JPH06500462A - 細胞の分離、濃縮および分析方法およびキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ７５　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第７４項記載の透明化溶液。

７６、　体細胞溶解剤が、非イオン性活性剤である請求の範囲第７３項〜第７５ 項記載の透明化溶液。

７７　キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第７３項〜第 ７５項記載の透明化溶液５ ７８、　キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸である請求の範囲第７３項〜第７５ 項記載の透明化溶液。

７９　キレート化剤が、ビス−（０−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ、Ｎ。

Ｎ’　、Ｎ’−四＃酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテ ル）Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサ ン四酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイボザ ンチン、４．５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスｌレフオン酸、ナトリウ ムリン酸塩ガラス、クラウンエーテルタイプ化合物および誘導体およびこれらの 前駆体からなる群から選ばれたものである請求の範囲第７３項〜第７５項記載の 透明化溶液。

ｓｏ、ｉ生物起源材料の培養物あるいは抽出物のアリコートおよび懸濁した微粒 担体の透明化溶液。

８１、　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズで ある請求の範囲第８０項記載の溶液。

８２、ＩＩ生物起源の材料が、ミルクあるいはミルク製品以外の食物材料である 請求の範囲第８０項〜第８１項記載の溶液。

８３、　微生物起源の材料が肉であり、透明化溶液が肉から調製された培養物の アリコートからなる請求の範囲第８２項記載の溶液。

８４、　下記工程からなる微生物起源材料の培養物あるいは抽出物のアリコート から細胞を分離濃縮する方法： （ａ）　上記アリコートを微粒担体の懸濁液と一緒にして透明化溶液を形成する 工程、 （ｂ）　透明化／Ｓ液を遠心分離して細胞ベレットを形成する工程。

８５、　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズで ある請求の範囲第８４項記載の方法。

８６、　微生物起源材料が、ミルクあるいはミルク製品以外の食物材料である請 求の範囲第８４項〜第８５項記載の方法。

８７、　微生物起源材料が、肉である請求の範囲第８６項記載の方法。

８８、　微生物起源材料の培養物あるいは抽出物中の予め選択された目標セグメ ントを含有する核酸を有することを特徴とする細胞の存在を検出する方法であっ て、該方法は、培養物あるいは抽出物のアリコートを微粒担体の水性懸濁液と一 緒にして透明化溶液を形成し、そして透明化溶液を遠心分離して細胞ベレットを 形成することにより培養物あるいは抽出物から細胞ベレットを得ることからなり 、ただし、微生物起源の材料が液状ミルク試料である場合には、該透明化溶液は さらにキレート化剤を含有し；第１の溶液で得られたペレットからの細胞を懸濁 し、第１の溶液を処理して細胞の他の成分から細胞の核酸を実質的に単離するこ となく細胞からの核酸増幅工程２の溶液を得；予め選択された目標セグメントが ベレットから懸濁された細胞中に存在する場合にのみ第２の溶液の核酸を核酸増 幅工程にかけて所定の増幅された核酸セグメントを得：そして増幅工程後に所定 の増幅されたセグメントの存在のために核酸を検定する上記方法。

８９、　微生物起源材料がミルクであり、そして該材料の培養物が液状ミルク試 料である請求の範囲第８８項記載の方法。

９０、　キレート化剤が、ＥＤＴＡおよびニトリロトリ酢酸からなる群から選ば れたものである請求の範囲第８９項記載の方法。

９１、　微生物起源材料が、ミルク以外の食物材料である請求の範囲第８８項記 載の方法。

９２、　食物材料が、肉である請求の範囲第９１項記載の方法。

９３、　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍである請求の範囲第８８項 〜第９２項記載の方法。

９４、　増幅工程が、ＰＣＲ方法である請求の範囲第８８項〜第９２項記載の方 法。

９５、　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍである請求の範囲第９４項 記載の方法。

９６、ＰＣＲ増幅工程におけるＤＮＡ合成を触媒する酵素が、工立旦ＤＮＡポリ メラーゼである請求の範囲第９４項または第９５項記載の方法。

９７、　検出される細胞が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｐｐである請求の範囲第 ９４項〜第９６項記載の方法。

９８、　微生物起源材料の培養物または抽出物中に、予め選択された目標セグメ ントを含有する核酸を有することを特徴とする細胞の検出用キットであって、微 粒担体および、微生物起源材料の培養物が液状ミルク試料である場合には、キレ ート化剤と、；予め選択された目標セグメントが該培養物または抽出物の細胞中 に存在する場合にのみ所定の、増幅された核酸セグメントを提供する核酸増幅工 程に必要な酵素およびプライマまたはプローブと、；および増幅工程後に該所定 の、増幅されたセグメントのための核酸検定に必要な試薬とからなる上記キット ９９、　液状ミルク試料中の細胞検出用である請求の範囲第９８項記載のキット １００、　キレート化剤が、ＥＤＴＡおよびニトリロトリ酢酸からなる群から選 ばれたものである請求の範囲第９９項記載のキット。

１０１、　ミルク以外の食物材料の培養物または抽出物中の細胞検出用である請 求の範囲第９８項記載のキット。

１０２、　食物材料が、肉である請求の範囲１０１項記載のキット。

１０３、　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍのポリスチレンビーズで ある請求の範囲第９８項〜第１０２項記載のキット。

１０４、　実施される増幅工程が、ＰＣＲ方法である請求の範囲第９８項〜第１ ０２項記載のキット。

１０５、　微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍのポリスチレンビーズで ある請求の範囲第１０４項記載のキット。

１０６、ＰＣＲ増幅工程においてＤＮＡ合成を触媒する酵素が、ＬＪＡＤＮＡポ リメラーゼである請求の範囲第１０４項または第１０５項記載のキット。

１０７、　検出される細胞が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｐｐである請求の範囲 第１０４項〜第１０６項記載のキット。

明細書 細胞の分離、濃縮および分析方法およびキット技術分野 本発明は、一般に生ミルク、殺菌ミルクまたは液状に戻された粉末ミルクのよう なミルク試料中の、または肉のような他のタイプの食物からの微生物培養、また はストール（ｓｔｏｏｌ）あるいは血液のような他の試料またはその他の試料に 由来する微生物の培養中の非細胞成分から細胞を分離、濃縮し、ついで分離され た細胞について望ましくない微生物の存在を分析する方法に関する。

背景技術 ミルク試料中の細胞を計数あるいは定量する方法は、２つのカテゴリーのいずれ かに属する。第一のカテゴリーでは、生ミルク中の牛の体細胞を種々の方法で計 数して牛乳脳炎、感染された動物におけるミルク生産の品質、量を制限する望ま しくない状態にあるかもしれないミルク生産動物を識別する。乳腺炎の試験方法 は、細胞のアデノシントリリン酸塩（ＡＴＰ）を放出する活性剤のような試薬で の細胞溶解を伴う自動機器を使用した直接の細胞計数および蛍光体細胞ＡＴＰ検 定を含む１元々試料中に存在する体細胞の数は、放出されたＡＴＰの測定により 算定される。

第二のカテゴリーでは、真菌（［ｕｎｇｉ）およびバクテリアのような通常単細 胞微生物の細胞（以下ひとまとめにして微生物細胞という）を、稚々の計数方法 を用いてミルク試料中で計数する。これらの方法は、−ｉにミルク品質の評価に おいて、特におおざっばに、汚染ミルク試料をふるいにかけるために使用される 。

微生物検出に使用される方法で、Ｂｒｅｅｄ　Ｓｍｅａｒ　（Ｂｒｅｅｄ、Ｒ， Ｓ、、　ｄ江、１１工」１江。

Ａｂｒ、３０：３３７．１９１１）は一般に最も早い方法である。この技術では 、ミルク試料をスライド上に塗りつけ、乾燥し、染色し、そして諷微鏡検査でバ クテリアを計数する。この方法の欠点は、生存可能な生物体と非生存可能な生物 体との両者を計数し、そしてミルク試料に含まれる生物体の数が１０’生物体／ 　ｃ　ｃよりも少ないときには、統計的に有効な結果を得るために顕微鏡で多く の視野を計数しなけれならないということである。詔微鏡評価は退屈で操作者に 疲労をもならす。

最も広く使用されているミルク微生物の検出方法は、成育培地中あるいは上に塗 布した後直接コロニーを計数する標準プレート法である。標準法（Ｓｔａｎｄａ ｒｄ　Ｍｅｔ　ｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｅｘａｍｉ　ａｔｉｏ　ｏ　Ｄａ’ｒ　 Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、１５ｔｈ　Ｅｄ、、１９８５、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｇ 、Ｈ，、Ｅｄ、、＾ａｅｒｉｃａｎ　Ｐｕｂｌｉｃ　［１ｅａｌｔｈ　Ｏｒｇ、 　ｌｌａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，）は、ミ泣N試 料用に発展し、多くの実験者が手動あるいは自動塗布方法のいずれかを用いてミ ルク試料を評価している。これらの方法は世界的に利用されているが、使用上あ る程度の不利益がある。第一に、手動塗布法では、統計的に有意なプレート数を 得るためには、２個あるいはそれ以上のミルク試料の希釈液を塗布しなければな らない、第二に、手動あるいは自動塗布法でもプレートは、通常昇温下（米国で は３５℃、日本では３２℃）で殺菌される。そしてこれらの温度では好低温性生 物体の成長は抑制され、人工的に低いプレート計数値を生ずる。最後に、約４８ 時開という培養時間がバクテリアプレートの計数前に必要であり、真菌ではより 長いブレーティング時間が必要である。この殺菌期間中、試料を採取するバルク ミルク中のバクテリア数は増加するので、試験後のミルク中におけるコロニーを 形成する生物体の実際の数を過小評価することとなる。この培養期間を含む生ミ ルク処理の遅れは、生ミルクの品質を低下させ、かつ最終製品の商品寿命を短く することとなる。

プレートあるいはコロニー計数法は、手動でも自動でも実施できる１手動方法は プレートｌレープ法（丁ｂｏｍｐｓｏｎ、Ｄ、１．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　Ｍｉ ｌｋ　ａｎｄ　Ｆｏｏｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ　３０、ｐ、２７３．１９６７）お よび標準プレート計数（同上）を含む。

半自動あるいは自動コロニー計数方法は、スパイラルプレート法（Ｇｉ　Ｉｃｈ ｒｉｓｔ、Ｊ、Ｅ、　鼓紅、Ｌ肛ム２５、ｐ、　２１．１９７５＞および電子コ ロニー計数器により実施される方法（Ｆｌｅｅｉｎｇ、Ｍ、Ｇ、辷−」」注し」 」１１４、ｐ、　２１．１９７５）を含む、直接エビーフルオレッセント技術（ Ｅｐｉ−Ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、ＤＥＦＴ）は蛍光ラベ リング技術であり、手動あるいは自動器具で実施することができる。他の技術と しては、ミルク生物体の成長後のインピーダンス測定および放射性グルコースを 使用した放射分析法がある。

