JPH06508989A

JPH06508989A - Ｃｔｌ４ａレセプター、それを含有する融合タンパク質およびそれらの使用

Info

Publication number: JPH06508989A
Application number: JP5501569A
Authority: JP
Inventors: リンスレイ，ピーター　エス．; レッドベター，ジェフリー　エー．; ダムル，ナイティン　ケイ．; ブラディ，ウィリアム
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1991-06-27
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 1994-10-13
Anticipated expiration: 2020-11-30
Also published as: NZ243286A; AU2240092A; MX9203605A; IL162430A0; NO2012001I1; DK0606217T3; EP0606217B1; KR100238712B1; FI935795L; NO20020491D0; CA2580812A1; NO934801L; NO2007013I2; FI935795A0; WO1993000431A1; DE69226871T2; DK0606217T4; IL102294A; IE20010097A1; ZA924782B

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＴＬ４Ａレセプター、それを含有する融合タンパク質およびそれらの使用又更亘立！本発明は、ＣＴＬＡ　４レセプター遺伝子、前記レセプターと８７抗原を発現する細胞との間の相互作用の同定、およびＣＴＬＡ　４レセプターを含む細胞の相互作用を調節する方法に関する。

発明の背景を推動物の免疫系の特徴は、「自己Ｊと「非自己」とを区別する能力である。この性質は、最適な免疫活性化を達成するために多数のシグナルを必要とする系の進化に導いた（Ｊａｎｅｗａｙ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎシμ初二」１リエｊ購ｎｔ、　Ｂｉ剥−、５４：　１−１４　（１９８９））　、　Ｔａ１ｌ！！　Ｂ細胞の相互作用は免疫応答に対して必須である。Ｔ細胞およびＢ細胞上に見いだされる多数の付着分子のレベルは、免疫応答の間に増加する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９８７）　、前掲；およびＳｈｉｍｉｚｕ、　Ｃｕｒｒｅｎｔ　０ｐｉｎｉｏｎｉｎ　ｆｍｓ＋ｕｎｏｌｏｇｙ、　ＫｉｎｄｔおよびＬｏｎｇ編、ｌ　：９２−９７　（１９８８））　；およびＨｅａｌｅｒ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　９　：　１０９−１１３　（１９８８））　、これらの分子のレベルの増加は、活性化されたＢ１１１胞が、抗原特異的Ｔ細胞の増殖を刺激するとき、休止のＢ細胞よりもいっそう有効である理由の説明を促進することができる（Ｋａｉｕｃｈｉ　ら、Ｊ、　Ｉａ＋＊ｕｎｏ１．１３１　：１０９−１１４　（１９８３）　；　Ｋｒｃｉｇｅｒら、Ｊ、　［ｍｍｕｎｏｌ、　１３５　：　２９３７−２９４５（１９８５）　；　ＭｃＫｅｎｚｉｅ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１　：　２９０７−２９１１　（１９８８）　；およびＨａｗｒｙｌｏ＠ｉｃｚおよび［Ｉｎａｎｕｅ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４１　：　４０８３−４０８８（１９８Ｂ））　。

Ｔリンパ球（「Ｔ細胞」）の免疫応答の発生は、細胞−細胞の相互作用（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ａ、　Ｒｅｖ、　ｆｍｕｎｏｌ、　５　：　２２３−２５２　（１９８７））　、とくにＴ細胞とアクセサリ−細胞、例えば、Ｂ細胞との間の相互作用、および可溶性仲介因子（サイトカインまたはリンホカイン）の生産を含む複雑なプロセスである（Ｄｉｎａｔｅｌ　ｌｏおよびＭｉｅｒ、　籾り旺紅− Ｊｏｕｒ、　Ｍｅｄ、　３１７　：　９４０−９４５　（１９８７））、この応答は、Ｔ細胞レセプター複合体（Ｗｅｉｓｓ　ら、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｎｎｕｎｏｌ、　４　：　５９３−６１９　（１９８６））および他の「アクセサリ −」表面分子（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９８７）前掲）を含む、いくつかのＴ細胞表面レセプターにより調節される。これらのアクセサリ−分子の多数は、細胞の表面上のモノクローナル抗体の反応性により定められる、天然に見いだされる細胞表面の分化（ＣＤ）抗原である（ＭｃＭｉｃｈａｃｌ　ｋｍＳＬｅｕｋｏｃ　ｔｅ　Ｔ　ｉｎ　Ｉ［［、（ｌｘｆｏｒｄＵｎｉｖ、　Ｐｒｅｓｓ　、オックスフォード、ニューヨーク（１９８７））。

リンパ球のアクセサリ−分子を含む抗原独立の細胞間の相互作用は、免疫応答に対して必須である（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９８７）前掲）。

例えば、Ｔ細胞関連タンパク質ＣＤ２のそのリガンドＬＦＡ　３　（広く発現される塘タンパク質（Ｓｈａｗおよび５ｈｉｓｕｚ、前掲の中に概観されている））への結合は、抗原特異的Ｔ細胞の活性化を最適化するために重要である（Ｍｏｉｇｃｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９　：　３１４　（１９８Ｂ））。他の重要な付着系は、リンパ球、マクロファージ収量顆粒球上に見いだされるＬＦＡ−ｌｔｊ！タンパク質（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９８７）前掲；　５ｈａ−およびＳｈｉｍｕｚ　（１９８８）前掲）のそのリガンドＩＣＡＭ−１（Ｍａｋｇｏｂａら、Ｎａｔｕｒｅ３１１　：　８６−８８　（１９８８））およびＩＣＡＭ　 −２（Ｓｔａｕｎｔｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３９　：６１−６４　（１９８９））への結合を含む。Ｔ細胞のアクセサリ−分子ＣＤ８およびＣＤ４は、それぞれ、ＭＨＣクラスＩ　（Ｎｏ＋ｖｅｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３３６　ニア９− ８１　（１９８８））およびクラスＵ　（ＤｏｙｌｅおよびＳｔｒｏｍｉｎｇｅｒ、　Ｎａｔｕｒｅ３３０　：　２５６−２５９　（１９８７））分子との相互作用により、Ｔ細胞の付着を強化する。「ホーミング・レセプター（ｈｏｓｉｎｇ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）」はリンパ球の移動のコントロールのために重要である（Ｓｔｏｏｌ鵬ａｎ、　Ｃｅ１１５６　：　９０７−９１０　（１９８９））、　ＶＬＡ　１１１９　ンハクｉ［ｔ、細胞外マド’）ｙクス成分への付着を必要とするリンパ球の機能を仲介するように思われるインテグリン（ｉｎｔｅｇｒｉｎ）である（Ｈｅａｌｅｒ、前掲）　、　Ｃ［１２／ＬＦＡ−３、ＬＦＡ−１／ＩＣＡ門−１、およびＶＬＡ付着系は、広範な種類のタイプの細胞上に存在する（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、（１９８７）　、前掲；Ｓｈａｗおよび５ｈｉｓｕｚ、（１９８９）、前掲およびＨｅａｌｅｒ、（１９８８））、前掲）。

Ｂ−リンパ球の活性化は２つのシグナルを必要とすることがかなり以前に提案され（ＢｒｅｔｓｃｈｅｒおよびＣｏｈｎ、　５ｃｉｅｎｃｅ　１６９　：　１０４２−１０４９　（１９７０））そして現在すべてのリンパ球はそれらの最適な活性化のための２つのシグナル、抗原特異的またはクローナルシグナル、ならびに抗原非特異的シグナルを必要とすると信じられている（Ｊａｎｅｗａｙ　、前掲）　、　Ｆｒｅｅｍａｎら（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４３　（８）　：　２７１４−２７２２　（１９８９））は、＋ｗＡＢ　Ｂ７により認識されるＢ細胞活性化抗原をエンコードするｃＤＮＡクローンを単離しそして配列決定した（ＦｒＢｅｍａｎ　ら、Ｊ、　Ｉｓｎ＋ｕｎｏ１．１３８　：　３２６０　（１９８７））、このｃＤＮＡでトランスフエフシランしたＣＯ３細胞は、標識化−ＡＢ　８７および■ＡＨＢＢ−１の両者により染色されることが示された（Ｃ１ａｒｋ　ら、Ｈｕｍａｎ　ｆｎｕｎｏｌ、　１６　：　１００−１１３（１９８６）　；　Ｙｏｋｏｃｈｉ　ら、　Ｊ、１ｗ５ｕｎｏ１．　１２８　：　８２３　（１９８１））　；　Ｆｒｅｅｓａｎら、（１９８９）前掲；およびＦｒｅｅｍａｎら、（１９８７）　、前掲））。さらに、この抗原の発現は他の系統の細胞、例えば、単球上に検出された（Ｆｒｅｅｍａｎら、前掲）。

Ｔヘルパー細胞（Ｔ１）抗原の応答のために要求されるシグナルは、抗原を提示する細胞（ＡＰＣ）により提供される。Ｔ細胞レセプター複合体（Ｗｅｉｓｓ、エムーリュｎ　Ｉｎｖｅｓｔ、　８６　：　１０１５　（１９９０））を、ＡＰＣ上のクラス■の主要な組織適合性複合体（ＭＩＩＣ）分子に関係して提示された抗原と相互作用させることによって、第１シグナルは開始される（ＡＩｌｅｎ、　Ｉｍ＋ａｕｎｏ１．　Ｔｏｄａｙ　８　：　２７０　（１９８７））　、この抗原特異的シグナルは完全な応答を発生するために不十分であり、そして第２シグナルの存在下に、クローナルの不活性化またはアネルギーに実際に導くことがある　（Ｓｃｈｗａｒｔｚ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４８　：　１３４９　（１９９０））。

Ｍｌ（Ｃにより提供される第２「共同刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）　Ｊシグナルについての要件は、ある数の実験の系において証明された（Ｓｃｈｗａｒｔｚ＋前掲；　Ｗｅａｖｅｒおよび［ＪｎａＨ６，Ｉｍｍｕｎｏｌ、ユ剋ｕ１１　：　４９　（１９９０））。これらの１または２以上のシグナルの分子の性質は完全には理解されないが、ある場合において、可溶性分子、例えば、インターロイキン（ｒＬ）　−１（ＷｅａｖｅｒおよびＵｎａｎｕｃ＋　前掲）および細胞間付着に関係する膜レセプターの両者は共同刺激シグナルを提供できることが明らかである。

ＣＤ２Ｂ抗原、すなわち、免疫グロブリン上材のホモ２量体の糖タンパクｉｉ　（Ａｒｕｆｆｏおよび５ｅｅｄ＋　Ｐｒｏｃ、　！Ｊａｔ１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４　：　８５７３−８５７７　（１９８７））は、はとんどの成熟ヒトＴ細胞上に見いだされるアクセサリ−分子である（Ｄａｍｌｅら、Ｊ、　Ｉ＋ｓｍｕｎｏ１．１３１　：　２２９６−２３００（１９８３））。現在の証拠が示唆するように、Ｔ細胞反応複合体により開始されるものと区別される別のＴ細胞活性化の経路において、この分子は機能する（Ｊｕｎｅら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｃｌ、　７　：　４４７２−４４８１（１９８７））　、　ＣＤ２８抗原と反応性のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、種々のポリクローナルの刺激により開始されるＴ細胞の応答を増強することができる（Ｊｕｎｅら、前掲、の中に概観されている）。これらの刺激作用は＋ａＡｂ誘発サイトすインの生産（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８６　：　１３３３−１３３７　（１９８９）　；　およびＬｉｎｄｓｔｅｎら、５ｃｉｃｎｃｅ２４４　：　３３９−３４３　（１９８９）から、ｍＲＮＡ安定化の増加（Ｌｉｎｄｓｔｅｎら、（１９８９）、前掲）の結果としてを生ずることができる。抗ＣＤ２８ｍＡｂは、また、阻止作用を存することができ、すなわち、それらはオートロガス混合リンパ球反応（Ｄａｓｌｅら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７８　：５０９６− ６００１　（１９８１））および抗原特異的Ｔ細胞クローンの活性化（Ｌｅｓｓｌａｕｅｒら、Ｅｕｒ、　Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１６　：　１２Ｂ９−１２９６　（１９８６））をブロックすることができる。

ＣＤ２８はＢ細胞活性化抗原であるＢ７／ＢＢ−１のための対レセプターであることが研究において示された（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７　：　５０３１−５０３５　（１９９０））　、便宜上、Ｂ７／ＢＢ−１抗原を以後ｒＢ７抗原」と呼ぶ、　ＣＤ２８と８７抗原との間の相互作用は、Ｂ７抗原およびＣＤ２８レセプターの細胞外部分、および免疫グロブリン（Ｉｇ）　Ｃ１０（一定領域の重鎮）の遺伝学的融合を使用して特徴づけられた（Ｌｉｎｓｌｅｙ　ら、Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、　１７３　：　７２１−７３０　（１９９１））。同定化８７１ｇ融合タンパク質ならびにＢ７陽性Ｃ）１０細胞は、Ｔ細胞の増殖を共同刺激（ｃｏｓｔｉ＋１ｕｌａｔｅ）することが示された。Ｂ７陽性ＣＨＯ細胞によるＴ細胞の刺激は、また、ＩＬ−２のための転写レベルの増加を特異的に刺激する。追加の研究において、抗ＣＤ２８ｗＡｂは、ある種のＴ細胞白血病細胞系においてＢ細胞系白血病系統との細胞の相互作用により誘発されたＩＬ−２の生産を阻止することが示された（Ｋｏｈｎ。

ら、Ｃｅ１ｌ　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３１−１−１０　（１９９０））。

ＣＤ２８は単一の細胞外の可変開城（Ｖ）様ドメインを有する（Ａｒｕｆｆ。

および５ｅｅｄ、前掲）。相同性分子のＣＴＬＡ　４は、ネズミ細胞溶解性Ｔ細胞のｃＤＮＡライブラリーの分別スクリーニングにより同定された（Ｂｒｕｎｅｔら、Ｎａｔｕｒｅ　３２８　：　２６７−２７０　（１９８７））。この分子の転写は細胞障害活性を有するＴ細胞の集団の中に見いだされ、ＣＴＬＡ　４が細胞溶解性応答において機能するであろうことを示唆した（Ｂｒｕｎｅｔら、前掲；およびＢｒｕｎｅｔら、Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、　１０３−２１−３６　（１９８８））　、研究者らの報告によると、ＣＴＬＡ　４のヒトの対（Ｄａｒｉａｖａｃｈ　ら、Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１８　：　１９０１−１９０５　（１９８８））の遺伝子はクローニングされそしてＣＯ２８と同一の染色体頭載（２ｇ　３３−３４）にマツピングされた（Ｌａｆａｇｅ−Ｐｏｃｈｉｔａｌｏｄｄ）ら、Ｉｍｍｕｎｏ　ｅｎｅｔｉｃｓ　３１　：　１９Ｂ−２０１（１９９０））。

このヒトＣＴＬＡ　４のＤＮＡ　とＣＤ２８タンパク質をエンコードするものとの間の配列の比較は、膜近傍領域および細胞ｆ８１域において最高度の相同性をもつ、配列の有意な相同性を明らかにする（Ｂｒｕｎｅｔら、１９８日、前掲ｉ　Ｄａｒｉａｖａｃｈら、１９８８、前掲）。

