細胞」とは、単一の細胞または細胞群あるい はカルスとして培養に存在するいずれの細胞も意味する。また、該細胞は培養に おいて発育している植物におけるものであってもよく、あるいは天然で成長して いる植物におけるものであってもよい。植物細胞は天然に存在するもの、あるい は植物体から単離してもの、あるいは組換え、突然変異その低誘導化された植物 細胞もしくは細胞群であってもよい。植物は双子葉植物または単子葉植物いずれ でもよく、後者の場合、細胞周期遺伝子はさらにプロトプラスト細胞からの再生 を助ける初期相で使用することもできる。分裂の回復を助けるこのさらなる技術 は、小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米その他の作物に適用する場合に特 に価値がある。

単子葉植物については、本発明は二重の利益がある：　（１）いずれかの有益遺 伝子の導入後におけるより容易なプロトプラストからの再生作業：および（２） 細胞周期遺伝子の植物遺伝子型への付加。双子葉植物については、すでに容易に 再生可能であるので、利点（２）が特にあてはまる。

好ましくは、細胞周期制御蛋白はその誘導体、同族体および機能的アナログを含 めたｐ３４　ｅｄｅｌである。この蛋白は制御されるべき植物細胞に同種、すな わち該細胞において天然に存在するものであるか、あるいは該細胞に対して異種 、すなわち該蛋白またはその遺伝子配列が同植物起源でない源からの当該細胞に 導入され得るものである。例えば、制御蛋白はもう１つの植物からのものであっ てよく、あるいはもう１つの酵母細胞のごとき真核生物からものであうでもよい 。該ｐ３４″′６゛２蛋白またはｐ３４°１様分子のハイブリッドであってもよ く、および／または、ハイブリッド遺伝子配列によってコードされるものでもよ い。本明細書中で用いるｒｐ３４”°２またはｐ３４　ｃｄｃ３様分子」なる語 の使用は同種または異種誘導体、同族体および機能的アナログすべてを含む。本 発明は、他の細胞周期制御蛋白まで及び、それらはｐ３４ｔｄ−１と同様に機能 し、あるいはｐ３４°６″′２活性を制御するので、そのような用語使用とする 。かかる蛋白は、ｐ３４″′１°２とは別にあるいはそれと一緒ニ、ｐ３４ｓＬ ｌｃｌ、”ｊイク’Ｊ　：／　（ｃｙｃＬｉｎ）、ｃｄｃ２５、およびｎｉ−一 １．５ｅｅ−１およびｍ１ｋ−１の産物またはその組合せを包含する。

ｐ３４ｅｄｅｌの「誘導体」とは、誘導体化前に天然に存在する分子における配 列と比較して、少な（とも１個のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有するいずれ の蛋白分子も意味する。加えて、該用語は組換えもしくは合成分子および単一も しくは複数のアミノ酸の置換、欠失および／または付加あるいは炭水化物または リビド部位のごとき関連分子のいずれかの置換、欠失および／または付加を担う 分子をいう。

便宜には、ｐ３４ｅ６ｃ２のレベルはｃｄｃ２遺伝子プロモーター（またはその 同等物）を操作することによっぞ遺伝子レベルで制御できる。例えば、異なるプ ロモーターを挿入することができ、それは発育段階で調節でき、あるいはいくつ かの他の手段によって調節できる。異なるプロモーターの使用は、促進された発 現および／または大いに制御された発現の機会を与え得る。別法として、適当な 制御下にある同種または異種ｃｄｃ２遺伝子の多重コピーを挿入して発現レベル を増加させることができる。また、ｃｄｃ２遺伝子の発現を助力し、あるいは調 節する制御遺伝子または遺伝子部位を操作することが可能であろう。当業者なら ば、抑制的遺伝子の発現を減少させるアンチセンス剤またはルボザイム剤の使用 のごとき同種および／または異種ｃｄｃ２遺伝子のｉｎ　ｖｆｖｏにての発現を 制御する種々の手段、ならびにそのようなすべての手段が本発明の範囲内に入る ことを直ちに認識するであろう。例えば、ｐ　３４””のごとき細胞周期蛋白は 細胞周期蛋白に対して作用する酵素の活性レベルで制御することができる。

また、ｐ３４　ｔｄｅ２レベルは蛋白レベルで制御することもできる。かかる制 御はｉｎ　ｖｉｔｒｏでの細胞の成長に対しより多（適用されるが、本発明は、 必ずしもそのように限定されるものではない。本発明のこの態様において、例え ば、細胞周期制御蛋白を培養に添加し、エレクトロボレーシタンのごとき種々の 手法によって細胞に浸透させることができる。適当な形態への蛋白の精製は記載 されている（１２）。量としては、細胞成長を調節するのに十分な時間および条 件下にて使用される。

植物成長を制御する方法に関し、これは、初期の種子発育中におけるとか分裂組 織におけるごとく適当な部位および時期に発現できるプロモーターの制御下にて 植物ゲノムへの細胞周期遺伝子の安定な組み込みを含み得る。これは、アグロバ クテリウムの使用のごとき形質転換の常法によって双子棄植物作物行うことがで きる。また、それは、胚形成カルス由来の細胞に遺伝子を導入し、続いて再生さ せるためのバイオリスティック（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）マイロプロジェクタイル 衝撃のごとき公表された方法を用いて単子葉植物で行うこともできる。

本発明のもう１つの態様は、長期懸濁培養を行う必要をなくすることによって、 形質転換できる単子葉植物の数およびいずれの単子葉植物も形質転換できる容易 性を増加させるために細胞周期遺伝子を用いることである。

関連する植物細胞に応じ、細胞膜は処理されたものである必要があれ、および／ または、蛋白自身が標的細胞への侵入を容易にするために誘導体化されている必 要がある。別法として、周期制御蛋白の活性の阻害剤、拮抗剤または作動剤を用 いることもできる。さらに、かかる手法の組合せを用いることもできる。１つの 特別の態様において、ｐ３４　ｅｄｃｆｉをオーキシンと組み合わせて使用する こともできる。