微生物評価のための他の方法としては、蛍光ルシフェラーゼ（商品名Ｌｕｍａｃ 　ｂｙ、　Ｔｈｅ　ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用したミルク中の生細胞から のＡＴＰの蛍光測定法がある。この方法では、生ミルク中のウシの体細胞を活性 剤で溶解し、体細胞のＡＴＰを放出させる。ウシ細胞からのＡＴＰ、および他の 非微生物ミルクＡＴＰをＡＴＰアーゼ、通常ポテトアビラーゼで分解する。最終 的には、バクテリア溶解剤を添加し、そして蛍ルシフェラーゼを用いた蛍光検定 法によりバクテリアＡＴＰを測定する０文献にこれらの方法に関する多くのデー タが累積されているが、ミルクおよび抽出用溶剤のルシフェラーゼ反応に対する 妨害、非バクテリアＡＴＰ除去の不完全、バクテリア細胞溶解前および溶解後に おけるバクテリアＡＴＰ検出に間するアビラーゼの有害な作用（Ｔｈｅｒｏｎ、 　Ｄ、Ｎ、、ムム匝」ユム４９：４−７．１９８６）、細胞ＡＴＰの非能率的な 抽出により、日常のミルク試験には感度が不十分である。このタイプの検定に対 する文献データ（ｊｌｅｂｓｔｅｒ、Ｊ、＾、Ｊ、、　Ｈａｌｌ、１４．Ｓ、　 。

Ｒｉｃｈ、　Ｃ，Ｎ、　Ｇ１１ｌｉｌｉａｒ、　Ｓ、Ｅ、、　Ｆｏｒ、　Ｓ、Ｒ ，、Ｌｅａｃｈ、　Ｆ、Ｒ，、Ｊ、Ｆｏｏｄ　Ｐｒｏｄ、　T１：　９４９ −９５４．１９８８）は、細胞感度的Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ミリリツトルを示唆 しており、この検定はグレードＡの生ミルクに対する受容限度がＩ　Ｘ　１０’ である米国で利用できない。

この方法の論理的な改良は、ＡＴＰ検定の前にミルクバクテリアを濃縮すること である。細胞濾過濃縮（Ｐｅｔｅｒｋｉｎ、　Ｐ、！、、　５ｈａｒｐｅ、＾、 Ｎ、、Ａ　ｖｉｒ　Ｈｉｅ匹垣旦り、　３９：　１１３８−１１４３．１９８０ ）を利用した種々の技術が文献で紹介されているが、これらの技術は非常に煩わ しく、遅く、そして上述した技術上の問題の多くを有している。

一方、上記した技術の全てはある程度の成功を示してはいるが、いずれの技術も 安価、簡便、正確および感度の点で、日常の試験に満足して使用できる試験のタ イプをミルク工業に提供するものではない。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｓｐｐ、に共通に存在する抗原に対する抗体を適用する ｉｓｍｕｎｏａｓｓａｙ技術、およびサルモネラＤＮＡに対するＤＮＡ１０−ブ と適用する核酸プローブハイブリッド形成技術を使用したサルモネラ汚染に対す る食物（ミルクおよび肉を含む）試料から成長させたバクテリア培養物の諸検定 方法が利用できる。しかしながらこれらの方法では、サルモネラ検定の実施前に 、分析される食物材料がらのバクテリア培養物の煩鎖でかつ時間のががる成長が 必要である。

公知のポリメラーゼチェインリアクション（ＰＣＲ）技術のような核酸増幅技ｆ すを採用し、微生物汚染の特徴である核酸セグメントの濃度を核酸プローブハイ ブリッド形成法あるいは核酸染色法により容易に検出できるようなレベルに増加 させるならば、ミル入内（例えば鶏肉、七面鳥肉、牛肉、豚肉、馬肉、羊肉、鯨 肉等）、卵、魚、マツセル（−ｕｓｓｅｌ）、軟体動物（＋＋ｏｌ　Ｉｕｓｃｓ ）、甲殻類、野菜、果物、＠類等の食物材料の、望ましくない微生物による汚染 を検出するために、核酸プローブハイブリッド形成技術の適用前の培養の必要を 無くし、あるいは培養時間を著しく減少できる。しかし、増幅方法の適用前に、 標本からの微生物を蛋白質分解酵素、ガニジニウム塩の高濃縮、および活性剤、 あるいは沸騰のような煩鎖な、責用のかかるさもなければ望ましくない処理にか けることがないならば、また微生物からのＤＮＡをエタノール−沈澱あるいはフ ェノール／クロロフォルム抽出と共にあるいは無しにクロマトグラフィーによる 分離のような同じように望ましくない方法で処理することが無いならば、目標核 酸の増幅技術は、食物材料、あるいは血液、尿あるいは便のような微生物起源の 他の材料の標本の培養物あるいは抽出物に関しては、上記目的に対し十分に適用 できるものではない、これらの処理は、増幅させるためには、汚染物がら核酸を 分離するために必要であると考えられてきた。汚染物は増幅に必要な酵素反応を 阻害し、また汚染物は微生物それ自体によって提供され、あるいは標本から分離 された微生物に提供されるものである。（参照、例えばＨｉｌｌ　ｅｔ　ａｌ、 、ム社−カムｒｏｎ、＋山餌止泣Ｌ５７：　７０７−７１１（１９９１）；　Ｋ ｅａｓｌｅｒ　ａｎｄ　１ｌｉｌｌ、＾ｂｓ　ａｃｔ　ｏｆ　ｔｈｅ　９１ｓｔ 　Ｇｅ　ｅｒａｌ@Ｍｅｅｔｉ ｏｒ　ｔｈｅ　＾−ｅｒｉ　ａ　５ｏｃｉｅｔ　ｆｏｒ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏｌｏ 　、＾ｂｓＬｒａｃｔ　Ｎｏ、ｐ−１２，ｐ、２６９（１９９１）；　０１ｉｖ ｅ、Ｌ匹ｉｎ、　Ｍｉｃ　ｏｂ’ｏ　２７：　２６１−２６５（１９８９）。

発明の要約 本発明は、簡便かつ信頼できる方法で実施できる液状ミルク試料がらの哺乳類あ るいは微生物細胞の濃縮方法を提供する０本発明は、生ミルク、殺菌ミルク、液 体状に戻された乾燥ミルク、クリーム、アイスクリームおよび他のミルク製品お よび誘導体を含む種々のタイプの液状ミルク製品の分析に使用できる。

本発明の方法は、通常“透明化剤”　（ｃｌｅａｒｉｎｇ　ａｇｅｎｔ）と称さ れる溶液に入れたく溶解させた）キレート化剤をミルク試料に添加し、ついでキ レート化剤と結合した試料を短時間遠心分離するような方法で他のミルク成分か ら細胞成分を分離し、そして分離された細胞成分から非細胞成分を分離しあるい はデカントすることからなる。好ましい分離方法においては、沈降が細胞よりも やや遅い小さなポリスチレンビーズのような極微粒担体を遠心分離中試料に加え る遠心分離を包含する。動物細胞を溶解するが目標とする微生物細胞を溶解しな い活性剤のような薬剤を添加してもよい。

分離して得られた細胞ベレット成分は、ミルク成分の汚染に起因する妨害からフ リーである分析のような種々の分析に適用できる。細胞ベレットは、体細胞（即 ちミルクの発生源である動物からの動物細胞）および微生物細胞を含み、それぞ れの相対濃度を顕微鏡で調べて決定することができる０体細胞と、活性剤のよう な溶解剤をキレート化剤の透明化溶液を加えた試料に、体細胞のみを溶解する薬 剤と共に試料に加えることにより、分離することができる。遠心分離後に残存す るベレットは、殆どもっばら微生物細胞を含有し、これを種々の方法で分析でき る。この分析は、微生物の溶解のようなＡＴＰ抽出後のＡＴＰ濃度の分析を含む 、透明化剤３添加したミルク試料中で他のミルク成分からの細胞成分の分離にｒ 通もまた利用できる。

ウシの体細胞のような動物細胞の存在は、迅速かつ簡便な方法で決定できる。

本発明はさらに、バクテリア、イーストおよびカビ、およびバクテリア、イース トおよびカビからの胞子のような種々の微生物によるミルク試料の汚染の分析に も適している。

本発明は、染料あるいは染色による詔ｇ＆鏡検査、色素産生バクテリア（ｃｈｒ ｏｍ。

Ｆｌｅｎｉｅ）、蛍光、化学ルミネセンスあるいは他の検出できる報告分子（ｒ ｅｐｏｒｔｅｒ健ｏ１ｅｃｕｌｅ）を含む種々のタイプの分析へのミルクから分 離された濃縮細胞材料の利用にも関する０本発明は、ブレーティング用、微生物 のブロードスペクトルあるいは特殊なブレーティング用、あるいは通常利用され るミルク試験法用試料の調製用への濃縮細胞材料の使用にも関する。

ビートルルシフェラーゼＡＴＰ定量法（ＤｅＬｕｃａ、　Ｍ、＾、、＾ｄｖａｎ ｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ。

ｇｙ、　Ｍｅｉｓｔｅｒ、＾、、　Ｅｄｉｔｏｒ、　４４．３７−６８．１９７ ６）は、元の液状ミルク試料中の細胞数の定量化に利用できる。このＡＴＰ定量 法は、動物細胞あるいは微生物細胞数の定量化にも適用できる１分離された細胞 材料は、液状ミルク試料中の特殊な生物体のタイプを定量しあるいは同定する酵 素的、免疫的２分子生物的試験方法のいずれのタイプにも利用できる。これらの 方法には、目標核酸のＰＣＲあるいは他の技術による増幅に続いておこなわれる 検定をはじめとして、を含む核酸プローブハイブリッド形成検定が含まれる。

本発明の方法は、メンプレイン、中空繊維あるいは遠心分離タイプフィルターの ような種々のタイプの濾過マトリックスにおけるＰ通あるいは遠心分離用の種々 の試料の前処理法としても使用できる。

一方、ミルク試料からの細胞分離において、キレート剤、活性剤（溶解剤）、お よび微粒担体はそれぞれ重要な、独立の利益を有し、他の食物試料の場合には微 粒担体と遠心分離あるいは濾過のいずれかの結合で十分である。

驚くべきことに、ミルク試料からの微生物細胞、あるいは他の食物材料の試料、 あるいは血液、尿および便のような生体起源の非食物材料がら調製された培養物 あるいは抽出物からの微生物細胞は、キレート化剤、微粒担体／透明化溶液（ミ ルクの場合）あるいは微粒担体／透明化溶液（他の材料の場合）および本発明に 従った分離法を使用した非細胞成分からの分離後には、分離された細胞それ自体 に存在するもの以外には目標核酸の増幅に必要な酵素反応を阻害する汚染物が存 在しない、従って分離された細胞は他の細胞成分がら核酸を単離する必要なしに 直接使用することができ、増幅用核酸を提供するという利益がある。細胞は単に 核酸を放出するように処１１（昇温下に短時間保持すること）される必要がある だけであり、そして酵素あるいは増幅された核酸を分解する他の成分あるいは適 用される増幅方法に必要とされる酵素反応を阻害する他の成分を変性する。増幅 法が、昇温下で非可逆的に不活性化される酵素に依存する場合には、細胞を温度 に敏感な酵素以外の増幅に必要な試薬の溶液中に直接加え、溶液を昇温下に保持 し、ついで冷却し、そして該酵素を増幅を始めるべく添加することができる（目 標核酸が存在すると仮定して）、好ましい方法は、熱的に安定な酵素のみを増幅 で使用することである（好ましくはＰＣＲ）、ついで分離された細胞を増幅に必 要な酵素を含む全ての試薬と共に溶液中に添加し、そして溶液を昇温させく増幅 用酵素が活性を保持するに十分低い温度に）、ついで温度が諸プライマーが混成 し鋳型となるべく十分低下したときに増幅が開始する。検出すべき微生物からの 目標核酸セグメントが存在するならば、増幅工程で増幅する。増幅工程で得られ た核酸は、ついで例えば核酸プローブハイブリッド形成検定方法を用いて、目標 核酸セグメントを検定する。

