JPH06511385A - 植物由来の酵素及びｄｎａ配列並びにそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物由来の酵素及びＤＮＡ配列並びにそれらの使用本発明は、グルタチオン−８ −トランスフェラーゼ酵素及びそれをコード化するＤＮＡ配列に関する。

グルタチオン−８−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）類は、グルタチオンがスルフ ィドリル基を介して広範な疎水性の親電子化合物に複合（ｃｏｎ＋　ｊｕｇａｔ ｉｏｎ）するのを触媒する一部の酵素である。この複合の結果、前記化合物が解 毒きれ得、しかも組織から前記化合物が除去され得る。

ＧＳＴ酵素は、一連の作物植物例えばトウモロコシ、小麦、モロコシ及びエント ウマメにおいて確認されている。ＧＳＴ類は、白化したトウモロコシ菌中の全可 溶性タンパク質の１〜２％を構成する。

ＧＳＴの３種類のイソ型（ｉｓｏｆｏｒｍ）、すなわちＧＳＴ−Ｉ、ＧＳＴ−Ｉ Ｉ及びＧＳＴ−ＩＩＩが確認されている。トウモロコシの組織中の主要なイソ型 、ＧＳＴ−Ｉは、構成的に（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）発現され、しかも グルタチオンを出芽前除草剤例えばアラクロール（ａｌａｃｈｌｏｒ）と複合さ せることができる。トウモロコシ組織を化学的解毒剤（例えば、Ｎ、Ｎ−ジアリ ル−２，２−ジクロロアセトアミド）で処理すると、出芽前除草剤の解毒に関与 するＧＳＴ−Ｉの活性が高められる。

国際特許出願公開第Ｗ０９０１０８８２６号明細書には、ＧＳＴ−ＩＩ　（イソ 型■）が記載されている。

ＧＳＴ−ｎタンパク質とＧＳＴ−ｎタンパク質は両方共に約５０ｋＤの固有の（ ｎａｔｉｖｅ）分子量を有する。哺乳動物におけるように、トウモロコシのＧＳ Ｔ類は二量体であり；　ＧＳＴ−Ｉは明らかに同じ複数個の２９ｋＤのポリペプ チドサブユニット（ＧＳＴ−ｌ−２９）を有し、これに対してＧＳＴ−ＩＩはＧ ＳＴ−Ｉに認められるサブユニット（ＧＳＴ−ｌ−２９）と同じ２９ｋＤサブユ ニツトと、新規な２７ｋＤサブユニツト（ＧＳＴ−ｎ−２７）とのへテロニ量体 である。ＧＳＴ−ｎは解毒剤の不存在下において極めて低い基礎濃度（ｂａｓａ ｌ　１ｅｖｅｌ）で検出されるが、その発現は解毒剤処理によって劇的に高めら れる。ＧＳＴ−Ｉと同様に、ＧＳＴ−ｎはある種の除草剤に対する抵抗性を付与 する。ＧＳＴ−ｎがクロロアセトアニリド系除草剤やチオカーバメート系除草剤 、例えばアラクロールを解毒することは公知である（Ｍｏｚｅｒらの論文、Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２２．１０６８−１０７２（１９８３））。

ＧＳＴ−Ｉの２９ｋＤサブユニツトに対応するｃＤＮＡと遺伝子とは、既にクロ ーン化され、配列決定されているＣ１ｉｅＣ１１ｅらの論文、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ ｌ。

Ｂｉｏｌ、、７．２３５−２４３（１９８６））　、さらにまた、トウモロコシ ノ菌中のＧＳＴ活性をもつ第３の少量成分の２６ｋＤサブユニツト（ＧＳＴ−ｍ −２６）に対応するｃＤＮＡも、既にクローン化され、配列決定されている（Ｍ ｏｏｒｅらの論文、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１８．７ ２２７−７２３５（１９８６））　ｏ　ＧＳＴ−ｍはこの２６ｋＤサブユニット 同士のホモニ量体である。ＧＳＴ−Ｉと同様にしかもＧＳＴ−ＩＦとは異なって 、ＧＳＴ−ｍは構成的に発現される。除草剤例えばアトラジンを解毒することは 知られている。

本発明によれば、本発明者らによって、グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ 、イソ型■、酵素の２７ｋＤサブユニツト（ＧＳＴ−ｎ　−２７）用の遺伝子プ ロモーターをコード化するゲノムＤＮＡ配列であって、本明細書に添付の第８図 に示されるヌクレオチド配列を有するゲノムＤＮＡ配列及びその遺伝暗号の宿退 によって可能な該配列の変型（ｖａｒｉａｎｔｓ）が提供される。

上記ゲノムＤＮＡは、大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株の中に含有させたプラスミドｐ ＧＩＥ７として、英国、スコツトランド、ＡＢ２１ＲＹ、アバディーン、マーチ ャー−ドライブ・ストリート２３　（２３Ｓｔ　Ｍａｃｈａｒ　Ｄｒｉｖｅ。

Ａｂｅｒｄｅｅｎ、　ＡＢ２１ＲＹ、　５ｃｏｔｌａｎｄ、　ＵＫ）所在のザ・ ナショナル・コレクションズ・オン・インダストリアル・アンド・マリン・バク テリア（ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｕ ｓｔｒｉａｌ　ａｎｄ　Ｍａｒｉｎｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）（ＮＣＩＭＢ）に、 寄託番号ＮＣＩＭＢ　４０４２６として１９９１年６月１４日付で寄託しである 。

また、本発明によれば、本明細書に添付の第４図に示されるアミノ酸配列を有す るＧＳＴ−ｍ−２７酵素サブユニツトが提供される。

さらにまた、本発明によれば、このＧＳＴ−ＩＦ−２７サブユニツトをコード化 するｃＤＮＡ配列であって本明細書に添付の第２図に示されるヌクレオチド配列 を有するｃＤＮＡ配列、及びその遺伝暗号の縮退によって可能にされる該配列の 変型が提供される。

上記ｃＤＮＡは、大腸菌ＸＬＩ−ｂｌｕｅ株の中に含有させたプラスミドｐ０２ １として、英国、スコツトランド、ＡＢ２１ＲＹ、アバディーン、マーチャー・ ドライブ・ストリート２３所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オン・イン ダストリアル・アンド・マリン・バクテリア（ＮＣＩＩＩＩＢ）に、寄託番号Ｎ ＣＩＭＢ　４０４１３として１９９１年４月１９日付で寄託しである。

国際特許出願第公開１０９０１０８８２６号明細書には、トウモロコシＧＳＴ− ＩＩ遺伝子の２７　ｋＤサブユニット（ＧＳＴ−ｌｌ−２７）から単離された化 学誘導性の（ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ　１ｎｄｕｃｉｂｌｅ）遺伝子プロモーター 配列が記載されている。該国際特許出願公開明細書は本明細書において参照され る。

本出願において、本発明者らは前記の記２７ｋＤサブユニットに対応する完全ｃ ＤＮＡのクローニング及び配列決定について記載する。この配列は誘導性（ｉｎ ｄｕｃｉｂｌｅ）であり、ＧＳＴ−ｌｌ−２７特異的抗血清によって特異的に認 識される。該配列は他のトウモロコシＧＳＴ類と部分的に相同性である。

本発明によって、ＧＳＴ−１−２７用ｃＤＮＡは、前記プロモーター領域を含ん でいる対応ゲノム配列を単離するための遺伝子プローブとして利用されている。

さらにまた、本発明によれば化学的にスイッチし得る（ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ） 遺伝子組立て体であって、１個の外来遺伝子又は一連の外来遺伝子類に操作的に 連結されたＧＳＴ−ｎ−２７遺伝子プロモ一ター配列を含み、それによって該外 来遺伝子又は該一連の外来遺伝子類の発現を有効な外因性誘導物質（ｉｎｄｕｃ ｅｒ）を適用することによって制御し得るようにされである、化学的にスイッチ し得る遺伝子組立て体が提供される。また本発明によれば、前記遺伝子組立て体 を用いて形質転換された植物が提供される。