ＣＤ２ＢとＣＴＬＡ　４との間の高度の相同性は、それらの遺伝子の共同局在化と一緒に、これらの分子がまた機能的に関係するかどうかという問題を発生する。しかしながら、ＣＴＬＡ　４のタンパク質生産物はまだ首尾よく発現されてきていないので、これらの問題は未解決のままである。

免疫グロブリン遺伝子の上材における細胞表面の糖タンパク質の可溶性誘導体の発現は、ＣＤ４．　ＨＩＶ−１のレセプター、およびＣｒ３２ＢおよびＢ７のレセプターについて、ハイブリッド融合分子を使用して活性化され、これらのハイブリッド融合分子は抗体ドメインに融合されたＣＤ４　レセプターの細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするＤＮＡ配列から成る（免疫グロブリンｒ　ｌ　（Ｃａｐｏｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　３３７　：　５２５−５３１　（１９８９）（ＣＤ４）およびＬｉｎ５ｌｅｙ　ら、Ｊ、　Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、、前掲）　（ＣＤ２８およびＢ７）。

従来発現されていないＣＴＬＡ　４遺伝子の可溶性タンパク質生産物を得ること、およびＴ細胞の機能的応答に関係するＣＴＬＡ　４のための天然のリガンドを同定することは有用であろう０次いで、可溶性タンパク質生産物を使用してＴ細胞のｉｎ　ｖｉｖｏ応答を調節して病理学的状態を処置することができるであろう。

発明の要約したがって、本発明はＣＴＬＡ　４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードする完全なかつ正しいＤＮＡ配列を提供し、モしてＣＴＬＡ　４レセプターのために天然のリガンドとしてＢ７抗原を同定する６本発明は、また、ＣＴＬＡ　４免疫グロブリン（１ｇ）融合タンパク質生産としてＤＮＡを発現する方法を提供する０本発明のＭ様は、ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質、およびＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ４　Ｉｇ融合タンパク質を包含するハイブリッドの融合タンパク質を包含する。また、ＣＴＬＡ　４融合タンパク質、８７１ｇ融合タンパク質、およびそれらの断片および／または誘導体、例えば、ＣＴＬＡ　４およびＢ７抗原と反応性のモノクローナル抗体を使用して細胞の相互作用および免疫応答を調節する方法が提供される。

本発明のヒトＣＴＬＡ　４レセプタータンパク質は１８７アミノ酸によりコードされ、そして新しく同定されたＮ連鎖グリコジル化部位を包含する。

本発明のＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質は、活性化Ｂ細胞、および他の系統上に発現されたＢ７抗原、Ｔ細胞上のＣＤ２８レセプターのためのリガンドと結合する。ＣＴＬＡ　４　［ｇは、ＣＤ２Ｂレセプターに結合するＢ７よりも存意により高い親和性で８７抗原と結合する。ＣＴＬＡ　Ｊ　Ｔｇ構成体は、ヒトｆｇｃ　ｒ　１ドメインに相当する第２アミノ酸配列に融合したＣＴＬＡ４レセプターの細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列を有する。第１アミノ酸配列は、アミノ酸配列の約位置ｌから約位置１２５のアミノ酸残基を含有し、これらのアミノ酸残基はヒトＩｇＣｙｌのヒンジ、ＣＨ２およびｃｏ３ａ域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合したＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当する。融合タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。可溶性ＣＴＬＡ４１ｇはＴおよびＢリンパ球の応答の効力のあるｉｎ　ｖｉｖｏインヒビターである。

また、本発明において、ハイブリッド融合タンパク質、例えば、第１アミノ酸配列を有するＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質が包含され、この第１アミノ酸配列はｃＴＬＡ　４　Ｉｇの細胞外ドメインの断片に相当する第２アミノ酸配列およびヒトｒｇｃｒｌのヒンジ、ＣＩ（２およびＣＩ（３領域に相当する第３アミノ酸配列に接合したＣＤ２Ｂの細胞外ドメインの断片に相当する。

ハイプリント融合タンパク質の１つの態様は、ＣＤ２８の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１から約９４のアミノ酸残基を含有する第１アミノ酸配列を有するＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合タンパク質であり、ＣＤ２８の細胞外ドメインはＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置９４から約位置１２５のアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列を接合し、ＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインはヒトＩｇＣγ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３＠！域に相当するアミノ酸残基を含有する第３アミノ酸配列に接合している。

また、本発明において、Ｔ細胞をＣＴＬＡ　４レセプターのリガンドと反応させることによって、ＣＴＬＡ　４陽性Ｔ細胞とＢ７陽性細胞との相互作用を阻止することによる、他の細胞とのＴ細胞の相互作用をＵＲｗｌする方法が包含される。リガンドは８７１ｇ融合タンパク質、ＣＴＬＡ　４レセプターと反応性のモノクローナル抗体、および抗体断片を包含する。

本発明は、また、Ｂ７抗原のためのりガーゼを使用する、Ｂ７陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節する方法を提供する。このようなリガンドは、本発明のＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質、その断片または誘導体、ＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質のハイブリッド、またはＢ７抗原と反応性のモノクローナル抗体である。

本発明は、さらに、Ｂ７抗原と反応性のリガンドを投与してＢ７陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を調節することによって、Ｂ７陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により仲介される免疫系の疾患を処置する方法を包含する。このリガンドは、ＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合タンパク質、ＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質のハイブリッド、またはＢ７抗原と反応性のモノクローナル抗体である。

ＣＴＬＡ　４１．融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体およびＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体を、細胞の相互作用の＊Ｓにおける使用について記載する。

ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質を安定に発現する新規なチャイニーズハムスター卵巣細胞系をまた開示する。

図面の簡単な説明第１図は、下の実施例２に記載するＣＴＬＡ　４１ｇ融合構成体の線図的表示である。

第２図は、下の実施例２に記載するＣＴＬＡ　４　ｒｇの５ＯＳ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーの精製から得られたゲルの写真である。

第３図は、下の実施例３に記載する、オンコスタチイン（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ）　Ｍシグナルプライマー伸長（位置−２５〜−１）に融合したヒ）　（：ＴＬＡ　４レセプター（配列識別番号＝１３および１４）をエンコードし、そして新しく同定されたＮ連鎖グリコジル化部位（位置１０９〜１１１）を含む、完全なアミノ酸配列を示す。

第４図は、下の実施例４に記載する、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ　４でトランスフェクションしたｃｏｓ　ｇ胞へのＢ７ｒｇ融合タンパク質の結合のＦＡＣ３”分析の結果を示す。

第５図は、下の実施例４に記載する、Ｂ７抗原陽性（Ｂ７”　）　ＣＩＯ細胞およびリンパ芽球様細胞系（ＰＭ−ＬＣＬ）上の精製したＣＴＬＡ　４　Ｉｇの結合のＦＡＣ５”分析の結果を示す。

第６図は、下の実施例４に記載する、同定化ＣＴＬＡ　４　Ｉｇへの１２５１標識化Ｂｎｇの競争結合の分析を示すグラフである。

第７図は、下の実施例４に記載する、同定化ＣＴＬＡ　４１ｇへの１！５１標識化８７１ｇのスキャンチャード分析の結果を示すグラフである。

第８図は、下の実施例４に記載する、ｌｆｆ１Ｓ１で表面標識化したＢ７陽性Ｃｌｌ０細胞およびＰＭ−ＬＣＬ細胞の免疫沈澱分析のＳ［１Ｓ−ＰＡＧＥクロマトグラフィーからのゲルの写真である。

第９図は、下の実施例４に記載する、〔３Ｈ〕−チミジンの組み込みにより測定した、ＣＴＬＡ　４　ＩｇのＴ細胞の増殖への作用を示すグラフである。

第１Ｏ図は、下の実施例４に記載する、酵素のイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により決定した、ヒ）Ｔ細胞によるヘルパーＴ細胞（Ｔｂ）誘発免疫グロブリンの分泌へのＣＴＬＡ　４　ｔｇの作用を示す棒グラフである。

発明の詳細な説明ここに記載する本発明を完全に理解することができるように、次の説明を記載する。

本発明は、Ｔ細胞表面上に見いだされ、活性化Ｂ細胞および他の系統の細胞上に発現されたＢ７抗原に結合する、ヒ）ＣＴＬ＾４レセプターの単離およびクローニング、およびＣＴＬＡ　４レセプター遺伝子の可溶性融合タンパク質生産物の発現に関する０本発明は、また、発現されたＣＴＬＡ　４レセプターを使用して、Ｂ７陽性細胞とのＴ細胞の相互作用を包含する細胞の相互作用を調節する方法を提供する。

好ましい態様において、本発明のヒトＣＴＬＡ　４レセプタータンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードする完全なかつ正しいＤＮＡ配列をＰＣＲによりクローニングする。ＣＴＬＡ４の完全な予測されたコーディング配列を含有するｃＤＮＡを、下の実施例の中に詳細に記載されているように、）１３８ＲＮＡから増幅されたＰＣＲ断片からアセンブリングし、そして発現ベクターＣＤ？Ｉ８の中に挿入した。単離物をＣＯＳ　Ｉｇ胞の中にトランスフェクションし、そしてＢｕｇ、すなわち、Ｌｉｎ５ｌｅｙら、Ｌ−ハ上工１回工１７Ｓ　：　７２１ −７３０　（１９９１）記載されているように、Ｂ７の細胞外ドメインおよびヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）　Ｃ１１′８Ｉ域に相当するアミノ酸配列を有する可溶性融合タンパク質の結合について試験した。

次いで、ＯＭＣＴＬＡ　４と表示する１つの単離物の［ｌＮＡ配列を決定し、そしてＮ末端においてオンコスタチインＭからのシグナルペプチドに融合した、予測されたヒトＣＴＬＡ　４配列に正確に相当することが発見された。ＣＴＬＡ４レセプターは１８７アミノ酸（シグナルペプチドおよび停止コドンを除外する）によりコードされ、そしてアミノ酸位置１０９−１１１に新しく同定されたＮ連鎖グリコジル化部位を含む（下の第３図を参照）、オンコスタチインＭのシグナルペプチドを使用して、ＣＴＬＡ　４レセプターを発現させる。

他の好ましい態様において、ＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当する第１アミノ酸配列およびヒトＩｇＣｒｌドメインに相当する第２アミノ酸配列を有する融合タンパク質を使用して、ＣＴＬＡ　４レセプター遺伝子（ＣＴＬＡ　４１ｇ）のタンパク質生産物の可溶性の形態を調製する。

ここに記載するｃＤＮＡ配列に基づくヒトＣＴＬ＾４レセプターに相当するアミノ酸配列の部分をエンコードするｃＤＮＡを含有するクローニングおよび発現のプラスミド（ＣＤＭ８およびπＬＮ）を構成し、ここでＣＴＬ＾４レセプター遺伝子の細胞外ドメインの断片に相当する第１アミノ酸配列をエンコードするｃＤＮＡを、発現されたＣＴＬＡ　４タンパク質の可溶性の変更によりＣＴＬＡ　４レセプター遺伝子の発現を可能とする１ｇＣ領域に相当する第２アミノ酸配列をエンコードするＤＮＡに接合する。

こうして、可溶性ＣＴＬＡ　４　ｒｇ融合タンパク質は第１アミノ酸配列によリコードされ、この第１アミノ酸配列はヒトＩｇのＣｒｌのヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３９Ｍ域に相当するアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合したＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位ｆ１〜約１２５のアミノ酸残基を含有する。融合タンパク質は好ましくは２量体の形態で生産される。次いでこの構成体をＣＯ３またはＣＨＯ細胞の中にトランスフェクションし、そしてＣＴＬＡ　４１ｇを精製しそして２量体として同定した。

ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク譬に相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡは、ブダペスト条約の規定に従いアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシボン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｃｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（米国マリイランド州ロックビレ）に１９９１年５月３１日に受託され、そしてＡＴＣＣ受は入れ番号６８６２９を与えられた。

本発明は、可溶性融合タンパク質の形態でＣＴＬＡ　４転写体の第１タンパク質生産物を提供する。ＣＴＬＡ　４タンパク質はほぼ５０，０００サブユニツトのＭ、のジサルファイド連鎖の２量体を形成し、天然のＣＴＬＡ４がＴ細胞表面上にジサルファイド連鎖ホモ２量体として多分存在することを示す。

Ｂ７抗原はＴ細胞上のＣＤ２８レセプターのためのリガンドであることが示された（Ｌｉｎｓｌｅｙら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ、前掲）。

ＣＴＬＡ　４レセプタ一分子はＣＤ２Ｂレセプターに機能的にかつ構造的に関係すると思われる；両者はＢ細胞活性化抗原のためのレセプターであるが、ＣＴＬＡ　４は、リンパ系付着系についてこれまで報告された最高のもの中で、Ｂ７に対するより高い親和性を有するように思われる。

しかしながら、ＣＴＬＡ　４１ｇはＣＤ２８１ｇよりＢ７陽性（Ｂ７”　）細胞系にいっそう強く結合することが示された。他の実験において、ＣＴＬＡ　４はＢ７抗原に対してＣＤ２８レセプターより高い親和性のレセプターであることが証明された。さらに、ＣＴＬＡ　４１ｇはＢ７抗原に大きさが類似するりンバ芽球球細胞上の単一のタンパク質に結合することが示された。

ＣＴＬＡ　４１ｇはＴ細胞増殖を阻止し、そしてＴゎ誘発１ｇＭ生産を阻止した。

他の好ましい態様において、異なるレセプタータンパク質の断片に相当するアミノ酸配列を有するハイプリント融合タンパク質を構成した０例えば、ＣＤ２ＢおよびＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインの選択した断片に相当するアミノ酸配列を連鎖して、ＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４１ｇハイブリッド融合タンパク質を形成した。こうして、第１アミノ酸配列を有するＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４　ｒｇ融合タンパク質が得られ、この第１アミノ酸配列はＣＴＬＡ　４１ｇの細胞外ドメインの断片に相当する第２アミノ酸配列およびヒトＩｇＣγ１のヒンジ、ＣＩ’ ＋２およびｃｕａｓＩ域に相当する第３アミノ酸配列に接合した、ＣＤ２Ｂの細胞外ドメインの断片に相当するアミノ酸残基を含有する。ハイプリント融合タンパク質の１つの態様は第１アミノ酸配列を有するＣＤ２８１ｇ／　ＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合構成体であり、この第１アミノ酸配列ｃ；１ｃｏ２ａの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位１９４のアミノ酸残基を含有し、ＣＤ２８はＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置９４〜杓位１１２５のアミノ酸残基を含有する第２アミノ酸配列に接合し、ＣＴＬ八４へヒトＩｇＣ７１のヒンジ、ＣＩ（２およびＣＨ３？＋Ｉ域に相当する第３アミノ酸配列に接合している。

ＣＴＬＡ　４レセプタータンパク質、可溶性融合タンパク質およびハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮ＾配列をクローニングしそして発現する技術、例えば、オリゴヌクレオチドの合成、ＰＣＲ、細胞の形質転換、ベクターの構成、発現系などはこの分野においてよく確立されており、そしてほとんどの熟練者は特定の条件および手順のための標準的源材料をよく知っている。しかしながら、必要に応して便利および変更の注釈のために次の節を準備し、そしてこれらの節はカイトラインの役Ｈをするであろう。

