JPH06505631A

JPH06505631A - 巨核球刺激因子

Info

Publication number: JPH06505631A
Application number: JP4506745A
Authority: JP
Inventors: ターナー，キャサリン; クラーク，スティーブン・シイ; ジェイコブス，ケネス; ヒューウィック，ロドニー・エム; ジェスナー，トーマス・ジイ
Original assignee: ジェネティックス・インスティテュート・インコーポレイテッド
Priority date: 1991-01-18
Filing date: 1992-01-17
Publication date: 1994-06-30
Also published as: US20060025570A1; AU1441792A; EP1428883A1; EP0567599A1; EP1535929A3; US7030223B2; US6433142B1; WO1992013075A1; US20020137894A1; US7361738B2; EP1535929A2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、一般的に、巨核球前駆細胞の分化および成熟に関与する巨核球コロニー刺激因子（Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ）と相同的な配列および生物学的活性を共有している新規蛋白の族に関する。

背景巨核球は、造血器管細胞であり、その大部分は、骨髄のみならず末梢血および、おそらく、血小板を作り、結果的にそれらを循環系に放出（血小板増加症として知られる）する他の組織にも見られる。結局、巨核球は、ヒトの造血系のすべての造血器管細胞と同様、多（の細胞分裂およびかなりの分化ならびに成熟からなる複雑な経路を経た初期幹細胞に由来する。

、これらの巨核球細胞に由来する血小板は、恒常性の維持および負傷の際の血餅形成にとり重要である。血小板はまた、傷の治癒過程を加速し、他の機能にも役立つ血餅形成部位における成長因子を放出する。しかしながら、血小板レベルの低い（血小板減少症）の患者においては、血餅形成部位如は最も直接的かつ重大な結末であり、多くの癌治療における致命的な合併症を引き起こし得る。この問題については、かかる癌患者を血小板輸血で治療する。他の血小板輸血を要する患者は、骨髄移植を行った患者あるいは再生不良性貧血の患者である。

かかる過程に関する血小板を、通常の提供者からの血小板除去法により得る。

これらの血小板は、相対的に寿命が短く、ＨＩＶまたは肝炎のごとき危険なウィルスに患者をさらすことになる。

血小板減少症患者に内在的な血小板形成を刺激する能力があれば、血小板輸血への依存を減らすこともてき、多くの利点がある。そのうえ、癌の放射線治療または化学治療を受けている患者において、血小板減少症を治しあるいは避ける能力があれば、治療はより安全なものとなり、治療効果を増強する可能性も生じ、それゆえ、多大な抗癌効果を生じる。

これらの理由により、巨核球および血小板形成の調節作用を含む因子の同定について、かなりの研究がなされてきた。かかる因子は、２群に分類される：　（１）巨核球コロニー刺激因子であり、培養における巨核球前駆細胞の増殖および分化を助けるものである。そして、（２）血小板新生性（Ｔ　Ｐ　Ｏ）因子であり、生体内での巨核球の分化および成熟を助け、その結果血小板の形成および放出が起こる。［例えば、マズア・イー（Ｍａｚｕｒ、　Ｅ、　）　、エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Ｅｘｐ、ｔｌｅ＋ｎａｔｏ１．）　１５　：　３４０− ３５０　（１９８７）参照〕各クラスの因子をバイオアッセイにより定義する。

Ｍｅｇ−ＣＳＦ活性のある因子は、巨核球コロニー形成を助けるが、一方、ＴＰＯ活性のある因子は、動物に投与した場合、循環系の血小板数の増加を誘導する。これらの活性のいずれかまたは両方を有する因子が、どれくらい多く存在するかは、定かでない。例えば、既知のヒト・ＩＬ−３は、ヒト・巨核球コロニー形成を助けるし、少なくとも、サルにおいては、しばしば、血小板数増加を誘導する。しかしながら、ＩＬ−３は、すべての造血器管の細胞系において造血器管細胞の成長に影響し、巨核球細胞系の細胞に選択的に相互作用する巨核球および血小板形成の特異的レギュレーターとは、区別される。

巨核球細胞系の細胞と相互作用する因子に関する、多くの異なワた報告が、文献となっている。い（つかの推定上のＭｅｇ−Ｃ３Ｆ成分は血清由来である［例えば、ホフマン・アール（Ｈｏｆｆｍａｎ、　Ｒ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・インベスティゲーション（Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）、７５　：　１１７４−１１８２（１９８５）；ストラネバ・ジェー・イー（Ｓｔｒａｎｅｖａ、　Ｊ、　Ｅ、　）ら、エクスベリメンタル・ヘマトロジ−（Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、）　、１５　：　６５７　６６３　（１９８７）　：マズア・イー（Ｍａｚｕｒ、　Ｅ、　）　、エクスペリメンタル・ヘマトロジ−（Ｅｘｐ、Ｈｅｍａｔｏｌ、）　、１３　：１１６４−１１７２　（１９８５）参照］。ＴＰＯ因子に関する多くの報告が当該分野にある。［例えば、マクドナルド・ティー・ピー（ＭｃＤｏｎａｌｄ、　Ｔ、　Ｐ、　）、エクスベリメンタル・ヘマトロジ−（Ｅｘｐ、　Ｈｅｍａｔｏｌ、　）、１６　：　２０１−２０５（１９８８）；マクドナルド・ティー・ピー（ＭｃＤｏｎａｌｄ、　Ｔ、　Ｐ、　）ら、バイオケム・メディ・メタボ・バイオｏ　（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｍｅｄ、Ｍｅｔａｂ、Ｂｉｏｌ、）　、３７　：　３３５−３４３（１９８７）；タイリエン・ティー（Ｔａｙｒｉｅｎ、　Ｔ、　）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）　、２６２　：　３２６２−３２６８（１９８７）他参照］。

しかしながら、Ｍｅｇ−Ｃ３ＦおよびＴＰＯ因子の生物学的同定ならびに特徴づけは、例えば、血液および尿のような天然の源に存在する量がきわめて少ないため、うまく行かない。

本発明者は、先に、１９９１年２月２１日公開のＰＣＴ　ＷＯ９１１０２００１号において、尿由来の精製Ｍｅｇ−ＣＳＦ因子を同定した。この単一種からなるＭｅｇ−Ｃ３Ｆを、蛋白ｍｇ当たり５Ｘ１０’希釈単位以上、そして好ましくは蛋白ｍｇ当たり２Ｘ１０”希釈単位のネズミのフィブリンクロットアッセイにおける特異的活性により特徴付けた。

当該分野において、他の蛋白と会合したところから分離したさらなる蛋白あるいは、天然光由来または他の方法で調製した単一種からなる物質が必要である。

これらの蛋白あるいは物質は、生体内で血小板形成を刺激または促進する能力があり、目下血小板輸血に置き換わるものであり、リンパ造血系の他の細胞の形成を刺激するものである。本発明は、かかるさらなる蛋白を提供する。

図面の簡単な説明図１は、ＰＣＴ公開Ｗ０９１１０２００１号開示のヒト・尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆに見い出される配列のみならず、本発明開示の他の天然のおよび人工的なＭＳＦの配列を含むＭＳＦ前駆体をコードしているｃＤＮＡ配列を示す図である。１２個のエクソンそれぞれを、特異的なエクソンによりコードされたＤＮＡ配列中の最初のヌクレオチド上から引かれた実線または破線で表す。対応するアミノ酸配列を各コドンの下に示す。

図２は、各エクソンによりコードされたアミノ酸数に関して、ＭＳＦ遺伝子のゲノム上の成り立ちを示す線状の図である。

図３は、実施例５記載のイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ、大腸菌）におけるチオレドキシンを伴う融合蛋白としてＭＳＦを生成させるのに用いるＭＳＦ−に１３０の修飾した核酸配列を表す図である。

図４は、発現プラスミドＰＡＬＴＲＸＡ／ＥＫ／ＩＬ１１△Ｐｒｏ５８１および実施例５記載のチオレドキシン／ＭＳＦ生成のための出発物質として用いる融合蛋白に関するアミノ酸配列を表す図である。

詳細な説明本発明により提供されるヒト・巨核球刺激因子（ＭＳＦｓ）の新規な族は、他のヒト・蛋白性物質、汚染物質あるいは天然界に存在する因子を伴った他の物質を実質的に含まない蛋白または蛋白性成分である。ＭＦＳを、天然の源から単一な蛋白として精製してもよく、それを分泌または発現する選択した細胞系から精製してもよい。自然界に存在するＭＳＦｓの混合物を天然の源から得てもよく、あるいは同様の精製手法により、選択した細胞系から得てもよい。本明細書中においては、他のクラスのＭＳＦｓは、化学合成および／または組換え遺伝子工学技術、ならびに／または両方の手法の組み合わせにより調製された、天然および非天然型の蛋白である「組換えあるいは遺伝子操作蛋白」である。所望により、これらのＭＳＦｓを、種々の発現系における因子の発現により生じるアミノ酸残基および他の物質に関連させて提供してもよい。さらに本発明の組換えあるいは遺伝子操作によるＭＳＦｓを、その起源あるいは操作により、図１のＭｅｇ−Ｃ５Ｆ　ＤＮＡ由来の配列を伴うゲノム、ｃＤＮＡ、半合成または合成的起源のポリヌクレオチドを含むと定義してもよい・　（１）自然界で会合しているポリヌクレオチドの全部または一部に会合していないもの、（２）自然界で連結しているポリヌクレオチド以外のポリヌクレオチドに連結しているもの、または（３）自然界には存在しないものである。

本発明のＭＳＦｓは、図１に示したＤＮＡおよびアミノ酸配列由来の活性のある断片および別に切り出された配列を包含する。図１のヌクレオチド配列および対応する翻訳アミノ酸は、図２の線状の図で示された最も大きなＭＳＦ蛋白をコードしている最も大きな同定されたｃＤＮＡに連続している。なお、図２の線状の図は、各エクソンによりコードされたアミノ酸数に関して、ＭＳＦ遺伝子のゲノム上の成り立ちを示す。しかしながら、図１において、各エクソンは、特異的なエクソンをコードしているＤＮＡ配列上に示されている。図１の配列は、実質的に完全であると信じられているが、ＭＳＦ族の他のものに関する配列を提供する、エクソンＶｌおよびＩＸ間またはエクソンＸＩＩの次に存在する、今回未同定のさらなるエクソンが存在するかもしれない。

Ｍｅｇ−ＣＳＦのエクソンを、該遺伝子またはその断片によりトランスフェクションしたＣＯ８細胞由来の、あるいは、刺激されたヒト・末梢血リンパ球から単離したｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡクローンを分析することにより同定した。開始メチオニンを含む最初のエクソンは、古典的な哺乳動物の蛋分泌シグナル配列を夕を基準にすると図１の１３４ないし２０５番目のアミノ酸領域において終結す□ 　る可能性が最も高い、本来の尿のＭｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白のアミノ酸配列を含む。

より正確には、ヒト・尿Ｍｅｇ−ＣＳＦ蛋白は、１３４ないし１４７番目のアミノ酸残基の間で終結する。未修飾のプロセッシングされたＭｅｇ−ＣＳＦは、エクソンＶないしエクソンＸＩＩの１つまたはそれ以上に由来する付加的なアミノ酸配列を含むより大きな前駆体分子中のこの部位または近傍における、蛋白分解酵素による開裂（エンドおよび／またはエキソ型開裂の前のエンド型開裂）により生じる可能性が最も高い。

１８．２ｋｂのｒＭｅｇ−Ｃ３Ｆ遺伝子」構造の分析の過程で、初めのＲＮＡ転写物が、種々の方法でスプライシングされ、それぞれ異なったＭＳＦ蛋白をコードするｍＲＮＡ族を生じることを発見した。さらに、これらの前駆体蛋白は、異なった方法でプロセッシングされ、異なった成熟ＭＳＦ蛋白を生じる。した力くって、骨髄移植患者の尿から単離されたＭｅｇ−ＣＳＦをはじめとする、ＭＳＦｓの−族の自然界における存在が確認された。この族のすべてのＭＳＦｌ！、１８゜２ｋｂのｒＭｅｇ−ＣＳＦ遺伝子」およびさらに少しのエク゛ノンに由来すると信じられており、１８．２ｋｂの遺伝子の３′側のほんの少し下流に位置する末梢血白血球のｃＤＮＡ中に見い出される。ノくクテリオファージ・ラムダＤＮＡ中にＮｏｔｌ断片として挿入された１８．２ｋｂゲノム配列の全体を、米国メ１ノーランド州２０５８２、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）のノく−クローンドライブ（ＰａｒｋｌａｖｎＤｒｉｖｅ）　１２３０１番地のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾ｗｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）Ｉこ、ＡＴＣＣ４０８５６として寄託した。

本発明はまた、図１のエクソンのアミノ酸配列の異なる組み合わせを用しＡて調製した「組換えまたは遺伝子操作」クラスのＭＳＦｓの構築を目的とする。これらの新規ＭＳＦｓのいくつかは、発現が容易であり、未修飾の尿のＭｅｇ−Ｃ３Ｆとは異なる生物学的特性を有するであろう。

理論に拘束されることなく、図１の自然界１こ存在するＭｅｇ−Ｃ３Ｆ配夕１ｊの分析に基づ（と、エクソン■は、哺乳動物細胞番二おけるＭＳＦ蛋白の適正な開始および分泌に必須であると推測される。エクソンＩＬｒＩＩおよびＩＶｉｉ、ＭＳ′　Ｆの生物学的活性に必須の配列を含むを信じられてＬする。エク゛ノン■および■Ｉは、該因子の活性の関係している可能性がある力く、該分子の安定性、折り畳みおよびプロセッシングにも関与している。エク゛ノンＶおよびエク゛ノンＶＴもまた、観察される他のサイトカインとの相乗作用↓こお０て役ｉｌｌを果たして０ると信じられている。これとは別に、スプライシングされｔこ形態のＭＳＦのＤＮＡ１ｔ、エクソン■を有していない。別のスプライシング（こよるものもまｔこ、エク゛ノンＶｌおよびｘＩＩの間を有していないことが確認された。し力１しな力（ら、予備的なデータは、エクソンＶｌないしエクソンＸｌｌの領域での力１力するスプライシングと矛盾しない。エクソンＶないしＸｌｌは、生じた因子のブロモ・ソンンク゛まｔこ（よ適当な構造の折り畳みに関与していると信じられてしＸる。伊１え（ず、エクソンＶな０シエクソンＸｌｌの１つまたはそれ以上のエク゛ノン（ま、蛋白分解１こよる開裂、付着、細胞マトリックスの組織化あるいは細胞外マトリックスのブロモ・ンシンク゛に向（すられた配列を含むと信じられている。自然界に存在する、および自然界に存在しない双方のＭＳＦｓを、図１の別にスプライシングしたエクソンの組み合わせにより、異なった構成員のＭＳＦ族を形成するために、異なった順番にスプライシングしたエクソンを用いて特徴付けても良い。最も少ない場合でも、エクソンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶならびに生物学的に活性のあるそれらの断片からなる、少なくとも１つの群が、ＭＳＦ中に存する。

自然界に存在するＭＳＦは、少なくともエクソン■を有していてもよい。エクソンＩは、翻訳に必要な開始メチオニンおよび哺乳動物細胞から該因子を分泌するための暗号のリーダー配列の双方、ならびに図１に示した１つまたはそれ以上のさらなるエクソンを含んでいる。これらのさらなるエクソンのうち、エクソンＩＬＩＩＩおよびＩＶならびにそれらの生物学的活性のある断片から１つのエクソンを選択する。このクラスの代表的なＭＳＦは、エクソンＩ、ＩＩおよびＩＩＩをスプライシングしてひと続きになった配列により表される蛋白を包含する。このクラスのもう１つの代表的なＭＳＦは、エクソンＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶｌを含んでいる。

他の自然界に存在するＭＳＦは、エクソン■および翻訳の終止コドンを有するエクソンＸＩＩ、ならびにエクソンＩＬ　ＩＩＩ、ＩＶから選択されるさらに１つのエクソンおよびそれらの生物学的に活性のある断片を有していてもよい。エクソンＩの開始ＭｅｔおよびエクソンＸＩＩの終止コドンの両方が、活性のある、正しく折り畳まれた、自然界に存在するＭＳＦｓを真核細胞中に生成するのに必要である。したがって、自然界に存在するＭＳＦｓは少なくともエクソンＩおよびＸｌｌならびに別のエクソンを含んでいる。このクラスの代表的なＭＳＦは、図１に示したエクソンＩないしＸｌｌから選択されるエクソンを、スプライシングでひと続きになった配列により表される蛋白を包含する。このクラスのさらに別の代表的なＭＳＦｓは、スプライシングでひと続きになったエクソン１．ＩＩ。

ＩＩＩ、ＩＶ、ＶおよびＸＩＩによりコードされた蛋白を包含する。このクラスのもう１つのＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソン１．ＩＩ。

１１１１　ＩＶ、およびＸＩＩの配列により形成される。このクラスのさらに別のＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソン■、ＩＩ、ＩＩＩおよびＸＩＩを包含する。もう１つのＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソンＬＩＩＩおよびＸｌｌにより形成される。しかし、このクラスのＭＳＦのさらなる例は、スプライシングでひと続きになったエクソンＬＩＩＩ。

ＩＶおよびＸＩＩにより形成される。

自然界に存在するＭＳＦｓのもう１つのクラスを、エクソン１１エクソンＩＩ、ＩｌｌおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、またはそれらの生物学的活性のある断片およびエクソンＶｌないしＸｌｌのすべてのエクソンの存在により、特徴づけてもよい。このクラスの代表的なＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソン■、ＩＩ、ｌｌｌ５ＩＶおよびＶＩないしＸＩＩを含んでいる。このクラスのもう１つのＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソン１１ＩＩ、ＩＩＩおよびＶＩないしＸｌｌにより形成さる。このクラスのさらにもう１つのＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソン■、ＩＩＩおよびＶＩないしＸｌｌの配列から形成される。このクラスのもう１つのＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソンＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩないしＸｌｌを含む。

さらにもう１つのクラスの自然界に存在するＭＳＦｓを、エクソン１１エクソンＩＩ、ＩＮおよびＩＶにうちの少なくとも１つ、およびそれらの生物学的に活性のある断片、ならびにエクソンＶｌないしＸＩＩの存在により特徴づけてもよい。このクラスの代表的なＭＳＦは、スプライソングでひと続きになったエクソンＬＴＬＩＩＩおよびＶないしＸｌｌを含む。このクラスのさらにもう１つのＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソン■、ＩＩおよび■ないしＩｌｌから形成される。このクラスのもう１つのＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソンＩＳ　Ｉｌｌ、ＩＶおよび■ないしＸｌｌを含む。

自然界に存在するＭＳＦｓのもう１つのクラスを、エクソンＩ、エクソンＩＩ、ＩｌｌおよびＩＶのうち少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片；エクソンＶおよびエクソンＶＩＩないしＸＩＩの存在により特徴づけてもよい。このクラスの代表的なＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶおよびＶＩＩないしＸＩＩを含む。このクラスのもう１つのＭＳＦは、−緒にスプライシングされた形態のエクソン■、ＩＩＩ。

■およびＶｌｌないしＸＩＩにより、生成する。さらに別のＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソンＩ、Ｉ　ＩＳ　ＩＶ、ＶおよびＶＩＩないしＸｌｌから形成される。このクラスのもう１つのＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソン■、ＩＩＬＩＶ、ＶおよびＶＩＩないしＸＩＩを含む。

