JPH06503179A

JPH06503179A - 毛管電気泳動法の緩衝液

Info

Publication number: JPH06503179A
Application number: JP5505177A
Authority: JP
Inventors: チェン、アルバート　フータイ
Original assignee: ベックマン　インスツルメンツ　インコーポレーテッド
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-07-31
Publication date: 1994-04-07
Also published as: AU2424592A; WO1993005389A1; CA2094244A1; ATE147859T1; DE69216807T2; EP0556352B1; EP0556352A1; DE69216807D1; AU657164B2; ES2098523T3; US5259939A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】毛管電気泳動法の緩衝液発明の分野本発明は概してサンプルの分析、特に毛管ゾーン電気泳動法による分析に関するものであり、より詳細に述べるならば開放（ｏｐｅｎ）毛管ゾーン電気泳動に使用する動的コーティング緩衝液に関するものである。

発明の背景発明の背景に示される論文は引例によってここに挿入される。

毛管ゾーン電気泳動法（“ＣＺＥ”）は、荷電物質の迅速かつ効率的分離を可能にする方法である。概してＣＺＥは、サンプルの毛管、すなわち約５ないし２０００ミクロンの内径をもつ管への導入、及びその毛管に電場を与えることを含んで成る。電場の電位はサンプルを毛管を通って引っ張り、その構成成分に分離する。サンプルの各構成成分は独自の個々の電気泳動移動度をもっている；より大きい易動度をもつ構成成分は、より遅い移動度をもつものよりも速く毛管中を移動する。その結果、サンプルの構成成分は毛管を移動する間に毛管中で別々の構成成分に分かれる。オン−ライン検出器を用いてその分離を連続的にモニターし１分離したゾーンに基づいて種々の構成成分に関するデータを提供することができる。

ＣＺＥは毛管カラムの内容に基づいて概ね２つのカテゴリーに分けることができる。“ゲル”ＣＺＥでは、毛管に適したゲル、例えばポリアクリルアミドゲルが充填される。サンプル構成成分の分離は、一部はゲルマトリックスを通って移動する構成成分の大きさ及び電荷によって決まる。“開放”ＣＺＥでは、毛管に電気伝導性緩衝液が充填される。毛管をイオン化すると、負に荷電した毛管壁は緩衝液から陽イオン層を引き付ける。電位の影響下でこれらイオンが陰極に流れると、電気的中性を維持するためにバルク溶液（緩衝液及び分析すべきサンプル）もこの方向に流れなければならない。

この電気浸透流（ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｄｏｓｍａｔｉｃ　ｆｌｏｗ）は電荷には無関係に中性種も・イオン種も陰極の方へ動かす固定速度成分を作り出す、開放ＣＺＥ中の緩衝液は伝導及び拡散に対しては、ゲルＣＺＥに用いられるゲルと同様に安定である。よって、開放ＣＺＥにおいても、ゲルに基づいたＣＺＥと全（同様な分離が得られる。

主に溶融シリカが毛管材料として用いられる、というのはそれはＣＺＥにおいて用いられる比較的高い電圧に耐えることができ、溶融シリカ毛管の内壁がイオン化されると負電荷を生成し、それは所望の電気浸透流をひきおこすからである。

しかしながら毛管の内壁のイオン化は、蛋白性物質の分離に関しては問題がある。蛋白質はへテロ−多価電解質である（すなわち分子内に正に荷電した部分と負に荷電した部分がほぼ同数あり１分子そのものは中性電荷をもつ）、こうして、イオン化された場合、成る蛋白質種は正味正電荷分布をもつことができ、そのためその蛋白質種はイオン化された内壁に非常に強（吸着される。この吸着はＣＺＥ内にひろがる人工ゾーンを作り出し、その結果決定的でない、間違った、又は理解できない結果が得られる。

電解質緩衝液のｐＨはＣＺＥによる分離の効率及び分離能に劇的影響を及ぼす。

ｐＨのわずかの変化でさえ分離に大きい影響を与える。しかしながら未処理の溶融シリカ毛管ではこの事実は両刃の剣である、なぜならば中性に近いｐＨ以外のｐＨは、毛管の内壁に負に荷電したシラノール基を生成するからである。こうして、これまでは、未処理の溶融シリカ毛管は広範囲のｐＨ値で用いることはできなかった。

この問題を解決するために提案された一つの試みは、毛管の内壁を処理又は“コーティングして、電圧をかけたときに電気浸透流が減るようにすることであった。これはこれで、蛋白質の毛管への吸着を減らすであろう、血清蛋白質の分析のためにはグリコール変ルゲンソン（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｌ）及びルカス（Ｌｕｋａｃｓ、に、Ｄ、）著“毛管ゾーン電気泳動法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｚｏｎｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）　”、５ｃｉｅｎｃｅ　２２２巻：　２６６−２７２ページ、１９８３、参照、米国特許第４６８０２０１号は、壁と共有結合する第一の官能基と、重合可能の第二の官能基とを有する二官能性化合物を含む被覆毛管について述べている。Ｈｊｅｒｔｅｎ、　Ｓ、著“高性能電気泳動による除去及び溶質吸着（）Ｉｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈ。

ｒｅｓｉｓ　ａｎｄ　５ｏｌｕｔｅ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　）　”　、Ｊ、Ｃｈｒｏｍ、　５４７巻、１９１−１９８ベージ、１９８５、及びコブ（Ｃｏｂｂ、　Ｋ、　Ａ、　）ら、“加水分解抵抗性表面構造をもつ毛管内における蛋白質の電気泳動分離（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ　ｗｉｔｈ　）ｌｙｄｒｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ　５ｔａｂｌｅ　５ｕｒｆａｃｅ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）″、　Ａｎａｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　６２巻、２４７８−２４８３ページ、１９９０．その他の共有結合する被覆物は米国特許第４９３１３２８号及びＰＣＴ出願第１’１０８９／１２２２５号に記載されている。参照：スウェドベルグ（Ｓｗｅｄｂｅｒｇ、　Ｓ、Ａ、）著”新規の毛管システムを用いる高性能毛管電気泳動法における蛋白質の挙動の特徴（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｅｈａｖｉｏｒ　ｉｎ　Ｈｉｇｈ−Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　Ｃ：ａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）　”　、　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１８５巻、５７−５６ページ、１９９０）　（以後は“スウェドベルグどする）。

同時に、被覆溶融シリカ毛管は保存寿命が比較的短く、それらの被覆物は予測できない方法で“分解する“傾向がある。予測不可能という雰囲気は、多数のサンプルを頻繁に分析する状況下では容認できない、被覆毛管カラム使用時の実際的制限は別としても、それにかかる費用を考えても被覆毛管カラムは非現実的なものである。

市販のＣＺＥ分析器に使用できる被覆毛管カラムは約＄　９０．００である。この金額のうち約＄１．００　が溶融シリカ毛管そのもののコストである。このように市販カラムのコストの大部分は被覆そのものにかかる。被覆カラムは平均して約５０ないし１００回の試験後には品質が悪化し始める。このように、これらの使用は高くつ（。