前記ＧＳＴ−Ｉ［−２７遺伝子が、“除草剤解毒剤”として公知のある種の化合 物であって、例えば噴霧液として生育植物に施用し得る化合物によって誘導され ることは既に明らかにされている（国際特許出願公開第Ｗ０９０１０８８２６号 明細書）。この誘導は、任意の適当な化学物質例えば公知の解毒剤並びに他の農 薬、化学物質類縁体及び他の可能性のある（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）誘導物質を施 用することによって達成し得る。かかる化学物質としては、Ｎ、Ｎ−ジアリル− ２，２−ジクロロアセトアミド（一般名：　ｄｉｃｈｌｏｒａｍｉｄ）　；　２ ．２．５−　）ジエチル−３−（ジクロロアセチル）−１，３−オキサゾリジン ；２−クロロ−４−（トリフルオロメチル）−５−トリアゾール−カルボン酸ベ ンジル（一般名：　ｆｌｕｒａｚｏｌｅ）　；ナフタレン−１，８−ジカルボン 酸無水物；２−ジクロロメチル−２−メチル−１，３−ジオキソラン：ｌ−（ジ クロロアセチル）−ヘキサハイドロ−３，３，８ａ−トリメチル−ピロール（１ ，２−ａ）−ピリミジン−６（２１１１）−オン；１，３−ジオキソラン−２− イル−メトキシイミノ（フェニル）ベンゼンアセトニトリル；４．６−ジクロロ −２−フェニル−ピリミジン；２，２−ジクロロ−［Ｎ−アリル−Ｎ（１，３− ジオキソラン−２−メチル）］アセトアミド；１−（シアノメトキシイミノ）ベ ンズアセトニトリル；４゛−クロロ−２，２，２−トリフルオロアセトフェノン −〇−１，３〜ジオキソラン−２−イル−メチルオキシム、　２．２−ジクロロ −１−（３，４−ジヒドロ−３−メチル−２Ｈ−１，４−ベンゾオキサジン−４ −イル）エタノン；３−ジクロロアセルー２．２−ジメチルオキサゾリジン；４ −メトキシ−３，３−ジメチルベンアゾール−１−イル）ペンタ−１−エン−３ −オール；２，２−ジクロロ−Ｎ−（３−メチル−４−チアゾリン−２−イリデ ン）アセトアミド；０，０−ジエチル−０−フェニルホスホロチオエート、　２ ．２−スピロシクロへキシル−Ｎ−ジクロロアセチルオキサゾリジン；Ｎ−ベン ジル−Ｎ−エチル−ジクロロアセトアミド；３−クロロアセチル−４，４−シク ロヘキサン−スピロ−２，２−ジメチル−１，３−オキサゾリジン；スピロオキ サゾリジンアセトアミド；オキサベトリニル；ジオメトリニル；フェンクロリム ；メトキシフェノンが挙げられる。

次いで、前記ＧＳＴ−ｎ−２７プロモーターは、外因性又は外来性の遺伝子に連 結され、形質転換によって植物中に導入された場合には、その外来遺伝子の発現 を外部調節するための手段を提供する。上記外来遺伝子は野生型ＧＳＴ−ｎ−２ ７遺伝子以外の遺伝子であり得る。前記の国際特許出願公開第１０９０１０８８ ２６号明細書には、かかる外部調節可能なプロモーターの使用の方法の詳細が記 載されており、また国際特許出願公開第ｔｏ　９０１０８８３０号明細書には、 植物中で雄性不稔を惹起する遺伝子カスケード（ｃａｓｃａｄｅ）の−要素（ｃ ｏｍｐｏｎｅｎｔ）としてかかるプロモーターを使用すること及びかかる植物を ハイブリッド作物の作成において使用することが詳細に記載されている。本明細 書においては、誘導性のＧＳＴ−ｌｌ−２７プロモーターが単子葉植物及び双子 葉植物の両方において機能できることが明らかにされる。従って、上記ＧＳＴ− Ｉｆ−２７プロモーターは、種々の遺伝子修飾（ｇｅｎｅｔｉｃａｌ　ｌｙ　ｍ ｏｄｉｆｉｅｄ）植物、例えば耕作作物例えばｃａｎｏｌａ、ヒマワリ、タバコ 、サトウダイコン、ワタ；穀物例えば小麦、大麦、稲、トウモロコシ、モロコシ ；果実例えばトマト、マンゴ−、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ及びメロ ン；並びに野菜例えばニンジン、レタス、キャベツ及びタマネギにおいて遺伝子 の発現を制御するのに使用できる。また、前記ＧＳＴ−ｎ−２７プロモーターは 、種々の組織例えば根、葉、茎及び再生組織において使用するのに適している。

概略、本発明の酵素、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡを単離するのに使用した方法は 下記の通りである。

解毒剤で誘導したトウモロコシ組織からＧＳＴ活性のピーク時に全ＲＮＡを抽出 し、それを使用してＧＳＴ転写物を含んでいるｃＤＮＡライブラリーを構築した 。

ＧＳＴ−ｎ−２７タンパク質を上記と同種の組織から抽出し、精製し、それを使 用してヒツジ抗血清を高めた（ウェスタン分析及びドツトプロット分析により特 定した）。

この抗血清を用いて前記ｃＤＮ＾ライブラリーを免疫スクリーニングする（同位 体検出装置を使用して）ことによって、前記の新規ＧＳＴ配列を単離した。プラ ーク精製により、このＧＳＴを含むプラスミドＤＮＡの生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ ）切除及び配列決定が可能にされた。ノーザン分析により、上記プラスミドＤＮ Ａが解毒剤誘導性（ｓａｆｎｅｒ　１ｎｄｕｃｉｂｌｅ）クローンであることが 明らかにされた。

上記ｃＤＮＡから調製し、注意深く設計したプローブを用いてトウモロコシゲノ ムライブラリーをスクリーニングすることによって、ＧＳＴ−ｎ−２７ゲノムク ローンを単離した。これらのクローンをマツピング（ｍａｐｐｉｎｇ）すること によって、前記プロモーター領域を含んでいる断片を単離し、配列決定した。

得られたプロモーター配列を使用して植物遺伝子発現カセットを組み立てた。こ れらのカセットを、単子葉植物と双子葉植物の両方に導入し、これらのカセット により誘導可能な方法で遺伝子発現が制御されることを明らかにした。

また、本発明によれば、ＧＳＴポリペプチド類をコード化するＤＮＡを植物中に 、グルタチオン−８−トランスフェラーゼ酵素が発現されるように組み込むこと からなる、除草剤耐性のトランスジエニ・ツク植物（遺伝子導入植物ともいう） の作成方法が提供される。さらにまた、本発明によれば、該方法によって作成さ れた除草剤耐性植物及びその後代（ｐｒｏｇｅｎｙ）が提供される。

除草剤の作用に耐える作物植物を提供する目的は、標準状態、すなわち除草剤感 受性の状態にある作物植物を撲滅させる有効濃度の除草剤を全面施用することに よって、作物植物の間で生育する雑草を防除するのに役立てることである。かか る耐性植物はまた、前の（ｐｒｅｖｉｏｕｓ）施用から除草剤が短時間キャリー オーバー（ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）している場所において使用するのに有効であ る。このような状況においては、耐性植物は、標準的植物と比較した場合に、高 められた除草剤耐容性を示す植物であると定義される。耐性は、除草剤の影響に 対する耐容性において僅かに高いものから、植物が除草剤の存在によっても影響 を受けない完全耐性にまで変化させ得る。

グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子を含有する除草剤耐容性植物は、 １９８７年１１月２６日付けで公告されたオーストラリア特許出願公告第７３１ ４６／８７号明細書（チバガイキー社）　（１９９１年１２月１７日付けで公告 された米国特許第５０７３６７７号に関連する）に記載されている。

該特許出願公告明細書には、哺乳動物のＧＳＴ配列、具体的にはラットのＧＳＴ 配列の使用が記載されている。ラットのＧＳＴをコード化する遺伝子配列が記載 され、これを使用してタバコ用の植物形質転換ベクターが組み立てられている。

幾つかの形質転換体はアトラジン耐性を示した。上記特許出願公告明細書には、 植物から誘導されたＧＳＴ配列は記載されていない。特に、該特許出願明細書に は、ＧＳＴ−■−２７配列は記載されていない。