本発明は、特定の目標核酸セグメントを有することを特徴とする予め選択された 微生物によるミルク製品、他の食物材料、および動物の血液、尿あるいは便のよ うな微生物起源の他の材料の汚染の試験方法において、本発明の細胞分離方法（ ときに細胞洗浄法ともいう）を使用して、ミルクあるいは生体起源の他の材料、 あるいは該材料で調製された培養物から微生物細胞を分離し；分離された細胞を 溶液中に懸濁させそして該溶液を処理して細胞の他の成分から細胞の核酸を実質 的に単離することなく増幅用に細胞からの核酸を提供し、得られた溶液の核酸を 核酸増幅工程にかけ、これによりもし存在するなら、目標核酸セグメント、を増 幅しあるいは目標核酸セグメントにより他の所定のセグメントを増幅させ、そし て増幅工程後に増幅されたセグメントの存在をみるために核酸を検定することを 特徴とする上記方法である。細胞洗浄法で産生されたベレットの細胞は、増幅用 核酸を提供する処理に供する溶液中に懸濁する前に単に洗浄してもよい、好まし くは、本方法の最終ステップである検定は、核酸プローブハイブリ・ｙド形成検 定である。これは当業者が容易に理解するように、増幅された目標セグメントに あわせてハイブリッド形成できるプローブ（好ましくはオリゴヌクレオチドであ り検出用にラベルされている）を使用する。当業者が理解するように、本方法を 適当な標準と共に実施することにより、本方法は、テスト用材料中の予め選択さ れた汚染する微生物の存在（本方法の感度以上のレベルで存在するならば）検出 に使用されるばかりではなく、このような微生物による材料の汚染の程度を定量 化するのにも使用される。細胞から核酸を放出しそして細胞からの増幅阻害物質 を変性しあるい不活性化するのに使用できる、ミルクからの細胞、食物資源とし て使用される肉、卵あるいは水性種（ａｑｕａｔｉｃ　５ｐｅｃｉｅｓ）から調 製された培養物の試料分析用温度は、約７０℃以上、より好ましくは約９０℃以 上である。

好ましい増幅方法においては、試薬（例えば酵素）の入った溶液のアリコートを 増幅過程で加える必要がない、特に好ましい増幅方法は、高温度で生存するｎｅ ｒｍｕｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓのようなバクテリアからの熱的に安定なりＮＡポ リメラーゼを使用するＰＣＲ法である。特に好ましい方法では、熱サイクルは生 ずるが、サイクル中高温には達するにも拘わらず熱的に安定なポリメラーゼは十 分活性を保持し、増幅過程中酵素を補給する必要がない。

本発明はまた、本発明の方法を実施するのに使用される新規なキットを包含する 。このキットは透明化溶液を含み、ミルク試料用キットの場合には少なくともキ レート化剤および必要に応じ微粒担体あるいは体細胞溶解剤を含み、そして生体 起源の他の材料の場合には、少なくとも微粒担体を含む、キットは、細胞ベレッ ト洗浄用およびＡＴＰ検出用溶液、微生物細胞ＡＴＰ抽出剤あるいは溶解剤、緩 衝溶液およびルシフェラーゼ−ルシフェリンのようなＡＴＰ検出試薬を含んでも よい、キットはまたＢｒｅｅｄ　Ｓｍｅａｒ試験あるいは直接微生物を試験する 方法の他のタイプ用試料を調製するための成分を含んでもよい０本発明のキット は、酵素、Ｍｔａ液および核酸増幅用の他の試薬あるいは核酸プローブハイブリ ッド形成検定におけるまたは染色による核酸検出用の他の試薬を含んでもよい。

本発明のさらなる目的、特徴および利益は、添付図面と下記詳細な説明とから明 らかになるであろう。

図面の簡単な説明 図１は、液状ミルク試料を使用する本発明の一般的方法のステップを説明する図 ２は、実施例１の試料中の微生物濃度に対して本発明の方法および他の方法に従 って分析された試料の相対釣元単位（ＲＬＵ）を示すグラフである。

区３は、実施例２に記載されたミルクからの微生物細胞の分離に対するコロニー 形成単位（ＣＦＵ）とＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。

図４は、実施例３に記載されたミルクからの微生物細胞の分離に対するＣＦＵと ＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。

図５は、実施例４に記載されたミルクからの微生物細胞の分離に対するＣＦＵと ＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。

図６は、実施例５に記載されたミルクからの微生物細胞の分離に対するＣＦＵと ＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。

図７は、実施例６に記載されたミルクからの微生物細胞の分離に対するＣＦＵと ＲＬＵとの相間関係を示すグラフである。

発明の詳細な説明 一般に、本発明は液状ミルク試料あるいは池の食物材料から調製された培養物あ るいは血液あるいは便のような生体起源の他の材料からの細胞材料の分離および 濃縮方法に関する。キレート化剤、必要に応じポリスチレンビーズのような微粒 担体あるいは活性剤のような動！Ｉｖ細胞溶解剤を含む透明化剤をミルク試料に 加えて培養物あるいはミルク試料から細胞を除去し、そして細胞を遠心分離し、 細胞ベレットから非細胞上層液を吸引あるいはデカントすることにより非細胞成 分から細胞成分を分離する。ベレット中の細胞を、例えばミルクあるいは他の材 料の微生物汚染の分析に供することができる。

本発明は、生体起源材料の培養物あるいは抽出物中の予め選択された目標セグメ ントからなる核酸を有することを特徴とする細胞検出方法をも包含する。この方 法は培養物あるいは抽出物のアリコートを微粒担体の水性懸濁液と化合（ｃｏｍ ｂｉｏｓ）させて透明化溶液を形成し、そして透明化溶液を遠心分離して細胞ベ レットを形成させて、培養物あるいは抽出物から細胞ベレットを得、ただし生体 起源材料の培養物が液状ミルク試料である場合には、透明化溶液はさらにキレー ト化剤を包含する；最初の溶液で得られたベレットからの細胞を懸濁し、そして 最初の溶液を処理して細胞の核酸を細胞の他の成分から実質的に単離することな しに増幅用細胞から核酸の第２の溶液を準備し；第２の溶液を核酸増幅工程にか けて、該ベレットから懸濁された該細胞に予め選択された目標セグメントが存在 する場合にのみ所定の増幅された核酸セグメントを準備し；そして増幅工程後に 該所定の増幅されたセグメントの存在に対する核酸検定を実施することからなる ６本発明は、本発明の方法を実施するためのキットをも提供する。

本発明の方法は、好ましくは液状ミルク試料で実施される。

」 “バクテリア”という用語は、単細胞の原核生物と含む、用語“バクテリア“を 用語“微生物“および“微生物細胞“に入れ換えることもまた本発明の範囲内で ある。

“真核細胞”という用語は、遺伝材料が核により包含される生体を表示する。

“液状ミルク試料”という用語は、生ミルク、超高温殺菌ミルク、低温長時間殺 菌ミルク、戻された粉末ミルク、クリーム、スキムミルク、液化アイスクリーム あるいはアイスミルクあるいは関連製品、およびミルクの懸濁液あるいは液状試 料である酪農製品を含む酪農生材料あるいは製品起源の全ての液状溶液を含むこ とＰ意味する。一方ウシのミルクは本発明の適用に好ましい材料であるが、本発 明はいかなる晴乳想からのミルクにも同じように適用できる。

“キレータ−”あるいは“キレート化剤”という用語は、カルシウムイオンと結 合しあるいは化合し、そしてマグネシウムイオン、鉄イオン、亜鉛イオン、カド ミウムイオン、ベリリウムイオン、コバルトイオン、ニッケルイオン、銅イオン 、鉛イオンおよび他の金属イオンのような他の二価金属イオンと結合してもよい 全ての分子あるいは巨大分子を含むことを意味する。′キレーター”あるいは“ キレート化剤”という用語は、上記イオンに結合することが知られている全ての 合成および天然有機化合物を含み、そして上記イオンに結合する生体起源の分子 、あるいは蛋白質、糖あるいは炭水化物、リビドおよび核酸、それらの組合わせ のような生体起源分子の副生品あるいは変性品を含むことを意味する。“キレー タ−“あるいは“キレート化剤”という用語は、カルシウムと結合し、そしてよ り少ない程度でマグネシウムおよび多分上記イオンの１つ以上と結合する天然産 あるいは合成起源のいかなる固体材料をも含有する。

本発明で利用される種々の方法は、当業者に知られたものであるが、本発明に従 うこれらの方法の組合わせは予測されたものではない０本発明の全体的な検定技 術の一部を担う従来知られた一般的な方法は、乳製品からの微生物の標準ブレー ティング技術、微生物用染色および同定方法、バクテリア抽出方法、他の方法に おける分離、濃ａ細胞材料の使用、および一般的キレート化学を含有する。

上記技術の一つあるいはそれ以上の論考は下記の文献に記載され、これらは本発 明の記載として引用する＋ＳａｄａｄＭ　ｄ　ｏ　ｔ　ａｍ’ａ’　ａ’ｏｄｕ ｃｔｓ、１５ｔｈ　Ｅｄ、、１９８５．　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、（、、Ｈ，、 Ｅｄ、；　＾−ｅｒｉｃａｎ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａ撃狽■@Ａｓ ５ｏｃ、、　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、　Ｄ、Ｃ，、；　Ｂａｃｔｅｒｉｏ　ｏ　 １ｃａｌ　Ａｎａｌ　ｔｉｃａｌ　Ｈａ　ｕａ　、　６ｔｈA、　ＵＳＤＡ。

１９８４、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ　Ｉｎｃ、、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：　Ｓａ ｍｂｒｏｋ　Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、ａｎｄ　Ｍ≠獅奄■ ｔｉｓ、　Ｔ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｏｎ’ｎ　、　２ｎｄ　Ｅｄ、、　Ｆ ｅｒｇｕｓｏｎ、　Ｍ、、Ｅｄ、、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎ■@Ｈａｒｂ。

ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９；　Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ、　 Ｆ、、　Ａｕ５ｔ　ａｌ’ａ　Ｊ、　ｉｒ　ｅ　、　Ｊｕｎ■ １９８４、　ｐｐ、　６１−６５．１９８４　（この文献は、微生物学的ミルク 試験方法および各方法の関連文献を含んでいる。）：註虹公烏ム頗立己ヱ肛ニジ ４４．７３９−７６９．にａｒｌ、Ｄ、Ｍ、、　１９８０；　Ｍａｒｔｅｌｌ、 ＾、Ｅ、、　（ｈｐｏｔ　ｏ　Ｍｔａ　Ｃｈ　ａ　ｍ　ｕｄ、ＰｒｅｎＬｉｃｅ −Ｈａｌｌ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９５２　；Ｃｕｒ　ｅｒｌ　ｒｏｔｏｃｏ ｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、@Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　２　ｖｏｌｕｓ＋ｅｓ　（ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ）（１９８７−１９９１）。

