JPH06500050A - ダウンストリーム処理のための方法および手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ダウンストリーム処理のための 方法および手段 本発明は流動床における分離の分野に関し、さらに重合体、特に多糖類のビーズ であって、その中にガラスまたはシリカ粒子、特に石英粒子を含有する、重合体 ビーズ、および制限された範囲の軸方向分散性を有することを特徴とする安定化 流動床における担体マトリックスとしてのこれらビーズの使用に関する。

固形物は、重力場に対して反対方向に流れている流動性媒体（気体または液体） 中に固形物を導入することによって、固形支持体上に浮遊させておくことができ ることが知られている。制限された空間、例えば円筒容器（カラム）中のそのよ うな流動媒体流に置いた多数の粒子は、この制限された空間に粒子がずっと止ま っているという条件の下に通常流動床と呼ばれる。これは、固形粒子の流体流れ が及ぼす摩擦力および浮揚力と重力とがバランスをとることにより達成される。

流動床は、固形粒子を液相と接触させる効果的な手段として用いられてきた。粒 子に対して流速が比較的高い場合は、有効な物質および熱の転移が得られる。そ のため、流動床は燃焼および吸着工程に用いられてきた。流動床はまた、いわゆ るエアリフトリアクターでの微生物および動物細胞の培養にも用いられてきた。

この場合には、効率の良い物質移動により、効率良く栄養物および溶解酸素が細 胞にもたらされ、老廃物は細胞から除去される。

流動床の流れ場における小さな不規則性は粒子の並進運動をもたらす。ある一定 時間にわたって、ある粒子が流動床の制限された空間内の任意の場所に存在する 確率がある。これをここではパックミキシング（逆混合）または重度軸方向分散 と呼ぶ。パックミキシングは、全流動床における流動相および固体相を均一な組 成にしたい場合には有益である。しかし吸着工程では、均一組成は必ずしも有益 とは限らない。

実際、流動床の制限された空間内にパックミキシングがある場合よりも、パック ミキシングがない場合に流出液中により低濃度の溶質を得ることができる。

完全にパックミキシングを防ぐために、流動床中に挿入されたスクリーンにより 流動床を区画化することができることが開示されている（Ｂｕｉｊｉｓ　（１９ ８０））。

流体の密度、粘性および速度並びに固形物質の直径および密度が、摩擦力対重力 のバランスに影響を与える（Ｌｙｄｅｒｓｅｎ（１９７９））。液体はより高い 密度および粘性を有するので、液体の場合には、気体よりずっと低い流速を用い なければならない。物質移動の抵抗性を減じ、処理量（液体供給速度）を高める ために、重力場だけでバランスをとる流速より高い流速を用いることが考えられ るが、これは第三の力を固形物質に付与することにより可能である。この第三の 力は、鉄性または常磁性粒子を含む流動床に磁場を与えることによって導入する ことができる。

そのような磁気的に安定化させた流動床は既に記載されている（Ｂｕｒｎｓ（１ ９８５：　１および１９８５　：　２）参照）。流動床を安定化させるためのそ のような系によって発生した熱は、明らかに不利益をもたらし、特に熱感受性生 物活性分子系において、たとえ様々な冷却系が利用できるとしても、この方法の 有用性を低下させる。磁場発生用および系の冷却用装置の必要性は、この工程の コストを甚だしく増大させる。

比較的小さい密度および直径を有する粒子は、流動床では上方に移動する。結果 として、流動床に供給液の固形物を蓄積させることなく、大きな径および／また は高密度の吸着体粒子を含む流動床に未浄化の液体を供給することができる。供 給流れから生じる比較的小型および／または低密度の粒子は、液体の流速が適切 に選択されることを条件として、排出液とともに洗い出される。したがって、浄 化工程による時間、コストおよび収量減少が避けられるので、未浄化供給液で始 まる吸着回収工程を、流動床を用いて改良することが可能である。しかしく何ら かの方法で安定化されなければ）流動床はパックミキシングを起こすので、流動 床は軸方向分散がより大きいために、充填床と比べて効率の悪い吸着体である。

