JPH06510420A - 新規なタンパク質チロシンキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規なタンパク質チロシンキナーゼ 本発明は概して、新規なタンパク質チロシンキナーゼと、それをコード化する遺 伝子配列に関する。

タンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）は、細胞内の情報伝達に好適な構造を持 っている。例えば、多くの成長因子レセプターは、同族体リガンドとの相互作用 によって受ける細胞外の刺激を、細胞内のチロシンキナーゼドメインを介して伝 達する。非レセプターＰＴＫの少なくとも一つ、つまりＬＣＫは、細胞表面タン パク質（ＣＤ４）の架橋アンチＣＤ４抗体との相互作用からの情報のＴ細胞にお ける伝達の仲介をすると考えられる。

ＰＴＫのより広い科は、個々の構成種の構造パラメータに基づいて再分できる。

例えば、ＰＴＫのｓｒｃ科には８種あり（マース他（Ｍａｒｔｈ　ｅｔ　ａｌ） 　１９８５　；ニシザワ他（Ｎｉｓｈｉｚａｗａ　ｅｔ　ａｌ）　１９８６　； センバ他（Ｓｅｍｂａｅｔａｌ）　１９８６　；フルチネス他（Ｍａｒｔｉｎｅ ｚ　ｅｔ　ａｌ）１９８７、スケガワ他（Ｓｕｋｅｇａｗａ　ｅｔ　ａｌ）　１ ９８７　；ヤマニシ他（Ｙａｍａｎｉｓｈｉ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９８７　；ホ ラマン他（Ｈｏｔｚｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）　１９８７　；ディメッキ他（Ｄｙｍ ｅｃｈｋｉｅｔａｌ）１９９０）、夫々か、ＳＨ２、ＳＨ３ドメインおよび可変 リガンド結合ドメインを含む触媒外ドメインの特異的補体を持っている。この場 合遺伝子重複のプロセスか起こり、この科の進化的に成功した主題構造か種々の 細胞状況に使用できるようになったことは明かである。同様なＰＴＫの構造的亜 科か、ＦＧＦレセプターおよびＣ３Ｆ−ルセプターの周囲に存在する（ウイルラ ス（Ｗｉｌｋｓ）　１９９０で検討されている）。

しかし、上記ＰＴＫに共通の一つの特徴は、各キナーゼか単一の非常に関連した 「触媒性」　ドメインを持つことである。

本発明は、公知のものと異なるタンパク質チロシンキナーゼを提供する。特に、 本発明のタンパク質チロシンキナーゼは、複数のタンパク質キナーゼ触媒性ドメ インを有する点でユニークである。更に、そのキナーゼはＳＨ２ドメインを持た ない。本発明の新規なタンパク質チロシンキナーゼは、タンパク質チロシンキナ ーゼの新しい亜科ないし種類を表す。

従って、本発明の一面は、多重タンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つが、Ｓ Ｈ２ドメインを持たないポリペプチドからなる動物のタンパク質チロシンキナー ゼ状の分子に関連する。

そのポリペプチドは、２個のタンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つことが望 ましい。

動物は、は乳類であることが望ましく、特にヒトまたはマウスであることが望ま しい。

以下、これらの特徴を持ったタンパク質をｒＪＡＫＪと呼ぶ（ＪＡｎｕｓ　Ｋｉ ｎａｓｅに由来；　Ｊａｎｕｓ、ブリタニカ百科辞典（Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄ ｉａ　Ｂｒ１ｔａｎｎｉｃａ）　（第１１版）　Ｖｏｌ　ＸＶｐｐ　１５５−１ ５６）。本発明は、ヒトおよびマウス由来のＪＡＫ　１およびＪＡＫ２を使用し て具体的に例示する。しかし、本発明は、すべての動物に由来するＪＡＫ科全体 と、その突然変異体、誘導体、類似体および同族体に適用する。

［タンパク質チロシンキナーゼ状分子Ｊという語句（本書でｒＰＴＫＰＴＫ状分 子する）は、本発明がＪＡＫ科のすべての種と、その突然変異体、誘導体、類似 体および同族体を包含することを強調するために、明細書と請求項全体にわたっ て使用される。

本発明はＰＴＫ状分子を提供する。その分子は、生物学的に純粋または実質的に 純粋および／または合成の形であることか望ましい。その調製物の純度は、少な くとも７０重量％、望ましくは８０重量％、特に望ましくは少なくとも９０重量 ％のＰＴＫ状分子からなる試料によって特徴づけられる。代わりとして、酵素調 製物の純度か重要でない場合、本発明は、純粋でないが相当量のＪＡＫ活性を有 するＰＴＫ状分子調製物をも包含する。

本発明は、上記のように生物学的に純粋または実質的に純粋な、自然に存在する ＰＴＫ状分子と、その誘導体、機能的類似体および同族体に関する。そのような 誘導体は、自然に存在する配列に対する単一または多重アミノ酸置換、欠失およ び／または付加を持つポリペプチドを含む。これらの誘導体、機能的類似体およ び同族体も、炭水化物、脂質および／またはタンパク質性部分等の関連分子に対 する単一または多重置換、欠失および／または付加を包含する。本書中で言うｒ ＰＴＫＰＴＫ状分子のような誘導体、機能的類似体および同族体をすへて含む。

本発明は、組換え分子と、アミノ酸基にアミノ酸を所定の順序で段階的に付加す ることによって調製した分子と、を含む合成のポリペプチドにも及ぶ。

本書でＰＴＫ状分子のある範囲の誘導体と類似体が考察され、細胞中または生体 外または合成後の修飾でのその発現時に、ヌクレオチド配列コード化レベルで変 更することを含む。そのような誘導体と類似体は、側鎖の修飾、ポリペプチド合 成時の非天然アミノ酸の組込み、ポリペプチドまたはその類似体に立体配座の抑 制を及ぼす架橋物質や他の方法の使用を非限定的に含む。

本発明か考察する側鎖の修飾の例は、アルデヒドとの反応による還元的アルキル 化の後Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４で還元すること、メチルアセトイミデートを使用したア ミジン化、無水酢酸を使用したアシル化、シアン酸塩を使用したアミノ基のカル バモイル化、２．４．６．）リニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を使用し たアミノ基のトリニトロベンジル化、無水コハク酸と無水テトラヒドロフタル酸 を使用したアミノ基のアシル化、そしてピリドキサルー５“　−リン酸塩を使用 したりシンのピリドキシル化の後Ｎ　ａ　Ｂ　Ｈ４で還元、すること等にょるア ミノ基の修飾を含む。

アルギニン残基のグアニジノ基は、２，３−ブタンジオン、フェニルグリオキサ ル、およびグリオキサル等の試薬を使用した複素環の縮合物の形成によって修飾 できる。

カルボキシル基は、０−アシルイソユリアの形成後に、例えば対応するアミドに 誘導することを介したカルボジイミドの活性化によって修飾できる。

スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを使用したカルボキ シメチル化、過ギ酸のシスティン酸への酸化、他のチオル化合物との混合ジスル フィドの形成、マレイイミド、無水マレイン酸または他の置換マレイミドとの反 応、４−クロロスルキュリベンゾエート、４−クロロスルキュリフエニールスル ホン酸、塩化フェニル水銀、２−クロロヌルキュリニトロ二トロフェノール等の 水銀剤を使用した水銀誘導体の形成、アルカリｐＨでシアン酸塩を使用したカル バモイル化等の方法で修飾できる。

トリプトファン残基は、例えば、Ｎ−ブロモスクシンイミドを使用した酸化、あ るいは２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロマイドまたはスルフェニールハ ライドを使用したインドール環のアルキル化によって修飾できる。一方、チロシ ン残基は、テトラニトロメタンを使用したニトロ化で３−二トロチロジン誘導体 を形成することによって改変できる。

ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を使用したアルキ ル化またはジエチルピロカーボネートを使用したＮ−カルボエトキシル化によっ て行える。

ポリペプチド合成時の非天然アミノ酸と誘導体の組込みの例は、ノルロイシン、 ４−アミノ酪酸、４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−フェニルペンタン酸、６− アミノヘキサン酸、ｔ−ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オル ニチン、サルコシン、４−アミノ−３−ヒドロキシ−６−メチルへブタン酸、２ 〜チエニルアラニンおよび／またはアミノ酸のＤ−異性体の使用を非限定的に含 む。

立体配座を安定化させるために、例えは、ｎ＝１からｎ　＝　６　ｃ７）　（Ｃ Ｈ２）。スペーサー基を持った三官能イミドエステル、グルタルアルデヒド、Ｎ −ヒドロキシスクシンイミドエステル等のホモニ官能架橋物質や、Ｎ−ヒドロキ シスクシンイミド等のアミノ反応性部分およびマレイミドまたはジチオ部分（Ｓ Ｈ）またはカルボジイミド（ＣＯＯＨ）等の他の群特異反応性部分を通常含むヘ テロ二官能試薬等の架橋物質を使用できる。更に、ポリペプチドは、例えば、Ｃ αおよびＮα−メチルアミノ酸の組込み、アミノ酸のＣαおよびＣβ原子間の二 重結合の導入、ＮおよびＣ末端間、２個の側鎖間または側鎖とＮまたはＣ末端間 にアミド結合を形成する等の共有結合を導入することによる、環状ポリペプチド または類似体の形成によって立体配座の抑制が行える。

従って、本発明は、ＰＴＫ状分子の領域に対応するペプチドまたはポリペプチド およびアミノ酸および／またはその化学類似体に及ぶ。ＰＴＫ状分子はＪＡＫ活 性を保持することが望ましい。しかし、触媒ドメインで突然変異体を持ってそれ らを不活性にする分子は、活性の滴本発明のＰ　Ｔ　Ｋ状分子の分子量は、１０ ０，０００から２００，０００ダルトン、好ましくは１２０．０００から１５０ ．０００ダルトンの範囲にある。