上記で引用した７旦ＩＢｊＨ１およびＣｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉ ｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ−に記載されたように、核酸増幅技術、特にＴｈ ｅｒｍｕｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓからのＤＮＡポリメラーゼな適用したＰＣＲ増 幅のような熱的に安定な酵素による増幅技術はよく知られており、核酸セグメン ト検出用の核酸プローブハイブリッド形成検定方法および染色方法もよく知られ ている。上記技術に関する付加的な情報として、Ｕ、Ｓ、Ｐ、Ｎｏ、４．６９３ ．１９５および４，６９３，２０２　（ＰＣＲａｎｄ　ｉｔｓ　ａｐｐｌｉｃａ ｔｉｏｎ　ｉｎ　ｎｕｃｌ■奄■ ａｃｉｄ　ｐｒｏｂｅ　ｂｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙｓ　ｆｏｒ　 ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）；国際特許公開公報Ｎｏ、１１０８８／１０３１５（ｔｒ ａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｍｐｌｉ ｆｉｃａｔｉｏｎ／ｄｅｔｅｃｔｉｏ氏@ｍｅｔｈｏｄｓ ）：　Ｕ、Ｓ、Ｐ、Ｎｏ、４，８８９，８１８および国際特許願Ｎｏ、ＰＣＴ／ ＵＳ９０１０４１６９　（１９９１年２月発行）（ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ　 ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｔ　ｅｒ＋＊ｕ　ａ　ｕａ　ｉ　ｕ 　（ＴＬＬ　ＤＮＡ　ｐｏｌ剔撃■窒≠唐■ ｓ）　ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｕｓｅ　ｉｎ　ＰＣＲａ＋５ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏ ｎ）：ヨーロッパ特許公開公報Ｎｏ、０３２９８２２　（ｉｓｏＬｂｅｒｍａｌ 　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ　ａｍ ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　垂窒盾モ■唐刀j： Ｕ、Ｓ、Ｐ、Ｎｏ、　４，９５７，８５８　（Ｑ−Ｂｅｔａ　ｒｅｐｌｉｃａｓ ｅ　ｃａｔａｌｙｚｅｄ　ａｕｔｏｃａｔａｌｙｔｉｃ　ｒ■垂撃奄モ≠狽■ ｏｎ　ｏｆ　ｒｅｐｌｉｃａｔｉｂｌｅ　ＲＮＡ　１ｉｎｋｅｄ　ｔｏ　ｐｒｏ ｂｅｓ　１！ｏｓｐｌｅｗ＋ｅｎＬｉｒｙ　ｔｏ　ｔａｒｇ■煤@ｓｅｇｍｅｎ ｔ） 本発明は、液状ミルク試料および他の培養物からの細胞材料除去用の分離および 濃縮技術を包含する。この技術を液状ミルク試料に関して説明するが、他の材料 から調製された培養物にも同じように適用される、この技術を実施するには７分 析されるミルク試料を図１の１０に示すような適当な大きさの遠心分離容器に入 れ、そしてミルクにキレート化剤、必要に応じ微粒担体あるいは溶解剤を加える 。キレート化剤は上記した種々のタイプのいずれでもよく、エチ１／ンジアミン 四酢酸（ＥＤＴＡ、商品名Ｖｅｒｓｅｎｅ）　、ビス−（〇−アミノフェノキシ ）−エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）。

エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ、Ｎ、Ｎ’　、Ｎ ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロトリ酢酸（トリグリシン、アンモニア三酢酸 塩、！−リドンＡ）、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢酸（ＣＤ ＴＡ）、ジエチレントリアミノペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）　、クエン酸塩、アルギ ニン、ハイポザンチン、４．５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン 酸、ナトリウムリン酸塩ガラス（ｇｌａｓｓ＞あるいは“ガラス”またはポリリ ン酸塩類における分子のいずれか、クラウンエーテルタイプ化合物およびこれら 分子の全ての誘導体および前駆体を含むことができる。キレート化剤、例えばＥ ＤＴＡ、および担体あるいは溶解剤（もし存在するなら）を、好ましくは“透明 化溶液“ど呼ばれる溶液にしてミルク試料に添加する；そしてキレート化剤、お よび担体あるいは溶解剤、およびミルク試料の混合物に蓋をし、反転あるいは旋 回して混合する。試料は、ついで適当な大きさの遠心分離器に入れ、最小限５分 量１０．０００ｘｇ　（最小相対遠心力）で遠心分離する、試料は遠心分離後、 ３つの層４こ分離する。最上層は図１の１５で示されるようなりリームおよびミ ルク蛋白質“パッド”　（ｐａｄ）であり、そしてこのパッドは、液状試料の上 側に浮動する、パッドの下側には、図１の１６で示されるような第２の“透明” 　（ｃｌｅａｒ）液領域があり、これはミルク試料とは異なり、非不透明および 半透明である。最後に、遠心分離管の底部には、細胞ペレット１７があり、これ の大きさは原ミルク試料の細胞数および使用されたキレート化剤および／または 微粒担体および／または活性剤のタイプに依存する。ベレットは少量の細胞と会 合した他のミルク成分を含んでもよい１代表的な１．０ｍｌの生ミルク試料の透 明化後には、ベレットは約１０〜４０μｍの容積であり、外観は白色または灰色 がかった白色である本発明におけるキレート化剤の作用は、ミルク試料中におけ るカゼインミセルのサブミセルへの解離である（Ｌ、Ｃ，Ｃｈａｐｌｉｎ、ム」 紅ユ」Ω、　５１：　２５１−２５７．１９８４）、キレート処理後には、キレ ータ−の無い状態でペレット化した場合とは反対にミセル状ミルク蛋白質材料は 遠心分離管の上側に登りあるいは溶液中に残存する。キレータ−は、ミセル構造 に寄与する主成分であるカルシウムイオンと結合する（Ｓ、Ｈ，Ｃ，Ｌｉｔ、　 Ｌ匹匝虹■江１１：　１８１８−１８２１．１９７２）、従って、本発明ではカ ルシウムイオンを特によく結合するキレート化剤が好ましい。

本発明の分離方法では、キレート化剤がミルクミセルに作用し、一方検査すべき 細胞にはネガティブで作用しないことが非常に重要である０例えば、ビートルル シフェラーゼのような微生物ＡＴＰを測定するような検定方法の場合には、ミル クを透明にするが、微生物細胞ＡＴＰあるいは生存度（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を 除き、低めあるいは減するキレート化剤は検定方法用候補としては好ましくない 、この理由により、あるタイプの適用に対して、ある種のキレート化剤が他のキ レート化剤よりも優れている。特に適していると見いだされたキレート化剤は、 ニトリロトリ酢酸およびエチレンジアミン四酢酸である。

本発明では、細胞分離の遠心分離段階で、細胞特に微生物細胞を気めるのに微粒 担体を使用してもよい、微粒担体はペレット化を助けるのに役立つ、微粒担体の 物性は、微生物細胞よりも担体が僅かに遅く沈降するあるいはペレット化するよ うなものであり、そして細胞採集をより一層定量的にするようなものである。

多数の材料を微粒担体として使用することができ、微粒担体は、ポリスチレン、 ラテックス、プラスチック、ガラス、ケイソウ土、金属酸化物のビーズおよびポ リアクリルアミド、デキストラン、架橋デキストランおよび澱粉を含むコロイド 状物質の“ビーズを含む、望ましい微粒担体の特性は３つである。：１）担体は 採集される目標細胞と同じ速さ、あるいは好ましくは採集される目標細胞よりも 僅かに遅く沈降する。この特性は基本的には粒子の密度、寸法および荷電という 機能に依存する。２）担体は、遠心分離後に、細胞ベレットの処理あるいは評価 を容易にするために再懸濁できる。３）担体は細胞ペレットで実施される試験あ るいは評価に対して不活性でなければならない０例えば、顕微鏡検査を実施する 場合には細胞染色技術において、担体は不可視である、あるいは担体は微生物細 胞の測定あるいは評価用ＡＴＰのような、測定される分析物と結合してはいけな い、直径約０．２５μｍ〜２．５μｍの上記材料のビーズは、微粒担体として適 している５直径約１μｍの活性剤フリーのポリスチレンビーズは、好ましい微粒 担体である。　本発明の細胞分離法における微粒担体の使用は、遠心分離を伴う 細胞ベレッ１−からの望まＬ＜ない表面層の除去を容易ならしめる。担体は微生 物細胞ベレットよりも大きな可視指示体とし、て役立ち、表面層の除去により一 層好都合である、加えて、細胞ベレッ（−の一部あるいは全部を誤って吸引する 可能性を、微粒担体の使用により大きく減少する。

生ミルク試料から体細胞を除去し　微生物細胞のみを分離濃縮する場合には、Ｔ ｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００あるいはＮｏｎ１ｄｅｔ、Ｐ−４０（ＮＰ−４０）のよ つな非イオン性活性剤をキト・−１−（ヒ剤と共にミルク試料に加えてもよい、 このような活性剤は特に微生物細胞を溶解することな・くウシの体＃Ｉ胞（動物 細胞）を溶解する９何故なら、体細胞は遠心分離前の処理で溶解され、遠心分離 後にはそのままの体Ｕ胞は本質的に残存し、ない。引き続・くこれらのベレット についてなされるＡＴＰ定量は、バクテリア細胞あるいは他の微生物細胞のみを 検出する。

他方、ミルク試料中の体細胞数を測定あるいは定Ｘ′する４台には、上記活性剤 を細胞べ１ノツトに添加し、体細胞のみを溶解する、体細胞中に含有されるＡＴ Ｐのような細胞代謝生成物は、活性剤で抽出できない微生物ＡＴＰによる結果の 」−昇を伴うことなく、容易に測定される。試料中に存在する体細胞数は、測定 されな既知量のＡＴＰおよび体細胞中に′？？！在すると知らｆｌ、ｃＡＴＰの 平均りを使用し。

てｇ１′算される。、二の方法はｆａ’Ｊ来知らノｑ−ｆ）方法の改良で゛ある （Ｒ，Ｂｏｓｓｕｙｔ、註ｆｅ　ｈ　ｗ（ユ凹ル遷Ｉ８．３３：　１１−１３， １９７８）。

本方法は、Ｍ胞の製網およびカゼインおよびカゼインミセル、親油性成分、およ び害のようなバックグラウンドのミルク汚染物を除去する有用な方法を提供する 。、−の濃縮を実施するには、飼えばミルク１ｍｌをキレ−１・止剤と共に遠心 分離により透明化１２、得られたベレ・ブトを非常に少Ｉ（例えば１０μｌ）の 適当な縛衡渣Ｊ、たは液体で再度懸濁させるやこの刑で１３５、全部の細胞成分 がミルク汚染物から除去され、そして１００倍に濃縮される。この濃縮試料は、 所望の他の分析に利用される。

この方法の有用性の一例は、生ミルクからの微生物を染色し計数することにある 。ミルク試料がｍ１当たりｉ　ｘ　ｉ　ｏ’よりも少ない生物体を含有し、１０ μｍのミルクがＭ微鏡用スライドに載！され、染色された場合には、統計的に意 味のある計数値を薬めるため多くの視野の染色標本を観察せねばならない、視野 は、他のミルク成分がバックグラウンドで染色されているため、計数することが 難しい、Ｂｒｅｅｄ　Ｓｍｅａｒ法は、生ミルク品質検定のために広く、特に日 本で広く使用されている。前記濃縮工程く１００倍に濃縮）を利用することによ り、計数用視野はより少ない数でよく、そして視野はバックグラウンドがより奇 麗なので計数はより容易である。このことは、標本作成を迅速にしかつ操作者の 疲労および誤りを減少する。

ミルクの種々の他の成分から本発明の方法に従って全細胞と分離し、細胞を濃縮 することにより、標本中の体細胞数を決めることができる。

汚染する体細胞がないベレット中の微生物細胞を、微生物抽出剤で溶解し、ＡＴ Ｐを検定できる。微生物細胞の数は、ＡＴＰ測定および微生物細胞、あるいは特 にミルク微生物細胞に存在すると知られているＡＴＰの平均量を用いて算定され る。、：のタイプの方法は、標準ブレーティングおよびスパイラルブレーティン グのような他の方法に比して数多くの利点を提供する。第】に、他の２つの方法 の４８時間という時間構成とは反対に１時間という短時間で結果が利用できる。