従って、本発明においては、ｐ３４　ｃｄｃｌの量は植物組織における細胞分裂 につき限定的であることが判明した。特殊化された機能の発育につき分裂の停止 が必要な場合、これは、この鍵細胞周期制御蛋白の低レベルへの減少によって決 定する。細胞分裂を回復できる組織においては、この蛋白を分裂に先立って誘導 する（１２）。さらに、本発明者らは、植物ｐ３４　ｅｄｃｆｉは、酵母ｐ３４ 　ｅｄｅｌの活性を制御する役割を果す分裂酵母からの調節サブユニットｐ１３ ””と相互作用することを見い出した。ｐ１３”ｃｌの植物同族体が今回見い出 された。ｐ１３ｓｌ″ＣＩの機能は分裂酵母における有糸分裂の完成に必要であ る。植物ｐ３４　ｃｄｃ３蛋白が１つの調節サブユニットと関連するという事実 は、酵母で遺伝子的に同定されている他の調節相互作用が植物で作動できこと、 および酵母からまず採取された調節遺伝子を植物細胞分裂を制御するのに使用し 得ることを意味する。従って、本発明はｐ３４°″ｃ２レベルの制御に向けられ るのみならず、間接的にｐ３４　ｅｄｅ３活性の調節となるｐ　１３　ｓｕｃ　 ｌ、　ｗｅｅ−１、ｍ１ｋ−１、ｎ１ｍ−１およびｃｄｃ２５のごとき調節要素 の制御まで拡大される。

本発明は植物の再生で特に有用である。例えば、小麦葉の成熟細胞から、ＤＮＡ の導入に非常に適する健全なプロトプラストが得られるがそれは、植物へ再生す るのが非常に困難である。今回、これらの細胞は低レベルのｐ３４°６゛２を有 し、これらのレベルを増加できないことが判明した。これは、単子葉植物と双子 葉植物の間の組織の基本的な相違であろう。後者の群において、成長は先端で起 こり、傷をつけると新しい組織を回復できる新しい分裂組織が生成される。しか しながら、単子葉植物では、末端分裂組織はな（、成長は基部分裂組織の継続的 分裂による。傷をつけた結果、局在分裂組織は生じない。従って、ｐ　３４−　 ｄ　ｅｌのレベルを上昇させることによって、単一細胞または細胞群の植物への ｐ３４　ｃａｇ　３再生を容易とできる。

特別の適用は、細胞が従前に懸濁培養で長期増殖を受けていない場合における、 その分裂を促進するための形質転換単子葉植物プロトプラストにおける分裂活性 の影響である。この目的で、分裂に対する影響は、一過性のものであれば足り、 非組込型遺伝的形質転換、または蛋白の導入が適当であろう。この使用は単子葉 植物へのいずれかの有益遺伝子の導入を容易にするであろう。

細胞のプロトプラスト化後における分裂の回復を容易にするための細胞周期蛋白 またはそれをコードする遺伝子配列の使用は、ゲノムに安定に組み込まれるべき 遺伝子の単子葉植物への導入を可能とする。導入された遺伝子は、成長のための 温度範囲の増大、病気耐性、水利用、穀類サイズおよび悪条件下における成長を 改良するものを含む。

後者に関しては、また、本発明は、植物がその成長を修飾するのに十分な時間お よび条件下で植物において分裂できる１またはそれを超える植物細胞において細 胞周期蛋白のレベルを調節することを特徴とする１またはそれを超える環境条件 の存在下で植物成長挙動を修飾する方法に関する。。好ましくは、該植物は小麦 、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または同様の作物のごとき単子葉植物であ り、細胞周期蛋白はｐ３４　ｃｄｅｆｉまたはｐ３４　ｅａｒ１様分子である。

「環境条件」なる語は、高温または低温下での成長、病気への暴露および水もし くは他の栄養物の過剰または不足のごとき条件を含めるようその最も広義で使用 する。

穀類サイズおよび成長に関し、安定な組込のために導入される遺伝子は細胞周期 制御遺伝子を包含する。この場合、分裂を促進する遺伝子を、全部プロセスの間 に２つの方法で用いることができる：１６分裂を再開するために、プロトプラス ト化の後の分裂の回復期の間に、コードする蛋白の遺伝子の一過性発現、または その蛋白の導入を用いる。２．再生後の植物で分裂活性を修飾するために、さら に、Ａｃのごとき転移性要素およびｎｅｏのごとき選択可能マーカーも含有する ＤＮＡに導入された細胞周期遺伝子を安定に組み込み、また、それを用いる。

安定に組み込まれた細胞分裂遺伝子は選択した組織または環境条件下で細胞分裂 特性を改良するであろう。

さらに、穀物への根粒の誘導の困難性の一部は必要な局在化細胞分裂を誘導でき ないという可能性がある。本発明では、例えば、ｐ３４″′６°２遺伝子のさら なるコピーを酵母からおよび／または植物から穀物へ導入できる。ｐ３４”°２ の高レベルは酵母でテストした場合に細胞分裂に対して抑制的でなかったので、 導入された遺伝子は構成的プロモーターの制御下にあり得る。誘導可能なプロモ ーターも使用することができ、それは、ｐ３４°６°２の基礎レベルを上昇させ ることから予測されない困難性があれば、形質転換細胞の再生の間のみ誘導でき る。

ｐ３４　ｃｄｅｌの基礎レベルが上昇した、あるいはりゾビウムの感染の時点で レベルが上昇する植物は窒素固定用根粒を形成できるであろう。

しかしながら、植物細胞増殖を抑制する必要があるかも知れない。例えば、冬季 の雨に続いて有限量の水を利用できる場合がしばしばそうであり、作物成長の価 値ある部分が発育してしまう前に水源を消費しないように植物成長を抑制するの は有利である。冬季の雨の後に播種した小麦は、土壌水が消費される前に実を結 ばなくてはならない。野菜植物の成長および特に水の蒸散は抑制されなければな らない。蒸散を減少させる化学薬剤は引き続いての成長に逆の副作用を有するこ とが判明した。本発明は、ｐ３４　ｃｄｅｌの発現または活性の減少により毒性 副作用なくして成長減少を達成できることを提案する。ｐ３４°１″の発現また は活性の減少は前記したごとき多数の方法で達成できる。かかる方法の１つにお いて、ｐ３４”°２の活性を抑制する優性作用用量依存性遺伝子を用いることが できる。

これらは分裂酵母のｗｅｅ−１およびｍ１ｌ−１遺伝子である。その制御された 発現は水源を考慮するために作物の成長を調節するのに使用される。これには、 矯化品種を創製するためには構成的に、あるいは水が限定的になる恐れがあれば 誘導剤の適用によって暖化を誘導できるよう誘導的にｗｅｅ−１および／または ｍ１ｋ−１を導入する必要がある。