充填床が吸着体としてより有効である第二の理由は、充填床は多工程吸着体とし て働くからである。

理論的見地からは、流動床のような単一工程吸着体は、吸着部位が供給流れ中の 溶質の濃度に比べ溶質への高い結合親和性を有する場合は、効率よく働くことが 期待できる。流動床で分離を行う、これまで述べた系は、しかしながら、ユーザ ーが提起するすべての要求を満たすわけではない。これまでのところ、問題の一 つは、流動床が安定化されていないので、この床を通り抜ける流路が簡単に形成 され、サンプル分子は殆ど結合の機会をもたないままこの流路を通り抜けること があり得るということである。

ビーズは拡散距離を小さくするために小型で、高い密度を有し、さらに制御可能 な高い沈降速度を有し、生物活性分子を含む利用に適するように、誘導が容易な 親水性重合体である必要がある。

予期せぬ事ながら、本研究者らは、充填床および流動床の有利な特性を合わせ持 つ床を企図することができることを見いだした。本発明の一局面では、粒子が互 いに密集して充填されていないので、比較的小さな密度および／または比較的小 型の粒子が上方に流れる液体流れとともに床を通過することが可能な床を提供す る。

所定のサイズおよび／または密度を有するビーズ粒子を用いることによって、あ る粒子がある位置に存在する確立が、金床容積の極めてわずかの部分である限定 容積においてのみ高くなるようにし、粒子が床の制限された空間を動き回るのを 防ぐ。粒子をその場所にとどまらせることによって、パックミキシングを防止す ることができ、それによって軸方向分散を減少せしめ、スクリーンまたは同様な 装置を用いることな（多工程吸着を可能にする。

さらに、本発明のビーズは、熱発生磁場の利用または吸着体粒子への鉄性もしく は常磁性添加物の使用を必要とすることなく、上方に流れる液体中に浮遊状態で 保持することができる。以下では、現下の粒子を用いた場合の床を、安定化また は非混合膨張床と呼び、これは無視できる程度の軸方向分散性を有することを特 徴とするものである。軸方向分散は、しばしば容器分散値（定義にライてはＬｅ ｖｅｎｓｐｉｅｌ　（１９７２）参照）によって表わされ、これは、安定化床で はおよそ７５Ｘ１０”より小さく、特に２０Ｘ　１０−’より小さい。

本発明のビーズは、重合体マトリックス中にガラスまたはシリカ粒子好ましくは 石英粒子を含有する、該重合体マトリックスから成る。ビーズは多孔性でも非多 孔性でも良い。直径は１００〜ｔｏｏｏμ厘、好ましくは１００〜５００μｍで 、球形ビーズ同様不定形のビーズも、以下に述べるように仮に球形ビーズの方が 好ましい場合であっても用いることができる。ビーズ密度は代表的には１．１０ 〜１、５０　ｇ　／　ｍｌ、例えばおよそ１．１５ｇ／＋ａｌ（これらの値は水 和ビーズの値である）である。

重合体は、モノ−または、例えばアクリレート、メタクリレートもしくはビニル ベンゼンのようなポリビニルモノマーから合成され、または天然物、好ましくは 多糖類、例えばアガロース、澱粉、セルロースもしくはこれらの誘導体で、場合 によっては所望の堅さおよび孔分布を得るために架橋される。

含有させるガラスまたはシリカ粒子は好ましくは１〜１００μｍの範囲で、球形 でも不定形でも良い。重合体粒子中に含有させるシリカ粒子の量は、最終湿潤粒 子の重量の５〜５０％の範囲である。本発明の好ましい具体例では、石英粒子が 用いられる。

ダウンストリーム処理に用いる担体マトリックスの重要な特性の一つは、例えば 再条件付は工程で用いられる種々の溶液に対して安定であることである。いくつ かの装置では再条件付けのために強アルカリ溶液の使用が必要で、これは、以前 にテストした従来の担体マトリックスにとっては致命的であることが分かった。

特に溶出工程中に床を通る流れを充填床にするために逆流させる場合に、支持体 マトリックスのほんのわずかの変化が、収量減少などの結果をまねく重大な問題 となる。この溶出技術では、溶出能力を改良するために、球形ビーズが好ましい 。その理由は当業者にとっては既知である。

本発明のこの局面では、ビーズは、図１に模式的に示したように、特に培養液か ら生成物（例えば細菌またはその他の使用宿主の細胞溶解後の細胞壁粒子および その他の老廃産物を含む）を回収するために採用されるタイプの分離系において 用いられる。この系の主な構成は、ポンプＰｉ−Ｐ３（適切な溶液を供給する） 、バルブｖ１−Ｖ３、サンプル容器Ｓ１底部に流体分配装置りおよび調節上部ア ダプター（図示せず）をもっカラムＣ並びにフラクションコレクターＦＣである 。