レセブ　−および　Ａ　ンバク　のためのコーディング　１のクローニングおよび本発明のＣＴＬＡ　４１．を特性決定しかつＣＤ２８　Ｉｇ／　ＣＴＬＡ　４１　ｇ融合ハイブリッドを調製するためのＣＤ２８１ｇＣｒ１およびＢ７ＩｇＣｒ　１に相当する融合タンパク質の構成体を、Ｌｉｎ５ｌｅｙ　ら、Ｊ、　ＩＥＸ　、　Ｍｅｄ、　１７３　：　７２１−７３０　（１９９１）（これを引用によって加える）に記載されているように調製した。あるいは、Ｂ７抗原およびＣＤ２８レセプターを発現する細胞から、これらのタンパク質について発表された知！ｍ　（ｌｌｒｕｆｆｏおよび５ｃｃｄ、およびｐｒｅｅｍａｎ　、前掲）に基づいて標準的手順を使用して、ｃＤＮＡクローンを調製することができる。

ＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインおよびヒトＩｇＣＴ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ｆｉｉ域に相当するに相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡから成るＣＴＬＡ　４１ｇ融合体を、ＰＣ’Ｒ断片の結合により構成した。

アミノ酸をエンコードするｃＤＮＡを、ポリメラーゼ連鎖反応（ｒＰＣＲＪ　）技術に従い増幅する（米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４．６８３，２０２号（Ｍｕｌｌｉｓら）、およびＭｕｌｌｉｓおよびＦａ［ｏｏｎａ、　Ｍｅｔｈｏｄｓハ■鯰ム１５４　：　３３５−３５０　（１９８７）を参照のこと）　、　ＣＴＬＡ　４　ｒｇ融合ポリペプチドを構成し、これらのポリペプチドはＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約位置１〜約位置１２５のアミノ酸残基を含有するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡ　、およびＩｇＣｒｌのヒンジ、Ｃ１（２および（Ｈ３ｅ！Ｉ域に相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡを有した。

ヒトリンパ系細胞の中のＣＴＬＡ　４レセプタータンパク質の発現は従来報告されてきていないので、ＣＴＬＡ　４のｌｌＲＮＡ源を探すことが必要であった。

いくつかのヒト白血病細胞系の全体の細胞の！ｌＮＡから作ったＰＣＲのｃＤＮＡを、プライマーとして、ＣＴＬＡ　４遺伝子の発表された配列かのオリゴヌクレオチドを使用してスクリーニングした（Ｄａｒｉａｖａｃｈ　ら、前掲）。試験したｃＯＮＡのうちで、１（３８！胞（ＩＩＴ［、Ｖ■関連白血病系統）は期待したサイズを有するＰＣＲ生産物の最良の収量を提供した。ＣＴＬＡ　４の単一のペプチドはＣＴＬＡ　４遺伝子の中で同定されなかったので、ＣＴＬＡ　４の予測された配列のＮ末端をオンコスタチインＭのシグナルペプチド（Ｍａｌｉｋら、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　９　：　２８４７　（１９８９））に、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドを使用して融合した。　ＰＣＲ反応の生産物を、ＩｇＣｒｌのヒンジ、Ｃ）１２およびｃＨａｔｉＩ域に相当するアミノ酸配列をエンコードするｃＤＮＡを使用して、発現ベクター、例えば、Ｃ０Ｍ８またはπＬＭの中に結合した。

全長のヒトＣＴＬＡ　４をエンコードする［ｌＮＡを得るために、ＣＴＩ、Ａ　４のトランスメンブレンおよび細胞質ドメインをエンコードするｃＤＮＡを８３８細胞からＰＣＨにより構成し、そしてＣＴＬＡ　４のＮ末端に融合したオンコスタチインＭシグナルペプチドをエンコードする、前述したように構成した、ＣＴＬＡ　４１ｇからの断片と、下の実施例に記載するオリゴヌクレオチドのプライマーを使用して接合した。　Ｐｃｔ？断片をプラスミドＣＤＭ８の中に結合して、全長のＣＴＬＡ　４をエンコードする発現プラスミドを生成し、そしてこれをＯＭＣＴＬＡ　４と表示した。

ハイブリッド融合タンパク質に相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡを構成するために、１つのレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするＤＩＪＡを、他のレセプター遺伝子の細胞外ドメインの部分に相当するアミノ酸をエンコードするＤＮＡ　、およびヒトｒｇｃｒ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３領域に相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡに、Ｂ７１ｇＳＣＤ２８１ｇおよびＣＴＬＡ　４１ｇ構成体について前述した手順を使用して接合する。

こうして、例えば、ＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインに相当するアミノ酸配列の約１位置〜約９４位置のアミノ酸残基をエンコードするＤＮＡを、ＣＴＬＡ　４レセプターの細胞外ドメインのアミノ酸配列の約位置９４〜約位置１２５のアミノ酸残基をエンコードするＤＮＡ　、およびヒト■ｇＣＴ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ｔｉｉ域に相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡに接合する。

大量のクローニングしたＤＮＡを生産するために、本発明の融合構成体をエンコードするＤＮＡを含有するベクターを適当な宿主細胞、例えば、細菌細胞系の大ＮＩｒＭ　（Ｅ、　ｃｏ目）　ＦＩＣ１０６１／ｐ３株（Ｉ　ｎ　ｖ　ｒ　ｔｒｏｇｅｎＣｏｒｐ、　、カリフォルニア州すンディエゴ）の中に標準的手順を使用して形質転換し、そしてコロニーを適当なプラスミドについてスクリーニングする。

次いで、前述したようにして得られた融合構成体をエンコードするＨＡを含有するクローンを、発現のために適当な宿主細胞の中にトランスフェクションする。

使用する宿主細胞に依存して、このような細胞に適当な標準的技術を使用してトランスフェクションを実施する。例えば、哺乳動物細胞中のトランスフェクションは、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフエフシラン、ＣａＰＯａ共沈、リボフエク’ｉ　ｑ　７　（Ｉｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、エレクトロボレイションまたは原形質体の融合、および他のこの分野において知られている方法により達成し、ここで後者の方法は次のものを包含する：リゾチームの融合また１よ赤血球の融合、スフレイピング、直接的吸収、浸透圧またはスクロースのシヨ、り、直接的マイクロインジェクション、間接的マイクロインジェクション、例えば、赤血球仲介技術を介するマイクロインジェクション、および／または宿主細胞を電流に暴露する。

遺伝的情報を細胞の中に導入する他の手順は疑いなく開発されるであろうから、上に列挙したトランスフェクションの技術はｗｉ羅的であるお考えられない。

多細胞の生物から誘導化された真核生物の宿主細胞の培養物の中の発現は好ましい（Ｔｉｓｓｕｒｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ　＆Ｂ、（１９７３）を参照のこと）、これらの系はイントロンをスプライスする能力をもつという追加の利点を有し、こうしてゲノム断片の発現に直接使用することができる。ｆ用な宿主細胞系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＩ（Ｏ）細胞、サル腎臓（ＣＯ３）細胞、ＶＥＩ？Ｏ細胞およびＨｅＬａ細胞を包含する。本発明において、融合構成体を安定に発現する細胞系は好ましい。

このような細胞のための発現ベクターは、通常、哺乳動物細胞と適合性のプロモーターおよびコントロール配列、例えば、ＣＭＶプロモーター（Ｃ０Ｍ８ベクター）および鳥類の肉腫ウィルス（ＡＳＶ）　（πＬＮベクター）を包含する。他の普通に使用される前期および後期のプロモーターは、サルのウィルス４０　（ＳＶ４０）　（Ｆｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ　２７３　：１１３　（１９７３））　、または他のウィルスのプロモーター、例えば、ポリオーマから誘導化されたもの、アデノウィルス２、およびウシ乳頭腫ウィルスを包含する。コントロール可能なプロモーター、ｈ？ＩＴＩＩ（Ｋａｒｉｎ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　２９９　：　７９７−８０２　（１９８２））をまた使用することができる。哺乳動物細胞の宿主系の形質転換についての一般的面ば、Ａｘｅｌ　（米国特許第４，３９９，２１６号、１９８３年８月１６日発行）により記載された。現在明らかなように、「エンハンサ−Ｊ６Ｎ域は発現を最適化するとき重要である；これらは、一般に、非コーディング領域の中のプロモーター領域の上流または下流に見いだされる配列である。

必要に応して、複製の由来をウィルス源から得ることができる。しかしがら、染色体中の組み込みは真核生物におけるＤＮＡの複製のための普通のメカニズムである。

融合構成体の発現のために好ましい真核生物の細胞、例えば、ＣＯＳまたはＣｌｌ０細胞を包含するが、他の真核生物の微生物を使用できる。サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏ＋＊ｙｃｅｓ　ｃｃｒｅｖｉｓｉａｅ）、イーストの実験室用菌株をたいてい使用するが、他の菌株、例えば、シゾサン力ロミセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）を使用できる０例えば、Ｂｒｏａｃｈ、　Ｍｃｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　１０１　：　３０７　（１９８３）の２μの複製由来、または他の酵母適合性の複製由来（例えば、５ｔｉｎｃｈｃｏｓｂら、ルビｕｒｅ　２８２　：　３９　（１９７９））　；　Ｔｓｃｈｅｒａｐｅら、Ｇｅｎｅ　１０　：１５７　（１９８０）　；およびＣ１ａｒｋｅら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ、　１０１　：　３００　（１９８３）を参照のこと）を用いるベクターを使用することができる。酵母のベクターのためのコントロール配列は、グリコール分解酵母の合成のためのプロモーターを包含する（ｌｅｓｓら、Ｊ、　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｒｅｇ。

７　：　１４９　（１９６８）　；　Ｈｏ１ｌａｎｄら、Ｂｉｏｃｈｃｍｉｓｔｒ　、　１７　：　４９００　（１９７８））。

この分野において知られている追加のプロモーターは、Ｃ０Ｍ８ベクターの中に提供されたＣＭＶプロモーター（ＴｏｙａｍａおよびＯｋａｙａｍａ、ＦＥＢＳ２６８　：　２１７−２２１　（１９９０）　；３−ホスホグリセレートキナーゼのためのプロモーター（Ｈ４ｔｚｅｍａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｗ、　２５５　：　２０７３））　、および他のグリコール分解酵素のためのプロモーターを包含する。成長条件によりコントロールされる転写の追加の利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ５酸性ホスファターゼ、窒素の代謝に関連する分解酵素、およびマルトースおよびガラクトースの利用に関係する酵素のためのプロモーター領域である。また、ターミネータ−配列はコーディング配列の３′末端に゛おいて望ましいと信じられる。このようなターミネータ−は、酵母誘導化遺伝子の次の３′−非翻訳領域の中に見いだされる。

あるいは、原核生物の細胞を発現のための宿主として使用することができる。原核生物の細胞は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）の種々の株により最も頻繁に発現される；しかしながら、他の微生物の菌株も使用できる。ここにおいて転写開始のためのプロモーターを、必要に応じてオペレーターとともに含むと定義される、普通に使用される原核生物のコントロール配列は、リポソーム結合部位の配列と一緒に、ベーターラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇ　ら、Ｎａｔｕｒｅ　１９８　：　１０５６　（１９７７））、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ　ら、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　８　：　４０５７　（１９８０））およびラムダ誘導化Ｐ。

プロモーターおよびＮ−遺伝子リポソーム結合部位（Ｓｈｉｗａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ　２９２　：　１２８　（１９８１））のような普通に使用されているプロモーターを包含する。

ＣＤ２８ＩｇおよびＣＴＬＡ　４１ｇタンパク質、および融合ハイゾリッドタンパク質、例えば、ＣＤ２８１ｇ／ＣＴＬＡ　４　Ｉｇを後述するように種々の系の中で発現することができる。　ｃＤＮ＾を適当な制限酵素で切り出し、そしてこのような発現について適当な原核生物または真核生物の発現ベクターの中に結合することができる。　ＣＤ２８およびＣＴＬＡ　４レセプターのタンパク質は天然に２量体として存在するので、これらのタンパク質の首尾よい発現はこれらのタンパク質を２量体として形成することを可能とする発現系を必要とすると信じられる。これらのタンパク質の切頭バージョン（すなわち、タンパク質のトランスメンブレン領域より上流の位置において配列の中に停止コドンを導入することによって形成される）は発現されると思われない、　ＣＤ２８およびＣＴＬＡ　４レセプターの融合タンパク質としての発現は、これらのタンパク質の２量体の形成を可能とする。こうして、ＣＴＬＡ　４タンパク質の融合生産物としての発現は、本発明において好ましい。

チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＴＬＡ　４１ｇ−２４と表示する本発明の安定なＣｕＯ系はＣＴＬＡ　４１ｇの発現のために好ましく、そしてブダペスト条約の規定に従い＾ＴＣＧに１９９１年５月３１日に受託され、そしてＡＴＣＣ受は入れ番号１０７６２を与えられた。

本発明のＣＴＬＡ　４レセプターの発現は、細胞系、例えば、ＣＯＳ細胞をトランスフェクシヨンし、そしてＣＴＬＡ４）ランスフエフシランした細胞をＣＴＬＡ　４レセプターに結合することによって、例えば、細胞の８７１ｇ融合タンパク質への結合について経験することによって、発現を検出して達成される。

生ずる構成体の配列は、既知の手順、例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｅｔ、　ＵＳＡ　７４　：　５４６３　（１９７７）に記載されている、さらにＭｃｓｓｉｎｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　９　：　３０９　（１９８１）に記載されている手順を使用するＤＮＡの配列決定によるか、あるいはＭａｘａｍ　ら、Ｍｃｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　６５　：　４９９　（１９８０）の方法により確証される。

タンパク　の前述したように、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ　４レセプターの遺伝子は、切頭タンパク質をエンコードするＤＮＡの直接の発現を使用して成熟タンパク質として容易に発現されない。ホモ２量体の形成を可能とするために、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインに相当し、そしてシグナル配列、例えば、適当なプロセシングを行うことができる細胞中のオンコスタチインＭの配列のためのコドンを含むアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡを、天然に２量体のタンパク質のＦｃドメインに相当するアミノ酸配列をエンコードするＤＮＡと融合する。こうして、細胞から分泌された後のこれらの融合タンパク質の生産物の精製は、融合タンパク質の抗免疫グロブリン部分と反応性の抗体を使用して促進される。融合タンパク質の生産物は、培地の中に分泌されると、タンパク質の標準的精製技術、例えば、プロティンＡカラムへの適用により回収される。

使−里ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質および／またはその融合タンパク質の断片を使用してＢ７陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、Ｂ７抗原陽性細胞とのＴ細胞の相互作用により仲介される免疫応答を調節することができる。

ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質およびＣＴＬＡ　４　Ｉｇ／ＣＤ２８１ｇハイブリッドタンパク質、および／またはこれらのタンパク質の断片および誘導体を、また、使用して、Ｂ７陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させて、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞の応答により仲介される免疫応答をｔｔｉｉ＊することができる。用語「断片」は、ここにおいて使用するとき、ｒＣＴＬＡ　４　Ｊと呼ぶタンパク質をエンコードするアミノ酸配列の部分を意味する。使用できるＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合のタンパク質の断片は、ここに記載するＣＴＬＡ　４　ｒｇ融融合タンパクモ得るために使用するＣＴＬＡ　４レセプターに相当するアミノ酸配列のある部分に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドである。