また、本発明は、植物成長の制御の他の領域で有用である。例えば、植物器官の 最終サイズが発育の臨界的段階における細胞数によって決定されるというのがし ばしばその場合である。これは、穀類、豆類およびリンゴのごとき多（の重要な 作物に適用される。本発明は収穫を増加させるためにこの段階で細胞分裂を刺激 するのに使用できる。

さらに、被覆を形成する草冠成長の刺激は植物が休眠している間の土壌からの蒸 発による水の喪失を減少でき、それにより、春に成長が回復した場合により多く の水が利用できる。これは、特に、秋蒔小麦に適用される。

さらに、農夫により表面下方で利用可能なことが知られている水を植物が利用で きるように土壌の根貫入を促進するのが望ましい。また、農夫が将来の水供給を 提案する場合は、水が限定されるときには苗条成長を遅延させないことが望まし い。植物における制御は、水ストレスの最初の検出時において、かつ、これが収 穫を制限するかも知れない農業的状況において、成長の保存的制限を生じる。

本発明は、分裂活性を刺激し、ｐ３４　ｒｄｅＱに影響を与えることによって作 用する優性作用用量依存性遺伝子のコピーを導入するのに使用できる。２つの候 補遺伝子はｎ１ｍ−１およびｃａｇ２５である。他の戦略は、活性の抑制的調節 に応答しないｃａｇ２の突然変異体のコピーを導入することである。２つの突然 変異体はｃａｇ２−１ｖおよびｃａｇ２−３ｖである。すべての３種の遺伝子に ついては、発育の適当な段階で誘導すれば発現は最も効果的であろう。１つの可 能性はニトレートレダクターゼプロモーターを使用することであり、希薄ニトレ ート含有栄養の適用によってその発現を誘導する。

また、この栄養は誘導されたさらなる成長を有利に支持するであろう。他の誘導 剤を利用することができ、すべて本発明に含まれる。

双子葉植物および単子葉植物を共に含めた作物植物の経済的に価値ある部分にお いて成長および発育を促進するために細胞周期制御遺伝子を使用することができ る。この第２の分類群において、その再生性を改善するための細胞周期制御遺伝 子もしくは蛋白のさらなる一過性使用は有利であるが、胚形成カルスの〕くイオ リスティック（ｂｉｏｌｌｉｓｔｉｃ）形質転換も遺伝子の導入についての可能 な経路であろう。

経済的に価値ある組織の最終収穫に細胞数が影響する場合は、発育の数段階で細 胞分裂挙動に影響を与えるために細胞周期制御遺伝子を使用できる。特別の例は 穀粒における胚乳発育の多核段階における多数繰返核分裂である。

また、本発明は、単子葉植物におけるｐ３４°６゛２またはｐ３４°６°２様分 子のごとき人工的に制御された細胞周期蛋白を担うトランスジエニ・ツク植物も しくは植物細胞に指向され、かかる植物は小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ 、米または他の作物を含む。かかる人工的制御は高構成もしくは誘導プロモータ ー、多重遺伝子反復および他の同様な手法および技術を含む。

単子葉植物の再生に関しては、単子葉プロトプラストにつき好ましい１の具体例 は、例えば、ＤＮＡの２の調製を用いるエレクトロポレーションによって、再生 植物における発現用の有益遺伝子（例えば、菌類または害虫に対する耐性または 凍結耐性用遺伝子、および分裂挙動を修飾する遺伝子）で安定に形質転換される ことである。１のものは、少なくともｐ３４°６゛２様分子をコードする遺伝子 を担い、恐らく、要すれば、さらに、構成的に発現される３５Ｓまたはその複合 ｐＥＭＵのごときプロモーターの制御下にあって、かつ組込を刺激するトランス ポゾン要素およびＤＮＡのこの種の残存性を強化する選択マーカーを欠くサイク リンをコードする遺伝子を担うものである。このＤＮＡは分裂の数回の繰返を促 進し、（プロトプラスト化の後に起こるごと（、単子葉植物の単一の細胞ではそ うではないが、単子葉植物からの分裂する細胞の組織ではそうであるごとく）分 裂が継続するミクロカルスに導くのに十分なくらい長く存在するであろう。同時 に導入すべき他のＤＮＡは選択可能マーカー、および再生植物に安定に導入され 発現される新しく望ましい特性を付与する遺伝子に隣接するＡｃ遺伝子を含有す るものである。安定な形質転換のための遺伝子は、病気および害虫耐性用の遺伝 子を包含するが、前記したごとき分裂挙動を改善するための遺伝子も包含できる 。

単子葉植物の場合、それは葉分裂組織特異的プロモーターの胚乳の制御下で発現 されるであろう。

ミクロカルスは、オーキシンホルモン（２，４−Ｄ）を含有する固体培地に形質 転換細胞を平板培養させることによって生きた状態で得られる。次いで、ミクロ カルスを（例えば、カナマイシン型の抗生物質を含有する）選択培地に移して、 非形質転換細胞を殺す。生き残るクローンを、オーキシン型ホルモン（２，４− ＤＮＡＡ）ならびにサイトカイン型ホルモン（カイネチン、ＢＡＰ）および苗条 と根の再生のためのＡＢＡを含有する培地に移し、次いで、暫時寒気にあてて強 くし、育種のために地面に植える。この手法は、トウモロコシおよび恐らくは米 のいくつかの株に適用される別の手法よりも優れた２つの利点を有する。別の手 法では、懸濁培養にて、（胚形成カルスに由来する）細胞の集塊を衝撃し、次い で、新しい遺伝情報を摂取した細胞を殺すことを試みる。なぜなら、それは、カ ナマイシンまたは関連抗生物質に対する耐性を欠くものであり、その耐性は安定 に組み込まれるべき遺伝子を担うＤＮＡと一緒に導入されるからである。新しい ＤＮＡを有しない各集塊におけるすべての細胞を殺すのは困難であるので、キメ ラ植物が生じる。しかしながら、概説した手法では、個々のプロトプラストとし て十分分散され、か（して、キメラは回避される。第２の利点は、プロトプラス トが、サテライトＤＮＡへではなくて、核ゲノムへの真性で安定な組込の高い機 会を与え、従って、新しい特性を各世代に伝達できる真性育種作物の発育を容易 とすることである。