蛋白質吸着の問題に対して提案されたもう一つの解決策は、サンプル中の蛋白質成分の等電点（ｐｒ）より大きいｐＨをもつ緩衝液を用いることである。よく知られているように、ｐＨが１）Ｉに等しいとき、その分子の正の部分と負の部分とはバランスする。同様にして、ｐＨがｐＩより大きいときは負の部分が優勢となり、ｐＨがｒ＋Ｉより小さいときは正部分が負部分より優勢となる。例えばアルブミンのｐＸは４．５である；したがってｐ）１４．６では、アルブミンの負に荷電した部分及び正に荷電した部分はアルブミン分子表面に等しく分布し、その全体的電荷は中性である。しかしながらｐＨが等電点を超えて上がった場合には負に荷電した部分が優勢になり、正味電荷は負になる。こうして、高ｐＨ緩衝液の影響下で、サンプル中の全蛋白質種は負電荷をもち、負に荷電した壁から追い払われる。これはひいてはそれらの表面吸着を回避し、又は少なくとも著しく減少させる。しかしながら大きいｐ）ｌ−ｐＩ差は蛋白質の構造変化又は加水分解さえもおこし得る。例えばヒト血清蛋白質などの複雑な混合物を未処理溶融シリカ毛管中で５−８のｐＨ範囲をもつ緩衝液を用いて電気泳動した場合、全サンプルゾーンの再現性をもたない移動がおきた。参照ニラウェル（Ｌａｕｅｒ、　Ｈ，Ｈ，）及びマク′マニギル（ＭｃＭａｎｉｇｉｌｌ、　Ｄ　）著”未処理溶融シリカ管中における蛋白質の毛管ゾーン電気泳動（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｚｏｎｅ　Ｅ］、ｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅＳｉｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｕｎｔｒｅａｔｅｄ　Ｆｕｓｅｄ　５ｉｌｉｃａ　Ｔｕｂｉｎｇ　）　＋、Ａｎａｌ、　Ｃｈｅｗ。

５８巻、１６６−１６９ページ、　１９８６　。

未処理溶融シリカ毛管壁への蛋白質の吸着は、蛋白質のカチオン部位と壁のシリケート部分とのイオン交換的相互作用によるものであると理論づけられている。

参照：ジョルゲンソン著“毛管電気泳動法（Ｃａｐｉｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）”１３章　電気泳動法における新しい方向（Ｎｅｗ里：巴巨匹」Ｌ旦旦由］吐肛」お口悦堕聾）、ＡＣ５Ｓｙｍｐ、　Ｓｅｒ、　３３５、１９１１７　（Ｊｏｒｇｅｎｓｏｎ、　Ｊ、　Ｗ、　＆　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｍ、編）。

よって、蛋白質吸着をへらすために高塩類緩衝状態を用いることが示唆された。

参照ニラウェル＆マクマニギル、Ｔｒｅｎｄｓ　Ａｎａｌ、　Ｃ：ｈｅｍ。

５巻、１１ページ（１９８６）　、　シかしながら緩衝液の塩類濃度の増加は毛管の伝導度を高める効果を有し、その結果毛管内の熱が著しく増加する。温度が上昇すると移動ゾーンは拡散し、その結果ゾーンの分離能は低下する。このような熱生成を避けるためには、毛管にかける電位を太き（下げなければならない。

しかしながらこれはサンプル分析のために必要な時間が延びるという不都合な効果をもたら溶融シリカ毛管への蛋白質吸着を最小にする目的でアルカリ金属塩が緩衝液に加えられた。グリーン（Ｇｒｅｅｎ、　Ｎ、　Ｓ、）及びジョルゲンソン著°″毛管ゾーン電気泳動法において緩衝液へのアルカリ金属塩添加によって溶融シリカへの蛋白質吸着を最小にする方法（Ｍｉｎｉｍｉｚｉｎｇ　Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｎ　Ｆｕｓｅｄ　５ｉｌｉｃａ　ｉｎ　ＣａｐｒｉｌｌａｒｙＺｏｎｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｂｙ　ｔｈｅ　Ａｄｄｉｔｉｏｎ　ｏｆ　Ａｌｋａｌｉ　Ｍｅｔａｌ　５ａｌｔｓｔｏ　ｔｈｅ　Ｂｕｆｆｅｒｓ）　”　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、　４７８巻、６３−７０ページ（１９８９）　（以後は°゛グリーン゛する）。ｐＨ９，０の緩衝液にに、ＳＯ２を加えると、普通はｐＨ９，０の緩衝液で著量の吸着を示す２蛋白質（リゾチーム及びトリプシノーゲン）がほとんど吸着を示さないことが報告された。同様に、双性イオン塩類もこのような緩衝液に加えられた。ビジー（Ｂｕｓｅｙ、　Ｍ、Ｍ、　）及びジョルゲンソン“高濃度の双性イオン塩類を含む緩衝液における蛋白質の毛管電気泳動法（ＣａｐｉｌｌａｒｙＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　Ｂｕｆｆｅｒｓ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　Ｈｉｇｈ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｚｗｉｔｔｅｒｉｏｎｉｃ　５ａｌｔｓ）”　Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、　４８０巻、３０１−３１０ページ、１９ｇ９゜広範囲のｐＨ値、すなわちｐＨ３，０ないし１１．０にわたってサンプル成分を分離するためには先行方法はすべて不十分である。これは特に未処理（すなわち未被覆）カラムにおいて強調される。記載のように、分離すべきサンプルの各構成成分は独自の等電点をもっている。そこで、緩衝液のｐＨが例えば７．０で、２構成サンプルの等電点がそれぞれ２．０及び４．０である場合、生成した電気泳動図は２嘴成成分間の分離を示さないかも知れない。これは、緩衝液のｐＨがそれらの正当な分離を妨げ、２構成成分の同時移動が起り、それらは電気泳動図では単一のピークとしてあられれるからである。

異なるｐＨ値をもつ種々の緩衝液系の使用は、その分析に複数の変数を加えるという不都合な効果をもつ。すなわち酸性ｐＨ（約−４，０以下）緩衝液はアルカリ性ｐＨ（約８．０以上）緩衝液とは異なる仕方でサンプル構成成分と“相互作用する”。　理想的には、成る巾のｐＨ値をもち得る単一の緩衝系を使用して、内部変動性を無（すべきある。

現在の被覆毛管カラムは、上記の種類のｐＨ巾、すなわち約ｐＨ３，０から約ｐＨ１１，０までの巾をもつ緩衝液の苛酷さに対しては、予測不能で且つ不安定であるため耐えることができない、未処理カラムにはこの問題はないが、サンプル構成成分の吸着に関して固有の問題がある。そこで必要なのは、開放毛管ＣＺＥに関連して用いることができ、未処理毛管へのサンプル成分の吸着を顕著に減らす、成るｐＨ範囲に使用できるＣＺＥ緩衝液である。

