JPH06510036A - 嚢胞性線維症の治療のための組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 嚢胞性線維症の治療のための組成物および方法発明の分野 この発明は嚢胞性線維症の治療のための方法に関し、特に、肺気道上皮における 嚢胞性線維症に関連する生理的欠陥を直すための治療に関する。より特定的には 、この発明は、嚢胞性線維症に関連する細胞の機能的欠陥を治療で直すためにポ リヌクレオチド配列、タンパク質またはその組合せを気道上皮に向けるための方 法を提供する。

発明の背景 嚢胞性線維症（ＣＦ）は、外分泌上皮における体液および電解質の運搬に異常を 引き起こす常染色体劣性疾患である。嚢胞性線維症ｌ・ランスメンプランコンダ クタンス制御因子（ＣＦＴＲ）と呼はれるタンパク質をコートするＤＮＡ内の変 異は、事実上すへてのＣＦ患者において見られている。肺の細胞か特に冒される 。

ＣＦでは、気道粘膜細胞の管腔縁は、膜塩素イオンチャネルのｃＡＭＰ依存タン パク質キナーゼ活性化に対して反応しにくい。細胞は、ＣＩ−不浸透性であるた め、細胞膜を介するＮ　ａ　”の吸収は加速される。これらの電解質の不均衡は 、気道粘液の水和レヘルを低減しやす（、したかってＣＦに特有の肺の粘性物質 の分泌の一助となる。外来性の細菌およびマイコプラズマは肺気道に入り、粘液 内にコロニーを形成する。ＣＦから起こる濃い粘液は、これらの病原体を免疫系 から隔離する。ＣＦ患者において粘膜繊毛のクリアランスが低減されるため、細 菌のクリアランスも低減される。したかって肺の音直および感染はよく起こるこ とである。これらの病原体が長い間存在すると常に、肺機能を危険にさらす炎症 反応を起こす。

細菌のコロニーからの毒素の分泌、免疫複合体の沈着および非効果的な食作用は 、結果として好中球ブロティナーゼとその阻害剤との間の不均衡を引き起こすと 考えられている。これにより、長時間の組織の損傷のサイクルが確立される。

健康な肺では、気道上皮細胞は、時間とともにゆっくりと抜は落ち、前駆細胞を 分裂させることにより置換えられる。ＣＦにより、組織に連続的に損傷が与えら れれば、前駆細胞の能力は危険にさらされ、抜は落ちたまたは損傷を受けた気道 上皮が置換えられる。したがって、患者は関連組織の炎症および損傷を伴う慢性 再発性感染症に罹りゃすくなり、その結果肺の衰退が進行する。ＣＦ患者に対す る維持治療には、気道の痰を機械により取り除くことが含まれる。肺の感染症を 抑制するために、抗生物質が全身にまたはエーロゾルとして投与される。実質組 織の損失およびムコイト分泌の増加は呼吸困難を引き起こし、これは肺高血圧に よりさらに悪化する。現在、ＣＦに関連する細胞の欠陥を直接標的にするために 利用できる治療法はない。

ＣＦ患者における粘性の粘液の存在は、絶えず維持治療に対する問題となってい る。粘液は、細菌増殖の支えとなり寄り所となる。したかって、はとんとの抗生 物質は肺に直接与えられる。粘液内での細菌増殖を抑制するのに十分な濃度で静 脈内に抗生物質が与えられると常に、有害な二次的作用を引き起こす。粘液はさ らに肺内の物理的障壁となり、これにより抗生物質の播種が妨げられる。さらに 、抗生物質の中には粘液中の成分と特異的に結合して殺菌効果をさらに弱めるも のもあることを示す証拠もある。

嚢胞性線維症に関連する粘性の粘液によりＣＦの肺における抗生物質の分散か制 限されるため、ＣＦの肺内ての他の複合体または化合物の分散も同様に制限され 得る。ＣＦの肺における粘液の粘性は、ＣＩ−チャネルの機能不全に関するよう に、ある程度は粘液水和の減少のためである。

しかしなから、ＣＦ患者の粘液は、細菌、免疫反応の低下により起こる化膿、お よび死滅した上皮細胞によりさらに濃くなる。ＣＦ患者の痰は正常な痰よりも遥 かに多くのＤＮＡを含んでおり、このＤＮＡによりさらに粘液の粘弾性か大きく なる。

ウシ膵臓のデオキシリボヌクレアーゼＩはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）で肺粘液の 粘性を低減するのに効果的であることか示された（Ｊ　リーバ−マン（Ｊ、　Ｌ ｉｅｂｅｒｍａｎ）　、Ｊ、　Ａｍ　Ｍｅｄ　Ａｓ５ｏｃ、　２０５　：　３１ ２−３１３．１９６８　）　、デオキシリポヌクレアー上１治療法は約２０年前 には日常的に使用されていたか、今日ではその使用数は減っている。これらのデ オキシリボヌクレアーゼ製剤は不純物で高度に汚染されており、これにより治療 が複雑になっていた。純粋なウシ膵臓のデオキシリボヌクレアーゼを繰返し使用 すれば、肺において免疫反応を引き起こしＣＦに関連する病原性続発症を増加し 得ることかさらに予測され得る。シェーク（５ｈａｋ）他は、近年、嚢胞性線維 症患者の痰の粘性を低減するためにインビトロ（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）でヒトの組 換えデオキシリボヌクレアーゼ■を使用した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａ ｄ、　Ｓｃｉ、　（ＩＪＳＡ）　８７：９１８８−９１９２．１９９０　、これ は引用によりここに援用される）。ヒトのデオキシリボヌクレアーゼＩは、長い 期間使用しても、ウシのデオキシリボヌクレアーゼＩよりも免疫学的に寛容性が あると予想される。したがって、ヒトの組換えデオキシリボヌクレアーゼＩをエ ーロゾルとして吸入すれば、ウシのデオキシリボヌクレアーゼＩと比へると、嚢 胞性線維症患者の粘液の粘性を低減するのに有利であろう。

嚢胞性線維症に罹っている個体の平均余命は、２５ないし３５年である。維持療 法だけては、これらの患者の寿命を大幅に増加させることはできない。ヒトのデ オキシリボヌクレアーゼ■を投与することによりインビトロで粘液の粘性は減少 し、免疫原性は低減されるであろう。抗生物質は、細菌のコロニー形成を制御す る助けとなる。しかしながら、これらの治療法はとれもこの病気の基本的な病理 に直接取り組むものではない。したかって、ＣＦに関連する生理的欠陥を直すた めの治療法か緊急に必要とされている。

気道上皮細胞において生理的欠陥を直すための治療法とともに、デオキシリボヌ クレアーゼ■を使用するＣＦのためのこれまで開示されていない新規な治療法を ここに開示する。この治療法は、他の企図された治療法に対して明らかに利点を 有し、これらの利点についてはこの発明の詳細な説明において議論する。

図面の簡単な説明 図１は、ヒ１−のＣＦＴＲ遺伝子に関する制限エンドヌクレアーゼ地図の概略図 である。

図２は、ＣＦＴＲを含む構造、ｐＲ８ｖ−ＣＦのアセンブリの図である。図２Ａ は、ＣＦＴＲ遺伝子フラグメントを得るために使用される制限酵素を示す図であ る。図２Ｂは、発現プラスミドｐＲ３Ｖ−１ｕｘの概略図である。図２０は、ｐ Ｒ８ｖ−ＣＦの構造の概略図である。

図３は、陽イオンリポソーム製剤に関する、タンパク質の濃度を増加させたとき の細胞内配達（デリバリ−）を示す図である。図３Ａは、毒素濃度の関数として の、ＣＥＭ細胞におけるサイクリックＡＭＰの生産を示す図である（点にｔＤＯ ＴＭＡ／ＤＯＰＥ　ＭＬＶＩ＝おいて捕らえラレるサブユニｙｌ□Ａの量を表わ し、黒い正方形はホロ毒素を示し、白い正方形は陰イオンリポソームにおけるサ ブユニッ）−Ａを示している）。図３Ｂは、Ｘ軸上の対応するり。

ＴＭＡ濃度を示す図である。

発明の概要 この発明のある局面に従って、治療上効果的な量のデオキシリボヌクレアーゼ、 嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するだめの機能タンパク質を効果的に コートするポリヌクレオチド配列、およびインビボ（ｉｎ　ｖｉｖｏ）でポリヌ クレオチド配列を肺細胞に配達するのに効果的な量の陽イオン脂質を含む、肺へ の投与に適切な薬剤組成物か提供されている。

好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼの量は、嚢胞性線維症患者の肺粘液の粘 性を低減し、これによりポリヌクレオチド配列の肺細胞への配達を促進するのに 効果的な量である。さらに、ポリヌクレオチドの量は、治療上有効な量のタンパ ク質をコートするのに十分な量である。このポリヌクレオチドは好ましくは、嚢 胞性線維症トランスメンプランコンダクタンス制御因子である。ポリヌクレオチ ドはＤＮＡまたは好ましくはｍＲＮＡてあり、組成物は肺への点滴注入により、 または好ましくはエーロゾルにより配達可能である。

この発明の他の実施例に従えば、組成物は、デオキシリボヌクレアーゼ、嚢胞性 線維症に関連する細胞の欠陥を治療するための機能ポリペブチ１−１およびイン ビボでポリペプチドを肺細胞に配達するのに効果的な量の脂質を含み、この脂質 およびポリペプチドは陽イオン複合体を形成する。

デオキシリボヌクレアーゼの量は、好ましくは、嚢胞性線維症患者の肺粘液の粘 性を低減しそれにより機能ポリペプチドの肺細胞への配達を促進するのに十分な 量である。好ましい実施例において、ポリペプチドは嚢胞性線維症１〜ランスメ ンプランコンダクタンス制御因子であり、組成物は肺への点滴注入に適切であり 、好ましくはエーロゾルによる投与に適切である。

この発明の池の局面に従えば、治療上効果的な量のデオキシリボヌクレアーゼ、 嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために機能タンパク質を与える高 分子、およびインヒポでの高分子の肺細胞への配達のために、高分子ど陽イオン 複合体を形成するのに適切な脂質を含む１つ以上の組成物を収容する容器と、そ の容器と関連して組成物の肺系への配達を促進する手段とを含む嚢胞性線維症の 治療のための装置から構される装置は、組成物を肺への点滴注入によりまたはエ ーロゾルとして配達するように適合される。高分子は好ましくは、機能ポリペプ チド、または嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療する機能タンパク質を効 果的にコー１−するポリヌクレオチド配列である。

この発明の別の実施例において、治療上効果的な量のデオキシリボヌクレアーゼ 、嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するため機能タンパク質を与える効 果的な量の高分子、およびインヒポで高分子を肺細胞に配達するために、前記高 分子と陽イオン複合体を形成するのに適切な脂質を含む一連の有効成分を与える ステップと、嚢胞性線維症患者の気管支通路にこれらの有効成分を配達するステ ップとを含む、嚢胞性線維症患者の治療法を開示する。治療は、好ましくはエー ロゾルにより行なわれ、この方法の一実施例では、デオキシリボヌクレアーゼは 、効果的な量の高分子および陽イオン脂質の配達の前に投与される。高分子およ び陽イオン脂質は好ましくは一緒に投与される。高分子は、機能タンパク質、ま たは機能タンパク質を効果的にコー１”　して嚢胞性線維症に関連する細胞の欠 陥を治療するポリヌクレオチ１〜を含み得る。

この発明の他の局面において、粘液の粘性を減少させるのに十分な量のデオキシ リボヌクレアーゼを患者の気管支通路に投与するステップと、機能タンパク質を 与えて嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するのに効果的な量の高分子お よびインヒポで前記高分子を肺細胞に配達するのに効果的な脂質をデオキシリボ ヌクレアーゼとともに通路の細胞に配達するステップとを含む嚢胞性線維症の治 療法を提供する。この治療法は、肺細胞にタンパク質の発現か観察されるまで定 期的に治療を繰返すステップをさらに含み得る。高分子は、機能タンパク質を効 果的にコートして嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するポリヌクレオチ ド配列を含み得る。ポリヌクレオチドはｍ　ＲＮ　ＡまたはＤＮＡか可能であり 、ｍＲＮＡは好ましくは５′キャッピングヌクレオチドを欠く。高分子は、嚢胞 性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために機能ポリペプチドをさらに含み 得、好ましくは嚢胞性線維症トランスメンプランコンダクタンス制御因子である 。デオキソリボヌクレア−ゼは、好ましくは組換えタンパク質てあり、より好ま しくはヒトの組換えデオキソリボヌクレアーゼ■である。デオキシリボヌクレア ーゼ、高分子および脂質は、好ましくは、肺への点滴注入またはエーロゾルによ り配達される。

この発明の別の実施例では、デオキシリボヌクレアーゼ、嚢胞性線維症に関連す る細胞の欠陥を治療するために機能タンパク質を与える高分子、およびインビボ で高分子を肺細胞に配達するのに効果的な脂質を収容する１つ以上の容器と、デ オキシリボヌクレアーゼ、高分子および脂質の嚢胞性線維症患者の気管支通路へ の配達を促進するための手段とを含む、嚢胞性線維症患者の治療に有用なキット が提供される。このキットは、好ましくは、予め定められた単位投薬量のデオキ シリボヌクレアーゼ、高分子および脂質を収容するための容器を存する。より好 ましくは、投薬量は、１つの治療処置に効果的な単位投薬量である。

最後の実施例において、肺通路において粘液に関連するＤＮＡの量を減少させる ステップと、嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために機能タンパク 質を与える効果的な量の高分子を、インビボで高分子を肺細胞に配達するのに効 果的な陽イオン複合体として通路の細胞に配達するステップとを含む嚢胞性線維 症の治療法を提供する。

肺の粘液量は、好ましくは、粘液の粘性を減少させるのに十分な量のデオキシリ ボヌクレアーゼ■で通路を処理する肺の洗浄、または胸部の打診および体位ドレ ナージによって減少され得る。さらにこの方法は、肺細胞においてタンパク質の 発現が観察されるまで定期的に繰返される。

