JPH06511389A - 動物細胞培養 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （１）該生成物を産生ずる動物細胞を、炭素、窒素、アミノ酸、鉄および他の無 機イオン、微量元素および任意に脂質の同化源並びに成長促進物質または調節物 質を２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロへブタトリエン−１−オンまたはその 誘導体と混合された状態で含む栄養培養培地で培養する工程と。

（２）該生成物が蓄積されるまで該培養を継続する工程と、 （３）該生成物を回収する工程とを含む細胞培養によっ。

て動物細胞生成物を得る方法。

明　細　書 動物細胞培養 見五立此見 本発明は、動物細胞培養における改良、特に動物細胞を増殖させる方法およびそ の栄養培地における改良に関する。

見五例ＬＬ 細胞生成物、例えば免疫グロブリン、ホルモンおよび酵素の大量生産のための動 物細胞培養の使用は、商業的観点からますます重要になってきており、現在、こ れらの物質の大規模生産の最適化をめて細胞培養技術の開発に多大な努力がはら れれている。

培養中の動物細胞は、塩１Ｍ糖、アミノ酸およびビタミンの基礎的栄養混合物を 必要とする６通常この混合物は、生物学的液体または抽出物で補充され、それら の非存在下では殆どの細胞は活力を失い、または増殖することができない。もっ とも普通に用いられる補充物質は血清である。

しかしながら補充物質の使用は、それらの性状が一般的に未確認であるがゆえに 、さらに与えられたタイプのバッチ間に存在する変動ゆえに、培養の成功および 再現性に影響を与える可能性があるため、満足のいくものではない。したがって 、培養細胞の増殖を支援するためにより確定された培地を提供するという観点か ら、血清のような補充物質中の活性因子を同定する多くの試みが為されてきた。

今日まで、この試みは限られた成功しかもたらさなかったが、これは生物学的補 充物質の複雑な性状、およびそれらに含まれる活性因子の量が非常に少ないこと が大きな理由である。

しかし、補充物質を含まない多くの培地も報告され、それらのいくつかは市販さ れている（例えば、ムラカミら、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７９．　１１５８−１１６２（１ ９８２）ＨＤａｒｆｌｅｒら。

Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１３８．２８７−２９５（１９８２）；国際特 許出願公開第ｗ０９０１０３４３０号公報参照）。

補充物質を含まない培地は通常、アミノ酸、塩、ビタミン、微量元素、炭水化物 および他の増殖支援成分（例えばアルブミン、インシュリン、グルタミン、トラ ンスフェリン、フェリチンおよびエタノールアミン）の複雑な混合物を含んでい る（例えば米国特許第４８１６４０１号明細書参照）。そのような培地で培養し たとき、動物細胞は、該培地中の１つまたは２つ以上の必須の栄養物が枯渇する までの限られた期間活力を維持する。そのようなときに、該培地に１つまたは２ つ以上のエネルギー源および１つまたは２つ以上のアミノ酸を含む栄養物を補充 することができる（例えば国際特許出願公開第１１０８７１００１９５号公報参 照）。この方法で、培養を延長させ細胞または細胞生成物の収量を増加させるこ とができる。

金属イオン、特に第一および第二鉄イオンは動物細胞代謝に必須で、未確認補充 物質例えば血清として、または補充物質非含有培地中に含まれる塩および微量元 素の成分として培養液中に存在する。細胞の金属イオン要求は動物細胞培養にお いて、特に細胞密度が高密度になるとき高くなるが、実際、このことは、細胞の 増殖および活力を支援するために金属イオンは培地中で持続的に利用できること が必要であることを意味している。補充物質非含有培地においてこれを達成する ために、該金属の高い単純塩濃度を用いることができるが、しかし、細胞の該金 属数り込みを促進するために、および／または高金属イオン濃度につきものの溶 解性の問題および毒性の問題を避けるために、該金属がキレート型であることが しばしば必要とされる。

補充物質非含有培地で増殖している細胞に十分な鉄を供給するために、単純なま たは複雑な鉄塩、例えば硫酸第一鉄、塩化第二鉄、硝酸第二鉄またはクエン酸第 二鉄アンモニウムが用いられてきたが、必要によりしばしばキレート剤と組み合 わせて用いることもできる。細胞培養で用いられてきた特定の鉄キレート剤は、 天然の蛋白トランスフェリンおよびフェリチン、有機酸（例えばクエン酸、イミ ノジ酢酸およびグルコン酸）、ピリドキサルイソニコチノイルヒドラゾン、並び にオーリントリカルボン酸を含む。