発明の概要本発明は蛋白質、ペプチド及び酵素のＣＺＥ分析において有用な動的コーティング緩衝液を提供することによって上記の必要を満たす。ここに用いられる“動的コーティング緩衝液”とは、未処理溶融シリカ管と化学的に反応でき、少な（とも１つのイオン化サンプル成分と溶媒和によって物理的に相互作用することができ、（１）少なくとも２つの解離定数（“ｐＫａ”）及び（２）高イオン強度をもつことを特徴とする、少なくとも１つの作用物質を含んで成るｐ）（緩衝溶液である。ここに用いられる用語”溶媒和”とは、作用物質とサンプル成分とが、作用物質が変化したり又は作用物質がすンブル成分の化学的特性を変えたりするような方法で化学的に反応することな（、その２つの分子（作用物質とサンプル成分）が物理的に相互作用して１つの分子として振る舞うことを意味する：　“ 解離定数”又はｐＫａは、作用物質が１つのプロトンを完全に失うｐＨを意味する；　“高イオン強度”は作用物質が最低０．２Ｍの（容積）モル濃度をもつことを意味する。

それだけで、又は組み合わせて動的コーティング緩衝液として用いられる適した作用物質の例は、燐酸（Ｈ３ＰＯ４）、少な（とも１つのプロトンをもつアルカリ金属燐酸塩、約１ないし約８の炭素原子をもつモノ−、ジー、トリー、及びテトラ−アルキル　アンモニウムホスフェート、約１ないし約２０の炭素原子をもつアルキルホスフェート、炭酸（Ｈ−Ｃ０５）、少な（とも１つのプロトンをもつアルカリ金属炭酸塩、約１ないし約８の炭素原子を含むモノ−、ジー、トリー、及びテトラ−アルキルアンモニウムカルボネート、及び約１ないし約２０の炭素原子をもつアルキルカルボネートである。

動的コーティング緩衝液は、酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロボンスルホン酸、Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）エチルコグリシン、トリス−（ヒドロキシメチル）アミノメタン、シクロへキシル　アミノエタン−スルホン酸、トリエチルアミン、ジメチルアミン、炭素原子約１２個までのアルキルアミド、Ｎ−２−ヒドロキシエチル　ピペラジン− Ｎ’−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’　−ビス（２−エタンスルホン酸）、３−（［トリス−（ヒドロキシメチル）メチルコアミノ）プロパンスルホン酸、２−（［（ヒドロキシメチル）メチルコアミノ）エタンスルホン酸及び尿素も含むことができる。

好適には作用物質のモル濃度は約０．２Ｍないし約１．０Ｍ、より好適には約０．４Ｍないし約０．６Ｍ、最も好適には約０．５Ｍである。ＣＺＥ分析の温度範囲は約４℃ないし約６０℃で好適に行われ、大体周囲（室内）温度が最も好適である。動的コーティング緩衝液のｐＨ範囲は約３．０ないし約１１．０が好適である。

特に好ましい実施態様において、動的コーティング緩衝液はその緩衝液の所望ｐＨによって、０．５Ｍ燐酸−ナトリウム、０．５Ｍ燐燐酸ナナトリウムび０．５Ｍ　燐駿三ナトリウムを必要に応じて組み合わせて含んでなる。すなわち緩衝液の所望ｐＨが約４．０と約９．０との間であるならば、ＮａＨｔ　ＰＯ４部分とＮ　ａ　＊　ＨＰ　０４部分とを混ぜることによってそのｐＨ値を得る；緩衝液の所望ｐＨが約９．０より大きい場合は、Ｎａｓ　ＨＰＯ４部分とＮａｓ　ＰＯ４部分とを混ぜてそのｐＨ値を得る。

図面の簡単な説明図１は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ５，０、における４種類のモデル蛋白質及び中性マーカー（ＤＭＦ）の電気泳動図である２図２は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ６，０、における図１の４種類のモデル蛋白質及びマーカーの電気泳動図である；図３は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ７，０、における図１の４種類のモデル蛋白質及びマーカーの電気泳動図である；図４は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ９，０、における図１の４種類のモデル蛋白質及びマーカーの電気泳動図である；図５は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ１０，０、における図１の４種類のモデル蛋白質及びマーカーの電気泳動図である；図６は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ７，０、における４種類のモデル蛋白質及び中性マーカー（ＤＭＦ　）の電気泳動図である；図７は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ９，０、における図６の４種類のモデル蛋白質及びマーカーの電気泳動図である；図８は、１つは実験１で他方は実験９により、動的コーティング緩衝液、ｐＨ７，０，における図６の４種類のモデル蛋白質及びマーカーの２つの電気泳動図の再現性のある重なりを示す；図９は、動的コーティング緩衝液、ｐＨ７，０における血清蛋白質及び中性マーカー（ＤＭＦ　）の電気泳動図である；図１Ｏは、動的コーティング緩衝液、ｐＨ８，０における血清蛋白質及び内部マーカーの電気泳動図である；図１１は、脱脂乳の蛋白質分離を示す電気泳動図である；図１２は、低脂肪（２％）乳の蛋白質分離を示す電気泳動図である；図１３は、全乳の蛋白質分離を示す電気泳動図である；図１４は、粉乳の蛋白質分離を示す電気泳動図である；図１５は、各実験間に洗浄及び再コンディショニング工程を行わなかった場合のＢ組モデル蛋白質の最初の実験（太１１［）及び３回目の実験（点線）の電気泳動図である；図１６は、各実験間に洗浄及び再コンディショニングを行わなかった場合のＢ組モデル蛋白質の最初の実験（太線）及び５回目の実験（点線）の電気泳動図である：図１７は、各実験間に洗浄及び再コンディショニングを行わなかった場合のＢ組モデル蛋白質の最初の実験（太線）及び７回目の実験（点線）の電気泳動図である；図１８は、各実験間に洗浄及び再コンディショニングを行わなかった場合のＢ組モデル蛋白質の最初の実験（太線）及び９回目の実験（点線）の電気泳動図である；図１９は、各実験間に洗浄及び再コンディショニングを行わなかった場合のＢ組モデル蛋白質の７回目の実験（太い線）及び９回目の実験（点線）の電気泳動図である；図２０は、比較緩衝液を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２１は、比較緩衝液を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２２は、比較緩衝液を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２３は、比較緩衝液を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２４は、比較緩衝液を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２５は、比較緩衝液を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２６は、比較緩衝液を用いたＡ組モデル蛋白質の電気泳動図でである；図２７は１図２６の条件を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図２８は、被覆カラム及びｐＨ６，０の比較緩衝液を用いたＡ組モデル蛋白質の電気泳動図である；図２９は、図２８、　ｐＨ７，０の条件を用いたＡ組モデル蛋白質の電気泳動図である；図３０は、図２８の条件を用いた血清蛋白質の電気泳動図である；図３１は、図２９の条件を用いた血清蛋白質の電気泳動図である。