ＣＦの原因となる遺伝子は、ヒトのゲノム内に局在化されている。遺伝子は１， ４８０のアミノ酸からなるタンパク質をコードし、嚢胞性線維症トランスメンプ ランコンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）と呼ばれる。その配列はりオーダン（ Ｒｉｏｒｄａｎ）他による出版物に示されており、これは引用によりここに援用 される（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２４５：１０６６−１０７３゜１９８９　）。ＣＦに かかった個体は欠陥ＣＦＴＲＤＮＡ配列を有し、ＣＦの欠陥に関連した種々の突 然変異かある。

最も一般的な突然変異は、ＣＦＴＲ遺伝子上の位置番号５０８でフェニルアラニ ンをコードする３つのヌクレオチドの欠失である。ＣＦに関して、正しいＣＦＴ Ｒ遺伝子配列の欠陥細胞への配達のための方法は、嚢胞性線維症に関連する細胞 の欠陥を直すために使用され得る。

この発明は、嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を直すために、？Ｕ療のための 遺伝子タンパク質または他の高分子を気道上皮に効果的に配達するための脂質媒 介高分子治療法と組合わせた、デオキシリボヌクレアーゼＩのこれまで開示され ておらずかつ提案されていない使用法に関する。

「高分子」はここではポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは池の生物活性分子 を示すために使用される。ポリヌクレオチド配列は、プロモータ等の標的細胞に よる発現に必要なすへての遺伝子情報を有するときにポリペプチドを効果的にコ ードする。ポリヌクレオチドは、発現に必要な認識および他の配列とともに、完 全なりＮＡもしくはＲＮＡ、遺伝子、遺伝子のフラグメント、または幾つかの遺 伝子を含み得る。嚢胞性線維症の原因となるタンパク質は、ＣＦＴＲタンパク質 もしくはポリペプチドおよびそのペプチドフラグメント、または嚢胞性線維症患 者の細胞において細胞レベルを変更したことが示されるいかなる油のタンパク質 もしくはタンパク質性物質をも含む。デオキシリボヌクレアーゼＩの酵素活性は 、痰の粘性を減少させてそれによりリポソーム複合体の分散を促進するためたけ てはなく、リポソーム媒介高分子配達にとってこれまで開示されていない思いか けない利点を与えるために使用される。

嚢胞性線維症のための提案された遺伝子治療法現在までに提案された嚢胞性線維 症のための遺伝子治療法は、主にウイルスヘースの遺伝子治療法である。これら の治療法、およびこれらの治療法に関連する合併症を以下に議論する。

研究者は、ＣＦＴＲ遺伝子をインビトロて嚢胞性線維症患者由来の細胞に採り入 れ、ＣＦＴＲ遺伝子発現かＣＩ−の運搬に与える影響を観察した。ドラム（Ｄｒ ｕｍｍ）他は、ＣＦ患者由来の膵臓のかん細胞系にＣＦＴＲ遺伝子を運ぶた０、 これは引用によりここに援用される）。安定した形質転換細胞の、塩素イオンを 運搬する能力が評価された。ＣＦＴＲ遺伝子の１つの正常な複製物をＣＦ細胞に 添加することにより、塩素イオンチャネルの欠陥は軽減された。これらの研究者 は、ＣＦ患者におけるＣＦＴＲ遺伝子の安定した発現のために、レトロウィルス ベクターを使用することを企図している。

レトロウィルスベクターは、レトロウィルスタンパク質により感染性ウィルス粒 子にパッケージされたレトロウィルスベースの遺伝子配列を含む。典型的には、 １本鎖ＲＮＡは、感染細胞に放出される。ＲＮＡはＤＮＡに逆転写され、このＤ ＮＡは宿主ゲノムに組込まれる。レトロウィルスベースの遺伝子発現には、転写 およびタンパク質の翻訳が起こり得る前に、問題の遺伝子を細胞の染色体に組込 むことが必要とされる。遺伝子の挿入位置は常に制御されているわけてはないた め、異常な宿主細胞タンパク質の発現の恐れ、したがってかんの恐れがある。し たがって、レトロウィルス遺伝子治療法の安全性に関しては、かなりの疑問かあ った。

さらに、レトロウィルス遺伝子の発現は常に効率的なプロセスであるわけではな い。遺伝子に欠陥を有する気道上皮細胞のすへてが、エーロゾル化された所与の 投薬量のレトロウィルスにより影響を受けるわけではない。影響を受けたそれら の細胞のうちのほんの少しだけが安定して組込まれたベクターの複製物を含み、 それよりもさらに少ない細胞か機能遺伝子を実際に発現させる。現在までのプロ セスは、比較的非効率的である。

肺細胞配達のために企図されるウィルス媒介（非レトロウィルス）遺伝子配達系 は他にもある。アデノウィルスおよびアデノ関連ウィルスには、呼吸系に対する 自然親和力がある。したかって、これらのウィルスが肺におけるウィルス媒介遺 伝子配達の優れた候補であると考える研究者もいる。アデノウィルスは、レトロ ウィルスと異なり、遺伝子の発現に細胞分裂を必要とせず、したかってこれはイ ンビボの適用に、より適切である。しかしながら、天然の肺病原体から設計され たアデノウィルスおよびアデノ関連ウィルス遺伝子ベクターには、病原体の状聾 への復帰突然変異の可能性かある。

一般の法則として、すへての修飾ウィルス遺伝子移動媒体には復帰突然変異の恐 れかあり、かつ病原性続発症の可能性かある。さらに、ウィルス媒介遺伝子移動 媒体には、それか適応できるポリヌクレオチド配列の量に関して固有のサイズ制 限かある。さらに、ウィルス遺伝子ベクターは特定のタイプの核酸を配達するこ としかできない。修飾された核酸、タンパク質および他の高分子は、ウィルスベ クターを使用して効率的に配達できない。細胞に配達される核酸のタイプは、そ の特定のウィルスにより正常にパッケージされたタイプの核酸に制限される。し たかって、ＲＮＡはＤＮＡ由来ウィルスにより本来パッケージされず、その逆の ことも言える。ＲＮＡウィルスもＤＮＡウィルスもｍＲＮＡを効率的にバラケー ンしない。患者に対する危険性かより少なくかつある範囲の生物活性分子を配達 するであろう、ＣＦの原因に関連する高分子の配達のためのウィルスベースでな い遺伝子移動媒体てあれば、現在企図されている治療法をかなり改善するものと なるであろう。

ＣＦの気道上皮へのタンパク質の配達 ＣＦ患者に見られるような損傷を受けたまたは危険にさらされた気道上皮細胞か ＤＮＡであってもＲＮＡてあってもその修飾物であっても、配達された核酸配列 をとのようなレベルで容易に発現させることかできるかは常に明らかであるわけ てはない。したかって、この発明の他の目的は、嚢胞性線維症の原因に関するタ ンパク質を気道上皮に導入することである。たとえはＣＦＴＲを気道上皮に配達 すれば、危険にさらされた細胞、さらに核酸配列を転写できない程度まで危険に さらされた細胞における塩素イオンチャネルの機能を都合よく直すことかできる であろう。さらに、機能ＣＦＴＲを気道上皮細胞に添加すれば、細胞をすぐに救 済できるであろう。ＣＦの原因に関するタンパク質は、単独でたけてなく核酸と 組合わせて投与できることがさらに企図される。即時に救済すれば、その後には 配達された核酸配列の発現に由来するタンパク質かさらに与えられるであろう。

ＣＦＴＲはＣＦに関連する主要な欠陥タンパク質であると考えられているか、さ らに研究すれば、池のタンパク質または高分子もその病理に関係し得る可能性か ある。したかって、ここでは、他のタンパク質および核酸配列を含む他の高分子 か、ＣＦの気道上皮に見られる異常なタンパク質を補うかまたは調節するために 、気道上皮に同様に投与され得ることか企図される。

脂質媒介高分子配達 リポソームは、中空の脂質小胞を形成する両親媒性脂質を含む。それらは、遺伝 子配列を組織培養細胞に導入するためのメカニズムとしてインビトロで使用され てきた（マニツ、Ｒ，Ｊ、フォールドーフォーゲリット、　Ｓ、（Ｍａｎｎｉｎ ｏ、Ｒ，Ｊ、Ｆｏｕｌｃｌ−Ｆｏｇｅｒｉｔｅ、Ｓ、）　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑ ｕｅｓ　６：６８２−６９０、１９８８　）。リポソームを形成する脂質は、正 の電荷（陽イオン）を有しても、負の電荷（陰イオン）を有しても、中性であっ てもよい。幾つかの脂質のみか細胞膜と接触して融合し、それらの関連物質を細 胞内に配達する。最初はリポソーム媒介遺伝子配達のために使用された脂質は、 標的細胞面との融合において有効ではなく、その代わりにエントサイト−シスに より摂取された。これらのリポソームは細胞のリソソームに配達され、分解され た。

リポソームの開発における主要な進歩は、正の電荷を持った合成陽イオン脂質、 すなわちＮ−［１−９２，３−ンオレオ、イルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ −１〜リメチルアンモニウムクロリト（ＤＯＴＭＡ）が自発的にＤＮＡと相互作 用し、細胞膜に結合する負の電荷を有する脂質と融合することかできる脂’［− ＤＮＡ複合体を形成し得ることの発見てあった（エプスタイン、　Ｄ　（Ｅｐｐ ｓｔｅｉｎ、Ｄ）他に与えられた米国特許番号第４，８９７，３５５号、および 以下に（ＰＮＡＳ、１９８７）として引用するＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、ＡＣａｄ 。

Ｓｃｉ、、　（ＵＳＡ）８４ニア４１３−７４１７（１９８７）　）　。リポソ ーム媒介遺伝子配達は、レトロウィルス媒介遺伝子配達と異なり、ＲＮＡまたは ＤＮＡを配達できる。したがって、ＤＮＡ、ＲＮＡ、修飾されたポリヌクレオチ ド、またはその組合せを細胞質に直接導入できる（マロン（Ｍａｌｏｎｅ）他、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）　８６：６０７７− ６０８１．１９８９）。

リポフェクチン（１，１ｐｏｆｅｃｔｉｎ”）　（商標）は、核酸トランスフェ クション法のためにインヒドロで使用される。リポフエクチン（商標）はまた外 来のポリヌクレオチド配列をカエルおよびラノ１〜の細胞にインビボで導入する ために使用できる。ボルト（Ｂｏｌｔ）他は、アフリカッメガエルの胎芽の脳の ニューロンにレポーター遺伝子を導入した（Ｎｅｕｒｏｎ　４：２０３−２１４ ．１９９０）　。ハジンスキー（Ｈａｚｉｎｓｋｉ）他は、リポフェクチン〜ポ リヌクレオチド複合体の気管への点滴注入によりラットの肺においてしｌ・ロウ イルスーＣＡＴ融合遺伝子の発現を誘発した（Ａｍ、　Ｊ、　Ｒｅ５ｐｉｒ、　 Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４：２０６−２０９．　１９９１）。しかし なから、ＤＯＴＭＡ、すなわちリポフェクチン（商標）（メリーランド州ゲイザ ースバーグ（Ｇａｉ　ｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）のベセスダ・リサーチ・ラボラトリ ー（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　）の陽イ オン脂質成分は、ジエーテル脂質である。これらのタイプの化学構造は、インビ ボで容易に分解できない。したがって、このタイプの陽イオン脂質は、ヒトにお ける使用の理想的な候補ではない。以下に示す改良された陽イオン脂質は、イン ビボでの遺伝子配達のより良い候補である。

この発明の方法に使用される正および負の電荷を有する脂質小胞は、典型的には 、陽イオン脂質または負の電荷を有する脂質のいずれかと、中性脂質およびコレ ステロールまたは類似のステロールとの混合物から適切に調製される。

したかって、負および正の電荷を持った脂質、ならびに中性の脂質、またはその 組合せの使用は、ここに有利なものとして企図されている。中性脂質は、モノグ リセリド、ジグリセリドおよびＩ・ジグリセリドたけてなく、ホスファチジルコ リン、ホスファチジルエタノールアミン、類似のリン脂質類似体力ｉ丁能である 。この発明の負の電荷を有する脂質試薬は、生理学的ｐＨて正味の負電荷を有す る少なくとも１つの脂質種、またはこれらの組合せを含むものである。適切な脂 質種は、ホスファチジルグリセロールおよびホスファチンン酸または類似のリン 脂質類似体を含む。

リポソームおよび脂質小胞という言葉は、ここでは交換可能に使用できる。陽イ オンリポソームという言葉は、ここでは幾らかの量の陽イオン脂質を含み、これ により中に含まれる負の電荷を有する脂質の量に関係なく、負の電荷を有する細 胞膜と結合できるリポソームを示すために使用される。リポソーム複合体とは、 生物活性分子と結合された脂質小胞を指す。陽イオン複合体とは、複合体上の電 荷か細胞膜融合を可能にするのに十分な程正であるように、１つ以上の生物活性 物質か脂質と結合したものを指す。したがって、陽イオン複合体は、生物活性分 子と陽イオン脂質との複合体から、生物活性分子と、陽イオン脂質ないし中性脂 質とともに陽イオンタンパク質を含む脂質種の混合物との複合体にわたる範囲の 製剤を含む。複合体において、高分子は、二重層に組込まれるか、電荷により表 面に複合されるか、または脂質の表面に吸収され得る。この発明の脂質試薬は、 リン脂質を主成分として含む、生理学的細胞膜の脂質と類似した脂質混合物を含 み得る。脂質試薬は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン 、スフィンゴミエリン、ホスファチジルセリン、またはホスホイノシトール等の 天然の植物または動物由来のリン脂質を含む、いかなる従来の合成または天然リ ポソーム物質をもさらに含み得る。使用され得る合成リン脂質は、シミリストイ ルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイル ホスファチジルコリンおよびジステアロイルホスファチジルコリン、ならびに対 応する合成ホスファチジルエタノールアミンおよびホスファチジルグリセロール を含むが、それらに制限されるわけではない。リポソームの調製に関して従来的 に既知であるように、コレステロール、糖脂質、脂肪酸、スフィンゴ脂質、また はガングリオツド等の他の添加剤もまた使用できる。

適切な陽イオン脂質種は、１．２−ヒス（オレオイルオキシ）−３−（＋−リメ チルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）等の既知の陽イオン脂質、またはＤＯ ＴＭＡ等のＮ−（Ｗ、Ｗ−１−ジアルコキシ）−ａｌｋ−１−イル−Ｎ。