図１ａは、所望の成分がゲルに結合し他の成分から分離される流動床型の系を示 している。安定化流動床を作るため、さらにｐＨ，イオン強度などに関して適切 な条件をつくるために、溶液はＰ２により精製する成分を結合するように誘導化 されたビーズを入れたカラムに送られる。カラムからのアウトフローは廃液に接 続されている。次にバルブｖ１は、流動床が維持される条件下で、サンプル溶液 がＰｌによってカラムに送られるように切り替えられる。サンプルがカラムに移 されたとき、洗浄液が（Ｐ２を介して）カラムに供給されるようにバルブｖ１は 切り替えられる。流動床が完全に洗浄され、さらに細胞性粒子などの未結合成分 がカラムの上部を通って廃液に流れ出した後、本方法の第一段階が終了する。

図１ｂでは、カラムを通る流れは結合したサンプル成分を溶出するために逆流さ せられる。流れがＰ３からカラムを介してフラクションコレクターＦＣへ送られ るように、バルブは切り替えられる。床を落ち着かせてから、さらに場合によっ て上部アダプターを床表面に移動させることによって充填床に変換し、適切な溶 出溶液がＰ３を介して、所望の成分が遊離、採取される床に導入される。非常に 多くのクロマトグラフィー用カラムに見られる伝統的なタイプである、該上部ア ダプターはカラムの所望の位置に設定でき、ビーズが通り抜けるのを防ぐために 網を有している。

本発明の別の具体例では、カラムからの溶出は、溶出液をポンプＰ２を介してカ ラムに導入し、さらにビーズから遊離したサンプル成分をカラムの上部出口につ ないだフラクションコレクター（図１ａの“廃液”と置き換える）で採取するこ とによって、流動型で行われる。この場合には、カラムに調節上部アダプターは 不要である。

本発明の安定化床を得るために極めて重要なことは、溶液をカラムに導入する方 法である。溶液はカラムの横断面部分に均等に整流されなければならず、そのた めに整流機が用いられる。この整流機は一般的には上側（ゲル床側）が穴開き板 となったものである。その板の孔はサンプルの全成分を通過させるに十分な大き さでなければならないことは言うまでもな（、そうでなければ目詰まりがこの方 法を妨げるであろう。Ｄ上の圧力低下は、流速、粘性、粒子サイズなどの各組み 合わせについて、所定の値を越えるものでなければならない。そうでなければ小 さな流れ抵抗を有する流路、したがって高速の流れが床に生じるからである。整 流機上の圧力低下と床との間の比はしたがって３％、好ましくは１０％を越え、 至適系ではずっと高い数値、例えば５０％、５００％、さらには２０００％まで が一般的である。孔の全横断面積は、板の全面積に対して一般的にはおよそ０． ００５〜１０％、特に０、００５〜３％である。円錐形の整流機を用いる場合に は、整流機の一定の圧力低下の必要性は、明らかな幾何学的理由により減少し、 上記に示した数値より低い値を利用できる。

本発明の方法において用いるカラムの寸法は広い範囲でよく、例えば直径は１ｃ ｍから１〜２ｍまで、長さはおよそＬＯｃｒｎから１０ｍで、実施する分離の種 類およびその規模に依る。判明したことで重要なことは、従来の非安定化系と比 べて、安定化流動床法では非常に短いカラムを用いることができるということで ある。この方法は、少なくともおよそ５０〜３０００ｃｍ／　ｈの流速にも利用 でき、およそ１００〜５００ｃｍ＋／　ｈが非常によ（利用される数値である。

溶出中（Ｄ　流速１ｔｆｔ　５〜５００ｃｍ／　ｈ　テ、特１：５０〜２００ｃ ｍ／ｈである。

上記のようにこの方法は、沈殿物および細胞培養液からの細胞壁成分のような固 体粒子も含む系にも用いることができる。伝統的なりロマトグラフィー系では、 この種の不純物には１または２工程の予備精製が必要である。

したがって、これは、ヒトまたは動物の血液、尿などの他、細菌もしくは酵母ホ モジネートをカラムに直接導入できる、本特許請求の方法の主な利点の−っであ る。

相当な量の粒子性不純物を含む系では、上部アダプターに目詰まりが生じ得るこ とが判明した。これは、カラムを通る流れを吸着段階で時折逆流させれば、容易 に避けることができる。１５分毎に１０〜２０秒の断続的逆流でこの問題は除く ことができることが分かった。