動物細胞培養用の補充物質非含有培地で一般的に使用するための鉄キレート剤を 選択する場合、多くの因子が重要である。したがって、キレート剤は鉄に対して 適切な結合親和性を有し、細胞膜を効率よく通過して鉄を移送することができな ければならない。それはまた安価で容易に手に入り、さらに無毒でなければなら ない。より重要なことには、キレート剤は動物由来でなく合成のものであるべき である。それは。

所望の細胞生成物の望ましくない汚染の可能性を避け、結果として純粋な生成物 の回収コストの増加を避けるためである。

上記のキレート剤のいずれもこれら全ての基準には適合しない。

又ｊ凶日【１ 出願人は、２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘブタトリエンー１−オンがこ れら基準のすべてに適合し、細胞増殖を支援するために動物細胞培養に有利に用 いることができることを見いだした。特に、この物質は、毒性問題を避けるため に低い鉄濃度を用いる必要があり、さらに他の認知されたキレート剤（例えばク エン酸塩およびグルコン酸塩）の使用が失敗に終わった撹拌細胞培養での増殖を 支援するために用いることができることが分かった。出願人はこの発見を用いて 動物細胞増殖のための培地及び方法を開発した。

したがって、本発明の１つの特徴によれば動物細胞培養の栄養培地が提供され、 該培地は、炭素、窒素、アミノ酸、鉄および他の無機イオン、微量元素および任 意に脂質の同化源並びに成長促進物質または調節物質を、２−ヒドロキシ−２゜ ４．６−シクロへブタトリエン−１−オンまたはその誘導体と混合された状態で 含んでいる。

見匪Ｌ１亙星１豆 一般に、この栄養培地は、動物細胞の持続的増殖を支援し、および／または定常 期の間にそれらを維持する、いずれがの既知基本培地またはその応用培地であり 、それに２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロへプタト・リエノー１−オン（以 下では場合によってはトロポロンと呼ぶ）又はその誘導体が添加されている。既 知の基本培地およびその応用培地は、例えばダルベツコ−修正イーグル培地（Ｄ ｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄ ｉｕａ＋［ＤＭＥＭコ）、イスコツ修正ダルベツコー培地（Ｉｓｃｏｖｅ　Ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ　Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）、ハム培地（Ｈａｍ’ｓ Ｍｅｄｉｕｍ）、ロズウェルパークメモリアルインスティテユート培地（Ｒｏｓ ｗｅｌｌ　Ｐａｒｋ　Ｍｅｍｏｒｉａｌ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅＭｅｄｉｕｍ［Ｒ ＰＭＩコ）、フィッシャー培地（Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）またはツ ー（Ｈｕ）らによりＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　ＢｉｏｅｎｇＪ１９８５）、２７ ．　５８５−５９５に記載されたもの、クレスピ及びチリ−（Ｃｒｅｓｐｉ　ａ ｎｄ　Ｔｈ１ｌｌｙ）によってＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　（１ ９８１）、　２３．９８３−９９３）に記載されたものおよびファンベーラエル （Ｖａｎ　Ｗｅｚｅｌ）によりＤｅｖ、　Ｂｉｏｌ。

５ｔａｎｄ、　（１９７７）、　３７．１４３−１４７に記載されたものを含む 。好ましい一つの特徴では該培地は蛋白非含有培地である。

本発明にしたがえば、トロポロンまたはその誘導体は一般に細胞の増殖および活 力を支援するために十分な濃度で培地中に存在する。正確な濃度は使用する細胞 系および存在する他の培地成分によって変動するが、慣用的な方法に従い予備的 な小規模試験を用いて容易に決定することができる。したがって、例えば選択さ れたいずれの培地についても、一連の濃度のトロポロンの存在下で細胞を小規模 で培養し、細胞増殖および活力における種々の濃度の影響を！ｉＲ察することに よって最適濃度を決定することができる。