好ましい実施態様の詳細な説明イオン化で、未処理溶融シリカ毛管の内壁はポリシラノール基を露出する。これは図式的に次のようにあられされる（図式的にあられし７た蛋白質構成成分を含む）：よって、緩衝液のｐＨが正味正電荷をもつ蛋白質成分を生成するとき、これらの成分はシラノール基に結合し、同時に有害な効果をもたらす。

出願人は動的コーティング緩衝液を電解質緩衝液として用いることによってこれらの問題を回避する。動的コーティング緩衝液は未処理溶融シリカ材料と化学的に反応することができ、少な（とも１つのイオン化したサンプル成分と溶媒和によって物理的に相互作用することができ、（１）少なくとも２つの解離定数（“ ｐＫａ”）をもつこと及び（２）高イオン強度をもつこと（すなわちその作用物質のモル濃度は最低的０．２Ｍである）を特徴とする、少なくとも１つの作用物質を含んで成るｐＨ緩衝溶液である。

作用物質の例は、燐酸、少な（とも１つのプロトンをもつアルカリ金属燐酸塩、約１ないし約８の炭素原子をもつモノ−、ジー、トリー、及びテトラ−アルキル　アンモニウムホスフェート、約１ないし約２０の炭素原子をもつアルキルホスフェート、炭酸、少なくとも１つのプロトンをもつアルカリ金属炭酸塩、約１ないし約８の炭素原子を含むモノ−、ジー、トリー、及びテトラ−アルキルアンモニウムカルボネート、及び約１ないし約２０の炭素原子をもつアルキルカルボネートである。

燐酸は作用物質のはたらきの例となるものである；しかしながら本発明は作用物質として燐酸に限るものではない、燐酸は３つの明らかな解離定数をもつ、すなわち燐酸は３つの特異的な異なるｐＨ値でプロトンを失う：ｆＨ！！！２ＪｕＡ　旦ム互Ｈ＊　ＰＯ，約２．１以下のｐＨではプロトンは失われないＨ，ＰＯ，−２，１ＨＰ０４″　６・８ＰＯ４’　１０．８杆部合なことに、約１．９以下のｐＨでは未処理溶融シリカは荷電表面をもたない。それだけで、荷電サンプル成分の吸着は問題にはならない。約２．１より大きいｐＨでは、緩衝液からの燐酸は、下に図式的に示すように、シラノール基とも、正に荷電したサンプル成分とも相互作用することができる：よって、作用物質は毛管を“被覆”し、イオン化した蛋白質成分を“保護”するようにはたらく。このため、蛋白質の正に荷電した゛パッチ゛が毛管へ吸着される傾向は著しく減少する、なぜならば作用物質はシラノール基とサンプル成分との間に全体的に負電荷のバリアを与えるからであり、また作用物質はサンプル成分が全体的正味負電荷をもつようにするからである。

作用物質のモル濃度は好適には約０．２Ｍないし約１．０Ｍで、より好適には約０．４Ｍないし約０．６Ｍで、最も好適には約０．５Ｍである。作用物質のモル濃度（“Ｍ”）が増加又は減少するにつれて。

分析が行われる温度もそれぞれ上昇又は低下する。好適には分析のための温度範囲は約４℃ないし約６０℃である。普通はＣＺＥ分析は室温で行われる。

本発明の緩衝液は、作用物質の官能性挙動を妨害しないその他の材料を含むことができる。緩衝液中に含まれる材料の例は酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロボンスルホン酸、Ｎ−［トリス−（ヒドロキシメチル）エチルコグリシン、トリス−（ヒドロキシメチル）アミツメクン、シクロへキシル　アミノエタン−スルホン酸、トリエチルアミン、ジメヂルアミン、炭素原予約１２＠までのアルキルアミド、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎｏ−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２− エタンスルホン酸）、３−（［１−リス−（ヒドロキシメチル）メチルコアミノ）プロパンスルホン酸、２−（［（ヒドロキシメチル）メチルコアミノ）エタンスルホン酸及び尿素である。

好適には作用物質又は作用物質の組み合わせが動的コーティング緩衝液の唯一の成分である。発明の特に好ましい実施態様においては燐酸−１二及び三ナトリウムが用いられる。燐酸−ナトリウム（ＮａＨ，ＰＯ４）は約４．０　のｐＨをもつ；燐酸二ナトリウム（Ｎａ、ＨＰＯ４）は約９．０のｐＨをもつ；燐酸三ナトリウム（Ｎａ！ＰＯ４）は約１１．０のｐＨをもつ。これらの各々のモル濃度は０．５Ｍであるのが最も好適であるが、各々で異なるモル濃度も用いられる。しかしながらモル濃度が同一である場合、ｐｉ−ｔはより効率的に操作される。すなわち緩衝液の所望ｐＨが約４．０と約９．０との間であるならば、ＮａＨｔＰＯ４部分とＮａ＊ＨＰＯ４部分とを混ぜ合わせて所望ｐＨに達せしめる；緩衝液の所望ｐＨが約９．０と約１１．０との間である場合は、Ｎａ−ＨＰＯ４部分とＮａ２ＰＯ４部分とを混ぜ合わせて所望ｐＨに達せしめる。

所望ｐＨを得る上記の方法は、作用物質以外のｐＨ緩衝液に利用することができる。これは、公知のｐＫａをもつｐＨ緩衝液を選択し、所望ｐＨが得られるまで、これを公知のｐＫａをもつ作用物質と混ぜ合わせろことから成る。各々が異なるｐＨ値をもつ一連の動的ｐ）（緩衝液を含む動的りＨ緩衝液キットも有用である；このようなキットがあれば、研究者はそのキットから、関心のあるｐＨ値をもつ動的コーティング緩衝液を選択することができる。

例ここに開示される発明の好ましい実施態様に関する下記の例は説明のためのものであり、発明の開示又は後記の請求の範囲を制限するとみなすべきものではない： ■、材料及び方法Ａ８毛管電気泳動操作法サンプルの毛管電気泳動はベックマン　インスッルメント社の高性能毛管電気泳動装置（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｉｎｃ、、フラートンＣＡ、、ＵＳＡ、型番号筒３５７５７５１で行われた。データ分析はＳｙｓｔｅｍＧｏｌｄ”ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、　）で行われた。上記の毛管電気泳動装置は、オン−ライン検出及び定量のための内蔵された２００．２０６．２１４．２８０及び３４０　ｎｍのバンド巾の狭いフィルターを含む。電気泳動は内径２０μｍ、長さ２７ｃｍ　（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、　Ｉｎｃ、）、又は内径２０μｍ及び２５μｍ、長さ２５ｃｍ　（Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、　Ｉｎｃ、、フェニックス、ＡＺ、、ＵＳＡ、部品番号ＴＳＰ０２０３７４及びＴＳＰＯ２５３７４）の溶融シリカ毛管で行われた。検出窓はカラム出口から約６．５ｃｍのところにある。