一般的な実施例では、ｐＥＩがおよそ７で免疫グロブリンを含む培養液を、Ｉｇ Ｇと結合するプロティンＡを導入したビーズを含むカラムに図１８に示したよう に供給する。

粒子を含む廃液成分を中性緩衝液で洗い流し、流れを逆方向にし、充填床の形成 が完了したとき溶出緩衝液のｐＨをおよそ３に下げ、図１ｂに示した態様でカラ ムの底を通ってＩｇＧを溶出させる。

したがって、本発明は、その−局面においてダウンストリーム処理（例えば流動 床分離）で使用する、重合体マトリックスから成る支持体ビーズであって、その 中にシリカ粒子を含有するマトリックスに関する。該重合体は好ましくは多糖類 、例えばアガロース、澱粉、セルロースまたはこれらの誘導体で、場合によって 所望の堅さおよび孔分布を得るために架橋されている。ビーズは、１００〜１０ ００μｍ、好ましくは１００〜５００ｇｍの範囲で、重合体粒子中に最終湿潤粒 子重量の５〜５０％の範囲でガラスまたはシリカを含む。用いられるシリカ物質 は例えば石英で、今のところ石英が好ましい。本発明はさらに、所望の成分を含 む液体から種々の成分を分離する膨張床系でのそのようなビーズの使用にも関す る。

現時点で好ましいビーズマトリックスである、アガロースをベースにしたマトリ ックス材を調製するときは、石英粒子を含むアガロース溶液を、下記でさらに例 示するように増稠添加剤の存在下で乳化させる。

乳化剤は低分子量の界面活性化合物であるべきであるが、イオン性または非イオ ン性で、例えば５ｐａｎ２０゜Ｇａｆｅｎ　ＬＢ−４００または当該技術分野で 既知のものである。

膨張剤は分散媒中で可溶性であるべきで、疎水性多糖類誘導体から選ぶことがで きる。今のところ好ましいものはエチルセルロースである。

さらにビーズを安定化させるために、ビーズ中の重合体鎖は、好ましくはそれ自 体既知の方法で架橋することができる。アガロースのような多糖類を用いる場合 には、例えば、アガロースマトリックス中の隣接する鎖が架橋される条件下で、 ビスエポキシドまたはハロヒドリンのような架橋剤を含む溶液にビーズを懸濁さ せることができる（Ｐｏｒａｔｈ　（１９７１））。

架橋アガロースビーズ同様、アガロースビーズは極めて多くのクロマトグラフィ ー装置で用いられ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグ ラフィーなどで用いるビーズの種々の誘導化法を記載した多くの文献がある。こ れらの方法は、特定の利用のための支持体を調製するために、厳密に選択される ものである。

そのようものの−例は、ＩｇＧの精製用支持体調製のために、アガロースマトリ ックスに臭化シアン法でプロティンＡまたはプロティンＧを結合させるものであ る。

本発明は、別の局面において、安定化流動床を用いてサンプル成分を分離する方 法にも関する。この方法は以下の工程から成るニ ー流動液床処理用カラムを、所望の成分を結合するように誘導したビーズ粒子で 装填する； −安定化流動床ができるような条件下で、粒子を溶液で条件付けする； −そのように安定化させた流動床に、所望の成分を含むサンプル溶液をカラムの 下部出口から供給し、それによって所望の成分はビーズに結合し、さらにサンプ ル溶液中の不純物はカラムの上部出口から排出されるニー膨張床を維持する流れ 条件下で下部出口から導入した溶液でカラムを洗浄し、それによってサンプル溶 液中の残存未結合成分をカラムの上部出口から排出するニービーズから結合サン プル成分を遊離させ、場合によってはフラクションコレクターを用いてそれらを 採取するために、カラムに溶出液を導入する。

本発明の具体例では、溶出工程は、カラムの下部出口から溶出液を導入し、床を 膨張床型のままで維持することによって実施される。

別の具体例では、カラムの上部出口から適切な条件づけ緩衝液を流入させ、さら に上部のアダプターをゲル表面に移動させることによって、ゲル床は充填される 。この緩衝液はもちろんビーズから所望の成分を遊離させるものではない。その 後、溶出溶液をカラムの上部出口から導入し、サンプル成分をビーズから溶出さ せ、これを最終的にカラムの下部出口からの流出液において採取すこの方法を用 いる利点は、細胞培養実験で一種または二種以上の成分を培養液の他の成分と分 離する場合に、容易に理解し得よう。充填床の目詰まりを起こす固形細胞粒子は 、本方法の流動床段階でこの系から容易に除去でき、全く障害とならないであろ う。