一般に、トロポロンまたはトロポロン誘導体は培地に存在する鉄に対して過剰モ ル濃度、例えばおよそ５：１からおよそ７０：１、例えばおよそ１ｏ：１がらお よそ７ｏ：１のモル比で存在する。したがって例えば、培地中の鉄濃度がおよそ ０．３μＭの場合、トロポロンまたはその誘導体はおよそ１．５μＭからおよそ ２０μＭ１例えばおよそ３μＭがらおよそ２０μＭの濃度で用いることができる 。鉄は第一または第二鉄イオンとして存在するが、これは例えば培地に単純また は複雑な鉄塩（例えば硫酸第一鉄、塩化第二鉄、硝酸第二鉄または特にクエン酸 第二鉄アンモニウム）を使用することによって生じる。

一般に本発明にしたがって使用するトロポロン誘導体は、第一鉄または第二鉄イ オンをキレートすることができる誘導体である。この誘導体は、トロポロンの１ つまたは２つ以上の環状炭素原子が脂肪族、芳香族または複素芳香族基、例えば アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、アラルケニル、ア ラルキニル、ヘテロアリール、ヘテロアラルキル、ヘテロアラルケニルまたはヘ テロアラルキル基によって置換されたものを含む。トロポロンまたはその誘導体 は市販されている（例えばアルドリッチケミカルカンパニー（Ａｌｄｏｒｉｃｈ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）から）が、または既知の文献記載の方法を用いて 調製できる。

本発明の培地は慣用的な方法を用いて個々の成分の適切な混合によって調製され 、液状形または使用前に適切な緩衝液（例えば重炭酸塩緩衝液）を用いて再構成 する乾燥形のいずれかとして提供できる０本発明の培地を調製する場合、トロボ ロンおよび鉄の濃縮液体混合物を使用することは避けるへきである。

本発明の培地は動物細胞を培養するために用いることができる。したがって本発 明の別の特徴によれば、炭素、窒素、アミノ酸、鉄および他の無機イオン、微量 元素および任意に脂質の同化源並びに成長促進物質または調節物質を、動物細胞 の持続的増殖のために２−ヒドロキシ２，４．６−シクロヘブタトリエンー１− オンまたはその誘導体と混合された状態で含む動物細胞培養栄養培地が提供され る。

本発明の培地は、撹拌培養、特に低い鉄濃度、例えばおよそ０．３μＭの鉄濃度 での動物細胞の持続的増殖に特に適している。

本発明にしたがって培養できる動物細胞は、例えば遺伝子工学的につくられた細 胞、リンパ球球細胞（例えばミエローマ細胞）、またはハイブリドーマ細胞もし くは他の融合細胞でもよい、細胞タイプには特にヒト、ラット、マウスまたはハ ムスター由来の細胞が含まれる０本発明の培地はリンパ球球、特にミエローマ細 胞、特にマウス由来、特にＮ５１０細胞との使用に特に適している。

本発明の培地は、動物細胞を培養し動物細胞生成物を得るために使用することが できる。したがって本発明の別の特徴によれば、下記工程（１）−（３）を含む 細胞培養によって動物細胞生成物を得る方法が提供される：　（１）炭素、窒素 、アミノ酸、鉄および他の無機イオン、微量元素および任意に脂質の同化源並び に成長促進物質または調節物質を、２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロへブタ トリエン−１−オンまたはその誘導体と混合された状態で含む栄養培養培地中で 該生成物を産生ずる動物細胞を培養する工程と、（２）該生成物が蓄積するまで 培養を継続する工程と、（３）該生成物を回収する工程。

本発明にしたがって得られる細胞生成物には、培養動物細胞によって産生される いずれの生成物も含まれる。典型的な生成物はポリペプチドおよび蛋白質、例え ば免疫グロブリン例えばモノクロナル抗体および組換え体（ｒｅｃｏＩｂｉｎａ ｎｔ）抗体およびその断片、ホルモン例えばエリスロポエチンおよびヒト成長ホ ルモン等の成長ホルモン、リンホカイン例えばインターフェロン、インターロイ キン例えばインターロイキン２゜４．５および６並びに工業的および治療的に有 用な酵素例えば組織プラスミノーゲンアクチベーターを含む。