活性化されたＢ細胞および他の系統の細胞上で発現されたＢ７抗原、およびＴ細胞上で発現されたＣＤ２８レセプターを互いに直接結合することができ、そしてこの相互作用は細胞−細胞の相互作用を仲介することができる。このような相互作用は、Ｔ細胞の増殖、および免疫グロブリン生産細胞へのＢ細胞の分化に導く、Ｔ細胞の中のＣＤ２８活性化経路を直接トリガーする。起こるＢ細胞の活性化は、Ｂ７抗原の発現を増加し、さらにＣＤ２８を刺激して、慢性の炎症の状態、例えば、自己免疫疾病、異種移植の拒絶、移植片対宿主の疾患または慢性のアレルギー反応に導くことがある。この反応をブロックまたは阻止することは、Ｔ細胞のサイトカインの調製を防止し、こうして炎症反応を防止または逆転するとき有効であることがある。

ＣＴＬＡ　４　Ｉｇは、ここにおいて、Ｔ細胞およびＢ細胞の相互作用を必要とするｉｎ　ｖｉｔｒｏリンパ球機能の効力のあるインヒビターであることが示された。これはＢ７抗原およびその対レセプター、ＣＴＬＡ　４および／またはＣＤ２８の間の相互作用の重要性を示す。ネズミおよびヒトのＣＴＬＡ　４の細胞質ドメインは類似しくＤａｒｉａｖａｃｈ　ら、前掲、１９８８　）、この領域が重要な機能的性質を有することを示唆する。また、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ　４の細胞質ドメインは相同性を共有する。

ＣＴＬＡ　４は、抗ＢＢＩまたは抗ＣＤ２８モノクローナル抗体よりも、いっそう効力のあるリンパ球の応答のｉｎ　ｖｉｔｒｏインヒビターである。

ＣＴＬＡ　４１ｇは、その阻止作用と反作用するＴ細胞の増殖に対する直接の刺激作用をもたない、したがって、ＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合タンパク質は抗ＣＤ２８モノクローナル抗体よりもすぐれたｉｎ　ｖｉｖｏインヒビターとして働くことができる。　ＣＴＬＡ　４１ｇのｉｎ　ｖｉｔｒｏ免疫抑制作用は、異常なＴ細胞の活性化またはＩｇの生産を包含する自己免疫疾患の処置の治療におけるその使用を示唆する。

ＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合タンパク譬は、ｉｎ　ｖｉｖｏ阻止性質を示すことが期待された。こうして、ＣＴＬＡ　４　Ｉｇは、同様なｉｎ　ｖｉｖｏ条件下に抗ＣＤ２８抗体について観察される作用に類似する方法で、Ｔ細胞を阻止する作用をすることが期待される。Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用がＴ細胞とＢ細胞との間の接触の結果として起こる条件下に、Ｂ７抗原陽性細胞、例えば、Ｂ細胞と反応させために導入されたＣＴＬＡ　４　ｒｇの結合は、Ｔ細胞／Ｂ細胞の相互作用を妨害、すなわち、阻止して免疫応答の調節を生ずることができる。この独占的な阻止作用のために、ＣＴＬＡ　４Ｉｇは生体内でＴ細胞の活性のインヒビターとして、非特異的インヒビター、例えば、シクロスポリンまたはグルコステロイドよりも有用であることが期待される。

１ツノ！ｔＪ、様におい７、ＣＴＬＡ　４　ｒｇ融合タンパク譬またはＣＴＬＡ　４１ｇ／ＣＤ２８１ｇハイブリッドタンパク質は、過当な製剤学的担体と組み合わせてｉｎ　ｖｉｖｏ導入する、すなわち、病理学的状態、例えば、免疫系の疾患または癌の処置のためにヒトの投与することができる。融合タンパク質のｉｎ　ｖｉｖｏ導入は、Ｔ細胞と他の細胞、例えば、Ｂ細胞との相互作用を、Ｂ７陽性細胞へのりガントの結合の結果として、妨害することが期待される。正常のＴ細胞の相互作用の防止は、Ｔ細胞の活性を減少し、例えば、Ｔ細胞の増殖を減少することができる。

さらに、融合タンパク質のｉｎ　ｖｉｖｏ投与はサイトカインのｉｎ　ｖｉｖ。

レベルの調節して被検体において所望の作用を促進することが期待され、ここでサイトカインは次のものを包含するが、これらに限定されない：インターロイキン、例えば、インターロイキン（「ル」）−２，ＩＬ−３，ＩＬ−４，ＩＬ−６，ＩＬ−８，成長因子、例えば、腫瘍成長因子（「ＴＦＧ　Ｊ　）　、コロニー刺激因子（ｒｃｓＦ　Ｊ　）　、インターフェロン（ｒｌＦＮ　Ｊ　）および腫瘍壊死因子（ｒＴＮＦ　、　）　、例えば、融合タンパク質をｉｎ　ｖｉｖｏ導入するとき、それは悪性の増殖、例えば、腫瘍細胞の増殖に寄与するサイトカインの生産をブロックすることができる。融合タンパク質は、また、Ｔ細胞の活性化に依存するウィルス、例えば、エイズを引き起こすウィルス、ＨＴＬＶ　１の増殖をブロックすることができる。

ある環境下に、前述したように、ＣＴＬＡ　４　Ｔｇ融合タンパク質またはその断片のｉｎ　ｖｉｖｏ投与の作用は阻止であり、Ｔ細胞／Ｂ細胞の接触から生ずるＣＴＬＡ　４およびＣＤ２８のトリガーの融合タンパク質によるブロッキングから生ずる０例えば、ＣＴＬＡ　４１ｇタンパク質はＴ細胞の増殖をブロックすることができる。こうして、ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質のｉｎ　ｖｉｖｏ導入は、Ｔ細胞およびＢ細胞の両者が仲介する免疫応答に対する作用を生成するであろう、また、融合タンパク質をサイトカインまたは他の治療用試薬の導入と組み合わせて被検体に投与することができる。

本発明の追加の態様において、ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質またはＣＴＬＡ　４レセプターと反応性の誘導体を包含する他の試薬を使用してＴ細胞の相互作用を調節する。例えば、ＣＴＬＡ　４レセプターと反応性の抗体および／または抗体断片をスクリーニングして、Ｂ７抗原へのＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質の広いスペクトルのを阻止することができるものを同定することができる。次いで、抗体または抗体断片、例えば、ＦａｂまたはＦ　（ａｂ’　）　ｚ断片を使用して、例えば、Ｔ細胞と反応させてＴ細胞の増殖を阻止することができる。

ＣＴＬ＾４レセプターと反応性のモノクローナル抗体は、既知の手順、例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ　（ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｎａｔｕｒｅ＋２５６　：　４９５−９７　（１９７５））により導入された手順、およびその変更により生成して、細胞の相互作用を調節することができる。

これらの技術は、特定の抗体を生産するようにブライミングした動物の使用を包含する。動物は免疫原（例えば、８７１ｇ融合タンパク質、ＣＴＬＡ　４　［ｇ融合タンパク質またはＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ　４　Ｉｇハイブリッド融合タンパク質）の注入によりブライミングして、所望の免疫応答、すなわち、ブライミングされた動物からの抗体の生産を引き出すことができる。また、ブライミングされた動物は疾患を発現する動物である。ブライミングされた病気の動物のリンパ節、肺臓または末梢血液から誘導化されたリンパ球を使用して、特定の抗体を探索することができる。所望の免疫グロブリンをエンコードするリンパ球の染色体を、一般に融合剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の存在下に、リンパ球を骨髄腫細胞と融合することによって、永久分裂能化する。ある数の骨髄腫細胞系、例えば、Ｐ３−ＮＳＩ／１−Ａｇ４−１　、　Ｐ３−　ｘ６３−Ａｇ８　、６５３．　Ｓｐ２／　０−Ａｇ１４、または１（Ｌｌ−６５３骨髄腫系統の任意のものを、標準的技術に従い、融合相手として使用することができる。

これらの骨髄腫系統はＡＴＣＣ（米国マリイランド州ロックビレ）から入手可能である。

次いで、所望のハイブリドーマを包含する生ずる細胞を選択培地、例えば、ＨＡＴ培地の中で成長させ、ここで未融合の親の骨髄腫またはリンパ球の細胞は究極的に死亡する。ハイブリドーマ細胞のみは生き残り、そして制限希釈の条件下に成長して単離されたクローンを得ることができる。ハイブリドーマの上澄み液を、例えば、免疫化に使用したＣＴＬＡ　４１ｇタンパク質を使用するイムノアッセイ技術により、所望の選択性の存在についてスクリーニングする０次いで、陽性のクローンを制限希釈の条件下にサブクローニングし、そして生成したモノクローナル抗体を単離することができる。

モノクローナル抗体の単離および精製の種々の普通の方法を使用して、他のタンパク質および汚染物質を含有しない抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を精製する普通に使用されている方法は、硫酸アンモニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、およびアフィニティクロマトグラフィーを包含する（Ｚｏｌａら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ｈｂｒｉｄｏｍａ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　：　Ｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　ａｎｄ　Ａ　ｌ１ｃａｔｉｏｎｓＨｕｒｅｌｌｌｉ、ｐ、　５１−５２　（ＣＲＣＰｒｅｓｓ、　１９８２を参照のこと）。これらの方法に従い生産されたハイブリドーマは、この分野において知られている技術を使用してｉｎ　ｖｉｔｒｏまたは１ｎｖｉｖｏ（腹水の中で）増殖することができる（一般に、Ｐｉｎｋら、Ｐｒｏ　、　Ｃｌ１ｎ、　Ｐａｔｈｏｌ、、　９　：１２１−３３　（１９８４）、　Ｆｔｇ、　６−１．　ｐ、　１２３を参照のこと）。

一般に、個々の細胞系を、例えば、実験室用容器の中でｉｎ　ｖｉｖ。

増殖させ、そして高い濃度の単一の特定のモノクローナル抗体を含有する培地をデカンテーシヨン、濾過または遠心により収穫することができる。

さらに、ＣＴＬＡ　４レセプターの細胞外ドメインと反応性の活性結合領域を含有するこれらの抗体の断片、例えば、Ｆａｂ　、Ｆ　（ａｂ′）　！およびＦｖ断片を生成することができる。このような断片は、この分野においてよく確立された技術を使用して生成することができる（例えば、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ　ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１２１　：　６６３−６９゜Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　（１９８６）を参照のこと）。

前述したようにして調製した抗Ｂ７モノクローナル抗体を使用してＢ７抗原に結合させて、ＣＤ２８陽性またはＣＴＬＡ　４陽性のＴ細胞とＢ７陽性細胞との相互作用を阻止することができる。抗ＣＴＬＡ　４モノクローナル抗体を使用してＣＴＬＡ　４レセプターと結合させて、ＣＴＬＡ　４陽性Ｔ細胞と他の細胞との相互作用を阻止することができる。

他の態様において、ＣＴＬＡ　４１ｇ融合タンパク質を使用して、ＣＴＬＡ　４とＢ７抗原との間の相互作用をＵ！４節できる追加の化合物を同定することができる。このような化合物は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞と反応させるために使用できる天然に見いだされる小さい分子を包含することができる０例えば、発酵プロスをＣＴＬＡ　４　／Ｂ７の相互作用を阻止する能力について試験することができる。さらに、前述のＣＴＬＡ４１ｇ融合タンパク質の誘導体を使用してＴ細胞の増殖を調節することができる０例えば、断片または誘導体を使用して、異種移植の骨髄の移植に伴う移植片対宿主（ＧＶＨ）の疾患におけるＴ細胞の増殖をブロックすることができる。ＣＤ２８仲介Ｔ細胞増殖経路は、ｃｏ３／Ｔ細胞のレセプター複合体により与えれる増殖（Ｊｕｎｅら、１９８７、前掲）と対照的に、シクロスポリン耐性である。シクロスポリンはＧＶＨ疾患のための処置として比較的無効である（Ｓｔｏｒｂ、　Ｂｌｏｏｄ　６８　：　１１９−１２５　（１９８６））　、　ＧＶＨ疾患は、ＣＤ２８抗原を発現するＴリン３球ニヨり仲介されると考えられる（ＳｔｏｒｂおよびＴｈｏｍａｓ、　Ｉｓｍｕｎｏｌ、　Ｒｅｖ、　８８　：２１５−２３８　（１９８５））。こうして、ＣＴＬＡ　４　ｒｇ融合タンパク質は、単独で、あるいは免疫抑制剤、例えば、シクロスポリンと組み合わせて、ＧＶＨ疾患におけるＴ細胞の増殖のブロッキングに有用であることができる。

こうして、Ｂ細胞を包含するＢ７陽性細胞とのＣＴＬＡ　４陽性Ｔ細胞の相互作用の本発明の方法による調節を使用して、病理学的状態、例えば、自己免疫性、移植、感染症および新形成を処置することができる。

次の実施例によって、本発明をさらに説明しかつ当業者による本発明の実施および使用を助ける。これらの実施例は本発明を限定しない。

レセプター−免疫グロブリンＣｒ（ＩｇＣγ）融合タンパク質８７１ｇ及びＣＤ２８１ｇを、本発明において引用により組込まれる、Ｌｉｎ５ｌｅｙなど、、− り一鉦且工肋組、　１７３　：　７２１〜７３０　（１９９１）により記載されているようにして調製した。簡単に言えば、それぞれのレセプタータンパク質（たとえばＢ７）に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡを、ヒト１ｇｃｒｌのヒンジ、Ｃ）１２及びＣＨ３５ｉ域に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡに連結した。これは次のようにして達成される。

ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）。ＰＣＲのために、ＤＮ＾フラグメントを、個々の融合タンパク質について下記のようにしてプライマ一対を用いて増幅した。ＰＣＲ反応（０，１の最終体積）を、ハトポリメラーゼ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ＋　ＣＡ）において行ない、ここで前記緩衝液は、個々のｄＮＴＰ２０μモル；前記に示されたプライマー５０〜１００ｐモル；鋳型（引用により本明細書において組込まれる、Ｋａｕａｓａｋｉ＋　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ＋　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　２１〜２７ページ（１９９０）により記載されるようにして、ランダムヘキサマープライマーを用いて合計 ≦１μｇのＲＮＡから合成されたプラスミド又はｃＤＮＡ　１　ｎｇ）　；及びにポリメラーゼ（Ｓ　ｔｒａ　ｔａｇｅｎｅ）を含んだ０反応は、１６〜３０回のサイクル（典型的なサイクルは、９４°Ｃで１分、５０°Ｃで１〜２分及び７２°Ｃで１〜３分の段階から成る〕のためにサーモサイクラ−（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｏｒｐ、　Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣＴ）上で行なわれた。

７”　−Ｚ　Ｓ　’Ｆ（Ｄ　、　Ａｒｕｆｆｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

丈μｍ８４　：　８５７３　（１９８７）により記載されるような、Ｃ［１２８をコードするｃＤＮＡを含む発現プラスミドが、Ｄｒｓ、　Ａｒｕｆｆｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ　（Ｍａｓｓ　ＧｅｎｅｒａｌＨｏｓｐｉｔａｌ　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）により供給された。Ａｒｕｆｆｏ、　Ｃｅｌ＋　６１　：　１３０３（１９９０）により記載されるような、Ｃｌ１５をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドがＤｒ、　Ａｒｕｆｆｏにより供給された。　Ｆｒｅｅｍａｎなど、、Ｊ、Ｉ＋＋ｍｕｎｏｌ。

１４３　：　２７１４　（１９８９）　により記載されるような、Ｂ７をコードするｃＤＮＡを含むプラスミドは、叶、　Ｆｒｅｅｍａｎ　（Ｄａｎａ　Ｆａｒｂｅｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ。

Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）により供給された。ＣＤ２８及びＢ７の可溶性形の発現での初期状みのために、構成体をＬｉｎ５ｌｅｙなど、、」ユハムＭｅｄ、１Ｍにより記載されているようにして製造しく０ＭＣＤ２８及びＯＭＢ７）　、ここで停止コドンがトランスメンブランドメインの上流に導入され、そして生来のシグナルペプチドがオンコスタチインＭ　（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ　Ｍ）（Ｍａｌｉｋなど、、　Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　９　：　２８４７　（１９８９））からのシグナルペプチドにより置換された。それらは、再構成のための合成オリゴヌクレオチド（０？ＩＣ０２８＞を用いて又はＰＣｌｌのためのプライマー（ＯＭＢ７）として製造された。０ＭＣＤ２８は、シグナルペプチドをオンコスタチインＭからの類似領域により置換することによってより効果的な発現のために変性されたＣＤ２８　ｃＤＮＡである。　ＣＤ２８１ｇ及びＢ７Ｉｇ７ｌ構成体を２つに分けて製造した。５′部分を、鋳型として０ＭＣＤ２８及びＯＭＢ７及び前方プライマーとしてオリゴヌクレオチド、ＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡ（：ＡＣ（配列番号１）（オンコスタチイン間シグナルペプチドに対応するアミノ酸配列をコードする）及び逆方向プライマーとしてＴＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＴＴＡＧＡＡＧＧＴＣＣＧＧＧＡＡＡ　（配列番号２）又は、ＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧＣＴＴＧＧＴＴＧＴ　（配列番号３）のいづれかをそれぞれ用いて製造した。　ＰＣＲ反応の生成物を、ＰＣ１１プライマーに導入される部位として制限エンドヌクレアーゼ（Ｈｉｎｄ■及びＢｃｌｌ）により切断し、そしてゲル精製した。

ヒ）ＩｇＣγ１配列に対応する融合構成体の３′部分を、鋳型として、ヒト−マウスキメラ−ＡＢ　Ｌ６を生成する骨髄細胞系（Ｏｒ、　Ｐ、　Ｆｅ１ｌａｎｄ　Ｍ、　Ｇａｙｌｅ＋　Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　５ｑｕｉｂｂ　Ｃｏｎｙａｎｙ、　ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　５ｅａｔｔｌｅ＋−八により供給される）からのＲＮＡを用いて、連結された逆転写酵素（トリ骨髄芽症ウィルスからの；Ｌｉｆｅ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、　Ｂａｙｐｏｒｔ、　ＮＹ）−ＰＣＲ反応により製造した牽オリゴペプチド、すなわちＡ　Ａ　ＧＣＡ　Ａ　Ｇ　ＡＧＣＡ　ＴＴＴＴＣＣＴＧＡ　ＴＣＡ　ＧＧ　ＡＧＣＣＣＡ　Ａ　ＡＴＣＴＴＣＴＧ　ＡＣＡ　Ａ　Ａ　ＡＣＴbＡＣＡ　ＣＡ　ＴＣＣＣＣＡＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧ（：ＡＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧ　（配列番号４）を前方プライマー及びＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＧＡＣＣＧＣＧＡＧＡＧＣ（配列番号５）を逆方向プライマーとして使用した０反応生成物をＢａｌ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉにより切断し、そしてゲル精製した。最終生成物を、ＩｇＣｒｌ配列を含む、Ｂｃｌ　Ｉ／Ｘｂａ　ｒ切断されたフラグメントと共に、ＣＤ２８又はＢ７配列を含む、旧ｎｄＩ［［／Ｂｃｌ　Ｉ切断されたフラグメントを、旧ｎｄｌｌｌ／Ｘｂａ　Ｉ切断されたＣＤ２８中に連結することによってアセンブリーした。

連結生成物を用いてＭＣ１０６１／ｐ３　Ｅ、コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドのためにスクーンした。得られた構成体の配列を、ＤＮＡ配列決定によりｆｌ！認した。

Ｂ７をコードする構成体は、Ｂ７の細胞外ドメインの約１位〜約２１５位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするＤＮを含んだ。

ＣＤ２８をコードする構成体は、ＣＤ２８の細胞外ドメインの約１位〜約１３４位のアミノ酸残基に対応するアミノ酸をコードするＤＮＡを含んだ。

ＣＤ５１１ｇを、前方プライマーとしてＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧ　（配列番号６）及び逆方向プライマーとＬ　テＡＴＣＣＡＣＡＧＴＧＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧＧＣＡＴＧＴＧＡＣ（配列番号７）を用いて、同し！！樺で構成した。ＰＣＲ生成物を制限エンドヌクレアーゼ消化し、そして上記のようにしてＩｇＣγ１フラグメントにより連結した。得られた構成体（ＣＤ５１ｇ）は、ＣＤ５に対応する配列の１位〜３４７位のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する成熟タンパク譬、前記構成工程により導入された２つのアミノ酸（アミノ酸ＤＱ）、次にＩｇＣγ１領域に対応するアミノ酸をコードするＤＮＡをコードした。

”　びトランスフェクション。ｃｏｓ（モンキー腎細胞）を、引用により本発明に組込まれる、５ｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ　（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、８４　：　３３６５　（１９８７））の方法の変法を用いて、ＣＤ２８及びＢＴを発現する発現プラスミドによりトランスフェクトした。

細胞を、トランスフェクトする１８〜２４時間前、１０ｃｍの直径の培養皿当たり１０６個で接種した。プラスミドＤＮＡを、０．１ｍＭのクロロキン（ｃｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）及び６（１０ａ　ｇ　／１ｍｌのＤＥＡＥ　Ｄｅｘｔｒａｎを含む血清フリーＤ−ＥＭ　５　ｍｌに添加しく約１５μｇ／皿）、そして細胞を３７℃で３〜３．５時間インキュベートした。次に、トランスフェクトされた細胞をすぐに、ＦＢＳ中、１０％ジメチルスルホキシドにより処理しく約２分）、そして１０％ＦＣ５を含むＤ？ＩＥ）１において３７℃で１６〜２４時間インキュベートした。トランスフェクションの２４時間後、培養培地を除去し、そして血清フリーＤＭＥＭにより変換した（　６　ｍｌ　７皿）。インキュベーションを３７°Ｃで３時間続け、この時点で、古い培地を集め、そして新鮮な血清フリー培地を添加した。３７°Ｃでさらに３日後、古い培地を再び集め、そして細胞を捨てた。

ＣＤ２８．　ＣＤ５又はＢＴを発現するＣＨＯ細胞を、次の通りに、Ｌｉｎ５ｌｅｙなと、、　（１９９１）　肚により記載されるようにして単離した：簡単に）　言及すれば、ＣＤ２８．　（：Ｄ５又はＢＴを発現する安定したトランスフェクシントを、適切な発現プラスミド及び選択マーカー、ｐｓＶ’１ｄｈｆｒ（Ｌｉｎｓｌｅｙなと、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＋　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８７　：　５０３１　（１９９０））の混合物によるジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣（ｄｈｆｒ−ＣＨＯ）細胞の同時トランスフェクションの後火に、トランスフェクトを、１μＭの最終レヘルまでメトトレキセートの徐々に高まる濃度で増殖し、そして１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２−門のプロリン及び１μＭのメトトレキセートにより補充された□ＭＥＨに維持した。高レベル０）　ＣＤ２８　（ＣＤ２８　’　ＣＨＯ）又はＢＴ　（ＢＴ”　ＣＨＯ）を発現するＣＨＯ系を、＊Ａｂｓ９．３又はＢＢ−１による間接的な免疫染色に従って、複数回の螢光活性化細胞ソーチング（ＦＡ（１：Ｓ　（Ｒ））により単離した。ＣＤ２８又はＢＴの表面発現のために陰性の増幅されたＣＨＯ細胞をまた、ＣＤ２８−）ランスフェクトされた集団がらＦＡＣＳ　（Ｒ）により単離した。

”　ヒＦＡｃｓＲ、ｌ−ランスフェクトされたＣＨＯ又はＣＯＳ細胞又は活性化されたＴ細胞を、間接的免疫染色法により分析した。染色の前、ＣＩ（０細胞を、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにおけるインキュベーションによりそれらの培養器から除去した。細胞をまず、ネズミｍＡｂｓ　９．３　（Ｈａｎｓｅｎなと、、　ｆ＋ｗｕｎｏ　ｅｎｅｔｉｃｓ　１０　：　２４７　（１９８０））又は８Ｂ　−１（Ｙｏｋｏｃｈｉ　など、、　Ｊ、　Ｉｆｆｌｍｕｎｏｌ、　１２８　：　８２３　（１９８１））と共に、又はｒｇ融合タンパク質（１０％のＦｅ２を含むＤＭＥＦＩにおいて１０Ｊｊｇ／ｌｌｌで）と共に４°Ｃで１〜２時間インキュベートした０次に細胞を洗浄し、そしてさらに０．５〜２時間、４° Ｃで、ＦＩＴＣＣ接合の第２段階試薬（２ズミＩＩＡｂｓのためにヤギ抗−マウスｒｇ血清又は融合タンパク質のためにヤギ抗−ヒトｒｇｃＴ血清（Ｔａｇｏ、　Ｉｎｃ、＋　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍａ。

ＣＡ）　）と共にインキュベートした。螢光を、４０対数増幅器（ｆｏｕｒｄｅｃａｄｅ　ＩｏｇａｒｉｔｈＬＩｔｃ　ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）を備えたＦＡＣＳ　ＩＶ（Ｒ）細胞ソータ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、＋　Ｍｏｕｎｔａｉｎ　Ｖｉｅｗ、　ＣＡ　）上で分析した。

■　ムタンパク　の　＋１゜トランスフェクトされたＣＯ３細胞からの古い血清フリー培養培地の第１．第２及び第３回収集物を、Ｉｇ融合タンパク質の精製のだめの源として使用した。高速遠心分離により細胞残髄物を除去した後、培地を、０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム溶Ｈ（ｐＨ８，０）により平衡化された、固定されたプロティンＡ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐ、、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ）のカラム（約２００〜４００　ａｌｌの培地／ｍｌ充填層体積）に適用した。その培地の適用の後、カラムを１μのリン酸カリウム溶液（ｐ）１１３）により洗浄し、そして結合されたタンパク質を０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム溶液ＣｐＨ３）により溶出した。画分を集め、そしてすぐに、２Ｍのトリス（ｐＨ８）１／１０体積の添加により中和した。ＡｔＭＯ吸収材料のピークを含む百分をプールし、そして使用の前、ＰＢＳに対して透析した。それぞれＣＤ２８ｒｇ及びＢ７Ｉｇのための吸光係数は、既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により２．４及び２．８ｎｌ／ｍｇであった。精製されたＣＤ２８１ｇ及びＢ７Ｉｇ７μ活性の回収率は、Ｂ７°及びＣＤ２８”　ＣＨＯ細胞の間接的な螢光染色の後、ＦＡＣＳ（Ｒ）分析により判断される場合、はぼ定量的であった。

ＣＴＬＡ　４の細胞外ドメインと１ｇＣ７１ドメインとの間にＣＴＬＡ　４　Ｉｇをコードする可溶性遺伝子融合体を、Ｃ０２８１ｇ構成体についての上記方法に類似する方法で構成した。ＣＴＬＡ　４遺伝子の細胞外ドメインを、公開された配列（Ｄａｒｉａｒａｃｈなど、、　Ｅｕｒ、　Ｊｏｕｒ、　［ｓｗｕｎｏｌ、　１８　：１９０１〜１９０５　（１９８８））に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによりクローン化した。

ＣＴＬＡ　４のためのシグナルペプチドはＣＴＬＡ　４遺伝子において同定されていないので、ＣＴＬＡ　４の示された配列のＮ−末端を、オーバーラツプオリゴヌクレオチドを用いて２段階で、オンコスタチインＭ（Ｍｅｌｉｋなど、、　Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、　９　：　２８４７　（１９８９））のシグナルペプチドに融合せしめた。第１段階に関しては、オリゴヌクレオチド、ＣＴＣＡ　Ｇ　ＴＣＴＧＧ　ＴＣＣＴＴＣＣＡ　ＣＴＣＣＴＧ　Ｔ　ＴＴＣＣＡ　Ａ　ＧＣＡ　ＴＧＧＣＧＡＧＣＡ　ＴＧＧＣＡ　Ａ@ＴＧＣＡ　ＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣ（配列番号８）　（ＣＴＬＡ４のＮ末端側の７個のアミノ酸に融合されるコンスタチンＭシグナルペプチドからのＣ末端側の１５個のアミノ酸をコードする）を、前方プライマーとして、及びＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＧ　（配列番号９）　（Ｂｃｌ　ｒｌ［！酵素部位を含み、そしてＣＴＬＡ　４レセプターをコードするアミノ酸配列のアミノ酸残基１１９〜１２５をコードする）を逆方向プライマーとして使用した。この段階のための鋳型は、）＋３８細胞（叶５．５ａｌａｈｕｄｉｎａｎｄ　Ｇａ１ｌｏ、　ＮＣｒ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ＋　ＭＯにより供給されるＩＩＴＬＶ　ＩＩ感染性Ｔ細胞白血球細胞系）からの合計１μｇのＩ？ＮＡがら合成されたｃＤＮ＾であった。第１段階からのＰＣＲ生成物の一部を、オンコスタチインＭシグナルペプチドのＮ末端部分をコードし、そしてＨｉｎｄ　ｍ制限エンドヌクレアーゼ部位を含むオーバーラツプ前方プライマー、ＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧＡ　ＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡ　Ａ　ＴＧＧＧＴＧＴＡ　ＣＴＧＣＴＣＡ　ＣＡＣＡ　ＧＡＧＧＡ　ＣＧＣＴＧＣＴＣＡ　ＧＴＣＴＧＧ　ＴbＣＴＴＧＣＡＣＴＣ（配列番号１０）及び同じ逆方向プライマーを用いて再増幅した。

ＰＣＢ反応の生成物をＩ（ｉｎｄ　ｍ及びＢｃｌ　Ｉにより消化し、そしてＢｃｌ　ｒ／Ｘｈａ　■ニヨ’）切断サレタ、ｒｇｃｒＬのヒツジ、ＣＨ２およびＣ８３９Ｍ域に対応するアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡフラグメントと共に、旧ｎｄｍ／Ｘｈａ　Ｉ切断された発現ヘクター、ＣＤ＋１８又はＨｉｎｄｌｌｌ／Ｘｂａ　Ｔ切断された発現ヘクター、πＬＮ　（Ｄｒ、　Ａｒｕｆｆｏにより供給される）中に連結した。

得られたＣＴＬＡ　４　Ｉｇ融合構成体の地図は図１に示される。その図に示される配列は、ＣＴＬＡ４　（上方の文字、黒くない部分）とコンスタチンＭのシグナルペプチドＳＰ（黒い部分）及びＩｇ（、ｒｌのヒンジＨ（点描模様の部分）との間の連結を示す。括弧内のアミノ酸は、構成の間に導入された。星印（★ ）は、ＩｇＣγヒンジ領域に導入されたシスティン−セリン変異を示す。ＣＴＬＡ　４に存在する免疫グロブリンスーパーファミリー■−株ドメインは、１ｇＣ７１のＣＨ２及びＣＨ３ドメインであるように示される。