Ｎ、Ｎ−三置換アンモニウム界面活性剤、または構造および特性か類似した複合 陽イオン脂質、またはこれらの混合物を含む。インビボてより容易に分解できる ことが仮定される陽イオン脂質を含む特に好ましい陽イオン脂質は、フェルブナ −（Ｆｅｌｇｎｅｒ）他による１９９０年４月１９日出願の同時係属中の米国出 願番号第６８６，７４６号に開示されており、これは引用によりここに援用され る。

これらは、ＤＯＲ＋エステル／エーテル化合物（ＤＬ−１−０−オレイル−２− 才レイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキソエチルアンモニウム、 またはＤＬ−１−才レイル−２−〇レオレイルー３−ジメチルーアミノプロピル −β−ヒドロキソエチルアンモニウム）たけてなく、ＤＯＲＩ　（ＤＬ−１，２ −ジオレオイル−３−ジメチルアミノプロピル−β−ヒドロキソエチルアンモニ ウム）およびＤＯＲＩＥ　（ＤＬ−］、］２−０−ジオレイルー３−ジメチルア ミノプロピルβ−ヒドロキシエチルアンモニウム）の類似体、または以下の一般 式％式％ を有する他の誘導体を含み、ここで ＹｌおよびＹ２は同じかまたは異なり、かつ−０−ＣＨ２−１−０−Ｃ（０）− １または一〇−であり、Ｒ１およびＲ２は、同じかまたは異なり、かつ１１、ま たはＣ１ないしＣ２３アルキルもしくはアルケニルであり、 Ｒ３およびＲ４は、同しかまたは異なり、かつＣ１ないしＣ２４アルキル、また はＨてあり、Ｒ５はＣ１ないしＣ２４のアルキル直鎖または分岐鎖てあり、Ｒ６ は、−Ｃ（０）−（ＣＨ２）、−ＮＨ−、アルキル、アリールもしくはアラルキ ルであるジアミノカルボン酸、または前記ジアミノカルボン酸に結合した一Ｃ（ ０）　−（ＣＨ２）ゆ−ＮＨ−であるか、または存在せず、Ｒ７は、Ｈ、スペル ミン、スペルミジン、ヒストン、もしくはＤＮＡ結合特異性を有するタンパク質 であるか、またはそこにおいてＲ７の部分であるアミンかＲ２、Ｒ４もしくはＲ ５基で四級化されたものであり、またはＲ７は側鎖上に正に荷電された基を有す るＬ−もしくはＤ−アルファアミノ酸であり、前記アミノ酸はアルギニン、ヒス チジン、リジン、オルニチンもしくはその誘導体、またはＲ７の部分であるアミ ンがＲ’　、Ｒ’　もしくはＲ６基で四級化されたこれらと同じアミノ酸であり 、またはＲ７はＬ−またはＤ−アルファアミノ酸からなる群から選択されるポリ ペプチドであり、そこにおいてアミノ酸残基の少なくとも１つはアルギニン、ヒ スチジン、リジン、オルニチンもしくはその誘導体を含み、 ｎは１ないし８てあり、 ｍは１ないし１８てあり、 Ｘは非毒性アニオンである。

ここに示される非毒性アニオンは、無機酸および存機酸を含む薬事上非毒性の酸 のものか可能である。そのような酸は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、酢酸 、安息香酸、クエン酸、グルタミン酸、乳酸等を含む。薬事上許容できる塩の調 製に関しては、Ｓ、　Ｍ、パージ（Ｓ、　Ｍ、　Ｂｅｒｇｅ）他によるＪｏｕｒ ｎａｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ、　６６：ｌ −１９（１９７７）を参照されたい。さらに、ＤＯＴＭＡ　（Ｎ−［１−（２， ３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ、Ｎ、Ｎ−トリメチルアンモニウム）は 、改良された陽イオン脂質と組合わせて、またはコレステロール、リゾ脂質もし くは中性脂質と組合わゼて使用され得る。

これらの陽イオン脂質の他に、他の脂質か選択された陽イオン脂質に添加され得 る。これらは、リゾホスファチジルコリン（１−オレオイルリゾホスファチジル コリン）かその−例であるリゾ（Ｌ　ｙ　ｓ　ｏ）脂質、コレステロール、また はジオレオイルホスファデジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）もしくはジオレオ イルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）を含む中性リン脂質を含むか、これに限 定されるわけてはない。脂質の割合は、コレステロール、またはリゾもしくは中 性脂質の混合物と組合オ）せて主成分である陽イオン脂質を含むため変化し得る 。脂質のモル比、および脂質の好ましい組合せは、以下に示す例から明らかにな るであろう。

実験結果によれは、ＤＯＲＩおよびＤＯＲＩＥは陽イオン脂質トランスフェクシ ョン剤としてはＤＯＴＭＡより優れており、インビボての遺伝子配達に役立つと いう特性を有することが示された。さらに、第四級アンモニウムの窒素に結合さ れるしドロキシエチル部を付加することにより、ＤＯＴＭＡの活性を向上てきる 。ＤＯＰＥを陽イオン脂質製剤に加えることにより、ＤＯＲＪまたはＤＯＲＩＥ のみよりもトランスフェクションの効率か上昇する。ＤＯＰＥは、１−ランスフ エクションの効率の向上においてコレステロールよりも効果的であり、陽イオン 脂質混合物中にり。

ＰＥか５０モル９６あれば最も効果的である。これらの最適化基準は、陽イオン 脂質種が異なれば変わる。

ポリヌクレオチドまたは陰イオンタンパク質等のポリアニオン分子は、陽イオン 脂質と容易に結合する。しかしなから、陽イオンまたは中性タンパク質の細胞へ の配達には、さらに脂質製剤を使用することか必要である。フェルブナ−（Ｆｅ ｌｇｎｅｒ）による１９９０年５月３日出願の同時係属中の米国特許出願番号第 ５１９，２９１号は、細胞への投与の前またはそのプロセスにおいて、まず負の 電荷を有する脂質小胞にカプセル化され、またはそれと結合し、次に正の電荷を 有する陽イオン脂質小胞と複合化された中性または正の電荷を存する生物活性物 質を含み得る、負の電荷を存する細胞膜に自発的に付加するのに適切な正の電荷 を有する組立てられた複合体を開示しており、これは引用によりここに援用され る。これらの脂質を使用することにより、嚢胞性線維症の原因に関する正または 中性の電荷を有するタンパク質の配達が可能となる。ＣＦＴＲは、両親媒性の細 胞外面および陰イオン性の細胞質面を備える大きなタンパク質である。分子の正 味の電荷は、ＣＦＴＲとともに中性脂質の複合体か細胞膜と直接融合できるのに 十分な正電荷である。

正の電荷を仔する脂質小胞の製剤において、陽イオン脂質は、約０．１モル％な いし１００モル９６、好ましくは５ないし９５モル９６、最も好ましくは２０な いし８０モル％の濃度で存在できる。負の電荷を有する脂質小胞を調製するため の製剤において、負の電荷を有する脂質は、約０゜１ないし１００モル％、好ま しくは１ないし９０モル％、最も好ましくは３ないし５０モル％の濃度で存在で きる。

正味の電荷を存する脂質小胞を生産するためには、正または負の電荷を有する成 分の量か、その反対の電荷を有する成分の量よりも多くなければならない。反対 の電荷を有する脂質は、約０ないし４９モル％、好ましくは０ないし４０モル％ で存在できる。

中性脂質は、約０ないし９９．９モル％、好ましくは５ないし９５モル９６、最 も好ましくは２０ないし８０モル％の濃度で、正または負の電荷を有する脂質小 胞に存在できる。コレステロールまたは類似のステロールは、０ないし８０モル ％、好ましくはＯないし５０モル％で存在できる。

脂質の製剤は、肺に配達されるべき生物活性物質に応じて変わる。

肺におけるデオキシリボヌクレアーゼＩによる治療効果的な遺伝子治療法には、 冒された細胞に遺伝子を効果的に運搬することか必要である。しかしなから、本 出願人は、気管支の気道の内側を覆う濃い粘液か、気管支の欠陥上皮細胞への高 分子の直接の配達に対する障壁として作用し、効果的な遺伝子治療を妨げること を発見した。

３０年以上前に始められた実験によれば、嚢胞性線維症患者の肺の粘液中のＤＮ Ａの濃度は、通常の健康な患者のものよりも高い。最近の研究によれば、ＣＦ患 者の粘液に見られるＤＮＡのはとんとすべてはヒ１−のものであり（レセム　Ｍ 、Ｉ　、（Ｌｅｔｈｅｍ　Ｍ、　１．）他、Ｅｕｒ、　Ｒｅ５ｐ　Ｊ、　３：１ ９−２３、　１９９０）　、恐らく白血球および」二皮細胞に由来するものであ る。ウノ膵臓のデオキシリホック１フアーセＩは、インビボてＣＦの肺の粘液の 粘性を減少し、米国では１９５８年にヒトに使用することか認められた。

ヘパリン硫酸は、機能遺伝子配列の組織培養細胞への陽イオン脂質媒介配達を競 合的に阻害する。本出願人は、ＤＮＡ、すなわち大きなポリアニオン分子が、タ ンパク質またはポリヌクレオチドの陽イオンリポソーム媒介配達を同様の態様で 阻害すると考えている。したかって、多量のＤＮＡを含むＣＦ患者の粘液もまた 、阻害効果を有するであろう。ＣＦＴＲタンパク質または核酸配列の気管支の上 皮細胞への陽イオン複合体を媒介とする配達は、細胞外ＤＮＡの存在により低減 され、または妨げられ得る。例８は、ＤＮＡ等のポリアニオンか、組織培養細胞 への陽イオン脂質媒介配達を競合的に阻害することを示している。

したかって、嚢胞性線維症患者の粘液による阻害は、２倍になるであろう。粘液 は、肺における治療剤の播種を妨げることにより物理的障壁となり、かつ粘液は 、高分子の陽イオン複合体媒介配達に対する特異的な障害である化学的障壁とな る。したかって、肺における生物活性物質の陽イオン複合体媒介配達は、池の組 織に向けられる他の陽イオンリポソームまたは複合体媒介配達法よりも予測でき ない複雑な事態を有し得る。肺に向けた、高分子治療法と組合わせたデオキシリ ボヌクレアーゼＩの使用法は、これまで開示されていない。デオキシリボヌクレ アーゼＩは、遺伝子治療の前にまたはそれと同時に与えられ得る。同様に、デオ キシリボヌクレアーゼ治療は、リポソームを気道の上皮細胞に配達できるほと十 分に痰の粘性およびＤＮＡの濃度か低減されるまで、繰返される必要かあるかも しれない。

さらに、デオキシリボヌクレアーゼ治療は、すべての治療上の処置に対しては必 要でないかもしれない。

ウシ膵臓のデオキシリボヌクレアーゼＩは、嚢胞性線維症患者の肺の治療に認め られている。しかしながら、それを繰返し使用することに関して潜在的な問題か 幾つかある。

最も一般的な問題は、ウシのデオキシリボヌクレアーゼの初期の調製物において 見られる不純物に関連するアレルギー性合併症から生しる。プロテアーゼの汚染 は、アレルギー反応を引き起こすか、または肺組織を直接刺激し得る。

ウシ膵臓のデオキシリボヌクレアーゼ■の純粋な調製物は、ＣＦ患者の肺への陽 イオンリポソームの配達と組合わせることかできる。

ウシのデオキシリボヌクレアーゼＩを精製した調製物でも、繰返し適用すると免 疫反応を引き起こすであろう。シェーク（Ｓｈａｋ）他は、ヒトのデオキシリボ ヌクレアーゼＩの配列を発表し、インビトロでＣＦ患者の痰の粘性を低減する、 天然デオキシリボヌクレアーゼＩと同様の活性を存するヒトの組換えデオキシリ ボヌクレアーゼ■を生産した（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、 （ＵＳＡ）　８７：９１８８−９１９２．１９９０、これは引用によりここに援 用される）。ＣＦ患者の平均余命は３０年以上であり、したかつて免疫学的に調 和したデオキシリボヌクレアーゼＩか、繰返し使用するのにはより適切であり、 ウシのデオキシリボヌクレアーゼＩに比べて副作用か少ない。

インヒポでＤＮＡを分解することかでき、それにより粘液の粘性を低減すること かできる他のＤＮＡ特異的エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼか、こ の発明において使用され得ることも企図される。精製されたまたは組換えヌクレ アー七は、切断効率を向上させるためにデオキシリボヌクレアーゼの調製物にさ らに加えられ得る。たとえは、デオキシリボヌクレアーゼＩとλフアージ由来の エキソヌクレアー七とエキソヌクレアー七ＩＩＩとの組合せは、ヌクレアーゼ活 性を増加させるために使用され得る。

企図された生物活性分子かＲＮＡまたはタンノくり質であれは特に、選択される エキソヌクレアー七およびエンドヌクレアーゼの残留リホヌクレアーゼおよびプ ロテアーゼ活性は最小てなけれはならない。さらに、ＤＮＡ消化のために選択さ れた酵素は、生物活性分子の配達か、その酵素の存在により支障か生しないこと を確かめるため、培養物においてテストされなけれはならない。

デオキシリボヌクレアーゼＩまたは他のＤＮＡ特異的ヌクレアーゼはＣＦ患者の 肺粘液の粘性を減少させるために使用できるか、他の酵素も粘液の粘性をさらに 低減するために都合よく使用され得る。したかって、ヒアルロニダーゼ等の他の 粘液成分に向けられる他の酵素は、陽イオン複合体の前にまたはそれと一緒に肺 に配達され得る。粘液は明らかに核酸またはタンパク質のリポソーム媒介配達に 対する障壁であるため、洗浄、肺の打診、体位ドレナージまたは他の手段により 粘液を機械的に除去することにより、配達をさらに促進できる。これらの方法を 行なえば、デオキシリボヌクレアーゼＩ治療が必要でなくなるように、肺の粘液 に残っている粘液または水和物を十分に取り除くことかできるてあろう。したが って、リポソーム媒介配達は、単独で、またはデオキシリボヌクレアーゼ、洗浄 または粘液の障壁を取り除くための他の手段と選択的に組合わせて行なうことか できる。