一連の実施例によって、本発明をこれから詳述する。

実施例１１石英粒子含有架橋アガロースビーズ（Ｌｏｇ／１００ｍ１．６％アガ ロース）の合成 ビーズ形成 ５７ｇのアガロースを９０ｈｌの水に９０℃で、アガロースが溶解するまで撹拌 して、アガロース溶液を調製した。

この溶液の粘性は２５０〜７００ｃＰｓ　（８５℃）であった。

９０ｇの石英粒子（１０〜７０μ腸、ＮＧＱ２００、Ｅｒｎ５ｔｒＱｉｓ社製） を撹拌アガロース溶液に加えた。撹拌機（１００〜２００ｒｐｍ）を備えた円筒 容器に入れた、トルエン１０１００Ｏ中のエチルセルロース４５ｇ溶液（Ｎ　− ５０、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製）（６０℃）にこのスラリーを注入した。Ｇａｆｅ ｎ　ＬＢ　４００　（Ｇａｆ社製）／トルエン（１：　２　（ｖ／ｖ）　）のお よそ２０ｍ１を徐々に加え、所望のビーズサイズを得た。この撹拌懸濁液を室温 まで冷却し、１０００Ｉｌｌの水を加えた。混合物を一晩放置し、上層液を取り 除いた。ビーズをトルエン、水で洗浄し、最後に湿ったままふるいわけて１２５ 〜３１５μ厘の粒度分布をＰｏｒａｔｈら（１９７１）が記載したように、エピ クロロヒドリンによる架橋は必ず行った。

実施例２１石英粒子含有アガロースビーズ（１３ｇ／１００ｍ１．４％アガロー ス）の合成 水３００ｍ１中の１２ｇアガロースという点を除き実施例１のように調製した撹 拌アガロース溶液に４０ｇの石英（１０〜７０　ｐ　ｍ１ＮＧＱ２００、Ｅｒｎ ｓｔｒＱｍｓ社製）を加えた。コノスラリーを、３５０ｍ１のトルエン中の２５ ｇエチルセルロース（Ｎ−５０、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製）の撹拌溶液に６０℃で 懸濁させた。

１時間後、懸濁液を室温まで冷却した。石英含有アガロースビーズを洗浄し、湿 ったままふるいわけし、上記のように架橋した。

実施例３９石英粒子含有アガロースビーズ（１７ｇ　／　１００ｍ１．６％アガ ロース）の合成 水４５０ｍ１中の２８ｇアガロースおよび石英７５ｇという点を除き実施例２の ように、アガロース溶液中の石英スラリーを調製した。この懸濁液を５００ｍ１ のトルエンおよび５０ｇのエチルセルロース溶液に懸濁し、３時間６０℃で撹拌 した。室温まで冷却した後、ビーズを洗浄し、湿ったままふるいにかけ、上記の ように架橋した。

実施例４０石英粒子含有アガロースビーズ（３３ｇ　／　１００■１１６９６ア ガロース）の合成 石英粒子が１５０ｇという点を除き、実施例３のように調製した。

実施例５１石英粒子含有架橋デキストランビーズの合水４０ｍ１中の１６ｇのデ キストラン（分子量２５００００）、３，５ｇの水素化ホウ素ナトリウムおよび １．６ｇの水酸化ナトリウムの撹拌溶液に３ｇの石英粒子（１０〜４５μ園、Ｎ ＧＱ３２５、Ｅｒｎ５ｔｒＱｌ！ｓ社製）を加えた。このスラリーを、ブレード 撹拌器（５００ｒｐｍ）付き丸底フラスコに入れた、７５ｍ１トルエン中の３ｇ のＧａｆｅｎ　ＬＢ　４００および３ｇのエチルヒドロキシエチルセルロース（ ＥＩＩＥＣ−Ｘ■、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ社製）に加えた。撹拌懸濁液を５０℃に加 熱し、８１１１のエビクロロヒドリンを加えた。この懸濁液を５０℃で一装置い た。