次に、ＣＴＬ＾４１．を含む発現プラスミド、Ｃ０Ｍ８を、５ｅｅｄ　ａｎｄ　Ａｒｕｆｆｏ。

１９８７、　ＭｊＡにより記載される方法の変法（Ｌｉｎｓｌｅｙなど、、　１９９１．ｆｉ記）により、ＤＥＡＥ／テキストラントランスフエクシジンを用いてＣＯ８細胞中にトランスフェクトした。

ＣＴＬＡ　４１ｇのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡを含む発現プラスミド構成体（πＬＮ又はＣ［１Ｍ８　）を、標準方法を用いてのりポフエクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ系中にトランスフェクトし、ＣＴＬＡ　４　Ｉｇを安定して発現する新規細胞系を得た。

ＣＴＬＡ　ｄ　Ｉｇに対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、１９９１年５月３１日、ブタベスト条約に基づいてＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号６８６２９を得た。

チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＴＬＡ　４１ｇ−２４と称する、ＣＴＬＡ４Ｉｇを発現する好ましい安定性のトランスフェクシントを、免疫染色法を用いて、培地におけるＢ７結合活性についてＢ７陽性Ｃ）１０細胞系をスクリーンすることによって製造した。トランスフェクシントは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、０．２ｍＭのプロリン及び１ｌＭのメトトレキャートにより補充されたＩ）ＭＥＭに維持された。

ＣＴＬＡ　４　ｒｇ−２４ＣＨＯ細胞系は、１９９１年５月３１日、ブタペスト条約に基づいてＡＴＣＣに寄託され、そしてＡＴＣＣ受託番号１０７６２を得た。

ＣＴＬＡ　４　Ｉｇを、血清フリーに条件付けられた上清液がらプロティンＡクロマトグラフィー処理により精製した（図２　）　、　ＣＴＬＡ４１ｇの濃度を、２８０　ｎｍで１．６の吸光係数（既知の吸光度の溶液のアミノ酸分析により実験的に決定された）を仮定して、決定した。ＣＴＬＡ　４　Ｉｇのサンプル（１ｌｇ）（レーン２及び４）及び分子量標準（レーンｌ及び３、図２）を、非還元条件（−βＭＥ、レーン１及び２）又は還元条件（＋βＭＥ、　レーア３及び４）下テ５Ｄｓ−ＰＡＧＥ　（４〜１２％のアクリルアミドグラジェント）にゆだねた、タンパク質は、クーマシーブリリアンドプルーによる染色により可視化された。

非還元条件下で、ＣＴＬＡ　４１ｇは計が約１００．０００である種として移動し、そして還元条件下でそれば、Ｍｒが約ｓｏ、ｏｏｏである種として移動した（図２）、ｆｇＣγヒンジのジスルフィドが構成の間に排除されたので、ＣＤ２８１ｇのようなＣＴＬＡ　４　ｒｇは、生来のジスルフィド結合を通してたぶん連結されたダイマーである。

十分な長さのヒトＣＴＬＡ　４遺伝子に対応するアミノ酸をコードするＤＮＡを再構成するために、ＣＴＬＡ　４のトランスメンプラン及び細胞質ドメインのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするｃＤＮＡを、ＰＣＲによりクローン化し、そして次に、ＣＴＬＡ　４のＮ−末端に融合されるオンコスタチン間シグナルペプチドに対応する、ＣＴＬＡ　４１ｇからのフラグメントに対応するアミノ酸をコードするｃＤＮＡにより連結した。ＰＣＨのための方法、及び細胞培養及びトランスフェクションは、ＣＯ３細胞及びＤＥＡＥ−デキストラン　トランスフェクションを用いて、例１に記載されている通りであった。

ヒトリンパ球細胞におけるＣＴＬＡ　４レセプタータンパク質の発現はこれまで報告されていないので、ＣＴＬＡ　４　ｍＲＮＡの源を示す必要はなかった。上記に示されるような、Ｈ３８細胞の全体の細胞ＲＮＡから逆転写されるＰＣＲｃＤＮＡを、ＰＣＩ？によるクローニングのために使用した。

この目的のためには、オリゴヌクレオチド、ＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧ、ＴＧＧＴＡＧＴＧ　（配列番号１１）（推定されるコード配列に初めの１１個のアミノ酸をコードする）を、前方プライマーとして及び逆方向プライマーとして、ＴＧＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＧＧＧＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＧ　（配列番号１２）　ＣＴＬＡ４における最後の８個のアミノ酸に相同であり、且つＸｂａ　ｆ部位を含む）を使用した。鋳型は再び、）＋３８細胞からの１ｌｇのＲＮＡから合成されたｃＤＮＡであった。ＰＣＲ反応の生成物を制限エンドヌクレアーゼＮｃｏ　Ｉ及びＸｂａ　ｒにより切断し、そして得られた３１６　ｂｐの生成物をゲル精製した。上記ＣＴＬＡＩｇ融合からの３４０　ｂｐの旧ｎｄｎＩ／Ｎｅｏ　Ｉフラグメントをまたゲル精製し、そして両制限フラグメントを、Ｈｉｎｄ　ｍ　／χｂａ　Ｉ切断されたＣ［１ＭＢ中に連結し、０門ＣＴＬＡを形成した。

得られる構成体は、完全な長さ０ＣＴＬＡ４　（配列番号１３及び１４）及びオンコスタチン間シグナルペプチドに対応した。その構成体は図３に示され、そしてＯＭＣＴＬＡ　４と称した。図３に示されるＣＴＬＡ　４のための配列は、示されるアミノ酸配列のアミノ酸位置１１１でのこれまで通告されたアラニンがトレオニンをコードするような塩基変化により、推定されるヒトＣＴＬＡ　４　ＤＮＡ配列（Ｄａｒｉａｖａｃｈなど−１前記）とは異なる。このトレオニンは、融合タンパク質の好結果をもたらす発現のために重要である、新しく同定されたＮ一連結グリコシル化部位の一部である。

連結生成物を用いて、ＭＣ１０６１／ｐ３　Ｅ　コリ細胞を形質転換し、そしてコロニーを適切なプラスミドについてスクリーンした。得られる構成体の配列を、ＤＮＡ配列分析により確かめた。

ＣＴＬＡ　ｄ　Ｉｇ構成体を特徴づけるために、い（っがの単離体、ＣＤ２８１ｇ。

Ｂ７Ｉｇ及びＣＤ５Ｉｇを上記のようにして調製し、そして例２及び３に記載されるようにしてＣＯ８細胞をトランスフェクトし、そして８７１ｇの結合のためにＦＡＣＳ（Ｒ）分析により試験した。上記構成体の他に、Ａｒｕｆｆｏ　ａｎｄ　５ｅｅｄ　（ＥＭＢＯＪｏｕｒ、　６　：　３３１３〜３３１６　（１９８））により記載されるようなＣＤ７をコードするｃＤＮＡを含むＣ０Ｍ８プラスミドをまた使用した。

１匡、２ズミモノクローナル抗体（ｍＡｂａ）　９．３　（抗−Ｃ０２Ｂ　）及びＧ１９−４　（抗−ＣＤ３）　、Ｇ３−７　（抗−ＣＤ７）、　８Ｂ−１（抗 −８７抗原）及びラット＊Ａｂ　１８７．Ｈ抗−マウスＫ　Ｍ　）はこれまで記載されており（ＬｅｄｂｅＬｔｅｒなど、、　Ｐｒｕｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４　：　１３８４〜１３８８（１９８７）　；　Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒなど、、　Ｂｌｏｕｄ　７５　：　１５３１　（１９９０）　；　Ｙｏｋｏｃｈｉなど、、ＪＬＭＬそして使用の前、腹水から精製した０ｍＡｂ　ＯにＴ８を生成するハイプリドーマをＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＯから得、そしてｍＡｂをまた、使用の前、腹水から精製した。ｍＡｂ　４Ｇ９（抗−Ｃ［１１９）は、Ｄｒ。

Ｅ、　Ｅｎｇｌｅ＋ｗａｎ　（Ｓｔａｎｆｕｒｄ　Ｕｎｉｎｅｒｓｉｔｙ、　Ｐａ１ｏ　Ａｌｔｕ、　（Ａ）により提供された。精製されたヒト−マウスキメラｍＡｂ　Ｌ６　（ヒトＣ７’ｌＦｃ部分を存する）は、叶、　Ｐ、　Ｆｅ１ｌ　ａｎｄ　Ｍ、　Ｇａｙｌｅ　（Ｂｒｉｓｔａｌ−Ｍｙｅｒｓ　ＳｑｕｉｂｂＰｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ｒｎｓｔｉｔｕｔｅ＋　５ｅａｔｔｌｅ、−＾）の贈与である。

染色　びＦＡＣ３Ｒ、染色の前、ＣＯＳ又はＣＨＯ細胞を、１０ｎＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳにおいてインキュベートすることによってそれらの培養容器から除去した。細胞をまず、ｍＡｂｓ又はＩｇ融合タンパク質と共に、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭにおいて１０ｕｇ／ｍｌで４°ｃで１〜２時間インキュベートした。次に、細胞を洗浄し、そしてＦＴＴＣ−接合ヤギ抗−マウス免疫グロブリン又はＦＩＴＣ−接合ヤギ抗−ヒＨｇＣＴ血清（両者とも、Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａａ＋、　ＣＡからである）と共に、４°Ｃでさらに０．５〜２時間時間インキュトート。両−Ａｂｓ及びＩｇ融合タンパク質の結合が同じ実験において測定される場合、ＦＩＴＣ−接合抗−マウス及び抗−ヒト第２段階試薬を、使用の前、−緒に混合した。

合計１０．０００個の細胞に基づく螢光を次に、ＦＡＣ３（Ｒ）により分析した。

末″　リンパ　＼　び刺激。末梢血液リンパ球（ＰＢＬｓ）を、リンパ球分離媒体（Ｌｉｔｔｏｎ　Ｂｉｏｎｅｔｉｃｓ、　Ｋｅｎｓｉｎｇｔｏｎ＋　ＭＤ）を通しての遠心分離により単離した。アロ反応性Ｔｍ胞を、−次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）におけるＰＢＬの刺激により単離した。ＰＢＬを、１０６／ｍｌの照射された（５０００ラド）　Ｔ５１　ＬＣＬで培養した。ＥＢＶ−形質転換リンパ球芽細胞系（ＬＣＬ）、　ＰＭ　（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　５ｑｕｉｂｂ　Ｃｏ、）及びＴ５１（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　５ｑｕｉｂｂ　Ｃｏ、）を、１０％ＦＢＳにより補充されたＲＰ旧に維持した。６日後、アロ反応性“ 幼芽”細胞を凍結保存した。二次ＭＬＲを、ｍＡｂｓ及びｒｇ融合タンパク質の存在及び不在下で、新鮮な照射Ｔ５１　ＬＣＬと共に融解されたアロ反応性幼芽を培養することによって行なった。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩを有する９６ウエル平底プレート（０，２ｍｌの体積、４Ｘ１０’個のアロ反応性幼芽及びｌＸｌ０’個の照射Ｔ５１　ＬＣＬ細胞／ウェル）において培養した。四重培養物の細胞増殖を、２〜３日の培養の最後の６時間、〔３Ｈ〕−チミジンの摂取により測定した。

ＰＨＡ−活性化されたＴ細胞を、Ｉμｇ／ｍｌのＰＨＡ　（Ｗｅｌｌｃｏ＋＊ｅ。

ＩＪａｒｌｏｔｔｅ、　ＮＣ）と共にＰＢＬを５日間、培養することによって、及びＰＨＡを欠く培地において１日間、培養することによって調製した。

生存細胞を、使用の前、リンパ球分離媒体を通しての沈殿により集めた。ａｒ胞をｍＡｂｓにより刺激し、又はＣＨＯ細胞により３７℃で４〜６時間トランスフェクトせしめ、遠心分離により集め、そしてＲＮＡを調製するために使用した。

ＣＤ４°Ｔ細胞を、健康なドナーからのＰＢＬを、羊赤血球ロゼツト技法を用いてＴ及び非−丁細胞に分離し、そしてさらに、Ｄａｍｌｅなど、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１３９　：　１５０１　（１９８７）　（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにＣＤ４”細胞をパンニングすることによりＴ細胞を分離することによってＰＢＬｓから単離した。Ｂ細胞をまた、抗−ＣＤ１９ｍＡｂ　４Ｇ９を用いて、Ｗｙｓｏｃｋｉ　ａｎｄ　５ａｔｏ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７５　：　２８４４　（１９７８）（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにパンニングすることにより末梢血液から精製した。Ｔｈ−誘発された１ｇ生成を測定するために、１０６個のＣＤ４” Ｔ細胞を、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ　１　ｍｌにおいて１０＆個のＣＤ１９”　Ｂ細胞と共に混合した。３７℃での６日間の培養に続いて、ヒＩ−１ｇＭの生成を、Ｖｏｌｋｗａｎなど、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７８　：　２５２８（１９８１）　（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるようにして固相ＥＬＩＳ＾を用いて培養上清液において測定した。簡単に言及すれば、９６−ウェル平底マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ、　ＮＹ）を、１０ｇｇ／ｍｌのアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒトＩｇＧ又はＩｇＭ抗体（Ｔａｇｏ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）を含む２００μｌ／ウエルの炭酸ナトリウム緩衝液（ρｌ（９，６）により被覆し、４°Ｃで一晩インキユベートし、そして次に、ＰＢＳにより洗浄し、そしてウェルをさらに、ＦＢＳ中、２％ＢＳＡ　（ＢＳＡ−ＰＢＳ）によりブロックした。アッセイされるべきサンプルを、それらのウェルに適切な希釈度で添加し、そして２００μｌ／ウエルの１　：　１０００希釈度のアフィニティー精製されたヤギ抗−ヒｌ−１ｇＧ又はＩｇＭ抗体（Ｔａｇｏ）のホスラディシュ　ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−接合Ｆ　（ａｂ’　）　ｚ画分と共にインキュベートした。次に、プレートを洗浄し、そして１００μ ｌ／ウエルの０−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、　Ｓｔ。

Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）溶！（ｐＨ５のクエン酸−リン酸緩衝液１ｍｌ当たり０．６ｎｇ及び０．０４５％の過酸化水素）を添加した。色の進行を、２Ｎの硫酸により止めた。　４９０　ｎ−での吸光度を、自動ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより測定した。試験及び対照サンプルは３通り行なわれ、そして吸光度の値を、培養上清液における［Ｈの濃度が定量化される標準曲線を生成するために、上清液サンプルにより同時に行なわれた既知のＩｇＧ又はＩｇＭ標準により得られた値と比較した。データを、三重反復又は四重反復培養物の１ｇ＋５２Ｍのｎｇ／ｍｌとして表わされる。

、　び５Ｄ５　ＰＡＧＥ、細胞を、１′■により表面ラベル化し、そして免疫沈殿分析にゆだねた。簡単に言及すれば、ＰＨＡ−活性化されたＴ細胞を、Ｖｉｔｅｔｔａなと、、　Ｊ、　Ｅｘ　、　Ｍｅｄ、　１３４　：　２４２　（１９７１）（引用により本明細書に組込まれる）により記載されるように、ラクトペルオキシターゼ及びＨｚＯｔを用いてＩ！ｓ１により表面ラベル化した。５Ｏ３− ＰＡＧＥクロマトグラフィー処理を、５％のアクリルアミドの積み重ねゲルを有する直線アクリルアミドグラジェントゲル上で行なった。ゲルをクーマシープルにより染色し、脱色し、そして写真を取り、又は乾燥せしめ、そしてＸ線フィルム（Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲ−５）に露光せしめた。