サンプルは上記の毛管電気泳動装置の入口トレー上に置かれ、約２０ないし約４０秒間の噴射圧によって毛管内に挿入される。下記の例において特に記載がない限り、実験と実験の間に毛管をカラムの２倍量の１．ＯＮ水酸化ナトリウム（塩基）及び水（０，３分間、高圧）で洗い、その後５−１Ｏ倍量の動的コーティング緩衝液で再コンディショニングした（１．５ないし２．５分、高圧）。

２１０ポルト／ｃｍと４５０ボルト／ｃｍとの間のカラム電圧勾配を用いてサンプル成分の分離を行った。

Ｂ、動的コーティング緩衝液燐酸−ナトリウム（ｐＨ４，０，０，５Ｍ　）　、燐酸二ナトリウム（ｐＨ９，０，０，５Ｍ　）及び燐酸二ナトリウム（ｐＨｔｔ、ｏ、０．５Ｍ）はシグマ　バイオケミカル社のものであった。各々の塩から緩衝液を作り、ｐＨ値５．０．６．０．７．０．８．０．９．０及び１０をもつ動的コーティング緩衝液を得た。

Ｃ，モデル蛋白質モデル蛋白質Ａ組はウシ肺トリプシン　インヒビター（ｐＩ＝１０．５．　ＭＷ＝５００　）　（これの電気泳動図のピークは図中に“１”として引用される）、チトクロームｃ　（ｐ　Ｉ　＝１０．６５．　ＭＷ　＝１２．５００）（”２ ”）、炭酸脱水酵素（ｐ　Ｉ　＝５．９．　ＭＷ　＝２９．０００）　（“３” ）、及び大豆トリプシンインヒビター（ｐＩ＝４．５、ＭＷ　＝２１，０００）（”４”　）から成る。モデル蛋白質Ａ組は５ｅｒｖａ　ＢＬｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から得た（ウェストベリー、Ｎ、Ｙ、、ＵＳＡ、製品番号３９２０９）　。

Ｂ組のモデル蛋白質はシグマ　バイオケミカル社（セントルイス。

ＭＯ，ＵＳＡ）から入手した。そしてウマ心臓ミオグロブリン（ｐＩ＝７．０、ＭＷ　＝、　１７．　Ｓｏｎ　、シグマ製品番号Ｍ１８８２）　（５″）、コナルブミ’Ｊ　（ｐ　Ｉ　＝６．６．　ＭＷ　＝７７．０００；シグマ製品番号Ｃ０７５５）（“６”）、ベーターラクトグロブリンＢ（ｐＩ＝５．４、Ｍ、Ｗ、　＝３５、０００　、シグマ製品番号Ｌ１１００５）（“７″）及びベーターラクトグロブリンＡ（ｐＩ＝５．２、Ｍ、Ｗ、　＝３５，０００；シグマ製品番号　し７８８０）　（“８″）から成っていた。

モデル蛋白質を７５１　塩化ナトリウム、２０　ｍＭ燐酸カリウム、０．０１　％アジ化ナトリウムを含む　希緩重液（ＰＢＳ）ｐＨ７，０に溶解した。各モデル蛋白質の濃度は０．３ないし１．０　ｍｇ／ｍｌであった。０．Ｏ１％Ｖ　／　Ｖのジメチルホルムアミド（“ＤＭＦ”）をＥＯＦマーカーとして希緩重液に加えた。すべての化学物質は少なくともＡＣＳグレードであった。

Ｄ、血清サンプル血清蛋白質の標準対照サンプルをベックマン　インスツルメント社（フラートン、ＣＡ）から得た。血清サンプルを上記の希緩重液で１対２０の比（血清サンプル対希釈剤）で希釈した。上記のようにＤＭＦを、希釈したサンプルに加えた。

Ｅ、牛乳サンプル牛乳の主な蛋白質成分であるβ−カゼイン、α−ラクトアルブミン、β−ラクトグロブリンＢ、α−カゼイン、及びβ−ラクトグロブリンＡを４種類の牛乳で分離した：脱脂；低脂肪（２％）；全乳；及び粉末。牛乳サンプルは食品雑貨店から購入し、冷凍した。粉乳は水道水で調製した。牛乳サンプルをサンプル１部に対してベックマンＩＣＳ”希釈剤５部の比で希釈した（ベックマン　インスツルメント社）。動的コーティング緩衝液は、カゼイン蛋白質の凝集を防止するために緩衝液に尿素（最終濃度：４Ｍ）を加えたことを除けば上記と同じであった。

上記のように希釈したサンプルにＤＭＦ例Ｉ広いｐＨ範囲にわたる動的コーティング緩衝液の分析：モデル蛋白質Ａ組図１−５はそれぞれｐＨ５，０，６，０、７，０，９，０及び１Ｏ８０の０．５Ｍ　燐酸ナトリウムを用いるモデル蛋白質Ａ組の分離の電気泳動図である。各実験の条件は下記のようである：毛管・　′又　さ　ｖ／ｃＬＱＡ１　２５μｍ　２１ｃｍ　３５０　３４２　２５μａ＋　２１ｃｍ　３５０　４６　−３　２５μｍ　２１ｃｍ　３５０　４６４　２５ｕｍ　２１ｃａ＋　３５０　７９５　２５μｍ　２１ｃｍ　２２０　６９吸光度は各実験で２００止であった。全ｐＨレベルですぐれた分離に達したことがわかる。

興味深い傾向がいくつかみられる。予想されるように、ｐＨ７，０ではウシ肺トリプシンインヒビター（１、ｐ　Ｉ　＝１０．５）及びチトクロームｃ（２、ｐ　Ｉ　＝１０．６５　）が、それらのｐＩ値に基づいて、中性マーカーＤＭＦより早（移動する。炭酸脱水素酵素（３、ｐＩ＝５．９）はｐＨ５，０ではＤＭＦマーカーより早く移動し、ｐＨ６，０ではそのマーカーに接近して移動すると予想される。しかしながら炭酸脱水素酵素はｐＨ５，０及びｐＨ６，０ではＤＭＦマーカーよりずっと遅（移動する。ｐＨ９，０ではチトクロームＣはＤＭＦマーカーの後から移動する；しかしながら予想ではｐＨ９，０ではチトクロームＣはマーカーの前になって移動するはずである。同じタイプの異常な結果が１）ＨｌＯ，０でチトクロームＣ及びウシ肺トリプシンインヒビターで証明されている。