本発明の方法では、動物細胞は一般に、適切な容器、例えば撹拌タンクまたはエ アーリフト式ファーメンタ−中で既知の培養技術を用いて浮遊状態で培養できる 。

したがって、例えば、慣用的な技術によって得られた適切な細胞の種培養を該培 養培地に接種するために用いることができる。一般には接種に用いる細胞の数は Ｉ　Ｘ　１０５から５×１０５細胞／ｍｌの範囲またはそれ未満であろう。続い て細胞を所望の密度に達するまで、および／または十分な生成物が蓄積するまで 培養する。

培養中の所望の生成物の産生は問題となっている特定の生成物のための適切なア ッセーを用いてモニターすることができる。したがって１例えば生成物がポリペ プチドまたは蛋白質である場合、このものの産生は一般的なアッセー技術、例え ば特定のポリペプチドまたは蛋白質と使用できるようにした酵素結合免疫吸着ア ッセーまたは放射性免疫アッセーによってモニターできる。

本発明の方法で得られた細胞生成物を分離することを望む場合は、これは慣用的 な分離および精製技術を用いて達成することができる。したがって、例えば該生 成物が培地中に細胞によって分泌される場合は、遠心分離および濾過のような技 術を用いて細胞から分離し、続いて例えば親和性精製技術（例えばアフィニティ ークロマトグラフィー）を用いてさらに精製することができる。生成物が細胞に よって分泌されない場合は、細胞をまず溶解させ、該生成物を遊離させた後、上 記の方法を用いることができる。

た　１ 本発明を添付の図表を参考に以下の実施例によって詳述する。

図１−４はトロボロンおよび種々の他のキレータ−の存在下におけるマウスハイ ブリドーマ細胞の増殖を示す。

図５および６はトロボロンの存在下でのマウスＮ５１０細胞の増殖を示す。

ｌ生斑例に匪 以下の実施例は本発明を詳述する。

大１皿上 １μｇ　／　ｍ　ｌのヒトトランスフェリンを含む血清非含有培地で予め継代培 養したマウスハイブリドーマ細胞系を遠心分離し、トランスフェリン非含有培地 に２度再浮遊した。最終的に０．１ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムを含 むトランスフェリン非含有培地に１．５Ｘ１０５細胞／　ｍ　１の密度で細胞を 再浮遊させた。

１００倍の濃度の被験鉄キレータ−（８−ヒドロキシキノリン、トロボロン、ミ モシン、マルトール、ピコリン酸）を水で調製し濾過滅菌した。１０μｌの各鉄 キレータ−を２４ウェルコースタ−プレートのウェルに分散させ、続いて１ｍｌ の細胞浮遊液を加えた。

アセチルアセトンをエタノール中の０．０５Ｍの原液としてＦＡ製し、２μｍを 組織培養ウェルに分散させた。その後１ｍｌの細胞浮遊液を加えた。コントロー ルのウェルは１０μｍの水（陰性コントロール）または１００μｇ　／　ｍ　ｌ のヒトトランスフェリン溶液の１０μｍ（陽性コントロール）のいずれかを含ん でいた。

プレートを３６．５℃静止状態で５％Ｃｏ、−９５％空気雰囲気下で湿潤インキ ュベーターで３日間培養した。

３日後に個々のウェルの分散細胞浮遊液サンプルをコールタ−マルチサイザー（ Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ）を用いて分析し、細胞濃度をめた。

図ＩＡは、３μＭのトロポロンが、０．３６μＭの鉄（＝０．１ｍｇ／ｌのクエ ン酸第二鉄アンモニウム）の存在下での細胞増殖支援において１μｇ　／　ｍ　 ｌのヒトトランスフェリンと同じ効果があることを示している。他の親油性キレ ータ−は０．０３−３μＭの濃度ではトランスフェリン非存在下で細胞増殖を支 援しなかった。

図ＩＢは、５μＭのトロポロンは細胞増殖支援に効果があったが、一方１１００ ｐのアセチルアセトンおよび５０μＭのピコリン酸はずっと効果が小さかったこ とを示す。ピコリン酸およびアセチルアセトンのこの濃度は予備実験で最適なも のとして選ばれた（データは提示せず）。