延金ヱヱ土盃。８７１ｇを、約２　ＸＩＯ’　ｃｐｍ／ｐモルの比活性に＋ｚｓｌによりラベルした。９６のウェルのプラスチック皿を、ＣＴＬＡ　４　Ｔｇ　（１０ｆｆＭのトリス（ｐＨ８）　０．０５ｍ１の体積において０．５μｇ）を含む溶液により１６〜２４時間、被覆した。ウェルを、競争体の存在又は不在下で、”’Ｔ　Ｂ７Ｉｇ　（約５　ＸＩＯ’　ｃｐｓ）を含む溶液（０，０９ａ＋ｌ　）の添加の前、結合緩衝液（５０ｍＭのＢＥＳ　（Ｓｉｇｎａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ）、ｐＨ６，８、０，１％ＢＡＳ及び１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）によりブロックした。２３℃で２〜３時間のインキュベージタンに続いて、ウェルを結合緩衝液により１度洗浄し、そしてＰＢＳにより４度洗浄した。次に、結合された放射能を０．５ＮのＮａＯＨの添加により溶解し、そしてｒ計数により定量化した。

屓カヒ裏ηか金。完全なヒ）　ＣＴＬＡ　４　［ＩＮＡ遺伝子をコードするＯＭＣＴＬ＾４構成体の官能多活性が、図４に示される実験に示される。ｃｏｓ細胞を、上記のようにして発現プラスミドＣＤ？、　０ＭＣＤ２８及びＯＭＣＴＬＡ　４によりトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞を集め、そして培地のみ（添加なし）と共に又はｍＡｂｓ　９．３゜８７１ｇ、　ＣＤ５１ｇ又はＧ３−７と共にインキュベートした。次に細胞を洗浄し、そして結合性を、ＦｒＴＣ−接合ヤギ抗−マウスｒｇ及びＦＩＴＣ−接合ヤギ抗−ヒトＩｇ第２段階試薬の混合物により検出した。トランスフェクトされた細胞を、間接的免疫染色法により適切な細胞表面マーカーの発現について試験し、そして螢光を上記のようにしてＦＡＣ５（Ｒ）分析を用いて測定した。

図４に示されるように、ｗ＋Ａｂ９．３は、ＣＤ２８−トランスフェクトされたＣＯ５細胞に結合したが、しかしＣＴＬＡ　４−　トランスフェクトされる細胞には結合しなかった。対照的に、Ｂ７Ｉｇ７μタンパク！（但し、対照のＣＤＳＩｇ融合タン融合タンパク−）は、ＣＤ２８−及びＣＴＬＡ　４−トランスフェクトされた細胞の両者に結合した。ＣＤ７−１−ランスフエクトされたＣＯ５細胞は、ｍＡｂ９．３にも融合タンパク質のいづれにも結合しなかった。これは、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ　４の両者がＢ細胞活性化抗原、Ｂ７を結合することを示唆する。さらに、ｍＡｂ９．３は検出できるほどは、ＣＴＬＡ　４を結合しなかった。

８７ＣＨＯ上へのＣＴＬＡ　４１の　人。ＣＴＬＡ　４１ｇ及びＢ７の結合をさらに特徴づけるために、Ｂ７”　ＣＩＯ細胞及びリンパ芽球細胞系（ＰＭＬＣＬ）上への精製されたＣＴＬＡ　４１ｇの結合活性を、図５に示される実験において測定した。増幅された、トランスフェクトされたＣ）１０細胞系及びＰＭ　ＬＣＬを、培地のみ（添加なし）又はＣＤ５１ｇ、　ＣＤ２８４ｇ又はＣＴＬＡ　４１ｇの同濃度のヒ目ｇＣγ１−含有タンパク質（１０ｇｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。結合性を、ＦＩＴＣ−接合ヤギ抗−ヒトＩｇ第二段階試薬の添加に続いて、ＦＡＣ５（Ｒ）により検出した０合計１０、０００個の染色された細胞を、ＦＡＣ５（Ｒ）により分析した。

図５に示されるように、ＣＤ２８１ｇはＢ７°ＣＨＯ細胞に結合するが、しかしＰＭ　Ｌ（：Ｌには結合せず、すなわち細胞系は比較的低レベルの６７抗原を発現する（Ｌｉｎｓｌｅｙなと、、□、　１９９０）　−ＣＴＬＡ４ＩｇはＣＤ２８ｒｇよりも両細胞系により強く結合し、これは、それが高い親和性を伴って結合することを示唆する。ＣＤ２８１ｇもＣＴＬＡ　４　Ｉｇも、ＣＤ２８’″ＣＨＯＩＩＩ胞に結合しなかった。

ＣＴＬＡ　４１　びＢ７Ｉの　への　０次に、ＣＴＬＡ　４　Ｉｇと８７１ｇとの間の相互作用の見掛は親和性を、固相競争結合アッセイを用いて測定した。９６−ウェルプラスチック皿を、上記のようにしてＣＴＬＡ　４　ｒｇにより被覆した。８７１ｇを”５Ｉ　（５ＸＩＯ’　ｃｐｓ、２　ＸＩＯ”　ｃｐｓ／９モル）により放射ラベルし、そして添加し、示される濃度（図６を参照のこと）のラベルされていないキメラｍＡｂ　Ｌ６．　＋＊Ａｂ　９．３　、　ｍＡｂ　ＢＢ　−１又はＢ７Ｉｇの存在下で、４ｎＭの濃度にした。プレート−結合放射能を測定し、そして競争体なしに処理されたウェルに結合される放射能の百分率として表わされた（２８．３００ｃｐｍ）　、個々の点は二重反復測定の平均を示し；反復試験は一般的に平均から２０％以下変化した。濃度を、ｍＡｂに関して結合部位当たり７５，０００の肚に基づいて及びＢ７Ｉｇに関して結合部位当たり５１，０００のＭｒに基づいて計算した。

図６に示されるように、ｍＡｂ　ＢＢ　−１及びラベルされていない８７１ｇが ”’４−Ｂ７Ｉｇ結合のために有意に競争した（それぞれ約２２ｎＭ及び約１７５　ｎＭで最大の半分の効果）。キメラ−＾ｂ　Ｌ６もｍＡｂ９．３も、試験された濃度で効果的に競争しなかった。他の実験においては、使用されるｓＡｂの濃度は、固定されたＣＤ２８１ｇ又は９０％以上、ＣＤ２８を発現する細胞表面への”’Ｉ−Ｂ７Ｉｇの結合を阻害するのに十分であった。

図６からの競争データがスキャノチャート　プロットでプロットされる場合、約１２ｎＭの解離定数Ｋｄが、固定されたＣＴＬＡ　４　ＩｇへのＩＺＳＩ−ＢＴの結合性について計算した（図７）。この値は、”ＳＩ−８７１ｇとＣＤ２８との間で前で測定されたＫｄよりも約２０倍低く　（約２００　ｎＭ）（Ｌｉｎｓｌｅｙなと、　（１９９１）、　ｆｉ）　、これは、ＣＴＬＡ　４がＣＤ２８レセプターよりもＢ７抗原のためにより高い親和性レセプターであることを示唆する。

ＣＴＬＡ　４１ｇを結合したリンパ芽球細胞上の分子を同定するために（図７）、１１５１−表面ラベルされた細胞を、免疫沈殿分析にゆだねた（図８）。ＢＴ ”Ｃ）１０及びＰ？Ｉ　ＬＣＬ細胞をＩＺＳＩにより表面ラベルし、そして上記のようにして非イオン性界面活性剤溶液により抽出した。

約１．５　ＸＩＯ’　ｃｐｓを有する、０．１ｍｌの体積での抽出物のアリコートを、添加を伴わないで、又はそれぞれ２μｇのＣＤ２８１ｇ、　ＣＤ２８１ｇ又はＣＤ５１ｇを伴って、上記のようにして免疫沈殿分析にゆだねた０次に、洗浄された免疫沈殿物を、還元条件下で５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１０〜２０％のアクリルアミドグラジェント）により分析した０次に、ゲルを乾燥せしめ、そしてオートラジオグラフィーにゆだねた。図８の左側のパネルは、１日間の暴露の後に得られたオートラジオグラムを示す。

図８の右側のパネルは、１０日間の暴露の後の同じゲルのオートラジオグラムを示す。図８の中央のパネルにおけるオートラジオグラムはまた、１０日間、暴露された０分子量標準の位置はまた、この図に示される。

図８により示されるように、分散的に移動する（約ｓｏ、ｏｏｏ〜７５．０００　；約６０，０００での中央）、放射性ラベルされたタンパク質を、ＣＴＬＡ　４　ｒｇにより（但し、ＣＤ２８Ｉｇ又はＣＤ５Ｉｇによってではない）免疫沈殿せしめた。この分子は、ＣＴＬＡ　４１ｇにより、ＢＴ”　ＣＨＯ細胞から免疫沈殿されたＢＴと共に同時移動し、そしてＣＤ２８１ｇより免疫沈殿されたＢＴと共には、より一層弱く同時移動した。これらの発見は、ＣＴＬＡ４Ｔｇが、Ｂ７抗原に大きさがＩＩ（ｌｕする、リンパ芽球細胞上の単一タンパク質を結合することを示唆する。

ＣＴＬＡ　４　Ｉによるインビトロでの　亡　の１瀘至里豆。これまでの研究は、抗−ＣＤ２８　ｍＡｂ、　９．３及び抗−Ｂ７ｍＡｂ、ＢＢ　１が、アロ抗原を表わすＢ細胞により、アロ抗原特異的Ｔ７の増殖及び免疫グロブリン分泌を阻害することを示している（Ｄａｍｌｅ、など、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　７８　：　５０９６　（１９８１）　；Ｌｅｓｓｌａｕｅｒなど、、　Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１６　：　１２８９　（１９８６））　、　ＣＴＬＡ４は本明細書に示されるように８７抗原のために高い親和性レセプターであるので、可溶性ＣＴＬＡ　４１ｇは、それらの応答を阻害するその能力について試験された。Ｔ細胞増殖に対するＣＴＬＡ　４　ｒｇの効果は、図９に示される実験で試験された。

一次混合リンパ球反応（ＭＬＲ）幼若を、ネズミｍＡｂ９．３　Ｆａｂフラグメント、又はＢ７Ｉｇ、　ＣＤ２８ＩｇもしくはＣＴＬＡ　４１ｇ免疫グロブリンｃｒ融合タンパク譬の濃縮物の不在又は存在下で、照射されたＴ５１　リンパ芽球細胞（ＩＣ）により刺激した。細胞増殖を、４日後、Ｃ’Ｈ）　−チミジン組込みにより測定し、そして未処理の培養物による組込みの百分率として表わす、（２１、０００ｃｐｓ）　、図９は、４重反復測定の平均を表わす（ＳＥ門≦１０％）。

図９に示されるように、ＣＴＬＡ　４１ｇは、約３０ｎｇ／ｍｌ　（約０．８ｎＭ）で、１／２最大応答を伴って最大９０％以上、投与量−依存性態様でＭＬＲ反応を阻害した。完全なｎ＋Ａｂ９．３よりもより可能性あるＭＬＲのインヒビターであることがこれまで示されている、ｍＡｂ９．３のＦａｂフラグメント（Ｄａ■ｌｅなど、、　Ｊ、　Ｔｍ＋ｗｕｎｏ１．１４０　：　１７５３〜１７６１　（１９８８））はまた、ＭＬＲを阻害したが、しかしその濃度は、より高い濃度（約８００　ｎｇ／ｍｌ又は１／２最大応答のためには約３０ｎＭ　）であった。Ｂ７Ｉｇ及びＣＤ２８Ｉｇは、高濃度でさえ、ＭＬＲを存意に阻害しなかった。他の実験においては、ＣＴＬＡ　４１ｇと共に８７ＩＨの添加は、ＣＴＬＡ　４１ｇによるＭＬＩ？の阻害を一部克服し、この事は、その阻害が８７抗原との特異的な相互作用によることを示唆する。

グロブリン　゛、の　。ヘルパーＴ細胞（Ｔ、）　ｍ発性免疫グロブリン分泌に対するＣＴＬＡ　４１ｇの効果をまた試験した（図１０）。

ＣＤ４”Ｔ細胞を、上記のようにして、指示された免疫グロブリン分子の存在又は不在下で、同種ＣＤ１９°ＢＩｌｌ胞と共に混合した。ネズミｓ＋Ａｂｓ　０ＫＴ８．９．３及び８Ｂ−１を２０ｇｇ／ｍｌで添加し、そしてＩｇ融融合タンパクモ１０ｇｇ／ｍｌで添加した。６日間の培養の後、培養土清液におけるヒトＩｇＭの濃度（ＳＩＥ）＋＜５％）を、上記のようにして酵素イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）により測定した。ＣＤ４３Ｔ細胞の不在下で培養されたＢ細胞による１ｇＭ生成はｌｌｎｇ／ｍｌであった。

図１０に示されるように、ＣＤ４−Ｔ細胞は同種ＣＤ１９”　Ｂ細胞による１ｇＭ生成を刺激した（ＣＤ４”Ｔ細胞の不在下で、ＩｇＭｇベルは９３％減じられた）　、　ｍＡｂｓ　９．３及びＢＢ−１は、Ｔｈ　ｇ発されたＩｇｌ’ｌ生成を有意に阻害した（それぞれ６３％及び６５％の阻害率）。ＣＤ２８１ｇは、それらのｍＡｂｓよりもインヒビターとしてより効果的であった（８９％の阻害率）。対照分子、ｍＡｂ　０ＫＴ８及びＣＤ５■ｇによる阻害は、より低かった（３０％以下の阻害率）、それらの分子は、困しスエユユニ立止　アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃａｌ　ａｕｒｅｕｓ）エンテロトキシンＢの存在下で測定される１ｇ生成を有意に阻害しなかった。類似する結果が、他のドナーに由来するＢ細胞及びＣＤ４”Ｔ細胞により得られた。それらの結果は、ＣＴＬＡ　４　ｒｇによる阻害が特異的であることを示す。

上記データはまた、ＣＴＬＡ　４及びＣＤ２Ｂレセプターが機能的及び構造的に関連していることを示す、ＣＤ２８のように、ＣＴＬＡ　４はまた、Ｂ細胞活性化抗原、Ｂ７のだめのレセプターでもある。　ＣＴＬＡ　４１ｇは、約１２ｎＭの親和性定数Ｋｄを伴って＋ｔＳ■８７を結合し、その価は、ＣＤ２８と８７１ｇとの間の親和性よりも２０倍高い（約２００　ｎＭ）　、従って、ＣＴＬＡ　４及びＣＤ２８は、同じリガンド、すなわちＢ７抗原のために、それぞれ高い及び低い親和性レセプターとして考えられる。

ＣＤ２Ｂと８７との間の見掛は親和性は、ネズミＴ細胞ハイブリドーマのＴ細胞レセプターへの可溶性アロ抗原の結合について報告される親和性に類似しく約１００　ｎＭ　Ｈ５ｃｈｎｅｋなど、、Ｃｅ１ｌ　５６　：　４７　（１９８９））、そしてＣＤ２とＬＦ＾３との間（Ｒｅｃｎｙなと、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２６５　：８５４２　（１９９０））又はＣＤ４とＭＨＣクラス■ 分子との間（Ｃ１ａｙｔｏｎなど、。

