JPH06500461A - 造血前駆体細胞の成熟促進 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 造血前駆体細胞の成熟促進 発明の背景 本発明においては合衆国政府がＯｕｔｓｔａｎｄｉｎｇ　Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔ ｏｒ　Ｇｒａｎｔ、　Ｃａ　３９８１４を通して叶、　Ｒｕｔｈ　Ｓａｇｅｒを 支持しており、本発明の権利は、合衆国政府が有する。

本発明は、造血前駆体細胞の成熟促進に関する。

ＧＲＯは、ｇｒｏと呼ばれる遺伝子にコードされるポリペプチド成長因子である （Ａｎｉｓｏｖｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｅ、　Ｎａ１１．Ａｃａｄ、　 Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８４ニア１８８−７１９２．１９８７；@Ａｎｉｓ ｏｖｌｃｚ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 　ＵＳＡ　８５：９６４５−９６４９．１９８８　）　、ヒg成熟 ＧＲＯのアミノ酸配列（すなわちＡｎｉｓｏｖｉｃｚらによって１９８７年にｇ ｒｏ　ｃＤＮＡ配列から推定された配列、ただし、３４アミノ酸残基のリーダー ペプチドを除く）は、ヒト悪性黒色腫細胞系の調整培地中に存在し、黒色腫成長 刺激活性もしくは“ＭＧＳＡ”と呼ばれティた７３アミノ酸残基から成る蛋白質 （Ｉｌｃｔｏｓｏｎｄ　ｅｔａｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　４３ ：２１０Ｂ−２１１２，１９８３；　ＲＬｃｈｍｏｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　ＥＭ ＢＯＪ、　７：２０２５|２０３３゜ １９８８　）のアミノ酸配列と一致した。同様に、活性化好中球から分泌される 蛋白質（好中球活性化ペプチド−３またはＮＡＰ−３）のＮ−末端アミノ酸配列 は、少なくともＧＲＯ／ＭＧＳＡのものと、少なくともそれぞれ３１番目の残基 まで一致した（Ｓｅｈｒｏｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、 　１７１：１０９１−１１００．１９９０）、ＧＲＯ／ＭＧＳＡは、黒色腫細胞 、肺ガン細胞、母斑細胞、不死繊維芽細胞系の成長因子として機能する（Ｒｉｃ ｈｗｏｎｄ　ａｎｄ　Ｔｈｏｍａｓ、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　１０７： ４０Ａ　ＨＯ３，１９８ｇ　）。

ｇｒｏ遺伝子のＤＮＡ配列は、炎症性応答に関与する分泌蛋白質をコードする遺 伝子群と類似している。この遺伝子群のｇｒｏを含む各遺伝子は、他のサイトカ イン及び成長因子と同様、ホルボールエステル、インターロイキン−１及び腫瘍 壊死因子（ＴＮＦ）のような薬剤により、感受性細胞（ｓｕｓｃｅｐｔａｂｌｅ 　ｅｅｌ　Ｉ）中に迅速に誘発される（Ａｎｉｓｏｖｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ、、　 １９８７；＾ｎ１ｓｏｖｉｃｓ　ｅｔ　ａｌ、、　１９８８）　ｏこの遺伝子群 のメンバーがコードする蛋白質は、同一位置に存在する４個のシスティン残基を 含む高い配列相同性を示す蛋白質をコードしている：このような蛋白質には以下 のようなものがある；血小板因子−４（Ｄｅｕｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ 、　Ｎａ１１．＾ｃａｄＳｃｊ、ＬＩＳ＾７４二２２５６．１９７７）　；血小 板塩基性蛋白質及びその分解産物：β−トロンボグロブリン（Ｂｅｇｇ　ｅｔ　 ａｌ、、Ｂｌｏｃｈｅｍｌｓｔｒｙ　１７：１７３９．１９７８）結合組織活性 ペプチドｍ　（ＣＴＡＰ　ｍ）　（Ｃａｓｔｏｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８０ニアＢ５、１９８３）　； インター７　ｘ　Ｏン誘発性蛋白質１０　（Ｉ　ＰＩＯ）　（Ｌｕｓｔｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３１５：６７２．１９８５　）　；　７クロフア ージ炎症性蛋白質−２（ＭＩＰ−２）　（ｗｏｌｐｅｅＬ　ａｔ、、　Ｐｒｏｃ 、　ＮａＬｌ、　Ｓｃｊ、　ＵＳＡ　８Ｂ＋６１２．１９８９　）　；及び好中 球活性化蛋白質−１フィンターロイキン−８（ＮＡＰ　−１／　Ｉ　Ｌ−８）　 （Ｗａｌｚ　ｅＬ　ａｌ、、　Ｂｌｏｃｈｅｍ、　Ｂ＋ｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、 　ＣｏＩＩＩＩｌｌｕｎ、　１４９ニア５５．１９８７　）　［ＮＡＦ　（Ｗａ ｌｚ　ｅｔ　ａｔ、；　Ｌｌｎｄｌ■凵@ｅＬ　ａｌ 、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８５：９１９ ９．　１９１１８　）　、ＭＤＮＣＦ　（Ｙｏｓｈｌ＋ｇｕ窒＝@ｅｔ ａｔ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８４：９２ ３３．１９８７　）　、ＭＯＮＡＰ　（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ　■ ｔ　ａｌ、、　Ｊ、ｌ＋ｕ＋ｕｎｏ１．１３９：３４７４．１９８７　）　、及 びＧ　ＣＰ　（Ｖａｎ　Ｄａｍｍｃ　ａｔ　ａｌ、、　Ｊ、@Ｐｘｐ 、　Ｍｅｄ、　１６７：１３６４．１９８８　）　］　、この後者の化合物は好 中球特異的走化性因子０１ａＩｚ　ｅｔ　ａｌ、；　Ｌｉｎｄｌｅｙ　ｅｔ　ａ ｔ、：　Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ　ｅｔ　ａｌ、；　５ｃｈｒｏｄｅｒ　ａｔ　ａｌ 、；　Ｖ≠氏@Ｄａｕ＋ｅ ｅｔ、　ａｔ、）　、細胞アクティベータ（ｖｏｌｐｅ　ｅｔ　ａｔ、；　Ｌｉ ｎｄｌｅｙ　ｅＬ　ａｔ、）　、好中球の内皮細胞への付着に対するインヒビタ （低濃度）　（Ｇｉａｂｒｏｎｅ　ｅＬ　ａｔ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４６： １６０１．１９８９　）及びアクティベータ（高濃度）　（Ｃａｒｖｅｔｈ　ｅ ｔ　ａｌ、、　Ｂｌｏｃｈｅ＠、　Ｂｌ。

ｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃａａｍｕｎ、　１６２：３８７．１９８９）である。

非常に間接的と言える根拠に基づいてはいるものの、Ａｎｌｓｏｖｉｃｚら（１ ９８８）はｇｒｏ遺伝子は“細胞増殖における推定上の正の初期応答遺伝子、繊 維芽細胞におけるＩＬ−１−誘導炎症応答のメディエータ、上皮細胞における負 の制御因子として、様々な重要な細胞機能゛を有しているであろうと提唱した。

発明の要旨 概して本発明は、動物（例えばヒト）の造血前駆体細胞（好ましくはＣＦＵ−０ ２ＭＭ細胞もしくはＣＦＵ−ＧＭ細胞）の成熟を促進する方法を特徴としており 、この方法には成熟を促進する量のＧＲＯを細胞に接触させる過程も含まれる。

好適な態様において、細胞は最初に動物から取り出され（例えば動物の骨から骨 髄を取り出すなどの方法で）　、Ｉｎ　ｖｌｔｒｏでＧＲＯと接触される；次い で、好ましくは、細胞及び／又はその子孫は、元の動物もしくはその代わりとし て第二の動物（最も好ましくはヒト）に再度挿入される。

また、本発明は、動物に成熟を促進する量のＧＲＯを導入することにより、動物 （例えばヒト）の造血前駆体細胞（好ましくはＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞もしくはＣ ＦＵ−ＧＭ細胞）の成熟を促進する方法も特徴としている。本発明の全ての方法 に使用されるＧＲＯは、組み換えＧＲＯ（すなわちＧＲＯをコードする組み換え ＤＮＡ分子の発現により生産される）であることが好ましく、また、例えば成熟 ヒトＧＲＯと同じアミノ酸配列を有するか、もしくは天然ＧＲＯのアナログまた は断片であることが好ましい。

動物体内で造血前駆体細胞の成熟を促進する他の方法は、ＧＲＯを放出する（す なわち、分泌またはそれ以外の方法でＧＲＯを細胞外に移送する）−個またはそ れ以上の細胞を動物に導入するものである；その他、ＧＲＯをコードし、発現可 能な遺伝子を一個またはそれ以上の動物細胞に導入し、造血前駆体細胞の成熟促 進に十分な量のＧＲＯを動物体内で放出することができる細胞（ここではトラン スジェニック細胞と呼ぶ）を作製する方法もある。

ここで“造血細胞”という用語は、赤血球、巨核球、単球、顆粒球、好酸球など の完全に分化した骨髄細胞及び、Ｂリンパ球様細胞、Ｔリンパ球様細胞などの完 全に分化したリンパ球細胞を指す；また、分化細胞が発達する基となる以下のよ うな様々な造血前駆体細胞も含む：　ＢＦＵ−Ｅ　（バースト形成ユニット−赤 血球）　、ＣＦＵ−Ｅ　（＋ｏユニー成ユニットー赤血球）　、ＣＦＵ−Ｍｅｇ 　（＝ｉｏニー形成ユニットー巨核球）　、ＣＦＵ−ＧＭ　（コロニー形成ユニ ット−顆粒球−単球）、ＣＦＵ−Ｅｏ（コロニー形成ユニット−好酸球）及びＣ ＦＵ−ＧＥＭＭ（コロニー形成ユニット−頴粒球−赤血球−巨核球一単球）。こ れら造血細胞の相互関係と様々な分化経路における位置を図１に示した。造血前 駆体細胞の“成熟。

は、前駆体細胞の子孫（その前駆体細胞と同一、またはより分化した、またはそ の両方が混在している）の発生を意味する。例えば、本発明の方法によりＣＦＵ −ＧＥＭＭは複数の細胞を生じるよう誘導されるが、これらの一部はＣＦＵ−Ｇ ＥＭＭてあり、他はＣＦＵ−ＧＭ、ＣＦＵ−Ｅｏ及び巨核球のように分化の進ん だもの、または単球／マクロファージ、血小板、顆粒球（例えば好中球、好塩基 性球または好酸球）のような完全に分化した最終段階の細胞である。成熟を促進 するＧＲＯの量とは、骨髄中に存在する、もしくは骨髄から取り出された相当数 の造血前駆体細胞の成熟を引き起こすのに十分な蛋白質の量である。例えば、そ の量のＧＲＯにより、半固形物質上に播かれた約１０６個の低密度骨髄細胞（す なわち、下記のＰｌｃｏｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ法で沈澱しない骨髄細胞）のう ち、最低−個の造血前駆体細胞が最低８個（３７℃で７日間培養後）、または最 低４０個（３７℃で１４日間培養後）の細胞（これらの細胞は元の細胞と同一ま たはより分化している）から成るコロニー（−個の細胞から生じた細胞全体のグ ループ）を形成するまで増殖するよう誘導される。ｉｎ　ｖｉｖｏのＧＲＯ処置 による成熟を促進するＧＲＯの量とは、処置を受けた患者の体内で造血細胞を増 加させることができる量を指す。