ＧＳＴポリペプチドサブユニットをコード化するＤＮＡは、適当なプロモーター （構成性又は誘導性）の制御下に植物形質転換ベクター中に組み込み得る。ＧＳ Ｔ−Ｉ　２９ｋＤポリペプチドサブユニツトを発現する植物は、ＧＳＴ−１酵素 活性を示すであろう。ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニツトと、ＧＳＴ−ＩＩ　２ ７ｋＤサブユニツトとを一緒に発現する植物は、ＧＳＴ−■酵素活性と若干のＧ ＳＴ−ｎ活性を示すであろう。ＧＳＴ−ｍ　２６ｋＤサブユニツトを発現する植 物は、ＧＳＴ−ｍ酵素活性を示すであろう。ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニツト と、ＧＳＴ−Ｉ［［２６ｋＤサブユニツトとを一緒に発現する植物は、ＧＳＴ− ｎ活性とＧＳＴ−Ｉ［ｎ活性とを示すであろう。ＧＳＴ−Ｉ２９ｋＤポリペプチ ドと、ＧＳＴ−１２７ｋＤポリペプチドと、ＧＳＴ−ｍ　２６ｋＤポリペプチド とを一緒に発現する植物は、ＧＳＴ−ｎ活性と、ＧＳＴ−Ｉｎ活性と、ＧＳＴ− ｍ活性とを示すであろう。かかる植物は全て、グルタチオンをある種の出芽前除 草剤と複合させ得るであろう。従って、かかる植物は上記除草剤に耐性であろう 。ＧＳＴ活性は、一連の化学的除草剤、例えばクロロアセトアニリド類及びチオ カーバメート類に対して有効であることが知られており、しかも除草性を示す別 の化合物に対して活性であり得る。本発明のトランスジェニック植物によって示 される除草剤耐性の実際的スペクトラムは、活性なＧＳＴイソ型（ＧＳＴ−Ｉ　 、　ＧＳＴ−ｎ又はＧＳＴ−ｍ）に左右されるかあるいは植物中に存在する種々 のＧＳＴイソ型の相対活性に左右されるであろう。例えば、ＧＳＴ−ｎは、アラ クロール及びアセトクロールに対して活性であり、ＧＳＴ−ｍはアトラジンに対 して活性である。従って、本発明の除草剤耐性トランスジェニック植物の作成方 法は、すでに感受性の植物に耐性を付与することに又は存在する耐性を高めるこ とに使用し得るばかりではなく、除草剤であってそれに対して植物が耐性である 除草剤の範囲を拡大するのにも使用し得る。従って、トランスジェニック植物内 で種々のＧＳＴイソ型を発現させることによって多数の耐性を導入することがで きることは、農業用途には好都合である。特定の除草剤に対して特異的な耐性は 、この除草剤に対して最も効果的な特異的ＧＳＴイソ型（又は複数のイソ型の組 合わせ）を組み込むことによって達成し得る。特に、植物中にＧＳＴ−ｎ活性が 存在すると、ＧＳＴ−Ｉ酵素又はＧＳＴ−Ｉｎ酵素では解毒できないある種の除 草剤に対する耐性が付与され得る。従って、ＧＳＴ−ｎ活性によって（ＧＳＴ− ＩＦ　−２７配列を用いて形質転換することによって）除草剤耐性が付与される 植物を作成することができることは、好都合であろう。

ＧＳＴサブユニットをコード化する配列を含んだ組立て体を用いて種々の公知の 方法〔アグロバクテリウムＴｉプラスミド法、電気穿孔法、微量注入法、ミクロ プロジェクタイルガン（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｇｕｎ）法など〕に従 って、植物を形質転換し得る。次いで、適当な場合には、新規な核材料がゲノム 中に安定的に組み込まれている植物全体中に、形質転換細胞を再生させ得る。形 質転換された単子葉植物及び双子葉植物は両方共にこのようにして得られるが、 通常的には形質転換された双子葉植物の方がより再生し易い。作成し得る遺伝子 修飾（ｇｅｔｅｔｉｃａｌｌｙ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ）植物の例としては、耕作作 物例えばｃａｎｏｌａ、ヒマワリ、タバコ、サトウダイコン、ワタ、及び穀物例 えば小麦、大麦、稲、モロコシ及びトウモロコシが挙げられる。

幾つかの植物種は、除草剤を解毒できるＧＳＴ酵素を生まれつき有していない。

従って、かかる植物種中に、ＧＳＴポリペプチドをコード化するＤＮＡを組み込 むと、ある種の除草剤に対する新規又は追加の耐性が付与されるであろう。ＧＳ Ｔ類は別の植物種特にトウモロコシにおいては生まれつき発現されるが、ＧＳＴ 類を高められた濃度で含有するトランスジェニック植物を作成することにより、 作物の除草剤耐性の水準を増大させ得る。さらにまた、ＧＳＴイソ型の全てはト ウモロコシの系統全てに通常は存在していない。１種又はそれ以上の追加のＧＳ Ｔイソ型を含有するトランスジェニック植物を作成することによって、広範囲の 除草剤に対する耐性が付与されるであろう。別の利点は、ＧＳＴ−ｎ−２７配列 を構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）プロモーターの制御下に置くことに由来 する、従ってこのことはＧＳＴ−Ｉｎ酵素がトランスジェニックトウモロコシ植 物内で構成的に発現されることを意味するであろう。これによりトウモロコシの 種子又は苗に化学的解毒剤を施用する必要性が回避される。通常は、ＧＳＴ−Ｉ Ｆ酵素活性は誘導性である。解毒剤（例えばジクロルアミド）を種子コーティン グ（ｓｅｅｄ　ｃｏａｔｉｎｇ）として施用して出芽植物中でＧＳＴ−ｎ酵素活 性を誘導させ、このようにして除草剤耐性を付与するのが現在のやり方である。

アミノ酸配列決定により、ＧＳＴ−Ｉの２９ｋＤサブユニツトがＧＳＴ−ｎの２ ９ｋＤサブユニツトと同一であることが明らかにされている。従って、ＧＳＴ− ｌ−２９サブユニツトとＧＳＴ−Ｉｆ−２７サブユニツトとの組合わせは活性な ＧＳＴ−ｎ酵素を与えるであろう。ＧＳＴ−ｌ−２９をコード化するｃＤＮＡ　 ＣＷｉｅｇａｎｄらによって単離された、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、 ヱ、　２３５−２４３（１９８６））と、ＧＳＴ−ｌｌ−２７をコード化するｃ ＤＮＡ（第２図に示したもの）とを−緒にトランスジェニック植物内で発現させ ると、ＧＳＴ−ｎ活性を有する植物を与えるであろう。

ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニツト又はＧＳＴ−ＩＩ　２７ｋＤサブユニツトを コード化するＤＮＡは、適当なプロモーター例えば３５Ｓ　ＣａＭＶプロモータ ーの制御下にでベクター中に組み込み得る。植物は、ＧＳＴ−Ｉ　−２９発現カ セット又はＧＳＴ−１−２７発現カセットのいずれかを含有するベクターを用い て形質転換し得る。それぞれのＧＳＴ−ＩＩｎサブユニット２９ｋＤ又は２７ｋ Ｄ）を発現する形質転換体を交雑させて、ＧＳＴ−Ｉ　−２９とＧＳＴ−ｎ　− ２７の両方を発現する後代を産生させ、除草剤耐性の表現型をもたらし得る。こ の方法の変法においては、各植物は、ＧＳＴ−Ｉ　−２９発現カセットを含有す るベクターと、ＧＳＴ−ｆ［−２７発現カセットを含有するベクターとを用いて 一緒に形質転換し得る。別法として、ＧＳＴ−Ｉ　２９　ｋＤサブユニットとＧ ＳＴ−ｎ　２７ｋＤサブユニツトとをコード化するＤＮＡを、単一のプロモータ ーの制御下に単一の植物形質転換ベクター中に含有させ得る。両方のＧＳＴ−ｎ サブユニット（２９ｋＤ及び２７ｋＤ）を発現する形質転換体は、除草剤耐性の 表現型を示すであろう。それぞれのＧＳＴ−ＩＩｎサブユニット２９ｋＤ又は２ ７ｋＤ）の一方のみを発現する形質転換体を交雑させて両方のサブユニット（２ ９ｋＤ及び２７ｋＤ）を発現する後代を産生させ得る。

上記の方法を適合させて、ＧＳＴ−ｎ酵素（ＧＳＴ−ｌ−２９をコード化するＤ ＮＡを用いて形質転換）　、ＧＳＴ−Ｉｎ酵素［ＧＳＴ−ＩＩ［−２６ををコー ド化するＤＮＡを用いて形質転換、Ｍｏｏｒｅらによって単離されたようなもの 、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１８．７２２７−７２３５ （１９８６））又はＧＳＴ−Ｉ　／ＧＳＴ−ＩＦ／ＧＳＴ−ｍ活性の幾つかの選 択を発現する除草剤耐性植物を作成し得る。

前記ＧＳＴサブユニット類をコード化するＤＮＡは、構成性プロモーター（例え ば３５Ｓ　ＣａＭＶプロモーター）の制御下に植物中に導入するのが好ましい。

これにより、ＧＳＴ発現の外部誘導の必要性が回避され、得られる植物は永久的 に除草剤耐性である。また、前記ＧＳＴサブユニット類をコード化するＤＮＡを 誘導性プロモーターの制御下に植物形質転換ベクター中に含有させて、トランス ジェニック植物中に誘導性の除草剤耐性を付与し得る。かかるプロモーターは、 第８図に示した化学誘導性のＧＳＴ−ｌｌ−２７プロモーターを含有する。耐性 は適当な誘導物質（例えば化学的解毒剤）を適用することによってスイッチしく ５ｗ１ｔｃｈ）得る。ある環境のもとでは、必要とする場合にのみ除草剤耐性を 発現させるか又は増大させることができることが好都合であり得る。例えば、作 物の輪作中に、第１の作物種の個体を、第２の作物種を用いて耕作すべき田畑で 翌年、栽培し得る。除草剤を使用してこれらの未誘導性で且つ未だ感受性の“自 生”植物を撲滅し得る。除草剤耐性を必要とする場合（すなわち、除草剤を施用 する直前）にのみＧＳＴの発現を誘導させることもまた、植物がＧ３７表現型を 必要とする場合にのみＧＳＴポリペプチドを産生じつつあるという理由から、あ る場合には代謝的により効果であり得る。