非常に好適な実施例では、本発明はＪＡＫＩとＪＡＫ２を提供する。ＪＡＫ　ｌ は、分子量が約１３２．０００ダルトンで、図２に示されたヌクレオチド配列を 持った約１１４２のアミノ酸分子である。ＪＡＫ２は、分子量が約１３０，００ ０ダルトンで、図８に示されたヌクレオチド配列を持った約１１００のアミノ酸 分子である。

本発明は、本書記載したＰＴＫ状分子をコード化するＤＮＡ、ｃＤＮＡおよびｍ ＲＮＡを含む遺伝子配列にも関連する。そのような遺伝子配列は、自然に存在す る配列に対する単一または多重ヌクレオチド置換、欠失および／または付加を持 つポリペプチドを含み、ＰＴＫ状分子の誘導体、機能的類似体および同族体をコ ード化する配列に及ぶ。また、本発明は、これらの遺伝子配列を、ベクターおよ び発現ベクター系で、生体外で、あるいはそのようなベクターまたは遺伝子配列 で変換された生体系（つまり、真核または原核細胞）において提供する。

非常に好適な実施例で、本発明は、図２および８に夫々示されたＪＡＫＩおよび ＪＡＫ２をコード化するｃＤＮＡを提供する。オリゴヌクレオチド突然変異誘発 および化学突然変異誘発等の標準技術を使用して得られるある範囲の突然変異体 、そのような突然変異体と誘導体はすべて本発明に包含される。

本発明はＰＴＫ状分子に対する抗体も提供する。そのような抗体は、モノクロー ナルでもポリクローナルでもよい。

本発明のＰＴＫ状分子は、タンパク質のリン酸化、標識の組込み、ＪＡＫの類似 体、拮抗体およびアゴニストの設計など種々の用途を持つ。

従って、本発明の別の側面では、タンパク質のリン酸化方法を意図し、それは、 前記タンパク質をリン酸化に必要な量のＰ　Ｔ　Ｋ状分子と接触させ、前記最初 のタンノくり質がリン酸化されるに十分な時間と条件下で、前記分子か、多重タ ンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つか、ＳＨ２ドメインを持たないポリペプ チドからなる。ポリペプチドが２個のタンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持ち 、特にＪＡＫ　１および／またはＪＡＫ２および／またはその誘導体であること か望ましい。

以下の非限定的な図と例を参照して、本発明をさらに説明する。

図中、 図１は、マウスとヒトのＪＡＫｌのノーザン分析の写真である。

Ａ、ポリ（Ａ）＋マウスの組織からのｍＲＮＡの２μｇアリコート：レーン１、 肺；レーン２、肝臓；レーン３、腎臓、レーン４、腸：レーン５、脳；レーン６ 、骨格筋；レーン７、牌臓；レーン８、唾液腺；レーン９、胎盤；レーンＩＯ１ 乳腺、が１．０％アガロース／ホルムアルデヒド（モーラン他（Ｍｏｒａｎ　ｅ ｔ　ａｌ）、１９８８）ゲルで分画され、ＲＮＡがシーンスクリーン（Ｇｅｎｅ ｓｃｒｅｅｎ）プラス（デュポン（Ｄｕｐｏｎｔ）　）膜へ移された。移された ＲＮＡは１．８ｋｂの３２ｐ標識のマウスＪＡＫ１プローブでハイブリッド形成 され、フィルタが２個の強調スクリーンを使用して一７０°Ｃで１６時間オート ラジオグラフされた。２８ＳｒＲＮＡ（上の矢印）と１８ＳｒＲＮＡ（下の矢印 ）の相対移動性か示されている。

Ｂ、　ポリ（Ａ）＋ヒトの造血細胞系からのｍＲＮＡの２μｇアリコート：レー ンｌ５ＨＬ６０（骨髄単球）；レーン２、Ｕ９３７（単球）；レーン３、ＬＫ６ ３（ブレＢ）：レーン４、ＲＡＪＩ（Ｂ細胞）；レーン５、ＣＥＭ（Ｔ細胞）； レーン６、Ｋ５６２（赤血球性白血病）、か１．０％アガロース／ホルムアルデ ヒド（モーラン他（Ｍｏｒａｎ　ｅｔ　ａｌ）、１９８８）ゲルで分画され、Ｒ ＮＡがシーンスクリーン（Ｇｅｎｅｓｃｒｅｅｎ）プラス（デュポン（Ｄｕｐｏ ｎｔ）　）膜へ移された。移されたＲＮＡは全長の２２ｐ標識のヒトＪＡＫＩプ ローブでハイブリッド形成され、フィルタが２個の強調スクリーンを使用して一 ７０°Ｃで１６時間オートラジオグラフされた。２８ＳｒＲＮＡ（上の矢印）と １８ＳｒＲＮＡ（下の矢印）の相対移動性が示されている。

図２は、ヒトＪＡＫＩのヌクレオチド配列と予測されるアミノ酸配列を示す表で ある。ＤＮＡ配列は最大のクローン（ｐＨＪ７．３）の最初のヌクレオチドから 配列の各行の終わりに番号かつけてあり、アミノ酸配列（１文字コードで）は推 定ＡＵＧから番号かつけてあり、関連付の上に記されている。２個のキナーゼ触 媒ドメインが矢印のついた枠に囲まれ、キナーゼ共通モチーフかハンクス他（Ｈ ａｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８８）の命名法に従って列挙されている。接尾 語ａ（例えばＩＩａ）は、同じ命名法に従って番号が付された最初のキナーゼ関 連ドメイン（図３ａの指定ドメイン１）に存在するキナーゼ関連モチーフを示す 。いくつかの他のタンパク質チロシンキナーゼの自己リン酸化部位に類似の位置 におけるチロシン残基は、逆三角で示されている。（配列Ｉｄ、ｌ）図３は以下 を示す図である。

パネルＡ、ＪＡＫＩの２つのキナーゼ関連ドメインのアミノ酸配列の比較。ＪＡ Ｋｌの２つのキナーゼ関連ドメイン（ドメインｌアミノ酸５７６−８２５；ドメ イン２（ＰＴＫドメイン）アミノ酸８６８−１１３０）のアミノ酸配列（１文字 のアミノ酸コードで表現されている）と、ヒトのトレオニン／セリン特異性キナ ーゼＣＤＣ２（２４）（アミノ酸９−２７２）とが、同定を最大にするため同列 に配されている。キナーゼ関連ドメインは３つのセグメントに分割され、各セグ メントを分離するアミノ酸残基の数が各行の終わりに示されている。これらのド メインの少なくとも２つに共通のモチーフは、太字かつ枠で示されている。整列 の上に記されたローマ数字は、ハンクス他０（ａｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ）　（１９ ８８）によって考案された保存ドメイン命名法に対応する。

パネルＢ、ヒトＪＡＫ１タンパク質の水治療図。ヒトＪＡＫＩのタンパク質配列 （最も可能性のある開始コドンに先行する１０個の余分のアミノ酸を含む）か、 ２５のアミノ酸の全長を使用したカイト・アンド・トウーリトル（にｙｔｅ　ａ ｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）　（１９８２）の親水性アルゴリズムで分析された 。２つのキナーゼ関連ドメインの相対位置か、ドメイン−１およびＰＴＫとして 記されている。アミノ酸３２３および３５０の間に非常に親水性の領域があり、 疎水性の質膜ドメインが無いことが明白である。

図４はＪＡＫ１タンパク質の分析を示す。

パネルＡ、　マウスの乳腺繊維芽細胞系の細胞タンパク質（Ｉ７）が３５３−メ チオニンで標識され（パネルＡ）、前免疫（Ｐ　Ｉ）または免疫（Ｉ）アンチＪ ＡＫラビット抗血清（ｐＧＥＸ／ＪＡＫ１／１融合タンパク質またはＣ末端ペプ チドに対してラビットＭ８で培養された［Ｍ３］）で免疫沈降され、９．５％５ ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）、１９７９）で分画された。

両方のラビット抗血清が、見かけ上の分子量１３９．０ＯＯＤの、２ＳＳ標識の タンパク質を特異的に免疫沈降した。

パネルＢ、　ＪＡＫＩバクテリア融合タ融合タンパクロンンキナーゼ活性の実証 。ＪＡＫ１融合タンパク質は、ｐＧＥＸ２　（スミス・アンド・ジョンソン（Ｓ ｍｉｔｈ　ａｎｄ、Ｊｏｈｎｓｏｎ）、１９８８）を使用して生成した。ドメイ ン１の全域が構築ｐＧＥＸ／ＪＡＫ１／１に含まれた。融合タンパク質のＰＴＫ ドメイン部分は、ＡＴＰ結合部位のＧＸＧＸＸＧモチーフの最初のグリシンコド ンのＢＡｍＨＩ部位１５ヌクレオチド５′　まで延びた。空ベクター制御も行わ れた。スミス・アンド・ジョンソン（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ）　 （１９８８）に記載されたように、１ｍＭのＩ　ＰＴＧを加えることによってバ クテリアが誘発され、２つの１ｍｌアリコートのバクテリアが誘発後６０分と１ ２０分に取り出され、ＳＤＳサンプル緩衝液で溶解された。抗ホスホチロシンの 抗血清（ＰＹ−２０［ＩＣＮ］）を使用して、サンプルのウェスタン分析が行わ れた。先頭は、各誘発でのＧＥＸ−ＪＡＫ融合タンパク質の位置を示す。

パネルＣ，ＧＥＸ−ＪＡＫ融合タンパク質の構成。

ＪＡＫＩの２つのキナーゼ関連ドメインの場所か示され、下にグルタチオンｓ− トランスフェラーゼ遺伝子を持つ融合タンパク質の構造が示されている。

図５は、ＪＡＫｌおよびＪＡＫ２のキナーゼ関連ドメインの配列比較を示す。配 列分析プログラムのスターブ：／ＶＡＸをベースにした（Ｓｔａｄｅｎ　ＶＡＸ −ｂａｓｅｄ）組の整列プログラムを適用して、マウスのＪＡＫ２の推論アミノ 酸配列かヒトのＪＡＫ１アミノ酸配列と比較された。星印（＊）は同定を示し、 ドルマーク（＄）は同類置換を示す。配列は、ＪＡＫＩ配列に対して番号が付け である。