第２に、ＡＴＰ測定は、細胞凝集によって影響されることのない結果が得られる 、即ち、ＡＴＰは全ての細胞から測定される。；ブレーティング方法では、細胞 の対あるいは細胞のグループが１つのコロニーを形成するため、単一の４ａＩ胞 として計数される。第３には、ＡＴＰ方法では、３０℃より上の温度で培養する プｌ／−ティング計数法では測定されない好低温性生物体からのＡＴＰを測定す る。。

先述したように、本発明を用いて分離濃縮された細胞には、バックグラウンドを 大きく減少１〜、濃縮により細胞数を非常に増大することで５ｆｌ！！の種々の 方法が適用できる。このことはより大きな感度の可能性と、バックグラウンドの 除去による信頼できかつ再現できる結果とを提供する。

本発明の方法は、感度、細胞数、あるいは細胞耐久性（ｃｅｌｌ　ｈａｒｄｉｎ ｅｓｓ）を改良する透明化遠心分離の前または後の細胞濃厚化あるいは細胞増強 化（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）技術を含んでもよい０例えば、細胞を細胞ＡＴＰ を増加する処理法（ｔｒｅｉｔｍｅｒｉｔｓ）（Ｄ、Ｐ、　Ｔｅｒｏｎ、　、Ｌ １四しム匹、　４６：　１９８−１９８．１９８３）あるいは処理剤（Ｋ、Ｍ、 　０ｘｌｔＪ、　ｉｏ　ｕｎｉ　ｄ　ｍ’　−ｉ　ｅ　ｅｎ　、Ｅｄ、Ｊ、Ｓｅ ｂｏｌｍｅｒｉｃｈ、Ｊｏｈｎ　Ｍｉｌｅｙ　＆　５ｏｎｓ、　Ｎ、Ｙ、、　９ ９．４９５−１９８．１９８６）で処理することにより、本方法の感度は増強さ れる。このタイプの方法は、培地の選択、あるいはポリクローナルまたはモノク ローナルでさえも使用して、特殊な試料中における特殊なタイプの細胞の検出に も適用できる。

本発明に適用される検定方法の適切なコントロールおよびこのような検定方法で 決定されるべき分析物の濃度あるいは量に関する量的な情報を与える適切な標準 の必要および特性は当業者にはよく知られている。このようなコントロールおよ び標準は下記の例で説明される。

図１を参照して本発明の透明化洗浄方法をミルク試料について説明する。この方 法では、ミルク試料をまず遠心分離容器１０に入れる０次にキレート化剤、場合 により微粒担体および活性剤を透明化溶液を使用して加える。容器の内容物を混 合し、ついで容器を遠心分離器にかけると得られた試料はいわゆる透明化される 。もしキレート化剤無しのミルク試料を同様にして遠心分離にかけると、透明化 せず、大きな、拡散したミルク蛋白質および細胞ベレットが管の底部にたまる、 最後に細胞ベレットを容器中の大部分の他の材料から遠心分離後の表面層の吸引 により分離する。

液状ミルク試料からの細胞成分の分析用キットは次の成分から形成される。：Ａ ＴＰ検出を使用する微生物試験キット：（ａ）　キレート化剤、上記したキレー ト化剤および活性剤のような体細胞溶解剤、および場合により微粒担体を含有す る透明化溶液、（ｂ）　場合により細胞ベレットの洗浄用溶液、（Ｃ）　微生物 細胞ＡＴＰ放出用の上記した細胞溶解溶液のようなＡＴＰ抽出剤、 （ｄ）　場合により、Ｍ菌液、 （ｅ）　生物発光によるＡＴＰ測定用ルシフェラーゼ（例えばＰ、ｐｙｒａｌ　 ｉｓからの）−ルシフェリンのようなＡＴＰ検出試薬。

ブリードスミア法を使用する微生物試験キット：（ａ）　ＡＴＰ検出を使用する 微生物試験キット用に記載された透明化溶液、（ｂ）　場合により、細胞ベレッ ト洗浄用溶液、（ｃ）　細胞染色用溶液。

ＡＴＰ検出を使用するウシの体細胞試験キット：（ａ）　ＡＴＰ検出を使用する 上述した微生物試験キット用の透明化溶液であり、体細胞溶解剤を除いたもの、 （ｂ）　微生物細胞を溶解しない体細胞溶解溶液、（Ｃ）　ルシフェラーゼ−ル シフェリンのようなＡＴＰ検出試薬、核酸増幅および核酸プローブハイブリッド 形成を経た微生物の検出用微生物検出キット； （ａ）　微粒担体および、ミルク試料の場合にはキレート化剤からなる透明化溶 液。

（ｂ）　場合により、透明化溶液を使用する細胞洗浄法からの細胞ベレットの洗 浄用溶液、 （ｃ）　検出する微生物に特異的な巨像核酸セグメントの増幅用酵素およびアラ イマ、場合にｊ：す、ヌクレオシドトリフォスフエイト（ＤＮＡのみが増幅工程 で合成される場合には２°−デオキシリボヌクレオシドトリフォスフエイト）、 緩衝液等のような増幅で使用される他のより一般的に有用な成分、（ｄ）　（ｃ ）の成分で増幅された目標セグメント用核酸１０−プと、プローブそれ自体が検 出できないならば（例えばｆｆ２ｐでラベルされたような）該目標セグメントに ハイブリダイズされたプローブを検出するに必要な試薬０例えば、１０−ブが共 有結合で（即ち直接）アルカリ性ホスファターゼのような酵素でラベルされてい る、あるいは非共有結合で（即ち閉接）、ビオチンを介してアビジン酵素（例え ばアルカリ性ホスファターゼ）錯体でラベルされているならば、ここで酵素は検 出信号を提供する発色団の生産を触媒するものであるが、発色団の生産用試薬お よび、非直接ラベル用にアビジン−酵素錯体を準備する。再び緩衝液、ハイブリ ッド形成用固体支持体等をまた準備してもよい。

（ｅ）　変法として、あるいは場合により、核酸プローブおよび（ｄ）で会合し た試薬に追加して、ゲルのようなサイズの知られた増幅された目標を検出するた めのエチジウムブロマイドのような染色試薬、当業者が熟知しているように、ゲ ルのサイズを揃えるのと並行して適当なゲルを調製する試薬等を準備してもよい 。

上述した各キットは、例えば実施例６で記載するように、フィルター、および定 量化、標準化用に適当なコントロールをする試薬を含有させてもよい。

本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明するが、これらの実施例により限 定されるものではない。

実施例１ この実施例は、人工的に接種されたミルク試料からの微生物細胞の分離を開示す る。加えて、この検定を市販の利用できるミルクＡＴＰ検定と比感度について比 較した。

生ミルクを地方の乳牛場から得、そしてその生ミルクを標準方法の寒天で画線培 養して、個々のコロニーを分離した（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏ ｒ　ｔｈｅ　Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ−社」臘辷しヱ皿止ニ臘、上記参照）、１ １個の視覚的に異なるコロニーのタイプを取り上げ、標準方法のブイヨンで成長 させ、生ミルク中で見いだされる異なる覆の代表的試料を得るように試みた。こ れらの分離物から一細胞タイブ（Ｓｅｒｒａｔｉａユム邸ｈニ匡匣）を実験用に 選んだ。

殺菌ミルク試料を陰性対照として使用した。殺菌ミルクの１ｍｌに、１０μｍの 一夜（２３℃）成長させたミルク分離バクテリア（Ｓ、　ｌ１ｑｕｅｆａｃ＋ｅ ｎｓ）を添加した。この人工的に接種したミルク試料および未接種殺菌ミルクを 使用して、多数の接種ミルク試料を下記表に示すように調整した。

区阪亘　五旦旦圧２　１皿二止２ 接種ミルク試料中の生物体数を計数するため、−皮細胞懸濁後の１００μｌの一 連の希釈液（１０−’、１０−’、１０−’、１０−”、１０−’および１０１ ）を標準方法寒天上におき、３７℃で一夜インキユベートした。データを計数す る得られたコロニーは、試験管２−１１のバクテリア数を計数するために使用し た。

一連の８個の１．５ｍｌマイクロ遠心分離管を試験管面におき、番号を付けた、 そして１．０ｍｌの上表の各試料１−８を各試験管に入れた。ミルクを室温（２ ２℃）で１０時ロインキュベートし、５００μｌの０．２５ＭＥＤＴＡ−ｐＨ８ ，０，０，５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（ＮＰ−４０）溶液を各試験管に加え た。試験管に蓋をし、１０回逆転して混合し、そして試験管のヒンジが外側を向 くように注意しながら、アングルヘッドマイクロ遠心分離器（Ｎｈｅａｔｏａ） のローターにおいた。試験管を１２，０００ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを フォージットアスピレータ−についている使い捨て式の１０００μｍピペットチ ップを使用して除去した。試験管を僅かに傾けて、得られたベレットを吸引もし くは破壊しないように、最後の残っている上澄みをアスピレータ−に注いだ。

各ベレットに５００μｌの０．１ＭＭｇＣ１ｘ、０．２％ＮＰ−４０溶液を加え 、試験管に蓋をし、細胞がベレットに再懸濁するように旋回し、次いで試験管を 前と同じように遠心分離した。遠心分離後、上澄みを再度吸引し、次いで５０Ｏ μ１（７）０．ＩＭＭｇＣＩ！、０．２％ＮＰ−４０を各試験管に加えた。試験 管に蕾をし、遠心分離し、前と同じように吸引した。

各試験管に、細胞ＡＴＰを抽出するため、５０μｌの１％トリクロロ酢酸（ＴＣ Ａ）＋　１ｍＭＥＤＴＡ、０．０００５％キシレノールブルー溶液を加えた。試 験管を旋回し、室温で１０分間インキュベートした。

使い捨て用のプラスチック製ビベットチッ１を使用して、ＴＣＡ抽出物をルミノ メーターキュヴエット（ＳｉｒｓＬｅｄｔ）４：移し、４００μｌの０．１Ｍの ト！Ｊ２−酢ａａｔ＠液、ｐＨ７，７５で中和した。ルシフェラーゼ反応を開始 するため、１００μｌのＰ、　ｐｙｒａｌｉｓルシフェラーゼ−ルシフェリン試 薬（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ、、　Ｍａｄｉｓｏｎ、　１ｌｆｉｓｅｏｎｓｉ ｎ、　ＵＳＡ）を加え２次いで１０秒のインテグレーション時間を用いるＢｅｒ ｔｈｏｌｄ　９５０１　／レミノメーター（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ　Ａｎａｌｙｔｉ ｃａｌ、　Ｍｕｎｉｃｈ、　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて放出光と測定した。放出 光の結果は、相対釣元単位（ＲＬＵ）として、記録した。

同様に調整された汚染ミルク試料（試験管１−１１．表１）を用いて、各ミルク 試料の５０μｌを市販の利用できるミルクバクテリア検出キット（商品名Ｌｕｍ ａｃ　ｂｖ、オランダ）を使用し、製造者のプロトコルに従い分析した。

これらの検定結果を図２に要約しな０本発明および市販の利用できるミルク検定 キットに対して、ＲＬＵ　（ｙ軸）の対数をミリリットル当たりのコロニー形成 単位（ＣＦＵ）におけるバクテリア数（Ｘ軸）の対数に対してプロットした０本 発明の感度は、Ｉ　Ｘ　１０’細胞／ｍｌよりも小さく、一方Ｌｕｍａｃ検定の 感度は約ｌＸ１０’＃胞／ｍｌであることが見いだされた。