特別の理論に束縛された（はないが、その異常な結果は蛋白質の正に荷電した部分の緩衝液対イオンによる溶媒和によって説明される、と出願人は仮定した。ここに用いられる用語”溶媒和”は、作用物質とサンプル構成成分とが、作用物質がそれ自体変化したりすンブル構成成分の化学的特性を変えたりするような仕方で化学的に反応することな（、これら２つの分子が１つの分子として振る舞うように物理的に相互作用することを意味する。こうし、て溶媒和効果は蛋白質の等電点を顕著に変えることができる。すなわち作用物質は、荷電蛋白質と物理的に相互作用することによって、蛋白質の電荷密度を変化させ、その結果蛋白質の移動は予想又は仮定される移動から、相対的に中性マーカーの移動の方に変わり得るめである。

これらの結果は、Ａ粗蛋白質の分離が、未処理毛管カラム中で種々のｐＨ値で、特に中性ｐＨ７，０で実現することを示している。

例■ 狭いｐ■範囲における動的コーティング緩衝液の分析＝Ｂ組モデル蛋白質図６−７はそれぞれ０．５Ｍ　燐酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７，０及び９．０によるモデル蛋白質８組の電気泳動図である。各実験の条件は次のようであった：毛管・　さ　ｖ／ｃｍ　Ａ６　２０μｍ　２２ｃｍ　４１０　７３７　２０μｍ　２２ｃｍ　４１０　９６吸光度は各実験で２００　ｎｍで測定された。これらのｐＨ値で効率的分離が実現することがわかる。β−ラクトグロブリンＢ及びＡ（ピーク７及び８、ｐＩ＝５．３及び５．１）の明らかな分離が注目される。これらの結果は、ｐＩＩＯ２２をもつ蛋白質種をここに開示せる動的コーティング緩衝液を用いて分離することができることを示している。

８組モデル蛋白質の９連続実験（既述のように各実験の間に洗浄と再コンディショニングを行う）がｐＨ８，０で行われた（２５μｍ×２１ｃｍ毛管；　３５０　ｖ／ｃｍ　；　９０ｕＡ　；　２００　ｎｍ　吸光度）、図８は最初及び第９回目の実験の電気泳動図であり、これらにｌはとんど同じである。これらの結果は、ここに開示せる動的コーティング緩衝液を用いた場合の移動時間の正確さを証明している。

例■ 血清蛋白質の分析これまで未処理溶融シリカ毛管カラム中でヒト血清蛋白質を分析しようとする場合、約９．０より大きいＰＨをもつ緩衝液を使用しなければならなかった。参照；ケン、エフ−ティーニー（Ｃｈｅｎ、　Ｆ−ＴＡ、）らの“毛管電気泳動−新しい臨床的手段（Ｃａｐ　１ｌｌａｒｙ　Ｅｌｅｃｔｒ。

ｐｈｏｒｅｓｉｓ−Ａ　Ｎｅｗ　Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｔｏｏｌ　）　”　Ｃ１１ｎ、　ＣｈｅＩＩ＋、　７７／ｌ　：　１４−１９（１９９１）　、これは説明のためにここに参照される。

図９−１Ｏは、それぞれ０．５Ｍ　燐酸ナトリウム、ｐＨ７，ｏ及び８．０、を用いた場合の血清蛋白質分離の電気泳動図である。ここに開示せる動的コーティング緩衝液を用いてｐＨ７，０及び８．０両方で血清蛋白質が明確に分離されることがわかる。

例■ 牛乳蛋白質の分析種々の形の牛乳の主要蛋白質を分析した。脱脂乳（図１１）、低脂肪（７％）乳（図１２）、全乳（図１３）、及び粉乳（図１４）の蛋白質成分が明確に分離されることが明らかになった。ピークは下記のようである：β−β−カゼイン−； α−ラクトアルブミン−２：β−ラクトグロブリンＢ及びα−カゼイン−３；β −ラクトグロブリンＡ−４６図１１−１４の電気泳動図に示される分析によって興味深い傾向が明らかにされた。注目されることは、粉末でない牛乳では、α−ラクトアルブミンのピーク（２）がユニークであるが、粉乳ではこのピークが全く小さいことである。すべての種類の牛乳において、β−カゼイン（１）のピークが主要ピークである。このため、成る牛乳試料に粉乳が混ぜられているかどうかを確認するための興味深い方法が可能となる。例えばａ−ラクトアルブミンの吸収ピークの面積をβカゼインのそれで割ることによって、粉乳を粉末でない牛乳に混ぜたかどうかを検出することができる。

この理論を試験するために、水に溶かした粉乳を種々のパーセンテージで脱脂乳に加え、生成したα−ラクトアルブミン及びβ−カゼインの吸収面積（上記のシステム　ゴールドＴＩ′ソフトウェアによって自動的に誘導することができる）を得た。

結果は下の表１に示される：表１成分のパーセンテージ　面積比中１　ニア５％：２５％　１２，３５０％：５０％　１Ｏ６２２５％ニア５％　７．７０　：　１００％　５．７本＝β−カゼイン：α−ラクトアルブミン緩重液＝０．５Ｍ燐酸ナトリウム、４Ｍ尿素、ｐＨ７，０条件：　１０　ＫＶ　１５１　ｕＡこれらの結果は、混ぜものである粉乳のパーセンテージが増加するにつれて、β −カゼインのα−ラクトアルブミンに対するピーク面積比が増加することを示す。

例■ 動的コーティングの有効性の確認典型的ＣＺＥ分析評価では、各サンプル実験間に洗浄段階が設けられる。カラムが被覆されているかいないかにかかわらず、サンプル構成成分の毛管壁への吸着は避けられない。この洗浄段階によって、特にこのような吸着成分が壁から除去される。未処理毛管ではサンプル構成成分の吸着はずっとより大きい。

サンプル構成成分の吸着はｒｕｒｒｔｏ−ｒｕｎ法の観点では少な（とも一つの重大な影響をもつ：　ＣＺＥ分析を行うために必要な時間が実験間で著しく延びる。これは、その物質がカラムに吸着されるにつれて表面の電荷密度が減り、それが特に、電気浸透流を減らすようにはたらくからである。

動的コーティング緩衝液を用いると、実験間でより速い分析がおこり、最後は“ ：Ｉ−ティング平衡に達する。“より速い分析”とは、サンプルの後続実験が同じづ゛７ノブルのそね以前の実験の前に検出窓に達することを意味する。゛コーティング平衡”とは、作用物質がカラムを“被覆”するにつれてカラムのほとんど全部が“被覆される”時点に達し、この時点以後はサンプルの分析的行程（ａｎａｌｙｔ、１ｃａＬ　ｒｕｎ）がそのサンプルのその後の分析的行程とほぼ同じ時間で検出窓に達するはずであるという時点を意味する。この速度上昇の説明は、作用物質とシラノール基との相互作用に基づく；毛管のイオン化により、これらの基は両方兵員に荷電するから、そして作用物質は水素結合にってもシラノール基と相互作用することができるからである；動的被覆構成成分の電荷密度は増加し、それによって電気浸透流は増加する。