ここに開示するように、デオキソリボヌクレアーゼＩ治療は、陽イオン複合体の 配達に関して、デオキシリボヌクレアーゼＩ治療か粘液の障壁の広かりに対して のみ寄与する場合に予想され得るものに比べて斃異的な利点を存する。

例９に示されるように、デオキシリボヌクレアーゼＩ治療は、物理的およびこれ まて開示されていない化学的手段を介して、複合体を含む陽イオンリポソームの トランスフェクションの効率を増加する。

以下のセクションでは、選択された１つ以上の生物活性分子を含む陽イオン複合 体の開発、生産、試験および投与の例か示されている。これらの例に関して、本 出願人は、ＣＦＴＲタンパク質およびＣＦＴＲ核酸を研究の対象として選択した 。しかしながら、嚢胞性線維症の原因に関する他の生物活性分子も、この発明を 考慮すれば当業者に容易に明らかになるであろう同様の方法を使用して同様に使 用され得る。

ＣＦＴＲをコードするＤＮＡ構造体の調製陽イオン脂質に媒介された遺伝子配達 を使用すれば、ＣＦＴＲをコードする遺伝子をＤＮＡまたはＲＮＡとして導入す ることか可能である。図１は、図２に示されるＣＦＴＲフラグメントの生成のた めに使用される、Ａｖａｌ、１２２および５ｐｅｌ、５８１６の制限部位を示す ＣＦＴＲの制限エンドヌクレアーゼ地図である。図２は、ｐＲ３Ｖ−ＣＦの構造 をコートするＣＦＴＲのアセンブリを示している。図２Ａは、Ａｖａ　１．Ｓｐ ｅ　Ｉフラグメントとして与えられる、長さ５．７ｋｂ　（キロヘース）のＣＦ ＴＲ遺伝その概略図である。図２Ｂは、細菌発現プラスミドｐＲ３Ｖ−１ｕｘの 概略図である（サンディエゴ、ユニバーシティ・才ブ・カリフォルニア（Ｕ旧ｖ ｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）のスレン１’スブラマニ博士（叶 、　５ｕｒｅｓｈ　Ｓｕｂｒａｍａ旧）からの贈呈）。このプラスミドは、アン ピシリン耐性遺伝子およびラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）プロモータエレメント を含む。ＣＦＴＲ遺伝子を含む発現構造体は、ｐＲ３Ｖ−ｌｕｘをＨｉｎｄ　Ｉ ＩＩおよびＥｃｏ　Ｒ１で消化し、ルシフェラーゼ遺伝子フラグメントを取り除 くことにより調製される。非付着末端は、ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラグ メントて補充され、ベクターは、１．７ｋｂのフラグメントから精製される。Ｃ ＦＴＲフラグメントをＡｖａ　Ｉおよび５ｐｅｌて消化した後、重複末端か同様 にフレノウで補充される。平滑末端連結反応か、ベクターフラグメントを挿入物 と結合させるために使用され、陽性のＥ、ｃｏ１ｉ形質転換体か正しい配向を存 する挿入物に関してスクリーニングされる。図２０は、完全なプラスミドを示し ている。この説明を当業者に周知の基本的な分子生物学技術と組合わせれば、ｐ Ｒ３Ｖ−ＣＦの再形成か可能となる。このおよび他のＣＦＴＲ構造ならびにここ に企図される他の構造を完成させるのに必要なすべての方法のための手順は、た とえば、ニューヨーク州のコールドスプリングハーハーラボラトリー（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）のマニエイティス・ Ｔ　（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、）他によ得られ、以下にｒＭａｎｉａｔｉｓＪ 　として引用する。

ｐＲ３Ｖ−ＣＦ構造体は、治療］二効果的な量のＤＮＡを標的細胞に配達するよ うに、陽イオン脂質小胞て複合化され得る。ＣＦＴＲｍＲＮＡの生産に関して、 ＣＦＴＲ遺伝子フラグメントは、好ましくは以下に説明する第２のプラスミドに 運ばれる。どちらの適用に関しても、プラスミドの精製のために、形質転換され た細菌の量を増加させる必要かある。これらの方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓに記載 されている。

ＣＦＴＲを含む他の発現ヘクター構遺体もこの発明において同様に使用できるで あろうことかさらに企図されており、したかって、ベクターｐＲ３Ｖ−ＣＦのア センブリは例示的なものである。他のプロモータおよび調節要素、抗生物質耐性 マーカー、またはプラスミド配列は、プラスミド配達のため、およびｍＲＮＡま たは組換えタンパク質の生成のために使用てきるであろう。

気道上皮に配達されるポリヌクレオチド配列は、遺伝子発現を制御または安定化 するために、アンチセンス核酸をさらに含み得る。アンチセンス配列は、ＲＮＡ またはＤＮＡに結合して、遺伝子発現を促進または抑制し得る。陽イオンリポソ ームにより配達されるアンチセンス配列は、問題の特定の遺伝子、またはその遺 伝子の調節領域に結合し得る。

例８に示されているように、嚢胞性線維症の粘液に見られるＤＮＡは、気管支の 上皮細胞におけるＣＦＴＲ遺伝子の効率的な陽イオン脂質媒介配達を妨げると予 想される。

遺伝子配列の陽イオン脂質複合体と一緒にデオキシリボヌクレアーゼを投与すれ ば、粘液中に存在する阻害ＤＮＡを加水分解すると予想されるであろう。しかし ながら、ＤＮＡはまた、製剤中の治療ＤＮＡ配列を消化するであろう。

ＣＦＴＲ遺伝丑をデオキシリボヌクレアーゼと一緒に投与することを可能にする ために、賦形剤のｐＨは、デオキシリボヌクレアーゼを阻害するｐＨまて上昇ま たは下降され得る。デオキシリボヌクレアーゼはさらに、肺に配達されるときに のみ活性化されるであろう。さらに、ＤＮＡは、修飾されて、デオキシリボヌク レアーゼの消化に対してより耐性かあるようにされ得る。たとえば、環状ＤＮＡ が使用されれば、線状ＤＮＡか優先的に分解されるように、エキソヌクレアー七 を肺に加えることができるであろう。

配達されるポリヌクレオチドかＤＮＡであるこの発明の別の実施例に従えは、デ オキシリボヌクレアーゼは、遺伝子配達の２ないし４時間前に投与され得る。さ らに、残留デオキシリボヌクレアーゼ活性は、遺伝子治療の前に標準の実験手段 によりモニタリングできる。体位ドレナージおよび洗浄を含む他の方法は、肺粘 液の粘性を低減するための、デオキシリボヌクレアーゼ治療の代替例としてここ に開示される。ＤＮＡを投与する前に、デオキシリボヌクレアーゼ治療の後に肺 を洗浄し、それによりデオキシリボヌクレアーゼのポリヌクレオチドへの阻害効 果を低減することかさらに可能である。ＤＮＡを修飾しかつデオキシリボヌクレ アーゼの消化に対して耐性かあるようにてきない限り、またはデオキシリボヌク レアーゼに晒されるＤＮＡが最小でない限り、ＤＮＡよりもｍＲＮＡか好ましい 。

ＲＮＡの調製 逆転写酵素かなけれは理論上ＲＮＡ配列は宿主ゲノムに組込まれないため、一般 に、ＲＮＡヘースのＣＦ治療には、ＤＮＡヘースの治療よりも制限となる問題か 少ないと考えられるてあろう。ｍＲＮＡｔ□ランスフェクシスれた配列からの発 現の持続時間は、類似のＤＮＡ配列よりも短いか、これは肺におけるＣＦＴＲ遺 伝子治療に関する問題とはならない。気管支の上皮細胞は本来入れ代わるもので あり、この入れ代わりはＣＦ患者においてはより早く起こり得る。

したかって、これらの細胞からの長期のＤＮＡ発現の潜在的な利点は、細胞の入 れ代わりの結果失われ得る。例１２において議論されるように、この治療のため の企図されたエアゾール経路による投与は、容易に毎日または１日に２回でも行 なわれ、したかって、配達系の持続期間かより長いことへの必要性は、他の組織 に向けられる遺伝子治療に比べてそれはと重要ではない。

この例から、ｍＲＮＡを調製するために、ＣＦＴＲ構造体はＴ７ＲＮＡポリメラ ーゼプロモータを含む第２のプラスミドｐＳＣ−ＣＦＴＲ−２に運搬される。こ のブラスミＩ・の構造は、グレゴリ−（Ｇｒｅｇｏｒｙ）他により示されている （Ｎａｔｕｒｅ　３４７：３８２−３８（ｉ、　１９９０、これは引用によりこ こに援用される）。プラスミ！〜はＡｖａ　Ｉで線状にされ、線状にされたＤＮ Ａのアリコートは、適切なヌクレオチド、リボヌクレアーゼ［■害剤、Ｔ７ＲＮ Ａポリメラーゼ、ジチオ）〜レイＩ・−ル、および必要なＩへリス（Ｔｒ　ｉ　 ｓ）　−ＨＣ］緩衝液と混合される。この方法は当業者に周知であり、Ｍａ旧ａ ｔｉＳに詳細に説明されている。一旦、ｍＲＮＡか調製されると、ＲＮＡ分子に ５′末端塩基（通常、グアニン）を付加することか必要となり得る。細胞質にお いて、これは、グアニリルトラシスフエラーセにより行なわれる。この「５′キ ヤツプ」は、ｍＲＮＡに安定性を与える。

インビトロでの転写反応には、５′キヤツプを転写生成物に付加するための２つ の方法のうちの１つが使用される。

キャップ類似体は、転写反応の間、または転写後にＲＮＡに直接組込まれ、５′ 末端キヤツプをｍ　ＲＮ　Ａ転写物に運ぶように、グアニリルトランスフエラー ゼが添加される。

これらの方法はともに、コストが高く比較的非効率的である。残りのキャップの ないメツセージは不安定であり、脂肪／核酸複合体の調製の間に分解するか、ま たは翻訳が起こり得る前に細胞内で分解し得る。

５′キヤツプ構造の代替物を使用して、ある程度成功が収められている。脳心筋 炎ウィルス（ＥＭＶ）を含むピコルナウィルス属の中には、本来キャップされて いないｍＲＮＡを有するものもあるか、それらは翻訳され安定している。５′の 非翻訳領域における６５０のｂｐ（塩基対）配列は、キャッピング構造なしてリ ポソーム結合を可能にするリポソーム結合部位を与える（エルロイ−シュタイン （Ｅｌｒｏｙ−３ｔｅｉｎ）他、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　（ＵＳＡ）　８６：６１２６−６１３０．　１９８９、これは引用によりこ こに援用される）。

この配列は、プロモータ配列のすぐ下流に配置され、発現を５ないし１０倍高め ることができる。この配列を使用することにより、製造コストを低減して、安定 したｍＲＮＡを生成させることか５丁能となる。

さらに、転写物の安定性を高めるため、またはＲＮＡの翻訳の効率を向上させる ために、他の制御配列を付加することかできる。環状ｍＲＮＡ、化学的にブロッ クされたｍＲＮＡ、および５′キヤツプを有するｍＲＮＡ等のエキソヌクレアー ゼ耐性ＲＮＡは、インヒポにおける半減期がより長いため、好ましい。ある好ま しいｍ　ＲＮ　Ａは、課題の遺伝子の前にポリオウィルスの５′の非翻訳領域か ある自己環化ｍＲＮＡである。環状ｍＲＮＡの半減期は非常に長いこと（バーラ ンｔ”　（Ｈａｒｌａｎｄ）他、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　１０２：　８３７− ８５２．１９８８）　、およびポリオウィルスの５′の非翻訳領域は通常の５′ キヤツプなしてｍＲＮＡの翻訳を促進できること（ペレティア（Ｐｅｌｌｅｔｉ ｅｒ）他、Ｎａｔｕｒｅ　３３４：３２０−３２５゜１９８８、これは引用によ りここに援用される）か立証されている。この発明はまた、リボヌクレアーゼに よる接近を防ぐために５′および／または３′末端で化学的にブロックされるｍ ＲＮＡの使用を含み得る。そのような化学的ブロックは、インヒポでのＲＮＡの 半減期を実質的に延ばすことかできる。そのような薬剤は、Ｃ２アミノモディフ ァイア（ＡｍｉｎｏＭｏｄｉｆｉｅｒ）およびアミノ　（Ａｍｉｎｏ）　−７− Ｕ　Ｔ　Ｐ（カリフォルニア月ト＜ロアルト（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ）のクローン チク（Ｃ１ｏｎｅｔｅｃｈ））を含む。転写反応におけるＲＮＡの収率を向上さ せるために、さらなる制御配列をＤＮＡに添加できる。正の配列モティーフの例 は、コサーク（Ｋｏｚａｋ）により示される翻訳開始コンセンサス配列（Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１５：８１２５．１９８７）および翻訳活性 を高めるように作用する５’ＵＴＲ配列　（ヘンツーＴ−（Ｈｅｎｔｚｅ）他、 Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

核酸配列を気管支の気道細胞に配達するための好ましい実施例において、プラス ミドｐＳＣ−ＣＦＴＲ−２由来のＥＭＶ配列を含むｍＲＮＡは、例２およびリポ ソーム製剤と題されたセクションに示されるような好ましい製剤を使用して、陽 イオンリポソームと複合化される。これらの複合体は、エーロゾルとして単独で 、またはデオキシリボヌクレアーゼＩと一緒に気管支の気道細胞に配達される。

これらの複合体は、単独で、またはＣＦＴＲタンパク質を含むリポソームと組合 わせてさらに配達され得る。混合物は、各々の患者の臨床状態に応して個々に調 製される。

本出願人は、１０００リツトルの発酵槽により約ｌＯダラムの精製された遺伝子 か生産されると見ている。この遺伝子のｍＲＮＡ複製物は、インヒドロで酵素に より少なくとも１００倍の増幅で生産され、１ｋｇのｍＲＮＡ生産物を生産する ことかできる。

ＣＦＴＲをコートするｍＲＮＡのトランスフェクションには、インヒポの適用に 関するＤＮＡ　１〜ランスフエクシヨンに比へて多数の利点かある。一旦細胞質 に入ると、ｍＲＮＡは即時の翻訳のためのものである。核酸配列はウイルスの複 製機構の一部分てはなく、かつ宿主ゲノムに組込まれるように設計されていない ため、ｍＲＮＡは、調製しかつ使用するためにはより安全である。さらに、ｍ　 ＲＮ　Ａ遺伝子治療には、細胞への持続性の有害な影響はない。時間とともに、 ｍＲ’ＮＡは分解し、タンパク質の翻訳は減少する。この治療は、標的細胞の本 来の入れ代わりがありかつ治療を繰返すことか予測される肺に行なうのに特に適 切である。