例として本発明を下記の記載により説明する。下記の記載は、ＧＳＴ−ｌｌ−２ ７の単離、発現調査及び配列決定、誘導性発現カセットの組立て並びにトランス ジェニック植物中でのその機能化の例証、並びに除草剤耐性植物の作成を詳細に 示すものである。

本出願に添付の図面は下記の通りのものである。

第１図は誘導（ｉｎｄｕｃｅｄ）　トウモロコシ又は未誘導トウモロコシの根の 組織中のＧＳＴ活性を表わす時間経過グラフである。

第２図はＧＳＴ−ｌｌ−２７をコード化するｃＤＮＡのヌクレオチド配列を示す ものである。

第３図は誘導（ｉｎｄｕｃｅｄ）ＲＮＡ試料又は未誘導（ｕｎｉｎｄｕｃｅｄ） ＲＮＡ試料のノーザン分析結果を示すものである。

第４図はＧＳＴ−ｌ−２９及びＧＳＴ−ＩＩＩ−２６のアミノ酸配列と比較した ＧＳＴ−Ｉ［−２７のアミノ酸配列を示すものである。

第５図はゲノムクローンのプライマーエクステンション・マツピングを示すもの である。

第６図はＧＳＴ−ＩＩ−２７遺伝子の５゛末端を示すものである。

第７図は５．４ｋＤのＧＳＴ−ｌｌ−２７遺伝子とプロモーターとを配列決定す るのに使用した方法を示すものである。

第８図はＧＳＴ−ｌｌ−２７プロモーターのヌクレオチド配列を示すものである 。

第９図はＧＳＴ　ＧＵＳベクター組み立ての概要を示すものである。

第１０図はトウモロコシの過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）形質転換ベクター、ｐ ＰＵＧを示すものである。

第１１図はタバコの安定な形質転換ベクター、ｐＧＳＴＴＡＫを示すものである 。

第１２図はトウモロコシの安定な形質転換ベクター、ｐＺＭ／ＲＭＳ−３を示す ものである。

第１３図はプロトプラストの過渡的発現検定の結果を示すものである。

第１４図はタバコの安定な形質転換実験の結果を示すものである。

第１５図はトウモロコシの安定な形質転換実験の結果を示すものである。

第１６図は未処理トウモロコシ及び解毒剤処理トウモロコシ中のＧＳＴ−１２７ ｋＤサブユニツトの組織分布を示すものである。

第１７図は圃場試験におけるトウモロコシの解毒剤処理後のＧＳＴ−ｎ濃度を示 すものである。

第１８図は誘導組織と比較した種々の大きさの未誘導トウモロコシの房の中のＧ ＳＴ−ｎ濃度を示すものである。

第１９図はＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＳＴ−ｌ−２９カセツト又はＣａＭＶ３５Ｓ−Ｇ ＳＴ−ｌｌ−２７カセツトを含有するベクターの調製を説明するものである。

トウモロコシ組織の解毒剤処理 若いトウモロコシ苗の処理については、種子を湿った濾紙上で発芽させた。発芽 させ、生育させた（１週間まで）後に、解毒剤Ｎ、Ｎ−ジアリルー２，２−ジク ロロアセトアミド（以下、Ｒ−２５７８８という）を濾紙中の水に加え、トウモ ロコシ苗をさらに一定の期間生育させた後に組織を採取した。

酵素検定 １−クロロ−２，４−ジニトロベンゼン（ＣＤＮＢ）を基質として使用して３４ ０Ｍｍで分光光度分析することにより酵素活性を測定した。反応緩衝液は０．　 ＬＭ　ＥＤＴＡと０．　ＯＯＩＭ　ＣＤＮＢと０．００２５Ｍグルタチオンとを 含有するも組織を、乳棒と乳鉢でもって０．０５Ｍ　トリスＨＣＩ　（ｐＨ７， ８）、Ｏ，ＯＯＩＭＥＤＴＡ、　Ｏ，ＯＯＩＭ　ＤＴＴ及び７．５％ポリビニル ピロリドンの中で４℃で均質化し、３０．０００　ｇで遠心分離して粗抽出物を 得た。

得られた粗抽出物からのＧＳＴイソ型の分離は、下記のようにして行った。粗抽 出物をＤＥＡＥセファロースカラムにかけ、０．０１ＭトリスＥ［Ｃ１（ｐｆ１ ７．８）、０．　ＯＯＩＭ　ＥＤＴＡ及び０．００１Ｍ　ＤＴＴで洗浄した。結 合したＧＳＴを０．３Ｍ塩化カリウムで溶出させた。ＧＳＴ活性を含有する画分 を一緒にし、ＰＤ　１０ゲル濾過カラムを使用して脱塩した。ＧＳＴ−ｎイソ型 とＧＳＴ−ｎイソ型との分離は、ＦＰＬＣによりｍｏｎｏ−Ｑカラム上で塩化カ リウム濃度勾配Ｏ〜０．４Ｍで行った。

ＦＰＬＣから得られたＧＳＴ−ＩとＧＳＴ−ＩＩの脱塩画分を、ｐＨ１７，３の ０．０５Ｍ燐酸緩衝液で平衡化したグルタチオン−８−セファロース・アフィニ ティーカラムにかけることによって、ＧＳＴ−ＩとＧＳＴ−ｎの純粋な試料を得 た。緩衝液で洗浄した後に、結合ＧＳＴを０．００５１［グルタチオンで溶出さ せた。

ＧＳＴ−Ｉ又はＧＳＴ−ＩＩの５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（１７，５％、アクリルアミ ド：ビスアクリルアミド＝３０　：　０．１７４）は、Ａｍ１ｃｏｎ　Ｃｅｎｔ ｒｉｃｏｎ　１０　Ｍｉｃｒｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ（登録商標）を使 用して純ＧＳＴ試料を濃縮し、Ｌａｅｒｎｍｌｉ緩衝液を含有するメルカプトエ タノール中で試料を変性し、次いで得られたゲルをクーマシー染色することによ り行った。

ＧＳＴの誘導発現 経時（ｔｉｍｅ　ｃｏｕｒｓｅ）実験を行って解毒剤処理後のＧＳＴ類の発現を 調べた。Ｒ−２５７８８の３０ｐｐｍ溶液を３日齢の苗の根に施用し、解毒剤処 理後の種々の時間間隔で組織を採取した。試料を、前記の酵素検定法を使用して ＧＳＴ活性について試験した。この実験の結果を第１図にグラフで示した。第１ 図は、４８時間インキュベーション後に全ＧＳＴ活性において約２．５倍の増加 があったことを示している。

ｃＤＮＡライブラリーの作成 前記の経時実験により、解毒剤処理後４８時間でＧＳＴ発現のピークが示された 。従って、解毒剤処理後２４時間及び４８時間で根組織から抽出した全ＲＮＡか ら２種類のｃＤＮＡライブラリーを作成した。

誘導操作が首尾よくいっていることを確認するために、２４時間誘導した組織の 試料１ｇを採取し、ＧＳＴ−ｎについて分析した。この実験により、ｃＤＮＡラ イブラリーを作成するのに使用した組織は、全ＧＳＴ活性の約２５％を占めるＧ ＳＴ−ＩＩとして実に首尾よく誘導されていることが示された。

一本鎖ｃＤＮＡを前もって精製することなく、第二の鎖の合成にＲＮアＨｏｆｆ ｍａｎ、　１９８３年）により、オリゴｄＴ−セルロース精製ＲＮＡから二本鎖 ｃＤＮＡを調製した。λＺＡＰ　ＩＩをクローニングベクターとして選択した。

ＧＳＴ−ｎ−２７酵素に対する抗体の産生多数の別々の実験から前記のようにし て単離した酵素サブユニットを溜めることによって、ヒツジの免疫化を可能にす るのに十分なタンパク質を得た。次いで、得られた２７　ｋＤ　ＧＳＴ−ｎポリ ペプチドを、ポリアクリルアミドゲル切片から電気溶出することによって精製し て明確な均質性にした。抗血清を上記２７ｋＤポリペプチド対して調製した。ヒ ツジの免疫化は、本質的にはＳｔｅｗａｒｔとＲｏｖｅの方法（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　８−、３７−４５（１９７５ ））に従って行った。

ウェスタンブロッティング実験により、抗血清を使用して上記ＧＳＴ−ＩＩ　２ ７ｋＤサブユニツトの特異認識が得られたことが明らかにされた。また、ＧＳＴ −ｎ　２９ｋＤサブユニツトとの交差反応性は得られなかった。１次抗血清の親 和性と特異性を、免疫ドツトブロッティングとウェスタンブロッティングとによ り試験し、粗抽出物中の他のポリペプチドとの交差反応性がないことが示された 。

種々の対照実験を行って、１次及び２次抗体濃度を最適化し、種々の酵素基質を 試験し、融合タンパク質誘導条件を確認にした（ｖａｌｉｄａｔｅ）。バックグ ランドノイズに対する信号の比を最大にする条件を確立し、ＧＳＴ−ｎ　２７　 ｋＤサブユニットｌｏｇの検出を可能にした。