実施例２ この実施例は、１１個の生ミルク試料および１個の殺菌ミルク試料からの微生物 細胞の分離を開示する。

生ミルク試料を地方の乳牛場から受け取り、４℃で貯蔵した。殺菌ミルクもまた 本検査に含まれる。各ミルク試料１ｍｌを１．５ｍｌのエッペンドルフ試験管に ピペットで入れた。この操作をそれぞれについて２回繰り返した。ミルク試料を 室温で１０分間インキュベートし、次いで０．５ｍｌの０．５％ＮＰ−４０，３ ％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩）を各試験管に加えた。試験管に蓋をし、１ ０回逆転して混合した。

試験管を１２．０００ｇで５分間室温で遠心分離し、上澄みを実施例１と同様に して吸引した。各ベレットに０．５ｍｌの０．０５ｍＭＭｇＣＩｇ、０．２％Ｎ Ｐ−４０溶液を加え、試験管に蓋をし１、旋回し、上記と同じように５分間遠心 分離した。遠心分離後、上澄みを再吸引し、そして洗浄、遠心分離および吸引を もう一度繰り返した。

得られたベレットとＴＣＡ溶液で処理し、実施例１と同様に操作してルミノメー タ−で測定した。各試料の結果は、測定を２度繰り返した結果の平均である。

各ミルク試料をもまた、無菌の０．８％ＮａＣｌで希釈し、１．０ｍｌの１０倍 希釈液をベトリ皿にピペットで加えた。この操作もそれぞれについて２回繰り返 した。約２０ｍ１の無菌標準性寒天を各皿に加え、混合した。プレートを２３℃ で４８時間インキュベートし、コロニーを計数した。結果は２回繰り返したプレ ート計数値の平均である。

本実施例の結果を区３に示す、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の対数とＲＬＵの対 数との間には、検査範囲にわたる直線状の対応が認められた１本データの相開計 数は０．９９４であり、２つの方法の間に有意の相間関係があることを示す。

実施例３ 本実施例は、実施例２の方法を変更した方法を使用した６５個の生ミルクがらの 微生物細胞の分離を開示する。

ミルク試料を、微生物ベレットの処理に１０テアーゼ処理を加えた外は実施例２ と同様に処理した。

第１の遠心分離工程の後に、得られたベレットを５００μｍの０．０５ＭＭｇＣ １，，０，２％ＮＰ−４０、および３０μｇのα−キモトリプシン（Ｓｉｇ＋ｕ 　Ｃｈｅｓｉｃａｌ　Ｃｏ、、　ＳＬ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、　 ＵＳＡ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　Ｃ７７６２）に溶解した。ベレットを２秒間で３ 回逆転し、そして試験管を室温で２０分間インキュベートした。残りの工程は実 施例２と同様に操作した。

図４は、この方法による６５個の生ミルクにおけるＣＦＵ／ｍｌの対数とＲＬＵ の対数との相関関係を示す、２つの方法の間に正の相関間係があることを示して いる。

実施例４ 本実施例は、実施例３の方法を変更した方法を使用した８８個の生ミルクからの 微生物細胞の分離を開示する。

各生ミルク試料１．０ｍｌに５００μｌの３％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩 ）溶液、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−Ｌｏｏｔ加え、ついで実施例３と同様に処 理した。第１の遠心分離工程からの上澄みを吸引した後、０．０５ｍＭＭｇＣｌ □、０．０１％活性剤フリーのポリスチレンビーズ（Ｑ、　９８４μｍ、　Ｂａ ｎｇｓ　Ｌａｂｓ、Ｃｉｒｍｅｌ、　ｒｎｄｉｉｎａ、　ＵＳＡ）を含有する０ 、２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００および６０μｇ／ｍ＋のα−キモトリプシンの 溶液と加えた６ボリスチレンビーズは、遠心分離により細胞と共に除去された。

試料をインキュベートし、遠心分離し、実施例３と同様にして吸引し、そしてベ レットを０．０５ｍＭＭｇＣ１ｚ、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００に再懸濁 し、逆転し、再度遠心分層を実施しな、残りの工程は、実施例３と同様に実施し た０本実施例の結果を、図５に示す。

２つの方法間に正の相関関係が認められた。

実施例５　。

本実施例は、実施例４の方法を変更した方法を使用して、１８１の生ミルクから の微生物細胞の分離を開示する。

本実施例では、第１のミルク処理工程で担体ポリスチレンビーズ（実施例４と同 じ）の等ｌと３％ニトリロトリ酢酸（ナトリウム塩）、０．５％Ｔｒｉｔｏｎｘ −ｉｏｏ溶液に加えた。担体は次からの工程では加えなかった。さらにα−キモ トリプシンを第１の洗浄溶液における１５０μｍ／ｍｌの最終の濃縮として使用 した。残りの方法は、実施例４と同様に操作した。

図６に相関間係の結果を示す、２つの方法の間に相関関係が認められた。

実施例６ 本実施例は、濾過袋！を使用する本発明の有用性を開示する。

１組の接種された殺菌ミルク試料を実施例１と同様にして調製した。実施例１に おける試験管１−１１に対応する試料を使用した。

各試料に、３００μｌの０．５ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８，０、および３００μｍの １％ＮＰ−４０！加えた。試験管に蓋をし、混合するためにＩＯＸ旋回し、そし て１２．０００ｇで１０分間遠心分離した。上澄みを吸引により除去し、ベレッ トを２００μｍの０．ＩＭＭｇＣｌｚ、０．２％ＮＰ−４０中に再懸濁するため に旋回して懸濁させた。細胞懸濁液をスピンｒ過装置側１１１ｉｐｏｒｅ、　Ｕ ｌｔｒａｆｒｅｅ１４ｃ、　０．４５μ■）に入れ、１２，０００ｇで１０分間 遠心分離した。遠心分離後、フィルターインサートを蓋の無い無菌のマイクロ遠 心分離管に入れ、５０μｍの１％ＴＣＡを加え、室温で１０分間インキュベート した。フィルターおよびホールダーを１０分間再度遠心分離してＴＣＡ抽出物を 集め、実施例１と同様に操作本実施例の結果を図７に、そして濾過タイプフォー マットにおける本発明の有用性と示す０本実施例で検査した細胞濃度範囲にわた って、ＲＬＵが投与量と良い応答を示した。

実施例７ ニューイングランドの病院から得られたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕ ｒｉｕｍ　５ｔｒａｉｎ　ＰＢ６３７をブイヨンで一夜増殖した。−後後の培Ｉ ！物を○Ｄ６゜。で０．１に希釈し、ついでＯＤ…で０．９に増殖した。培養物 を、リン酸塩でＭｌｌされたサリーン（ＰＢＳ）で１０倍に希釈して一連の希釈 物ができるようにした。各希釈物のアリコートを生存バクテリアの力価を決定す るために塗布した。各希釈物の５μｌをマイクロ遠心分離器のチューブ内の生ミ ルク０．９９５ｍ１に加えた。７個の希釈物とバクテリアのないＰＢＳのブラン ク１個がある。透明化溶液（０，２５ＭＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ− １００，０，０１％微粒担体（活性剤フリーのポリスチレンビーズ、参照実施例 ４））５００μｌを各チューブに加えた。十分に混合するため１０回逆転した。

クリーム層を除き、上澄みを吸引した。ベレットの細胞をヴオルテックスミキサ ーを使用してＰＢＳＩミリリットルでベレットを再懸濁することにより洗浄し、 ついで得られた細胞懸濁液の５００ＡＬｌをマイクロ遠心分離管に加え、５分間 遠心分離した。上澄みを吸引して除き、得られたベレットを希釈水２５μｌで再 懸濁した。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｇｅｎｏｍｅの増幅を生ミルク試料中に存在する５ａｌ ｓｏｎｅｌ　Ｉａの検出用に使用した。プライマとして、オリゴヌクレオチドＡ ８６，２８−ｂａｓｅＤＮＡ、およびＢ８３を使用した。各プライマを無菌、希 釈水中で５０μＭの濃度となるようにプライマを混合した。

ＰＣＲ試薬の混合を、１８０μｌの１０ＸＴａｑＤＮＡボリメラーバツフア−（ ５００ｍＭＫＣＩ、１００ｍＭ）リスＨｃＩ　（ｐＨ８，８，２５℃）、１５ｍ ＭＭ　ｇ　ＣＩ　ｘ、　１％Ｔｒ　ｉ　ｔ　ｏ　ｎＸ−１００）　（Ｐｒｏｍｅ ｇａ　Ｃｏｒｐ、、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ。

ｎ５ｉｎ、　［ＩＳ＾＞、１０．８μｌ　（４５単位）のＴ　ａ　ｑ　Ｄ　Ｎ　 Ａポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃ。

ｒｐ、）＝１８０μｌのｄＮＴＰ溶液（各２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ−ｄＣＴ ＰおよびＴＴＰ）を混合してＰＣＲ反応における各ｄＮＴＰの初期濃度２００μ Ｍ、希釈水の最終容１１１Ｆ１．８ｍｌとなるようにした。新しいマイクロフユ ージ管にＰＣＲ試薬混合物９３μｌおよびプライマ混合物（各プライマＬｏｏｐ モル）２μｌを加えた０次に各バクテリア懸濁液５μｍを管に加え、鉱物油２滴 で液の表面を覆った。管をＰｅｒｋｉｎ−ＥＩ＋＊ｅｒ　ＣｅＬｕ５　ＤＮＡ　 Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ　（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔ浮刀B Ｎｏｒｗａｌｋ、　ＣｏｎｎｅＬｉｃｕｔ、　ＵＳ＾）に設置した。バクテリア を溶解する、あるいはＤＮＡを抽出する工程は設けなかった。これはＰＣＲ反応 中に実施した。　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒの条件は、９４℃で１分間、次 いで６５℃で１分間、最後に７２℃で２．５分間であり、５秒間自動的に延期で きるようにした。全部でＰＣＨの３５サイクルを実施した。

ＰＣＲ生産物をアガロースゲルの電気泳動により分析した。ＴＡＥバッファ中の １．５％アガロースゲルにＰＣＲ反応生産物の各５μｌを加えた。ゲルを１．５ 時間７０ｖで電気泳動させた。ゲルをエチジウムブロマイドで染色した。２５゜ 細胞／ｍｌを有するミルク試料のレーンは、予定されたフラグメント長さの可視 バンドを示した。より少ない細胞での希釈物およびＰＢＳ対照管（細胞をミルク に加えていないＰＢＳ）はゲル上にバンドを示さなかった。