ドメイン１とＰＴＫ度メインの範囲は、アミノ酸配列の上の矢印で示しである。

図６は、ＪＡＫＩの２つのキナーゼ状ドメインの系統発生分析のグラフである。

例１に記載された系統発生ツリーを生成するために、フェンダ・アンド・トリト ル（Ｆｅｎｇ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）　（１９８７）およびハンクス他 （Ｈａｎｋｓ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８８）によって実施されたツイツチ・アン ド−ｖ−ゴリアシ（Ｆｉｔｃｈ　ａｎｄ　Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈ）（１９６７） のツリー構築案を使用した。各ケースで、比較に触媒ドメインのみを使用した。

ＪＡＫＩタンパク質の２つのキナーゼ関連ドメインを独立して比較した。

技の順序は構造的類似性の関数で、枝長さは配列同定の関数である。使用された 省略文字は、５ＲＣ＝ｃ−ｓ　ｒ　ｃ　；ＹＥＳ＝ｃ−Ｙｅｓ　；ＦＥＳ＝ｃ− ｆｅｓ　；Ｃ３ＦＩ　−Ｒ＝コロニー刺激因子−ルセプター；ＫＩＴ＝ｃ−ｋｉ ｔ　；ＰＤＧＦ−Ｒ＝血小板由来増殖因子レセプター−Ａ；ＲＥＴ＝ｃ−ＲＥＴ ；ＡＮＰ−Ａ＝心房性利尿ペプチドレセプター−Ａ、ＡＮＰ−Ｂ＝心房性利尿ペ プチドルセプター−Ｂ　：ＭＯ３＝ｃ−ｍｏｓ　；　ＰＢＳ２＝ポリキシンＢ抗 生物質抵抗遺伝子生成物；５ＴＥ７＝無菌突然変異体野生型対立遺伝子生成物、 ＪＡＫ１／１＝ヒトＪＡＫｌのドメイン１　；　ＪＡＫ１／２＝ヒトＪＡＫ　１ のＰＴＫドメイン。

図７は、ＰＴＫのＪＡＫ科の構成種の情報伝達における役割の典型を示す略図で ある。情報伝達におけるＰＴＫの役割の現在の概念の補性に基づいて、２つの考 え得る筋書きを考察する。パネルＡで、ＪＡＫタンパク質のＮ末端ドメインが特 定の代謝合図を感知し、このインプットを２つの別個のアウトプットに変換する 作用を持つ。

多分、第２のＰＴＫ関連ドメインのアウトプットはチロシンキナーゼ活性で、ド メインｌの活性は不明である。

パネルＢでは、別の筋書きが考えられる。この場合、ドメインｌの機能はＰＴＫ ドメインの調節である。この筋書きでＪＡＫタンパク質の唯一のアウトプットは ＰＴＫ活性である。

図８は、マウスのＪＡＫ２のヌクレオチド配列と予測されるアミノ酸配列を示す 表である。ヌクレオチド配列は、最大のクローン５°の最初のヌクレオチドから 配列の各行の終わりに番号がつけである。予測されるアミノ酸配列は、１文字コ ードで配列の各行の終わりに番号がつけである。２個の推定上のキナーゼドメイ ンか矢印のついた枠に囲まれ、キナーゼ共通モチーフかハンクス他（Ｈａｎｋｓ 　ｅｔ　ａｌ）　（１９８８）の命名法に従って列挙されている。添え字ａは、 同じ命名法に従って番号か付された最初のキナーゼ関連ドメインに存在するキナ ーゼ関連モチーフを示す。（配列Ｉｄ、２） 図９は、マウスの組織のＪＡＫ２の発現を示す写真である。図の上部に示された 各組織から、そして種々のマウス（３０Ｆ：乳腺繊維芽細胞；３１Ａ：乳腺上皮 細胞；３０　ｌ：造血細胞系ＦＤＣ，ＰＩの因子独立下位系：ＮＩＨ：繊維芽細 胞）とヒト（Ｋ５６２：慢性顆粒球性白血病細胞）の細胞系からの５μｇのｍＲ ＮＡのノーザンプロット分析。プロットは３２Ｐ標識の２．２ｋｂのＪＡＫ２プ ローブでハイブリッド形成されていて、オートラジオグラフィは４日間であった 。２８Ｓおよび１８ＳｒＲＮＡの相対移動性が示されている。

図１Ｏは、ＪＡＫＩとＴＹＫ２アミノ酸配列の比較を示すグラフである。プログ ラムＳＥＱＭＡＴＣＨのＨＯＭＯＬＯＧＹオプションを使用し、２１のアミノ酸 のウィンドウ長さを使用して、ＪＡＫＩ（ウィルラス他（Ｗｉｌｋｓｅｔ　ａｔ ）、１９９１）とＴＹＫ２（フィルムバッハ−クラフト他（Ｆｉｒｍｂａｃｈ− Ｋｒａｆｔ　ｅｔ　ａｌ）、１９９０）のアミノ酸配列が比較された。グラフの 縦軸は２つの配列間のパーセンテージ同一性を表し、横軸は特定レベルの同一性 が計算されたＪＡＫｌにおけるアミノ酸の位置を表す。

グラフの下の陰をつけた枠は、本文中で記載され、図１１で更に示された、任意 に定めたＪＡＫ同族ドメインを表している。

図１１は、ＰＴＫＯＪＡＫ科の構成種のアミノ酸配列比較を示す。ＪＡＫＩ（ウ ィルラス他（Ｗｉｌｋｓ　ｅｔ　ａｌ）、１９９１）（この図ではＪｌと記され ている）、ＪＡＫ２（この図ではＪ２）およびＴＹＫ２　（フィルムバッハ−ク ラフト他（Ｆｉｒｍｂａｃｈ−Ｋｒａｆｔ　ｅｔ　ａｌ）、１９９０）（この図 ではＴ２）のアミノ酸配列がＣＬＵＳＴＡＬプログラム（ヒギンズ・アンド・シ ャープ（Ｈｉｇｇｉｎｓ　ａｎｄ　５ｈａｒｐ）、１９８８）を使用して整列さ れた。番号付けはＪＡＫＩの最初のアミノ酸に対するだけで、この配列に挿入さ れるギャップを考慮してなく、従って、位置の相対的な単位としてのみ有用であ る。各ＪＡＫ同族ドメインの範囲は、図１Ｏの同族プロットと関連させて定めた 。提示された３つの配列のうち少な（とも２つに保存されたアミノ酸位置は、太 字で、共通配列としてＴＹＫ２配列の下に示されている。

図１２は、ＪＨ３／ＪＨ４ドメイン領域（７）ＳＨ２ドメインとの比較を示す。

ＧＡＰの２つのドメイン（ＧＡＰ−Ｎと呼ばれる更なるＮ末端ドメイン（残基１ ７８−２６９）、更なるＣ末端ＧＡＰ−ＣＣ残基３４８−４３８）（トラヘイ他 （Ｔｒａｈｅｙ　ｅｔ　ａｌ）、１９８８）とｖ−ｃｒｋのＳＨ２ドメイン（残 基２４８−３５４）（メイヤ他（Ｍａｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、１９８８）が、Ｊ ＡＫＩのＪＨ３／ＪＨ４（残基４２５−５３６）（ウィルラス他（Ｗｉｌｋｓｅ ｔ　ａｌ）、１９９１）、ＪＡＫ２　（残基２５２−３５９）（この原稿）およ びＴＹＫ２（残基４４９−５５５）（フィルムバッハ−クラフト他（Ｆｉｒｍｂ ａｃｈ−Ｋｒａｆｔ　ｅｔ　ａｌ）、１９９０）と比較された。２種の配列間で 共通のアミノ酸は、２セツトの配列間の縦の線で示されている。同種のドメイン の構成種に共通に保存された残基は、太字で記されている。

例１ 材料と方法 （Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）、（１９８２）に概説されたプロトコールに 従ってふるい分けられた。マウスＮＦＳ　ＴＰＡ活性牌臓（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　 ｃａｔ、＃ＭＬ１０１８）　、マウススイス白子３Ｔ３繊維芽細胞（Ｃ１ｏｎｔ ｅｃｈ　ｃａｔ、＃ＭＬ１０２３ｂ）　、マウスｂａｌｂ／ｃ骨髄（Ｃ１ｏｎｔ ｅｃｈ　ｃａｔ、＃ＭＬ１００？）　、マウススイスウェブスター全脳（Ｃ１ｏ ｎｔｅｃｈ　ｃａｔ、＃ＭＬｌｏ０２）　、？ウスＩＣＲリノール酸活性肋膜マ クロファージ（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈｃａｔ、＃ＭＬｌｏ０５ｂ）　、そしてヒト第 １三ケ月胎肝（Ｃ１ｏｎｔｅｃｈｃａｔ、　＃ＨＬ１００５ｂ）由来のｃＤＮＡ ライブラリが、すべてλｇｔｌｌで生成された。マウスＢａ１ｂ／ｃこう丸（Ｃ １ｏｎｔｅｃｈ　ｃａｔ、＃ＭＬ１０２０ｂ）　、マウスのｌＯ日目脂児神経上 皮（リード他（Ｒｅｉｄ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９９０　）およびヒト包皮繊維芽 細胞系ＡＧ１５１８（クリーソンーウエルシ他（Ｃ１ａｅｓｓｏｎ−Ｗｅｌｓｈ 　ｅｔ　ａｔ）　１９８９　）由来のｃ　ＤＮＡライブラリが、λｇｔｌＯで生 成された。これらライブラリ夫々の約１０６の組換え体が、その都度ふるい分け られた。