すべての培地はＯ，１ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムを含んでいた。

失五匠ｌ 左置 予めヒトトランスフェリンを含む血清非含有培地で継代培養したマウスハイブリ ドーマ細胞系を遠心分離し、１．５×１０５細胞／　ｍ　ｌの密度でトランスフ ェリン非含有またはトランスフェリン含有血清非含有培地に再浮遊させた。すべ ての培地は０．１．１．又は１０　ｍ　ｇ　／　ｌの添加クエン酸第二鉄アンモ ニウムを含んでいた。このフラスコに５％Ｃｏ２−９５％空気雰囲気で通気し密 封して、静止状態または交互軌道型（ｏｒｂｉｔａｌ　ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ） 撹拌台（１２０ｒｐｎ＋）で３６．５℃で３日間培養した。その後サンプルを取 り出し、細胞濃度を血球測定法でめた。

藝夏 図２Ａは、ｌ　Ｏｍ　ｇ　／　ｌまでのクエン酸第二鉄アンモニウムの濃度の増 加は、静止培養においてトランスフェリン非含有培地中の細胞濃度の増加を支援 することを示している。しかし図２Ｂは、撹拌培養（交互撹拌台）では、１ｍｇ ／ｌより高いクエン酸第二鉄アンモニウムの濃度はトランスフェリンの存在下ま たは非存在下ともに有毒であることを明らかにした。

去ＪＬｆ２Ｌシ マウスハイブリドーマ細胞系を１ｍｇ／ｌのヒトトランスフェリンおよび０．０ １ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムを含む血清非含有自家製培地（図３ｂ ）、または５μＭのトロポロンおよび０．１ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニ ウムを含む蛋白非含有自家−製培地（図３ａ）で継代培養した。各培地で該細胞 系の通気撹拌型（ａｇｉｔａｔｅｄ、　ｓｐａｒｇｅｄ）バッチ式培地補給発酵 を実施した。

図３ａおよび図３ｂは、通気撹拌型ファーメンタ−システムではトロポロン（図 ３ａ）またはトランスフェリン（図３ｂ）のいずれを用いても、類似の細胞増殖 および生成特性が認められることを明らかにした。

１五五主 マウスハイブリドーマ細胞系を０．１ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムお よび５μＭトロポロンを含むトランスフェリン非含有培地で継代培養した。細胞 を遠心分離し、Ｏ１○１ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムおよび５μＭの トロポロンを含む培地に１．５Ｘ１０’細胞／ｍｌの密度でＴ−２５フラスコ中 に再浮遊させた。余分のクエン酸第二鉄アンモニウムをフラスコに加え、０．０ １−２ｍｇ／ｌの範囲の濃度にした。フラスコに５％Ｃ０Ｉ−９５％空気雰囲気 で通気し交互撹拌台（１２Ｑｒｐｍ）で３日間３６．５℃で培養した。

３８後サンプルをフラスコから取り出し、コールタ−マルチサイザーを用いて細 胞濃度をめた。

■ ３日間の増殖後の細胞濃度は鉄濃度、細胞増殖率および最大バイオマス量の結合 関数である。したがって、最大バイオマス量は０．０７５−１ｍｇ／ｌのクエン 酸第二鉄アンモニウムの範囲で得られたが（増殖収量は３．３Ｘ１０７細胞／μ ｇクエン酸第二鉄アンモニウムである（データーは提示せず））、最大増殖率（ 図４）は０．１５−０．５ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムで認められる 。

炎見涯旦 トランスフェリン代替物としてのトロポロン使用の効果を、さらに組換え体（ｒ ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）のＯ５−ミエローマ細胞系［マウスＮ５１０］を用いて 調べた。この細胞系はグルタミン合成酵素（ＧＳ）発現系を用いてヒト化（ｈｕ Ｉｌａｎｉｓｅｄ）抗体を発現している［　Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎら、Ｂｉｏ／ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＬ　ＩＬ　１６９−１７５；欧州特許公開第２５６０５５号 公報］。異なる抗体を産生ずる３種の組換え体細胞系を、０．２ｍｇ／ｌのクエ ン酸第二鉄アンモニウムおよび、５μＭのトロポロンまたは１ｍｇ／ｌのトラン スフェリンのいずれかを含む培地で浮遊培養として増殖させた。最高生細胞濃度 と同様、増殖速度はいずれの培地でも類似していた。３種の細胞系のすべてにつ いて、トランスフェリンがトロポロンで置換されたとき、該曲線の終末点の抗体 濃度は類似していた（表１参照）、トロポロンまたはトランスフェリンのいずれ かの非存在下、０．２ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムの存在下では、ミ エローマ細胞は増殖することができず、４８時間以内に死滅した。