しかし、自然界に存在するＭＳＦｓのもう１つのクラスを、エクソン１１エクソンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶにうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片：エクソン■ないしＸＩのうちの少なくとも１つ：およびエクソンＸＩＩの存在により、特徴づけてもよい。このクラスの代表的なＭＳＦは、スプライシングでひと続きになったエクソンＩＳ　ＩＩ、Ｉ　Ｉ　１１１Ｖ、Ｖ、ＩＩＩおよびＸＩＩを含む。このクラスのもう１つのＭＳＦは、スプライシングでひと続きニナッたｘり’／ンＩ、Ｉ　Ｌ　Ｉ　Ｉ　Ｉ、ＶＩ　Ｉ　Ｉ、ＩＸおよびＸＩＩかう形成される。さらに別のＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソンＩ、ｌｌｌ５ＶＩおよびＸＩＩから形成される。このクラスのもう１つのＭＳＦ配列は、スプライシングでひと続きになったエクソンＩ、ＩＩ、ＩＶ、Ｖ。

ＶＩＩおよびＸｌｌを含む。

組換えまたは遺伝子操作されたＭＳＦｓに関して、開始Ｍｅｔおよび選択した発現系において使用するために設計した選択分泌リーダー配列を含む、合成または異種の配列（以下、簡単のため、「人工エクソン■」と称す）により、エクソン ■を置換してもよい。天然のエクソンＩは、イー・コリのごとき細菌の宿主においては、全く細胞内発現が起こらない。分泌リーダー配列を、種々の宿主細胞から蛋白分泌に関する既知の配列の中から選択してもよい。組換えまたは遺伝子操作されたＭＳＦｓの発現に関する宿主細胞として有用な細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞および菌類につＬｚで（よ、多くの分泌１ノーダー配ダ＋＋＋を既知である。分泌リーダー配列および開始Ｍｅｔを含む、遺伝子操作された適当なエクソンｌ配列は、当該分野では既知の配列および手法である。したつ力＜、て、あるクラスのＭＳＦｓを、図１の自然界に存在するエクソン■の力Ａわりに、遺伝子操作によるエクソンＩにより特徴づけてもよｌ、Ｎ。

さらに、エクソンＩＩＩにより、自然界に存在するＭＳＦｓ１ｍ提供される終止コドンを、図１に選択されたエクソン中またｌマその後Ｉこおし１て、選択された宿主細胞に適した終止コドンで置き換えてもよ０（以下、簡単のため、「人工終止コドン」と称す）。終止コドンを有する適切なＭＳＦ配Ｆ１１の構築（よ、当該分野の技術範囲内であり、種々の宿主細胞に関するコドン（ま既知であり、慣用的手法である。したがって、組換えＭＳＦｓの１つのクラスを、人工終止コドンの存在（こより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓの１つのクラスは、自然界に存在するエクソン１１エクソンＩｔＳＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならび↓こそれらの生物学的に活性のある断片］そして人工終止コドンを含む。力１力するＭＳＦの伊１として（ま、以下に詳細に述べる他のもののうち、ＭＳＦ−に１３０およびＭＳＦ−Ｎ１４１力畷挙げられる。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスは、人工エクソン１１エクソンＩｆＩＩＩおよびＩＶのうち少なくとも１つ、ならび（二それらの生物学約６こ活性のある断片、そしてエクソンＸｌｌを含む。

組換えＭＳＦｓのさらにもう１つのクラスは、人工エク゛ノンＩ、エク゛ノンＩＩ。

ＩＩＩおよびＩＶ、ならびにそれらの生物学的１；活性のある断片、そして人工終止コドンを含む。

組換え、遺伝子操作によるＭＳＦｓのさら（こもう１つのクラスζよ、遺伝子操作したエクソン１１エク゛ルＩＬＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片：そしてエク゛ノンＶなＬ）ＬＸＩＩのすべてを含む。

組換えＭＳＦｓのさらにもう１つのクラスを、遺伝子操作したエクソンＩ、エクソンＩＬＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片、そしてエクソンＶｌないしＸｌｌにより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスを、遺伝子操作したエクソン１１エクソンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片：そしてエクソンＶ１およびエクソンＶｌｌないしＸＩＩにより特徴づけてもよい。

しかし、組換えＭＳＦｓの別のクラスを、遺伝子操作したエクソン■、エクソンＩＬＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片、そしてエクソンＶないしＸＩのうちの少なくとも１つ：および人工終止コドンにより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスを、てエクソンＶｌないしＸｌｌにより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスを、遺伝子操作したエクソン■、エクソンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学約６こ活性のある断片；そしてエクソンＶ、およびエクソンＶｌｌなｔ、）ＬＸＩＩｌこより特徴づけてもよい。

しかし、組換えＭＳＦｓの別のクラスを、遺伝子操作したエクソンＩ、エク゛ノンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片；そしてエクソンＶないしＸＩのうちの少なくとも１つ；および人工終止コドンにより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスを、遺伝子操作したエクソン１１エクソン１１、ＩＩＩおよびｍＶのうちの少な（とも１つ、ならび１こそれらの生物学的に活性のある断片：そしてエク゛ルＶないしＸＩのすべてにより特徴づＣすてもよ（１゜ただし、人工終止コドンを、配列の選択した最後のエク゛ノン中↓こ挿入また１ま付加いずれかをするものとする。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスを、遺伝子操作したエクソン１１エク・ノンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的活性活性のある断片；そして、人工終止コドンを伴ったエクソンＶｌなＬ）しｘＩのすべてにより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓのもう１つのクラスを、天然のクソン■、エクソンＩＬＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的に活性のある断片：そして、人工終止コドンを伴ったエクソンＶなＬｓＬ、ＸＩのすべて書こより特徴づけてもよい。

組換えＭＳＦｓのさらにもう１つのクラスを、エクソン１１エクソンＩＩ、ｉｔｔおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的４こ活性のある断片：そして、人工終止コドンを伴ったエクソンＶＩなＬ％しＸＩのすべてｌこより特徴づけてもよい。

しかし、組換えＭＳＦＳの別のクラスを、エクソン１１エクソンＩＬＩＩＩおよびＩＶのうちの少なくとも１つ、ならびにそれらの生物学的１こ活性のある断片；エクソンＶないしＸＩ：そして人工終止コドンにより特徴づ番すてもよＬ）。

組換え、遺伝子操作によるさらなるＭＳＦｓを、エクソンＩの完全な欠失↓こより特徴づけてもよい。かかるＭＳＦｓは、イー・コリのごとき細菌綿１１ａｌこお番する細胞内発現に有用である。これらのＭＳＦｓは、エク゛ノンＩＩ、ＩＩＩおよびＩＶならびにそれらの生物学的に活性のある断片；そして所望によりエク゛ノンＶないしＸｌｌのうちの１つまたはそれ以上のエク゛ルカ＼らなってｌ、Ｘでもよ（Ｘ０エク゛ルＸｌｉがない場合、人工終止コドンを、最後の好ましＬＮカルボキシル側のエクソン中またはその後ろに挿入してもよい。本発明の代表的なＭＳＦｓｌ！、以下に記載したＭＳＦ−２３４およびＭＳＦ−２３６である。

別のクラスの自然界に存在するあるいは自然界に存在しなＬ）ＭＳＦｓζこおＧ）では、エクソンＶｌｌｌおよびエク゛ルＩＸの配列が、−緒に存在する力Ａ，また（嘘これらの２つのエクソンの両方ともが存在しないかのＬλずれ力Ａである。このことは、第一には、これらのエクソンおよび残りのエクソンの間のフレームシフトによる。

最終的に、１２個すべてのエクソンを含むＭＳＦが構築される。

上記ＭＳＦ配列構造は、自然に、あるいは宿主細胞発現系によりプロセッシングされることができ、成熟ＭＳＦ蛋白になる前駆体ＭＳＦｓを供給するけれども、真核細胞系で生成された該蛋白の成熟、プロセッシングされた形態は、エクソンＩの全部を欠いていると考えられている。おそらく、成熟蛋白は、同様に、エクソンＩＩの一部を欠いているかもしれない。その結果、プロセッシングされた形態から、リーダー配列を除去することになる。ＭＳＦ蛋白のプロセッシングされた形態はまた、カルボキシル末端に由来する実質的な配列を欠いていてもよい。

例えば、エクソンＶないしＸＩＩの配列が、成熟、プロセッシングされたＭＳＦ蛋白には存在しなくてもよい。もう１つの例として、エクソンＶｌないしＸｌｌの配列が、成熟、プロセッシングされたＭＳＦ蛋白には存在しなくてもよい。さらにもう１つの例として、エクソンＶｌｌないしＸＩＩの配列が、成熟、プロセッシングされたＭＳＦ蛋白には存在しなくてもよい。かかる方法で、代表的な自然界に存在するＭＳＦであるヒト・尿Ｍｅｇ−ＣＳＦが、主にホモダイマーの形で存在するエクソンＩＩＳ　ＩＩＩおよびＩＶにより、特徴づけられる。

人工ＭＳＦｓの選択された例を、以下のの方法で調製してもよい。Ｍｅｇ−ＣＳＦ遺伝子の分析過程で、エクソンエないしＶＩを含む付随的なｃＤＮＡを構築した。人工終止コドンを、エクソンＴＶ，ＶおよびＶＩ中の異なった位置であって、本来のＭｅｇ−ＣＳＦがプロセッシングを受けると考えられる位置に挿入することにより、該ｃＤＮＡにおける１次転写産物を人工的に終結させた。その位置は、アミノ酸残基１３４および２０９番目の間である。これらのｃＤＮＡをＣＯＳ細胞にトランスフェクションさせ、得られる上清をＭｅｇ−ＣＳＦについて試験した。この方法により、異なる生物学的活性のＭＳＦｓを同定した。

本発明の１つのＭＳＦを、図１のエクソンＩＶの１番目のアミノ酸からエクソンＩＶの１３０番目のアミノ酸およびその後ろに終止コドンを伴う配列をコードしている、エクソン■の１番目の核酸からエクソンＩＶの３９０番目の核酸におよぶＤＮＡ配列より特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約１１．６ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約１９ｋＤの主要な蛋白種が検知された。非還元的条件での５ＤＳ−ＰＡＧＥでは、分子量は、約２０ないし４５ｋＤであった。２０ｍＭトリスおよびｐＨ７，４の標準的結合条件においては、このＭＳＦはヘパリンと結合していない。ＭＳＦ−に１３０と称するこの分子の生成および特徴付けを、実施例２および３で詳述する。

ＣＯ５−１細胞での発現の際、該ＭＳＦのｃＤＮＡ配列は、単量体および同種からなる２量体（ホモダイマー）の混合物を生成する。該ホモダイマーは、実施例１０のフィブリンクロットアッセイにおいて活性を示した。哺乳動物細胞において、この配列により発現されたＭＳＦは、未修飾のヒト・尿Ｍｅｇ−ＣＳＦと同等のの構造および性質を示す。

ＭＳＦ−Ｎ１４１と称する本発明のもう１つのＭＳＦを、図１の１番目のアミノ酸から１４１番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、エクソンＩの１番目の核酸からエクソンＩＶの４２３番目の核酸におよぶヌクレオチド配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約１３．２ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約２１ｋＤの主要な蛋白種が検知された。このＭＳＦは、標準的結合条件において、ヘパリンと結合する。Ｃ０８−１細胞での発現の際、該ＭＳＦのｃＤＮＡ配列は、単量体およびホモダイマーの混合物を生成する。Ｃ０８−１細胞により分泌されるのは、主として単量体型である。ホモダイマー型はＣＨＯ細胞により分泌される場合の主な蛋白種である。

本発明のさらにもう１つのＭＳＦであるＭＳＦ−３１７２を、図１の１番目のアミノ酸から１７２番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、エクソン■の１番目の核酸からエクソンＶの５１６番目の核酸におよぶヌクレオチド配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約１６．２ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約２３．５ｋＤの主要な蛋白種が検知された。このＭＳＦもまた、標準的結合条件において、ヘパリンと結合する。

本発明のさらなるＭＳＦであるＭＳＦ−Ｒ１９２を、図１の１番目のアミノ酸から１９２番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、エクソンＩの１番目の核酸からエクソンＶの５７６番目の核酸におよぶヌクレオチド配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約１８．４ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約２７ｋＤの主要な蛋白種が検知された。このＭＳＦもまた、標準的結合条件において、ヘパリンと結合する。

しかし、ＭＳＦ−に２０４と称する本発明の別のＭＳＦを、図１の１番目のアミノ酸から２０４番目のアミノ酸までの配列をコードしている、エクソン■の１番目の核酸からエクソンＶｌの６１２番目の核酸におよぶヌクレオチド配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約１９．８ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約２８ｋＤの主要な蛋白種が検知された。このＭＳＦもまた、標準的結合条件において、ヘパリンと結合する。

ＭＳＦ−７２０８と称するさらにもう１つのＭＳＦを、図１の１番目のアミノ酸から２０８番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、エクソン■の１番目の核酸からエクソンＶＩの６２４番目の核酸におよぶヌクレオチド配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約２０．４ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約２９ｋＤの主要な蛋白種が検知された。このＭＳＦもまた、標準的結合条件において、ヘパリンと結合する。

本発明のもう１つ別のＭＳＦであるＭＳＦ−Ｄ２２０を、図１の１番目のアミノ酸から２２０番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、エクソン■の１番目の核酸からエクソンＶｌの６６０番目の核酸におよびヌクレオチド配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦの推定分子量は約２１．６ｋＤである。還元条件下での１０〜２０％勾配ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、分子量約３０ｋＤの主要な蛋白種が検知された。このＭＳＦもまた、標準的結合条件において、ヘパリンと結合する。

本発明のさらなるＭＳＦｓは、ＭＳＦ−Ｔ１３３　（図１の１番目のアミノ酸から１３３番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、１番目の核酸から３９９番目の核酸を含む）　、ＭＳＦｓ−Ｒ１３５（図１の１番目のアミノ酸から１３５番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、１番目の核酸から４０５番目の核酸を含む）、ＭＳＦ−Ｒ１３９（図１の１番目のアミノ酸から１３９番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、１番目の核酸から４１７番目の核酸を含む）、ＭＳＦ−に１４４　（図１の１番目のアミノ酸から１４４番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、１番目の核酸から４３２番目の核酸を含む）　、ＭＳＦ−に１４７　（図１の１番目のアミノ酸から１４７番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、１番目の核酸から４４１番目の核酸を含む）およびＭＳＦ−Ｅ１５７　（図１の１番目のアミノ酸から１５７番目のアミノ酸およびその後ろに人工終止コドンを伴う配列をコードしている、１番目の核酸から４７１番目の核酸を含む）である。

上記すべてのＭＳＦｓにおいて、それぞれのＭＳＦのアミノおよびカルボキン末端を正確に決定するのであるが、いずれかのＭＳＦｓのどちらかの末端から（あるいはスプライシングされたＭＳＦｓを形成するいかなるエクソンのどちらかの末端から）１個または数個のアミノ酸（および連続したＤＮＡコード領域）を欠失させることが、特定のＭＳＦの性質を有意に変化させることはありえない。ＭＳＦの生物学的活性を保持している、かがる切除されたＭＳＦｓもまた、開示の範囲内である。ＭＳＦ配列の他の位置への人工終止コドンの慎重な挿入は、ＭＳＦ族の他のものを提供しうる。

別法によりスプライシングされた本発明のＭＳＦｓを、上記図１の少なくとも２個のエクソンおよび１２個のエクソンを含むアミノ酸配列により特徴づけてもよい。ただし、エクソンは、スプライシングしてひと続きになった種々の配列になっている。いくつかの代表的な「別法によりスプライシングされた」自然界に存在するＭＳＦ配列を、種々の細胞系から調製したｃＤＮＡのポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により同定した。これらのＭＳＦｓの配列を、ＰＣＲ断片の分子量のエクソン結合部位を含むオリゴヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションにより、および１つの場合にはＤＮＡ配列により確認した。ＭＳＦ配列を得るための２番目の方法は、ヒーラ（ＨｅＬａ）細胞のｃＤＮＡライブラリーからのＰＣＲの手法において、エクソン■およびＶｌ中にプライマーを含ま也これらのエクソン間のＰＣＲを設計した。それゆえ、これらのエクソンはすべて、これらのＭ　Ｓ　Ｆ　ｓ中に存在することになる。別法として、エクソンＶＩないしＸｌｌを存在させないこともできる。さらに別法として、エクソンＶｌないしＸＩＩにうちの１個またはそれ以上のエクソンを、交互にスプライシングしてできたこれらの代表的なＭＳＦｓ中に存在させてもよい。

例エバ、ＰＣＲにて同定したＭＳＦ−１３６（エクソンＩ、ＩＩＩおよびｖＩを含む）と称する、かかる１つのＭＳＦの５゛末端を、エクソンＶｌの２００〜約２５０番目のアミノ酸（５９８〜約７４８番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソン■の１〜２５番目のアミノ酸（図１の１〜７６番目の核酸）を含む付随的なアミノ酸配列により特徴づけてもよい。ＰＣＲプライマーにより同定されないが、以下に記載したようなＰＣＲで同定した配列のそれぞれの中のように、付加的な３′配列が、このＭＳＦ中に存在してもよい。この５’　ＭＳＦ配列は、以下の細胞系のｃＤＮＡ中に検出された：骨肉腫細胞系Ｕ２Ｏ５（ＡＴＣＣ番号ＨＢＴ９６）　、小細胞肺癌腫細胞系Ｈ１２８（ＡＴＣＣ番号ＨＢＴ１２０）、神経芽腫細胞系５Ｋ−Ｎ−ＳＨ（ＡＴＣＣ番号ＨＢＴ１１）、神経芽腫細胞系ＳＫ−Ｎ−ＭＣ（ＡＴＣＣ番号ＨＢＴＩＯ）　、赤白血球細胞系ＯＣＩＭＩおよびＱＣＩＭ２、ホルボールミリステート酢酸存在下または不存在下での培養による赤白血球細胞系に５６２　（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２４３）　、肝癌細胞系ＨＥＰＧ２　（ＡＴＣＣ番号ＨＢ８０６５）および通常の提供者からの刺激された末梢血白血球（ＰＢＬＳ）。その存在は、自然界に存在する交互にスプライシングされたＭＳＦｓが、エクソンＩＳ　ｌｌｌ５Ｖｌおよび所望によりエクソンＶｌｌないしＸＩＩのうちの１つあるいはそれ以上のエクソンからなっていてもよいことを示す。この構造を模倣した人工のＭＳＦは、エクソンＶｌ中またはその後ろに挿入された人工終止コドンを有していてもよい。

エクソン■、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶｌを含むもう１つのＰＣＲで同定した５゜ＭＳＦｓ配列（ＭＳＦ−１，２３６と称す）を、エクソンＶｌの２００〜約２５０番目のアミノ酸（５９８〜約７４８番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９００〜３１９番目する枠内に連結したエクソンＩＩの２６〜６６番目のアミノ酸（７７〜１９９番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソンＩの１〜２５番目のアミノ酸（図１の１〜７６番目の核酸）を含む付随的なアミノ酸配列により特徴づけてもよい。この５’　ＭＳＦｓ配列は、以下の細胞系のＰＣＲ分析により検出された：Ｕ２Ｏ５゜Ｈ１２８，５Ｋ−Ｎ−３Ｈ，ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，グリオーム上皮様細胞系Ｈ４（ＡＴＣＣ番号ＨＢＴ１４８）、ＯＣＩＭＩ、ＯＣＩＭ２、Ｋ５６２、ＰＭＡ存在下のに５６２、ＰＭＡ存在下の赤白血球細胞系細胞系（ＡＴＣＣ番号ＴｌＢ１８０）、ＯＣＩＭ２、ＨＥＰＧ２および刺激されたＰＢＬｓｏこのＭＳＦ−１２３６の存在は、自然界に存在する交互にスプライシングされてできたＭＳＦｓが、エクソン■、ＴＩ、ＩＩＬＩＶおよび所望によりエクソンＶＩＩないしＸｌｌのうちの１つあるいはそれ以上のエクソンからなっていてもよいことを示す。この構造を模倣した組換えＭＳＦは、エクソンＶｌ中またはその後ろに挿入された人工終止コドンを有していてもよい。