ライブラリのスクリーニングは次のように行われた。

ＦＤ２２　（ＪＡＫＩ）ＰＣＲクローンが、ニックトランスレーション（マニア ティス他（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ）　１９８２）によって標識され、マ ウスのライブラリのふるい分けに使用された。他の３つのポジティブのうち、１ ．８ｋｂのマウスｃＤＮＡクローンが神経上皮および骨髄ｃ　ＤＮＡライブラリ から分離された。マウスｃＤＮＡをプローブとして使用して、２つの全長ヒトＪ ＡＫＩｃＤＮＡクローンが非増幅ヒト包皮繊維芽細胞系Ａ０１５１８がら分離さ れた。ハイブリッド形成は、６ｘＳＳＣで６５０Ｃ；Ｉ％ＳＤＳ；０．５％Ｂｌ ｏｔｔｏ：　２００　μｇ／ｍ　１音波処理および変性されたニシン精子ＤＮＡ で行われた。ハイブリッド形成後、最終洗浄の緊縮は６５０Ｃで０．２ｘＳＳＣ ：０．１％であった。コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムを使用して、フィルター を一部オートラジオグラフィで撮影した。

ＪＡＫ２については、ＦＤ１７　（ＪＡＫ２）ＰＣＲクローンで先ずマウスマク ロファージをふるい分けし、５つのポジティブを得て、最長のｃＤＮＡクローン の一部を分離し、残りのｃＤＮＡライブラリのふるい分けに使用した。ハイブリ ッド形成条件は、上記のＪＡＫ　ｌと同様にした。

ＤＮＡ配列決定 ＪＡＫｌおよびＪＡＫ２のｃＤＮＡクローンの配列決定に、２つの方策が採用さ れた。ヒトＪＡＫ１配列の場合、最大ＥｃｏＲＩフラグメントのネストされた欠 失の生成にイレースアベース（Ｅｒａｓｅ−ａ−Ｂａｓｅ）キット（ＰＲＯＭＥ ＧＡ）が採用された。すべてのマウスＪＡＫ２配列データと残りのヒトＪＡＫｌ 配列は、前に決定されたＤＮＡ配列に基づいてオリゴヌクレオチドプライマーを 使用して決定した。夫々の場合、ジデオキシヌクレオチド鎖終結法（サンジャー 他（Ｓａｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｌ）１９７７）を使用して配列情報を生成した。す べての配列情報が両鏡で決定された。

ノーザン分析 ポリＡ＋ｍＲＮＡサンプルが、別のところ（ウィルラスーアンド・カーパン（Ｗ ｉｌｋｓ　ａｎｄ　Ｋｕｒｂａｎ）、１９８８）て記載されたように調製された 。アリコート（１μｇ）が、２．２Ｍホルムアルデヒド；２０ｍＭ　ＭＯＰＳ、 ｐＨ６，８；１ｍＭ　ＥＤＴＡ；５ｍＭ酢酸ナトリウムを含む１％アガロースゲ ルでの電気泳動で分析され、ハィポンド（Ｈｙｂｏｎｄ）　（アマ−ジャム（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ）　、ｃａｔ＃ＲＰＮ３０３Ｎ）またはニトロセルロース（シュ ライヒヤー・アンド・シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　＆　５ｃｈｕｅｌｌ） 　、ＢＡ８５．　ｃａｔ＃４０１１９６）膜へ移された。フィルタは、３ｘＳＳ Ｃ；　５ｘデンハード溶液；１０ｍＭのＨＥＰＥＳ　ｐＨ７，ｏ；１００μｇ、 ｍｌ　１　；ポリＣ；１００μｇ／ｍｌの変性ニシン精子ＤＮＡ；１０ｐｇ／ｍ ｌのＥ、ｃｏｌｉＤＮＡ；０．１％ＳＤＳを含む５０％ホルムアミドで４時間、 前ハイブリッド形成処理され、同じ溶液中で、ニックトランスレートされた３２ Ｐ−標識のマウスまたはヒトＪＡＫＩまたはＪＡＫ２挿入断片で、４２°Ｃで１ ８時間ハイブリッド形成された。コダックＸＡＲ−５Ｘ線フィルムでの露光の前 に、フィルタは２つの強調スクリーンで、６５°Ｃで０．２ｘＳＳＣ；０．５％ ＳＤＳの最終緊縮で洗浄された。

抗体試薬とタンパク質分析 ポリクローナルラビット抗血清Ｍ７およびＭ８が、アフィニティ純化されたｐＧ ｅｘ／ＪＡＫＩ／ｌバクテリア融合タンパク質（キナーゼ定量の項参照）に対し て培養された。ＪＡＫｌのＣ末端ペプチド（−ＴＳＦＱＮＬＩＥＣＦＥＡＬＬＫ Ｃ−）に対するポリクローナル抗体Ｍ３およびＭ４か、ラビットで培養された。

ペプチドが、０．０５％グルタルアルデヒドを持ったキーホールリンペットヘア モジアニン（Ｋｅｙｈｏｌｄｅ　Ｌｉｍｐｅｔ　Ｈｅａｍｏｃｙａｎｉｎ）に結 合され、フロイント完全アジュバントで乳化され、いくつかの部位に皮肉注射さ れた。動物は、４および７週間後にフロイント不完全アジュバントで乳化された 結合ペプチドでブーストされ、最後の注射後１０日目に採血された。

細胞は、夫々１００μＣ１／ｍ１および１ｍｃｉ／ｍｌの同位体を含む無メチオ ニンまたはリン酸塩媒体中の２ｊ３−メチオニンまたは２２ｐ−正リン酸塩で代 謝標識された。

ＲＩＰＡ緩衝液（１％トリトンＸ１００．１％Ｎａデオキシコレート、０．１％ ＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ。

１ｍＭのＰＭＳＦを含む２０ｍＭのトリス、ｐＨ７，５）の抽出物が、黄色ブド ウ球菌を持つタンパク質Ａを使用して、抗血清と免疫複合体を分離して、氷の上 で培養された。タンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ） 、１９７０）で分解され、放射能標識されたバンドがＸ線フィルム（コダックＸ ＡＲ−５）の露光で検出された。

３２Ｐ−標識された細胞のＲＩＰＡ緩衝液は、更に、ホスファターゼ阻害剤とし て２０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＮａＦ、１００μＭのオロソバナデートを含 んでいた。

切除された３２Ｐ−標識バンドのホスホアミノ酸分析は、ハンター−アンド・セ フトン（Ｈｕｎｔｅｒ　ａｎｄ　５ｅｆｔｏｎ）（１９８０）に記載された通り に行われた。ウェスタンプロット分析は、検出系としてアルカリ性ホスファター ゼまたは１２５■標識タンパク質Ａを使用して、トウピン他（Ｔｏｗｂｉｎ　ｅ ｔ　ａｔ）　（１９７９）に記載され、ツイーミーキ他（Ｚｉｅｍｉｅｃｋｉ　 ｅｔ　ａｌ）　（１９９０）で改変されたように行われた。

タンパク質キナーゼ定量 ＪＡＫ１タンパク質のＰＴＫ活性を明らかにするために、種々のプロトコールが 試された。先ず、ライヒマン他（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ　ｅｔ　ａｔ）　（１９８ ９）のマウス乳腺繊維芽細胞の抽出が、トリトンＸ１００またはノニデ・ノド（ Ｎｏ旧ｄｅｔ）　Ｐ　４０　（１，０％）のみ、またはそれに加えてデオキシコ レートナトリウム（０，５％または１．０％）を含むいくつかの緩衝液、または ＲＩＰＡ緩衝液（１，０％トリトンＸ１００．１．０％デオキシコレートナトリ ウム、Ｏ，１％硫酸ドデシルナトリウムを含む）で行われた。２０ｍＭのＥＤＴ Ａ、１０ｍＭのＮａＦ、１００．ｃｚＭのＮａ　２ＶＯ４等のホスファターゼ阻 害剤の存在または不在のもとに細胞が抽出された。

免疫沈降後、ある範囲のＡＴＰ濃度（ｌＯＯｎＭ−１０ｍＭ）または無担体７− ３２−ＡＴＰ（アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　、ｃａｔ　＃１０１６９） で、二価陽イオンとして１０ｍＭのＭ　１　＋＋、Ｍｇ十＋またはＺｎ＋十を持 った２０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４または５０ｍＭＭのＨＥＰＥＳ。

ｐＨ７，４でキナーゼ定量が行われた。培養が、氷の上（１５分）、２５°Ｃ（ １５分）、３０°Ｃ（１５分）または３７°Ｃ（２分）で、ホスファターゼ阻害 剤Ｎａ　２ＶＯ４の存在または不在のもとに行われた。

図４に示されたＪＡＫＩ／グルタチオントランスフェラーゼ融合タンパク質を生 成するために、ドメインｌ（図２のヌクレオチド１７７０−２６７２由来）とＰ ＴＫドメイン（図２のヌクレオチド２６７２端由来、従ってＡＴＰ結合グリシン モチーフの外に５つの余分なアミノ酸を含む）を夫々ｐＧＥＸ２のＢａｍＨ１部 位に融合させた。融合タンパク質は、他所（スミス・アンド・ジョンソン（Ｓｍ ｉｔｈ　ａｎｄ　、Ｊｏｈｎｓｏｎ）、１９８３）に記載されたように１ｍＭの ＩＰＴＧを添加によって誘導され、つニスタンプロット分析はＭ３抗ＪＡＫ１血 清およびアンチホスホトリシン抗血清（カンブス・アンド・セフトン（にａｍｐ ｓ　ａｎｄ　５ｅｆｔｏｎ）、１９８　Ｂ）で誘導経過時に行われた。アンチホ スホトリシン抗血清のい（つかのソースが試された。図４ｂのデータは、市販の モノクローナル抗体調製品ＰＹ−２０（ＩＣＮ）を使用して得られた。

対照実験で、無挿入断片ｐＧＥＸまたはｐＧＥＸ／ＪＡＫＩ融合タンパク質の誘 導は、バクテリア基質の検出可能なチロシンのリン酸化を生じず、アンチホスホ トリシン抗血清の反応性はフェニルリン酸塩の添加で完全になくせた。