その後この石英含有ビーズをエタノールで洗浄し、最後にわずかに酸性の水で洗 浄して、湿ったまま上記のようにふるいわけした。

実施例６１石英粒子含有多孔性ジビニルベンゼンビーズの合成 石英粒子のシラン化： １Ｍの水酸化ナトリウム２００ｍ１中の４０ｇの石英粒子（１０〜７０μｍ５Ｎ ＧＱ２００、Ｅｒｎ５ｔｒＱｉｓ社製）のスラリーを９０℃で３時間加熱した。

冷却したスラリーを濾過し、石英を水で洗浄して乾燥させた。この石英粒子を１ ４０ｍ１のトルエンに移し、６．２５　ｇのイミダゾールを加えた。撹拌スラリ ーを１００℃に加熱し、１６．６ｇのジメチルオクタデシルクロロシランを加え た。このスラリーを１００℃で一晩維持し、その後冷却まして濾過した。シラン 化石英粒子をアセトン、水で洗浄し、最後にアセトンで洗浄して室温で乾燥させ た。

懸濁重合反応： 水１００ｍ１中のポリビニルアルコール（Ｍｏｔｔｏ　１４０−８８、ＵＳＡ） 　５　ｇの溶液を、水１５０社中のデキストラン（分子量４００００）　１５ｇ の溶液と混合した。この撹拌溶液に、０．５ｇの過酸化ベンゾイル、２５１１の ジビニルベンゼン、２５ｍ１の４−メチル−２−ペンタノールおよび４ｇのシラ ン化石英のスラリーをゆっくりと加え、７５℃で６時間保持した。

冷却した懸濁液を濾過し、この石英含有ジビニルベンゼンビーズをアルコールで 洗浄し、さらに最後に水で洗浄した。

実施例７６石英粒子含有および不含アガロース粒子の沈降 この実験では、種々のゲルを、流動床実験に適したカラムに装填し、種々の流速 でのゲル床の高さを測定した。

ゲル１　：　（１２５〜２８０μｍ）は、実施例１のように合成したアガロース ゲルであるが、石英が添加されていない。

これは、さらに現行の実験には重要でないスルホネート基を含むように誘導され た。

ゲル２　：　（１２２〜２５０μｍ）は、実施例１のように合成した石英含有ア ガロースゲルである。石英含有量はアガロース１００ｍ１当たり石英１７ｇであ る。これはさらに、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を含むように誘導され た。

ゲル３　：　Ｃ１２５〜２８０ｔｔｍ）は、アガロース１００ｍ１当たり３３ｇ の石英を含むゲルで、ゲル２のように合成された。

各ゲルをカラム（５０Ｘ　６０（１＋＋ｍ）に装填し、その床の高さを測定した 。１０ｍ１／分の流れを用い、膨張床が安定した後、直ちに０床の高さを測定し た。流れを１０ｍ１／分で段階的に増加させ、その後の床の高さを測定した。結 果から、本発明のビーズを用いて非常に高い流速を採用することができ、なお安 定化流動床の条件下で機能させることができることが分かった。

実施例８．大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）ホモジネートからの組み換え抗凝固蛋白の精 製 抗凝固蛋白アネクシン（ａｎｎｅｘｉｎ）　Ｖを発現しているＥ。

ｃｏｌｉ株を発酵槽で複合栄養培養液で増殖させた。採取後、細胞をペレット化 し、水に再浮遊させ、高圧ホモジナイザーに３度通した。Ｔｒｉｔｏｎ　−Ｘ１ ００を最終濃度０．５％となるように加え、ｐＨを酢酸で５．５に調整した。

膨張床カラム（直径５Ｑ＋＋ｍ、高さ６０ｃｍ）に本発明の石英含有アガロース ビーズを１１．５ｃｍ（２２５ｍＭ）の高さまで入れた。このビーズはジエチル アミノエチル（ＤＥＡＥ）基を付加されている。ゲル床を平衡化緩衝液（３０ａ ＋Ｍ酢酸アンモニウム、ｐＨ５，５）で線型流れ速度３００ｃｍ／ｈで３０ＣＩ １１まで膨張させ、Ｅ、　ｃｏｌｔホモジネート１６００＋＊ｌを適用した。そ の後ゲル床を平衡化緩衝液および８０ｉＭ　ＮａＣ１含有平衡化緩衝液で４００ ｃｍ／　ｈで洗浄した。それから流れ速度を２００ｃｍ／　ｈまで低下させ、ゲ ルを充填するために流れの方向を逆にした。上部アダプターを床表面まで移動さ せ、結合蛋白を２５０ｍＭ　ＮａＣ１含有平衡化緩衝液で１００ｃｍ／１１で溶 出させた。抗凝固蛋白活性アッセーによれば、用いたアネクシンＶの８０％がゲ ルに結合し、さらにゲルから溶出した。