ゲルを０．５ＭＮａＯＨ中で３０分間室温で変性した。ＩＭトリスＨＣＩで１５ 分間づつ２度洗浄した。ゲルをナイロン薄膜で覆い、ついで２冊の大きな本を重 しにして０．５インチのＨｈａｔ−ａｎ　３ＭＭ紙およびサランラップで覆って プロット（ｂｌｏｔｔｅｄ）　した、２時間後、ナイロンを２ＸＳＳＣで１０分 間洗浄し、そしてＵＶでυＶ−Ｓｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ　１８００（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　ＵＳ＾）中で ■■ した。ゲルを２種のプライマ間のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｇｅｎｏｍｅのセグメ ントの配列であるコ２Ｐキナーゼでラベルされた、２４−ベースＤＮＡ、Ｐ４７ と呼ばれるもので、２ＸＳＳＣ１２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ、 １０　ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ溶液、１０％デキストランサルフェート、およ び０．１ｍｇ／ｍｌのへリング（ｈｅｒｒｉｎｇ）精子ＤＮＡ中で６２℃で一夜 ハイブリッド形成した。ナイロンを、２ＸＳＳＣ中で０．１％ＳＤＳで６２℃で 各１５分間づつ２度洗浄した。ナイロンを一７０℃で５．５時間コダックＸＡＲ フィルムに露出した。バクテリアの生ミルクへの希釈物の全ては、ＰＭ４０７で ハイブリッド形成されているＰＣＲ生産物のバンドと示したが、ＰＢＳ対照対照 上記バンドを示さなかった。最高の希釈物には、生ミルク１ｍｌに加えられた約 ２．５の生存細胞があった。ＰＣＲ反応にこの材料の１０分の１だけを加えた所 、ＰＣＲ反応のために取り出した〆料は１個の細胞を偶然に含んでいるか、ある いは培養物が数個の生存不能の細胞を含んでいることが判った。どちらの場合に も、この方法は生ミルク中のサルモネラ細胞の検出が非常に高感度であることを 示している。

実施例８ ビーフステーキ中のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｓｕｒｉｕｍを検出する 実験を実施した。ビーフステーキの５個の試料（２５ｇ）をそれぞれ２２５ｍ１ のテトラチオネートブイヨンに加え、そしてＳｔｏｍａｃｈｅｒ　Ｌａｂ−Ｂｌ ｅｎｄｅｒ　４００（Ｔｅｋｍａｒ　Ｃｏ、、　Ｃ１ｎｃｉｎｎａｔｉ、　０ｈ ｉｏ、ＵＳ＾）中で、ビスマスサルファイド寒天上への接種による初期標準プレ ート計数（ＳＰＣ）により測定された、０．０．０２．２．２００および２０， ０００サルモネラ細胞／ｍｌとともに消化した。試料を３７℃で振動（１５０ｒ ｐｍ＞しながらインキュベートした。Ｏ１３および２４時間で、プレート計数お よび“透明化洗浄ＰＣＲ検定”　（実施１１ｆｆ７記載の検定と類似、透明化洗 浄から始めて初期細胞ベレットを得る）を５個のブイヨンのそれぞれについて実 施した。肉はバクテリア７０−ラで予め汚染されているおそれがあるので、プレ ート計数はビスマスサルファイド寒天（サルモネラ成長の選択性および指標）で も実施された。

表８はビスマスサルファイド寒天で計数された結果を示す。

表８ 細胞／ｍｌにおけるビスマスサルファイドプレート計数値之１１１、ルた゛　ｔ ・ル・− ０，０２２００００ Ｔ＝Ｏｈ　ＯＯｔ、ｚｘｉｏ”　７．０Ｘ１０２３．５×１０’Ｔ＝３ｈＯ０１ ，Ｏ×１０”４．５×１０３３．６×１０’Ｔ−２４ｈ　９．５Ｘ１０”　１． ２Ｘ１０雷　１．６×１０’　１．８Ｘ１０’　！、６×１０會透明化溶液は実 施例７　（０，２５ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０，０，５％Ｔｒｉｔ。

ｎＸ−１００，０，０１％担体）のそれと同じである。ベレットを１００μｌの ＰＢＳで再懸濁し、ついで−７０℃で素早く凍結した。全ての試料を採取し、調 整した後、試料を解凍し、旋回した。各試料から抜き取った５μｌに９５μｍの ＰＣＲ混合物（参照実施例７）を加えた。ＰＣＲ増幅をＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅ ｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒを使用してオリゴヌク レオチドＣ８４（２７−ベースＤＮＡ）およびＡ８６をプライマとして実施した 。プライマは、２４−ベースＤＮＡＰ４７の配列を持つサブセグメントを含有す るＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｇｅｎｏｓｉｃセグメントを一括する。ＰＣＲサイク ルは５秒間の自動延長を含む９５℃で１分間、６５℃で１分間、７２℃で２分３ ０秒からなる。１，５％の寒天ゲルをＰＣＢ生産物に流した。ついでゲルをＮａ ＯＨで処理して中性化し、ナイロン薄膜上に押し込めてプロットした。薄膜を洗 浄し、３２ｐキナーゼでラベルされたＰ４７をプローブする前にＵＶで架橋した 。引き続く放射線透過写真は、生産物がＰ４７の配列を持つサブセグメントを含 有するＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｇｅｎｏ働ｉｅ　ＤＮＡセグメントを増幅してい ること分確認させた。積極的な信号は、０時間および３時間のインキュベーショ ンでの２０．０００細胞／ｍｌの試料および２４時間のインキュベーション時間 における全ての接種濃度で明らかである。肉試料から調整された細胞濃縮するた めの透明化洗浄法と引き続く一夜培養は、微生物汚染用ＰＣＲ分析に対する試料 調整として十分満足できる方法である。