コンピュータ援用配列分析 ＶＡＸ　ＶＭＳ５．２でスターデンをベースにした（Ｓｔａｄｅｎ−ｂａｓｅｄ ）　ｍから得た整列プログラムを使用して、アミノ酸配列比較が行われた。フェ ンダ・アンド・トリトル（Ｆｅｎｇ　ａｎｄ　Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ）　（１９８ ７）によって実施されたツイツチ・アンド・マーゴリアシ（Ｆｉｔｃｈ　ａｎｄ Ｍａｒｇｏｌｉａｓｈ）　（１９６７）のツリー構築案を使用して、ＪＡＫＩの ２つのキナーゼ状ドメインの系統発生分析が行われた。ＢＯＲＤおよびＢＬＥＮ プログラムを使用してツリーが考案された差マトリックスをつくるために使用さ れた５ＣＯＲＥプログラムは、サンディアゴのカリフォルニア大学（Ｕｎｉｖｅ ｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　−Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ）のＲ・トリ トル博士（Ｄｒ　ＲＤｏｏｌｉｔｔｌｅ）にすべて負うものである。

図１１に示された配列整列は、ＶＡＸ　ＶＭＳ５．２マイクロコンピユータでＣ ＬＵＳＴＲＡＬプログラム（ヒギンズ・アンド・シャープ（Ｈｉｇｇｉｎｓ　ａ ｎｄ　５ｈａｒｐ）、１９８８）を使用して集められた。図１０に示された同族 プロットは、プログラムＳＥＱＭΔＴＣＨのＨＯＭＯＬＯＧＹオプションを使用 して集められた。各ＪＡＫ同族ドメインのデータベース検索は、ＦＡＳＴＡプロ グラムを使用し、ピアソン／リップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ／Ｌｉｐｐｍａｎ）ア ルゴリズム（ピアソン・アンド・リップマン（Ｐｅａｒｓｏｎａｎｄ　Ｌｉｐｐ ｍａｎ）、Ｉ　９８８）に基づいて改良された。

ＲＡＣＥ／アンカーＰＣＲ ＲＡＣＥ／アンカーＰＣＲ（フローマン他（Ｆｒｏｈｍａｎｅｔａｌ）１９９０ ：ｏ−他（Ｌｏｈ　ｅｔ　ａｌ）　１９９０）は、オリジナルのプロトコールを 改変して行われた。簡単に記すと、アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）　ｃＤＮ Ａ合成キット（ｃａｔ　Ｎｏ、　ＲＰＮ１２５６）と４０ｎｇのＪＡＫ２特異性 オリゴヌクレオチドプライマー（５°−ＴＡＣＡＣＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＴＴＴ ＴＧＴ−３’　）を使用して、２μｇのポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡがｃＤＮＡに変換 される。逆転写酵素を加える前に、反応混合物は６５°Ｃに加熱された。

２０ユニツトの逆転写酵素を加えることによりｃＤＮＡ合成か開始され、反応物 は５５°Ｃて７５分間培養された。

スパンセファデックスコラム（マニアティス他（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ） 、１９８２）を通し、その後エタノール沈降を行うことによって、新たに合成さ れたｃＤＮＡか得られた。１４０ｍＭのカコジレートカリウム、３０ｍＭのトリ ス（ｐｈ７．２）、１ｍＭのＣｏＣｌ２．０．１ｍＭのＤＴＴ、６ｍＭのｄＧＴ Ｐそして１５ＬニツトのＴｄＴ（ＩＢＩ）を含む３０μｍ中で、３７°Ｃで１０ 分間、ｍＲＮＡ／ｃＤＮＡヘテロ二本鎖かＧテールされた。

６５°Ｃに１５分間加熱して反応を終らせ、１０ｍＭのトリスＨＣＩ　（ｐＨ７ ，５）で５００μｌに希釈した。

ＲＡＣＥ／アンカーＰＣＲについては、ｌＯμｌのテールされたｃＤＮＡか１０ ０．ｃｚｌのＰＣＲ緩衝液（５０ｍＭのＫＣＩ、ｌ０ｍＭのトリスＨＣＩ　［ｐ Ｈ８，３］、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２．０．０１％セラチン、２００μＭの各ｄ ＮＴＰ）に再構成され、これに５０ｎｇの”ポリ−Ｃ“オリゴヌクレオチドプラ イマー（５’　−ＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣ１４−３”）と２．５ユ ニツトのＴＡＯポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ）が加えられた。ｃ　ＤＮＡの相補鎖 が９５°Ｃ（５分間）、５２°ｃ（５分間）そして６８°Ｃ（４０分間）の１サ イクルで合成され、５００ｎｇ（７）ｒＲＡＣＥ／７：／カー」プライ７−　（ ５’　−ＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＧＡＡＴＴＣ−３”）とネストされたＪＡＫ２ 特異性プライマー　（５’　−ＣＴＴＧＣＴＴＡＡＴＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡ−３ ’　）が加えられ、反応物が９５°Ｃ（１分間）、５２℃（２分間）そして６８ ℃（５分間）の３０サイクルにかけられた。ＰＣＲ生成物はフェノール／クロロ ホルム抽出され、沈降され、１００μｌの水中に再懸濁された。そして、増幅さ れた材料がキナーゼされ、低溶解温アガローゼゲル上でサイズ分画され、Ｓｍａ ｌ切断Ｍ１３ｍｐ８にクローン化された。プラークがＪＡＫ２ｃＤＮＡとハイブ リッド形成されることでふるい分けられ、ポジティブか配列された。

例２ ＪＡＫＩをコード化するｃＤＮＡの分離とＤＮＡ配列決定 ＪＡＫＩのｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用してクローン化された。ノーザン分析（図 １ａおよびｂ）は、マウスとヒトの組織と細胞系の両方で、ＦＤ２２　（ＪＡＫ Ｉ）が単一の広く発現した５、４ｋｂのｍＲＮＡにコード化されることを示した 。ＦＤ２２　（ＪＡＫＩ）のヒトｃＤＮＡクローンは、ヒト包皮繊維芽細胞系（ ＡＧ１５１８）ｃＤＮＡライブラリ（クリーソンーウエルシ他（Ｃ１ａｅｓｓｏ ｎ−Ｗｅｌｓｈ　ｅｔ　ａｌ　）　ｌ　９８９）から分離された。クローン化さ れた８つの一次分離物のうち２つが、全長ｃＤＮＡ（−５，３ｋｂ）の候補であ る挿入断片を含んでいた。

ヒトＪＡＫＩのヌクレオチド配列が図２に示されている。クローンの５′端は、 推定上の開始ＡＴＧの前の３つのすへての読み枠に停止コドンを持っている。最 長のオープンリーディングフレームを持った枠内の２つのＡＴＧ開始コドンか、 図２に示されたヌクレオチド配列の位置４０および７６にあった。これらの最初 のものは特に劣った「コサン」共通配列（コサン（Ｋｏｚａｋ）、１９８４）（ −ＴＡＡＡＴＧＣＡＧ−）に埋もれているか、第２のものはコサン（Ｋｏｚａｋ ）に定義された最適の共通配列、つまり−ＧＣＣＡＴＧＧＣＴ−１と強くマツチ する。第１のものは、開始コドンに先行する配列の最強の相互関係の一つから外 れる、つまりＡＴＧ配列からヌクレオチド３つ前にＴ残基（Ａ残基でなく）が存 在するので、第２のＡＴＧがこのタンパク質の開始コドンと考えられる。３′端 で、位置３５０２の枠内停止コドンタンパク質のＣ末端を形成する。ポリアデニ ル化情報を含む大きい（１，４０５ｋｂ）３’非翻訳領域がｍＲＮＡ配列を完成 する。

３４２６ｂｐのＪＡＫＩコード化領域は、計算上の分子質量１３２．０００ダル トンを持つ１１４２アミノ酸のタンパク質をコード化する。ＰＴＫ触媒ドメイン はＪＡＫＩタンパク質のＣ末端帯りに位置する（図２）。

このドメインの構造的特徴の記述にあたって、われわれはハンクス他（Ｈａｎｋ ｓ　ｅｔ　ａｌ）　（１９８８）の命名法を採用することにした。モチーフＧＬ Ｙ−Ｘ−ＧＬＹ−Ｘ−Ｘ−ＧＬＹ−（サブドメイン１）で構成され、その後に非 変異りシン残基（サブドメインＩＩ）が続く推定上のＡＴＰ結合部位は、ＪＡＫ Ｉタンパク質のアミノ酸残基８７１および８９６の間に位置する。ＰＴＫ触媒ド メイン（サブドメインＶＩおよびＩＸ）のコアモチーフも適切な位置にあり、そ の−次配列と相互の関係に関して十分に保持されている。ＪＡＫＩタンパク質の 位置１０２２にチロシン残基が、サブドメインＶｌｌのＣ末端に１１の残基が存 在することは（同様な位置にあるチロシンはｖ−ｆｐｓにおけるチロシンの自己 リン酸化部位である；バインマスター他（Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ） 　１９８４　）、ＰＴＫ科の構成種の一貫した性質で、このクラスのキナーゼの 構成員の特徴と考えられる。位置１１２６（ドメインＸＩ）のアルギニン残基は ＰＴＫ触媒ドメインのよく保存された領域の終わりを示し、２５５のアミノ酸の 全触媒ドメインは、他の機能的に定義されたＰＴＫと同一の約２８％（ｃ−ｆｅ ｓについて；ウィルラス・アンド・カーボン（Ｗｉｌｋｓ　ａｎｄ　Ｋｕｒｂｏ ｎ）　１９８８　）　〜３７％（ＴＲＫについて、コズマン他（Ｋｏｚｍａｎ　 ｅｔ　ａｌ）　１９８８　）。

最後に、よく保存されたサブドメインＶＩＩＩのまれな変異型かあり（残基１０ ３２−１０３９）、これは活性部位の近くに位置すると考えられる（ハンクス他 （Ｈａｎｋｓｅｔａｌ）１９８８）。このモチーフに保存されたトリジ１〜フア ンの両側にあるフェニルアラニンとチロシンは、ＪＡＫＩとＪＡＫ２にユニーク なものである。