ハ旦ｒｅ　３３９　：　５４８　（１９８９））の相互作用よりも高い親和性である。

ＣＴＬＡ　４と８７との間の見掛は親和性定数Ｋｄはさらに大きく、そして好都合には、より高い親和性の翔Ａｂｓに匹適する（Ｋｇ　２　１０．ＯＯＯｎＭ　；Ａｌｚａｒｉなど、、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｉｍｍｕｎｏ、　６　：　５５５　（１９８８））　ＣＴＬＡ４とＢ７との間のＫｄは、インテグリンレセブター及びそれらのリガンドのＫｄに類似するか又はそれの値よりも大きい（１０〜２０００ｎＭ　：　Ｈａｕｔａｎｅｎなど、。

互作用の親和性は、リンパ芽球付着システムについて報告される中で最高である。

それらの結果は、ＣＴＬＡ　４転写体の官能的タンパク質生成物の最初の発現を示す。ＣＴＬＡ　４　ｒｇ、すなわちＩｇＣγｌドメインに融合されるＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む融合構成体は、約ｓｏ、ｏｏｏサブユニットのＭｒのジスルフィド結合ダイマーを形成する（図１）、鎖間ジスルフィドはこの融合のｒｇ部分において形成することが予期されないので、ＣＴＬＡ　４からのシスティンはジスルフィド結合形成に包含される。同種ＣＤ２８１ｇ融合タンパク質（Ｌｉｎｓｌｅｙなど、ＭＸ、　１９！Ｈ）はまた鎖間ジスルフィド結合を含む、それらの結果は、ＣＤ２８のようにＣＴＬＡ　４レセプター（Ｈａｎｓｅｎなど、、　Ｉｍｍｕｎｏ　ｅｎｅｔｉｃｓ　１０　：　２４７〜２６０（１９８０）　’）がジスルフィド結合ホモダイマーとしてＴ細胞表面上に存在することを示唆する。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ　４は高い相同性のタンパク質であるが、それらは免疫学的に異なっている。なぜならば抗−Ｃ０２８僧＾ｂ、　９．３はＣＴＬＡ　４を認識しないからである（図４及び５）。

ＣＴＬＡ　４が、ＣＤ２８に類似するシグナル化路によりＴ細胞を活性化できるかどうかについては知られていない、ネズミ及びヒトＣτＬＡ４の細胞質ドメインは同一であり（Ｄａｒｉａｖａｃｈ、、　Ｑ　１９８Ｂ）、これは、この領域が重要な官能性質を有することを示唆する。　ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４の細胞質ドメインはまた、相同性を共有す、但し、これが２つの分子に類似するシグナル性質を付与するために十分であるかいづれかについては不明である。

ＣＴＬＡ　４　ＩｇはＴ細胞及びＢ細胞協力を必要とするインビトロリンパ球機能の可能性あるインヒビターである（図９及び１０）。前記研究と共に、これらの発現は、Ｔ及びＢリンパ球応答をｇ４ｗｉすることにおいて、Ｂ７抗原とそのカウンターレセプター、ＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ４との間に相互作用の基本的重要性を示唆する。　ＣＴＬＡ　４１ｇは、免疫応答の間、それらの相互作用の役割上、未来の調査のために有用な試薬であるべきである。　ＣＴＬＡ　４１ｇは、ｍＡｂＢＢｌ又は−Ａｂ９．３のいづれよりもインビトロリンパ球応答のより可能性あるインヒビターである（図９及び１０）、醜Ａｂ　ＢＢ−１よりもよりＣＴＬＡ　４１ｇの高い能力は、はとんどそれらの分子間での８７のための親和性の差異によると思われる（図６　）　、　ＣＴＬＡ４１ｇはまた、■＾ｂ９．３よりも可能性がある。

なぜならば、たぶん、−＾ｂとは異なって、それはその阻害効果を妨害するために、Ｔ細胞増殖に対して直接的な刺激効果を有さないからである（Ｊｕｎｅなど、、［ｍ＋＊ｕｎｏｌｏ　Ｔｏｄａ　１１　：　２１１　（１９８９））　、　４７１？上旦でのＣＴＬＡ　４１ｇの免疫抑制効果は、未来の研究が、異常なＴ細胞活性化又は１ｇ生成を包含する自己免疫疾患の処置のために、この分子の可能な治療効果を保証されることを示唆する。

本発明が関与する当業者に明らかなように、本発明は、本発明の範囲内で、上記に特別に開示されるもの以外の形で具体化され得る。

従って、上記本発明の特定の態様は例示的であると考えられるべきである。本発明の範囲は、例示的であって、本発明を制限するものではない。

配列の列挙（１）一般情報（ｉ）出願者：　Ｌｉｎ５ｌｅｙ、　Ｐｅｔｅｒ　５Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、　Ｊｅｆｆｒｅｙ　ＡＤａｍｌｅ、　Ｎ１ｔｉｎにＢｒａｄｙ＋　Ｗｉｌｌｉａｍ（ｉｉ　）　発明（Ｄ表Ｂ　：　ＣＴＬＡ　４レセプター及びその使用法（ｉｉｉ）配列の数＝１４（ｉｖ）通信住所：（Ａ）あて先：　５ｈｅｌｄｏｎ　＆　Ｍａｋ（Ｂ）通り：　２０１５ｏｕｔｈ　Ｌａｋｅ　Ａｖｅｎｕｅ、５ｕｉｔｅ　８００（Ｃ）市：パサデナ（Ｄ）州：カリフォルニア（Ｅ）国：アメリカ合衆国（Ｆ）郵便番号：　９１１０１（Ｖ）コンピューター読取リフォーム：（Ａ）媒体型：ブロツビーディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−［１０Ｓ／ＭＳ−００５（Ｄ）ソフトウェア：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　≠１．０　、　Ｖｅｒｓｉｏｎ≠１．２５（ｖｉ）現在の出願日：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉ）アトニー／エージェントの情報：（Ａ）名　称：　Ｍａｎｄｅｌ、　ＳａｒａＬｙｎｎ（Ｂ）登録番号：　３１，８５３（Ｃ）参照／ドケット番号：　７８４８（ｉｘ）電信情報：（Ａ）電話：　（８１８）　７９６−４０００（Ｂ）テレファックス：　（８１Ｂ）　７９５−６３２１（２）配列番号１についての情報（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長　さ＝３９個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイポセテイカル＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号１：ＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧ　ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣ（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長　さ＝３９個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二車鎖状（１１）配列の種類：ＤＮＡ　（ゲノム）（由）ハイポセティカル：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス：Ｎｏ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ）配　列：配列番号２：ＴＧＧＣＡＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧ　ＧＣＴＴＡＧＡＡＧＧ　ＴＣＣＧＧＧＡＡ＾（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：３９個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二車鎖状（ｉｉ　）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｊ）ハイボセティカル＝ＮＯ（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏ５ｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号３：ＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＡ　ＡＡＴＧＣＴＣＴＴＧ　ＣＴＴＧＧＴＴＧＴ３９　（２）配列番号４についての情報：（ｉ）配列の＊＠：（Ａ）長　さ：８４個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二車鎖状（１１）配列の種ｉ：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｊ）ハイポセティカル：ＮＯ（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号４：ＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＡ　ＴＣＡＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＣＴＧ　ＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡ　５０ＣＡＣＡＴＣＣＣＣＡ　ＣＣＧＴＣＣＣＣＡＧ　ＣＡＣＣＴＧＡＡＣＴ　ＣＣＴＧ　８４（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：４１個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）Ｉｉの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｊ）ハイポセティカル＝ＮＯ（ｉｖ）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起ｆｌ：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号５：ＣＴＴＣＧＡＣＣＡＧ　ＴＣＴＡＧＡＡＧＣＡ　ＴＣＣＴＣＧＴＧＣＧ　ＡＣＣＧＣＧＡＧＡＧ　Ｃ４１（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長　さ：４７個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＩＪＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル二Ｎ０（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　）ｌａｍａ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号６：ＣＡＴＴＧＣＡＣＡＧ　ＴＣＡＡＧＣＴＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧ　ＧＴＴＣＴＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧ　４７（２）配列番号７についての情報：（１）配列の特＠：（Ａ）長　さ：３９個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０（ｉｖ）アンチセンス＝ＮＯ（ｖｉ）起′ａ：（Ａ）生物名：　Ｈｏ＋ｗｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ）配　列：配列番号７：ＡＴＣＣＡＣＡＧＴＧ　ＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴ　ＴＴＧＧＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＡＴＧＴＧＡＣ３９（２）配列番号８についての情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長　さ＝６５個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（ＣＨ！の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ　）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉ）ハイボセティカル：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏｓ＋ｏ　ｓａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号８；ＣＴＣＡＧＴＣＴＧＧ　ＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴ　ＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡ　ＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡ　ＧＣＡＴＧＧＣＡＡＴ　５０ＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣ６５（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：３３個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ０（１ｖ）アンチセンス＝ＮＯ（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｌ）配　列：配列番号９：ＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴ　ＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧ　ＴＴＧ　３３（２）配列番号１０についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さニア２個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（ＣＨ！の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種Ｒ：ＤＮＡＣゲノム）（ｉｉｉ）ハイボセティカル＝ＮＯ（１■）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起′ｌ！Ｘ：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ　）配　列：配列番号１０：ＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧ　ＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡ　ＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴ　５０ＧＣＴＣＡＧＴＣＴＧ　ＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣ７２（２）配列番号１１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：３３個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二車鎖状（ｉｉ）配列の種類：ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｊ）ハイボセティカル：ＮＯ（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　［ｌｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｉ）配　列：配列番号１１：ＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧ　ＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＡ　ＧＴＧ　３３（２）配列番号１２についての情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長　さ：４５個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種［：ＤＮＡ（ゲノム）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：ＮＯ（ｉｖ　）アンチセンス：Ｎｏ（ｖｉ）起ａ！＝（Ａ）生物名：　Ｈｏ＋＊ｏ　５ａｐｉｅｎｓ（ｘｌ）配　列二配列番号１２：ＴＧＡＴＧＴＡＡＣＡ　ＴＧＴＣＴＡＧＡＴＣＡＡＴＴＧＡＴＧＧＧ　ＡＡＴＡＡＡＡＴＡＡ　ＧＧＣＴＧ　４５（２）配列番号１３についての情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長　さ：５６１個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：ＤＮＡ（ゲノム）（山）ハイポセティカル：ＮＯ（ｉｖ　）アンチセンス二Ｎ０（ｖｉ）起源：（Ａ）生物名：　ＨＯＩＩＯ５ａｐｉｅｎｓ（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位　置：　１．．５６１（ｘｉ　）配　列：配列番号１３：（２）発明番号１４についての情報＝（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長　さ：１８７個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種類：タンパク質（ｘｉ）配　列：配列番号１４：Ａｒｇ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＧｌｙＬｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　ＡｓｐＦｉｇｕｒｅ　３ＣＤ７−ＣＯ５ＣＤ２８−ＣＯ５ＣＴＬＡ−４−ＣＯ５Ｆｉｇｕｒｅ　４ＣＤ２８＋ＣＨＯＢ７十ＣＨＯＰＭ　ＬＣＬＦｉｇｕｒｅ　５濃度　（ｎＭ）Ｆｉｇｕｒｅ　７ＨＪ胞：　Ｂ７＋ＣＨＯＰＭＬＣＬ　Ｂ７＋ＣＨＯ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年１２月λＯ日

Claims

【特許請求の範囲】

１．Ｂ７抗原と反応性である図３（配列番号１３及び１４）に示されるアミノ酸配列によりコードされるＣＴＬＡ４レセプタータンパク質。
２．ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣｒ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対応するアミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を有するＢ７抗原と反応性であるＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質。
３．ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列の約１位〜約１２５位のアミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣｒ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対応するアミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を有するＢ７抗原と反応性のＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質。
４．Ｂ７抗原と反応性であり、そしてＡＴＣＣＮｏ．６８６２９を有するＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質に対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡ。
５．ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインのフラグメントに対応する第２アミノ酸配列に融合されるＣＤ２８の細胞外ドメインのフラグメントに対応する第１アミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣｒ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対応する第３アミノ酸配列を有するＢ７抗原と反応性のハイブリッド融合タンパク質。
６．Ｂ７陽性細胞により機能的ＣＴＬＡ４陽性Ｔ細胞相互作用を調節するための方法であって、ＣＴＬＡ４と内因性Ｂ７抗原との反応によりＢ７抗原を妨害するためにリガンドと前記Ｂ７陽性細胞とを接触せしめることを含んで成る方法。
７．前記リガンドがＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの少なくとも一部を含む融合タソパク質である請求の範囲第６記載の方法。
８．前記リガンドが、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに対応するアミノ酸配列の約１位〜約１２５位のアミノ酸残基を含む第１アミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣｒ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対応するアミノ酸残基を含む第２アミノ酸配列を有するＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質である請求の範囲第７項記載の方法。
９．前記Ｂ７陽性細胞が前記ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質のフラグメント又は誘導体と接触せしめられる請求の範囲第７記載の方法。
１０．前記リガンドＢ７抗原と反応性のモノクローナル抗体である請求の範囲第６記載の方法。
１１．前記抗体が抗−ＢＢ１モノクローナル抗体である請求の範囲第１０記載の方法。
１２．前記Ｂ７陽性細胞がＢ細胞である請求の範囲第６記載の方法。
１３．前記Ｂ７陽性細胞と前記ＣＴＬＡ４−陽性Ｔ細胞との相互作用が阻害される請求の範囲第６記載の方法。
１４．前記リガンドが、ＣＴＬＡ４レセプターの細胞外ドメインの一部に対応する第２アミノ酸配列に融合されるＣＤ２８レセプターの細胞外ドメインの一部に対応する第１アミノ酸配列及びヒト免疫グロブリンＣｒ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域に対応する第３アミノ酸配列を有するＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドである請求の範囲第６項記載の方法。
１５．他の細胞とのＣＴＬＡ４−陽性Ｔ細胞相互作用を調節するための方法であって、ＣＴＬＡ４のためのリガンドとＣＴＬＡ４−陽性Ｔ細胞とを接触することによってＢ７陽性細胞と前記Ｔ細胞との相互作用を阻害することを含んで成る方法。
１６．前記リガンドがＢ７Ｉｇ融合タンパク質である請求の範囲第１５記載の方法。
１７．前記リガンドがＣＴＬＡ４と反応性のモノクローナル抗体である請求の範囲第１５記載の方法。
１８．前記リガンドが前記モノクローナル抗体のフラグメントである請求の範囲第１７記載の方法。
１９．Ｂ７陽性細胞により、Ｔ細胞相互作用により仲介される免疫システム疾患を処理するための方法であって、前記８７陽性細胞によりＴ細胞相互作用を調節するためにＢ７抗原のためのリガンドを患者に投与することを含んで成る方法。
２０．前記リガンドがＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質である請求の範囲第１９記載の方法。
２１．前記リガンドがＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質ハイブリッドである請求の範囲第１９記載の方法。
２２．前記リガンドがＢ７抗原と反応性のモノクローナル抗体である請求の範囲第１９記載の方法。
２３．前記Ｔ細胞相互作用が阻害される請求の範囲第１９記載の方法。
２４．請求の範囲第３記載のＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体。
２５．請求の範囲第５記載のＣＤ２８Ｉｇ／ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質と反応性のモノクローナル抗体。
２６．ＡＴＣＣＮｏ．１０７６２を有し、そしてＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質を安定して発現するチャイニーズハムスター卵巣細胞系。