所定の種類または量のＧＲＯが細胞の成熟を促進する能力は、藻標準的な方法で 測定することができる。例えば下記の通り骨髄から取り出し、半固形物質上で培 養した細胞に対するＧＲＯのコロニー形成促進活性を測定することにより、その 生物活性をｉｎ　ｖｉｔｒｏで測定することができる。

ＧＲＯは、Ｒｊｃｈｍｏｎｄら（１９８３，１９８８）のＭＧＳＡ蛋白質とＡｎ ｌｓｏｖｊｃｚら（１９８７，１９８８）のｇｒｏにコードされた蛋白質のみを 示すものではなく、いかなる動物種（特に哺乳類もしくは他のを推動物）に内在 する比較的活性のあるＧＲＯをも示す。現時点においては、三種の異なるヒトｇ ｒｏｃＤＮＡがクローニングされている。一つ目（ここでは、ｇｒｏ　ａと呼ぶ ）は、Ａｎｌｓｏｖｌｃｚら（１９８７）により、ヒト膀胱ガン細胞系（Ｔ２４ ）ｃＤＮＡライブラリーから同定された。このｇｒｏαＣＤＮＡをプローブとし て凝集した（ａｄｈｅｒｅｎｔ）単球ｃＤＮＡライブラリーを検索したところ、 ｇｒｏαｃＤＮＡとやや配列の異なる８８０ｂｐから成る部分的なＣＤＮＡクロ ーンが得られた。この部分的ｃＤＮＡをプローブとして第二のｃＤＮＡライブラ リーを検索したところ、ポジティブにハイブリダイズするｇｒｏαｃＤＮＡクロ ーン及び二種の異なるクローン（ｇｒｏβ、ｇｒｏγ）が得られた。ｇｒｏαｃ ＤＮＡをプローブとしてヒトゲノムＤＮＡライブラリーを検索することによって 得られたゲノムクローンを部分的に塩基配列を解析した結果、三種は、関連性が あるが異なる遺伝子から派生し、その三つの遺伝子とも染色体４ｑの同一領域上 にマツプされることが確認された。三種のｃＤＮＡの塩基配列及び推定翻訳配列 を図２に比較表示した。

このような多様な天然ＧＲＯをコードする遺伝子もしくはｃＤＮＡは、Ａｎｌｓ ｏｗｌｃｚら（１９８７）が使用したのと類似の方法により、ヒトもしくは他の ｇｒｏｃＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブに用いて同定及びクローニン グすることができる。Ａｎｊｓｏｗｌｃｚら（１９８７）が発表したヒトＧＲＯ α及びチャイニーズハムスターＧＲＯのｃＤＮＡ配列及び対応アミノ酸配列を図 ３に示す。ＧＲＯという用語は、溶液中で安定であり、天然ＧＲＯ／ＭＧＳＡに 匹敵する成熟促進の生物活性を示すいかなる天然ＧＲＯのいかなるアナログもし くは断片をも含む。それは、ＧＲＯ／ＭＧＳＡの成熟促進部分を提供する場合の みに限定される。ＧＲＯ／ＭＧＳＡの必須部分は、数ある標準的な技術のいずれ を用いても決定できる。

例えば、ＧＲＯをコードするｃＤＮＡもしくはクローニングされた遺伝子は、標 準的なｉｎ　ＶＩｔｒＯ変異導入法による改変が可能であり、その結果ＧＲＯア ナログは一個もしくはそれ以上の部位での一個もしくはそれ以上のアミノ酸置換 、付加、及び／又は欠失を起こして発現する。アミノ酸置換は保存的な場合も非 保存的な場合もあり、また、例えばＧＲＯ蛋白質からプロテアーゼ感受性部位を 除去するよう設計されることもある。［保存的とは、置換されたアミノ酸が元の アミノ酸と化学的に類似している（例えば、酸性、塩基性、疎水性、芳香族性） ことを意味する：例えばロイシンからバリンへの置換。］　ＧＲＯ蛋白質に潜在 的に有用な付加を行なう例として、いずれかの末端への以下のような短いペプチ ドの付加などがある：蛋白質を細胞外に分泌させるためのリーダーペプチドや、 蛋白質産物を免疫親和力に基づいて精製できるような抗原部位を提供するため遺 伝子工学的手法により付加したペプチド：そしてキメラＧＲＯ蛋白質は、特定の 受容体に結合することが可能なポリペプチドリガンドに共有結合する。成熟促進 活性を損なわずに内部にアミノ酸が付加されたＧＲＯの形状もＧＲＯの定義に含 まれる。これら作製されたアナログは、期待される生物活性、すなわち成熟促進 活性を試験される。このような方法で、ＧＲＯの成熟促進部分を特異的に決定す ることができ、その機能に必須ではないアミノ酸残基は除去、または他の残基と 置換される。

その他、天然もしくは組み換え蛋白質を、例えばトリプシンのような様々なプロ テアーゼにより消化して断片を作製し、これらについて成熟促進活性を試験する 方法もある。天然ＧＲＯの成熟促進部分を有する断片もしくはアナログは、簡便 なＩｎ　ｖｉｔｒｏ技術を用いて容易に決定することができる。