この精製は、３．１リツトルのゲルを含むパイロットスケールの膨張床カラム（ 直径２００　ｍ　ｍ　ｓ高さ９５ｃｍ）でも繰り返され成功した。このサンプル 容積は８リツトルであった。

実施例９．流動床の安定性試験 分配機（大面積は全面積の３％）付き膨張床カラム（直径５０ｍｍ、高さ６０ｃ ｍ）に、粒度分布が１００〜２７０μ鴨の範囲の石英含有アガロースビーズを６ ．０ｃｍ（１１８＋ａｌ）まで入れた。

ゲルを線型流れ速度３００ｃｍ／ｂで水中３０ｃｍまで膨張させた。整流機上の 圧力低下は床の圧力低下の６６％であった。

カラムに０．２５％の濃度のアセトン溶液を“刺激応答実験“（Ｌｅｖｅｎｓｐ ｉｅｌ（１９７２）参照）のトレーサーとしてパルス注入した。“低分散用分散 モデル”のモデルにおいて定義される“容器分散値”として表された結果は１９ Ｘ　１０−”であった（定義についてはＬｅｖｅｎｓｐｉｅｌ　（１９７２）参 照）。

参考文献 Ｂｕｉｊｓら（１９８０）　“浮遊粒子含有流体用バッチ式流動イオン交換カラ ム”（“Ｂａｔｃｈ　ｆｌｕｉｄｉｚｅｄ　ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅｃｏｌｕ ｍｎ　ｆｏｒ　ｓｔｒｅａｍｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　５ｕｓｐｅｎｄｅｄ　 ｐａｒｔｉｃｌｅｓ”）Ｊ、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　２０１．　ｐ、３ １９〜３２７゜Ｌｙｄｅｒｓｅｎ　（１９７９）　“液体流れと熱交換”（“Ｆ ｌｕｉｄ　ｆｌｏｗａｎｄ　ｈｅａｔ　ｔｒａｎｓｆｅｒ−）　Ｊｏｈｎ　Ｗｉ ｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ　Ｌｔｄ、。

Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、　ｐ、１３４〜１３６゜Ｂｕｒｎｓら（１９８５：　１ ）　“磁気安定化流動床を用いる連続アフィニティークロマトグラフィー″（“ Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ｕｓ ｉｎｇ　ａ　ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ　ｆｌｕｉｄｉｚ ｅｄ　ｂｅｄ’）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｏｇｒｅｓｓｌ（２）、 　ｐ、９５〜１０３゜ Ｂｕｒｎｓら（１９８５：　２）　“乾燥アルギン酸カルシウム／マグネタイト 球：クロマトグラフィー分離および酵素固定化用の新しい支持体”（“Ｄｒｉｅ ｄ　ｃａｌｃｉｕｍ　ａ１ｇｉｎａｔｅ／ｍａｇｎｅｔｉｔｅ　５ｐｈｅｒｅｓ 　：　Ａ　ｎｅｗ　５ｕｐｐｏｒｔ　ｆｏｒ　ｃｈｒｏｓａｔｏ−ｇｒａｐｈｉ ｃ　５ｅｐａｒａｔｊｏｎｓ　ａｎｄ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔ ｉｏｎ”　）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉ ｎｇ　２７．　ｐ、１３７〜１４５゜Ｐｏｒａｔｈら（１９７１）　“クロマト グラフィー、電気泳動およびゲル結合酵素用寒天誘導体、球形ビーズ形の脱硫酸 、低架橋寒天およびアガロース”（“Ａｇａｒ　ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓｆｏｒ 　ｃｈｒｏ＋＊ａｔｏｇｒａｐｈｙ、　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ａｎ ｄ　ｇｅｔ　ｂｏｕｎｄｅｎｚｙｍｅｓ、　Ｄｅｓｕｌｐｈａｔｅｄ　ａｎｄ　 ｒｅｄｕｃｅｄ　ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　ａｇａｒａｎｄ　ａｇａｒｏｓｅｉ ｎ　５ｐｈｅｒｉｃａｌ　ｂｅａｄ　ｆｏｒｌｌ”　）　Ｊｏｕｒ、　ｏｆＣｈ ｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　６０．　ｐ、１６７〜１７７゜Ｌｅｖｅｎｓｐｉｅ ｌ　（１９７２）　“ケミカルリアクションエンジニアリング”　（”Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”　５ｅｃｏｎｄＥｄｉ ｔｉｏｎ、　Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ）。