本発明によるさらにもう１つのＭＳＦｓを、エクソンＶｌの２００〜１１４０番目のアミノ酸（５９８〜３４２１番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソンＩＶの１０７〜１５６０７〜１５６番目３２０〜４６９２０〜４６９番目する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９００〜３１９番目する枠内に連結したエクソンＩＩの２６〜６６番目のアミノ酸（７７〜１９９番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソン■の１〜２５番目のアミノ酸（図１の１〜７６番目の核酸）を含む付随的なアミノ酸配列により特徴づけてもよい。このＭＳＦ−１２３４６は、以下の細胞系のＰＣＲ分析により検出されｔ：：０２Ｏ５，５Ｋ−Ｎ−３Ｈ，ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，ＰＭＡ存在下のＯＣＩＭＩ、ＰＭＡ存在下のに５６２、ＨＥ　Ｐ　Ｇ　２および刺激されたＰ　Ｂ　Ｌ　ｓ　ｏこのＭＳＦ−１２３４６の存在は、自然界に存在する、交互にスプライシングされてできたＭＳＦｓが、エクソン■、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、ＶＩおよび所望によりエクソンＶｌｌないしＸＩＩのうちの１つあるいはそれ以上のエクソンがらなっていてもよいことを示す。この構造を模倣した組換えＭＳＦは、エクソンＶｌ中またはその後ろに挿入された人工終止コドンを有していてもよい。

本発明の別のＭＳＦｓ配列は、ＭＳＦ−１２３４を包含する。ＭＳＦ−１２３４は、エクソンＩＶの１０７〜１５６０７〜１５６番目３２０〜４６９２０〜４６９番目する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９００〜３１９番目する枠内に連結したエクソンＩＩの２６〜６６番目のアミノ酸（７７〜１９９番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソン■の１〜２５番目のアミノ酸（図１の１〜７６番目の核酸）を含む付随的なアミノ酸配列により特徴づけられる。この配列は、所望により、エクソンＶないしＸｌｌのうちの１個またはそれ以上のエクソンからなる３′配列を有していてもよい。

この配列はまた、選択されたいかなるＣ−末端側のエクソン中またはその後ろに挿入された人工終止コドンを有していてもよい。

さらに別のＭＳＦｓ配列であるＭＳＦ−１３４を、エクソンＩＶの１０７〜１５６０７〜１５６番目３２０〜４６９２０〜４６９番目する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９００〜３１９番目する枠内に連結したエクソンＩの１〜２５番目のアミノ酸（図１の１〜７６番目の核酸）を含む付随的なアミノ酸配列により特徴づける。この配列は、所望により、エクソンＶないしＸｌｌのうちの１個またはそれ以上のエクソンからなる３゛配列を有していてもよい。この配列はまた、選択されたいかなるＣ−末端側のエクソン中またはその後ろに挿入された人工終止コドンを有していてもよい。

細菌細胞内発現に有用なＭＳＦｓの２つの例は、ＭＳＦ−２３４およびＭＳＦ− ２３６である。ＭＳＦ−２３４１；ｌ、エクソンＩｖの１０７〜１５６番目ノアミノ酸（３２０〜４６９２０〜４６９番目する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９００〜３１９番目する枠内に連結したエクソンＩＩの２６〜６６番目のアミノ酸（７７〜１９９番目の核酸）を含む付随的なアミノ酸配列により特徴づけられる：そしてＭＳＦ−２３６は、エクソンＶｌの２００〜１１４０番目のアミノ酸（５９８〜３４２１番目の核酸）に対する枠内に連結したエクソンＩＩＩの６７〜１０６番目のアミノ酸（２００〜３１９００〜３１９番目する枠内に連結したエクソンＩＩの２６〜６６番目のアミノ酸（７７〜１９９番目の核酸）を含む連続したアミノ酸配列により特徴づけられる。これらの各配列は、所望により、エクソンＶないしＸＩＩのうちの１個またはそれ以上のエクソンからなる３゛配列を有していてもよい。これらの配列はまた、選択されたいかなるＣ−末端側のエクソン中またはその後ろに挿入された人工終止コドンを有していてもよい。

ＭＳＦの生物学的活性により特徴づけられ、研究用試薬、診断用試薬または治療薬として有用である可能性のある他のＭＳＦが、図１に示した同定された２個またはそれ以上のエクソンの他の組み合わせおよび配列順序を有することが、本発明によりさらに推測される。組換えＭＳＦｓを生成するためのエクソンのスプライシングを、本明細書記載のごとく、慣用的な遺伝子操作手法または化学合成により行ってもよい。

さらに、ＭＳＦｓのアナログは、本発明の範囲内に属する。ＭＳＦアナログは、ＭＳＦ活性を保持し、好ましくはヒト・尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆに対し少なくとも５０％、より好ましくは７０％、最も好ましくは９０〜９５％の相同性を有する変異種あるいは修飾蛋白またはペプチドであってもよい。さらに他のＭＳＦアナログは、ＭＳＦ活性を保持し、好ましくはＭＳＦ−に１３０および他の切除されたＭＳＦｓに対し少なくとも５０％、より好ましくは７０％、最も好ましくは９０〜９５％の相同性を有する変異種である。典型的には、かかるアナログは、１．２．３、または４個のコドンのみが変化して異なっている。実施例は、未修飾または組換えＭｅｇ−Ｃ３Ｆあるいは上記ＭＳＦｓのいずれかのアミノ酸配列とは異なる小規模のアミノ酸変化、特に保存的なアミノ酸置換を伴うＭＳＦｓを包含する。

保存的置換は、その側鎖が関連しているアミノ酸の族の中で起こる置換である。

遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に４つの族に分類される＝　（１）酸性１アミノ酸＝アスパラギン酸、グルタミン酸：　（２）塩基性アミノ酸＝リジン、アルギニン、ヒスチジン：　（３）無極性アミノ酸＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン：および（４）非荷電極性アミノ酸＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、シスチン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時々、芳香族アミノ酸に分類される。例えば、単離されたロイシンのイソロイシンまたはバリンによる置換、アスパラギン酸のグルタミン酸による置換、スレオニンのセリンによる置換あるいはあるアミノ酸の構造的に関連のあるアミノ酸による置換は、特にその置換がＭＳＦの活性部位のアミノ酸を含まない場合は、ＭＳＦ活性に大きな影響を及ぼさないと期待するのは当然である。

本発明のＭＳＦｓは、エクソン中のシスティンに富む配列の存在のため、適当な発現系で発現された場合、ホモ−またはへテロダイマーを形成しうる。上述のごとく、特異的なホモダイマー形態を同定した。すなわち、図面の簡単な説明１３０番目のアミノ酸の配列により特徴づけられる、ＭＳＦ−１３０および図１の１番目ないし１４１番目のアミノ酸の配列により特徴づけられる、ＭＳＦ−１４１である。これらのホモダイマー形態を、これらの蛋白の主たる形態と見なした。

しかしながら、これらの蛋白は、他のダイマーおよびモノマー形態の混合物中に存在した。

本発明の他のＭＳＦｓは、例えば、図１の１番目ないし２０９番目のアミノ酸配列、または１番目から１７２番目のアミノ酸配列により特徴づけられるＭＳＦＳのように、混合物というよりはむしろ、主としてモノマーである。

本発明のＭＳＦｓは、直接または間接的に、巨核球前駆細胞および／または巨核球に作用しつる。ＭＳＦｓは、マクロファージおよびＴ細胞のごとき補助細胞に作用でき、巨核球コロニー形成を刺激するサイトカインを生成する。特異的に、ＭＳＦｓは、巨核球コロニー刺激活性を示す。もう１つのＭＳＦ活性は、巨核球成熟促進である。本発明の活性のあるＭＳＦ成分は、ネズミの繊維素血餅巨核球コロニー形成分析において、生物学的活性を有する。例えば、エクソンＩの１番目のアミノ酸ないしエクソンＩＶの１３０番目のアミノ酸の配列（ＭＳＦ−１３０）は、約ｌＸｌ０’倍希釈単位／ｍｇ蛋白より高い比活性を有する。

ＭＳＦｓを他のサイトカインとともに相乗的に使用してもよい。例えば、ＭＳＦｓは、ｌ−３依存性の巨核球コロニー形成増加作用も示す。また、ＭＳＦｓは、スチール・ファクター依存性巨核球コロニー形成も示す。これらのサイトカインＩＬ−３およびスチール・ファクターは、生体外において、増加した巨核球コロニー形成を刺激することが示されている。

上記エクソンｌないしエクソンＸｌｌから選択される配列の組み合わせによりコードされるすべてのＭＳＦｓは、ＭＳＦの生物学的活性を有するであろう。例えば、ＭＳＦ単独あるいは他のサイトカインとともに示す、ネズミのフィブリンクロットアッセイにおける活性である。スプライシングされた形態のＭＳＦを含めて、本発明のすべての修飾または変異ＭＳＦペプチドあるいはポリペプチドは、それ自身またはＩＬ−３、スチール・ファクターあるいはＧＭ−ＣＳＦを含む他の既知のサイトカインと組み合わさった、巨核球フィブリンクロットアッセイにおける活性を、容易に試験できる。本発明のＭＳＦｓと組み合わせて有用である他のサイトカインとしては、Ｇ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、エリスロポエチン、Ｉ　Ｌ−６、ＴＰＯｌＩＬ−１１、ＬＩＦ。

尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ、ＩＬ−７およびＩＬ−９挙げられる。

これらのＭＳＦｓは、ネズミの骨髄標的細胞を用いる分析における培養物中の巨核球増殖および分化を刺激する能力に加えて、生物学的または生理学的活性を有していてもよい。ネズミのフィブリンクロットアッセイにおいて、本発明のＭＳＦ成分は、多くの形態のコロニーの増殖を刺激するが、少なくとも５０％のコロニーが、十分な数の巨核球を含んだ純粋な巨核球または混合細胞系コロニーである。コロニー形態の正確な組成は、分析条件が異なると変化してしまう（ウシ・胎児血清のロットなど）。巨核球を含むコロニーのうち、典型的に、５０〜７０％が純粋な巨核球のコロニーである。ある場合には、特殊なＭＳＦは、それ自身では、巨核球コロニー形成を刺激せず、むしろ、ＩＬ−３またはスチール・ファクターのごとき他の因子に助けられた巨核球コロニー形成を増強しうるか；あるいは、単独では巨核球コロニー形成を助けることができないＩ　Ｌ−１１のごとき他の因子とともに相乗作用を示す。

寒天上でのネズミの巨核球コロニー形成分析において、本発明のＭＳＦは巨核球コロニーを刺激するであろう。同様に、ヒトの血漿血餅巨核球コロニー形成分析においても、本発明のＭＳＦは、巨核球コロニーを刺激するであろう。

生体外におるこれらのＭＳＦｓの最大の生物学的活性は、酸または５ＤＳ−ＰＡＧＥにおける変性条件あるいは逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によるこれらの因子の刺激により達成されうると、現在予測されている。無処理の尿蛋白および組換えによるＭＳＦ−１３０の両方による活性のユニット数の増加が、５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣの後で、常に観察される。

本発明はまた、天然由来である配列および物質と会合することなく、ＭＳＦをコートしているＤＮＡ配列を包含する。図１に示した、および上で同定した配列を含む、これらのＤＮＡ配列は、発現のためにＭＳＦポリペプチドをコードしている。哺乳動物細胞中で発現された場合、これらの配列は、哺乳動物細胞中でブロセッノングされ、機能的蛋白を生じる前駆体ＭＳＦｓを生じる。

ＭＳＦのＤＮＡ配列の例は、図１の１番目ないし３９０番目のヌクレオチドからなるＤＮＡ配列を含んでいてもよい。別のＭＳＦのＤＮＡ配列は図１の１番目ないし４２３番目のヌクレオチドからなる。もう１つのＭＳＦのＤＮＡ配列は図１の１番目ないし５１６番目のヌクレオチドからなる。しかし、別のＭＳＦｓのＤＮＡ配列の例は、図１の１番目ないし５７６番目のヌクレオチドからなる。さらなるＭＳＦｓのＤＮＡ配列の例は、図１の１番目ないし６１２番目のヌクレオチドからなる。また別のＭＳＦｓのＤＮＡ配列の例は、図１の１番目ないし６２４番目のヌクレオチドからなる。あるＭＳＦのＤＮＡ配列は、図１の１番目ないし６６０番目のヌクレオチドからなっていてもよい。さらなるＭＳ、ＦｓのＤＮＡ配列は、図１の１ないし３９９．１ないし４０５．１ないし４１７．１ないし４３２；１ないし４４１および１ないし４７１番目のヌクレオチドからなっていてもよい。

他のＭＳＦのＤＮＡ配列は、図１の５９８〜７４８番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した図１の２００〜３１９番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した、図１の１〜７６番目のヌクレオチドからなる配列のごとき、スプライシングされてひと続きになったＭＳＦｓの５′末末端列を含んでいる。もう１つのかかる５’　ＤＮＡ配列は、図１の５９８〜７４８番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した図１の１〜３１９番目のヌクレオチドからなる。さらに別のＤＮＡ配列は、図１の５９８〜７４８番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した図１の１〜４６９番目のヌクレオチドからなる。もう１つのＭＳＦのＤＮＡ配列は、図１の５９８〜７４８番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した図１の２００〜３１９番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した図１の１〜７６番目のヌクレオチドからなる。さらにもう１つのＤＮＡ配列は、図１の１〜４６９番目のヌクレオチドで終了する。もう１つのＮｌ５ＦのＤＮＡ配列は、図１の２００〜４６９番目のヌクレオチドに対する枠内に融合した図１の１〜７６番目のヌクレオチドからなる。

上記ＭＳＦのＤＮＡ配列によるホモ−あるいはへテロダイマーをコードしている他のＭＦＳのＤＮＡ配列あるいはかかる配列による生物学的に活性のある断片をコードしている配列もまた、本発明に包含される。同様に、ＭＳＦのＤＮＡ配列の対立変異体ならびにフィブリンクロットアッセイにおける活性を有するＭＦＳのＤＮＡ配列のいずれかにハイブリダイゼーションできるＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲内である。同様に、ＭＳＦのＤＮＡ配列の対立変異体（ａｌｌｅｌｉｃｖａｒｉａｔｉｏｎ）およびＭＳＦのＤＮＡのいずれかにハイブリダイゼーションすることができ、フィブリンクロットアッセイにおける活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードしているＤＮＡ配列もまた、本発明の範囲内である。

生物学的に活性のあるヒト・ＭＳＦｓをコードしている本発明のＤＮＡ配列もまた、図１の単離ＤＮＡ配列に対し、または上記のごとく交互にスプライシングするーことにより生じた図１の２個あるいはそれ以上のエクソンにより形成される活性のあるＭＳＦｓに対し、適切な条件下でハイブリダイゼーションできるか、あるいは、該条件下ではハイブリダイゼーション可能であるが、遺伝暗号の縮重にはハイブリダイゼーションしないことが理解される。これらのＤＮＡ配列は、上で定義したエクソンペプチド配列および緊縮または緩和的なハイブリダイゼーション条件下［ティー・マニアナイスら、モレキュラー・クローニング（ア・ラボラトリ−・マニュアル）　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ（＾１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング、ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、３８７〜３８９頁参照コで、ＭＳＦのＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションするそれらの配列のすべであるいは断片を含む。緊縮条件下でのハイブリダイゼーションを、６５℃、ＪＸＳＳＣ中、ついで、６５℃１時間０．ｌＸ５ＳＣで洗浄するハイブリダイゼーションと定義する。別法して、緊縮条件下でのハイブリダイゼーシヨンを、５０％ホルムアミド中、５０℃、４ＸＳＳＣにおけるハイブリダイゼーンヨンと定義する。

緩和または「非緊縮」ハイブリダイゼーション条件下で、ＭＳＦに関する配列にハイブリダイゼーションし、ＭＳＦの生物学的活性を有するＭＳＦペプチドの発現をコードしているＤＮＡ配列もまた、新規ＭＳＦポリペプチドをコードしている。非緊縮条件下でのハイブリダイゼーションを、５０℃、４ｘＳＳＣ中＋：おけるハイブリダイゼーションまたは３０〜４０％ホルムアミド中、４２℃におけるハイブリダイゼーションと定義する。例えば、エクソンｉｆ、ＩＩＩまたはＩＶのような重要な領域、および／または糖鎖結合部位あるいはジスルフィド結合をＭＳＦ配列と共有し、１種またはそれ以上のＭＳＦの生物学的性質を有する蛋白をコードしているＤＮＡ配列は、かかるＤＮＡ配列が緊縮条件下でＭＳＦ配列にハイブリダイゼーションしないとしても、はっきりとＭＳＦポリペプチドをコードしている。本発明のＤＮＡ配列は、種間の対立変異体に基づく非コーディング配列、シグナル配列またはコーディング配列における修飾、遺伝暗号の縮重あるいは慎重に行った修飾を有していてもよい。対立変異体は、アミノ酸変化を起しても、起こさなくてもよい種の集合における自然発生的な塩基変化である。

遺伝暗号における縮重は、ＭＳＦポリペプチドをコードしているが、コドン配列において異なるＤＮＡ配列を生じうる。慎重に行った修飾は、その配列によりコードされているポリペプチドの活性、半減期あるいは生成を増加させるための点突然変異または誘導的修飾により引き起こされたＭＳＦのＤＮＡ配列における変種を含んでいてもよい。かかるすべての配列は、本発明の範囲内である。図１の配列のデータおよび上述のエクソンの組み合わせのみならず記述したＭＳＦの特徴を用いて、ＭＳＦｓをコードしているＤＮＡ配列および生じたＭＳＦのアミノ酸配列を、既知の手法で修飾することは、当該分野の技術的範囲内である。

ＭＳＦ配列において対象とする修飾は、暗号配列における選択したヌクレオチドまたはアミノ酸の置換、挿入あるいは欠失を含む。例えば、構造遺伝子を、正しいアミノ酸を保持させつつ、個々のヌクレオチドを変化させることにより操作してもよく、あるいは、該ヌクレオチドを変化させて、生物学的活性の損失なしにアミノ酸を変化させてもよい。例えば、生体外突然変異およびプライマーの修復のような、かかる置換、挿入または欠失の突然変異を誘発する手法は、当業者によく知られている［米国特許第４．５１８，５８４号参照］。自然界のＭＳＦをコードしているＤＮＡの３°末端を、その生物学的活性を保持するように切形してもよい。組換え、遺伝子操作によるＭＳＦのＤＮＡ配列を、その生物学的活性を保持するように、その３′および５゛末端で改変または切形してもよい。シグナル配列をコードしている領域の除去および／またはその領域の異種の配列での置換も望ましい。ＭＳＦ配列の一部を異種の暗号配列に連結し、ＭＳＦの生物学的活性を有する融合ペプチドを調製することも望ましい。