また、ＧＲＯという用語には、（ａ）天然成熟ＧＲＯの一部分と最低８０％の相 同性を有する連続した２０残基部分（すなわち、２０残基部分を天然ＧＲＯのそ のような部分と並べた時、前者のうち最低８０％の残基がそれに対応する後者の 残基と一致する）、もしくは（ｂ）天然成熟ＧＲＯの一部分と最低９０％の相同 性を有する連続した１０残基部分のいずれかを含む７０〜１００アミノアシル残 基のアミノ酸配列を有する蛋白質もしくはポリペプチドも含まれる。ＧＲＯポリ ペプチドが７０アミノ酸より小さい場合（例えば、２０〜３０アミノ酸）、この ようなポリペプチドは天然ＧＲＯのある部分と最低８０％の配列相同性を示す。

ＧＲＯは、ＧＲＯ蛋白質を自然生産または誘導生産する動物組織または細胞がら の抽出、化学合成、もしくは組み換えＤＮＡ技術などの標準的な方法により生産 することが可能である。上述の通り、期待されるＧＲＯをコードするＤＮＡは標 準的な技術により、Ｒｉｃｈｉｏｎｄら（１９８ｇ）及びＡｎｉｓｏｖｉｃｚら （１９８７）が示したものと異なるアミノ酸配列を有するＧＲＯをコードするよ う改変することが可能であり請求められるいかなる細胞においても発現される。

天然ＧＲＯはグリコジル化されていないため、ＧＲＯをグリコジル化した状態で 生産する必要はない。

出願人は、意外にもＧＲＯが、ある造血前駆体細胞の成熟促進に有効であること を発見した。それまでは、造血前駆体細胞の成熟促進に有用な因子には、マルチ −Ｃ３Ｆ　（インターロイキン−３もしくはＩＬ−３とも呼ばれる）、顆粒球コ ロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）　、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ｃｓ Ｆ）及び顆粒球−マクロファージ刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激 因子（Ｃ５Ｆｓ）などがあった。これらはすべて分子量１４−４５ｋＤの糖蛋白 質であり、内皮細胞、繊維芽細胞、マクロファージ及びリンパ球などの多様な細 胞タイプで合成される。これに対して、ＧＲＯは糖蛋白質ではなく、分子量は７ ｋＤにすぎない。さらに、そのアミノ酸配列は、既知のＣＳＦそれぞれの配列と 大きく異なる。ＩＬ−１及びＩＬ−６を含むＣＳＦと相乗作用で機能することが 判明している他の因子にもＧＲＯアミノ酸配列配列似の配列を有するものはない 。

本発明の方法により、患者において造血前駆体細胞の増殖及び成熟を誘導するこ とにより完全に分化した造血細胞（顆粒球やマクロファージなど）のレベルを増 大させる手段が提供される。ＧＲＯを用いた治療法は、Ｉｎ　ｖｉｖｏ　、ｅｘ 　ｖｌｖｏのいずれにおいても行なうことが可能であり、患者自身の骨髄細胞、 もしくはドナーから提供された細胞を利用することができる。　最適な臨床結果 を得るために、ＧＲＯは単独もしくはインターロイキン（特にＩＬ−１、Ｉ　Ｌ −３、Ｉ　Ｌ−６及びＩＬ−８）、コロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−Ｃ３ＦＳ Ｇ−Ｃ３Ｆ、及びＭ−Ｃ３Ｆ）及びエリスロポイエチンとの組合せて使用するこ とが可能である。

本発明の他の特徴及び利点は、以下に述べる好適な実施例及び特許請求の範囲か ら明確である。

本発明の好ましい態様 はじめに図を簡単に説明する。

図１は様々な造血細胞の、分化経路の相互関係を示している。（Ｓｃｈｅｒｉｎ ｇ　Ｐｌ。

ｕｇｈ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ及び５ａｎｄｏｚ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｌｃ ａｌｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎが作製した１９９０年の図から転載）。

図２はヒトｇｒｏα、ｇｒｏβ及びｇｒｏγのｃＤＮＡ配列を比較表示している ：（Ａ）コーディング配列とそれに対応するアミノ酸配列；　（Ｂ）　５’　非 翻訳配列；（Ｃ）　３’　非翻訳配列、保存されている配列は箱で囲っである。

図３はヒトＧＲＯαとチャイニーズハムスターＧＲＯに対する塩基配列とそれに 対応するアミノ酸配列を示している：　（Ａ）　５°非翻訳領域及び蛋白質コー ディング領域。（Ｂ）３°非翻訳領域。（Ｃ）ヒト及びチャイニーズハムスター ｇｒｏ　ｃＤＮＡ３’非翻訳領域の間で高い相同性を示す領域。（Ａｎｉｓｏｖ ｉｃｚら（１９８７）の図４及び図５から転載。） 図４は多形核白血球（ＰＭＮＳ）に対する組み換えＧＲＯ（ｒｇｒｏ）の進化性 活性及び既知の化学誘引剤、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　（ｒｍｌｐ）の関係 を示したグラフである。

ＧＲＯの調製 上述の通りＧＲＯは、組み換えＤＮＡ技術を含むがそれに限定されないいかなる 標準的な方法でも調製することが可能である。二通りの別個の調製方法を下記の 例１及び例２に示すが、他の方法も蛋白質生産における当業者には明白であろう 。