Ｖコ Ｆ工Ｇ、ｌｂ 国際調査報告 ．＠ヶ＋＋ｍｗｓｌ　Ａｐ＠ｌｌｇｍｍ　＋ｍ　Ｐσ／ＳＥ　９２／００２５５ 国際調査報告 丁：ｗ＝″．ｈ−＝＝＝＝＝；Ｚ％ｑｚ冨ｒ　ｄｋｍ　ｌ＋＋　ｈ゜ｆｆ？ｒ’ ”−Ｔｈａ　Ｖｓｈ　ＮｌｌｌｌｌＩ　ＯＩｎａｍ　ＩＩ　Ｉ＠　ｗ　ｍｙ　ｌ ｍ−１ｗ　ｔｋａａｍ　一−ｍｎ　ｗｈｉｓｋ　ｗｅ−１−ｌｍ@一一一ｍ　ｌ −−１１ａ＋ｃ フロントページの続き （７２）発明者　へッドマン、ベル スウェーデン国ニス−１９４４０ウプランツヴエスビュー、ルンピューヴエイエ ン４８（７２）発明者　ベルネマルム、ペルーオーケスウェーデン国ニス−７５ ６４６ウプサラ。

ビョルクハークスヴエイエン　１１デー（７２）発明者　リョングレン、イヨル ゲンスウェーデン国ニス−７５６５２ウプサラ。

ウルムヴロークスヴエイエン１６ （７２）発明者　リントグレン、アン二カスウェーデン国ニス−７５７５５ウプ サラ。

ホランツレーサン１５５

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．サンプル溶液から所望の成分を回収する方法であって、 （ｉ）回収する所望の成分を含むサンプル溶液を、該成分に親和性を有するビー ズを含むカラムに、差流機を備えた下部出口から、安定化流動床の条件で供給し 、それによってサンプル溶液の未結合成分を該カラムの上部出口から排出させ、 （ｉｉ）膨張床を維持する流れ条件で、該下部出口から導入した溶液でカラムを 洗浄し、それによってサンプル溶液中の残存固体成分および他の不純物をカラム の上部出口から排出し、 （ｉｉｉ）該ビーズに結合したサンプル成分を遊離させる溶出溶液を導入し、該 成分を採取する ことから成る当該回収方法。
2. ２．工程（ｉｉｉ）が、該ビーズを落ち着かせ、場合によっては上部アダプター を該床表面に下げ、さらに充填床が形成されるように該カラムの上部出口から溶 液を導入し、その後該成分をビーズから遊離させる溶出溶液を上部出口から導入 して該カラムから溶出させることによって行われる、請求項１に記載の方法。
3. ３．流動床を形成するビーズが、請求項５〜１０のいずれかに記載のクロマトグ ラフィー用支持体ビーズであることを特徴とする、請求項１または２に記載の方 法。
4. ４．該サンプル溶液が固形細胞粒子を含む細胞培養液であることを特徴とする、 請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. ５．重合体マトリックスから成り、その中にガラスまたはシリカ粒子を含有する ことを特徴とする、ダウンストリーム処理で使用する支持ビーズ。
6. ６．該重合体が、場合によって架橋された、多糖類であることを特徴とする、請 求項５に記載の支持ビーズ。
7. ７．該重合体がアガロースであることを特徴とする、請求項６記載の支持ビーズ 。
8. ８．１００〜１０００μｍの直径を有し、シリカまたはガラスの含有量が５〜５ ０％（湿潤重量）であることを特徴とする、請求項５〜７のいずれかに記載の支 持ビーズ。
9. ９．該ガラスまたはシリカ粒子が１〜１００μｍの範囲の粒度分布を有すること を特徴とする、請求項５〜８のいずれかに記載の支持ビーズ。
10. １０．用いるシリカ粒子が石英粒子であることを特徴とする、請求項５〜９のい ずれかに記載の支持ビーズ。