ＭＳＦポリペプチド配列の特異的変異は、糖鎖結合部位の修飾を含んでいてもよい。糖鎖付加の不存在または部分的糖鎖付加は、適当な細胞の糖鎖付加酵素により特異的に認識されるトリペプチド配列からなる、アスパラギン−結合糖鎖付加認識部位におけるいずれかのアミノ酸置換または欠失により起こる。これらのトリペプチド配列は、Ａｓｎ−Ｘ−ＴｈｒまたはＡｓｎ−Ｘ−８ｅｒのいずれかであり、Ｘはプロリン以外のいかなるアミノ酸であってもよい。例えば、かがる部位は、図１に示したｃＤＮＡ中、２０６〜２０８番目に見られる。糖鎖付加認識部位における１個またはその１番目および３番目のアミノ酸の種々の置換および欠失（および／または２番目のアミノ酸の欠失）は、修飾されたトリペプチド配列における非糖鎖付加を引き起こす。かがる改変ヌクレオチド配列の発現は、その部位で糖鎖付加されていない変種を生成する。

ＭＳＦ活性の全部または一部を保持していると考えられる、ＭＳＦの他のアナログおよび誘導体は、本明細書の開示によれば当業者により、容易に調製される。

かかる修飾の一例は、米国特許第４，９０４，５８４号に示されたように、ＭＳＦ配列中に存在するりジン残基にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を結合させるものであってもよい。この文献をここに一体化させる。別法として、ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体と反応しうる〕個またはそれ以上のりジン残基あるいは他のアミノ酸残基を、慣用的手法により、配列中に挿入することは、ＰＥＧの一部分の結合を可能ならしめる。存在するシスティンを、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／１２７８４号により示した手法により用いてもよい。

上記に加え、他のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）またはＭＳＦｓをコードしている構造遺伝子を、他の動物細胞起源のｃＤＮＡライブラリーから得ることもおよび／または調製することもできる。例えば、ネズミのＭＳＦゲノムのクローンおよび数個の部分的なＭＳＦのｃＤＮＡクローンが、発明者により単離されている。

自然界に存在する本発明のＭＳＦを、単一の均質な蛋白または、交互にスプライシングしてできたＭＳＦ蛋白および自然界から生成したＭＳＦ蛋白の混合物として得てもよい。ヒトの尿または刺激されたＰＢＬｓ、自然にまたは細胞系由来の他の因子により誘導されて因子を生成する他の哺乳動物細胞起源のＭＳＦが、かかる自然由来のものに属する。かかるＭＳＦｓのＤＮＡを、自然界から得、精製してもよい。

自然界に存在するＭＳＦｓを単離、精製するための精製手法は、以下の実施例１により詳細に記載された次の段階からなる。実施例および以下の要約は、代表的な天然由来のＭＳＦ、ヒト・尿由来のＭｅｇ−Ｃ３Ｆに関する精製を説明する。

尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆに関しては、貯蔵しておいた骨髄移植患者の尿をアミコン（八ｗｉｃｏｎ）　ＹＭ−１０フイルターで濃縮することを含む。濃縮された尿を、アニオン交換クロマトグラフィーカラムに通し、素通り画分をカチオン交換クロマトグラフィーカラムに結合させる。次いで、溶出した尿蛋白を、貯蔵し、透析し、加熱し、レクチンアフィニティークロマトグラフィーカラムに適用する。次いで、この溶出液を、カチオン交換高性能液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）カラムに適用する。最後に、溶出液を、各回異なる溶媒系を用いる逆相高速液体クロマトグラフィーに３回適用する。

この精製手順により、以下に記載したネズミのフィブリンクロットアッセイにおける、最も高いレベルのＭＳＦｓを含むバッチを、さらなる半調製的スケール（尿換算で３０ないし１００リツトルの間）の精製用に選択し、回収率および収率を最大にする。従って、実施例１記載の精製方法を、ヒト・尿または活性化ＰＢＬｓのような他の由来のヒト・ＭＳＦに適用することにより、均一なＭＳＦである未修飾のＭｅｇ−Ｃ８Ｆを得ることができる。

天然由来のＭＳＦｓを単離できる他の組織および細胞系は、例えばＡＴＣＣ＃０９８−ＡＨ２のようなヒーラ細胞系、ネズミ骨髄細胞系のごとき骨髄細胞系、インスティチュート・インク（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｉｎｃ、　、　）社〕、骨肉腫細胞系Ｕ２Ｏ５，小細胞肺癌腫Ｈ１２８、神経芽細胞５Ｋ −Ｎ−３Ｈ，神経芽細胞ＳＫ−Ｎ−ＭＣ，グリオーム上皮様細胞系Ｈ４、赤白血球細胞系○ＣＩＭＩおよびＯＣＩＭ２、ＰＭＡ存在下での赤白血球細胞系に５６２、ＰＭＡ存在下での赤白血球細胞系ＨＥＬ、および肝癌細胞系ＨＥＰＧ２である。ＭＳＦを生成することがわかっている細胞源の培養方法は、当業者に既知である。ＭＳＦ蛋白および本発明のＭＳＦｓをコードしているＤＮＡ配列を、組換え遺伝子操作法により調製し、治療用途に有用な、純粋で活性のあるＭＳＦｓを大量生産することを可能にするために、ＭＳＦを分泌または発現するように設計した哺乳動物細胞系から精製することができる。該蛋白を、例えばイー・コリのような細菌細胞中で発現させ、そこから精製してもよい。該蛋白を、酵母細胞またはバキュロウィルスあるいは昆虫細胞中で発現させ、精製してもよい。別法として、ＭＳＦまたはその活性のある断片を化学合成してもよい。上記手法の組み合わせにより、ＭＳＦを合成してもよい。これらの異なる発現系についての適当な手法は、当業者に知られている。

組換えＭＳＦを調製するために、該因子をコードしているＤＮＡ配列を、種々の発現ベクターのいずれか１つに導入し、ＭＳＦあるいは１個またはそれ以上のその断片を、選択した宿主細胞中で生成できる発現系を構築する。

個々のエクソンのＤＮＡ配列を、化学合成により得てもよいし、以下の２カ所の寄託機関から、標準的な制限酵素によるサブクローニングの手法または図１のヌクレオチド配列に基づく個々のエクソンに関する合成プライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によって得てもよい。ＭＳＦ配列の源として用いることのできる、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ配列を含む２個のゲノムのクローンを、１９９０年８月３日に、特許手続上の微生物寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の定めるところにより、米国メリーランド州２０８５２、ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、パークローンドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　ｄｒｉｖｅ）　１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（＾＋ｌ１ｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に寄託した。

エクソンＩないしエクソンＶＩにわたる配列を含む、イー・コリのプラスミド中の約１２ｋｂのゲノム断片（Ｍｅｇ　Ｋｐｎ−３ｎａｂＩと称す）［表２参照、５’Ｋｐｎ１部位から３’　５ｎａＢ１部位まで］は、受託番号ＡＴＣＣ４０８５７を与えられた。上記のごとく、バクテリオファージのラムダＤＮＡ中に挿入された、エクソンＩないしエクソンＸにわたる１８．２ｋｂの配列の全部（１８ −５６６５と称す）を受託番号ＡＴＣＣ４０８５６として寄託した。エクソンＸＩおよびＸｌｌを、図１の配列から、既知の手法を用いて調製してもよく、あるいは、ＭＳＦのｃＤＮＡが検出された上記の種々の細胞系から単離してもよい。

上記のごとくして得られ、あるいは上記のごとく修飾したＭＳＦのＤＮＡを、選択した発現ベクター中に導入し、組換え分子または新規ＭＳＦポリペプチド発現法に用いるベクターを調製してもよい。これらのベクターは、ここに挙げた新規ＭＳＦのＤＮＡ配列を含んでおり、該配列は、単独であるいは他の配列と組み合わさって本発明のＭＳＦポリペプチドまたはその活性のある断片をコードしている。該方法において使用するベクターもまた、本発明のＤＮＡ暗号配列に機能的に連結した調節配列を含む。好ましくは、調節配列が、選択したベクター中に存在し、プロモーター断片、終止断片および適当な宿主細胞中で蛋白を発現させる、他の適当な配列を有するものとする。生じたベクターは、選択した宿主細胞中で複製し、ＭＳＦを発現できる。これらのベクターの適当な宿主細胞中への形質転換は、ＭＳＦポリペプチドの発現を引き起こす。

種々の形態の適当な発現ベクターが、哺乳動物（ヒトを含む）による発現のみならず、昆虫、酵母、カヒおよび細菌による発現に関して、標準的な分子生物学的手法として当該分野において知られている。哺乳動物細胞の発現ベクターが、発現にとり望ましい。イー・コリのごとき細菌細胞もまた、ＭＳＦｓの発現に望ましい。

本明細書記載の哺乳動物細胞の発現ベクターを、当業者によ（知られた手法で合成してもよい。例えば、レプリコン、選択遺伝子、エンハンサ−、プロモーターおよびそれに類するもののようなベクターの構成要素を自然界から得ることもできるし、既知の方法で合成することもできる。カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１１．　Ｂｉｏｌ）　１５９　：　５１１−５２１　（１９８２）；およびカウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）　、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ）　８２　：６８９− ６９３　（１９８５）参照。別法として、ベクターＤＮＡが、ウシ・乳頭腫ウィルス［ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）ら、セル（Ｃｅｌｌ）３６　：　３９１−４０１（１９８４）］のゲノムの全部または一部を含んでいてもよく、安定なエピソーム要素としてＣ１２７マウス細胞のごとき細胞系に保持されていてもよい。

哺乳動物用のかかるベクターの一例は、ｐＸＭ［ヤン・ワイ・シー（Ｙａｎｇ、　Ｙ、　Ｃ，）ら、セル（Ｃｅｌｌ）　４７　：　３−１０　（１９８６）　］である。このベクターは、ＳＶ４０の複製開始点およびエンハンサ−、アデノウィルスの大後期プロモーター（ｍａｊｏｒ　１ａｔｅ　ｐｒｏｍｏｔｏｒ）　、アデノウィルスの三分節系リーダー配列のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウィルスＶＡ　Ｉ遺伝子を、適当な関連をもって、哺乳動物細胞中で所望のｃＤＮＡを高レベルで発現するように含んでいる［例えば、カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）　、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン７、　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、５ｃｉ）　８２　：　６８９−６９３　（１９８５）参照］。

ＭＳＦｓ発現に関する構造を生じさせるには、ｐＸＭベクターを、適当な制限酵素で直線化し、例えば、制限酵素消化により、適当に調製したＭＳＦをコードしているｃＤＮＡに別々に連結する。

もう１つの同様なベクターはｐＭＴ２１である。ｐＭＴ２１は、ｐＭＴ２ｐｃ（受託番号４０３４８としてＡＴＣＣに寄託されている）を、Ｐｓｔｌで消化して直線化することにより調製する。次いで、該ＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて処理する。次いで、オリゴヌクレオチド：ＴＧＣＡＧＧＣＧＡＧＣＣＴＧＡＡＴＴＣＣＴＣＧＡ　２４を該ＤＮＡ中にライゲーションし、５゛末端においてＰｓｔ１部位を再生し、ＤＨＦＲｃＤＮＡのＡＴＧの前にＥｃ。

Ｒ１部位およびＸｈｏ１部位を付加する。このプラスミドをｐＭＴ２１と命名する。好ましくは、Ｎｏｔ　Ｌ　Ｋｐｎ　Ｌ　Ｓａ　Ｉ　Ｉおよび５ｎａｂＩ制限部位を持つ所望のポリリンカーを、該ベクターに導入し、ＭＳＦをコードしている配列の挿入を容易ならしめる。

ＣＨＯ細胞中のＭＳＦ発現に用いるさらに別のベクターは、ｐＥＤ４ＤＰＣ−１である。このベクターは、ｐＥＤ４から調製され、ｐ　ＥＭＣ２Ｂ　１としても知られている。上述のｐＸＭのように、このベクターは、Ｓ　Ｖ　４０の複製開始点およびエンハンサ−、アデノウィルスの大後期プロモーター、（ｍａｊｏｒ　ｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｏｒ）、アデノウィルスの三分節系リーダー配列のｃＤＮＡコピー、小さなハイブリッド介在配列、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびアデノウィルスＶＡ　Ｉ遺伝子を、適当な関連をもって、哺乳動物細胞中で所望のｃＤＮＡを高レベルで発現するように含んでいる。さらに、該ベクターは、ＤＨＦＲおよびβ−ラクタマーゼのマーカーならびにｐＸＭが持っていないＥＭＣ配列を有している。ｐＥＤ４ＤＰＣ−１を構築するために、ｐＥＤ４から１０７５ないし１０９６番目の配列を除去し、ントシンの拡張部分をなくす。新たなポリリンカーを付加し、ＮｏｔＩ、５ａｌＩおよび５ｎａｂｌ制限部位を該プラスミドに導入する。該ベクターを適当な制限酵素で直線化し、ついで、別々にＭＳＦをコードしているｃＤＮＡに連結する。

当業者は、例えば、適当な制限酵素により、プラスミドから切り出したＭＳＦのＤＮＡ配列を挿入することにより、他の有用な哺乳動物用発現ベクターを構築し、よく知られた組換え遺伝子操作技術、およびｐＪＬ３およびｐＪＬ４　［ボッ（Ｇｏｕｇｈ）ら、エンボー・ジャーナル（ＥＭＢＯＪ、）４　：　６４５−６５３　（１９８５）１ならびにｐＭＴ２　（ＡＴＣＣ６７１２２であるｐＭＴ　２−ＷＶＦを出発物質とする。ＰＣＴ出願ｗｏ８７１０４１８７号参照）のごとき他の既知のベクターを用いることができるため、上述のこれらのベクターは、本発明を限定するものではない。

ベクターを構築したならば、慣用的方法により、ＭＳＦを含むベクターを用いて選択した宿主を形質転換する。それゆえ、本発明の方法は、既知の調節配列のコントロールの下である場合には、ＭＳＦポリペプチドの発現をコードしているＤＮＡ配列で形質転換した適当な細胞または細胞系を培養することからなる。

適当な細胞または細胞系は、チャイニズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）またはサル・Ｃ０８−１細胞のごとき哺乳動物細胞であってもよい。安定なベクターＤＮＡの構築および構築したベクターＤＮＡの増幅、ならびに慣用的方法の双方に関して、ＣＨＯ細胞を哺乳動物細胞として選択するのが好ましい。適当な哺乳動物細胞の選択および形質転換、培養増幅、検索および精製物の生産ならびに精製法は、当該分野において既知である。ゲシング（Ｇｅｔｈｉｎｇ）およびサムプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）　２９３　：　６２０−６２５　（１９８１）、またはこれとは別にカウフマン（ＫａｕｆＩＩｌａｎ）ら、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）　５　（７）　：　１．７５０−１７５９　（１９８５）またはハウソーＱ！ｏｖｌｙ）ら、米国特許第４．４１９，４６６号参照。もう１つの適当な哺乳動物細胞系はｃｖ−１細胞系である。さらなる代表的な宿主細胞としては、形質転換細胞系を含む、霊長類細胞系およびげっ書類細胞系が挙げられる。

通常の二倍体細胞生体外初代組織のみならず初代組織片培養由来の細胞株もまた適している。提供志願者の細胞は、遺伝子型上は選択遺伝子を欠いていてもよく、あるいは、優性に作用する選択遺伝子を含んでいてもよい。他の適当な哺乳動物細胞系は、これらに限定しないが、ヒーラ（ｈｅＬａ）　、マウスＬ−９２９細胞、スイス（ｓｖｉｓｓ）　、Ｂａ　ｌ　ｂ−ｃまたはＮＩＨｖウス、ＢＨＫまたはＨａ　Ｋハムスター細胞系由来の３Ｔ３または２９３細胞系を包含する。

同様に本発明の宿主細胞として有用なのが細菌細胞である。例えば、種々のイー・コリ（例えば、ＨＢＩＯＩ、ＭＣ１０６１および以下の実施例に使用する株）が、バイオテクノロジーの分野で宿主細胞としてよく知られている。宿主細胞として用いた場合、ＭＳＦ蛋白は、単一蛋白として発現される。米国特許出願シリアル番号第０７／６５２，５３１号に詳細に開示されているように、細菌細胞中でＭＳＦが、チオレドキシンを伴う融合蛋白として発現されてもよい。この文献をここに一体化させる。バチルス・ズブチリス（Ｂ、５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）　、他のバチルス属およびそれに類する細菌の種々の株もまた、この方法に使用できる。

当業者に知られた多くの酵母細胞株もまた、本発明のポリペプチドの発現用宿主細胞として使用できる。さらに所望であれば、昆虫細胞を、本発明の方法に使用してもよい。ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、ジエネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）８　：　２７７−２９８　（ブレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、１９８６年）およびその中で引用された文献参照。カビの細胞もまた発現系として使用してもよい。

形質転換および培養した細胞によりＭＳＦが発現されれば、当業者に知られた適当な方法で、それを培地から（または細胞内発現の場合は細胞から）回収、単離および精製する。

無血清培地中の哺乳動物細胞（ＣＯ３−１）から組換えまたは合成ＭＳＦを単離するための好ましい精製法は、尿由来の未修飾Ｍｅｇ−ＣＳＦの精製法と同様であり、実施例４に詳述する。ＣＯ３−１細胞培養上清中の組換えＭＳＦを、排除分子量１０．０００ダルトンのアミコン（八ｍ１ｃｏｎ）　ＹＭ−１０フイルターで濃縮する。濃縮物を２０ｍＭ酢酸ナトリウム、Ｉ）８４．５中で透析し、ついで、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５で平衡化したＳトヨパールカチオン交換ＦＰＬＣカラムに適用する。ついで、結合物質を、１０％ＴＦＡから０１％ＴＦＡて酸性化して溶出し、０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルを溶媒系に用いたＣ４逆相ＨＰＬＣへ数回繰り返して適用する。ＭＳＦ−に１３０の場合には、２０〜３５％の０１％ＴＦＡ、９５％アセトニトリル含有緩衝液で該蛋白が溶出する。上記の他の自然界に存在しないＭＳＦｓを、実施例４でＭＳＦ−に１３０に関して詳述する、この精製法を用いて得てもよい。

ＭＳＦポリペプチドを、例えば、メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）合成またはその変法により化学合成してもよい。本発明のポリペプチドの構築法は、当業者に知られている。１次、２次または４次構造および未修飾ＭＳＦポリペプチドに関するフンフォーメーション上の特徴により合成的に構築したＭＳＦポリペプチドは、ともに共通した生物学的特性を有していてもよい。よって、それらのポリペプチドを、天然由来の精製されたポリペプチドについての生物学的活性物または免疫学的代用物として、治療的および免疫学的方法に用いてもよい。

自然界から単一に精製された、あるいは異なるＭＳＦｓの混合物として得た、もしくは組換え的または合成的に調製された１個またはそれ以上のＭＳＦあるいはその断片を、医薬調製物または処方として用いてもよい。本発明のＭＳＦの医薬組成物またはその医薬的に効果のある断片を、免疫不全または免疫障害の治療に用いてもよい。ＭＳＦｓを、造血前駆細胞または造血幹細胞欠損症あるいはそれに関する障害の治療に用いてもよい。ＭＳＦｓを、癌および疾病、放射線おおよび薬品に対する暴露、ならびに例えば、白血球減少症、細菌およびウィルス感染、貧血、骨髄移植による免疫細胞または造血細胞欠乏症を含むＴ細胞およびＢ細胞欠乏症に起因する病理学的症状の治療法に用いてもよい。長期持続性およびより効果的な免疫力を発揮する種々のワクチンに対する免疫応答性を高めるために用いてもよい。ＭＳＦｓを、Ｂ細胞のみならず巨核球の分化を刺激するために使用してもよい。