本発明は上記の具体例に限定されるべきものではなく、本発明の範囲内に属する 変法を含むことを理解すべきである。

肋　−口 Ｆｉｇｕｒｅ　３ ＬｏＱ［ＲＬＵ］ ω　＆Ｃｎ　［相］　Ｎ　− 相対釣元単位 国際調査報告 ＋ＩＩ＋ｏｒ＊ａＩ１１１１ａ−＾ｗｍｌ（ａｌｗＭＮ・Ｐ（７／ＩＫＱ＋ＩＮ 、７’）７フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｑ　１／６８　Ｚ 　７８２３−４８ＧＯＩＮ　３３／４８　Ｎ　７０５５−２Ｊ（７２）発明者　 マーティン・リサ・ニスアメリカ合衆国５３５８９ウイスコンシン州ストツフト ン・ノース・アカデミイストリート２１７ Ｉ （７２）発明者　ステブニツ・カスリーン・ケイアメリカ合衆国５３７０５ウイ スコンシン州マジソン・ツヴエルグドライブ３７１７ （７２）発明者　メンドザ・レオボルド・シイアメリカ合衆国５３７１９ウイス コンシン州マジソン・ララミイコート６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程からなる液状ミルク試料から細胞を分離濃縮する方法、（ａ）キレ ート化剤をミルク試料と混合する工程、（ｂ）試料を遠心分離して、細胞ペレッ トを形成する工程。 ２．さらに微粒担体をミルク試料と混合する請求の範囲第１項記載の方法。 ３．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズである 請求の範囲第２項記載の方法。 ４．細胞ペレットから上澄みを除去する工程をさらに含む請求の範囲第１項〜第 ３項記載の方法。 ５．ペレットを液中に再懸濁し、そして該懸濁液を試験して微生物細胞の濃度を 測定する工程をさらに含む請求の範囲第４項記載の方法。 ６．細胞ペレットから上澄みを除去する工程が、ペレット上の流体を吸引して実 施される請求の範囲第４項記載の方法。 ７．遠心分離工程の前に、試料中の体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない 溶解剤を試料と混合する工程をさらに含む請求の範囲第１項〜第３項記載の方法 。 ８．溶解剤が、非イオン性活性剤である請求の範囲第７項記載の方法。 ９．キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第１項〜第３項 記載の方法。 １０．キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸である請求の範囲第１項〜第３項記載 の方法。 １１．キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エクン−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢 酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸塩、アルギニン、ハイポザンチ ン、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン 酸塩ガラス、クラウンエーテルタイア化合物および誘導体およびこれらの前駆体 からなる群から選ばれたものである請求の範囲第１項〜第３項記載の方法。 １２．再懸濁されたペレットを試験して、細胞力価を測定する工程をさらに含む 請求の範囲第５項記載の方法。 １３．試験が、ブリードスミアー試験である請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．ペレットから上澄みを除去し、ペレットを液体中に再懸濁し、再懸濁され たペレットにブリードスミアー試験を実施して細胞力価を測定する工程をさらに 含む請求の範囲第７項記載の方法。 １５．ペレットから上澄みを除去し、細胞ペレットに溶解剤を加えて細胞を溶解 し、溶解した試料を試験して試料中に存在するＡＴＰの相対的量を測定する工程 をさらに含む請求の範囲第７項記載の方法。 １６．溶解試料を試験する工程が、試料にルシフェラーゼールシフェリン試薬を 加え、試料から放出された相対的光放出量を測定する工程をさらに含む請求の範 囲第１５項記載の方法。 １７．体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない溶解剤からなる液体中に細胞 ペレットを懸濁する工程をさらに含む請求の範囲第４項記載の方法。 １８．液体が、さらにプロテアーゼを含有する溶解剤からなる請求の範囲第１７ 項記載の方法。 １９．溶解剤との混合後試料を遠心分離し、上澄みを除去し、残りのペレットを 液体中に再懸濁し、細胞ペレットに微生物細胞からのＡＴＰ抽出剤を添加し、そ して試料のＡＴＰを定量的に試験する工程をさらに含む請求の範囲第１７項また は第１８項記載の方法。 ２０．ＡＴＰを試験する工程が、試料にルシフェラーゼールシフェリン試薬を加 え、試料から放出された光の相対的量を測定する工程をさらに含む請求の範囲第 １９項記載の方法。 ２１．ＡＴＰ抽出剤が、微生物細胞を溶解する溶解剤である請求の範囲第１９項 記載の方法。 ２２．懸濁液を遠心分離し、おもに微生物細胞であるペレット中の細胞から上澄 みを分離する工程をさらに含む請求の範囲第１７項記載の方法。 ２３．ペレットから分離された上澄み液のＡＴＰ濃度を試験する工程をさらに含 む請求の範囲第２２項記載の方法。 ２４．ＡＴＰの試験工程が、上澄みにルシフェラーゼールシフェリン試薬を添加 し、試料から放出された相対的光を測定する工程を含む請求の範囲第２３項記載 の方法。 ２５．微生物細胞からＡＴＰを抽出する薬剤を、ペレット中の細胞に加え、つい でＡＴＰの量的水準を試験する工程をさらに含む請求の範囲第２２項記載の方法 。 ２６．ＡＴＰ抽出剤が、溶解剤である請求の範囲第２５項記載の方法。 ２７．ＡＴＰ水準の試験工程が、試料にルシフェラーゼールシフェリン試薬を加 え、試料から放出された相対的光を測定する工程からなる請求の範囲第２５項記 載の方法。 ２８．ペレットから上澄みを除去し、体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しな い溶解剤とペレット中の細胞とを混合し、試料を遠心分離し、上澄み液を除去し 、得られたペレット中の細胞に再度体細胞を溶解するが微生物細胞を溶解しない 溶解剤を添加し、試料を遠心分離し、上澄みを除去し、次いで得られたペレット の微生物細胞の相対的濃皮を試験する工程をさらに含む請求の範囲第７項記載の 方法。 ２９．バクテリア細胞を安定化し細胞代謝物の損失を防止する溶液中に遠心分離 されたペレットを再懸濁する工程をさらに含む請求の範囲第２８項記載の方法。 ３０．安定化溶液が、マグネシウムイオンを含有する請求の範囲第２９項記載の 方法。 ３１．安定化溶液が、プロテアーゼをも含有する請求の範囲第２９項記載の方法 。 ３２．プロテアーゼ含有溶液に遠心分離されたペレットを再懸濁する工程をさら に含む請求の範囲第４項記載の方法。 ３３．（ａ）キレート化剤および体細胞溶解剤を含有する透明化剤；（ｂ）微生 物細胞ＡＴＰを放出するＡＴＰ抽出剤を含有する溶液；（ｃ）ＡＴＰ検出試薬 からなるミルク試料の試験用微生物試験キット。 ３４．透明化溶液が、さらに微粒担体を含有する請求の範囲第３３項記載の試験 キット。 ３５．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第３４項記載の試験キット。 ３６．（１）遠心分離により得られた細胞ペレットの洗浄用溶液および（２）緩 衝液を含む請求の範囲第３３項〜第３５項記載の試験キット。 ３７．ＡＴＰ検出試薬が、ルシフェラーゼールシフェリンである請求の範囲第３ ３項〜第３５項記載の試験キット。 ３８．ＡＴＰ抽出剤が、微生物細胞を溶解する溶解剤である請求の範囲第３３項 〜第３５項記載の試験キット。 ３９．体細胞溶解剤が、非イオン性活性剤である請求の範囲第３３項〜第３５項 記載の試験キット。 ４０．キレート化剤がエチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第３３項〜第３ ５項記載の試験キット。 ４１．キレート化剤がニトリロトリ酢酸である請求の範囲第３３項〜第３５項記 載の試験キット。 ４２．キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢 酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸塩、アルギニン、ハイポザンチ ン、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン 酸塩ガラス、クラウンエーテルタイブ化合物および誘導体およびこれらの前駆体 からなる群から選ばれたものである請求の重囲第３３項〜第３５項記載の試験キ ット。 ４３．ＡＴＰ抽出剤が、トリクロロ酢酸溶液である請求の範囲第３３項〜第３５ 項記載の試験キット。 ４４．ＡＴＰ抽出剤溶液が、エチレンジアミン四酢酸およびキシレノールブルー をも含有する請求の範囲第４３項記載の試験キット。 ４５．ミルク成分から細胞をろ過するためのフィルターをさらに含む請求の範囲 第３３項〜第３５項記載の試験キット。 ４６．（ａ）キレート化剤および体細胞溶解剤を含有する透明化剤；（ｂ）細胞 染色用溶液 とからなるブリードスミアーのような細胞計数試験と共同してミルク試料を試験 するための微生物試験キット。 ４７．透明化溶液が、さらに微粒担体を含有する請求の範囲第４６項記載の試験 キット。 ４８．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第４７項記載の試験キット。 ４９．遠心分離から得られた細胞ペレットの洗浄溶液をさらに含有する請求の範 囲第４６項〜第４８項記載の試験キット。 ５０．体細胞溶解剤が、非イオン性活性剤である請求の範囲第４６項〜第４８項 記載の試験キット。 ５１．キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第４６項〜第 ４８項記載の試験キット。 ５２．キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸である請求の範囲第４６項〜第４８項 記載の試験キット。 ５３．キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢 酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン 、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸 塩ガラス、クラウンエーテルタイブ化合物および誘導体およびこれらの前駆体か らなる群から選ばれたものである請求の範囲第４６項〜第４８項記載の試験キッ ト。 ５４．ミルク成分からの細胞ろ適用フィルターをさらに含む請求の範囲第４６項 〜第４８項記載の試験キット。 ５５．（ａ）キレート化剤を含有する透明化溶液；（ｂ）体細胞を溶解するが微 生物細胞を溶解しない剤を含有する溶液；および（ｃ）ＡＴＰ検出試薬 からなるミルク試料の体細胞試験用に使用する試験キット。 ５６．透明化溶液が、さらに微粒担体を含有する請求の範囲第５５項記載の試験 キット。 ５７．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第５６項記載の試験キット。 ５８．ＡＴＰ検出試薬が、ルシフェラーゼールシフェリンである請求の範囲第５ ５項〜第５７項記載の試験キット。 ５９．体細胞溶解剤が、非イオン性活性剤である請求の範囲第５５項〜第５７項 記載の試験キット。 ６０．キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第５５項〜第 ５７項記載の試験キット。 ６１．キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸である請求の範囲第５５項〜第５７項 記載の試験キット。 ６２．キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢 酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン 、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸 塩ガラス、クラウンエーテルタイブ化合物および誘導体およびこれらの前駆体か らなる群から選ばれたものである請求の範囲第５５項〜第５７項記載の試験キッ ト。 ６３．ミルク成分からの細胞ろ過用のフィルターをさらに含む請求の範囲第５５ 項〜第５７項記載の試験キット。 ６４．（ａ）キレート化剤をミルク試料と混合する工程；（ｂ）ミルク成分から 試料中の細胞を分離する工程、とからなる他のミルク成分から試料中の細胞を分 離濃縮するための液状ミルク試料の処理方法。 ６５．微粒担体をミルク試料と混合する工程をさらに含む請求の範囲第６４項記 載の方法。 ６６．微粒担体が、直径約０，５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第６５項記載の処理方法。 ６７．分離工程が、試料の遠心分離を実施して、細胞ペレットを形成する工程で ある請求の範囲第６４項〜第６６項記載の処理方法。 ６８．細胞の分離工程が、細胞をブロックし、キレート化剤と結合した他のミル ク成分を通過するフィルターで試料をろ過する工程を合む請求の範囲第６４項〜 第６６項記載の処理方法。 ６９．細胞ペレットから上澄みを除去する工程をさらに含む請求の範囲第６４項 〜第６６項記載の処理方法。 ７０．キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第６４項〜第 ６６項記載の処理方法。 ７１．キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸である請求の範囲第６４項〜第６６項 記載の処理方法。 ７２．キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢 酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン 、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸 塩ガラス、クラウンエーテルタイブ化合物および誘導体およびこれらの前駆体か らなる群から選ばれたものである請求の範囲第６４項〜第６６項記載の処理方法 。 ７３．キレート化剤および体細胞溶解剤を含有する水性溶液からなるミルク試料 の試験用透明化剤。 ７４．水性溶液が、さらに微粒担体の懸濁液を含有する請求の範囲第７３項記載 の透明化溶液。 ７５．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第７４項記載の透明化溶液。 ７６．体細胞溶解剤が、非イオン性活性剤である請求の範囲第７３項〜第７５項 記載の透明化溶液。 ７７．キレート化剤が、エチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第７３項〜第 ７５項記載の透明化溶液。 ７８．キレート化剤が、ニトリロトリ酢酸である請求の範囲第７３項〜第７５項 記載の透明化溶液。 ７９．キレート化剤が、ビス−（Ｏ−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ ′，Ｎ′−四酢酸、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル） Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−四酢酸、トランス−１，２−ジアミノシクロヘキサン四酢 酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、クエン酸、アルギニン、ハイポザンチン 、４、５−ジヒドロキシベンゼン−１，３−ジスルフォン酸、ナトリウムリン酸 塩ガラス、クラウンエーテルタイブ化合物および誘導体およびこれらの前駆体か らなる群から選ばれたものである請求の範囲第７３項〜第７５項記載の透明化溶 液。 ８０．微生物起源材料の培養物あるいは抽出物のアリコートおよび懸濁した微粒 担体の透明化溶液。 ８１．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第８０項記載の溶液。 ８２．微生物起源の材料が、ミルクあるいはミルク製品以外の食物材料である請 求の範囲第８０項〜第８１項記載の溶液。 ８３．微生物起源の材料が肉であり、透明化溶液が肉から調製された培養物のア リコートからなる請求の範囲第８２項記載の溶液。 ８４．下記工程からなる微生物起源材料の培養物あるいは抽出物のアリコートか ら細胞を分離濃縮する方法； （ａ）上記アリコートを微粒担体の懸濁液と一緒にして透明化溶液を形成する工 程、 （ｂ）透明化溶液を遠心分離して細胞ペレットを形成する工程。 ８５．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜約１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第８４項記載の方法。 ８６．微生物起源材料が、ミルクあるいはミルク製品以外の食物材料である請求 の範囲第８４項〜第８５項記載の方法。 ８７．微生物起源材料が、肉である請求の範囲第８６項記載の方法。 ８８．微生物起源材料の培養物あるいは抽出物中の予め選択された目標セグメン トを含有する核酸を有することを特徴とする細胞の存在を検出する方法であって 、該方法は、培養物あるいは抽出物のアリコートを微粒担体の水性懸濁液と一緒 にして透明化溶液を形成し、そして透明化溶液を遠心分離して細胞ペレットを形 成することにより培養物あるいは抽出物から細胞ペレットを得ることからなりた だし、微生物起源の材料が液状ミルク試料である場合には、該透明化溶液はさら にキレート化剤を含有し；第１の溶液で得られたペレットからの細胞を懸濁し、 第１の溶液を処理して細胞の他の成分から細胞の核酸を実質的に単離することな く細胞からの核酸増幅用第２の溶液を得；予め選択された目標セグメントがペレ ットから懸濁された細胞中に存在する場合にのみ第２の溶液の核酸を核酸増幅工 程にかけて所定の増幅された核酸セグメントを得；そして増幅工程後に所定の増 幅されたセグメントの存在のために核酸を検定する上記方法。 ８９．微生物起源材料がミルクであり、そして該材料の培養物が液状ミルク試料 である請求の範囲第８８項記載の方法。 ９０．キレート化剤が、ＥＤＴＡおよびニトリロトリ酢酸からなる群から選ばれ たものである請求の範囲第８９項記載の方法。 ９１．微生物起源材料が、ミルク以外の食物材料である請求の範囲第８８項記載 の方法。 ９２．食物材料が、肉である請求の範囲第９１項記載の方法。 ９３．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍである請求の範囲第８８項〜 第９２項記載の方法。 ９４．増幅工程が、ＰＣＲ方法である請求の範囲第８８項〜第９２項記載の方法 。 ９５．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍである請求の範囲第９４項記 載の方法。 ９６．ＰＣＲ増幅工程におけるＤＮＡ合成を触媒する酵素が、ＴａｑＤＮＡポリ メラーゼである請求の範囲第９４項または第９５項記載の方法。 ９７．検出される細胞が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐである請求の範囲第９４ 項〜第９６項記載の方法。 ９８．微生物起源材料の培養物または抽出物中に、予め選択された目標セグメン トを含有する核酸を有することを特徴とする細胞の検出用キットであって、微粒 担体および、微生物起源材料の培養物が液状ミルク試料である場合には、キレー ト化剤と、；予め選択された目標セグメントが該培養物または抽出物の細胞中に 存在する場合にのみ所定の、増幅された核酸セグメントを提供する核酸増幅工程 に必要な酵素およびプライマまたはプローブと、；および増幅工程後に該所定の 、増幅されたセグメントのための核酸検定に必要な試薬とからなる上記キット９ ９．液状ミルク試料中の細胞検出用である請求の範囲第９８項記載のキット１０ ０．キレート化剤が、ＥＤＴＡおよびニトリロトリ酢酸からなる群から選ばれた ものである請求の範囲第９９項記載のキット。 １０１．ミルク以外の食物材料の培養物または抽出物中の細胞検出用である請求 の範囲第９８項記載のキット。 １０２．食物材料が、肉である請求の範囲１０１項記載のキット。 １０３．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第９８項〜第１０２項記載のキット。 １０４．実施される増幅工程が、ＰＣＲ方法である請求の範囲第９８項〜第１０ ２項記載のキット。 １０５．微粒担体が、直径約０．５μｍ〜１．５μｍのポリスチレンビーズであ る請求の範囲第１０４項記載のキット。 １０６．ＰＣＲ増幅工程においてＤＮＡ合成を触媒する酵素が、ＴａｑＤＮＡポ リメラーゼである請求の範囲第１０４項または第１０５項記載のキット。 １０７．検出される細胞が、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｐである請求の範囲第１ ０４項〜第１０６項記載のキット。