以下の図面および実施例を参照し、本発明をさらに詳しく説明する。

図１は、ＥＧＶ抗体でプローブすることによる小麦葉の細胞分裂領域からの蛋白 のウェスタンプロットでｐ３４　＋ｄｅ３同族体の検出を示す写真である。抗体 溶液を分け、添加なしで（０）、２０ｎＭ　ＥＧＶペプチドＥＧＶＰＳＴＡＩＲ ＥＩＳＬＬＫＥを添加して（Ｖ）、または第１３位および第１４位に置換を有す る改変ペプチドＥＧＴＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＭＫＥの２００ｎＭを添加して（Ｔ ）プレインキュベートした。マーカーの位置およびサイズは右側に示す。

図２は、前記条件下における８日間の発芽の後に採取した小麦の９０ｍｍ長実生 葉において、（Ａ）分析用に採取した葉セグメントおよび（Ｂ）分裂の有余分裂 期の細胞の出現率の分布を示すグラフである。葉茶部から０および２０ｍｍ間と この上部で、１０ｍｍ間隔で隣接して４ｍｍｍ上長メントを採取した。図中に試 料番号を入れたのは、各セグメントの中心を示す。有糸分裂指標は、４：１エタ ノール／酢酸で固定し、アセトカルミンで染色した試料で決定した。分裂組織領 域における分裂の高出現率は、分裂周期のこの短時間の期間における細胞の検出 によって示される。

図３は、図２Ａに示したごとく切断した葉セグメントで検出された、（Ａ）染色 可能蛋白および（Ｂ）ｐ３４””同族体レベルの、細胞分化の間における変化を 示す写真である。蛋白５０μｇを含有する試料をＰＡＧＥによって分離し、ニト ロセルロースに移し、ＰｏｎｃｅａｕＳで染色し、次いで、ｐ３４　ｃｄｃｆｉ をアフィニティー精製したＥＧＶ抗体でプローブし、１２５Ｉ−標識抗−ウサギ Ｉ　ｇＧＦ（ａ　ｂ’）ｚを用いて検出した。

図４は葉細胞発育の間のｐ３４°ｄｅｇ同族体および合計蛋白の量の変化のグラ フである。（Ａ）蛋白の５０μｇ試料におけるｐ３４ｃｄｅ！蛋白のレベル、（ Ｂ）細胞における合計蛋白の濃度（１グラムの組織新鮮塊当たりの合計蛋白）、 （Ｃ）細胞当たりの平均合計蛋白含量、（Ｄ）細胞当たりのｐ３４°６′２同族 体の量。図１におけるごとく作成した抽出物における合計蛋白は、オボアルブミ ン標準を用い、８０倍希釈の後に、染料結合によって見積もった。細胞当たりの 蛋白は、Ｂに示した蛋白濃度に、細胞数と同一条件下（５）にて本実験で作成し た新鮮な塊との初期測定から得られ、かつこれらの試料で細胞の大きさの測定か ら確認した平均細胞新鮮塊を乗することによって計算した。ウェスタンプロ・ソ トでのｐ　３４　””同族体の定量はＥＧＶ抗体でプローブすることによって行 い、第２抗体をヨウ素化した。完全なセットの試料をニトロセルロースの単一の ツクネルにて処理したので、直接的比較が可能である。

図５は化トラデスカンティア（Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａ）雄しべ毛細胞におけ る有糸分裂核へのｐ１３５ｕｃｌ蛋白の局在化を示す写真である。

該ｐ　ｉ　３　Ｓ　ｕ　Ｃｌ蛋白は共有結合蛍光基（ＦＬＵＯ３）の励起によっ て直接検出された。１００ｍＭ　ＫＣｌ中の０．５ｍｇ／ｍＩ蛋白を含有する細 胞容量の１％と同等の容量のマイクロインジェクションによって該蛋白を導入し た。該蛋白は分裂酵母５ｕｃｌ遺伝子によってコードされ、イー・コリで過剰発 現され、蛍光標識前に均質精製された標品ｐ１３ｓ＋Ｊｃ！であった。

分裂酵母でｐ　１３９　Ｌ’　ＣＩの有糸分裂活性の制御に必要なｐ　ｉ　３　 ＄　ｕ　ｃｌ蛋白は、有糸分裂の前期に入るに従い核に濃縮されるのが観察され た。鮮やかな核が細胞の上部の１７３を占めるのが観察され、暗色染色体がｐ　 ｉ　３Ｂ　ｕ　Ｃｌ蛍光のノ＜・ツクグラウンドに対して観察された。

図６はツインニア（Ｚｉｎｎｉａ）板先端細胞にｐ３４°６°２様蛋白が存在す ることを示す写真である。

ｐ３４゛″に関連するすべての細胞周期制御蛋白で完全に保存されているペプチ ドＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥに対して生起したアフィニティー精製ポリ クローナル抗体を用いて蛋白を検出した。

プレ前期バンド（Ｐ　Ｐ　Ｂ）でのｐ３４°６°２様蛋白の濃度を検出した（矢 印）。

図７は、再生可能および再生不能ニコチアナ・プルンバギニフオリア（Ｎｉｃｏ ｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏｌｉａ）細胞の懸濁培養における同調的 細胞分裂の間のｐ３４・ｄ・２様蛋白（ＰＳＴＡＩ）？蛋白）のレベルを示すグ ラフである。該再生可能細胞系は固体培地へ移した際に完全な植物を再生させる ことができ、該再生不能細胞は懸濁培養における長期増殖の間にこの能力を喪失 した。２の細胞系を平行で増殖させ、各々からの蛋白試料を共電気泳動に付し、 同一のウェスタンプロ・ノドでｐ３４°１゛２様蛋白のレベルを見積もった。

各時点で採取した試料の対において、左側のは再生不能細胞系に由来する。

８期に細胞を揃えるアフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）ブロックからの 放出の後、間隔を置いて、各培養をサンプリングし、無阻害剤培地へ移して同調 細胞分裂が得られた。再生不能細胞系は再生可能細胞系の５倍のｐ３４””様蛋 白の構成的レベルを有していた。