Ｃ０８−１細胞（ＡＴＣＣＮｏ、ＣＲＬ１８５０　）に、ヒトｇｒｏ　ｃ　ＤＮ Ａ　（Ａｎｉｓｏｗｉｃｚ　ｅｔ　ａｌ８．１９８７）を有するｐＸＭ発現ベク ター（Ｇａｎｃｔｌｃｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ、　Ｃａｓｂｒｌｄｇｏ、　ＨＡ より入手可能）を一時的にトランスフェクションした。細胞を１０％ウシ胎児血 清（Ｆ　ＣＳ）を含むＡｌｐｈａ培地（Ｇｌｂｃｏ　）中に１日間放置し、次い て、血清を含まない培地で洗浄した後、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンと１００μ ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＡｌｐｈａ塩中に二日間放置した。培地を 回収し、低回転の遠心分離（５００Ｘ　ｇ、五分間）を行なって細胞残渣を沈澱 させた。培養上清を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）に対して透析し、 直ちに陽イオン交換カラム（ＣＭ−セフ７デクス、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　ｌ１ ｐｐｓａｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）にかけた。

結合した蛋白質を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６，５）中で０〜０．７ＭＮ ａｃ１の塩濃度の１次グラジエントにより溶出した。各分画の一定部分を１８％ ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析し、成熟組み換えＧＲＯの存在を示す６ ｋＤの明白な銀染色バンドが認められるかどうか調べることにより、ＧＲｏを含 有する分画を決定した。ＧＲＯを含有するバンドは、ＧＲＯの１０アミノ酸残基 から成るＣ−末端断片に対して作製した抗体との交差反応を行なうことにより確 認した。ＧＲＯを含有する分画を回収し、分画分子量３．０００ダルトンの膜を 通して分別濾過を行なって蛋白質を濃縮した。

実施例２ 組み換えＤＮＡ技術を用いて、ヒトＧＲＯアナログ［天然成熟ヒトＧＲＯαとは Ｎ−末端８ペプチドタグ：　ＡｓｐＴｙｒＬｙｓＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐＬｙ ｓを有するとコロカ違う（Ｈｏｐｐｅｔ　ａｌ、　、Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ　６：Ｌ２０４−１２１０．１９８８）　］を酵母中で生産した。

成熟ヒトＧＲＯαをコードするｇｒｏｃＤＮＡの一部分を酵母発現プラスミドｐ αＡＤＨ２（Ｐｒｉｃｅ　ａｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ５５：２８７−２９３．１９ ８７）に挿入し、Ｓ、ｃｅｒｅｖｌｓｉａｅ株ＸＶ２１８／　（ａ／α−ｔｒｐ −１）中で発現させた。得られたＧＲＯアナログは、Ｈｏｐｐらの方法により、 ８ペプチドタグの最初の４残基に特異的な抗体を利用した一段階のイムノアフィ ーティ法で精製した。

ＧＲＯの生物活性の測定 ＧＲＯ（天然ＧＲＯの断片及びアナログを含む）の生物活性は、実施例３−５に 記載の方法で測定することができる。

実施例３：　成熟促進活性の測定 造血前駆体細胞の成熟を促進するＧＲＯの能力は、以下に記載のような方法でＩ ｎ　ｖｌｔｒｏで簡便に測定することができる。この測定法の機能上の変化、及 び他の測定法も、当業者には明白であろう。

ヒトまたは他の動物の骨髄を標準的な無菌操作により回収し、ヘパリンを加えて 凍結もしくは直ちに使用した。低密度骨髄細胞を、標準的な方法に従ってＦｌｃ 。

ｌ　１−Ｈｙｐａｑｕｅ　（ＬＳＭ、Ｏｒｇａｎｌａ−ＴｅｃｈｎｉｃａＳＤｕ ｒｈａＩＩ、　ＮＧ）密度勾配遠心分離により単離し、次いで洗浄し、１００Ｕ ／ｍｌ　ペニシリン、１００μｇ／ｍｌ　ストレプトマイシン、１２．５％　Ｆ ｅ２及び１２．５％　ウマ血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地中でＩ　Ｘ　１０ ６細胞／ｍ＋になるよう調整した。この細胞（ＩＸＩＯ５）を、最終ａ度０．９ ％（Ｗ／Ｖ）のメチルセルロース（１５００センチポアズ）を含む同じ培地１． ０ｍｌが入ったＬｕｘ　３５−＋ｕ　ｇｒｉｄｄｅｄ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｄｉｓ ｈｅｓ　（Ｎｕｎｃ、　Ｉｎｃ、、Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）に、二連で 接種した。試験に供するＧＲＯを、例えば最終濃度２５．５０、もしくは１１０ ０ｎ／ｍｌで添加した。次いで、培養シャーレを水の入った１５０ｍｍシャーレ に入れ（湿り気を与えるため）、５％のＣＯ２を含有する空気中で３７℃で培養 した。１４日間の培養後、造血細胞コロニー（≧４０細胞／集合体）を計測した 。一般に、各コロニーは複数のタイプの（ｔｙｐｅｓ　）造血細胞の混合物から 構成されており、その組合せは各コロニーに特有で、これにより、そのコロニー の派生する元となった造血前駆体細胞が示唆される。例えば、顆粒球、単球、及 び／もしくはＣＦＵ−ＧＭ細胞のみを有するコロニーは、単一のＣＦＵ−ＧＭ細 胞に成熟促進活性を作用させた結果生じたものであり、これら三種の細胞タイプ に加えて好酸球、ＣＦＵ−Ｅｏ、巨核球、赤血球、ＣＦＵ−ＭｅｇＳＣＦＵ−Ｅ 、ＢＦＵ−Ｅ及び／もしくはＣＦＵ−ＧＥＭＭを含むコロニーは、より原始的な 前駆体細胞（ＣＦＵ−ＧＥＭＭ）から派生したもので、ＣＦＵ−ＧＥＭＭコロニ ーと計測される。ある特定の造血細胞タイプを他の造血細胞から区別する方法は 、血液学の分野の当業者には明白である。例えば、各コロニーの細胞形態は、Ｖ ｒｌｇｈｔのＧｉｅｍｓａ技術によりＤｌｒｒ−Ｑｕｌｃｋｍｏｄｌｆｌｃａｔ ｌｏｎ　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ　、　 ＭＯ）を用いて染色した細胞を細胞遠心分離（ｃｙｔｏｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ） で調製したものを分別的に計測することによって評価できる。