ｃＤＮＡライブラリーの免疫スクリーニングトウモロコシのＧＳＴ−Ｉｆ−２７ をコード化するｃＤＮＡクローンを同定するために、ｃＤＮ＾ライブラリーから バタテリオファージを選別した。

１２５Ｉタンパク質Ｇ検出装置を使用する免疫スクリーニングは、変性させたＧ ＳＴ−ｎ−２７ｉｎｇの検出を可能にした。

解毒剤で誘導した苗のライブラリーから組換え体ｌＸ１０６個を高い平板密度（ 平板当たり３Ｘ１０’個）で選別した。３０個の陽性プラークを検出し、選び取 り、ＩＰＴＧを浸した濾紙を用いて１夜インキユベーシヨンすることにより再選 別した。プラーク精製３回後に、６個の強い陽性の候補が残った。

さらなるプラーク精製 免疫スクリーニング法とＤＮＡハイブリダイゼーション法とを使用して（３回目 の選別からＰＣＨによって単離したｃＤＮＡプローブを用いて）第４回目のプラ ーク精製を行った。両方の検定法を用いてプラーク精製することにより６個のク ローンを得た。また、上記ＤＮＡプローブは６個の陽性クローン全てと同じ強さ で交差ハイブリダイズし、恐らくはそれら全てが同じ配列を表わすであろうとい うことを示した。

プラスミドＤＮＡ０単離 生体内（ｉｎ　ｖｉｖｏ）切除方法（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を実施して、ブル ースクリプト−７フージミド（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ｐｈａｇｅｍｉｄｓ）を 遊離させた。４種類の溶菌液から調製したプラスミドＤＮＡをそれぞれ、ｐＨ１ ３、ｐＨ１５，１）０１７及びｐＨ２１と命名した。プラスミドｐＵ２１はアバ ディーン所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・ア ンド・マリン・バクテリア（ＮＣＩＭＢ）に寄託番号ＮＣＩＭＢ　４０４１３と して寄託しである。

ライブラリー陽性クローンの特定 ＥｃｏＲＩで消化すると、全てのクローンは９００〜９５０塩基対の間の単一の 挿入断片を遊離した。該挿入断片は２７ｋＤタンパク質をコード化すると予測さ れた挿入断片寸法である。得られたゲルをプロットし、ｐＨ１７とハイブリダイ ズさせると、全ての挿入断片が同じ強さでハイブリダイズした。

前記クローンの中の１つから得た９５０塩基対の挿入断片を、ＧＳＴ−Ｉ−２９ 及びＧＳＴ−ＩＩＩ−２６のＰＣＲ生成物のサザンプロットにハイブリダイズさ せた。この実験により、ＧＳＴ−Ｉ［［−２６にはハイブリダイズせず、ＧＳＴ −ｌ−２９には極めて弱くハイブリダイズすることが明らかにされた（標的ＤＮ Ａ　１μｇを１夜暴ａ＞。サザンプロットを取り出し、ＧＳＴ−■−２９特異的 プローブと再びハイブリダイズさせると、わずか１５分間の暴露を必要としただ けであった。

また、上記の９５０塩基対の挿入断片（推定上のＧＳＴ−ＩＩ−２７ＰＣＲ生成 物）とＧＳＴ−ｌ−２９特異的オリゴとを使用して組変え体１×１０６個のライ ブラリーフィルターを探査した。それぞれのプローブについて種々のハイブリダ イゼーションパターンが得られた。

これらの調査により、上記ライブラリから得られた陽性クローンは、ＧＳＴ−ｌ −２９でもなく、ＧＳＴ−ｍ−２６でもないが、ＧＳＴ−Ｉ　−２９とのある弱 い相同性を共有していることが示される。

ｃＤＮＡの配列分析 各クローンの３゛末端と５′末端の２００−３００塩基の間を、ＳＫプライマー とＫＳプライマーを使用して配列決定した。これらのデータから、４種のクロー ン（ｐＩＪ１３、ｐＨ１５、ｐＨ１７及びｐｌＪ２１）はポリＡ尾部の位置以外 は同じであることが明らかにされた。ＧＳＴ−Ｉ　−２９については、３か所の 可能なポリＡ付加部位が確認された。

最も長いクローンｐＩＪ１７Ｋｓを完全に配列決定した。得られたｃＤＮＡ配列 （９５４塩基対）を第２図に示す。Ｉ）ＩＪ１７ＫＳの配列は、中心部領域にお いてトウモロコシのＧＳＴ−Ｉ　−２９及びＧＳＴ−１［ｌ−２６と相同性を示 し、このクローンがトウモロコシＧＳＴに相当するという強い確信を与えた。

しかしながら、５′末端におけるＧＳＴ−Ｉ　−２９とＧＳＴ−ｍ−２６との間 で高い相同性をもつ領域は、ｐＩＪ１７Ｋｓの５°領域と類似しておらず、後者 が異なるタンパク質をコード化することを示す。

ＧＳＴ−ｎ−２７の解読領域の分析により、それがＧ−Ｃ領域であること及び５ ゛領域に幾つかの反復を含むことが示される。

ｐＩＪ１７Ｋｓが誘導性ＧＳＴをコード化することの証明ノーザン分析によって 行った発現調査により、ｐＩＪ１７ＫＳがＧＳＴ−ＩＩ　−２７配列に相当する ことが強く示唆された。ｐＩＪ１７ＫＳは一連の処理組織例えば根（Ｒ）、房（ Ｔ）、毛（Ｓ）及び葉（Ｌ）から単離された誘導ＲＮＡ（Ｉ）中の０．９５ｋＢ の転写物に強くハイブリダイズした。未誘導ＲＮＡ（Ｕ）については、第３図に 示すように貧弱なハイブリダイゼーション信号であり、ある場合には信号を示さ なかった。構成性プローブとの対照ハイブリダイゼーションは、誘導試料及び未 誘導試料についてＲＮＡの等しいローディング（ｌｏａｄｉｎｇｓ）が示された 。このことにより、１）ＩＪ１７ＫＳが実際に解毒剤誘導性クローンに相当する ことが示される。

光学密度分析により、解毒剤処理後のある組織例えば葉の中の０．９５ｋＢの転 写物中において１００倍の誘導が示される。

未誘導ＲＮＡ中の信号の存在は、解毒剤処理がない中でＧＳＴ−ｎ　２７ｋＤの 低い基礎発現（ｂａｓａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が検出された先のウェスタ ンデータを支持する。

ＧＳＴ−ｌｌ−２７のアミノ酸配列 スルホブロモフタレン・グルタチオン−８−アガロース・アフィニティークロマ トグラフィーによりＧＳＴ−ＩＩの純粋な試料を得た。２７ｋＤサブユニツトと ２９ｋＤサブユニツトとを分離するために、上記ＧＳＴ−ＩＩをＣ８逆相［ＩＰ ＬＣカラム（ＳＥＧ　１００ｍＭ　Ｘ　２．１ｍＭ、細孔３００＾）に注入した 。

上記の２つのサブユニットを０．１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃度 勾配を用いて溶出した。ＳＤＳ　ＰＡＧＥ（１７，５％Ｔ、０．６％Ｃ）は、上 記２７ｋＤサブユニツトと２９ｋＤサブユニツトとに対応したＵＶ吸収ピークを 示した。

各サブユニットの全アミノ酸組成を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　 ４２０ＡＨＤｅｒｉｖａｔｉｚｅｒ自動アミノ酸分析計を使用して調べた。これ により、測定した組成と、上記２９ｋＤサブユニツトと２７ｋＤサブユニツトの 両方の核酸配列から予測される組成との間に密接な一致があることが明らかにさ れた。

Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　４７７パルス液相自動アミノ酸配列分 析計を使用してエドマン分解法により、各サブユニットについてＮ−末端配列分 析を行った。これにより、２９ｋＤサブユニツトのＮ−末端配列がＧＳＴ−■の ２９ｋＤサブユニツトと同じであることが明らかにされた。ＧＳＴ−ｎ２７ｋＤ サブユニツトのＮ−末端はエドマン分解に対してブロックされていた（ｂｌｏｃ ｋｅｄ）。

逆相ＨＰＬＣにより分離したＧＳＴ−ＩＦ−２７をＵｎｉｖａｐ凍結濃縮装置（ ｆｒｅｅｚｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）中で凍結乾燥した。各サブユニットを ６Ｍグアニジン−ＨＣｌと４５ｍＭジチオトレイトールとを使用して５０℃で１ ５分分間光し、次いで８ｍＭヨードアセトアミドで２０℃で１５分間アルキル化 した。