表１ 去］１医」− マウスミエローマ細胞系［Ｇ５−Ｎ５Ｏ１実施例５参照］を０．２ｍｇ／ｌのク エン酸第二鉄アンモニウムおよび５μＭのトロポロンを含むトランスフェリン非 含有培地で継代培養した。細胞を遠心分離し、０．２ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄 アンモニウムおよび５μＭのトロポロンを含む蛋白非含有培地［ＬＳ１］に２Ｘ １０’細胞／　ｍ　１の密度で撹拌フラスコに再浮遊した。フラスコに５％Ｇｏ 、−９５％空気雰囲気で通気し、軌道撹拌台（１２Ｏｒｐｍ）で３６．５℃で培 養した。

図５は得られた細胞増殖を示している。

ＬＳＩは、コレステロールおよび脂肪酸と複合化した２−ヒドロキシプロピル− β−シクロデキストリン（ＨＰＢ；ｌ。

２ｇ／ｌ）［ＬＳｌに添加する前に水にＨＰＢ　（０，６ｍｇ／ｌ）を溶解し、 等容量の補充物（予め無水アルコールに溶解したコレステロールおよび脂肪酸を 含む）に加え、続いて３時間撹拌しその後遠心分離および濾過することによって 調製］をさらに含んでいた。コントロールとして、コレステロールおよび脂肪酸 を補充し、さらに０．２ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムおよび５μＭの トロポロンを含むがＨＰＢの代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いたＬ ＳＩ培地で同じ細胞を増殖させた。図５は、トロポロンは両方の培養の増殖を支 援することができ、さらに、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン はコレステロールおよび脂肪酸のための担体としてウシ血清アルブミンの有効な 代替物であること示している。

図６は、ＳＬのエアーリフト式ファーメンタ−での同じミローマ細胞系の０．２ ｍｇ／ｌのクエン酸第二鉄アンモニウムおよび５μＭのトロポロンを含むＬＳＩ 培地を用いたときの増殖を示す。

図ＩＢ 図２Ａ クエン酸第二鉄アンモニウム濃度（ｍｇ／ｌ）図２Ｂ トロポロン含有蛋白質非含有培地 トランスフェリン含有培地 ０全細胞数　噛・生細胞数 本７２時間後の細胞濃度 図４ 時間 図５ 時間 図６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．炭素、窒素、アミノ酸、無機イオン、微量元素および任意に脂質の同化源並 びに成長促進物質または調節物質を２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘプタ トリエン−１−オンまたはその誘導体と混合された状態で含む動物細胞培養栄養 培地。 ２．２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オンまたはその 誘導体が、含まれている鉄に対して過剰のモル濃度で存在する、請求の範囲第１ 項に記載の培地。 ３．２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オンまたはその 誘導体および鉄が、およそ５：１からおよそ７０：１のモル比で存在する、請求 の範囲第２項に記載の培地。 ４．動物細胞の持続的増殖のための先行する請求の範囲のいずれかの項に記載の 培地。 ５．前記動物細胞が哺乳類細胞である、請求の範囲第４項に記載の培地。 ６．前記哺乳類細胞がリンパ球細胞である、請求の範囲第５項に記載の培地。 ７．前記リンパ球細胞がミエローマ細胞である、請求の範囲第６項に記載の培地 。 ８．先行する請求の範囲のいずれかの項に記載の蛋白質非含有動物細胞培養培地 。 ９．細胞培養によって動物細胞生成物を得る方法であって、該細胞培養は、 （１）該生成物を産生する動物細胞を、炭素、窒素、アミノ酸、鉄および他の無 機イオン、微量元素および任意に脂質の同化源並びに成長促進物質または調節物 質を２−ヒドロキシ−２，４，６−シクロヘプタトリエン−１−オンまたはその 誘導体と混合された状態で含む栄養培養培地で培養する工程と、 （２）該生成物が蓄積されるまで該培養を継続する工程と、 （３）該生成物を回収する工程とを含む細胞培養によって動物細胞生成物を得る 方法。