第２のタンパク質キナーゼ関連ドメイン（ここではドメイン１と呼ぶ）はアミノ 酸５７８と８２４の間に位置し、４７のアミノ酸が推定上のＰＴＫドメインのＮ 末端にある。タンパク質キナーゼのすへての保存された要素は、このドメインに 広く保持されている。図２中、これらの要素は、ハンクス他（Ｈａｎｋｓ　ｅｔ 　ａｌ）　（１９８８）に記載されたタンパク質キナーゼのサブドメインとの類 似性に関連して番号がつけられ（接尾語ａと共に、例Ｉ　Ｉ　１．）、ＪＡＫＩ の２つのキナーゼ関連ドメインのアミノ酸配列は相互に、そして図３ａのヒトＣ ＤＣ２（リー・アンド・ナース（Ｌｅｅ　ａｎｄ　Ｎｕｒｓｅ）　１９８７　） と比較される。ＰＴＫおよびトレオニン／セリンキナーゼ科の両者のキナーゼド メインに対するこのドメインの質キナーゼとして機能することを強く示唆する。

しかし、このドメイン内のキーモチーフの配列に重要な差異があり、このことは ドメイン１がセリン／トレオニンまたはチロシンリン酸化と異なる触媒活性を持 つ可能性を示唆する。例えば、サブドメインＶＩａは他のキナーゼ科の均等モチ ーフに対してよく保存されてなく、ＰＴＫおよびトレオニン／セリンキナーゼ科 の通常非変異である一ＡＳＰ−ＰＨＥ−ＧＬＹ−配列（サブドメインＶＩ１．） はＪＡＫＩ（７）ドメイン１のモチー−７ＡＳＰ−Ｐ−ＲＯ−ＧＬＹ−に置き換 えられる。他所で記載されているように、ＰＴＫおよびトレオニン／セリンキナ ーゼ科のサブドメインＶＩの正確な配列の保存は、キナーゼの基質特異性と相関 するようである。従って、ＪＡＫＩキナーゼのドメインｌがＰＴＫおよびトレオ ニン／セリンキナーゼ科が異なる基質特異性を持ち、ＰＴＫおよびトレオニン／ セリンキナーゼ科が異なる基質特異性を持つ可能性がある。この考えの裏付けと して、ＪＡＫＩのドメインｌにおけるある種のキーモチーフ間の通常一定した間 隔に微妙な差異がある。ＡＴＰ結合の構成要素（サブドメイン■、およびＩｌ、 ）がこのドメイン内で更に離れた７つ程度のアミノ酸で、それらはＰＴＫ科とト レオニン／セリンキナーゼ科の両方である。更に、この領域のサブドメイン■、 およびＩｌ、間の間隔も９つのアミノ酸分より長い。逆に、サブドメインＶＩ１ ．およびＩＸ、間の距離はＰＴＫ触媒ドメインの対応領域より短い。このドメイ ンの全体構造は、ＰＴＫとトレオニン／セリンキナーゼ科の構成種の触媒ドメイ ンと幾分具なると考えられる。

ドメインＩの配列Ｎ末端は、前に述べたタンパク質キナーゼの他のいかなる部分 に対しても同族性を持たない。

つまり、ｃ−ｆｅｓ／ｆｐｓ（サトウスキ他（Ｓａｄｏｗｓｋ　１ｅｔａｌ）１ ９８６）、ＧＡＰ　（トレーヘイ他（Ｔｒａｈｅｙｅｔａｌ）１９８８）および タンパク質のホスホリパーゼＣ科（スー他（Ｓｕｈ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９８８ ）等の細胞質ＰＴＫについて記載されたＳＨ２ドメインに対する同族性は、検出 されなかった。この特徴を持たない他の非レセプターＰＴＫは記載されていない ことから、これは特に興味を引く事項である。ＰＴＫの増殖因子レセプター型に 特異な疎水ドメインの存在を親水性プロットは示さず、これはこのタンパク質か ＰＴＫの非レセプタークラスの他の構成種のようにまったく細胞内的であること を示唆している。ＪＡＫＩの水治療プロットの唯一の特徴は、残基３２０−３５ ０間の非常に親水性の高い配列である。

この配列はマウスＪＡＫ２タンパク質では保存されないが、その顕著な性質はＪ ＡＫ１タンパク質のなんらかの機能と関係する可能性を示唆している。

ＪＡＫ　１タンパク質の発現 ヒトＪＡＫＩタンパク質に対して、いくつかの抗血清か生成された。ヘキサ十量 体−ＴＳＦＱＮＬ　ＩＥＣＦＥＡＬＬＫＣ−（ＪＡＫＩのＣ末端の１５のアミノ 酸）に対するポリクローナル抗血清がラビットで培養され、ＪＡＫＩタンパク質 の性質の検査に使用された。第２のラビット抗血清が、ヒトＪＡＫ１タンパク質 の全ドメインｌ領域を含むｐＧＥＸバクテリア融合タンパク質を使用して生成さ れた（例１参照）。マウスＪＡＫＩのｃＤＮＡクローンの予備配列分析は、この タンパク質のヒトおよびマウス版のＣ末端が同一で、マウスおよびヒトのドメイ ン１領域が非常に高い同一性を発揮することを示した。従って、ＪＡＫ１タンパ ク質の性質の検査に両方の系が取換え可能に使用された。

ウェスタンプロット分析と免疫沈降研究に両方の抗血清が使用され、そのデータ は図１に示されたｍＲＮＡ発現の研究を裏付けている。例えば、抗血清Ｍ３およ びＭ８は共に、２６Ｓ−メチオニン標識されたマウス乳腺繊維芽細胞から同じ見 かけ上の分子量（１３０にダルトン）のタンパク質を免疫沈降させる。同じソー スか・ら、３２Ｐ−正リン酸塩標識されたＪＡＫＩがホスホトレオニンおよびホ スホセリンを含むリンタンパク質として免疫沈降された。生体外で自己リン酸化 を行えることは、タンパク質チロシンキナーゼ科の構成種の特徴である。興味深 いことに、ＰＴＫ科全般に対するＪＡＫｌのＰＴＫ関連配列の高度な配列類似性 にもか拘らず、テストされたいかなるマウスまたはヒトに由来するこのタンパク 質の免疫沈降物にチロシンキナーゼ触媒活性を証明することはできなかった。こ の活性の証明に適した条件をめて広い範囲の可能性かテストされた。これらは例 １に列記されている。活性の欠乏の理由は、酵素の活性部位における抗体の立体 効果にあるのかも知れない。

分離されたドメインｌまたはＰＴＫドメインが触媒活性を持つかどうかを判断す るために、夫々のバクテリア融合タンパク質か日本住血吸虫（スミス・アンド・ ジョンソン（Ｓｍｉｔｈ　ａｎｄ　Ｊｏｈｎｓｏｎ）　１９８８　）のグルタチ オントランスフェラーゼタンパク質で生成され、アンチホスホチロシン抗体（カ ンブス・アンド・セフトン（Ｋａｍｐｓａｎｄ　５ｅｆｔｏｎ）　１９８８　） を使用して、融合タンパク質とチロシンリン酸化タンパク質の協調誘導の証明が 試みられた。このシステムで、バクテリアにチロシンキナーゼ１かないので、ア ンチホスホチロシン抗血清の交差反応バックグラウンドはない（図４ｂ）。従っ て、チロシンに基づくバクテリアタンパク質のリン酸化は、そのような血清で容 易に検出可能である。この一連の実験で、挿入断片を持たないｐＧＥＸもドメイ ンｌを持つｐＧＥＸ（ｐＧＥＸ／ＪＡＫ／Ｉ／ｌ）もチロシンキナーゼ活性を示 さなかった。ｐＧＥＸ／ＪＡＫ／１を還元グルタチオンカラムを使用したアフィ ニティクロマ上グラフィで更に純化したが、外性基質としてヒストン、カゼイン またはエノラーゼを使用してもキナーゼ活性を検出できなかった。ｐＧＥＸ　Ｐ ＴＫ融合タンパク質（ｐＧＥＸ／ＪＡＫ／２）に示される誘導チロシンリン酸化 のパターン（図４ｂ）は、異所発現ＰＴＫ融合タンパク質として珍しく単純であ る。注目すべきことは、融合タンパク質の自己リン酸化自体は起こらないようで あり、このことは、元のままのタンパク質にＰＴＫ活性を見いだすことの困難さ に対するある程度の説明になろう。

ＰＣＲクローンＦＤ１７のコード領域（ＪＡＫ２）を包含するｃＤＮＡクローン が、ある範囲のマウスｃ　ＤＮＡライブラリから分離された。ＪＡＫ２およびＪ ＡＫｌの予測されたアミノ酸配列は、相互にかなり類似したいくつかの領域を示 す（図５、例３も参照）。

系統発生の分析 はとんどのタンパク質キナーゼの触媒ドメインの系統発生関係が、フェンダ・ア ンド・トリトル（Ｆｅｎｇ　ａｎｄＤｏｏｌｉｔｔｌｅ）　（１９８７）のツリ ー構築プログラムを使用して判定された。図６は、ＪＡＫｌの２つのキナーゼ関 連ドメインの、キナーゼ科の残り部分に対する系統発生関係を示す。このファミ リーツリーから、これら２つのドメインか、ＰＴＫサブファミリーの発達より古 い共通の祖先を持っていたと結論される。ＡＮＰレセプター／グアニル酸シクラ ーゼ科のキナーゼ関連ドメインが隣接点で分かれることは興味深い。