作用物質とサンプル構成成分との相互作用はこのようなコーティングと関連している。すなわちサンプル構成成分の作用物質による溶媒和が起こると予想される。サンプル構成成分は作用物質により溶媒和されるから、溶媒和−構成成分の全体的電荷は毛管内壁の全体的電荷と同じである；この関係はその構成成分の毛管内壁への吸着を著しく減少させる。

動的コーティング緩衝液の概念の有効性を確認するために、実験間に洗浄及び再コンディショニングを行うことなしにいくつかのＣＺＥ分析実験を３組モデル蛋白質で行った。サンプル実験間に毛管に動的コーティング緩衝液、ｐＨ７，０、を充填した。図１５はＢ組の１回目及び３回目の実験の電気泳動図であり、１回目の実験は太線で、３回目の実験は点線であられされている。この電気泳動図は、３回目の実験が１回目の実験より速い（比較時間で）ことを示す。図１６はＢ組の１回目の実験（太線）と５回目の実験との同様な電気泳動図の比較を示す、ここでも５回目の実験は１回目の実験より速い（比較時間で）。同様な結果が図１７　（１回目の実験−太線、７回目の実験一点線）及び図１８　（１回目の実験−太線、９回目の実験一点線）で示される０図１９はＢ組の７回目及び９回目の実＠（７回目−太線、９回目一点ｌ１ｌ）の比較である。これらの電気泳動図は互いに重ね合わせるとき、はとんど一致する、すなわち７回目及び９回目の実験は比較分析時間においてほとんど同じである。

これらの結果は、動的コーティング緩衝液の概念が正しいことを証明する。各実験が進むにつれて、時間的に後の実験はより速い分析的結果を示した。さらに、ピーク高さ及び分布がほぼ同一であることは、サンプル構成成分の吸着が時間的に無視できることを示している。

例■ 比較分析ニゲリーン（Ｇｒｅｅｎ　）グリーンは、０．２５　Ｍ　Ｋｚ　ＳＯ４を含む　０．Ｉ　Ｍ　ＣＨＥＳ　（２ −（シクロへキシルアミノ）エタンスルホン酸）緩衝液、　ｐＨ９，０、がモデル蛋白質を分離することを証明した。しかしながら、０．３Ｍ及び０．５　Ｍ　Ｋｇ　ＳＯ４を含む緩衝液（双性イオン緩衝液）の８．０またはそれ以下のｐＨ条件を用いて血清蛋白質を分離することはできなかった。表２に示される条件を試験した。記載された図番器は、得られた電気泳動図の番号である：表２一巨ｌ戒　モル　Ｋａ　Ｋ、５０４Ｍ　Ｈ’ＢＥＳ　Ｏ，１７，１７，３７，０２０ＨＥＰＥＳ　Ｏｌｌ　７．５５　．３　７．５　２１ＴＡＰＳ　Ｏ，１８，０，３８，０２２ＢＥＳ　Ｏ，１７，１７，５７，０２３ＨＥＰＥＳ　Ｏ，１７，５５，５７，５２４ＴＡＰＳ　Ｏ，１８，００，５８，０２５ＢＥＳ　：Ｎ、Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸ＨＥＰＥＳ　・４−（２−ヒドロキシエチル）ビペラキシジンー１−エタンスルホン酸ＴＡＰＳ　：　Ｎ−Ｃトリス（ヒドロキシメチル）メチル］−３−アミノプロパンスルホン酸条件：　２５ｇｍ　Ｘ　２３　ａｍ　毛管；３５０ｖ／ｃｍ；　７２−８０　μ ａ　；２００ｎｌＩ！　吸光での吸光度図２０−２７の電気泳動図によって示されるように、種々の双性イオン塩類を３Ｍ又は、５Ｍ硫駿カリウムと共に使用した場合、ｐＨ８，０以下では血清蛋白質を分離することができなかった。

例■ 比較分析；グリーン及びスウエドベルグ（Ｓｗｅｄｂｅｒｇ）当業者には当然であるが、未処理及び処理カラムどちらの有用性も、明確な特徴をもつ精製モデル蛋白質を用いて確認するのが普通である。例としてＡ組及びＢ組のモデル蛋白質が挙げられろ。第一レベルでは、その他の“非モデル”蛋白質に関連した変動性が排除されている点でこれは容認できるが、第ニレベルではこれは容認できないことであり、カラムの有用性がこのような“非モデル”蛋白質、例えば血清蛋白質などに対して評価されな（ではならないからである。

既述のグリーンのプロトコルを、０．Ｉ　Ｍ　ＨＥＰＥＳ緩衝液、０．２５Ｍ　Ｋ、Ｓｏ、　、ｐＨ７，０を用いてＡ粗蛋白質の分析に関して追跡試験した（ＣＨＥＳの代わりにＨＥＰＥＳ緩衝液を用いたのは、当業者には当然のように、ＣＨＥＳはｐＨ７，０では緩衝能力をもたないからである）。得られた図２６の電気泳動図は、このような蛋白質の分離が達成されたことを示す。これと比較して、図２７は、図２６の条件を用いて血清蛋白質の分離を試みた結果の電気泳動図を示す。図２７の電気泳動図は血清蛋白質が分離されなかったことを示す。

処理された被覆カラムに関して言えば、スウエドベルグ法に記載されたコーティング（末端アリールペンタフルオロ基）が記述のようにして作られた。スウェドベルグが記載した移動（ｒｕｎｎｉｎｇ　）緩衝液（０，２５Ｍ　燐酸アンモニウム）がｐＨ６，０及び７．０　で作られた。カラムの長さ及び適用電圧は前記のベックマン高性能毛管ゾーン電気泳動機器によるものである（２５ｔｃａ＋　Ｘ　２５μｍ毛管；４００　Ｖ／Ｃω；７８μａ　；　２００ｎｍ吸光度）。

Ａ粗蛋白質分離の電気泳動図を図２８に示す；　ｐＨ６，０をもつ記載の緩衝液を用いた。約４０分間にわたる分離が明らかにされた。

ｐＨ７，０では図２９にＡ組の蛋白質１及び２のみが認められた（残る蛋白質は吸着されたか又はそのピークが４０分間の分析実験時間後に明確にされた）９図２８及び２９に示される条件を用いて血清蛋白質を分離する試みが行われた。上記の緩衝液を上記の被覆カラムと組み合わせて使用したとき血清蛋白質の分離はｐＨ６，０でも７．０でも証明されなかった；これはそれぞれ図３０及び３１に示される電気泳動図によって明らかである。

例■の結果から次のことがわかる：特殊の条件を用いれば精製された、確認された蛋白質の分離は成功するが、そのような条件は例えば血清蛋白質のような非モデル蛋白質に適用できることは証明されなかった。