同調分裂が両培養で起こっている場合、１５〜２３時間の間におけるプレ前期バ ンド頻度の測定は、再生可能細胞系における４００細胞のうち５９が隔膜形成体 を有し、６３が隔膜形成体および将来の横断壁の位置を決定するプレ前期ノくノ ド（ＰＰＢ）を有することを示した。対照的に、２９２隔膜形成体の検出は分裂 する細胞がサンプリングされていることを示したが、再生不能細胞系からの２０ ００細胞の大量の試料は、ＰＰＢの不存在を示した。ＰＰＢの欠如は、懸濁培養 の間の変性変化が分裂の面、従って、新しい細胞が形成される方向を決定する機 構を排除したことを示す。かかる方向はカルスではなく細胞への成長に必要であ り、その不存在はこの培養に再生性が無いことを説明する。本発明の鍵となる特 徴は、形質転換細胞におけるｐ３４°６″２活性の制御された一過的上昇の利点 を診断することである。これは、プロトプラスト化後に分裂の回復能を得るため の懸濁培養における細胞の長期前増殖の必要性を回避するであろう。懸濁培養間 におけるｐ３４”°２のランダムな上昇は予測できず、通常、制御されない分裂 および植物再生能力の喪失に至りかねない。

図８は、アッセイ前に１４日間２．４−Ｄを含有する固体培地へ移した後測定し た、実生小麦葉セグメントにおけるｐ３４　ｃｄｃｌ様蛋白のレベルを示すグラ フである。

無菌的に成長させた実生からの葉をセグメント化し、５ＤＳ−ＰＡＧＥによって 蛋白を分画し、前記したごとくにアフィニティー精製抗体によってｐ３４　ｃｄ ｅＱ様蛋白を見積もった（１１）。

分裂組繊細胞分裂領域よりなる葉の基部から採取した組織における細胞を、２． ４−Ｄによって刺激してｐ３４”ｃ２様蛋白の合成を継続させ、分裂を継続させ た。葉の他の箇所からの細胞は分化してしまっており、２．４−Ｄに対しては反 応せず、ｐ３４”°２様蛋白を合成せず、分裂しなかった。これらの成熟細胞は プロトプラスト化で生き残り、細胞壁を再生できる。それは、一過性発現につい ての細胞周期遺伝子の導入によって細胞分裂を回復するよう刺激できれば、形質 転換に適するであろう。

図９は２．４−Ｄが無＜　（−）　、２．４−Ｄを含有する（＋）培地の種々の ６後にニンジン子葉外植体から抽出した蛋白をウェスタンプロットにてｐ３４° ６°２様蛋白を検出するグラフである。（１，５＝Ｒｕｂｉｓｃｏ大サブユニツ ト）。時間を増やしていった後における２、４−Ｄ含有（−一一）および２．４ −Ｄの無い（・−・）培地での外植体におけるｐ　３４　””様蛋白の相対量。

相対的ユニットは文献１２に記載されている。

植物は本実験では先の実験で記載したごとくに正確に成長させた（１０）。

蛋白抽出、電気泳動およびプロッティング液体窒素中で破砕し、洗剤Ｔｖｅｅｎ 　２０ならびにプロテアーゼおよびフォスファターゼの阻害剤を含有するＲ、Ｉ ＰＡ緩衝液と０℃で激しく混合することによって蛋白を抽出した（６）。蛋白５ ０μｇを含有する試料を１０−１５％グラジェントゲル上の５ＤＳ−ＰＡＧＥに よって分離した。該蛋白をニトロセルロースに移し、マウスｐ３４　””融合蛋 白に対する抗体のアフィニティー精製（８）後に、先に記した（６　：　７）抗 −ＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥｉＳＬＬＫＥ抗体（ＥＧＢ抗体）でプローブした。ｐ　 ３４　””を含まない対照の精製は反応抗体を与えなかった。結合抗体は前記し たごとく　（６）アルカリ性フォスファターゼで検出するか、あるいは２４時間 オートラジオグラフィー暴露を使用する０、５ｍＣ１／Ｉにおける１２５１−標 識抗一ウサギＩ　ｇＧＦ（ａ　ｂ’：ｈ　（アメルスハム（＾ｍｅｒｓｈａｍ） 、ＩＭｌ、３４０）で検出した。

ｐ３４゛″ｌ唄町１Ｆ凛員 ｐ３４　””同族体はＥＧＶ抗体およびヨウ素化第２抗体でプローブすることに よってウェスタンプロットで定量した。完全な試料セットをニトロセルロースの 単一パネル上で加工し、従って、直接比較可能である。オートランオグラフィー を用いてｐ３４バンドを位置付けし、次いで、それを放射能活性計数のために切 断し、各トラックで測定した低バツクグランドで修正した（図３Ｂ参照）。

図１は、酵母とヒトの間ではｐ３４′ｄ”で完全に保存されているが他の蛋白キ ナーゼにおいては保存されていないＥＧＶＰＳＴＡＩＲＥＩＳＬＬＫＥ配列（Ｅ ＧＶペプチド）に対して生起した抗体を用いて、小麦葉の細胞分裂領域からの抽 出物中にｐ３４°６′２の同族体が検出されたことを示す。哺乳動物ｐ　３４　 ””に結合させることによるアフィニティー精製の後、該抗体は分子量３４Ｘ１ ０”の小麦蛋白を認識した。認識は保存されたＥＧＶペプチド領域に対し特異的 であった。

というのは、それは２Ｏｎ、Ｍ　ＥＧＶペプチドとの競合によって見積もったか らである（図１）。ｃｄｃ２と同様性を有するが細胞分裂には影響しない、ＰＨ ０８５遺伝子によってコードされる相同ペプチド（９）は競合せず、これは、Ｅ ＧＶ抗体は、細胞周期機能に特異的である最大の完全保存領域内のコンフィギユ レーションを認識したことを示す。

葉における分布 実生葉（図２Ａ）の基部から先端にかけてセグメントを採取し、細胞分裂はより 低い１２ｍｍにおいてのみ検出され（図２Ｂ）、これは、核ＤＮＡへのチミジン の取り込みの領域と一致する。分化の間の蛋白の量の変化（図３Ａ）は、基部か ら２８ｍｍを超えるところのＲＵＢＩＳＣＯの分子量５５Ｘ１０３サブユニツト の出現によって説明され、これはクロロプラスト数の増加および光合成の開始と 相関する。