負の対照実験（（−）制御）　、ＧＲＯ（もしくはいかなるサイトカイン）を含 まない当量の緩衝液を、同様に調製した骨髄細胞に添加した。正の対照実験（（ ＋）制＃）は、コロニー形成の解析に使用される造血前駆体細胞のタイプによっ て異なる。下記の表■に示した実験においては、ＣＦＵ−ＧＭ細胞によるコロニ ーの形成誘導の正の対照実験として５Ｕ／ｍｌの組み換えヒｌ−ＧＭ−Ｃ３Ｆ（ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＳＣａｍｂｒｉｄｇｅ　、　ＭＡ）が使 用され、ＣＦＵ−ＧＥＭＭとバースト形成ユニット−赤血球（ＢＦＵ−Ｅ）細胞 の両方によるコロニーの形成誘導の正の対照実験として２Ｕ／ｍｌの組み換えヒ トエリスロボイエチン（Ａａ＋ｇｅｎ　。

Ｔｈｏｕｓａｎｄ　０ａｋｓ　、　ＣＡ）　、０．　５ｍＭの２−メルカプトエ タノール及びヒト膀胱ガン細胞系５６３７　（ｆｅｌｔｅ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｐ ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳＡ　８２：１５２Ｂ、　１ ９８T） からの調整培地の組合せが使用されている。他のタイプの造血細胞によるコロニ ーの形成誘導の正の対照実験に使用される他のサイトカインの選択は、本発明が 属する分野の当業者には明白である。　組み換えヒトＧＲＯαの生物活性を試験 する上述の１１　ｖｉｔｒｏアッセイを使用して別々に行なった６つの実験の結 果を下記の表■に示した。試験した各濃度のＧＲＯ（１００ｎｇ／ｍ１．５０ｎ ｇ／ｍ１及び２５ｎｇ／ｍｌ）存在下で１４日間培養後に形成したコロニーの数 を、適切な正の対照実験サイトカイン（上述）存在下で同様の期間培養後に形成 したコロニーに対するパーセンテージで示している。これらの培養条件下で正の 対照実験においては、１０Ｂ骨髄細胞につき約１１００−２５０ＣＦＵ−Ｇコロ ニー、２４２４−６０ＧＥコロニー、４Ｏ−２００ＢＦＵ−Ｅコロニーが生じた 。負の対照実験の値は、各対応ＧＲＯ試験結果のすぐ下に示した。これらの実験 の結果、組み換えヒトＧＲＯは、骨髄細胞調製物中ＣＦＵ−ＧＭ細胞、ＣＦＵ− ＧＥＭ細胞、恐ら＜ＢＦＵ−Ｅ細胞のコロニー形成を刺激する能力を有すること が示され、その程度は、あるケースにおいては正の対照実験値を越えていた。

表■ ＧＲＯで処理した骨髄細胞によるコロニー形成コロニー数／１０６低密度骨髄細 胞を （＋）対照実験に対する％で示した ＣＦＵ−ＧＭ　ＣＦＵ−ＧＥＫＭ　ＢＦＵ−Ｅ表１ ＧＲＯで処理した骨髄細胞によるコロニー形成コロニー数／１０６低密度付髄細 胞を （＋）対照実験に対する％で示した ＣＦＵ−ＧＭ　ＣＦＵ＜淵　ＢＦＵ−８４１組 実施例４：付随細胞を除去した後の活性測定ＧＲＯが、増殖中の細胞に直接作用 することにより増殖を刺激するかどうか、または骨髄調製物中に存在する他の“ 付随的な”細胞による未同定のサイトカインの生成を誘導することにより増殖を 刺激するかどうかを決定するために、付随細胞を除去する実験を行なった。低密 度・け髄細胞を上記の通り調製し、その調製物をプラスチックシャーレに３時間 さらして（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）単球を凝集させることにより単球を除去した。次 いで凝集しなかった細胞をシャーレから回収、洗浄してその後の解析に供した。

ＮＫ　（ｎａｔｕｒａｌ　ｋｉｌｌｅｒ）及びＴリンパ球はＥｌ　ｌ　１ｏｔｔ とＰｒｏｓｓの方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　１０８： ４９−６４．１９８４　）に従い、Ｅ　Ｒｏｓｅｔｔｉｎｇにより行なった。表 Ｈの通り、このような除去処理を施した骨髄細胞に組み換えＧＲＯを作用させた 結果、単球及び／又はＮＫとＴ細胞が存在しない状態でもＧＲＯはＣＦＵ−ＧＭ 細胞の成熟刺激能力をほとんどもしくはまったく失っておらず、これは、ＧＲＯ がＣＦＵ−ＧＭ細胞の増殖に直接作用することを示唆している。これに対して、 ＧＲＯの、ＣＦＵ−ＧＥＭＭによるコロニー形成を刺激する能力はこのような付 随細胞の欠如により減少した。この結果は、ＧＲＯがＣＵＦ−ＧＥＭＭ細胞に対 して、少なくとも部分的には、他の細胞も関係する（恐らく副次的な細胞が別の 成長刺激サイトカインを生成するよう誘導することにより）間接的な経路で作用 することを示唆している。