例示的な単位投薬量の組成物は、総体積が約０．　２５ｍＩないし約２５ｍ１の リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）または気管支への点滴注入に適切な生理学的 に許容できる他の適切な担体を含むであろう。好ましくは、組成物は、タンパク 質１モル当り約ｌＸＩＯ２ないし約ｌＸｌ０＠の脂質分子の脂質対高分子モル比 、より好ましくはタンパク質１モル当りか約ｌＸｌ０’ないし約ｌＸｌ０６の脂 質分子のモル比となるのに十分な脂質で複合化された約０．　１ないし約２０ｍ ｇ／ｍｌのｍＲＮＡまたはＤＮＡを含む。

この製剤自体は、ａｕｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ（約１．Ｏｕｇ／ ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌ）、またはそれに相当するものを含み得る。代替的 には、デオキソリボヌクレアーゼは、別々に、好ましくはポリヌクレオチド配達 と同時にまたはその４時間前までに投与され得る。

ＣＦＴＲタンパク質の調製 ＣＦＴＲタンパク質は、上述の構造体から直接生産できる。精製されたプラスミ ドは、チャイニーズハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ）　、ＨｅＬａ、または他の 適切な真核組織培養細胞にトランスフェクトされる。同様に、ＣＦＴＲタンパク 質は、細菌またはバキュロウィルス系において生産できる。所与のタンパク質を 発現させる方法は、タンパク質の大きさ、溶解度、細胞内においてタンパク質が 通常見られる場所、必要とされるタンパク質の量および純度、その電荷、ならび にタンパク質機能のために翻訳後の修飾か必要とされるかどうかを含むがそれに 限らない多数の変数に依存する。したがって、タンパク質の調製のために選択さ れる方法は、所望のタンパク質の個々の特徴により決定される。

ＣＦＴＲは、各々か６つの疎水性へリックスからなる２つのトランスメンブラン ドメインを備えるかなり大きな膜内在性糖タンパク質である。概して、タンパク 質はほとんと外面に晒されない。さらに、ＣＦＴＲ分子は、過剰の正電荷を存し ているようである。

膜内在性タンパク質に関する分離および精製方法は、細胞質タンパク質の分離お よび精製方法とは異なる。疎水性トランスメンプラン配列と膜脂質二重層の非極 性コアとの広範囲な接触は、精製を幾分困難にする。これらのタイプのタンパク 質に関して、精製には、脂質二重層を界面活性剤または存磯溶媒で溶解する必要 かある。これらの膜内在性タンパク質は、一旦可溶化されると、簡単な緩衝水溶 液において沈澱する。長期にわたり水溶性を維持するには、ＳＤＳ等のより強く より激しい界面活性剤か必要である。

これらのより激しい方法を行なえば、タンパク質の変性を引き起こす可能性かよ り高くなる。一旦細胞脂質か溶解されると、ＣＦＴＲ等の膜内在性タンパク質は 、人工膜に組込まれるかまたは再構成され得る。これらの複合体は、プロテオリ ポソームと呼はれる。これらの方法は、コーネリウス（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ）池 により概説されている（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　ｅｔＢｉｏｐｈｙｓ、　ＡＣＴＡ　 １０７１．　１９−６６、１９９１）。

課題の膜タンパク質は、界面活性剤を使用することによりその天然の膜の環境か ら分離され、かつ遠心分離により他の膜の成分から分離される。粗な膜調製物は 、不純物を抽出するために界面活性剤の濃度、温度、持続時間、ｐＨおよびイオ ン強度を制御して使用して、穏やかなＳＤＳ処理で処理され得る。さらに、精製 は、勾配、ゾーン遠心分離法、または可能であれはアフィニティクロマトグラフ ィーを用いて分画を行なうことにより、達成できる。その後、さらに精製するた め、および安定したタンパク質調製物を形成するために可溶化か行なわれる。可 溶化界面活性剤は、膜タンパク質の疎水性部分に結合してそれを覆い、それを最 初の膜脂質から遊離させ、水溶性タンパク質としてさらに精製できるようにする 。

二重音を形成する脂質は、タンパク質に再び添加される。

これらの脂質は、タンパク質を安定化させかつ溶媒とじて作用するのに役立つ。

タンパク質は、同じまたは異なる界面活性剤で脂質と相互に可溶化される。その ような界面活性剤の例には、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００、オクチ ルグルコシ＋’およびＣ１２８８（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ ｓ）のシグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から入手可 能）か含まれる。界面活性剤は、混合されたミセルから取り除かれ、その結果プ ロテオリポソームが自発的に形成される。リボソマット（Ｌｉｐｏｓｏｍａｔ） 　（カナダ、オタワのＭＭデペロツプメンツ（ＭＭ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ））を使用すれば、制御された透析により、均一な単ラメラ小胞が迅速にかつ再 現可能に調製できる。代替的には、非イオン界面活性剤を、パイオービーズ（Ｂ ｉｏ−ｂｅａｄｓ）　（カリフォルニア州すッチモント（Ｒｉ　ｃｈｍｏ口ｄ） のＢＩＯ−ＲＡＤ）で取り除くことかできる。界面活性剤は、１回分ずつ加える ことができかつ遠心分離、濾過またはクロマトグラフィー法により取り除くこと ができるポリスチレンビーズに吸着する。

ＣＦＴＲタンパク質は、ｐＳ−ＣＦＴＲ−２誘導ＣＦＴＲｍＲＮＡから、または トランスフェクトされた細胞から直接生産できる。精製されたプラスミド゛は、 チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）　、ＨｅＬａ、または他の適切な真核 組織培養細胞にトランスフェクトされる。膜に結合したタンパク質は、細胞溶解 物のイムノアフィニティクロマト・グラフィーにより分離される。細菌により生 産されるタンパク質は、恐らくオイスターベルト（Ｏｅｓｔｅｒｈｅｌｔ）およ びス１−イケニウス（Ｓｔｏｅｃｋｅｎｉｕｓ）の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　３１：　６６７−６７８．１９７４）により精製でき る。

上述の発現系のいずれからも生じる比較的純粋であるが依然として膜に結合して いるタンパク質は、オクチルゲルコツト、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１ ００またはＣｌ２Ｅ８で、経験的に決定される界面活性剤：タンパク質の最適な モル比（開始点は、タンパク質Ｉ分子当り１２０ないし１２．０００の界面活性 剤分子である）で可溶化される。選択された１つ以上の脂質（中性、２０１両性 ：ＰＥ、陽イオン性：　ＤＯＲＩ、ＤＯＲＩＥ、ＤＯＴＭＡ等、またはこれらの 組合せ）および選択された界面活性剤（上述のうちの１つ）は、ロータリエバポ レータにおいてガラス瓶の壁上て有機溶媒（たとえはエタノール）から乾燥され 、膜は１晩真空下に置かれ、その後、選択された緩衝水溶液により可溶化される 。タンパク質および脂質溶液は、その後、均一な混合ミセルを形成する十分な時 間を与えて、脂質の相転移温度よりも高い温度で混合される。その後、界面活性 剤は、リボソマッｌ−（Ｌｉｐｏｓｏｍａｔ）またはバイオ−ビーズ（Ｂｉｏ− ｂｅａｄｓ）を使用して取り除くことかてきる。

したかって、ＣＦ治療のための膜融合性「自己配達Ｊリポソームは、慎重に選択 された担体脂質（ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ、ＤＯＲＩ／ＤＯＰＥ、ＤＯＲＩＥ／Ｄ ＯＰＥ、または膜タンパク質との結合により安定化されたＤＯＰＥのみ等）と− 緒に正味の正の電荷のＣＦＴＰタンパク質を使用して製剤される。好ましい製剤 では、ＤＯＲＩ／ＤＯＰＥ脂質は、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００に おいて、精製されたＣＦＴＲと組合わせられる。

さらに、ＣＦＴＲタンパク質は、ウサギの網赤血球溶解物系において、ミクロソ ーム膜およびＱ、５％のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）　Ｘ　−１００界面活性剤の 存在下、ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロで転写されたＲＮＡがらの翻訳に より生産てきる（グレゴリ　ＲＪ　（Ｇｒｅｇｏｒｙ　Ｒｊ）他、ＮａｔＵｒｅ 　３４７：３８２−３８６．１９９０）。

ＤＮＡ、ｍＲＮＡおよびタンパク質に関しては、種々の構造体、調製法、および 精製法かある。そのような例をすべて挙げることは、この発明の意図を示すのに 必要であるとは考えられない。同様の結果を得るために種々の構造体を使用でき ることは、当業者によって容易に認識されるでリポソームの調製に関する方法学 体系を詳細に再検討するには、ダレボリアディス（ＧｒｅｇｏｒｉａｄｉＳ）に ょるｌｉｐｏｓｏｍｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（ＣＦ　Ｃ出版（ＣＦＣＰｒｅ ｓｓ　）　、ニューヨーク、１９８４）　、オストｃ７　（Ｏｓｔｒｏ）にょる Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ　（７−セラクジラカー（Ｍａｒｃｅｋ　Ｄｅｋｋｅｒ　） 　、１９８７）およびリヒテンバーグ　（Ｌｉｃｈｔｅｎｂｅｒｇ）池による概 説（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａ胆旦３３：３３７−４６２．１９８ ８）を参照されたい。

陽イオン脂質媒介トランスフェクションまたはポリアニオン配達における第１の ステップには、陽イオン脂質小胞とポリアニオン高分子との複合体の自発的な形 成か含まれる。このステップは、脂質小胞上の正の電荷を有する基と、たとえば ＤＮＡまたはＲＮＡ上の負の電荷を有するリン酸基との間の強い協働的なイオン 相互作用により媒介される。

上針な量の陽イオン脂質か使用されると、結果として生じる複合体は正味の正の 電荷を有し、したかって細胞表面に自発的に付着する。細胞表面に付着した後す ぐに、細胞膜およびリポソーム膜の融合か起こり、これにより複合体中の物質は リゾソーム区画からの分解から逃れ、細胞質への直接の配達か可能となる。

これらの融合性リポソームの有効成分は、ＤＯＲＩ、ＤＯＲＩＥまたはＤＯＴＭ Ａ等の、二重層を形成する合成陽イオン脂質である。これらの小胞、およびこれ らの小胞か形成する複合体の融合能力は、異なるモル比でリポソーム膜に主にお よび優先的にＤＯＰＥと一緒に組込まれる中性脂質の選択により幾分制圓てきる 。酸化的分解を防ぐために、α−トコフェロール（ミズーリ州セントルイス（Ｓ ｔ。

Ｌｏｕｉｓ）のシグマ社（Ｓｉｇｉｍａ）　）を脂質二重層に添加できる。

電荷の遮蔽を防ぐために、製剤緩衝液のイオン強度は低くなけれはならない。で きるだけ大きいカチオン界面を与えて、ポリアニオン高分子または陰イオンリポ ソームとの最も効率的な複合化、その後の標的細胞との融合、および標的細胞へ の配達を確実に行なうために、できるたけ小さいサイズの単ラメラ小胞をもたら す製剤方法が好ましい。超音波処理またはマイクロ流体化は、これらの基準を満 たす十分に論述されたリポソーム製剤方法である。超音波処理された陽イオンリ ポソームの調製は、フェルブナ−（Ｆｅｌｇｎｅｒ）他による（ＰＮＡＳ、　１ ９８７）　、米国特許出願番号第５１９．２９１号、および例１に記載されてい る。

核酸、ポリアニオンタンパク質、および他の高分子は、例２に示されるように、 陽イオン脂質小胞と直接複合化できる。しかしなから、ポリアニオンは生物活性 分子のサブセットのみを表わすため、中性または陽イオン分子に適切な配達可能 な陽イオン複合体を調製するために、他の脂質または方法を使用しなければなら ない。ペプチド等の小さい極性または疎水性分子、小さいタンパク質（酵素）、 薬剤等は、中性、負または正の電荷を有するリポソームにカプセル化できる。大 きい陽イオンタンパク質は、中性脂質と直接複合化され得るか、または最初に陰 イオン脂質と、その後陽イオン脂質と順次複合化され得る。親油性または両親媒 性分子はさらに、陽イオン小胞の脂質二重層に挿入できる。

生物活性分子を陽イオンリポソームにカプセル化または組込むことにより、トラ ンスフェクションと同様に、それらを標的細胞の膜または細胞質に「直接Ｊ配達 することが可能となる。

この発明の陽イオン脂質で、文献に発表されかつ当業者に既知であるリポソーム 製剤方法に従って、小胞が形成される。利用できるリポソーム技術は、生体分子 を分解せず、確実に捕獲率を高くし、均一な大きさの小胞群を生じさせるもので ある。そのような方法の例には、ウィルシャット。

Ｊ　（Ｗｉｌｓｈｕｔ、　Ｊ）他の逆相蒸発法（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　１ ９：６０１１−６０２１．１９８０　）　、メイヤー、Ｌ　（Ｍａｙｅｒ、　Ｌ 、）他による凍結−融解エクストルージョン（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　ｅｔ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓ　ＡＣＴＡ　８５８・１６１〜１６８．１９８６）　、種々の界面活性 剤透析法（リボソマット（Ｌｉｐｏｓｏｍａｔ））　、水和の前に繰返し行なわ れる単純な凍結／融解法、または米国特許出願番号第５１９．２９１号に記載の 他の方法か含まれる。これらの方法すへてにおいて、親油性または両親媒性分子 は、有機溶媒中においてリポソーム製剤の脂質成分で、または界面活性剤を使用 して一緒に溶解される。製剤緩衝水溶液中に溶解された極性または疎水性分子は 、乾燥詣質膜に直接与えられる。特異的な製剤は、例３、例６および例７に見ら れる。