ｐ　３４　ｅｄ”同族体の電気泳動移動度は、いずれの富蛋白のそれとも合致せ ず、他の蛋白のそれに対するそのレベルは活性な細胞分裂の領域を外れるとシャ ープに減衰した（図３Ｂ）。図４Ａで定量化される相対レベルでのこの減衰は、 分化する細胞がサイズ、蛋白濃度（図４Ｂ）および、従って合計蛋白含量（図４ Ｃ）を増加させるに伴う他の蛋白の蓄積のためである。細胞当たりのｐ３４”” 同族体の量（図４Ｄ）は、どれくらいの数の細胞が図３Ｂおよび４Ａでプローブ された蛋白を生成したかを記す細胞当たりの蛋白含量を用いることによってめた 。分化の間にｐ３４”°２の有意な正味の分解は起こらず、その蓄積の停止によ って９４％相対減衰が計算された一方、他の蛋白の大々的な合成が分化の間に起 こる。

実施例３　ｐ３４°６゛２およびＰ　１３　ｓｌ″”　間（７）相互作用ｐ３４ 　ｃａ＋ｆｉの細胞周期制御蛋白様と考えられる植物蛋白は、酵母ｐ３４”°２ 蛋白と機能的に非常によく似ている。この重要性は、ｐ３４　ｅｔｌｔ２の細胞 分裂制御機能および植物蛋白の同様性につき、酵母における決定的な遺伝的証拠 があることであり、従って、同様の分裂制御機能がそれらに存在する可能性を支 持する。

かかる証拠は以下のことを含む： ａ、）３４に、Ｄａの同一サイズを有し、抗体によって認識されるアミノ酸配列 ＥＧ−ｖ−ＰＳＴＡ　ＩＲＥ　Ｉ　５ＬＬＫＥ　（ＰＳＴＡＩＲ）を含有する植 物］）３４’″″′様蛋白もまた、標品酵母ｐ３４”°２に結合する酵母ｐ　１ ３Ｓ　ｕＳ　＋サブユニツトに結合する。

該結合植物蛋白はカルシウムまたは環状ＡＭＰを要しないＨ１ヒストンに向けら れたプロティンキナーゼ活性を有し、これらの点で、標品酵母ｐ３４°６°２と 同一である。

ｂ）植物は、分裂酵母からの蛋白と間−サイズであって酵母ｐｉ　３５ＵＣＩに 対する抗体によって認識されるｐ１３ｓｕＣ１の同族体を含有する。点（ａ）お よび（ｂ）は、−緒に、植物ｐ３４”°２は酵母酵素と同様に調節蛋白との相互 作用につき同一の能力を保持することを示す。ｐ１３ｓｌｌｃ＋は酵母において 成長に必要であり、有糸分裂における後期の完了に必要である。ｐ１３３Ｕｃ１ と相同な植物蛋白の存在および標品ｐ　１３　Ｓ　Ｕ　Ｃｌへの植物ｐ３４°６ ゛２様蛋白の結合の意味するところは、植物ｐ３４°６゛２は、本発明者らが我 々の特許で提案したごとく酵母でまず特徴付けられたネットワークの他の蛋白と の相互作用によって調節されるということである。

これらの結果はジョン（Ｊｏｈｎ）ら（］１）によって開示されており、ここに 参照のために挙げる。

実施例４ 本実施例は（ｉ）ｐ３４″”と相互作用する蛋白の細胞内の位！および（ｉｆ） 可能な標的蛋白に対するｐ３４°６″の細胞内位置は植物細胞周期におけるｐ３ ４”°２の機能と一致するか否かの実験に指向される。

ａ）分裂酵母の１３ｋＤｉ白ｐ１３　ｓｌＩ”ｔ−イー　・コ’Ｊ　（Ｅ、　ｃ ｏｌｉ）ＴＡ剰発現すせ、均質に精製し、蛍光染料５（６）−カルボキシフルオ レセイン−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで共有結合的に標識し、活性 に分裂していた生トラデスカンティア（Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａ）雄しべ柔細 胞に０．５ｍｇ／ｍｌにて微量注射した。該蛋白は有糸分裂前期の核で濃縮され （図５）、これは、ｐ３４°６゛２は植物における有糸分裂で機能し、ｐ１３５ Ｌｌｅｌのごとき調節サブユニットとの協同によって調節されるという提案と合 致する。

ｂ）　ｐ３４”ｃ２様蛋白の位置は、分裂植物細胞における抗体結合および免疫 蛍光顕微鏡によって決定した。該蛋白は細胞質および核に位置するが、初期の有 糸分裂では、微小管のプレ前記バンド（ＰＰＢ）と呼ばれる細胞骨格構造である 分裂の配位の主要決定要素に局在するようになる（図６参照）。該ＰＰＢは新し い（娘）細胞を分離する横断壁の配位の部位をマークし、それ故、成長が起こる 方向を決定する。調節可能なｐ３４″″゛２レベルおよびＰＰＢ形成能は共に培 養細胞から植物を再生する能力において鍵となる要素である。導入された遺伝情 報を作物の改良で利用する場合、かかる再生が必要である。ｐ３４　ｃｄ＜３レ ベルおよびＰＰＢ成形能という二重の要件は、共に、培養細胞から植物を再生さ せる能力において鍵となる要素である。導入された遺伝情報を作物の改良で利用 する場合、かかる再生が必要である。ｐ３４　Ｉｄｔ２調節およびＰＰＢ形成と いう二重の要件は２つの要素の共局在によって強調される。

関連系列の調査は、他の界におけるｐ３４　ｒｄｒ２機能に必要な他の蛋白が植 物に存在するか否かを確立することを追及してきた。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣ Ｒ）技術を用いて細胞周期制御遺伝子と相同な植物遺伝子の領域を増幅させた。

小麦においては、ｐ３４ｃ＋ｌｅ９様蛋白および、６１期でｐ３４″′６°２と 複合体化するサイクリンのＧクラス様蛋白をコードできる遺伝情報が検出されて おり、細胞周期の６１期でその機能を活性化させることが示唆された。Ｇ１サイ クリン遺伝子のこの部分の存在およびプローブとしてＰＣＲ増幅断片を用いて単 子葉植物サイクリンをクローン化するのにそれを使用する能力は重要である。と いうのは、単子葉植物細胞は共通に細胞周期の０１期を妨げ、適当なサイクリン は分裂を刺激するのを助力するからである。