例３ Ｊ　Ａ　Ｋ　２のクローン化と配列決定マウスＪＡＫ２の配列 マウスＪＡＫ２のより長いｃＤＮＡクローンのクローン化を開始するベースとし て、ＰＣＲクローンＦＤ１７か使用された。ある範囲のｃＤＮＡライブラリから 、そしてＲＡＣＥ　（フローマン他（Ｆｒｏｈｍａｎ　ｅｔ　ａｌ）　１９９０ 、ロー他（Ｌｏｈ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９９０）によってｃＤＮＡが分る。予測 されたアミノ酸配列は、このタンパク質がＪＡＫ　１に深く関係することを示す 。Ｃ末端で、ＰＴＫ触媒ドメインのすべての特徴を持つ配列が、Ｎ末端へ向かっ て約２７０のアミノ酸分延びている。図８で、これらはハンクス（Ｈａｎｋｓ） の命名法に従って標識されている。このすぐ（７）Ｎ末端（ＡＡ４００−６６０ ）ニ、コノクラスノＰＴＫに特異的なキナーゼ関連ドメインがある（ウィルラス 他（Ｗｉｌｋｓ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９９１）　、　ＪＡＫ　１に関連して例２ に記載されたアプローチと同様、ハンクス（Ｈａｎｋｓ）の命名法に従って、そ の起源を示す接尾語Ｎａをつけてキナーゼ関連ドメインを指定した。このドメイ ンの一つのまれな特徴は、この科の他の構成種に対して、要素ＶＩ　ＩａとＶＩ 　Ｉ　Ｉａの間に７つのアミノ酸の見かけ上の挿入があることである（ハンクス の命名法；ハンクス・アンド・フィン（Ｈａｎｋｓ　ａｎｄ　Ｑｕｉｎｎ）　１ ９９１　）　ｏこの特徴はこの領域を包含する４つの配列決定されたクローンの 一つだけに見られ、その存在は機能的重要性でなく、まれなスプライシング異常 による可能性か残っている。

Ｊ　Ａ　Ｋ　２の分布 マウスにおけるＪＡＫ２発現のノーザン分析は、低いそして高い緊縮ハイブリッ ド形成条件の下にＪＡＫ２でハイブリッド形成する２つのｍＲＮＡ転写物（４， ８および４．４ｋｂ）を示した。異なる組織中で、これら転写物のレベルか互い に対して変化することは興味深い。

例えは、腎臓、牌臓および肺は、主としてより大きい発現を示し、卵巣、胎盤、 骨格（ｓｋ）筋、そして分析されだすへてのマウス細胞系は両方を略同等のレベ ルで発現する。

低い緊縮ハイブリッド形成条件のもとで、マウスＪＡＫ２プローブはヒトＪＡＫ 　２　ＲＮＡ　（Ｋ　５６２）を認識するが、４．４ｋｂといった小さい転写物 だけが検出される。

この点て、２つの転写物のどちらかの起源が不明で、それらの相違を説明する微 分スプライシングは検出できなかった。しかし、これらのサイズの差異の主要な ソースが、異なるポリアデニル化情報の使用にあるかも知れない。レベルは異な るが、ＪＡＫ２はマウスの器官に広く発現する。胸腺、骨格筋、卵巣および胎盤 に高い発現がみられたか、ＪＡＫ２はこう丸や肝臓でほとんど検出できなかった 。更に、ＪＡＫ２発現が繊維芽細胞（３０Ｆ、ＮＩＨ）、上皮（３１Ｄ）および 造血（３０，１）源のマウス細胞系に検出された。

ＪＡＫ科同族ドメイン ＪＡＫ　１およびＪＡＫ２のクローン化が、ＪＡＫ科同族ドメインの特定を容易 にした。図１０は、ＪＡＫｌのアミノ酸配列の比較を示す。これら２つのタンパ ク質の配列同一性は、７つの明確な同族ドメインとして表れている。これら７つ のドメインは、図１１の一次配列レベルで示されている。ＰＴＫドメインはＪＡ Ｋ同族ドメイン１　（ＪＨＩ）として、第２キナーゼ関連ドメインはＪＨ２Ｈ２ ドメインて等、ＪＨ７まて分類されている。

ＪＡＫ同族ドメインの境界は任意で、機能的ドメインを形成しても、しなくても よい。しかし、その記述は、このクラスのタンパク質の全体構造の類似性の考察 を助けるのに有用である。ＪＨＩおよびＪＨ２Ｈ２ドメイン造は、例２に記載さ れている。ＪＨ３はＪＡＫ同類ドメインの最も少なく保存されるうちの一つで、 各科構成種が推論された共通配列の３５％（ＪＡＫ２）から５０％（ＪＡＫＩ） を持つ。ＪＨ４ドメインはＣ末端境界付近に配列−ＧＬＹＶＬＲＷＳ−を持ち、 それはＳＨ３Ｈ３ドメインア配列に対しである程度の同族性を持つ（下記を参照 ）。更に、この領域の最もよく保存されるサブドメインは潜在的チロシンリン酸 化部位、つまり−ＶＤＧＹＦＲＩ−を持つ。総じて、ＪＨ４ドメインは、このド メインの推論された共通配列の５１％（ＪＡＫ２）から６４％（ＪＡＫＩ）を持 つ。残りの各ＪＡＫ同族ドメインは、ＦＡＳＴＡプログラムを使用して、ＮＢＲ ＬおよびＥＭＢＬデータベースに対して別々にふるい分けられた。これらデータ ベースの中のどれにも、注目すべき同族性は見られなかった。これらのドメイン はＰＴＫのＪＡＫ科の構成種に構造的かつ機能的に保存されるが、Ｐ　Ｔ　Ｋの ｓｒｃ科のＳＨ２およびＳＨ３Ｈ３ドメインなり、他の情報伝達分子における役 割を持たない可能性があると結論される。

ＰＴＫのＪＡＫ科のいずれにも、ＳＨ２Ｈ２ドメインかけ上存在しないことは興 味深い。ＳＨ２共通配列とＪＨ３およびＪＨ４ドメインの一部の間に微妙な配列 類似性か検出された（Ｈ・ハナフサ・アンド・Ａ・ベマーズ（Ｈ，Ｈａｎａｆｕ ｓａ　ａｎｄ　Ａ、　Ｂｅｍａｒｄｓ）　、個人通信）。図１２は、これら２つ のドメインの整列を示す。ＳＨ２Ｈ２ドメインするＪＨ３Ｈ３ドメイン似性はＳ Ｈ２コア配列を囲む領域（ＦＬＶＲＥＳ）で非常に明白だが、同族性はこの領域 からいずれの方向へも遠く延びず、ＳＨ２Ｈ２ドメイン末端境界付近に再び現れ るだけである。ＳＨ２ドメイン間に最もよく保存されるこれらの要素の多くに特 に、広範な同族性かないこと（コツホ他（Ｋｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ）１９９１）（ 恐らく、それら残基かこのドメインの保存機能に非常に深く関係することを示す ）は、検出された同族性が偶然のことか、かなりの配列分岐の展開の産物である ことを示唆する。ＳＨ２Ｈ２ドメインＰＴＫの基質上でリン酸化チロシン残基と 相互作用すると現在考えられている（ポーソン（Ｐａｗｓｏｎ）　１９８９　； 　Ｄ　ッホ他（Ｋｏｃｈ　ｅｔ　ａｌ）　ｌ　９９１に記載されている）、ＪＨ ３／ＪＨ４ドメインか、同様な機能的役割を果たすかどつがは判明していない。

例４ ＪＡＫがある範囲の動物に現れることを示すため、オリゴヌクレオチドプローブ を調製し、種々の動物に由来するスクリーンゲノムの増幅に使用した。ＪＡＫの ＤＮＡか、ショウジヨウバエ、ゼノプス、マウスおよびヒトゲノムに検出された 。主な保存配列は、テストされたすべての動物に共通なりＰＧであった。

参考文献： クリーソンーウエルシ　エル、　エリクソン　ニー、　ウェス９−マーク　ビー 、　ヘルプイン　シー・　エイ１３１５、＋９８０゜ コスマ　ニス　・　ノー、　レフドモンド　ニス　・　エム　・　ニス、　ノア ノーチャン　エフ、　ソーラー　ニス　・エム、　グトナー　ピー、　ハインズ 　１ヌ　−イー、ＥＭＢＯ，Ｊ、７：１４７−１５４゜１９８８゜ カイト　ノエも　トリトル　了−ル・エフ、Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、１５７：１ ０５−１３２゜１９８２゜ Ｎ、Ｙ、１９８２゜ モーラン　エム・　エフ、　コブ本　シー・　ニー、　サトウスキー　了も　ポ ーラン　ティ。

シー　ビー、　リコー　ニス　・　エイチ、　ムーン　ケイ　・　エイチア　シ ー　エイチ・　ダブリュ。

トウビン　エイチ、　ステーリン　テ仁　ゴートン　ジェイ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ 、Ａｃａｄ、ＳｃｉヴＴインマスター　ノー、　ツォラー　エム　・　エム、　 スミス　エム、　ハイフン　イー、　ボーラン１９８８゜ ズイーミフキー　ニー、　ミュラー　アール・　ジー、　ノアオーチャン　エフ 、　ハインズ　エフ　・　イー。

フィルムバブハークラフト　ア仁　パイヤーズ　エム、　ン３−ズ　ティ、　ダ ラーフＴベラ　了−ル。

ハンクス　ニス・　ケ仁　フィン　ニー・エム、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ ｙｍｏｌｏｇｙ　２００：３８−６２．　１９９１゜ ハンクス　ニス・　ケイ、　フィン　ニー・　エム、　ハンター　テ＜、５ｃｉ ｅｎｃｅ　２４１：４２−５２、　１９８８゜ コブ本　ノー　・　ニー、　アンダーラン　デ仁　モラン　エム・　エフ、　エ リス　シー、　ポーラン　テ仁２５２：６６８−６７４．１９９１゜ロー　イー ・　ワ仁　王すオブト　ノエイ　・　エフ、　クイラ　ニス、　ラニエル　エル ・　エル。

テイヴイス　エム　・　エム、５ｃｅｉｎｃｅ　２４３：２１７−２２０．　１ ９８９゜マース　ノエイ　・　ディ、　ビート　アール、　クレブス　イー・　 ノー、　ベリムター　アール・　エム。