本発明のＭＳＦｓが、血小板生成刺激、化学療法または骨髄移植による血小板回復刺激、血小板減少症、再生不良性貧血および他の血小板障害の治療、貯蔵中の血小板の保存およびその寿命の延長、ならびに血小板輸血用の生体外での血小板生成刺激に用いてもよい。ＭＳＦｓを、造血細胞および非造血細胞の他のコロニーの増殖および成長を刺激するために用いてもよい。同様に、これらの因子は、細胞標的化にも有用である。ＭＳＦはまた、創傷または熱傷の治療に、単独であるいは繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）のごとき他の創傷治療薬とともに用いることができる。ＭＳＦｓは接着分子形態の特性を有すると信じられており、よって、かかる接着分子の治療的用法も、本発明のＭＳＦｓに関して考えられる。ＭＳＦ組成物を骨髄移植患者の補助的な治療に用いてもよい。

かかる血小板障害または欠乏を、これらのＭＳＦポリペプチド組成物により治療することは、現在用いられている血清由来の因子あるいはヒト・血小板輸血により引き起こされる副作用を避けることができる。１個またはそれ以上のＭＳＦの活性のあるペプチド断片を、かかる医薬処方に用いることが可能である。

それゆえ、目下、本発明のもう１つの態様は上記症状の治療のための治療用組成物である。かかる組成物は、ＭＳＦ蛋白の治療的有効量、治療的に有効なその断片または様々にスプライシングされ、あるいは他の方法で修飾された、医薬上許容される担体と混合されたＭＳＦｓ混合物からなる。この組成物は、全身的に非経口的に投与してもよい。別法として、該組成物を経口的に投与してもよい。

所望であれば、該組成物を、皮下注射してもよい。全身的投与の場合、本発明で使用する該治療用組成物は、発熱原の無い、非経口投与可能な水溶液である。かかる医薬上許容される蛋白溶液の調製物のｐＨ，ｉ透圧、安定性その他に関しては、当該分野の技術的範囲内である。

上記症状の治療法に包含される処方せんを、例えば、患者の症状、体重、性別および食事、すべての感染症の重篤性、投与時間ならびに他の治療上の因子のごとき薬剤の効果を左右する種々の因子を医師が考慮したうえで決定する。一般的に、１日の投与量は、約１ないし約１０００マイクログラムのＭＳＦ蛋白、ＭＳＦ蛋白またはその断片の混合物である。別法として、体重１ｋｇあたり約５０ないし５０．０００単位のＭＳＦ蛋白を望ましい投与量としてもよい。

本発明の治療法、組成物、精製蛋白およびポリペプチドを、単独でまたは他のサイトカイン、造血因子、インターロイキン、成長因子あるいは抗体とともに、血小板欠乏と同様に他の症状により特徴づけられる病状の治療に用いてもよい。

ＭＳＦがそれ自身ＴＰＯ活性ヲ有シテイナイ場合、ＭＳＦは、ＩＬ−３、ＩＬ− −６、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、スティール・ファクター、ＩＬ−１１（ＰＣＴ出願ＷＯ９１１０７４９５号に記載）またはＴＰＯ様活性を持つ他の巨核球刺激因子と組み合わさって、ある形態の血小板減少症に有効であろう。かかる共投与に関する、さらなる代表的なサイトカインまたは造血因子は、ＴＰＯ，Ｇ−Ｃ３Ｆ、Ｍ−Ｃ５Ｆｓ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−７、エリスロポエチンおよびこれらすべてのサイトカインの変種あるいは複数のサイトカインの組み合わせを包含する。上述の投与量を、治療組成物中のかかる付加的成分を補うように調節する。例えば、ＭＳＦｓを体重ｋｇ当たり工ないし１０００μｇ投与°してもよく、他のサイトカインを、かかる共投与のプロトコールのいて同量投与してもよい。別法として、共投与を、投与すべき個々の治療薬のより少ない量としてもよい。治療される患者の経過を、慣用的方法でモニターできる。

これらの新規蛋白および組換えポリペプチドの他の用法は、生体内または生体外の診断的あるいは治療的使用に関する標準的方法により生じる抗体の発達に存する。診断または研究用試薬としてこれらのＭＳＦｓに対して生じた抗体は、親和性−カラムおよび同等物に有用であり、その結果、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白をさらに精製し、完全に同定することができる。かかる抗体は、モノクローナルおよびポリクローナル抗体の双方のみならず既知の手法により調製したキメラ抗体または「組換え」抗体を含む。

本発明の抗体を、例えば、検出可能な標識または標識系と結合させて、生体内および生体外での診断目的に用いてもよい。別法として、これらの抗体を、例えば、ある種の毒性または治療的化合物あるいは当業者に知られた物質の一部と結合させて、治療目的に用いてもよい。これらの抗体は、研究用試薬としても有用である。

また本発明により、選択した哺乳動物に対する抗原としてＭＳＦまたはその断片を存在させ、ついで、動物細胞および癌細胞を融合させ、既知の方法で絶えることのない細胞系を作り出すことにより、細胞系が提供される。かかる細胞系およびヒト・ＭＳＦｓ蛋白あるいは本発明の組換えポリペプチドの全部または一部に向けられた抗体を生成させるのに用いる方法もまた、本発明の範囲内である。

寒旌燃以下の実施例は、同種ヒトＭＳＦの精製および特徴付けならびに本発明の他の方法および生成物を例示的に記載する。これらの実施例は説明のためのものであって、本発明の範囲を限定する意図のものではない。

実施例１　尿からの天然Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆの精製および生化学的特徴以下の手法を用いて、ヒト骨髄移植患者の尿から天然Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白を得る。同一または同様の手法を用いて天然源から他のＭＳＦを精製することもできる。他の疾患状態を伴う再生不良性貧血または血小板減少症をもつ患者からの尿を、この精製を用いる該因子の原料源として用いることもできる。

工程１　尿は、移植後５日目および１８８日目間に骨髄移植患者から収集しｔこ。

５０および１００リツトルの間のプールした尿をプロテアーゼ阻害剤フェニルメチル−スルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理した。このプールした尿をアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　ＹＭ−１０フイルター（分子量１００００カツトオカで濃縮して過剰の色素を除去し、容量を減少させた。プロテアーゼ阻害剤のカクテル［ロイペプチン、ペプスタチン、エチレングルコ−ルービス−四酢酸（ＥＧＴＡ）およびＮ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）］をこの工程および次の３つの工程で尿に添加して蛋白分解を最小化した。尿濃縮物のｐＨを８．０に調整し、７　ｍ　Ｓ　／　ｃ　ｍの伝導度まで希釈した。

工程２　次いで、精製のこの最初の工程からの残留物（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）を、ｐＨ８０にて、ＱＡＥ　Ｚｅｔａｐｒｅｐ　［クバＣｕｎｏ）］上のアニオン交換カラムクＯ’７トグラフイーに付した。ＱＡＥフロー・スルー（ｆｌｏｗ　ｔｈｒｏｕｇｈ）を１Ｍ酢酸でｐＨ４，５に調整した。

工程３．第２の精製工程からの残留物をｐＨ４，５にて、カチオン交換クロマトグラフィーカラム、Ｓ　Ｐ−Ｚｅｔａｐｒｅｐカラム［クパＣｕｎｏ）］に結合させた。Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆを含有する結合蛋白を４．５のｐＨにてＩＭ　ＮａＣ１で溶出させた。

溶出物をプールし、プロテアーゼ阻害剤を前記したごとくに添加し、結合蛋白をｐＨ７に中和し、−８０℃て貯蔵した後、工程１に記載したプロテアーゼ阻害剤１を添加して、さらにクロマトグラフィーを行うか、あるいはトリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）溶液に透析した。この透析物を５６℃で３０分間加熱した。蛋白の回収に必須ではないが、プロテアーゼ阻害剤の添加により、系におけるプロテアーゼを不活性化することによって、この工程から回収されるべき蛋白の量を増加させるのが可能となる。この工程からのプールを、巨核球特異的成長因子の存在についても分析した。これらのプールはＭｅｇ−Ｃ３Ｆ活性を含有することが判明した。

工程４・得られた物質をレクチン・アフィニティークロマトグラフィーカラム、小麦胚芽セファロースカラム［ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）］に添加した。尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆはこのカラムに結合することが判明した。次いで、この蛋白をＴＢＳ中の０．２５Ｍ　Ｎ−アセチルグルコサミン（Ｎ−ａｃｇｌｃＮＨｚ）で溶出し、工程１のプロテアーゼ阻害剤の存在下、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，５に対して透析した。

工程５：この透析物を１０ｍ１の５−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　ＦＰＬＣカチオン交換カラムに適用、し、ｐＨ４，５の２０ｍＭ酢酸ナトリウム中の０ないしＬＭ　ＮａＣｌの直線グラジェントを用いて溶出させた。この工程から溶出させた蛋白を、後記するフィブリンクロットアッセイにおけるＭｅｇ−Ｃ３Ｆ活性につきテストした。該Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ活性は２つの区別されるピーク中に溶出されることが観察された。

主要活性は領ＩＭと０．２５Ｍ　ＮａＣ１との間に溶出した。少量の、しかしながら再現性のある活性は０．３Ｍと０．５Ｍ　ＮａＣｌとの間に溶出した。２つの活性は蛋白あるいは単一の蛋白の炭水化物修飾によるものであろう、しかしながら、提示するデータでは主要蛋白につきさらに言及する。

工程６　次いで、この５番目の精製工程からの溶出を、９５％アセトニトリル中の０．１％　ＴＥＡ（トリフルオロ酢酸）を用い、逆相ＨＰＬＣ（Ｃ４）カラム［Ｖｙｄａｃ：１ｃｍＸ２５ｃｍ］上で精製した。この工程により、豊富な３０Ｋｄ蛋白汚染物が除去された。組換えＭＳＦはＢ緩衝液の約２０−３３％のわずかに低いグラジェントにて溶出する。

工程７　工程６の溶出物を２部の酢酸およびピリジノで希釈した後、ＨＰＬＣ工程を異なる溶媒系で繰り返した。精製した物質は、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（０，４６Ｘ２５ｍ）にて、ピリジノおよび酢酸中の６〜１５％間のｎ−プロパツールで溶出した。アッセイを行うと、この工程の後に生じた物質は、実施例１０のマウスアッセイにおける１ミリグラム当たり５Ｘ１０’希釈単位よりも大きな特異的活性を与えた。この任意の工程により、調製物から主要汚染物である大量の尿リボヌクレアーゼが除去される。

工程８・アセトニトリル中の０．１５％ＨＦＢＡを用い、０４カラム（Ｖｙｄａｃ＋０．４６Ｘ２５ｃｍ）でＨＰＬＣ工程を１回以上繰り返した。最後のＨＰＬＣ工程により、工程７の後に存在する実質的にすべての残存リボヌクレアーゼおよび蛋白質性汚染物が除去された。

次いで、この精製したＭｅｇ−Ｃ３Ｆ物質をＤＳＤ−ＰＡＧＥによって分析し、バイオアッセイを行い、１′Ｉて標識した。工程７を省略したこの手法から、実施例８に記載したマウス巨核球コロニーアッセイににおける蛋白１ｍｇ当たり約、５　Ｘ　１０　’ないし約２−５Ｘ１０’希釈単位の範囲の特異的活性を有する同種蛋白が得られる。活性の単位は、１ｍｌ当たりの巨核球コロニーの最大数を刺激する最大希釈の逆数と定義される。

このプロセスは、好ましくは、天然源からいずれかの天然に存在するＭＳＦ蛋白、またはその混合物を精製するのに使用する。

この尿Ｍｅｇ−Ｃ８Ｆの他の物理的および化学的特性は以下のように決定された・蛋白の分子量は、非還元条件下で２時間６０ｍＡで泳動させた１２％ゲル上のＤＳＤ−ＰＡＧＥによって測定して約３５−４５ｋＤであることが判明した。

１２％ＤＳＤ−ＰＡＧＥにての還元条件下［１０ｍＭ　ＤＴＴ　（ンチオスレイトール）］では、分子量は２２−２５ｋＤであった。尿Ｍｅｇ−ＣＳＦはホモダイマーのようである。

前記精製の工程２からの溶出物をｐＨ７，５にて、−晩、トリス緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）に透析し、次いで、０　、５　ｃｏｌ、　ｖｏｌ、　７時間にて、 −晩、２００ｍ１の小麦胚芽セファロースカラムに負荷した。負荷後、カラムをＴＢＳで洗浄して、Ａ２８０ベースラインに到達するまで非結合蛋白を除去した。尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白は小麦胚芽セファロースに結合し、ＴＢＳおよび領２５Ｍ　Ｎ−アセチルグルコサミンで溶出させたが、これは、該蛋白がグルコシル化されていることを示す。

Ｉｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１．７％ＳＤＳ、ｐＨ８，４の０．２Ｍ　ＮａＨＰＯｓおよび５ｍＭＥＤＴＡにての非還元条件下におけるＮ−グリヵナーゼ消化に際し、該尿蛋白はＮ−結合炭水化物を含有しないと決定された。

恐らくは、該蛋白は〇−結合炭水化物を含有する。尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白は、前記工程６からの溶出物の透析試料をｐＨ７，４の２０ｍ１　トリス−ＣＩにてのカラムに負荷し、２０ｍＭトリス−ＣＩおよびＩＭ　ＮａＣｌ　（ｐＨ７，４）で溶出させた場合、ヘパリンセファ０−スに結合しなかった。

０・１％ＴＦＡのＡ緩衝液、０．１％ＴＦＡ中の９５％アセトニトリルのＢ緩衝、液、ならびに緩衝液Ｂを使用する５〜１００％のグラジェントを用いるＣ４ｖｙｄａｃカラムでの逆相ＨＰＬＣで泳動させると、尿Ｍｅｇ−ＣＳＦは２０〜３５％アセトニトリルの間に溶出する。

実施例２　ゲノムＭＳＦ、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆの分析ＷＯ９１１０２００１に記載されているごとくに単離したＫｐｎ−ＳｎａＢ１１２ｋｇゲノムサブクローンを発現するＣＯ８上澄みの予備分析を行い、ＭＳＦ−特異的抗体と反応する蛋白はＣＯ８細胞によって発現され、培地に分泌されることが示された。透析した濃縮細胞上澄みはマウスＭｅｇ−コロニーアッセイで変動があるものの活性であった。

ノーザンおよびウェスタンによる分析は、ＭＳＦ　ｍＲＮＡおよび蛋白のレベルが非常に低いことを示した。条件培地で発現されたＣＯ８上澄みからの蛋白のウェスタンイムノプロットにより、過剰のペプチドとの対抗体競合によって、抗Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ蛋白抗体に特異的に結合することが示された３つの異種種の存在が明らかにされた。これらの種の分子量２００ｋＤ、３０ｋＤ、および１４ｋＤは、還元条件下（１０ｍＭ　ＤＤＴ）で６０ｍＡにて１時間泳動させた１０〜２０％グラジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥで約１６〜２１ｋＤの範囲の見かけの分子量を有するＢＭＴ尿からの部分精製Ｍｅｇ−Ｃ８Ｆとは異なる。

実施例３　組換えＭＳＦの構築および哺乳動物細胞発現公知の技術によって切形した１２のＭＳＦｃＤＮＡクローンをポリメラーゼ鎖反応を用いて構築した。１３番目のクローンＭＳＦ−に１３０が、アミノ酸１３０後のエクソン■中への人工的終始コドンの故意でない挿入によってＰＣＲ反応の間に単離された。１３のオリゴヌクレオチドプラスマーを以下のごとくに合成した：開始メチオニンコドンを挟むｃＤＮＡにハイブリダイズするようにプライマー（１）を設計した。それは、９つのＭＳＦ−同種ヌクレオチド、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ部位およびにューイングランドバイオラブズ（Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）のカタログに示唆されているごと（）制限エンドヌクレアーゼ認識を増強させる３つの追加ヌクレオチドを含有する。

該ｃＤＮＡの３゛領域にハイブリダイズし、５１７２［前記プライマー（２）コ、ＭＳＦ−Ｒ１９２［前記プライマー（３）コ、ＭＳＦ−に２０４　［前記プライマー（４）］　、ＭＳＦ−に１３０ｔ−；よびＤ２２０　［前記ブライｖ−（５）］　、Ｎ１４１［前記プライマー（６）］およびＴ２Ｏ８［前記プライマー（７）］についての推定ＭＳＦ蛋白プブロッシング部位コドンを挾むようにオリゴヌクレオチドブライマー（２）ないしく７）を設計した。これらの３°プライマーはＭＳＦ−同種配列の１２のヌクレオチド、翻訳終始コドン、ＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位および制限エンドヌクレアーゼ認識を増強させるための３つの追加ヌクレオチドを含有する。

パーキンーエルマ町シータス・コーポレーション（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　Ｃａｒｐ、　）により推薦されている条件を用い、６つのＰＣＲ反応を二連で行った。６つの二連反応の各々は、５゛プライマー（Ｎｏ、１．１．０μＭ）、３’プライマーのうちの１つ（１，０μＭ）およびＭＳＦ　ｃＤＮＡのｌｎｇを鋳型として含有するものであった。該反応は各々１８サイクルの２ラウンドを通じて行った。１のサイクルは、９５℃の２分間の変性、続いての３分間のアニーリング／７２℃の伸長よりなるものであった。１８サイクルの最初のラウンド後、最初の反応１０μ１１を新鮮な反応混合物（合計１００μｍ）に移し、増幅サイクルを反復した。販売者によって記載された条件を用い、増幅反応（全部で１２）の第２ラウンドによって生じたＰＣＲ生成物をＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分画した。

哺乳動物宿主細胞でこれらの切形ＭＳＦの発現を得るために、次いで、適当なりＮＡバンドを切り出し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ消化のｐＭＴ２１−２ベクターに結んだ。該ベクターｐＭＴ２１−２は、ＭＳＦ　ＤＮＡ断片のクローニングを容易にするために変化させた、ＰｓｔＩ、Ｎｏｔｌ、Ｋｐｎｌ、ＡｐａＩ、ＥｃｏＲＶＳＥｃｏＲＩおよびＸｈｏ１部位を含有する、ポリリンカー領域を除いてベクターｐＭＴ２１と同一である。受容能のあるＤＨ５細胞を組換えプラスミドで形質転換し、対アンピシリン耐性について選択した。形質転換細胞からプラスミドＤＮＡを調製し、ＭＳＦインサートを横切る選択された内部オリゴヌクレオチドで配列決定した。

前記にてリストしたクローンは、所望のＭＳＦ蛋白をコードする正しいヌクレオチド配列を有するものとして同定された。例えば、５１７２はセリン残基で終わるＭＳＦアミノ酸１〜１７２をコードする。１７３位は翻訳終始コドンをコードする。例外は、Ｄ２２０を合成するために設計した２つの反応のうちの１つであった。このＰＣＲ反応の間、ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３９２の偶然の欠失の結果、クローンＭＳＦ−Ｌ１３０が得られ、これはＭＳＦアミノ酸１〜１３０をコードし、続いてＴＡＡ停止コドンとなるリシンで終わる。クローンＭＳＦ−に１３０はこの目的に設計したＰＣＲ反応によって、意識的に、容易に合成され得る。これには、設計において、他の３′ブライマーオリゴヌクレオチドと同様のプライマー、すなわち、ＭＳＦ−同種配列の１２のヌクレオチド、翻訳終始コドン、Ｘｈｏ制限部位および制限エンドヌクレアーゼ認識を増強させるための数個の追加ヌクレオチドを含有するオリゴヌクレオチドの使用が必要となろう。適当な３′プライマーの例は以下の配列：ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＴＡＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴＴＴであろう。