得られたタンパク質を希釈して２Ｍグアニジン−ＨＣｌ溶液を作成し、エンドプ ロティナーゼ・リシンＣを加えた（プロテアーゼ：　ＧＳＴ＝１　：２０）。プ ロテアーゼ消化を３７℃で１夜行った（Ｓｔｏｎｅらの著作；“Ａ　Ｐｒａｃｔ ｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｕ ｒｉｆｉｃａｔｆｏｎ　ｆｏｒＭｉｃｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ミクロ配列決 定のためのタンパク質及びペプチド精製の実際的指針）″第２章、ｌｌａｔｓｕ ｄａｉｒａ編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ発行〕。得られた消化物をＣ８ 逆相ＨＰＬＣ力５　ム（ＳＥＧ　２．１★１００ｍ１ｌ）　ニ注入し、０．１％ トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル濃度勾配を使用してペプチド断片を溶出し た。１個の断片のアミノ酸配列分析により、核酸配列から予測されるようなＧＳ Ｔ−ｎ−２７のアミノ酸２０８−２２２に対応する配列が得られた。この配列は 、ＧＳＴ−Ｉ　−２９又はＧＳＴ−ｍ−２６について公表されている配列との相 同性を有していなかった。

上記の還元し、アルキル化したＧＳＴ−ｎ−２７を、トリプシンで２０℃で２． ５時間消化することにより別のアミノ酸配列を得た。ペプチド類を逆相ＨＰＬＣ （Ｖｙｄａｃ　Ｃ８４，６★１５０ｍＭ、細孔３００λのカラムを使用して）と アセトニトリル濃度勾配により分離した。３種類のペプチドを配列決定した。こ れらの配列は、核酸配列から予測されるようなＧＳＴ−ｎ−２７のアミノ酸８− １９．２０−３８及び５２−７１に対応した。このことにより、単離されたｃＤ ＮＡクローンがＧＳＴ−ｌｌ−２７サブユニツトに相当対応することが示される 。

第４図は、ＧＳＴ−ｎ−２７、ＧＳＴ−ｌ−２９及びＧＳＴ−ｍ−２６のアミノ 酸配列を比べたものである。星印（★）は−列上にある位置が完全に保存されて いることを示し；点（・）は位置がよく保存されていることを示し；合い印（Ｊ ）はラットＧＳＴ類について保存される位置を示す。

ＧＳＴ−ｌｌ−２７は２つの公知のイソ型すなわちＧＳＴ−Ｉ　−２９とＧＳＴ −Ｉ［［−２６に対する相同性を示す。ＧＳＴ−ＩＩ　−２７はＧＳＴ−１−２ ９と５７％一致しており、ＧＳＴ−ＩＩＩ−２６と４１％一致している。さらに また、幾つかの残部はラツ）　ＧＳＴ類について保存される。

ゲノムクローンの単離 ＧＳＴ−ｎ−２７用ｃＤＮＡを利用して、プロモーター領域を含んでいる対応ゲ ノム配列を単離するための遺伝子プローブを設計した。

ＧＳＴ−Ｕ−２７ｃＤＮＡ配列を調べて、別のトウモロコシＧＳＴ類又は他の植 物／動物／ウィルス／ベクター配列中に存在しておらず、それ故に特異的遺伝子 プローブとして適当である特異領域を同定した。プラスミドｐＵ２１の３°末端 からＰＣＲによって２０８　ｂｐ配列を単離し、アクリルアミドゲル電気泳動に より精製した。このＰＣＲプローブを無作為プライム（ｐｒｉｍｅ）標識し、こ れを使用してトウモロコシゲノムライブラＵ　−（１５ｋＢの平均挿入断片サイ ズを有する、部分ＭｂｏＩ消化ＤＮＡ）から５Ｘ１０６個の組換え体を選別した 。

得られた陽性クローンを、３°ＰＣＲプローブと５°オリゴ（ｃＤＮＡの５′末 端由来の１３０ｂｐ）とを用いてプラーク精製した。次いで、これらのゲノムク ローンを地図化してｃＤＮＡの５゛末端からプロモーター領域の中に延びている （ｒｕｎｎｉｎｇ）断片を同定した。約４ｋＢのプロモーター領域を含んでいる ＥｃｏＲＩ断片を単離した。この断片をプラスミドｐＧＩＥ７と命名されたｐＢ Ｓベクター中にサブクローン化した。このプラスミドｐＧＩＥ７はアバディーン 所在のザ・ナショナル・コレクションズ°オブ・インダストリアル・アンド・マ リン・ノくクチリア（ＮＣＩＭＢ）に寄託番号ＮＣＩＭＢ　４０４２６として寄 託しである。

プライマー・エクステンション分析法（ＡｕｓｕｂｅｌらにょるＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、　１９８７ 年に記載の方法）を使用して第５図に示すようにｃＤＮＡの末端からｘａｂｐま で転写開始点（ＴＳＰ）を地図化した。前記プロモーターサブクローンｐＧＩＥ ７の配列分析にょＩ　リ、予測されたＴＳＰから一２９ｂｐ及び−１１０ｂｐに それぞれ推定上のＴＡＴＡボックス及びＣＡＡＴボックスが明らかにされた。こ のＴＳＰ部位、ＴＡＴＡボックス及びイントロン／エキラン境界領域は植物共通 塩基配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に適合しくｆｉｔ）、単離 された配列は実際にプロモーター領域であることが確認される。

ＧＳＴ−ＩＩ−２７プロモ一ター断片の配列決定第６図はＧＳＴ−ｎ−２７遺伝 子の５°末端を表わすものであり、制限部位の相対位置及び上記の単離されたＥ ｃｏＲＩ断片を示す。ゲノムクローンのＰＣＲ及び制限分析により、３ｏｏｂｐ に及ぶ上記２つのイントロンがｃＤＮＡの５゛末端に対応する領域に存在するこ と及び上記２つのイントロンのうちの１つはＥｃｏＲＩ切断部位を含むことが示 された。プラスミドｐＧＩＥ７は、ＧＳＴ−ｌｌ−２７プロモーター領域と幾つ かの解読配列に及ぶＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ断片を含む。エキソン１（下線） の配列はｃＤＮＡの５゛末端の配列に匹敵する。

ゲノムサブクｏ　−：／Ｉ）ＧＩＥ７とｐＧＩｓ１５とを使用して、５．４ｋｂ （７）ＧＳＴ−■−２７遺伝子とプロモーターを配列決定した。両方の鎖につい て、第７図に示した方法に従って大部分を配列決定した。第８図に、５゛Ｅｃｏ ＲＩ制限部位から予測された転写開始点までのプロモーター配列の３．８ｋＢの ヌクレオチド配列を示す。

ＧＳＴ−ｎ−２７プロモ一ター組立て体プロモーターサブクローンの詳細なマツ ピングと配列データとの組み合わせを使用して、プロモーター組立て体用に適当 な制限部位を選択した。プロトプラスト系用の種々の過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎ ｔ）検定ベクター（ｐＰＵＧ）並びにタバコ用の形質転換ベクター（ｐＧＳＴＴ ＡＫ）及びトウモロコシ（Ｚｅａ　ｍａｙｓ）用の形質転換ベクター（ｐＺＭ／ ＲＭＳ−３）を組み立てた。組換えプラスミド全てをハイブリダイゼーションプ ローブにより同定し、それらの全体性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）と配向とを制限酵 素地図作成によって調べ、そして完成したベクターの境界を配列決定によって分 析した。

種々の過渡的且つ安定な形質転換ＧＵＳベクターを約３．８ｋｂのＧＳＴ−ｌｌ −２７プロモーターを使用して組み立てた。Ｎｄｅ　Ｉを使用してＧＳＴ−ｎ　 −２７プロモーターをＡＴＧ及び４ｋｂ上流で切断した。この断片をＥｃｏＲＩ で切断し、平滑末端化し、ｐＴＡＫ　（Ｂｉｎ１９に基づいたプロモーターのな いＧＵＳ組立て体）のＳｍａ　Ｉ制限部位の中にクローン化した。次いで、ｐＧ ｓＴＴＡｉ［から得られたＧＳＴ　ＧＵＳカセットを過渡的検定ベクターｐＰＵ Ｇ（３，８ＧＳＴプロモーター及びＧＵＳ）中にクローン化した。また、同じＧ ＳＴ　ＧＵＳカセットを、Ｂａｒ選択し得るカセットを含んだｐＵＣ由来のベク ター中にクローン化しｐＺＭ／ＲＭＳ−３を得た。

第９図に上記のベクター組み立て方法の概要を示す。第１０図にトウモロコシの 過渡的形質転換ベクターｐＰＵＧの最終的構造を示し；第１１図にタバコの安定 な形質転換ベクター、ｐＧｓＴＴＡＫを示し；東１２図にトウモロコシの安定な 形質転換ベクターｐＺＭ／ＲＭＳ−３を示す。

プロトプラスト過渡的発現評価系 ｐＰＵＧを使用して一連のプロトプラスト過渡的評価（ａｓｓａｙ）実験を行っ て、３．８ｋＢ　ＧＳＴ〜■−２７プロモーター領域が転写的に活性であること 及びこのプロモーターからの発現が除草剤解毒剤によって誘導し得ることを例証 した。