Ｃｅ１ｌ　４３：３９３−４０４．　１９８５゜フル千ネス　了−ル、　７−ノ ーープレヴオー　ビー、　バーナーズ　ニー、　バルチモ了　テ仁メイヤー　ビ ー・　ノエ仁　ハマグチ　ェイチ、　ハナフサ　エイチ、Ｎａｔｕｒｅ　３３２ ：２７２−２７４、　１９８８゜ ニノザワ　エム、　センバ　ケ化　ヨノダ　エム・　シー、　ヤマモト　テ仁　 ササキ　エム、　トヨンセンバ　ケ仁　二ンザワ　エム、　ミャノ７　エフ、　 ヨンダ　エム・　シー、　スカガヮ　ジェイ、　ヤマＳｃｉ、８３：５４５９− ５４６３．　１９８６゜スケガワ　ノエ仁　センバ　ケ仁　ヤマナシ　ワイ、　 ニシザワ　エム、　ミャジマ　エヌ、　カマモトテ４．　）−１ン７　ケ仁　Ｍ ｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、７＋４１−４７．　１９８７゜トレーヘイ　エ ム、　ワン　ノー、　ハレンベフク　了−ル、　ルピンフェルト　ピー、　マー ティン　ジー　・ニー、　ラドナー　エム、　Ｏング　シー・　エム、　クロン ール　ダブリコ　・　ジエ仁　ワット　ケイ。

９７−１１１．　１９９０゜ ウィルラス　ニー・　エフ、　ハーバ−ニー、　カーパン　アール・　了−ｌし 、　ラｌレフ　ニス・　ノエヤマニン　ワ仁　フタンゲ　ニス・　アイ、　セン バ　ケイ、　スケガワ　ジエイ、　ミヤジ７　エヌ、　マｌ　葺ゴ　■　：；、 ５　Ｗ＃　葺ぶ　Ｕわ！″′　隠芝ａ′　兵？：′。２錠＝　８己＝　８場＝　 じε＝急芝　８よ　已；　已５　急足　６３　号３？品　瓢ご　ミま　旨ご　８ た　８ミ　色窃讐＝　屍＃　急ご　隠芝　８δ　６芝　８宸８ぶ　乏ｙ　邑芝　 瀝ｆ　６曹　８と　仁記１’＋ＱＩ　Ｅ−４１−１（ＪＯＪ　（Ｃｈ　ａｕ＞　 ｕｕ←−＜＞　←−じ− ＜Ｗ　Ｅ−ＩＥ−１＜Ｗ　＜よ　炬ご　淀εＳａ、　Ｕ　の　Ｑ　α　Ｑ　Φ　 Ｑ　の　Ｑ　−＜　の　＜・−＜　の　Ｅ−１−Ｉ　Ｅ−１二　Ｑ　■じ＜　ｕ ：ｃ　ａ＜　＜Ｈ＋ｃｗ　＜ωトの　く−　リ■　ＵＬＩ　Ｅ−１−４ＱＣ３− 、ＨＨ誘　がご　？ｙ　紹；　６芝＜＞Ｏ（ＪＧＪｕ”ｌ　（ＪＯＯイ■ｈｃｃ ＋　Ｅ−＜ｔ／）ｕ”１８ｇ口　ギ＝＝　８だ８　≦ご悶　乏芝雷　８　ＣＮ← α　０で　Ｑコ　トｃ　トα　トω 已芝　８′２　じ３　乏５　２曜　ミ＝（ＪＯＬ）＞　ｏｕ　Ｅ−１■　（ＪＷ 　ｌ−Φｕｕ　ｏＰ＠Ｅ−１Φ　Ｆ−１−１ｕ＋ｃ　←二〇〜　ａＶ　＜Σ　く Ｈくト　←− ○α　くり　Ｑの　Ｅ−ＩＬｔ　Ｕコ　くコ、、：）＜　＜ＪＡ　乏ご　＝〜　 乙３　西口く■　Ｅ＠の　Ｕの　く■　トコ　じのＵ＜　６−１゜　≦ご　８５ 　じ３　≦ごトω　ｏ＝＋　ｏｕ　Ｑリ　ＵＣ＜コ ミ＝　百Ｓ　ミ蒙　乏ご　２曜　じ３ Ｅ−＋００　（Ｊ（：ＩＪ”ｌ　（ｊｕｏ　ＣＪＬ＋Ｘ　ＱＯ’ｌＯ（ＪＧＪＬ ｎ８だ二　乏にニ　ミ避咎　ご式目　沼々よ　に記丈Ｅ″″′　い　Ｅ″口　寡 　じ菰　ε Ｅ＠ω　＜−ｕ＜　＜ｈ　−υ　Ｌ）Ｑｔ、Ｄ”５　ＣＤフ　く−　。の　。＞ 　。い＜１−ＩＥ−４０Ｅ＠旬　。為　。−。岬（！Ｉｊ　Ｕ、−１０＞ わ　韮　禄　臼　年５　臼 ミ唾　埼絆　日本　二≧；　８容　ヨ３！睡琶　わ　本　Ｈ運　睡占　簸コ ｇ占　迷３　ト　韮　匠１　韮 ＵＬＪ　Ｅ−ＩＬＩ　（Ｊ　■　〇　−Ｑ　■　ＱＣ（ＪＪ：ＵＧＪ　←−■■ 　ト一＜← くト　←Ｃ／）　＜ｓ　＜の　ｇ　ｘ　（Ｊ　（ｊＱの　Ｑの　ＯＳ　■■　Ｑ ＣＱり 冒ご　乏ご　色目　巳ミ　６己　旨ご （Ｊｌ、＋　ＣＤ：ｌｉ　Ｅ−１（Ｌｌ　（Ｊ　α　Ｑ　の　Ｑ　りＱΦ　＜− Ｅ−に　くり くの　ＱＣ，Ｄ　←山　■く　乏ご　翻δ芥　目　拍　Ｆト　離日　日 ギ＝　８と　てご　ご；　定＝　８と １占　肛　卦　口と　１ぎ　リ ＜ｌｊＱ、　Ｕ：５　“６０　乏ヨ　舐２じ　し　Ｑ　−←　Φ　＋（ｊＬ＋ Ｑ＜　Ｅ−Ｉ←　〇−く＜　ΦＧ　Ｅ−、−１（ＪＯｕ”：３　（Ｊ（ＬＩ　Ｑ Ｗ　ＣＪＱ、　ＣＪ＋ｕ　ｕ　＜−Ｅ−１＋　ｕぷ　＜リ　ト℃Ｑ山　ａｒ、ｖ 　＜ｙ　＜ｈ　ａ＜　ｕ＞墓訂　Ｈ市　訂社　葺釘　ん君拍ヨ長 ギ３　旨５　目　芥　Ｕ　属理 ｕｍｘ　■　コＯＱ　コＬｎ（Ｊ　ΦＱ＄Ｑ、ｕＴｈ　じ　り。

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Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．多重タンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つが、ＳＨ２ドメインを持たな いポリペプチドからなる動物のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）状分子。 ２． 子。 動物がほ乳類である請求項１に記載のＰＴＫ状分３．動物がヒトまたはマウスで ある請求項１に記載のＰＴＫ状分子。 ４．ポリペプチドが２個のタンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つ請求項１ま たは２または３に記載のＰＴＫ状分子。 ５．分子量が約１００，０００から約２００，ダルトンである請求項４に記載の ＰＴＫ状分子。 ０００ ６．分子量が約１２０，０００から約１５０，ダルトンである請求項５に記載の ＰＴＫ状分子。 ０００ ７．ポリペプチドが合成ポリペプチドである請求項１から６のいずれかに記載の ＰＴＫ状分子。 ８．合成ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項７に記載のＰＴＫ状分 子。 ９．前記分子がＪＡＫ１である請求項１に記載のＰＴＫ状分子。 １０．前記分子がＪＡＫ２である請求項１に記載のＰＴＫ状分子。 １１．多重タンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つが、ＳＨ２ドメインを持た ないポリペプチドからなる動物のタンパク質チロシン状分子をコード化したヌク レオチド配列からなる核酸分子。 １２．動物がほ乳類である請求項１１に記載の核酸分子。 １３．動物がヒトまたはマウスである請求項１１に記載の核酸分子。 １４．ポリペプチドが２個のタンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つ請求項１ １または１２または１４に記載の核酸分子。 １５．分子量が約１００，０００から約２００，０００ダルトンである請求項１ ４に記載の核酸分子。 １６．分子量が約１２０，０００から約１５０，０００ダルトンである請求項１ ５に記載の核酸分子。 １７．ＰＴＫ状分子がＪＡＫ１である請求項１１に記載の核酸分子。 １８．ＰＴＫ状分子がＪＡＫ２である請求項１１に記載の核酸分子。 １９．請求項１から１０のいずれかに記載のＰＴＫ状分子に対するアゴニスト。 ２０．請求項１から１０のいずれかに記載のＰＴＫ状分子に対する拮抗体。 ２１．請求項１から１０のいずれかに記載のＰＴＫ状分子に対する抗体。 ２２．抗体がモノクローナル抗体である請求項２１に記載の抗体。 ２３．タンパク質のリン酸化方法であって、前記タンパク質をリン酸化に必要な 量の動物タンパク質チロシンキナーゼ状分子と接触させ、前記最初のタンパク質 がリン酸化されるに十分な時間と条件下で、前記分子が、多重タンパク質キナー ゼ触媒性ドメインを持つが、ＳＨ２ドメインを持たないポリペプチドからなる。 ２４．動物がほ乳類である請求項２３に記載の方法。 ２５．動物がヒトまたはマウスである請求項２３に記載の方法。 ２６．ポリペプチドが２個のタンパク質キナーゼ触媒性ドメインを持つ請求項２ ３または２４または２５に記載の方法。 ２７．タンパク質チロシン状分子の分子量が約１００，０００から約２００，０ ００ダルトンである請求項２６に記載の方法。 ２８．分子量が約１２０，０００から約１５０，０００ダルトンである請求項２ ７に記載の方法。 ２９．ポリペプチドが合成ポリペプチドである請求項２３から２８のいずれかに 記載の方法。 ３０．合成ポリペプチドが組換えポリペプチドである請求項２９に記載の方法。 ３１．ＰＴＫ伏分子がＪＡＫ１である請求項２３に記載の方法。 ３２．ＰＴＫ状分子がＪＡＫ２である請求項２３に記載の方法。