、前記した手法をいくらか変形して６つの追加突然変異体を合成した。ＭＳＦ− Ｔ１３３　［前記プライマー（８）コ、ＭＳＦ−Ｒ１３５［前記プライマー（９）］、ＭＳＦ−Ｐ１３９　［プライマー（１０）］、ＭＳＦ−に１４４　［前記プライマー（１１）コ、ＭＳＦ−に１４７　［前記プライマー（１２）］、およびＭＳＦ−Ｅ１５７［前記プライマー（１３）］についての推定ＭＳＦ蛋白プブロッシング部位コドンを挟むｃＤＮＡの３°領域にハイブリダイズさせるために設計したオリゴヌクレオチドブライマーとの反応における５°プライマーとしてプライマー（１）を用いた。

ＰＣＲ反応は二連で行ったが、それは、（反応の最初のセットからの）５°ブライ７−（ＮＯ，１，１，０μＭ）　、３’プライマーの１つ（１，０μＭ）およびＭＳＦ−Ｒ１９２の１μｇを鋳型として含有していた。１８の２ラウンドよりなる２５サイクルを通じて反応を行った。

販売者によって記載されている条件を用い、ＰＣＲ生成物をＮｏｔＩおよびＸｈｏｌで消化し、アガロースゲル電気泳動によって分画した。次いで、適当なりＮＡバンドを切り出し、ｐＥＤ４ＤＰＣ−ＩＮＯＴ／ＳＡＬ、ｐＭＴ２１誘導体に結んだ。

発現は以下のごとくに達成された＋ＭＳＦ　ＤＮＡ配列を含有するＰＭＴ２１− ２プラスミドをＣＯ８細胞にトランスフェクトする。トランスフェクトしたＣＯ８細胞からの条件培地は、マウスアッセイで測定して、ＭＳＦ生物学的活性を含有する。同様に、ＭＳＦについてのｃＤＮＡを含有する修飾ｐＥＤ４ＤＰＣ−１構築体をＣＨＯ細胞にトランスフェクトする。

ベクターｐＥＤ４ＤＰＣ−１はｐＭＴ２１ベクターから誘導できる。ｐＭＴ２１を、２つの隣接するクローニング部位でプラスミドを切断するＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで切断する。５０８塩基対のＥＭＣＶ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＴａｑＩでｐ　Ｍ　Ｔ　２　Ｅ　ＣＡ　Ｔ　＋　［ジョン・ニス・ケイ（Ｊｏｎｇ、　Ｓ、　Ｋ、　）ら、ジャーナル・オブ・パイロロジ−（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、）６３　：１６５１　１６６０　（１９８９）］から切り出す。６８ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドの対を合成してＡＴＧまでのＥＭＣＶ配列を複製する。ＡＴＧをＡＴＴに変化させ、Ｃを添加し、３゛末端でＸｈｏｌを生じさせる。Ｔａｑ１部位は５゛末端に位置する。オリゴヌクレオチドの配列は：および各相補鎖である。

ｐＭＴ２１　ＥｃｏＲＩないしＸｈｏＩ断片をＥＭＣＶＥｃｏＲＩないしＴａｑｌ断片に、およびＴａｑｌ／Ｘｈｏｌオリゴヌクレオチドに結んで、ベクターｐＥＤ４を得る。ＰｓｔＩ、ＮｏｔＩ、５ａｌＩ、５ｎａＢＩおよびＥｃｏＲ１部位を含有するポリリンカーを前記したごとくにこのベクターに挿入してｐＥＤ４ＰＣ−１を得る。

次いで、実施例８で後記するごとき標準的な免疫学的、生物学的または酵素的アッセイによって、安定な形質転換体を産物の発現につきスクリーニングする。

ＭＳＦポリペプチドをコードするＤＮＡおよびｍＲＮＡの存在はサザーンおよびノーザンブロツティングのごとき標準的な手法によって検出される。適当な宿主細胞への発現ベクターＤＮＡの導入後数日間におけるポリペプチドをコードするＤＮＡの一時的発現は、活性または免疫学的アッセイ、例えば、培地中の蛋白のマウス・フィブリンクロットアッセイによって選択することなく測定される。

実施例４　ＣＯ３細胞からのＭＳＦ−に１３０の精製および生化学的特徴付け３工程精製プロセスを用い、ＭＳＦ−に１３０でトランスフェクトしたＣｏ５−１細胞からの無血清条件培地の最初の３Ｌバツチにより、精製した活性ＭＳＦ蛋白１４０μｇが得られた。無血清条件下で収穫したＣＯ５−１細胞条件培地を、１００００ダルトンの分子量カットオフのアミコン（Ａｌｌｌｉｃｏｎ）ＹＭ　１０膜で濃縮した。濃縮物を、４℃にて、５Ｓ３４０−ター中、１１００００ｒｐで遠心して細胞夾雑物および沈殿を除去した。上澄みを４℃にて、−晩、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）に対して透析した。透析した蛋白溶液を低速で再度遠心して残存する沈殿を除去した。透析ＭＳＦ−に１３０を含有する溶液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）で平衡化したＳ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカチオン交換ＦＰＬＣカラムに適用した。結合蛋白を、室温にて、２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４，５）中の０ないしＩＭ　ＮａＣ１のグラジェントで溶出した。この工程から溶出した蛋白を、後記するフィブリンクロットアッセイでＭｅｇ−Ｃ３Ｆ活性につきテストした。

ＭＳＦ−に１３０は０．１ないし０．２Ｍ　ＮａＣ１間に溶出した。活性ＭＳＦピークは、非還元条件下の２Ｏ−４５ｋＤとｌＱｍＭ　ＤＴＴ還元条件下の１８ −２１ｋＤとの間の、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　１０−２０％グラジェントポリアクリルアミドゲルによる分子量を有することが観察された。ＭＳ　Ｆ−Ｋ　１３０　Ｓ　ｔｏｙ。

ＦＰＬＣ画分の分子量は、抗Ｍｅｇ−Ｃ８Ｆペプチド・ウサギ抗血清を用いるＳ　ｔｏｙｏｐｅａｒ１画分のウェスタンプロットによって決定した。

非還元条件下の分子量に基づき、活性ＭＳＦ−に１３０のプールを３つのアリコツトに分けた。プールＡはかなり高分子量のダイマー３５−４５ｋＤよりなるものであった。プールＢは２Ｏ−４５ｋＤの範囲の中間分子量のダイマ一種よりなり：ブールＣはほとんどが１４−２５ｋＤの分子量範囲のモノマーよりなるものであった。すべての３つのプールからのＭＳＦは還元条件下で１８−２５ｋＤの分子量を有していた。

最終精製工程は逆相ＨＰＬＣの１サイクルであった。３つのプールからの蛋白を１０％ＴＦＡないしＯ６１％Ｔ　Ｆ　Ａ　（Ｖ／Ｖ）で酸性化し、０．４５μｍ　ＰＶＤＦ膜を通して濾過し、室温にて領１％ＴＦＡで平衡化した２５ｃｍＸ４．６ｍｍＣ４（Ｖｙｄａｃ）逆相ＨＰＬＣカラムに１ｍ１／分で注射した。結合蛋白を０．１％ＴＦＡ中０〜９５％アセトニトリルの直線グラジェントで溶出させた。典型的には、Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ活性は１５〜３０％緩衝液Ｂで溶出した（０．１％ＴＦＡ中９５％中上５ニトリル）。

ＭＳＦ−に１３０の分子量は、非還元条件下に、６０ｍＡで１時間泳動させる１０〜２０％ゲルにての５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定して２０〜４５ｋＤの範囲であった。１０ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）の還元条件下では、当該物質は１８〜２１ｋＤの分子量であり、主要種は約１９ｋＤで検出された。

非還元条件下または１ｍｇ／ｍｌ　ＢＳＡ、１．７％ＳＤＳ、ｐＨ８，４の０．２Ｍ　ＮａＨＰＯａおよび５ｍＭ　ＥＤＴＡ中の１０ｍＭ　ＤＴＴ還元条件下でのＮ−グルカナーゼ消化に際し、ＭＳＦ−に１３０蛋白はＮ−結合炭水化物を含有しないと決定された。ＭＳＦ−に１３ｏ蛋白はＪａｃａｌｉｎ　Ｃアガロース、〇−結合炭水化物結合レクチンに結合し、これは、〇−結合炭水化物の存在を示す。

特に、ＭＳＦ−に１３０でトランスフェクトしたＣＯ３−１細胞からの無血清条件培地を、０．１７５Ｍ　）リス−Ｃｌ、０．１５Ｍ　ＮａＣ１，０，１ｍＭＣａＣｌ２　ｐＨ７，４緩衝液に透析した。透析した物質２ｍｌを、同緩衝液で平衡化した１ｍｌのＪａｃａｌｉｎ　Ｃアガロースに添加し、４℃で一晩該樹脂に結合させた。Ｊａｃａｌｉｎ　Ｃアガロースに結合しなかった蛋白溶液を収集し、１０カラム容量の出発緩衝液で樹脂を洗浄した。Ｊａｃａｌｉｎ　Ｃアガロース樹脂に結合した蛋白は出発緩衝液＋２０ｍＭαメチルガラクトピラノシドで溶出させた。ＭＳＦ−に１３０は、抗Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆペプチド・エサギ抗血清を用いるウェスタンイムノプロットによると、Ｊａｃａｌｉｎ　Ｃ溶出物に検出されたがＪａｃａｌｉｎ　Ｃ非結合には検出されなかった。

ＭＳＦ−に１３０蛋白は標準的な結合条件下でヘパリンアガロースに結合しなかった。特に、ＭＳＦ−に１３０でトランスフェクトしたＣＯ３−１細胞からの無血清条件培地２ｍｌを２０ｍＭ）リス−ＣＩ　（ｐＨ７，４緩衝液）に透析した。

透析した蛋白溶液を、同一緩衝液で平衡化した０、２ｍｌアガロースカラムに負荷し、４℃で一晩樹脂に結合させた。ヘパリンアガロースに結合しなかった蛋白溶液を収集し、樹脂を１０カラム容量の出発緩衝液で洗浄した。ヘパリンアガロースに結合した蛋白は２０ｍＭｈリスーＣＬ　ＩＭ　ＮａＣＬ　ｐＨ７，４で溶出した。抗Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆペプチド・ウサギ抗血清を用いるウェスタンイムノプロットによると、ＭＳＦ−に１３０はヘパリン非結合中に検出されたが、ヘパリン結合中には検出されなかった。

、０１％ＴＦＡの緩衝液Ａ、０．１％ＴＦＡ中の９５％アセトニトリルのＢ緩衝液、および直線グラジェントを用いる（：４　Ｖｙｄａｃカラムでの逆相ＨＰＬＣで泳動させると、ＭＳＦ−に１３０は２０〜３５％アセトニトリル間に溶出した。理論的等電点は５．７６と計算された。

ＭＳＦ−に１３０の特異的活性は、実施例１０に記載したマウス巨核球コロニーアッセイにおいて蛋白１ｍｇ当たり１．９Ｘ１０’ないし８．６Ｘ１０’希釈単位の範囲であった。

実施例５　４Ａλ　ｃＤＮＡクローンの単離（図１のアミノ酸１〜９２４に対応し、従って、ＭＳＦ−Ｌ９２４ともいう）組換え４ＡλｃＤＮＡクローンは、標準的な分子生物学技術によって単離できる。

ＣＯ８細胞をＫｐｎ−８ｎａＢ１ゲノムサブクローンでトランスフェクトし、これらの細胞からポリＡ’ＲＮＡを単離する。ｃＤＮＡラライブラリーは、ストラタジーン・インコーホレイテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎｃ、　）から入手可能なりローニングベクターＬＡＭＢＤＡ　ＺＡＰＩ：：ＥｃｏＲＩでアダブトしたｃＤＮＡをサブクローンすることによってこのＲＮＡから調製する。該ライブラリーを構成する組換えファージを平板培養し、二連のニトロセルロースおよび／またはナイロンレプリカを該平板で作成する。

エクソン１１■、■、■、■および■を含有するクローンは、３！Ｐ標識オリゴヌクレオチドプローブで該レプリカをプローブすることによって同定する。該プローブは、連続するエクソン間の結合にわたるように設計した２４量体であり、例えば、エクソンＩに相補的な１２ヌクレオチドおよびエクソン■中の直ぐ隣のヌクレオチドに相補的な１２ヌクレオチドをもつプローブである。ハイブリダイゼーションおよびオートラグオグラフィーにより、フィルターから０．ｌＮＮａＯＨで放射能活性を除去でき、エクソン■および■間の結合にわたるオリゴヌクレオチドで再プローブできる。両プローブにハイブリダイズするファージを同定し、再度平板培養し、ｍ／■およびＩＶ／Ｖにわたるオリゴヌクレオチドでプローブする。両プローブにハイブリダイズするファージを同定し、再度平板培養、し、Ｖ／Ｖｌ結合にわたるオリゴヌクレオチドでプローブする。エクソンＶを含有するクローンの低頻度のため、このエクソンを含有するクローンがまず同定されるならば最も容易である。

ストラタジーン・インコーホレイテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　Ｉｎｃ、　）により記載されそこから入手可能な自動切出プロトコル（＾ｕｔｏｍａｔｉｃ　Ｅｘｃｉｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）を用いることによって、選択したファージクローン内のＭＳＦインサートを切り出す。これにより、ベクターＰｂ１ｕｅｓｃｒｉｐｔ　Ｓ　Ｋ−にサブクローンが得られる。これらのクローンは制限マツピングおよびＤＮＡ配列決定によって特徴付けられ、図１のＭＳＦ　ｃＤＮＡ配列と比較することによって確認される。単離した１のクローン（クローンｒ２１ＡＪという）はエクソン■、■、■、■およびＶのすべてを含有するが、エクソン６ないし５ｎａＢ１部位のすべてを含有しなかった。

エクソン■、■、■、■、■のすべておよびエクソン■中の５ｎａＢ１部位にいたるまでを含有するクローンは以下のごとくに調製した。クローン２１Ａを酵素ＡｃｃｌおよびＮｏｔｌで消化した。ヒト・ゲノムクローン１８−５６６５をＡｃｃＩおよび５ｎａＢＩで消化した。画情化からの適当なＭＳＦ　ＤＮＡ断片を電気泳動によりアガロースゲルから単離し、−緒に結んだ。結んだ生成物を酵素Ｎｏｔｌおよび５ｎａＢＩで消化し、電気泳動によって再度分離し、Ｎｏｔｌ− ＡｃｃＩ　：　：ＡｃｃＩ−８ｎａＢＩ連結生成物に対応するバンドを精製した。

この断片をＮｏｔｌおよびＥｃｏＲＶ消化のｐＭＴ２１−２にサブクローンし、前記したごとくに細菌細胞に形質転換してクローン４Ａλを得た。

該４Ａλクローンは、その３°末端に、該ベクターによってコードされるいくつかの追加アミノ酸を含有する。このクローンにおける最後の数個のアミノ酸はＫＴＴＥＲＤＬＨＨＬＰＥＦＬＥＰＳＷＦＤＨ＊である。下線を施したアミノ酸はＭＳＦ遺伝子に見い出されず；該＊は終始コドンを示す。これらの追加非ＭＳＦアミノ酸を含有しないクローンは、前記したＮｏｔＩ−ＡｃｃＩ　：　：ＡｃｃＩ−５ｎａＢＩ断片を、ポリリンカー中の５ｎａＢＩ部位、続いて枠内翻訳終始コドンを含有するｐＭＴ２１誘導体に結ぶことによって構築できる。かかる配列の例はＴＡＣＧＴＡＣＡＴＡＡである。５ｎａＢＩ部位はＴＡＣＧＴＡであり、ＴＡＡは、産生された蛋白がＭＳＦアミノ酸のみを含有するように枠内終始コドンをコードする。

別法として、エクソンＶＩＳｎａＢ１部位への配列を含有するクローンが得られるならば、それは制限酵素ＮｏｔｌおよびＸｈｏｌでの消化によって直接発現させることができる。ＭＳＦインサートはアガロースゲルへの電気泳動によりベクターＰｂ１ｕｅｓｃｒｉｐｔから分離し、切り出し、ＮｏｔｌおよびＸｈｏｌ消化の発現ベクターｐＭＴ２１−２に結ぶ。受容能のある細菌細胞を形質転換し、アンピシリンに対する耐性につき選択する。細菌から調製したプラスミドＤＮＡは標準的な技術を用いてＣＯ８細胞にトランスフェクトする。

実施例６　ｃｏｓ細胞からの（４ａλ）の精製および生化学的特性３工程精製プロセスを用い、組換えＭＳＦ４ａλ（ＭＳＦ−Ｌ９２４）を５Ｌ　ＣＯ３−１細胞条件培地から精製した。無血清条件下で収穫したＣＯ５−１細胞条件培地を、１００００ダルトンの分子量カットオフのＹＭＩＯアミコン膜で濃縮した。４℃ にて、５５３４０−ター中、濃縮物を１１０００Ｏｒｐで遠心して細胞夾雑物および沈殿を除去した。

４℃にて、上澄みを２０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５，０，０，０２％ツイーン２０に対して一晩透析した。透析した蛋白溶液を再度低速遠心して残存する沈殿を除去した。透析したＭＳＦ　４ａλ含有溶液を、４℃で２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．２％ツイーン２０、ｐＨ５，０で平衡化したジエイ・ティ・ペイカー・カンパニー（Ｊ、　Ｔ、　Ｂａｋｅｒ　Ｃｏｍｐａｎｙ）から入手可能なＰＥＩアニオン交換カラムに適用した。次いで、該カラムを１０カラム容量の平衡緩衝液で洗浄し、ＭＳＦ４ａλを平衡緩衝液中の１および２ＭＮａＣｌで溶出させた。抗Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆペプチド・ウサギ抗血清を用いるウェスタン・イムノプロットおよびマウス骨髄巨核球コロニー形成アッセイによる活性によると、組換えＭＳＦ　４ａλは精製画分に検出された。

組換えＭＳＦ　４ａλを含有するＰＥＩ溶出を４℃にて一晩ＴＢＳに透析した。

輯換えＭＳＦ４ａλを含有する透析ＰＥＩ画分を、ＴＢＳｐＨ７，４で平衡化したヘパリンＴｏｙｏｐｅａｒｌ　Ｆ　Ｐ　Ｌ　Ｃカラムに適用した。樹脂を１０カラム容量のＴＢＳで洗浄し、室温において、組換えＭＳＦ４ａλは段階的溶出法にて０．３および０．５Ｍ　ＮａＣ１で溶出した。最終精製工程はＲＰ−ＨＰＬＣの１サイクルであった。０，３および０．５Ｍ　ＮａＣｌヘパリンＦＰＬＣ溶出からの蛋白を１０％ＴＦＡないし０．１％Ｔ　Ｆ　Ａ　（ｖ／ｖ）で酸性化し、０．４５５ミフロンＰＶＤ膜を通して濾過し、室温にて０．１％ＴＦＡ中で平衡化した２５ｃｍＸ４．６ｍｍＣ４（Ｖｙｄａｃ）逆相カラムに１ｍ１／分で注射した。結合蛋白は０．１％ＴＦＡ中の５〜９５％アセトニトリルの直線グラジェントで溶出させた。典型的には、組換えＭＳＦ　４ａλ活性は１５〜３０％緩衝液Ｂ間で溶出した（０．１％ＴＦＡ中の９５％アセトニトリル）。

精製した組換えＭＳＦ４ａλの分子量は４〜２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥによって測定し、銀染色およびウェスタンイムノプロットによって検出した。主要組換えＭＳＦ４ａλ蛋白は２００ｋＤよりも大きく、より小さい形態は１５ないし７０ｋＤ間の範囲の分子量で存在する。