トウモロコシの細胞の懸濁液系（ｌｉｎｅｓ）又は試験管内（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ ）で生育させたトウモロコシの葉から、標準的酵素消化操作、篩操作及び洗浄操 作によって、プロトプラストを単離した。プロトプラスト０．４　Ｘ　１０５個 当りにつきＤＮＡ　２５μｇを使用して、部分改変したＰＥＧ−媒介取込み法（ Ｎｅｇｒｕｔｉｕらの論文、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、４，３６３−３ ７３（１９８７）に基づいた方法〕によって形質転換を行った。ＧＳＴ誘導のた めにプロトプラスト培養液に化学薬剤を３〜３００　ｐｐｍ添加し、次いで暗所 で２５℃でインキュベーションした。２４時間後に処理したプロトプラストの生 存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を評価し、その後に抽出物を調製した。ＧＵＳ発現 を蛍光定量ＧＵＳ検定法ＣＪｅｆｆｅｒｓｏｎの論文、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、４，３８７−４０５（１９８７））により測定した。

結果の概略を第１３図に示す。第１３図は、解毒剤を用いて又は用いずに１９時 間インキュベーションした後のプロトプラスト中のｐＰＵＧ発現のレベル（ｌｅ ｖｅｌ）を示すものである。結果は、ＧＳＴ−ｎ　−２７の３．８ｋＢプロモー ターが多数のプロトプラスト系において誘導可能な方法でＧＵＳ濃度（ｌｅｖｅ ｌ）を制御できることを例証している。

タバコにおける安定な形質転換実験 ＧＵＳレポーター（ｒｅｐｏｒｔｅｒ）遺伝子に対して５°方向の３．８ｋＢの ＧＳＴ−ｌｌ−２７プロモーターと、　ｎｏｓターミネータ−とを含有するＢ１ ｎ１９ベクターｐＧＳＴＴＡＫを使用して、Ｂｅｖａｎによって報告されたアグ ロバクテリウムＴｉプラスミド法［：Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、　１２．８７１１−８７２１（１９８４））を使用してトランスジェニ ックタバコを作成した。コノ方法ニよって作成した形質転換体を葉への塗布実験 において使用した。この実験においては、製剤化した解毒剤１０ｍｇを葉の１０ ｃｍ’の領域に施用した。第２の施用を４８時間後に同じ領域に対して行い、さ らにその２４時間後に組織を採集した。解毒剤処理及び未処理の葉の組織を、Ｊ ｅｆｆｅｒｓｏｎの方法［Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｒｅｐ、４．３ ８７−４０５（１９８７））を使用してＧＵＳ活性を検定した。

この方法を使用して一連の形質転換体を調べた。第１４図に示すように、解毒剤 施用により幾つかの場合においてＧＵｓ発現が１００倍まで高められた。このこ とにより、単子葉植物のＧＳＴ−Ｉｔ−２７プロモーターが、双子葉植物種にお いて誘導可能な方法で遺伝子発現を調節できることが明らかに例証される。

トウモロコシにおける安定な形質転換実験ＧＳＴ　ＧＵＳベクターＲＭＳ　３を 使用して、パーチクル・ガン（ｐａｒｔｉｃｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）法Ｃ Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍらの論文、Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１１．２．６０３−６１８ （１９９０））を使用してトランスジェニックトウモロコシ植物を作成した。葉 の組織を前記のようにして除草剤解毒剤で塗布した場合に、誘導性ＧＵＳ活性が （第１５図に示すように）認められた。

種々の組織におけるＧＳＴ−ｎ　−２７誘導発育中のトウモロコシの幾つかの組 織におけるＧＳＴ−ｎ　−２７誘導を調査して、プロモーターがその自然環境に おいてどの様に働Ｘかを調べた。

製剤化したＲ〜２９１４８　Ｃ２，２，５−トリメチル−３−（ジクロロアセチ ル）−１，３−オキサゾリジン〕又は製剤のみを、トウモロコシ植物に根の浸液 として施用しくＲ−２９１４８４００ｍｇ／植物）、一定時間後に成熟及び未成 熟の葉、根、茎及び房の試料から粗タンパク質抽出液を調製した。

これらの抽出液と抗ＧＳＴ−ｌｌ−２７血清又は抗ＧＳＴ−ｌ−２９血清を使用 してウェスタンプロット分析を行った。得られた結果により、２９ｋＤサブユニ ツト（ＧＳＴ−ｌ−２９）が供試組織全てにおいて構成的に発現しており、しか も解毒剤施用するによって全ての組織中で誘導可能であったことが示される。Ｇ ＳＴ−ｎに特異的な２７ｋＤサブユニツトは、根組織において唯一構成的に発現 しただけであった。Ｒ−２９１４８の根浸液を施用した後に、供試試料全部にお いてＧＳＴ−ＩＩの発現を検出した。この誘導は、Ｒ−２９１４８を含まない製 剤で処理した植物においては検出されなかった。第１６図は、解毒剤未処理（対 照）及び解毒剤処理のトウモロコシの成熟葉（２）、未成熟葉（３）、茎（４） 、根（５）及び房（６）においてＧＳＴ−ｎ　２７ｋＤサブユニツトの組織局在 を可能にするウェスタンプロットを示すものである。また、このプロットは標識 （レーン１）及び純粋なＧＳＴ−Ｕ　（レーン７）も含む。

これらの実験の結果により、本発明のプロモーターを使用して種々のトランスジ ェニック組織中で遺伝子の発現を制御し得ることが示唆される。

解毒剤施用による房組織中のＧＳＴ−ＩＩ　−２７誘導を示す圃場試験圃場試験 （ｆｉｅｌｄ　ｔｒｉａｌ）を行って、化学的解毒剤の外部施用後の発育中のト ウモロコシ組織におけＧＳＴイソ型の発現を調べた。この圃場試験は野外条件下 で統計的に顕著なＧＳＴ−ＩＩの誘導を例証した。

２種の解毒剤、Ｒ−２５７８８（Ｎ、　Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセト アミド）及びＩ？−２９１４８Ｃ２，２，５−トリメチル−３−（ジクロロアセ チル）−１，３−オキサゾリジン〕を圃場試験において使用した。これらをシク ロヘキサノン、５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　ＮＰＥ１８００及びＴｖｅｅｎ　８５か らなる製剤又は５ｏｌｖｅｓｓｏ　１００．５ｙｎｐｅｒｏｎｉｃ　ＮＢ１３及 びフェールスルホネートからなる製剤で施用した。

解毒剤を、下記の４段階の施用量（施用量当たり３回反復）：Ｘ　２．５８　Ｋ ｇ／Ｈａ ２Ｘ　５．１６　Ｋｇ／Ｈａ ４Ｘ　１０．３２　Ｋｇ／Ｈａ ８Ｘ　２０．６４　Ｋｇ／Ｈａ で頭上噴霧法（植物の上３０ｃｍ）を使用して噴霧施用により施用した。

対照処理は、製剤ブランク２Ｆ（解毒剤なしの処理２Ｘ）及び８Ｆ（解毒剤なし の処理８Ｘ）の噴霧を伴うものである。

一定の期間後に、房を採取し、３種類の大きさ二減数分裂前の小筒孔（ｐｒｅ− ｍｅｉｔｏｎｉｃ　ｆｌｏｒｅｔ）組織、減数分裂小筒孔組織及び減数分裂後の （ｐｏｓｔ−ｍｅｉｔｏｎｉｃ）小筒孔組織に分けた。小筒孔組織から粗タンパ ク質抽出物を調製し、−７０℃で保存した。

これらの粗抽出物と、ＧＳＴ−ｌ−２９サブユニツト又はＧＳＴ−ＩＩ−２７サ ブユニツトに対してヒツジで高めた抗血清とを使用してウェスタンプロット分析 を行った。セイヨウワサビペルオキシダーゼに結合した抗ヒツジ血清を２次抗血 清として使用し、増強した化学蛍光（Ｅｎｈａｎｃｅｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｌ ｕｍ１ｎｅｓｃｅｎｃｅ）（＾ｍｅｒｓｈａｍ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　 ＰＬＣ社製）を使用して検出を行った。上記粗抽出物中に存在するＧＳＴ−ＩＩ 　−２７の濃度を、粗抽出物試料に隣り合った５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのレーンに おける精製ＧＳＴ−Ｉ［−２７の標準を操作し、プロット上の光学密度分析を行 うことにより定量した。

また、ＦＰＬＣイオン交換クロマトグラフィーでＧＳＴイソ型を分離し、基質と してＣＤＮＢを使用してＧＳＴの存在を検定することにより、ＧＳＴ−■の誘導 の濃度（ｌｅｖｅｌ）も測定した。