陽イオン脂質小胞にカプセル化されないまたは直接組込まれない生物活性分子は 、負の電荷をもったリポソームを組込み得る。

電荷上口かまたは正味の負の表面電荷を持つ従来のリポソームは、主に受容体媒 介のエンドサイト−シスを介して組織培養細胞に入ることか示されている。それ らはコーティングされた孔を介して内在化され、その後、この孔により、細胞の リゾソームの区画に配達され、そこて分解される。

正味の負の表面電荷を示す小胞は、正の電荷を有する小さな小胞と複合化（コー ティング）され得る。負の電荷を有する小胞または一次複合体に添加される正の 電荷を存する小胞の量は、標的細胞面への付着および融合を促進するのに十分な 正味の正の表面電荷を有するリポソーム−リポソーム複合体を生産するのに十分 な量でなければならない。

細胞膜とリポソーム膜（あるいは、陽イオンリポソーム膜と陰イオンリポソーム 膜との）融合か起こることにより、親油性または両親媒性分子が細胞膜に組込ま れること、および極性または疎水性分子が細胞質に配達されることが可能となる 。理論上は、正の電荷を有するリポソームにより寄与される正の電荷の数は、負 の電荷を有する脂質および陰イオン小胞により運ばれたタンパク質または他の分 子により寄与される負の電荷の数よりも多くなければならない。

この方法により、主に陰イオンリポソームと結合した生物活性分子に媒体を与え 、存利な陽イオン脂質媒介の細胞内配達経路を間接的に利用して、リソソームの 分解を防ぐ。

文献に発表されかつ当業者に既知であるリポソーム製剤法に従い、選択された陰 イオン脂質（ＤＯＰＧ）を中性脂質（ジオしオイルホスファチジルコリン、ジオ しオイルホスファチジルエタノールアミン、コレステロール、またはスフィンゴ ミエリン）と−緒に用いて、小胞が形成される。

適用できるリポソーム技術は、生体分子を分解せず、高い捕獲率を保証し、結果 として、均一な大きさの小胞群を形成する技術と同様である。

ポリヌクレオチド／陽イオン脂質複合体は、減菌水または低イオン強度の溶液（ １０％スクロース、５％ソルビトールまたは５％グルコース）中でポリヌクレオ チドを懸濁し、０５ないしＩｍｇ／ｍｌのポリヌクレオチド溶液０゜５ｍｌを４ ０−］００ｕｇ／ｍｌの超音波処理されたリポソーム混合物０．５ｍｌと混合し て等張液を作ることにより調製される。脂質試薬はポリスチレンチューブに置か れ、ＤＮＡ溶液は静かに攪拌しなから脂質に加えられる。理想的には等しい体積 のＤＮＡおよび脂質は、０．５ないし１００のヌクレオチドモノマーに対する陽 イオン脂質モノマーの比で加えられる。これらの方法は、フェルブナ−，Ｐ。

Ｌ　（Ｆｅｌｇｎｅｒ、　Ｐ、　Ｌ、’）による（ＰＮＡＳ、＋９８７）　、な らびにフェルブナ−，Ｐ　（Ｆｅｌｇｎｅｒ、　Ｐ、　）およびＭ、ホルム（Ｍ 、　Ｈｏｌｍ）による１９８９年春のＰｏｃｕｓ　Ｉ　１　（２）に本質的に記 載されている。溶液中のポリヌクレオチドの濃度は、約０、　０１１１　ｇ／ｍ 　Ｉないし５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくはｌｕ　ｇ／ｍ　Ｉないしｌ０ｍｇ／ｍｌ 、最も好ましくはｌＯμｇ　／　ｍ　ｌないし１ｍｇ／ｍｌか可能である。正の 電荷を有する脂質小胞の濃度の範囲は、０．１μｇ／ｍＩないし１００ｍｇ／ｍ １、好ましくはＩａｇ／ｍ１ないし１００ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくはＩＯμｇ ／ｍｌないし５０ｍｇ／ｍｌか可能である。溶液は、低イオン強度、すなわち、 ２５ｍＭの塩化ナトリウムよりもそのイオン強度が低い緩衝液において混合され 得る。ソルビトール、スクロースまたはグルコースは、低イオン強度の等張緩衝 液を与えるため使用され得る。ポリアニオンポリヌクレオチドの陽イオン小胞へ の吸着により、ポリヌクレオチドの負の電荷の性質は低減される。ポリヌクレオ チド／陽イオン脂質複合体における正の電荷対置の電荷の比率は、約１００：ｌ ないし０．１：Ｉ、好ましくは２０：１ないし０．２：１となり得る。

好ましいポリペプチド／脂質製剤において、タンパク質１モル当り１×１０２な いしｌＸｌ０＠の脂質分子か添加され、より好ましくは、タンパク質１モル当り ｌＸＩＯ２ないしｌＸｌ０６の脂質分子が添加される。ＣＦＴＲ，ＤＯＰＣまた はそれらの飽和物等の陽イオンタンパク質に関して、スフィンゴミエリン、ＰＣ ，ＰＥ、およびＰＥとＰＣとの組合せが、陽イオン複合体の製剤に好ましい脂質 である。ボリアニオシ分子および細胞膜融合を促進する量の陽イオン脂質を含む 陽イオン複合体に関して、例６は、ＤＯＰＧおよびＤＯＴＭＡの好ましい製剤を 示しており、例８および例ＩＯは、ＤＯＲＩＥ：ＤＯＰＥに関する好ましい製剤 を示している。

好ましい方法に従えば、脂質成分はクロロホルム等の溶媒中に溶解され、混合物 はガラス瓶の内面で膜として蒸発乾固される。両親媒性脂質分子は、水性溶媒中 で懸濁すると、集まり、１次リポソームとなる。水性溶媒中にたとえは生物活性 物質等の他の分子か存在すれば、例２および例３に示されるように、これらはリ ポソーム内に捕獲される。

そうでなければ、例１に示されるように、空のリポソームが形成される。これら の１次リポソームは、上述の凍結／融解およびエクストルージョン法により、選 択された平均直径まで縮小される。

水和溶液を乾燥詣質膜に加え、１次リポソームを形成する。水和溶液には、等張 生理食塩水（０，９％ＮａＣ１）もしくはリン酸緩衝生理食塩水を含む生物学的 に適合性のいかなる緩衝液、またはｐＨ７，４の１０ｍＭのＴｒｉｓ中に５％ソ ルピ訃−ルもしくは１０％スクロースを含む低イオン強度の緩衝液か可能である 。そのような緩衝液は、当業者に周知である。細胞内配達の目的のための水和緩 衝液中の生物活性物質の濃度は、その物質またはその適用に応じて幅広く変わり 、この濃度は、１ピコグラム／ｍｌないし５００ｍｇ／ｍｌか可能である。脂質 膜の水和の後、結果として生したリポソーム懸濁液は、多くの方法のうちのいず れによってもさらに処理でき、たとえば、試料をヌクレオボア（Ｎｕｃｌｅｏｐ ｏｒｅＴＭ）　（商標）膜に通スト、ｆｌｕ　（７）　孔径に匹敵する大きさの 小胞を生産できる。

ポリアニオンタンパク質または核酸の配達に関して、例２に示されるように、生 物活性分子は陽イオン脂質と直接複合化される。間接的ノｙプセル化と呼はれる 代替的な方法において、細胞内配達の目的のｌ：めの高分子は、まず、負の電荷 を有するリポソームにカプセル化されるか、または負の電荷を有する空のリポソ ームと複合化される。最初に負の電荷を存するこれらの複合体は、その後、正の 電荷を存する脂質小胞と複合化される。反対の電荷を有する脂質小胞を含む２つ の溶液を混合するとすぐに、自発的に複合体が形成され陽イオンリポソームが生 産される。

カプセル化する負の電荷を有する小胞に添加される正の電荷を存する小胞の量は 、複合体の標的細胞面への付着を促進するのに十分な量てなければならない。さ らに、正の電荷を有するタンパク質は、陽イオン脂質に共有結合することかでき る。したかって、最終的な複合体における正の電荷対置の電荷の比率は、約１０ ０：１ないし０．１：１、好ましくは２０　ｌないし０．２：１となり得る。

例１：超音波処理された小さいｆ空の」陽イオンリポソームの調製 使用される脂質・モル比１：Ｉの、ＤＯＲｌ５ＤＯＲＩＥ、またはＤＯＴＭＡと ＤＯＰＥ、水和緩衝液：減菌脱イオン水、またはソルビトール、スクロースもし くはグルコースて等張にされた低イオン強度の生物学的緩衝液（たとえは１０ｍ Ｍ、ｐＨ＝７．４のＴＲＩ　Ｓ）　、酸化防止剤：脂質全体の０，１５モル％の α−トコフェロール。

５マイクロモルのＤＯＴＭＡＳＤＯＲＴまたはＤＯＲＩＥを、小さいガラス瓶に おいて約０．５ｍｌのクロロホルム中で５マイクロモルのＤＯＰＥおよび０．０ １５マイクロモルのα−１・コフェロールと混合し、脂質混合物を、ロータリー エバポレータ（スイス、ブリンクマン（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ）のブチ−ロータベ ーパ（Ｂｕｃｈｉ　Ｒｏｔａｖａｐｏｒ））において、または穏やかな窒素気流 下で乾燥し、その後真空ポンプにより１晩真空排気して、溶媒の痕跡を取り除く 。その後、薄い脂質膜を、選択された０、５ｍｌの緩衝液を含む、蓋をして密閉 した瓶において水和して多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）を形成し、撹拌して、最後に 、モデル（Ｍｏｄｅｌ）　３５０ソニケータにューヨーク州ファーミングデール （Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ）のヒートシステムーウルトラソニックス（Ｈｅａｔ 　Ｓｙｓｔｅｍｓ−［ＪＨｒａｓｏｎｉｃｓ）　）において透明になるまで（約 １０ないし２０分間）超汗波処理する。

例２．ポリヌクレオチ）−または陰イオンリポソームの、小さい空の陽イオンリ ポソームとの複合化使用の直前に、ポリスチレンテストチューブにおいて１ｍｇ ／ｍｌのｒｎＲＮＡもしくはＤＮＡ溶液または陰イオンリポソームの懸濁液０． ５ｍｌを小さい「空の」陽イオン脂質懸濁液（たとえは例１）０．５ｍｌに加え 、おだやかに攪拌する。陰イオンまたは核酸塩基ユニッ１〜対陽イオン賭質のモ ル比は、Ｉ・５である。リポソーム懸濁液はどちらも、それらの製剤緩衝液、ま たは組織培養物への適用の場合には血清を含まないオプティーメム（ＯＰＴｉ− ＭＥＭ）　（メリーラント州ベセスダ（Ｂｅ　ｔｈｅｓｄａ）のＧ［ＢＣＯ）で 、濃縮ストック溶液から所望の濃度まで（たとえば、１００マイクロモルのＤＯ ＴＭＡおよび２０マイクロモルのＤＯＰＧでは、１ｍｌ中に５０ナノモルのＤＯ ＴＭＡおよび１０ナノモルのＤＯＰＧの混合物が得られるように）新たに希釈さ れる。

例３：脂質二重層における、ローダミン−ＰＥで標識付けされた陰イオンおよび 陽イオンリポソーム５マイクロモルのＰＯＰＣ（１−バルミ！・イル−２−オレ オイル−ホスファチジルコリン）、２マイクロモルのＤＯＰＧ、３マイクロモル のコレステロール、０．０５マイクロモルのローダミン−ＰＥ、および００１５ マイクロモルのα−トコフェロールからなる混合物を、小さいガラス瓶に入れて ０５ｍｌのクロロホルム溶液からロータリエバポレーターで乾燥し、さらに真空 ポンプでｌ晩真空排気した。同様に、５マイクロモルのＤＯＰＥ、５マイクロモ ルのＤＯＴＭＡ、ＤＯＲ＋またはＤＯＲＩＥ、０．０５マイクロモルのローダミ ン−ＰＥおよび０．０１５マイクロモルのα−トコフェロールの混合物を、小さ いガラス瓶に入れて０．５ｒｎｌのクロロホルム溶液からロータリーエバポレー ターて乾燥し、さらに真空ポンプで１晩真空排気した。ガラス瓶中の乾燥した脂 質を、１０ｍＭ、ｐＨ＝７゜４のＴＲＩ　Ｓ／ソルビトール緩衝液０．５ｍｌで 水和し、その後、例１に示されるように音波処理した。

代替的には、これらの製剤は、エクストルーダ（Ｅｘｔｒｕｄｅｒ）　（カナダ 、バンク−バーのりペックスバイオメンプラン社（Ｌｉｐｅｘ　Ｂｉｏｍｅｍｂ ｒａｎｅｓ　Ｉｎｃ、））において、選択された孔径（５０，８０，１００また は２００　ｎｍ）のポリカーボネート膜を介する複数のエクストルージョンサイ クルを行なうかまたは行なわずに、上述のように凍結／融解され得る。

インビトロでの陽イオンリポソームの融合性の証明主に中性および／または負の 電荷を有するリン脂質て製剤された従来のリポソームは、受容体媒介エンドサイ ト−シスにより組織培養細胞に入ることが示されている。このリポソームは、コ ーティングされた孔を介して内在化され、その後、この孔により、リポソームは リゾソームの区画に配達され、そこでリポソームは分解される。

脂質小胞の動きは、エビ蛍光顕微鏡法（エビフルオレッセンス・マイクロスコピ イ）により目で見ることができる。

ＣＶ−を細胞（アフリカミトリサルの腎臓、ＡＴＣＣから入手）を、例３に示さ れる調製法を使用した、蛍光で標識されたリポソーム製剤に晒す。リポソーム製 剤に配達された小胞には、はっきりとした斑点か現われ、細胞膜と融合した小胞 には、分散した染色が見られる。これらの小胞の細胞内での局在化を、さらに正 確に示すことかできる。細胞を８−ヒドロキシ−１，３，６−ピレントリスルホ ンピラニン（ＨＰＴＳ）で前処理すると、リソプーム着色性緑色蛍光染料は細胞 のリソソームの区画を強調する。ローダミンホスファチジルコリン（Ｎ−（リサ ミン（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホニル）ホスファチジルエタノー ルアミン）を脂質小胞に組込むことにより、ＨＰＴＳを使用したリゾソームへの 局在化は、他の細胞内部位への配達と容易に識別され得る。緑色（ＨＰＴＳ）お よび赤色（Ｒｈ−ＰＥ）の蛍光は、それぞれ紫色および緑色フィルタブロックで 観察できかつ連続的に撮影できる。一般の細胞の外観は、微分干渉コントラスト （ＤＩＣ）ＩＩ微鏡て見ることかできる。中性または陰イオン脂質小胞は、ロー ダミン−ＰＥプローブをリポソーム製剤に配達し、はっきりした斑点を現わす。