ＭＳＦ４ａλはＣＯ３−１細胞条件培地からの数種の異なる分子量の蛋白形態を含有する。これらの形態は、１５ないし２００ｋＤ非還元および還元の範囲の分子量を有する。最低分子量を有する蛋白形態は標準的な結合条件下でヘパリンアガロースに結合せず、これは、この蛋白がヘパリン結合ドメインを有しないことを示す。すべての他の蛋白形態は標準的な結合条件下でヘパリンアガロースに結合し、これは、これらの蛋白形態がヘパリン結合ドメインを含有することを示す。詳しくは、４ａλでトランスフェクトしたＣＯ３−１細胞からの条件培地３０ｍ１を１００００ｋＤの分子量カットオフをもつＹＭＩＯ膜で濃縮した。４℃にて、５Ｓ３４０−ター中、濃縮物を１１００００ｒｐで一晩遠心して細胞夾雑物および沈殿を除去した。濃縮物を２０ｍＭトリス−ＣＩ　ｐＨ７，４緩衝液に透析した。透析した物質の２ｍｌを、同緩衝液で平衡化した１ｍｌヘパリンアガロースに添加し、４℃で一晩結合させた。ヘパリンアガロースに結合しなかっ、た蛋白溶液を収集し、樹脂を出発緩衝液の１０カラム容量で洗浄した。ヘパリンアガロースに結合した蛋白を２０ｍＭトリ；ｚ、−Ｃ１ＩＭＮａＣＩ、ｐＨ７，４で溶出させた。ウェスタンイムノプロットによると、４ａλ蛋白はヘパリン非結合およびヘパリン結合画分で検出された。ヘパリン非結合画分中の蛋白の分子量は非還元の標準的な１０−２０％グラジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で２５ｋＤ、および還元条件下で１８ｋＤであった。ＭＳＦヘパリン結合蛋白の分子量は、非還元および還元の標準的な１０〜２０％グラジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥ条件下で２０ないし２００ｋＤの間であった。

ＭＳＦ４ａλ蛋白は標準的な結合条件下で、レンチル・レクチンセファロースまたはＣｏｎＡセファロースに結合しなかった。詳しくは、４ａλでトランスフェクトしたＣＯ５−１細胞からの条件培地６０ｍ１を１００００ｋＤ分子量カットオフのＹＭＩＯ膜で４ｍｌまで濃縮した。４℃にて、５Ｓ３４０−ター中、濃縮物を１１００００ｒｐで一晩濃縮して細胞夾雑物および沈殿を除去した。濃縮物の半分をＴＢＳに透析し、第２の半分を１ｍＭ　ＭｎＣＬ、１ｍＭ　ＣａＣＩｔを含有するＴＢＳに透析した。ＴＢＳに透析した濃縮物質２ｍｌを、同緩衝液で平衡化したレンチル・レクチンセファロースカラムに負荷し、４℃で一晩結合させた。レンチル・レクチンセファ０−スに結合しなかった蛋白溶液を収集し、樹脂を１０カラム容量の出発緩衝液で洗浄した。レンチル・レクチンセファ０−スに結合した蛋白は０．２５Ｍαメチルマンノピラノシドを含有するＴＢＳで溶出した。抗Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆペプチド・ウサギ抗血清を用いるウェスタンイムノプロットによると、ＭＳＦ４ａλはレンチル・レクチンセファロース非結合画分に検出されたが、レンチル・レクチンセファロース結合画分には検出されなかった。

同様に、１ｍＭ　ＭｎＣＩ、、１ｍＭ　ＣａＣｌ、を含有するＴＢＳに透析した濃縮物質２ｍｌを、同緩衝液で平衡化したＣｏｎＡセファロースカラムに負荷し、４℃で一晩結合させた。ＣｏｎＡセファロースに結合しなかった蛋白溶液を収集し、樹脂を１０カラム容量の出発緩衝液で洗浄した。ＣｏｎＡセファロースに結合し、ノピラノシドを含有するＴＢＳで溶出した。ＭＳＦは、抗Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆペプチド・ウサギ抗血清を用いるウェスタンイムノプロットによると、ＣｏｎＡ非結合画分に検出されたが、ＣｏｎＡ結合画分には検出されなかった。

Ｎ５Ｆ４ａλの理論等電点は９８８である。

直線グラジェントにて、０．１％ＴＦＡのＡ緩衝液、０．１％ＴＦＡ中の９５％アセトニトリルのＢ緩衝液を用いるＣＪｖｙｄａｃカラム上の逆相ＨＰＬＣで泳動させると、ＭＳＦ４ａλは１５〜３０％アセトニトリルの間で溶出した。ＭＳＦ４ａλの特異的活性は、実施例１０のマウス巨核球コロニーアッセイにおける蛋白１ｍｇ当たりｌＸｌ０’およびｌＸｌ０’希釈単位の間であった。

炭水化物組成分析は、メタツリシス、続いての遊離した単糖のトリメチルシリルエーテルへの誘導体化および続いてのクランプ（Ｃ１ａ＋ａｐ）ら［糖蛋白、その組成、構造および機能（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、　ｔｈｅｉｒ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ、　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎj、パートム１セクション６、Ｃｈ、３、エルセビエ・パブリケーション（ＥｌｓｅｖｉｅｒＰｕｂｌ、）　（１９７２）およびレインフォールド（Ｒｅｉｎｈｏｌｄ）、メト・エンザイモル（Ｉｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）２５　：　２４４− ２４９　（１９７２）　］の手法によるガスク０７トグラフイーによって、精製した物質３０μｇにつき行った。１００ｋＤの見かけの分子量に基づき、４ａλ ナノモル当たりの糖ナノモルの比は以下の通りである。

ガラクトース　７３ＧａｌＮＡｃ　９１ＧｌｅＮＡｃ　９シアル酸　１４フコースおよびマンノースは分析した試料では検出不可能であった。

ＮＭＲ分光分析により、この広範な翻訳後に一結合グリコシル化の存在が確認当業者ならば、暗号配列を挟むいずれのヒト調節配列も除き、エクソン■の噛−動物分泌配列を除去し、次いで細菌調節配列を挿入して、細菌により本発明のＭＳＦポリペプチドの細胞内および細胞外発現用の細菌ベクターを得ることによって、ＭＳＦホリペプチドをコードする配列を操作できるであろう。当該分野で公知のごとく、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを異なるコドンを含有するようさらに修飾して細菌発現を最適化することもできる。

成熟ＭＳＦをコードする配列を、やはり当該分野で公知の方法によって、該成熟ＭＳＦポリペプチドの細菌発現、分泌およびプロセッシングを可能にする分泌リーダーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に枠内にて作動可能に連結する。かかる分泌系を用いるイー・コリでのＭＳＦの発現は、活性ポリペプチドの分泌を生じると期待される。このアプローチにより、活性キメラ抗体断片が得られている［例えば、ビター（Ｂｉｔｔｅｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２４旦：１０４１−１０４３　（１９８３）］。

別法として、ＭＳＦはイー・コリにて細胞質蛋白として、直接に、あるいはイー・コリにおける可溶形態の多（のペプチドを維持できるチオレドキシンのごとき蛋白に対するカルボキシ末端融合として発現され得る。分子に融合させるのに使用するアミノ酸配列に応じて、酵素切断（エンテロキナーゼ、因子Ｘａ）または化学切断（ヒドロキシルアミン）を用い、該融合蛋白を切断し、遊離ＭＳＦを単離できる。

細胞質ＭＳＦまたはＭＳＦ融合蛋白が封入体で発現されるならば、いずれかの分子は、たいていの場合、プロセスが当該分野で知られている塩酸グアニジンおよび還元剤での完全な変性の後再度折り畳まれるようである。細胞内発現蛋白の単離および再折畳の手法については、例えば、米国特許第４５１２９２２号を参照されたし。ＭＳＦ蛋白またはＭＳＦ融合蛋白がイー・コリでの発現後に溶液中で留まるならば、正しいジスルフィド架橋を生じるために、変性は必要でな（、温和な酸化のみが必要のようである。

次いで、細菌宿主細胞におけるいずれかの経路を通じての発現された化合物を回収し、精製し、および／または、すべて公知の方法によって、物理化学的、生、初学的および／または臨床的パラメーターに関して特徴付けできる。

実施例８　チオレドキシン−ＭＳＦ融合発現ＭＳＦは、以下のごとく、チオレド千ソン融合蛋白としてイー・コリにて高レベルで発現できる。例として、ＭＳＦ −に１３０を使用した。イー・コリにおける発現については、分泌リーダーをコードするエクソンＩの最初の２５アミノ酸をＭＳＦ−に１３０配列から除去した。エンテロキナーゼ部位ＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓをＭＳＦ−に１３０のエクソン■の５°末端に挿入した。加えて、ＭＳＦのＮ−末端Ａｓｐを欠失し、ヒドロキシルアミン切断部位をコードする配列ＡＡＣＧＧＴによってコードされるジペプチドＡｓｎ−Ｇｌｙで置き換えた。チオレドキシンへの融合として添加され、イー・コリでの好ましい発現のためのある種のコドン変化を含有するＭＳＦ−に１３０の配列を図３に示す。

発現に用いるプラスミド発現ベクターを図４に示す。それは、以下の主要な特徴を含有する。

ヌクレオチド１〜２０６０は、宿主イー・コリ株において抗生物質アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ用の遺伝子、およびｃｏｌＥｌ−由来の複製起点を含有する配列を含めたプラスミドｐＵＣ−１８［ノラングー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）ら、ジーン（Ｇｅｎｅ）２６　：１０１−１０６　（１９８３）］からのＤＮＡ配列を含有する。ヌクレオチド２０６１−２２２１は、３つのオペレータ配列−〇Ｌ１、ＯＬ２およびＯＬ３を含めた、バクテリオファージλ ［サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）１６２　：　７２９　７７３　（１９８２）］の主要左側プロモーター（ｐＬ）についてのＤＮＡ配列を含有する。オペレーターはλｃｌレプレッサー蛋白についての結合部位であり、その細胞内レベルはｐＬからの翻訳開始量を制御する。

ヌクレオチド２２２２〜２２４１はバクテリオファージＴ７［ダンおよびシュティドウール（Ｄｕｎｎ　ａｎｄ　５ｔｕｄｉｅｒ）、ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）、１６６　：　４７７−５３５　（１９８３）］の遺伝子１０のそれに由来する強力なリポソーム結合配列を含有する。

ヌクレオチド２２４２−２５６８はイー・コリのチオレドキシン蛋白［リム（Ｌｉａｒ）ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　）　１６３　：　３１１−３１６　（１９８５）］をコードするＤＮＡ配列を含有する。このプラスミド中のチオレドキシン暗号配列の末端には翻訳終止コドンはない。

ヌクレオチド２５６９−２５８３は、短く、親水性で、柔軟なスペーサーペプチドｒ−−ＧＳＧＳＧ−−Ｊについてのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有する。ヌクレオチド２５８４−２５９８は、エンテロキナーゼ（ＥＣ３，４，４，８）の切断認識部位についてのアミノ酸配列、ｒ−−ＤＤＤＤＫ−Ｊ　［マロ（Ｍａｒｏｕｘ）ら、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ、　）］をコードするＤＮＡ配列を提供する。

ヌクレオチド２５９９−３１３２は、成熟蛋白で通常見い出されるＮ−末端プロリル−残基につき欠失された、成熟ヒトＩＬ−１１［ボウル（Ｐａｕｌ）ら、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）８７　：　７５１２−７５１６　（１９９０）］の修飾形態のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を含有する。該配列はＩＬ−１１配列の３′末端の翻訳終止コドンを包含する。

ヌクレオチド３１３３−３１５９は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する［リンカ−Ｊ　ＤＮＡ配列を提供する。ヌクレオチド３１６０−３２３２はイー・コリａｓｐＡ遺伝子［タカギ（Ｔａｋａｇｉ）ら、ヌクレイツク・アシズ・リサーチズ（Ｎｕｃｌ、＾ｃｉｄｓ、Ｒｅｓ、）１３　：２００６３−２０７４　（１９８５）コのそれに基づき転写終止配列を提供する。ヌクレオチド３２３３− ３６３２はｐＵＣ−１８に由来するＤＮＡ配列である。

このプラスミドを以下の方法で修飾して、バクテリオファージＴ７のリポソーム結合部位をλＣ■のそれで置き換える。前記プラスミドにおいて、ヌクレオチド２２２２および２２４１は常法により除去した。それらのヌクレオチドの代わりに、前記にて引用したサンガーら（１９８２）に開示され記載されているバク、テリオファ−シラムダからのヌクレオチド３５５６６ないし３５４７２および３８１３７ないし３８３６１によって形成されたヌクレオチドの配列を挿入した。

修飾されたｐＡＬｔ　ｒｘＡ／ＥＫ／Ｉ　Ｌ■ΔＰｒｏ−５８１（ヌクレオチド２５９９−３１３５）中のヒトＩＬＩＩをコードするＤＮＡ配列を図３に示した配列によって置き換える。

ダゲルトおよびエーリッヒ（Ｄａｇｅｒｔ　ａｎｄ　Ｅｈｒｌｉｃｈ）　［ジーン（Ｇｅｎｅ）　６　：　２３（１９７９）］の手法によって、得られたプラスミドをイー・コリ宿主株ＧＩ７２４（Ｆ−１上ａｃ　Ｉ”、±ａｃＰ”、ａｍｐＣ：：λＣｉつに形質転換した。非形質転換宿主株イー・コリＧＩ７２４を、適用される法律および規則に従う特許目的で、１９９１年１月３１日、メリーランド州、ロックビル、バークローン・ドライブ１２３０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ、５５１５１の下で寄託した。形質転換体を、０．５％ｗ／ｖグルコース、０．２％Ｗ／Ｖカザミノ酸および１００μ ｇ／ｍ＋アンピシリンを補足したＭ９培地［ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、「分子遺伝学における実験（Ｅｘｐｅｒｉａ＋ｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＧｅｎｅｔｉｃｓ）Ｊ　、コールド・スプリング・ハーバ−研究所、ニューヨーク州（１９７２）］よりなる、ＩＭＣ培地を含有する１、５％ｗ／ｖ寒天平板で選択した。

サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａ１ｗ＋ｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）　ｔ　ｒ　ｐプロモーター／オペレーター配列の転写制御下におかれている、ａｍｐＣ座における染色体に安定に組み込まれた野生型λｃＩリプレッサー遺伝子のコピーをＧＩ７２４は含有する。ＧＩ７２４において、λｃｌ蛋白は、最小培地または前記したＩＭＣのごときカザミノ酸を補足した最小培地のような無トリプトファン培地での増殖の間にのみつくられる。トリプトファンをＧＩ７２４の培養に添加すると、ｔｒｐプロモーターを抑制し、λｃｌの合成をオフとし、それが細胞中に存在すると、ｐＬプロモーターからの転写の誘導を徐々に引き起こす。

含ＭＡＦプラスミドで形質転換したＧＩ７２４を、３７℃にて、ＩＭＣ培地中、０．５のＡｓｓ。まで増殖させた。トリプトファンを添加して１００μｇ／ｍｌの最終濃度とし、培養をさらに４時間インキュベートした。

、すべてのチオレドキシン−ＭＳＦ融合蛋白は、可溶性細胞画分に見い出され、１０％までの合計蛋白を示した。融合蛋白は熱に安定であり、１５分間の８０℃ 処理の後にも可溶性であった。融合蛋白は実施例１０に記載したフィブリンクロットアッセイにおいて生物学的活性を示した。

実施例９　他の発現系昆虫細胞におけるＭＳＦポリペプチドの発現用の昆虫ベクターの構築に操作を施すことができる［例えば、欧州特許出願１５５４７６号に記載されている手法参照］。

同様に、酵母ベクターは、前駆体をコードするｃＤＮＡを発現する酵母調節配列を用いて構築できて、酵母細胞にて、分泌された細胞外活性ＭＳＦが得られる。

別法として、ポリペプチドは酵母にて細胞内発現でき、該ポリペプチドを単離し、再度折り畳まれて活性ＭＳＦが得られる［例えば、ＰＣＴ出願ＷＯ３６１００６３９および欧州公開ＥＰ１２３２８９号参照コ。

実施例１０　ヒトＭＳＦの生物学的活性実施例１に記載した精製床Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆ、および粗製もしくは高度に精製された組換えＭＳＦ−に１３０の調製物を用いて以下のアッセイを行った。他の組換えまたは天然存在ＭＳＦは、本明細書中の教示に従い、これらの同一アッセイにて、ＭＳＦ生物学的特性および活性につきテストできる。別法として、当該分野で公知の他のアッセイを用いて生物学的活性につき本発明のＭＳＦをテストできる。

Ａ、マウス・フィブリンクロットアッセイ実施例１の精製の工程７から得られたＭｅｇ−Ｃ３Ｆを、ニス・クリヤ（Ｓ、Ｋｕｒｉｙａ）ら［エクスプ・ヘマトル（Ｅｘｐ、　Ｂｅｍａｔｏｌ、　）、１５　：　８９６−９０１（１９８７）］に実質的に記載されているように行った巨核球コロニー形成アッセイで活性につきテストした。６−ウェル平板中に２．５ｘｌＯｓマウス骨髄細胞を含有するフィブリンクロットが形成された。希釈した試料をクロットの周りに重ね、６日間インキュベートした。しかる後、細胞を固定し、巨核球をアセチルコリンエステラーゼ、マウス巨核球用の特異的マーカーにつき染色した。コロニーは単位領域当たり３またはそれ以上の巨核球と定義した。

巨核球コロニーを含有する純粋コロニーおよび混合コロニーの混合物が通常観察された＝７０％の純粋巨核球コロニーは追加の細胞タイプを含有しない＝３０％の混合巨核球コロニーは、アッセイに応じて、追加の非巨核球細胞タイプないし５０％純粋、５０％混合タイプを含有する。純粋コロニーは、典型的には、コロニー当たり３ないし８細胞の範囲の、コロニー当たり平均４ないし５細胞を含有していた。コロニー内の細胞はサイズが変動し、成熟および非成熟巨核球の双方を含有しているように見える。巨咳球はコロニー内に十分に分散していた。典型的な混合巨核球コロニーは、７ないし１７細胞の範囲で、コロニー当たり平均１０細胞よりなる。細胞は純粋巨核球コロニーにおける巨核球よりも密集しているようである。

以下の対照試料をいずれのアッセイにも含ませた。陽性対照は、クロット当たり７〜２５（平均１２）の巨核球コロニー、はぼ５０％純粋および５０％混合巨核球コロニーを産生じたＷＥＨＴ条件培地（マウス１ｌ−３）であった。もう１つの陽性対照は、血小板計数の最低点または低い点において致死的に放射されたイヌから採取した血清であり［マズール（Ｍａｚｕｒ）ら、エクスプ・ヘマトル（ＥｘｐＢｅｍａｔｏｌ、）１３：１１６４−１１７２］、クロット当たり６〜２２（平均１５）の巨核球コロニーを産生じ、そのほぼ７０％は純粋であり、３０％は混合巨核球コロニーであった。陰性対照はｌ５ｃｏｖｅｓ培地であり、クロット当たり２〜４の巨核球コロニーを産生じた。該アッセイにおいては、精製された尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆは約５Ｘ１０’希釈単位／蛋白ｍｇを超える特異的活性を有する。活性の単位は実施例１に記載したと同様に定義される。

実施例１の精製における５−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカチオン交換カラムクロマトグラフィー工穆から溶出した骨髄移植尿から得た主要Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆはこのアッセイにて、単独、他のサイトカイニンと一緒に、およびそれと組み合わせて分析した。フィブリンクロットアッセイにおいて、それは６〜１６（平均１３）の巨核球を産生、し、５０〜７０％の純粋巨核球コロニーであった。尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆは、マウスＩＬ−３と可変的に相乗作用を有することが示され、フィブリンクロット培養系においてヒトＩＬ−６またはマウスＩＬ−４と相乗作用しない。