圃場試験の幾つかの結果を第１７図及び第１８図に示す。第１７図は、Ｒ−２５ ７８８及びＲ−２９１４８を用いた処理についての全平均値を示すものである。

誘導性化学薬剤を存在させる（処理１．２ｘ、　４ｘ、　８Ｘ）と、対照植物（ 処理２Ｆ及び８Ｆ）と比較した場合に圃場試験条件下でＧＳＴ−ｎ酵素の量の増 加を生じることが明らかである。第１８図は、ウェスタンプロット分析により評 価した２Ｆ圃場試験の房試料から得られたＧＳＴ−ｎの量を示すものである。２ Ｘ処理試料と比較すると、誘導性化学薬剤を存在させると基礎濃度（ｂａｓａｌ 　１ｅｖｅｌ）にわたってＧＳＴ−ｎの量の増加を生じることが明らかである。

これらの結果により、解毒剤Ｒ−２５７８８及びＲ−２９１４８を使用して圃場 試験条件下でＧＳＴ−ＩＩの発現を誘導できることが示される。ＧＳＴ−Ｉ［− ２７遺伝子プロモーターを含んだトランスジェニック植物を用いた調査から得ら れた結果を用いたこれらのデータにより、前記のプロモーターが圃場試験条件下 にトランスジェニック植物中で遺伝子発現を制御する有効で効果的な機構を提供 するであろうことが示唆される。

ＧＳＴ−Ｉ［酵素を発現する除草剤耐性トランスジェニック植物の作成ＧＳＴ− ｌ−２９をコード化するｃＤＮＡのヌクレオチド配列は、Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、　、　Ｚ、　２３５−２４３にＷｉｅｇａｎｄらによって公表されて いる。この配列を使用して、特異的オリゴヌクレオチドプローブを設計し、それ を使用して解毒剤誘導した苗の根のｃＤＮＡライブラリーから、ＧＳＴ−Ｉ−２ ９をコード化するｃＤＮＡ　（プラスミドｐＵ４）の全長・を単離した。ＧＳＴ −Ｉｔ−２７をコード化するｃＤＮＡ　（第２図に示されるもの）の単離につい ては、既に記載しである。上記のｃＤＮＡ類の全長を３５Ｓ　ＣａＭＶプロモー ターの制御下にＢ１ｎ１９に基づくベクター類の中に組み込み得る。

第１９図にこれらの組立て体をどの様にして調製し得るかを示す。

ＧＳＴ−Ｉ　−２９解読領域の全長とＧＳＴ−ｎ−２７配列の全長とを、それぞ れｐＵ４及びｐＩＪ２１からＥｃｏＲＩで消化することにより単離した。これら の断片をクレノウ／Ｔ４ポリメラーゼを使用して平滑末端化した。

次いで、平滑末端化した断片をＳｍａ　Ｉクローニング部位でｐＪＲＩｉの３５ ３　ＣａＭＶプロモーターに３°連結した。正しい配向のｃＤＮＡ挿入断片を含 有する組換え体を、制限酵素地図化分析を使用して選択する。

タバコ植物を、ＣａＭＶ３５Ｓ−ＧＳＴ−ｌ−２９カセツト又はＣａＭＶ３５Ｓ −ＧＳＴ−ＩＩ　−２７カセツトのいずれかを含有するベクターを用いて、既に 記載しである方法を使用して形質転換し得る。それぞれのＧＳＴ−ｎサブユニッ ト（２９ｋＤ又は２７ｋＤ）を発現する形質転換体は、サブユニット特異的抗血 清（前記のもの）を用いてウェスタンプロット分析により調べた。

かかる形質転換体は交差してＧＳＴ−Ｉ　−２９又はＧＳＴ−Ｉｔ　−２７の両 方を発現する後代を産生じ、除草剤耐性表現型をもたらし得る。

第３図 第５図（１／２１ 第１１図 （ＬＰＪ＠／Ｂ（ＩＩＩ／Ｉ［ｒｕ）　ｎ＄ｎり第１６図 解毒剤処理 薯曹簿摘Ｅ／ｍ認３ｇｎ 国際調査報告 、、、、、、、、ム、、、、、Ｉ−，，，ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１１８７１＋− ア＋１．＋＋ｊ＋　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０１１８７ＰＣＴ／ＧＢ　９２１０１ １８７ フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、Ｃ３，ＦＩ、ＨＵ、ＪＰ。

ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＵＳ （７２）発明者　ブライト、シモン、ウィリアム、ジョナサン イギリス国、パツキンガムシャー・ニスエル７・２エイワイ、マーロー、パウン ド・レーン、２４ （７２）発明者　グリーンランド、アンドリュー、ジェームス イギリス国、バークシャー・ニスエル６・８ニスエツクス、メイデンヘッド、レ イミル・ロード・イースト、ザ・キャビン（番地なし） （７２）発明者　ボルト、デーピッド、チャールスイギリス国、バークシャー・ アールシイ１１・２イーシイ、ウオキシガム、イーストハンプステッド・ロード 、２２ （７２）発明者　ジエプソン、アイアンイギリス国、バークシャー・エスエルト ３キュシイ、スロウ、グレイス・ロード。

（７２）発明者　スコッチ、ウオルフガング、ヴアルター゛　イギリス国、バー クシャー・アールシイ１１・６テイゼツト、クロウトーン、ヘルスレーク・パー ク、グリーンランド・クロス、１４

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、イソ型ＩＩの２７ｋＤサブユニッ ト用の遺伝子プロモーターをコード化するゲノムＤＮＡ配列であって、本明細書 に添付の第８図に示されるヌクレオチド配列を含有するゲノムＤＮＡ配列及びそ の遺伝暗号の縮退によって可能にされる該配列の変型。
2. ２．請求の範囲第１項に記載のゲノムＤＮＡ配列を含有するベクター。
3. ３．化学的にスイッチし得る遺伝子組立て体であって、１個の外来遺伝子又は一 連の外来遺伝子類に操作的に連結された請求の範囲第１項記載のプロモーター配 列を含み、それによって前記１個の外来遺伝子又は前記一連の外来遺伝子類の発 現を有効な外因性誘導物質を施用することによって制御し得るようにされてある 、化学的にスイッチし得る遺伝子組立て体。
4. ４．請求の範囲第３項に記載の遺伝子組立て体を用いて形質転換された植物。
5. ５．単子葉植物である請求の範囲第４項に記載の植物。
6. ６．双子葉植物である請求の範囲第４項に記載の植物。
7. ７．前記外来遺伝子又は前記一連の外来遺伝子類の存在によって雄性不稔に影響 が及ぼされる請求の範囲第４項〜第６項のいずれかに記載の植物。
8. ８．本明細書に添付の第４図に示されるアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配 列を有するグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、イソ型ＩＩ、２７ｋＤサブ ユニット。
9. ９．請求の範囲第８項に記載のサブユニットをコード化するｃＤＮＡ配列であっ て本明細書に添付の第２図に示されるヌクレオチド配列を有するｃＤＮＡ配列及 びその遺伝暗号の縮退によって可能にされる該配列の変型。
10. １０．グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、イソ型ＩＩ、２７ｋＤサブユニ ットをコード化し且つ前記プロモーター領域を含んでいる対応ゲノム配列を単離 するための遺伝子プローブとして請求の範囲第９項に記載の配列を利用する方法 。
11. １１．ＧＳＴポリペプチドの１種又はそれ以上をコード化するＤＮＡを植物中に 、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ酵素が発現されるように組み込むこと からなる、除草剤耐性のトランスジェニック植物の作成方法。
12. １２．ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニットをコード化するＤＮＡを植物中に組み 込む請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．ＧＳＴ−ＩＩ　２７ｋＤサブユニットをコード化するＤＮＡを植物中に組 み込む請求の範囲第１１項に記載の方法。
14. １４．ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニットとＧＳＴ−ＩＩ　２７ｋＤサブユニッ トとをコード化するＤＮＡを植物中に組み込む請求の範囲第１１項に記載の方法 。
15. １５．ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニットをコード化するＤＮＡを第１の植物中 に導入し、ＧＳＴ−ＩＩ　２７ｋＤサブユニットをコード化するＤＮＡを第２の 植物中に導入し、次いで第１の植物と第２の植物とを交雑させて除草剤耐性の後 代を産生させる請求の範囲第１１項に記載の方法。
16. １６．ＧＳＴ−ＩＩＩ　２６ｋＤサブユニットをコード化するＤＮＡを植物中に 組み込む請求の範囲第１１項に記載の方法。
17. １７．ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニットとＧＳＴ−ＩＩＩ　２６ｋＤサブユニ ットとをコード化するＤＮＡを植物中に組み込む請求の範囲第１１項に記載の方 法。
18. １８．ＧＳＴ−Ｉ　２９ｋＤサブユニットと、ＧＳＴ−ＩＩ　２７ｋＤサブユニ ットと、ＧＳＴ−ＩＩＩ　２６ｋＤサブユニットとをコード化するＤＮＡを植物 中に組み込む請求の範囲第１１項に記載の方法。
19. １９．前記ＧＳＴポリペプチドをコード化するＤＮＡが構成性プロモーターの制 御下にある請求の範囲第１１項〜第１８項のいずれかに記載の方法。