上記の例は開示された発明の好適実施態様を示すものである。熟練せる当業者の視野内の変更は発明の範囲内であるものとする。

分分分分チャンネル　Ａ：吸光度チャンネル　Ａ：吸光度チャンネル　Ａ：吸光度チャンネル　Ａ：吸光度時間　− 時間　−一時間　一時間　−− 時間時間時間時間時間時間時間国際調査報告１ｇ、ｎｌｌｗａｌ　Ａｐ、１ｌｅｓ−０，ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６３６４国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】１．未処理溶融シリカ毛管系を用いる試料の開放毛管電気泳動分析において有用な動的コーティング緩衝液であって、前記動的コーティング緩衝液が、少なくとも２つの解離定数と少なくとも約０．２Ｍのモル濃度とを有する少なくとも１つの作用物質を含み、前記動的コーティング緩衝液のｐＨが約３．０と約１１．０との間にある動的コーティング緩衝液。２．前記作用物質のモル濃度が約０．２Ｍと約１．０Ｍとの間にある請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。３．前記作用物質のモル濃度が約０．４Ｍと約０．６Ｍとの間にある請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。４．前記作用物質のモル濃度が約０．５Ｍである請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。５．作用物質が、燐酸、少なくとも１つのブロトンを有するアルカリ金属燐酸塩、約１ないし約８の炭素原子を有するモノ−、ジ−、トリ−、及びテトラーアルキル　アンモニウムホスフェート、約１ないし約２０の炭素原子を有するアルキルホスフェート、炭酸、少なくとも１つのブロトンを有するアルカリ金属炭酸塩、約１ないし約８の炭素原子を有するモノ−、ジ−、トリ−、及びテトラーアルキルアンモニウムカルボネート、及び約１ないし約２０の炭素原子を有するアルキルカルボネートから成る群から選択される請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。６．作用物質がアリカリ金属燐酸塩である請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。７．作用物質が燐酸ナトリウムである請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。８．前記上記緩衝液の前記燐酸ナトリウムのモル濃度が約０．５Ｍである請求の範囲第７項記載の動的コーティング緩衝液。９．酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）ブロポンスルホン酸、Ｎ−［トリスー（ヒドロキシメチル）エチル］グリシン、トリスー（ヒドロキシメチル）アミノメタン、シクロヘキシル　アミノエタン− スルホン酸、トリエチルアミン、ジメチルアミン、約１２個までの炭素原子を有するアルキルアミド、Ｎ−２−ヒドロキシエチル　ピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、３− ｛［トリスー（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸、２− ｛［（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸及び尿素から成る群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含んでなる請求の範囲第１項記載の動的コーティング緩衝液。１１．未処理溶融シリカ毛管系を用いる試料の開放毛管電気泳動分析において有用な動的コーティング緩衝液であって、前記動的コーティング緩衝液が、少なくとも２つの解離定数を有する少なくとも１つの作用物質を含み、前記作用物質のモル濃度が約０．２Ｍと約１．０Ｍとの間にある動的コーティング緩衝液。１２．作用物質が、燐酸、少なくとも１つのブロトンを有するアルカリ金属燐酸塩、約１ないし約８の炭素原子を有するモノ−、ジ−、トリ−、及びテトラーアルキル　アンモニウムホスフェート、約１ないし約２０の炭素原子を有するアルキルホスフェート、炭酸、アルカリ金属炭酸塩、約１ないし約８の炭素原子を有するモノー、ジ−、トリ−、及びテトラーアルキルアンモニウムカルボネート、及び約１ないし約２０の炭素原子を有するアルキルカルボネートから成る群から選択される請求の範囲第１１項記載の動的コーティング緩衝液。１３．作用物質が燐酸ナトリウムである請求の範囲第１１項記載の動的コーティング緩衝液。１４．酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）ブロポンスルホン酸、Ｎ−［トリスー（ヒドロキシメチル）エチル］グリシン、トリスー（ヒドロキシメチル）アミノメタン、シクロヘキシルアミノエタン− スルホン酸、トリエチルアミン、ジメチルアミン、１２個までの炭素原子を有するアルキルアミド、Ｎ−２−ヒドロキシエチル　ピペラジン−Ｎ′−３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、３−｛［トリスー（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝プロパンスルホン酸、２−｛［（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸及び尿素から成る群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含んでなる請求の範囲第１１項記載の動的コーティング緩衝液。１５．分離すべき試料の構成成分を分抗するための毛管ゾーン電気泳動法であって、ａ）動的コーティング緩衝液を内部に含む未処理毛管に前記試料を導入し、前記動的コーティング緩衝液が少なくとも最低２つの解離定数を有する少なくとも１つの作用物質を含み、前記作用物質のモル濃度が約０．２Ｍと約１．０Ｍとの間にあり；ｂ）前記試料を毛管ゾーン電気泳動法にかけ；ｃ）前記試料の構成成分を検出する工程を含んでなる方法。１６．前記毛管の内径が約５ミクロンと約２０００ミクロンとの間にある請求の範囲第１５項記載の方法。１７．前記毛管の内径が約２０ミクロンと２５ミクロンとの間にある請求の範囲第１５項記載の方法。１８．前記動的コーティング緩衝液のｐＨが約３．０ないし約１１．０の間にある請求の範囲第１５項記載の方法。１９．作用物質が、燐酸、少なくとも１つのブロトンを有するアルカリ金属燐酸塩、約１ないし約８の炭素原子を有するモノ−、ジ−、トリ−、及びテトラーアルキルアンモニウムホスフェート、約１ないし約２０の炭素原子を有するアルキルホスフェート、炭酸、少なくとも１個のブロトンを有するアルカリ金属炭酸塩、約１ないし約８の炭素原子を有するモノ−、ジ−、トリ−、及びテトラーアルキルアンモニウムカルボネート、及び約１ないし約２０の炭素原子を有するアルキルカルボネートから成る群から選択される請求の範囲第１５項記載の方法。２０．作用物質がアルカリ金属燐酸塩である請求の範囲第１５項記載の方法。２１．作用物質が燐酸ナトリウムである請求の範囲第１５項記載の方法。２２．前記緩衝液中の前記燐酸ナトリウムのモル濃度が約０．５Ｍである請求の範囲第２１項記載の方法。２３．緩衝液が、酢酸、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、３−（Ｎ− モルホリノ）ブロポンスルホン酸、Ｎ−［トリスー（ヒドロキシメチル）エチル］グリシン、トリスー（ヒドロキシメチル）アミノメタン、シクロヘキシル　アミノエタン−スルホン酸、トリエチルアミン、ジメチルアミン、１２個までの炭素原子を有するアルキルアミド、Ｎ−２−ヒドロキシエチル　ピペラジン−Ｎ′ −３−プロパンスルホン酸、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホン酸）、３−｛［トリスー（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ１プロパンスルホン酸、２−｛［（ヒドロキシメチル）メチル］アミノ｝エタンスルホン酸及び尿素から成る群から選択される少なくとも１つの成分をさらに含んでなる請求の範囲第１５項記載の方法。２４．試料が少なくとも１つの蛋白質性成分を含んでなる請求の範囲第１５項記載の方法。