マウス骨髄フィブリンクロットアッセイにおいて、組換えＭＳＦ−に１３０に応答して、および組換え４ａλ（ＭＳＦ−Ｌ９２４）に応答して、巨核球コロニー形成が観察された。マウス巨核球はアセチルコリンエステラーゼ陽性細胞として同定され、巨核球コロニーはフィブリンクロット培養において単位領域当たり３を超える巨核球細胞と定義した。典型的には、組換えＭＳＦは３ないし６細胞／単位領域の巨核球コロニーを刺激し、平均６ないし１５コロニー／２５ｘ１０５マウス骨髄細胞であった。

巨核球コロニーの２つのタイプ、純粋巨核球コロニーおよび混合巨核球コロニーと呼ぶ他の細胞タイプをもつ巨核球細胞がアッセイで観察された。１のフィブリンクロットにおいて、２つのコロニータイプは混合巨核球コロニーに対して１：１ないし７：３の純粋コロニーの比であった。この比は組換えＭＳ　Ｆ−Ｋ　１３０の精製を通じて一貫していた。巨核球細胞数／コロニーおよび巨核球のサイズは、純粋および混合コロニーの双方につきほぼ同一であり、いくつかの巨核球は混合巨核球コロニーにおけるよりも小さかった。

生物活性の増加が、Ｃ４ＲＰ−ＨＰＬＣカラムから得られた活性ＭＳＦ画分から通常観察された。Ｓ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌカチオン交換カラムからのすべての３つのプールカラ、ＲＰ−ＨＰＬＣで生物活性ＭｓＦＭ白ｂ＜得らｈｆ：。ＲＰ− ＨＰＬＣ工程後のＭＳＦの最終特異的活性はすべての３つのプールにおいてｌＸｌ０’希釈単位／ｍｇを超えていた。活性ピークもまたＭＳＦウェスタンプロットで陽性であった。

ＡプールからのＲＰ−ＨＰＬＣ−精製ＭＳＦ−に１３０を非還元条件下で５ＤＳ −ＰＡＧＥに付した場合、３５−５０ｋＤ分子量種に対応するゲルスライスから生物活性蛋白が抽出された。銀染色ゲルおよびウェスタンイムノプロットデータは、１０〜２０％アクリルアミドグラジェント５ＤＳ−ＰＡＧＥでの還元に際して、３５−５０ｋＤ組換えＭＳＦ蛋白の９５％は１８〜２１ｋＤまで減少し、５％はシフトしなかったことを示した。

ＭＳＦ−に１３０ｃＤＮＡでトランスフェクトしたＣ０８−１細胞からの上澄みはフィブリンクロットアッセイで変動しつつも活性であった。各アッセイにおいて、試料を二連かつ３希釈でテストした。

Ｂ、ヒト血漿クロット巨核球コロニー形成本発明のヒト尿Ｍｅｇ−Ｃ３Ｆを、イー・マズール（Ｅ、　Ｍａｚｕｒ）ら［ブラッド（Ｂｌｏｏｄ）、５７：２７７ −２８６　（１９８１）］に記載されているものを修飾した血漿クロットＭＳＦアッセイでヒト活性につきテストした。非粘着性末梢血液細胞をロイコパック（Ｌｅｕｋｏｐａｃ）から単離し、分けて凍結した。テスト試料を２４−ウェル平板中の貧血小板ヒトＡＢ血漿および１．２５Ｘ１０’細胞と混合し、カルシウムの添加によって血清を形成せしめた。１２日のインキュベーションの後、血小板糖蛋白ＩＩ　ｂ　／　ｍ　ａに向けられたモノクローナル抗体およびホースラディシュベルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ発色系を用いて巨核球を同定した。組換えヒトＩＬ−３［ジエネンティック・インスティテユート・コーホレイテッド（Ｇｅｎｅｎｔｉｃ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｉｎｃ、）］を陽性対照として用い、クロット当たり１２〜３０の巨核球コロニーが産生され、はぼ６０％の純粋および４０％の混合巨核球コロニーであった。マウスアッセイにおけるごとく、形成不全イヌ血漿を陽性対照として用い、クロット当たり５〜１０の間の巨核球が産生され、そのうちほぼ５０％が１０細胞未満を含有する純粋巨核球コロニーであり、５０％が４０を超える巨核球を含有する混合巨核球コロニーであった。陰性対照はアルファ培地であり、クロット当たり０〜１の巨核球コロニーが産生された。

実施例１の精製スキームの工程６からのヒト尿Ｍｅｇ−ＣＳＦ生成物はこのアッセイで変動する活性を有していた。ＭＳＦ−に１３０はヒト血漿クロット巨核球コロニーアッセイで変動する活性を示した。

Ｃ１相乗効果組換えＭＳＦ−に１３０　ＣＯ５−１，細胞上澄みおよび精製した組換えＭＳＦを、種々のＣＦＵ−ＭＥＧアッセイ系、フィブリンクロット、寒天およびヒトＣＦＵ−ＭＥＧ血漿クロットアッセイにて、単独で、また他のサイトカインと組み合わせてアッセイを行った。

ＩＬ−３との可変的相乗作用がマウス骨髄フィブリンクロットアッセイで観察された。フィブリンクロットアッセイで骨髄細胞祖先と共にマウスＩＬ−３およびＭＳＦ−に１３０４ａλ（ＭＳＦ−Ｌ９２４）を培養シタ場合、巨［：ｌロー− を刺激すると、前記いずれかの蛋白単独を増加させた。最適下レベルのマウスＩＬ−３（１５単位／ｍ１）および最適レベルのＭＳＦ−に１３０は、各々、フィブリンクロットアッセイで、平均６〜１５のＣＦＵ−Ｍｅｇ／２．５Ｘ１０’？ウス骨髄細胞を刺激した。組み合わせると、３５にわたる巨核球コロニーの増大した巨核球コロニーの刺激が観察された。混合巨核球コロニーに対する純粋巨核球コロニーの比および巨核球コロニーのサイズは個々のＭＳＦ培養についてと同様に組合せ培養につき同一であった。

Ｄ、イー・コリ発現ＭＳＦ活性チオレドキシン−ＭＳＦ−に１３０融合蛋白としてエシェリキア・コリで発現されたＭＳＦはフィブリンクロットアッセイで可溶性かつ活性であった。イー・コリ発現ＭＳＦ−に１３０１；ＩＣ０Ｓ誘導ノＭｓ　Ｆ−Ｋ　１３０　ト同−範囲のＣＦＵＭｅｇ／２．５Ｘ］、Ｑ５マウス骨髄細胞を刺激した。この活性は、ＩＬ−３によってＣＦＵ−Ｍｅｇ形成を中和しなかったレベルにおける抗−ＩＬ− ３抗体の添加によって中和されなかった。イー・コリ溶解物からのＭＳＦ−に１３０チオレドキシン融合蛋白の巨核球コロニー形成活性は５Ｘ１０’希釈単位／ｍｌであった。

イー・コリ溶解物におけるＭＳＦ−に１３０チオレドキシン融合蛋白の特異的活性はｌＸ１０’Ｕ／ｍｇより大であった。チオレドキシンは該アッセイで活性で哺乳動物細胞から高レベルの本発明のＭＳＦ蛋白を産生ずる１つの方法は、ＭＳＦをコードするｃＤＮＡの多重コピーを含有する細胞の構築を含む。

増幅可能なマーカー、例えば、カウフマンおよびシャープ（Ｋａｕｆｍａｎ　ａｎｄ　５ｈａｒｐ）［ジャーナル・オブ・モレキュラー・アンド・バイオロジー０．　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　）（１９８２）、前掲］の手法による細胞が増大した濃度のメトトレキセート（ＭＴＸ）を含有するためのＤＨＦＲ遺伝子でｃＤＮＡを共トランスフェクトする。このアプローチは、多数の異なる細胞タイプで用いることができる。別法として、ＭＳＦ　ｃＤＮＡおよび薬剤耐性選択遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ）を同一のベクターに導入してもよい。このアプローチ用の１つの望ましいベクターはｐＥＤ４ＤＰＣ−１である。ＭＳＦ−に１３０およびＭＳＦ−Ｎ１４１はベクターｐＥＭＣ３−１、ｐＥＯ４ＤＰＣ−１と同一のベクターで発現され、そこでは、ｐＭＴ２１につき前記したごとくポリリンカーが変更されている（Ｐｓ　ｔ　Ｉ、Ｎｏｔ　Ｌ　５ａＩＩ、５ｎａＢＩ、ＥｃｏＲＩＳＰａｃｌ）。

例えば、その発現を可能とする他のプラスミド配列と作動可能に連結させたＭＳＦ遺伝子を含有するｐＭＴ２１ベクターを、リン酸カルシウム共沈法およびトランスフェクションによって、ｐＡｄＤ２６５ＳＶｐＡ３　［カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）８２　：　６８９　６９３　（１９８５）　］のごときＤＨＦＲ発現プラスミドと共に、ＤＨＦＲ−欠失ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩＩに導入する。

別法として、その発現を可能とする他のプラスミド配列と作動可能に連結したＭＳＦ遺伝子を含有するｐＥＤ４ＤＰＣ−１ベクターをプロトプラスト融合またはトランスフェクションによってＤＨＦＲ−欠損ＣＨＯ細胞、ＤＵＫＸ−ＢＩ［に導入する。ＭＳＦ遺伝子およびＤＨＦＲＨＦ的−遺伝子は、ＭＳＦをｐ　ＥＭＣ２Ｂ１に導入した場合、共に効果的に発現される。ＤＨＦＲＨＦ形質転換体を透析胎児ウシ血清でアルファ培地にて増殖につき選択する。カウフマン（Ｋａｕｆｍａｎ）ら［モレキュラー・アンド・セリュラー・バイオロジー（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　）、５：１７５０　（１９８３）］に記載されているごとくに、ウェスタンブロッティング、バイオアッセイ、またはＲＮＡブロッティングによって形質転換体をＭＳＦの発現についてチェックし、陽性プールを引き続いて濃度を増大したＭＴＸ（０，０２，０２，１，０および５μＭ　ＭＴＸ）での増殖による増幅につき選択する。増幅した系統をクローンし、ＭＳＦ蛋白発現をフィブリンクロットアッセイによってモニターする。ＭＳＦ発現はＭＴＸ耐性のレベルを上昇させつつ増大するものと期待される。

前記したいずれかの発現系において、得られた細胞系は適当な薬剤選択によってさらに増幅でき、再クローン化した細胞系および実施例１０に記載したマウスフィブリンクロットアッセイを用いて評価した発現のレベルが得られる。

ＭＳＦ発現ＣＨＯ細胞系は無血清培地におｉする増殖につき適合させることができる。ＣＨＯ細胞で発現されたＭＳＦを、ＣＯ３−１細胞上澄みと同一の精製スキームを用いて無血清条件培地から精製する。同種ＭＳＦは、レクチン−アフィニティークロマトグラフィー、逆相ＨＰＬＣ，ＦＰＬＣ等のごとき技術を含めた当該分野で周知の方法を用いて細胞系からの条件培地より単離できる。

これまでの記載は本発明の好ましい具体例を詳細に説明する。本発明の実施における多数の修飾および変形が当業者に予期される。かかる修飾および変形は以下の請求の範囲内に含まれるものである。

ＦＬＣ田ｔＥ１ｖｘａｕｐｘ　ｌｔ　）γ２）ｒＺＱｕｕ　Ｌ　（Ｃｏｎｅ４＋）Ｆ：０１７）ｌｊ！　Ｌ　１ｃｏｎｔ’４．１ｒ！ＧｔｌｌＪリ　！　１ｃｏｎｔ°ｄ、１ＦＩＧＵＲＸ　工　（っ）′ぞ　りｒｘｃｕＰｓｘ　＋　ｔつ”ｚ　ｌＣτフＡ’：”：ｅＡｃＡ　ＧＴ？Ｃ？？Ａ？フク　Ｔ？ＴＡＣＡｌ：Ａｅｌ：　ｆｉ−ｍＡＡ？？八＾　Ｔへττ；Ｃ’：？ＣＴ　４４２T ｙｚｃｔｒｓｔｔ工　（ｃｏａｔ４．１ＦＩＧＵＲＥ　３ＴＩ’ｒＣＧＧＧＧＡＡ　ＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧ　ＭＣＣＣＣＴＡＴＴ　ＴＧＴＩＴＡＴ’Ｍ’Ｔ　工２０ＴＡＡＡＡＧＧＡＴＣＴＡＧＧＴＧＡＡＧＡ　ＴＣＣ ’ｌ’ｒＴ’１ＴＧＡ　ＴＡＡＴＣＴＣＡＴＧ　１１６０ＦＩＧＵＲＥ　４　（ＣＯＮＴ’Ｄ）りふＩＩ：ムリ　−Ｊ−＋Ｊ−−・Ｖ！　・雪マ　−−一−−−ＦＩＧＵＲＥ　４　（ＣＯＮＴ’Ｄ）ＦＩＧＵＲＥ　４　（ＣＯＮＴ’Ｄ）ＣＧＣＣＴＧ　ＧＣＣＣＴＧ　ＣＣＣＣＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＣＣＣＧ　ＧＡＣＣＣＧ　３０００Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＡｌａＡＧＧ　ＧＧＡ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＣＴＧ　ＡＡＧ　ＡＣＴ　ＣＧＧ　ＣＴＧ　ＴＧＡ　３Ｌ３２ＧＴＣＡＴＣＡＣＣＧ　ＡＡＡＣＧＣＧＣＧＡ　３６３２フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｎ　５／１０１５／２７　ＺＮＡ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：９１）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＤＫ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＲ（７２）発明者　ジェイコブス、ケネスアメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１６０、ニュートン、ポーモント・アベニュー１５１番Ｉ（７２）発明者　ヒユーウィック、ロドニー・エムアメリカ合衆国マサチューセッツ州０２１７３、レキシントン、ウッドクリフ・ロード１６番（７２）発明者　ジェスナー、トーマス・シイ−アメリカ合衆国カリフォルニア用９４８０４、　−リッチモンド、ショアライン・コート２７番

Claims

【特許請求の範囲】

１．他の蛋白質性物質との会合および天然源では会合する汚染物が実質的に無いＭＳＦ蛋白であって、図１のエクソンＩＩ、エクソンＩＩＩおよびエクソンＩＶのアミノ酸配列よりなり、分泌リーダーをコードし、メチオニン先行エクソンＩＩを開始するアミノ末端配列およびエクソンＩＶに続く終止コドンを有し、巨核球細胞のコロニーの増殖および発育を刺激する能力によって特徴付けられる該蛋白。
２．該アミノ末端配列が図１のエクソンＩである請求の範囲第１項記載の蛋白。
３．さらに、図１のエクソンＸＩＩのアミノ酸配列ならびにエクソンＶ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＸおよびＸＩのうちの少なくとも１つよりなり、該終止コドンがエクソンＶＩＩに存在する請求の範囲第２項記載の蛋白。
４．他の蛋白質性物質との会合および天然源では会合する汚染物が実質的に無いＭＳＦ蛋白であって、（ａ）図１のアミノ酸６７−１０６に枠内にて融合し、図１のアミノ酸２００− ２５０に枠内にて融合した図１のアミノ酸１−２５よりなる近接アミノ酸配列（ｂ）図１のアミノ酸２００−２５０に枠内で融合した図１のアミノ酸１−１０６よりなる近接アミノ酸配列；（ｃ）図１のアミノ酸２００−２５０に枠内融合したアミノ酸１−１５６よりなる近接アミノ酸配列；（ｄ）アミノ酸６７−１０６に枠内融合し、アミノ酸２００−２５０に枠内融合したアミノ酸１−２５よりなる近接アミノ酸配列；（ｅ）図１のアミノ酸６７− １５６に枠内融合した図１のアミノ酸１−２５よりなる近接アミノ酸配列；（ｆ）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸１３０の配列；（ｇ）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸１４１の配列；（ｈ）図１のアミノ酸１ないし１５６の配列；（ｉ）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸１７２の配列；（ｊ）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸１９２の配列；（ｋ）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸２０４の配列；（１）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸２０９の配列；（ｍ）図１のアミノ酸１ないしアミノ酸２２０の配列；および（ｎ）配列（ａ）ないし（ｍ）のホモダイマーまたはヘテロダイマーよりなる群から選択されるアミノ酸配列からなる該蛋白。
５．（ａ）図１のヌクレオチド１ないし３９０よりなるＤＮＡ配列；（ｂ）図１のヌクレオチド１ないし４２３よりなるＤＮＡ配列；（ｃ）図１のヌクレオチド１ないし５１６よりなるＤＮＡ配列；（ｄ）図１のヌクレオチド１ないし５７６よりなるＤＮＡ配列；（ｅ）図１のヌクレオチド１ないし６１２よりなるＤＮＡ配列；（ｆ）図１のヌクレオチド１ないし６２７よりなるＤＮＡ配列；（ｇ）図１のヌクレオチド１ないし６６０よりなるＤＮＡ配列；（ｈ）配列（ａ）ないし（ｇ）のホモダイマーまたはヘテロダイマーをコードするＤＮＡ配列；（ｉ）（ａ）ないし（ｇ）の対立変異体；および（ｊ）フィブリンクロットアッセイにおいて活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする（ａ）ないし（ｊ）いずれかとハイブリダイズできるＤＮＡ配列よりなる群から選択されるＭＳＦＤＮＡ配列。
６．（ａ）図１のヌクレオチド２００−３１９に枠内融合し、図１のヌクレオチド５９８−７４８に枠内融合した図１のヌクレオチド１−７６よりなるＤＮＡ配列；（ｂ）図１のヌクレオチド２００−３１９に枠内融合し、図１のヌクレオチド５９８−７４８に枠内融合した図１のヌクレオチド１−７６よりなるＤＮＡ配列（ｃ）図１のヌクレオチド５９８−７４８に枠内融合した図１のヌクレオチド１− ４６９よりなるＤＮＡ配列；（ｄ）図１のヌクレオチド２００−３１９に枠内融合し、図１のヌクレオチド５９８−７４８に枠内融合した図１のヌクレオチド１−７６よりなるＤＮＡ配列、（ｅ）図１のヌクレオチド１ないし４６９の配列；（ｆ）図１のヌクレオチド２００ないし４６９に枠内融合した図１のヌクレオチド１ないし７６よりなるヌクレオチド配列；（ｇ）配列（ａ）ないし（ｆ）のホモダイマーまたはヘテロダイマーをコードするＤＮＡ配列；（ｈ）（ａ）ないし（ｆ）の配列の対立変異体；および（ｉ）フイブリンクロツトアツセイにおいて活性を有するペプチドまたはポリペプチドをコードする（ａ）ないし（ｈ）いずれかにハイブリダイズできるＤＮＡ配列よりなる群から選択される５′配列からなるＭＳＦＤＮＡ配列。
７．（ａ）そのための発現制御配列と作動可能に連結したＭＳＦ蛋白の発現をコードする請求の範囲第５項または第６項のＤＮＡ配列で形質転換した細胞系を培地で培養し；次いで、（ｂ）該培地からＭＳＦ蛋白を回収することを特徴とする該ＭＳＦ蛋白の生産方法。
８．請求の範囲第７項記載の生産方法により生産されたＭＳＦ蛋白。
９．発現制御配列と作動可能に連結した請求の範囲第５項または第６項記載のＭＳＦＤＮＡ配列で形質転換した細胞。
１０．医薬上有効な賦形剤中の請求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記載のＭＳＦ蛋白の治療上有効量よりなる医薬組成物。