表■ ＧＲＯで処理した、副次的な細胞除去後の骨髄細胞によるコロニー形成コロニー 数／１０Ｂ　（除去前）骨髄細胞を（＋）対照実験に対する％で示した ＣＦＵ−にＭ　ＣＦＵ−ＧＥＭＭ　ＢＦＵ−ＥＩＩＪ倒したＮＫ＋Ｔ 減１ｆｌｔ、たＮＫ＋Ｔ 表■ ＧＲＯで処理した、副次的な細胞除去後の骨髄細胞によるコロニー形成コロニー 数／１０６　（除去前）骨髄細胞を（＋）対照実験に対する％で示した ＣＦＵ−ＧＭ　ＣＦｔＪ−ＧＥＭＭ　ＢＦｔｌ−Ｅ減損したＩ′ｌｔ球ゴ仏土り 減慣したＱ１球ゴＶ土り 実施例５：走化性活性の定量 ｇｒｏ遺伝子が関連する遺伝子群のあるメンバーは、好中球に対して走化性があ る蛋白質をコードしている。組み換えＧＲＯもこのような細胞に対して走化性が あるかどうかを決定するために、以下の活性定量を行なった：　健常な志願者か ら末梢静脈血を採取し、＃キストラン沈降（Ｐｈａｒｍａｃｌａ、　Ｕｐｐｓａ ｌａ、　Ｓｗｅｄｅｎ）を行なった後、Ｗｌ　ｌ　Ｉ　ｊａｍｓら（Ｐｒｏｃ、 　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃ１．　ＵＳ＾７４：１２０４．１９７７）の方法 でＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｌｙｍｐｈｏ−ｐｒｅｐ、　Ｏｒｇａｎｏ ｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａ、　Ｄｕｒｈａａ、　ＮＣ）中で遠心分■ を行なった。多形核白血球（ＰＭＮｓ、好中球の一種）を含有する沈殿物を低張 性溶血（×２）に供した；　ｗｒｉｇｈｔ法により染色した標品を顕微鏡観察し たところ９５％以上のＰＮＭが含まれていた。単核細胞を含む軟膜を、０．ＯＩ Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，０）　、４．３ｍＭ　ＮａＨＣＯ３（ＨＢＳＳ）及 び２％ウシ血清アルブミン（ＨＢＳＳ−ＢＳＡ）を含有するＨａｎｋ’ｓ　ｂａ ｌａｎｃｅｄ　５ａｌｔ　５ｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｉｂｃｏ、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ ｌａｎｄ、　ＮＹ）を用いて２回洗浄した。非特異的エステラーゼ染色を行なっ たところ、単核細胞調製物は２５−３５％の単球を含有していた。走化性は、４ ８穴マイクロチヤンバ（Ｎｅｕｔｒｏｐｒｏｂｅ、　Ｉｎｃ、、　Ｃａｂｉｎ　 Ｊｏｈｎ、　ＭＤ　）を用いて定量した（Ｈａｒｙａｔｈ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　ｌｍ５ｕｎｏ１．　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３７：３９．１９８０；　Ｆａｌｋ　 ｅｔ　ａ戟B Ｊ、　ＩｍＩＩｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　３３：２３９．１９８０　）　、 　ＨＢＳ　Ｓ　（ｐＨ７，２）に懸濁したＰＭＮ　（０，０５ｍ１．１×１０６ ／ｍｌ）をマイクロチャンバの上部ウェルに入れた。ＨＢＳＳのみ、又はＧＲＯ 若しくは他の走化性刺激物（０，０３ｍ１）を含有するＨＢＳＳを各下部チャン バに入れ、孔径３．０μｍポリビニルピロリジン（ＰＶＰ）非含有ポリカーボネ ートフィルター（２５ｍｍＸ８０ｍｍ）により細胞から隔離した。湿気を含む空 気中で３７℃で６０分間保温後、移動しなかった細胞をフィルター上部から除去 し、計測し、移動した細胞については白血球特異的染色（Ｌｅｕｋｏ　５ｔａｔ 、　Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、　Ｏｒａｎｇｅｂｅｒｇ、ＮＹ）を 行なった。ＰＭＮの走化性は、フィルターを完全に通過した細胞数の平均値／フ ィールド（１０個の油浸フィールド（Ｘ１００Ｏ）中で計測）により定量した。

活性定量は３連で行ない、平均細胞個数／フィールド±Ｓ、　Ｄ、で表した。図 ４に示すとおり、組み換えヒトＧＲＯは移動ＰＭＮ数を、ＨＢＳＳのみの場合と 比較して約２．８倍に増加させた。ＧＲＯは、濃度０．０５ｎＭ〜５．ＯｎＭの 範囲でＰＭＨの移動を顕著に促進した。Ｇ　ＲＯｉｌｋ度が０．　７±０．２ｎ Ｍの時、好中球の最大走化性活性が得られ、最大移動値（ＥＣ５ｏ）の５０％の 値を示す前動濃度は０．０７±０．０５ｎＭであった。ＧＲＯに反応して移動す る細胞の総数は、１００ｎＭｒ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕｌｏｏｎ　（既知の化学誘引剤 ）に応答する細胞数の５３％〜８３％であった。単球についても、細胞をＨＢＳ Ｓ−ＢＳＡ　（ｐＨ７，０）中１．５Ｘ１０６単球／ｍｌに懸濁し；５．０μｍ ＰＶＰ−被膜ポリカーボネートフィルターを使用し、湿気を含む空気中で３７℃ で、９０分間保温する以外は同様の方法て走化性を定量した。ヒトＰＭＮとは異 なり、ヒト単球は０．０１．ｎＭ〜１０ｎＭの範囲のＧＲＯ濃度では走化性を示 さない（データ省略）。