これらの脂質は、物質の細胞質または細胞膜への配達においては有用でない。ロ ーダミン−ＰＥ膜プローブは、細胞膜を、小胞を含むＤＯＲＩＥに晒した後に標 識付けするために使用される。分散した蛍光パターンは、小胞がプラズマ膜およ び細胞内膜と融合した結果上じるものである。

このパターンは、リポソーム製剤ＨＰＴＳおよび負の電荷を持った脂質小胞に見 られるはっきりした斑点のパターンとは非常に異なる。

例４・蛍光脂質を細胞膜に配達する陽イオンリポソームＣＦＴＲｆ１酸配列を細 胞に配達するには、リポソームか細胞表面と融合すること、および細胞の転写お よび翻訳機構か核酸を処理できる細胞質にリポソームの成分を放出することか必 要である。しかしなから、ＣＦＴＲタンパク質を効率的に配達するためには、タ ンパク質が正しい配向て細胞膜に挿入されなけれはならない。膜タンパク質を細 胞膜に配達するリポソーム配達系の能力をテストするために、ＤＯＲＩＥ小胞を 、痕跡量（０，５Ｍ％）のリサミン（Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ）ローダミンＢスルホ ニルホスファチジルエタノールアミン（アラバマ州ハーミンガム（Ｂｉｒｍｉｎ ｇｈａｍ）　、アノくンティポーラリピト（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒ　Ｌｉｐ ｉｄｓ））で、例３に示されるように調製した。ホスファチジルエタノールアミ ンに結合される蛍光標識は、標的細胞におけるタンパク質の視覚化をシミュレー トする膜プローブである。したがって、この蛍光膜標識は、固有の立体配置で膜 二重層に同様に固着されるＣＦＴＲＩＩ！内在性タンパク質である。

結果は、細胞表面膜の染色を示した。細胞に斑点の染色は観察されず、これは大 部分のリポソームかリゾソームではなく細胞表面に結合していることを示してい る。

コントロール実験区において、Ｒｈ−ＰＥ標識陰イオン小胞は、既にＨＰＴＳて 染色されたＣＶ−１細胞に配達された。ＣＶ−１細胞を、フェルブナ−（Ｆｅｌ ｇｎｅｔ）他（ＰＮＡＳ。

１９８７）により開示されるようにオプテイーメム（ＯＰＴ［−ＭＥＭ）で処理 した。５ＸＩＯ’の細胞を、脂質二重層において、Ｒｈ−ＰＥて標識した２ｎモ ルのＤＯＰＧに３７°Ｃて１時間晒した。細胞を洗浄し、必要であれば、冷アセ トンまたはイノプロパツールに０°Ｃて１２分間固定し、エビ蛍光顕微鏡法を使 用して調へた。同じ緑色および赤色の斑点の蛍光染色パターンにより判断される ように、陰イオン小胞は、Ｒｈ−ＰＥをリソソームに配達した。対照となるＲｈ −ＰＥ陽イオン小胞は、細胞に分散した染色パターンを与えた。

例５：陽イオン小胞と複合化されたときの、小胞を含む標識ＤＯＰＧの摂取の向 上 ローダミン標識ＤＯＰＧ小胞は陰イオンであり、組織培養細胞に配達されると、 エンドサイト−シスによる摂取およびリソソームの局在化を示す斑点の染色パタ ーンが観察された。

Ｒｈ−ＰＥて標識された負の電荷を有するリポソーム（２ｎｍｏｌのＤＯＰＧ） は、オプティーメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ）においてリボフエクチン（い四ｆｅｃ ｔｉｎＴＭ）　（商標）　（１０ｎモルＤＯＴＭＡ）と複合化された。ＣＶ−１ 細胞は、３７°Ｃて４時間または２４時間、Ｒｈ−ＰＥ　ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＧ 複合体で処理された。Ｒｈ−ＰＥ／ＤＯＰＧのみて処理された培養物は、リポソ ーム配達系を意味する斑点の蛍光染色パターンを有し、ＤＯＰＧ／ＤＯＴＭＡ複 合体で処理された細胞は、融合を意味する細胞膜に分散する染色を有した。小胞 の表面上に陽イオン脂質か存在することにより、陰イオン脂質成分はリゾソーム の区画を回避することか可能となった。４時間の潜伏時間よりも２４時間後の方 か、膜の分散した染色はより多く観察された。

例６：陽イオン脂質小胞を使用した、ローダミンファロイシンまたはβ−ガラク トソダーゼをカプセル化する陰イオン小胞の摂取の向上 ローダミンファロイジンおよびβ−ガラク１−シダーゼは、負の電荷を有するリ ポソームに別々にカプセル化された。

β−がラクトノダーゼは、発色性基質Ｘ−ｇａｌを開裂し、青色のインドイル誘 導体を放出する。１ｍｇ／ｍｌのβ−ガラクトノダーゼは、７．５ｎｍｏｌのＤ ＯＰＧと、または７．５ｎｍｏｌのＤＯＰＧおよび１０　ｎｍｏ　ｌのＤＯＴＭ Ａと腹合ｔヒされた。混合物は、ＣＶ−１細胞に４時間与えられ、その結果Ｘ− ｇａｌの染色が得られた。青色の染色パターンは、β−ガラクトノダーゼの活性 を示した。ＤＯＰＧ小胞に結合するβ−ガラク１−ノダーゼを摂取した培養物に おいて、かすかな青色の斑点か観察された。ＤＯＰＧ　：　ＤＯＴＭＡ小胞複合 体とともにβ−がラクトシダーゼを摂取した培養物は、細胞内の細胞染色を示し た。

ファロイジンは、アクチンフィラメントを安定化させかつ特異的に結合させ、さ らに細胞内の解重合を阻害する有毒なアルカロイド゛である。ファロイジンは細 胞膜を横断せず、したかって、これらの実験において、細胞内にこれが（ｒ在す るということは、リポソーム媒介配達が行なわれたことを示している。

３３Ｎ４のローダミンフッ０イジン溶液は陰イオン小胞に組込まイ１、その後、 ８ｎｍｏｌのＤＯＰＧが、または１２ｎｍｏｌのＤＯＰＧと２０　ｎｍｏ　Ｉの ＤＯＴＭＡとが加えられた。これらの混合物は、３７°Ｃて４時間、２連のＣＶ −１培養物に与えられた。ＤＯＰＧのみを受け取る培養物は、ＨＰ　Ｔ　Ｓて染 色された細胞と類似した蛍光染色パターンを有した。斑点のパターンは、リソソ ームの摂取を示した。ＤＯＰＧおよびＤＯＴＭＡ小胞複合体を受け取る培養物に おいては、アクチンフィラメントのローダミン蛍光染色パターンか得られた。

これらの実験は、ローダミンファロイジンまたはβ−ガラク）・シダーゼをＤＯ ＴＭＡ　：　ＤＯＰＧ小胞に直接組込むこと（間接的な複合体の調製に対する直 接的な複合体の調製）によりさらに繰返され、これらの実験により、膜のより濃 い蛍光染色か得られた。

ファロイジンもβ−ガラクトシダーゼも、膜結合タンパク質てはない。この例は 、膜に結合しないタンパク質が細胞質に配達され、かつその機能を維持すること ができることを示している。本出願人は、他のタンパク質または生物活性物質を 単独で、またはＣＦＴＲタンパク質もしくは核酸と組合わせてＣＦ気道上皮に配 達することか有利であることに注目した。したがって、このタイプの戦法は、タ ンパク質を細胞質または細胞膜に直接配達することを提案している。ＤＯＴＭＡ ／ＤＯＰＧまたはＤＯＰＥ小胞を使用した細胞内でのタンパク質の配達の例を、 以下に説明する。

例７　：　ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥ小胞にカプセル化されたコレラ毒素サブユニッ ｌ−Ａか細胞質に配達され、細胞内サイクリックＡＭＰ生産を刺激する ＣＥＭ細胞における放射性サイクリックＡＭＰの蓄積は、コレラ毒素による処理 の後にモニタリングされた。結果は、図３に示されている。コレラ毒素サブユニ ットＡは、ＤＯＴＭＡ／ＤＯＰＥリソソームにカプセル化ソーた（黒丸線）。毒 素も、陰イオン小胞にカプセル化された（白い正方形）。コレラ毒素ホロ毒素は 、正のコントロールとして使用された（黒い四角形）。図３は、コレラ毒素サブ ユニットへの濃度を増加して使用した場合の結果を示している。

結果を見ると、この適用に関しては、脂質と複合化したタンパク質の直接的な接 近の方か間接的な接近よりも効果的であった。

タンパク質および核酸配列を嚢胞性線維症患者の気道上皮に配達するには、リポ ソームを粘性のある粘液で満たされた肺に効果的に配達することか必要である。

ＣＦの粘液の粘性を減少させるためにデオキシリボヌクレアーゼＩか使用され、 過去においては常に使用されていた。以下に、リポソームの配達の前またはそれ と同時に、ＣＦの肺をデオキシリボヌクレアーゼＩて処置することにより、粘液 の粘性の低減だけか寄与しているとはいえない生物活性分子の配達に関する予期 せぬ利点かもたらされることを示す証拠を示す。

例８・インドｊ・口におけるＤＮＡによるＤＯＲＩＥ小胞の膜融合の阻害 例３に説明されるように、ＤＯＲＩＥ　：　ＤＯＰＥ小胞は、ローダミン−ＰＥ で標識された膜であった。ＣＶ−を培養物は、オブティーメム（Ｏｐｔｉ−ＭＥ Ｍ）において、または５０ｕｇ／ｍｌの子牛の胸腺ＤＮＡを有するオプティーメ ム（Ｏｐ　ｔ　ｉ−ＭＥＭ）において準備された。ローダミン−ＰＥを含む陽イ オンリポソームか、２連て、子牛の胸腺ＤＮＡとともにまたはそれなして、既に ＨＰＴＳて染色されたＣＶ−１培養物に加えられた。子牛の胸腺ＤＮＡを含む培 養物は、子牛の胸腺ＤＮＡを含まないＣＶ−１培養物と比較して、表面の分散し た蛍光（Ｒｈ−ＰＥ）の大幅な減少、および表面の斑点の蛍光の増加を示した。

したがって、外来性ＤＮＡは、視覚的には培地の粘性を増加しない濃度で、陽イ オンリポソーム媒介配達を直接阻害したことになる。この阻害活性に関して説明 すると、ＤＮＡは、陽イオンリポソームに直接結合して正味の正の電荷を中和し 、それによりリポソーム複合体の配達の能率を低減するものである。

嚢胞性線維症患者において、気管支の気道は、非常に濃度の高いＤＮＡ　（３− １４ｍｇ／ｍＩ）を含む粘液で満たされている。この濃い粘液層は、リポソーム の配達に対する物理的障壁となるはかりでなく、ここに示されるように、強力な 化学的障壁となる。

例９．デオキシリポヌクレアーゼ処理によるＤＮＡの膜鎌合阻害活性の反転 この実験区に関するプロトコルは、例８に示したものと同一である。ＨＰＴＳか 与えられたＣＶ−１細胞は、Ｒｈ−ＰＥを備えるＤＯＲＩＥを含む陽イオンリポ ソームに晒された。しかしながら、この区において、ｃｖ−ｉ培養物はすへて、 ５０ｕｇ／ｍｌの子牛の胸腺ＤＮＡを含むオブティーメム（ＯＰＴＩ−ＭＥＭ） てインキュベートされた。これらの培養物の半分は、３７°Ｃて３０分間、５ユ ニツトのデオキシリボヌクレアーゼＩて処理され、その後陽イオンリポソームか 加えられた。処理されていない培養物は、コントロールの役割を果たす。Ｒｈ− ＰＥを存するリポソームは、デオキシリボヌクレアーゼで処理されたおよび処理 されていない細胞培養物で、３７°Ｃで１時間インキュベートされた。インキュ ベートの後に、培養物は洗浄され、蛍光顕微鏡法のために処理された。デオキシ リボヌクレアーゼ処理を受けていない培養物には、分散した蛍光染色かなく、膜 表面の斑点および分離した斑点のリゾソーム染色しかなかった。デオキシリボヌ クレアーゼを摂取した培養物は、ローダミン−ＰＥての分散した膜の蛍光および ＨＰＴＳのみての斑点のリゾソーム染色を示した。これらの結果は、デオキシリ ボヌクレアーゼＩか、ＤＯＲＩＥ小胞の融合性を阻害するポリ核酸の影響をうま く反転できることを示した。

例１Ｏ：インヒホてのＤＯＲＩＥ／ＤＯＰＥ小胞とマウスの肺気骨皮上皮との融 合 例３に議論されるようなローダミンＰＥを含むＤＯＲＴＥ／Ｄ　ＯＰ　Ｅ小胞は 、例８に示されるように調製された。

麻酔をかけられたＣ５７ＢＬ／６マウスは挿管され、０゜０５ｍ１のＤＯＲＩ　 Ｅ／ＤＯＰＥ−Ｒｈ−ＰＥリポソーム製剤（５０−２００ナノモル）か気管に導 入され、気管支の気道に落ちるようにされた。２０時間後、肺を取出し、気管支 上皮の冷凍切片か準備され、エビ蛍光顕微鏡法により評価された。切片は後に、 肺の中の目標物を確認するために、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色された 。肺の切片には、気管支上皮細胞表面に濃いローダミン蛍光染色側１Ｉ：マウス の肺における、β−ガラクトシダー・ゼをコードするＤＮＡの導入後の、レボー タ遺伝子の発現β−ガラクトシダーゼをコードするＤＮＡを含む陽イオンリポソ ームか調製された。これらの実験に関して、図２に示されるようなルシフェラー ゼ遺伝子を、β−ガラクトシダーセ遺伝子と置き換えた。ＤＮＡは、ＤＮＡの調 製と題されたセクションに開示される方法を使用する構造物から調製された。Ｄ ＯＲＩＥ　：ＤＯＰＥは、例１：正の電荷を有するリポソームの調製のセクショ ンに開示された方法を使用して、調製された。生理的食塩水、ＤＮＡ、リポソー ム、およびＤＮＡ−リポソーム複合体は以下のように調製された・１．０．９％ 塩化ナトリウム生理的食塩水。２゜ＤＮＡのみ：生理的食塩水中の１．Ｉ　１ｍ ｇ／ｍｌのｐＲ３ＶＬａｃＺ２２０μｌを、２８０μｌの減菌水て希釈した。３ ．脂質のみ：６．０４ｍＭ　ＤＯＲＩＥ３９０μｌ：滅菌水中６．０４ｍＭ　Ｄ ＯＰＥ　（ｒＤＯＲＩＥ：ＤＯＰＥＪ　）を、１１０μｍの減菌水て希釈した。