植物細胞の懸濁培養で起こる再生能の喪失の分子的基礎を直接調べるためにもう １つのアプローチを試みた。

懸濁液中における植物細胞の長期培養は、新鮮な培地での反復希釈および非天然 条件下でより迅速に分裂する細胞の暫時の優勢化を含む。本発明者らは、ニコチ ニア・ブルムバギニフォリア（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍｂａｇｉｎｉｆｏ ｌｉａ）の懸濁培養で、培養を希釈する毎に不可避的に起こるより迅速な分裂細 胞についての継続選択の結果、ｐ３４“２レベルが増加し、プレ前記バンドが喪 失したことを観察した（図７に詳細を説明する）。

成熟穀物葉細胞で調べた細胞分裂の抑制は鍵細胞分裂蛋白ｐａ４”°２を誘導で きないことによる。２．４−Ｄを含有する培地で無菌的に培養する場合、組織は 活性に分裂する（分裂組織）領域から採取したにも拘わらず、細胞は分裂を支持 できるレベルでｐ　３４　””様蛋白を保持しく図９参照）、一方、低レベルの ｐ３４°゛２様蛋白と共に成熟細胞を含有する葉の他の箇所から採取した組織は ｐ３４ｃｍｅ２のレベルを上昇させることができず（図８参照）、また、細胞分 裂を開始させることができなかった。細胞分裂を容易に継続する分裂組織は形質 転換源としては不適当である。なぜならば、それは細胞壁を再生せず、また、遺 伝物質の導入後に細胞分裂を回復できないプロトプラストを生じるからである。

成熟細胞は細胞壁を再生できるが、長期懸濁培養に付されたものでない場合、成 熟細胞における分裂の主要抑制はｐ３４°ｄｃｆｉ蛋白の低レベルのその保持で ある。

文献 １、ナース・ビイおよびビセット・シイ（Ｎｕｒｓｅ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｂ１５ ｓｅｔ、　Ｙ、　）、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２９２　＋　５５８−５６ ０．１９８１２、ナース・ビイおよびファンテス・ビイ（Ｎｕｒｓｅ、　Ｐ、　 ａｎｄ　Ｆａｎｔｅｓ、　Ｐ、　）、ザ・セル・サイクル（Ｔｈｅ　Ｃｅ１ｌ　 Ｃｙｃｌｅ）、８５−９８．１９８１３、ラッセル・ビイおよびナース・ビイ（ Ｒｕｓｓｅｌｌ、　Ｐ、　ａｎｄ　Ｎｕｒｓｅ　Ｐ、　）、セル４、モレノ・ニ ス、ナース・ビイおよびラッセル・ビイ（Ｍｏｒｅｎｏ、　Ｓ、　、　Ｎｕｒｓ ｅ、　Ｐ。

ａｎｄ　Ｒ１５ｓｅｌｌ、　Ｐ、　）、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）３４４　 ：　５４９−５５２．１９９０５、ウェルニッケ・ダブりニーおよびミルコビイ ッツ・エル（Ｗｅｒｎｉｃｋｅ、　Ｗ、　ａｎｄＭｉｌｋｏｖｉｔｓ、　Ｌ、） 、フィジオロジア・プル（Ｐｈｙｓｉ６１ｏｇｔａ　Ｐｉ、　）　６９　２３− ２８、９８７ｂ ６、ジョン・ビイ・シイ・エル、セフ・エフ・ジエイおよびり−・シイ・エム（ Ｊｏｈｎ、Ｐ、Ｃ，Ｌ、、Ｓｅｋ、Ｆ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｌｅｅ、Ｇ、Ｍ、）プラ ント・セル（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ）　１　：１１８５−１１９３．１９８９ ７、リー・エム・シイおよびナース・ビイ（Ｌｅｅ、　Ｍ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ｎ ｕｒｓｅ、　Ｐ、　）、ネイチャ（Ｎａｔｕｒｅ）３２７　：　３１　３５．１ ９８７８、スニダー・エム、エレッジ・ニス、スウエーツエル・ディ、ヤング・ アール−エイおよびディビス・アール・ダブリｘ　−（Ｓｎｙｄｅｒ、　Ｍ、　 、　Ｅｌｌｅｄｇｅ、　Ｓ、　、　Ｓｗｅｅｔｓｅｒ。