これらの結果はＮＡＰ−１及びＮＡＰ−１／ＩＬ−８が示す結果と一致し、ＧＲ Ｏの急性炎症における役割を示唆している。

用途 ＧＲＯの成熟促進能力は、多様な疾病及び条件下において有効である。例えばＧ ＲＯは、骨髄毒性の化学療法期間中造血細胞の再生を促進するのに使用すること ができ、これにより化学療法剤の使用量を増加することができる。また、この蛋 白質は、自己由来、同種異系、もしくは異種の骨髄移植の間もしくはその後移植 を促進するためにも使用できる。さらに、適当な造血前駆体細胞の成熟を促進す ることにより好中球減少症及び血小板減少症として分類されるいくつかの遺伝病 の治療にも使用が可能である。連続的に少量投与する治療法により、患者の永続 的な好中球及び血小板のレベルを上昇させることができる。後天性免疫不全症候 群（ＡＩＤＳ）患者に対するアジドチミジン（ＡＺＴ）処置は重度の好中球減少 症及び貧血を誘発することがあるが、これもＧＲＯ療法により治療することがで きる。このようにＧＲＯは、先天性のもの、または治療により誘発されたものに 関わらず造血細胞欠損症の治療に幅広く有効である。

ＧＲＯ療法は、静脈ポーラスや注入などにより患者の全身にＧＲＯ（例えば体ｆ ｉ［１ｋｇあたり１日１−１００μｇ）を作用させることにより行なうことがで きる。この時ＧＲＯは調剤上有効な担体中に含まれるか、または他の有効な手段 （例えば、経口投与しても活性を失わないＧＲＯアナログの形で経口投与する、 治療されるべきＩｎ　ｖｌｖｏの骨髄部位にＧＲＯを直接注射するなど）により 投与される。その他の方法としては、患者の骨髄（もしくはドナーの骨髄）調製 物をｅｘｖｌｖｏでＧＲＯにより処理し、造血細胞が生じるまで一定期間培養し た後、患者の体内に移植することもできる。

他の実施例は以下の請求項に含まれる。

請求の範囲は以下の通りである： ＦＩＧ、　１ ｙｕ；−２（Ａ） Ｌｏｇ（化学誘引剤）　（ｎＭ） 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／１２ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　Ｋ　８２１４−４Ｂ／／　Ａ　６１　Ｋ　３７１０２　 ８３１４−４Ｃ３７／２４　ＡＢＹ　８３１４−４Ｃ ＣＯ７Ｋ　１３１００　８６１９−４Ｈ（Ｃ１２Ｎ　１／１９ Ｃ１２Ｒ１：８６５） （Ｃ１２Ｎ　Ｓ／１０ Ｃ１２Ｒ１：９１） ８９３１−４Ｂ （７２）発明者　トラスフ　ダグラス　ケーアメリカ合衆国　フロリダ州　マイ アミブリッケル　アベニュー　１５５０　アット３１１ニー Ｉ Ｃ１２Ｎ　１５１００　Ａ （７２）発明者　し　フオング アメリカ合衆国　ノースカロライナ州　ダーハム　コークマンス　ウェイ　３３ １５

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．ＧＲＯを提供し、成熟を促進する量の前記ＧＲＯを造血前駆体細胞に接触さ れることを含む動物の造血前駆体細胞の成熟を促進する方法。
2. ２．前記細胞への前記ＧＲＯの接触に先立ち、前記動物から前記細胞を除去する ことを特徴とする請求の範囲１に記載の方法。
3. ３．前記細胞への前記ＧＲＯの接触後、前記細胞が前記動物に再導入されること を特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
4. ４．前記細胞への前記ＧＲＯの接触後、前記細胞由来の細胞が前記動物に導入さ れることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
5. ５．前記細胞への前記ＧＲＯの接触後、前記細胞が第二の動物に導入されること を特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
6. ６．前記細胞への前記ＧＲＯの接触後、前記細胞由来の細胞が第二の動物に導入 されることを特徴とする請求の範囲２に記載の方法。
7. ７．第二の動物がヒトであることを特徴とする請求の範囲５もしくは請求の範囲 ６に記載の方法。
8. ８．ＧＲＯを提供し、成熟を促進する量の前記ＧＲＯにより前記動物を処置する 過程を含む、動物体内における造血前駆体細胞の成熟促進方法。
9. ９．前記動物がヒトであることを特徴とする請求の範囲１、２、３、４、５、６ 、もしくは８のいずれかのーに記載の方法。
10. １０．前記ＧＲＯが成熟ヒトＧＲＯであることを特徴とする請求の範囲１もしく は請求の範囲８に記載の方法。
11. １１．前記ＧＲＯが組み換えＧＲＯであることを特徴とする請求の範囲１もしく は請求の範囲８に記載の方法。
12. １２．前記ＧＲＯが天然ＧＲＯのアナログもしくは断片であることを特徴とする 請求の範囲１もしくは請求の範囲８に記載の方法。
13. １３．前記細胞がＣＦＵ−ＧＥＭＭ細胞及びＣＦＵ−ＧＭ細胞であることを特徴 とする請求の範囲１もしくは請求の範囲８に記載の方法。
14. １４．ＧＲＯをコードする核酸分子の提供し、前記核酸分子を前記動物の細胞に 導入することによる（ａ）前記核酸から前記ＧＲＯを発現し、（ｂ）前記造血前 駆体細胞の成熟を促進するのに十分な量の前記ＧＲＯを分泌する形質転換細胞を 形成する過程を含む、動物細胞の体内における造血前駆体細胞の成熟を促進する 方法。
15. １５．ＧＲＯを分泌することが可能な第二の細胞を提供し、前記造血前駆体細胞 の前記成熟促進に十分な量のＧＲＯを前記動物体内で合成するために前記第二の 細胞を前記動物細胞に導入する過程を含む、動物細胞の体内における造血前駆体 細胞の成熟を促進する方法。