４．ＤＮＡ・リポソーム１　生理的食塩水中１．１１ｍｇ／ｍｌのｐＲ３ＶＬａ ｃ２２２０μｌを、２８０μｌのＤＯＲｒＥ・ＤＯＰＥて希釈した（陽イオン脂 質：　ＤＮＡのモル比２．２）。５．ＤＮＡ：リポソーム１１．生理的食塩水中 １、Ｉ　１ｍｇ／ｍｌのｐＲ３ＶＬａｃ２１１０μｌを３９０μＩのＤＯＲＩ　 Ｅ　：　ＤＯＰＥで希釈した（陽イオン脂質：　ＤＮＡのモル比６．２４）。

各々の溶液約１００μｍを、メトファンで麻酔をかけられたＣ５７Ｂ］／６マウ スの気管に導入した。気管内投与は、ガラスの皮下ＢＤエール（Ｙａｌｅ）シリ ンジおよびミニカス（Ｍｉｎｉｃａｔｈ）　Ｉ　９Ｇ外径７／８インチのチュー ブ（Ｃａｔ、　Ｎｏ、ｌ９１２、デセレットメディカル社（Ｄｅｓｅｒｅｔ　Ｍ ｅｄｉｃａｌＣｏ、りを使用して行なわれた。気管内投与は、胸部の触診により 確かめられた。動物１個体当たりのＤＮＡ／ＤＯＲＩＥ／ＤＯＰＥの総投薬量は 、１００μｍ当りのμｇで、それぞれ、１．＝０１０１０．２．＝４９１０１０ ．３゜＝０／３４０／３５０．４．　＝’４９／２４５／２５１．５゜＝２４／ ３４０／３５０てあった。

肺を、注入の２０後（１匹の動物ごと）および４日後（２匹の動物を１グループ にしてグループごと）に膨張させずに集め、イソペンクン中で一１５０°Ｃて凍 結し、０゜０　Ｔ、に埋込み、クリオスタットにおいて一１８℃で切断した。連 続した１５μｍの切片を集め、スライドガラスの上て溶解させた。これらの切片 を乾燥し、切片を１０番目ごとに、標準Ｘ−Ｇａ１反応混合物（リン酸ナトリウ ム、塩化マグネシウム、フェリシアン化ナトリウム、フェロシアン化すｌ・リウ ム、およびＸ−ｇａｌ）を使用して、β−ガラクトシダーセ酵素活性（機能的Ｌ ａｃＺ遺伝子精製物）に関して組織化学的に３７℃で１晩染色し、その後、ヘマ トキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で対比染色した。隣接する切片を、Ｈ＆Ｅての み染色した。特異的なβ−ガラクトシダーセ遺伝子生成物は、顕微鏡により濃い 青色の細胞質反応生成物として、うまくトランスフェクトされた細胞において見 られた。

結果は、生理的食塩水、ＤＮＡおよび脂質か注入された正常なマウスの胚は、間 質細胞および気道細胞内に幾らかの斑点のおよび桿状のＸ−Ｇａ１の斑点を含む ことを示した。時折、間質細胞のＸ−Ｇａ１ポジティブ細胞質染色がさらに観察 された。一方、脂質−ＤＮＡが注入された肺は、気管支の内面の広範囲の領域に わたって上述のポジティブ染色、およびさらに気道細胞の広範囲の細胞質染色を 含んでいた。

例１２：デオキシリポヌクレアーゼ、陽イオン脂質／ポリヌクレオチドまたはタ ンパク質複合体を用いたＣＦ患者の治療 最初の研究に関して、臨床上安定している、すなわち入院していないかまたは１ ケ月薬物療法を変えていないＣＦＴＲ療法のためのＣＦ患者か選はれる。

この適用に関しては、肺に深く浸透させるために必要な小さい液滴か必要でない ため、患者は最初に、手で持つ噴霧器からスプレーとして配達可能な液体組成物 で毎日または１日２回治療さ１１る。液体配達は、気道上皮細胞のためのもので ある。デオキシリボヌクレアーゼ■は好ましくは、粘液の粘性が減少するまで単 独で、または脂質と複合化された治療のだめの高分子と一緒に配達され得る。２ ．５ｍｇのｍＲＮＡ（好ましくは０．１−２０ｍｇ／ｍｌの範囲）、５ｍｇのＣ ＦＴＲタンパク質（０，１−１０ｍｇ／ｍｌ）、またはその両方を含む２．５ｍ ｌ　（好ましくは０゜２５ｍ１ないし２５ｍ１の範囲）の投薬量か、細胞膜と融 合する陽イオン複合体を形成するのに適切な脂質、および必要てあれは、３ｕｇ ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ１　（１，Ｏｕｇ／ｍ！−１０ｍｇ／ｒｎｌ ）とともに、噴霧器に入れられ、吸入される。希釈されたポリヌクレオチド、タ ンパク質、デオキシリボヌクレアーゼＩおよびリポソームの溶液は、肺吸入に適 切な緩衝液（たとえば、０．９％ＮａＣ］）に希釈することにより、濃縮ストツ タから調製さオ］る。これらの治療は、臨床上の改善か見られるまで定期的に繰 返すことかできる。

所与の患者に合わせて、正確な投薬による治療法の回数およびｌを変えてもよい 。この方法は動物テスｌ〜の間に最適化され、従来の評価法に従って臨床テスト の間に完成される。

デオキソリボヌクレアーゼの最大の活性を促進するために、特に陽イオンリポソ ーム複合体製剤において、マンガンおよびマグネシウムイオンを含む有効な緩衝 液中に酵素を入れて患者に与え、最大のヌクレアーゼ活性を促進することができ る。

患者は、毎日または１日に２回、エーロゾルによりＣＦＴＲ遺伝子の投薬量を直 接肺に受ける。単純なハンドバルブ噴霧器からのスプレーで、目標とする気管支 上皮細胞に届かせることかできる。治療の効力を維持するために、リポソーム複 合体か単独で、または必要に応じてデオキシリボヌクレアーゼＩと一緒に与えら れる。

効力は、治療を受けた嚢胞性線維症患者から集められた気管支上皮細胞における ＣＦＴＲ遺伝子生成物の存在、またはＣＦＴＲタンパク質の存在を、組織化学的 免疫法を使用して検定することにより決定される。さらに、患者の肺機能の改善 を臨床的に評価する。この評価は、痰の粘弾性の測定、呼気の容量および中呼気 の最大流量の向上を含む肺機能の向上を含み得る。抗生物質が患者の治療の一部 分として一緒に投与される場合には、治療後の細菌の計量も含まれ得る。ＣＦの 臨床上の向上に関する診断テストとともに肺機能テストは、当業者に周知である 。

ここに開示するこの発明は、キットに処方できることかさらに企図される。この キットは、デ才キソリポヌクレア−セ、治療のための分子（ＣＦＴＲ核酸、ＣＦ ＴＲタンパク質、またはＣＦの原因に関係する他の核酸、タンパク質もしくは池 の生物活性物質）の投薬量を単独て、または選択された脂質と複合化して保持す るための１つ以上の容器を含み得る。製剤を配達するための装置か、さらに企図 される。この装置は、好ましくは、手で持つ噴霧器等であるか、シリンジ状の装 置、もしくは気管への点滴注入に適切な池の装置、またはセンチミスト（Ｃｅｎ ｔｉｍｉｓｔ）噴霧器（ミズーリ州ブルースプリングス（Ｂｌｕｅ　Ｓｐｒｉｎ ｇｓ）のインチツク社（［ｎｔｅｃ　Ｃｏｒｐ、　））等のより複雑なエーロゾ ル化装置も可能である。容器を従来の吸入または噴霧装置に接続するため、およ び組成物をそのような装置を介して患者に導入するための装置もまた企図される 。この装置は、嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するための高分子、お よび高分子をデオキシリボヌクレアーゼと一緒にまたはそれなして配達するのに 適切な陽イオン脂質を含む薬剤組成物を保持する１つ以」二の容器を含む。適切 な装置を含むキットは、種々の年齢層に応じた種々の投薬量でパッケージされ、 １回分または複数回分の投薬量を含み得る。

上述の例は、この発明の好ましい実施例を示すものである。池の変更も企図され 、そのような変更はここに開示された発明の範囲から外れるものではないことは 、当業者により容易に認識されるであろう。これらの説明は、ガイドラインとな るものであって、この発明を制限するものてはない。

ＦＩＧ、　３；Ａ ’　し”７’４　（Ａ”Ｔ７”＞　２−ｙヒ　−ＶＬ　（ｐｍｏｌ／ｍｌ）国際 調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　マンソープ、マーストン・シイアメリカ合衆国、９２１２９　 カリフォルニア州、サン・デイエゴ、ケストラル・ストリート、１２４１８

Claims (31)

【特許請求の範囲】
1. １．肺への投与に適切な薬剤組成物であって、治療上効果的な量の デオキシリボヌクレアーゼと、 嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために機能ポリペプチドを与える 高分子と、 前記高分子をインビボで肺細胞に配達するのに効果的な量の陽イオン脂質とを含 む、薬剤組成物。
2. ２．前記高分子は、前記機能ポリペプチドを効果的にコードするポリヌクレオチ ド配列を含む、請求項１に記載の組成物。
3. ３．嚢胞性線維症患者の肺粘液の粘性を低減するのに効果的な量のデオキシリボ ヌクレアーゼを含み、それにより前記ポリヌクレオチド配列の前記肺細胞への配 達を促進する、請求項１に記載の組成物。
4. ４．前記高分子は機能ポリペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
5. ５．ポリヌクレオチドの量は、治療上効力のある量のポリペプチドをコードする のに十分な量である、請求項２に記載の組成物。
6. ６．前記ポリヌクレオチドは、嚢胞性線維症トランスメンプランコンダクタンス 制御因子（ＣＦＴＲ）をコードする、請求項２に記載の組成物。
7. ７．前記ポリヌクレオチドはＤＮＡある、請求項２に記載の組成物。
8. ８．前記ポリヌクレオチドはｍＲＮＡである、請求項２に記載の組成物。
9. ９．前記ｍＲＮＡには５′キャッピングヌクレオチドがない、請求項８に記載の 組成物。
10. １０．前記組成物はエーロゾルの形態である、請求項１に記載の組成物。
11. １１．前記組成物は、肺への点滴注入による配達に適切な形態である、請求項１ に記載の組成物。
12. １２．前記脂質および前記ポリペプチドは、陽イオン複合体を形成する、請求項 ４に記載の組成物。
13. １３．ポリペプチドの量は、治療上効力のある量である、請求項４に記載の組成 物。
14. １４．前記ポリペプチドは、嚢胞性線維症トランスメンブランコンダクタンス制 御因子（ＣＦＴＲ）である、請求項１に記載の組成物。
15. １５．前記デオキシリボヌクレアーゼは組換えタンパク質である、請求項１に記 載の組成物。
16. １６．前記デオキシリボヌクレアーゼはヒトのデオキシリボヌクレアーゼ１であ る、請求項１に記載の組成物。
17. １７．嚢胞性線維症患者の治療用薬剤の製造のための、請求項１ないし１６のい ずれかに記載の組成物の使用法。
18. １８．前記薬剤は、前記高分子および前記陽イオン脂質とは別の組成物としてデ オキシリボヌクレアーゼを含む、請求項１７に記載の使用法。
19. １９．前記薬剤は、１つの組成物中に、効果的な量の前記高分子および前記陽イ オン脂質を含む、請求項１７に記載の使用法。
20. ２０．嚢胞性線維症の治療のための装置であって、請求項１に記載の治療上効果 的な量の組成物を収容するための容器と、 前記容器と関連して、前記組成物の肺系への配達を促進する配達装置とを含む、 装置。
21. ２１．前記配達装置は、前記組成物をエーロゾルとして配達するように適合され る、請求項２０に記載の装置。
22. ２２．前記配達装置は、前記組成物を肺への点滴注入により配達するように適合 される、請求項２０に記載の装置。
23. ２３．前記高分子は、嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために機能 ポリペプチドを含む、請求項２０に記載の装置。
24. ２４．前記高分子は、嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために機能 タンパク質を効果的にコードするポリヌクレオチド配列である、請求項２０に記 載の装置。
25. ２５．嚢胞性線維症を治療するための方法であって、肺の通路において、粘液に 伴なうＤＮＡの量を減少させるステップと、 嚢胞性線維症に関連する細胞の欠陥を治療するために、機能タンパク質を与える 高分子の効果的な量を、インビボで肺細胞に配達するのに効果的な陽／オン複合 体として前記通路の細胞に配達するステップとを含む、方法。
26. ２６．粘液に伴なうＤＮＡの量を減少させるステップは、肺の洗浄を含む、請求 項２５に記載の方法。
27. ２７．粘液に伴なうＤＮＡの量を減少させるステップは、粘液の粘性を減少させ るのに十分な量のデオキシリボヌクレアーゼＩで前記通路を処理するステップを 含む、請求項２５に記載の方法。
28. ２８．粘液に伴なうＤＮＡの量を減少させるステップは、胸部の打診および体位 ドレナージを含む、請求項２５に記載の方法。
29. ２９．前記肺細胞において前記タンパク質の発現が観察されるまで、前記治療を 定期的に繰返すステップをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
30. ３０．前記高分子は、前記機能ポリペプチドを効果的にコードするポリヌクレオ チド配列を含む、請求項２５に記載の方法。
31. ３１．前記高分子は機能ポリペプチドを含む、請求項２５に記載の方法。