Ｄ、　、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｄ、　、　Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，、Ａ、　ａｎｄ　Ｄａ ｖｉｓ、　Ｒ，？、　）、メス・エンザイム（Ｍｅｔｈ、　dｎｚｙｍ、　）工 ５４　：１０７−１２８．１９８７ ９、トー・イー・エイ、タナ力・ケイ、ウニソノ・シイおよびウイックナー・ア ール・ビイ（Ｔｏｈ−Ｅ、　、　Ａ、　、　Ｔａｎａｋａ、　Ｋ、　、　Ｕｅｓ ｏｎｏ、　Ｙ、　ａｎｄ　１ｆｉｃｋｎｅｒ、　Ｒ，Ｂ、@）、サツカロ ミセス・セレビシェ・モレク・ジエン・ジェネト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ 　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｌｌｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）２１４：１６２ 　１６４．１９８８１０、ウィルニッケ・ダブリューおよびミルコヴイッツ・エ ル（Ｗｅｒｎｉｃｋｅ、　ｊ２．１９８７ １１、ジョン・ビイ・シイ・エル、セフ・エフ・ジエイおよびハイレス・ジエイ （Ｊｏｈｎ、Ｐ、Ｃ，Ｌ、、Ｓｅｋ、Ｆ、Ｊ、　ａｎｄ　Ｈａｙｌｅｓ、Ｊ、　 ）、プロトプラズ？　（Ｊ、Ｐｒｏｔｏｌａｓｍａ）１旦よ＋　７０−７４．１ ９９１ １２、コルスト・ジェイ・アール、セフ・エフ・ジェイおよびジョン・ビイ・葉 セグメント番号 【ユニ二二二、−ニニシュ− セグメント試料番号 葉基部からの販離（Ｉｗｌ） 葉基部からの距離（「圃） 葉基部からの距離（ｍｍ） （搗♀１猪醒ω聯■早宥） ｅ　ＩＩ）Ｉ　Ｉ　ＶＬＳｃＪ Ｄａ 発芽後の日数 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号庁内整理ｆｉｊｒ号Ｃ１２Ｎ　５／１０ ８９３１−４Ｂ Ｉ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞分裂を修飾または制御するのに十分な時間および条件下で植物における 細胞周期制御蛋白のレベルおよび／または触媒活性を調節することを特徴とする 植物細胞成長の制御方法。
2. ２．該細胞周期制御蛋白がｐ３４ｃｄｅ２またはｐ３４ｃｄｅ２様分子である請 求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．該細胞周期蛋白がｐ１３ｓｕｃｌ、サイクリンまたはｎｉｍ−１、ｗｅｅ− １もしくはｍｉｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれらによって制御され る請求の範囲第１項または第２項記載の方法。
4. ４．該植物細胞が単子葉植物または双子葉植物に属する請求の範囲第１、第２ま たは第３項記載の方法。
5. ５．該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様な 作物である請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．細胞分裂の修飾または制御が−過性である前記請求の範囲いずれか１項記載 の方法。
7. ７．細胞分裂を可能とするのに十分な時間および条件下で植物における細胞周期 制御蛋白のレベルおよび／または触媒活性を増大させることを特徴とする植物細 胞分裂を維持、促進または容易化する方法。
8. ８．該細胞周期制御蛋白がｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子である請 求の範囲第７項９記載の方法。
9. ９．該細胞周期蛋白がｐ１３ｓｕｃｌ、サイクリンまたはｎｉｍ−１、ｗｅｅ− １もしくはｍｉｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれらによって制御され る請求の範囲第６項記載の方法。
10. １０．該植物細胞が単子葉植物または双子葉植物に属する請求の範囲第８項また は第９項記載の方法。
11. １１．該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様 な作物である請求の範囲第１０項記載の方法。
12. １２．ｐ３４ｃｄｃ２活性のレベルがｐ１３ｓｕｃｌ、ｗｅｅ−１、ｍｉｋ−１ 、ｎｉｍ−１および／またはｃｄｃ２５のレベルによって直接または間接に制御 される請求の範囲第２項または第８項記載の方法。
13. １３．植物の再生を可能とするのに十分な時間および条件下で１またはそれを超 える植物細胞または該１またはそれを超える植物細胞からのプロトプラストにお ける細胞周期蛋白のレベルおよび／または触媒アクチベーターを上昇させること を特徴とする該細胞またはプロトプラストからの植物の再生を増強または促進す る方法。
14. １４．該細胞周期蛋白がｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子である請求 の範囲第１３項記載の方法。
15. １５．該細胞周期蛋白がｐ１３ｓｕｃｌ、サイクリン、ｃｄｃ２５またはｎｉｍ −１、ｗｅｅ−１もしくはｍｉｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれらに よって制御される請求の範囲第１３項記載の方法。
16. １６．該植物細胞またはプロトプラストが単子葉植物または双子葉植物からのも のである請求の範囲第１３項または第１４項記載の方法。
17. １７．該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様 な作物である請求の範囲第１６項記載の方法。
18. １８．人工的に制御される細胞周期蛋白を担うトランスジェニック植物または植 物細胞。
19. １９．該細胞周期蛋白がｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子である請求 の範囲第１８項記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
20. ２０．さらにｐ１３ｓｕｃｌ、サイクリン、ｃｄｃ２５、ｎｉｍ−１、ｗｅｅ− １またはｍｉｋ−１遺伝子のうち１またはそれを超えるものよりなる請求の範囲 第１９項記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
21. ２１．該植物細胞が単子葉植物または双子葉植物である請求の範囲第１８項、第 １９項または第２０項記載のトランスジェニック植物または植物細胞。
22. ２２．該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様 な作物である請求の範囲第２１項記載のトランスジェニック植物または植物細胞 。
23. ２３．植物がその成長を修飾するのに十分な時間および条件下で該植物における 分裂できる１またはそれを超える植物細胞中の細胞周期蛋白のレベルおよび／ま たは触媒活性を調節することを特徴とする１またはそれを超える環境条件の存在 下で植物の成長挙動を修飾する方法。
24. ２４．該細胞周期蛋白がｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子である請求 の範囲第２３項記載の方法。
25. ２５．該細胞周期蛋白がｐ１３ｓｕｃｌ、サイクリン、ｃｄｃ２、またはｎｉｍ −１、ｗｅｅ−１もしくはｍｉｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれらに よって制御される請求の範囲第２３項記載の方法。
26. ２６．該植物が単子葉植物または双子葉植物である請求の範囲第２３項、第２４ 項または第２５項記載の方法。
27. ２７．該単子葉植物が小麦、大麦、オート麦、トウモロコシ、米または他の同様 な作物である請求の範囲第２６項記載の方法。
28. ２８．該環境条件が温度上昇、病気への暴露または水もしくは他の栄養の過刻も しくは欠乏のうち１またはそれを超えるものからなる請求の範囲第２３項記載の 方法。
29. ２９．細胞周期蛋白をコードする第１のＤＮＡおよび選択可能マーカーをコード する第２のＤＮＡならびに有益遺伝子に隣接するＡｃ要素をプロトプラストに浸 透させ、該浸透プロトプラストを固体培地上で培養してミクロカルスを得、次い で、苗条および根の再生のためにの該ミクロカルスを培養することを特徴とする 再生植物における発現で再益な遺伝子で安定に形質転換したプロトプラストから 植物を再生させる方法。
30. ３０．該有益遺伝子が菌類または害虫に対する耐性、凍結および／または細胞分 裂を修飾することに対する耐性をコードする請求の範囲第２９項記載の方法。
31. ３１．該細胞周期蛋白がｐ３４ｃｄｃ２またはｐ３４ｃｄｃ２様分子である請求 の範囲第２９項または第３０項記載の方法。
32. ３２．該第１のＤＮＡがさらに細胞周期蛋白を制御する産物をコードする遺伝子 を含有する請求の範囲第２９項記載の方法。
33. ３３．該細胞周期蛋白がｐ１３ｓｕｃｌ、サイクリン、ｃｄｃ２５またはｒｉｍ −１、ｗｅｅ−１もしくはｍｉｋ−１遺伝子の産物であるか、あるいはそれらに よって制御される請求の範囲第３２項記載の方法。
34. ３４．該植物が単子葉植物である請求の範囲第２９項ないし第３３項いずれか１ 項記載の方法。
35. ３５．該浸透がエレクトロポレーションによるものである請求の範囲第２９項記 載の方法。
36. ３６．該細胞周期蛋白が構成的に発現される請求の範囲第２９項記載の方法。